İndÜkte balgamndÜkte...
Post on 29-Jan-2020
3 Views
Preview:
TRANSCRIPT
İNDÜKTE BALGAMİNDÜKTE BALGAM
Prof. Dr. Betül Ayşe Sin
Ankara Üniversitesi Tıp FakültesiGöğüs Hastalıkları Anabilim DalıAllerjik Hastalıklar Bilim Dalı
TarihçeTarihçe
Eski Yunan’da Hipokrat: Phlegm
1980 HIV’li hastalarda Pneumocystis carinii pnömonisi
1992 Pin ve ark. (astım)
FE Hargreaves ve ark. (yöntemin geliştirilmesi)
BALGAMBALGAM
Disülfid bağlarıyla birbirine tutunan glikoproteinleri içeren, submukozalbezlerden salgılanan jelatinöz bir madde olan mukus ve asılı bulunan hücrelerden oluşan bir materyaldir
AmaçAmaç
Normal şartlarda balgam spontan olarak çıkmazBalgam elde etmek için indüksiyon yapılmalıdır
Astım ve diğer solunum sistemi hastalıklarında havayolu inflamasyonunun
özelliklerini incelemek için spontanolarak balgam çıkaramayan hastalarda alt havayollarından yeterli miktarda
sekresyon örneği toplamaktır
HAVAYOLU İNFLAMASYONUHAVAYOLU İNFLAMASYONU
İDEAL TEST NEDİR?İDEAL TEST NEDİR?
Non-invaziv direkt tanı yöntemi
Basit, güvenilir, geçerli
İndükte Balgamİndükte Balgam
Havayolu hastalıkları
– Astım
– KOAH
– Kronik öksürük
– Eozinofilik bronşit
İndükte Balgamİndükte BalgamDiğer solunum sistemi patolojileri– Tüberküloz– Akciğer kanseri– Kistik fibrozis– Sarkoidozis– İnterstisyel akciğer hastalıkları– Ekstrensek allerjik alveolit– Mesleki toz hastalıkları
(asbestoz, karbon ve mineral partikülleri)– Mantar sporu, polen maruziyeti– Hücre içi bakterileri saptamak
İndükte Balgamİndükte Balgam
Sol ventrikül yetmezliği
(hemosiderin yüklü makrofajlar)
Soğuk algınlığı
(nötrofilik inflamasyon)
YÖNTEMYÖNTEM
Balgamın indüklenmesiİşlemden geçirilmesi (hücre ve sıvı faz analizi için)İnflamatuvar belirteçlerin okunmasıKlinik çalışmalarda ve klinik pratikteki değeri
İşlem sırasında önemli konularİşlem sırasında önemli konular
Malzeme, personelÖncesinde bronkodilatör tedaviAkciğer fonksiyonunun takibiSalin solüsyonu konsantrasyonuNebülizatörden aerosolün çıkış hızıİnhalasyon süresiEkspektorasyon tekniğiBalgam indüksiyonu sıklığı
%4 ve %5 hipertonik salinhazırlanması - 1
%4 ve %5 hipertonik salinhazırlanması - 1
Gerekli malzemeler8 tane steril 50 ml Falcon tüp2 tane steril ölçekli plastik bardak2 tane steril filtre (0.22 μm çap)30 cc’lik steril şırınga1 tane steril cam pipetToz NaCl (Sigma®)Steril distile su (non-pirojen, pH=5.5)
Hassas terazide 2 tane plastik kapta 4 g ve 5 g kuru toz NaCl tart Plastik ölçekli 2 tane 100 ml steril bardak içine non-pirojen distile su koy ve üzerine NaCl tozu ekle. İyice çözülene kadar bekleSteril 30 ml enjektörün iç tıpasını çıkar ve steril filtreyi bu enjektörün ucuna takBu şekilde 50 ml Falcon tüpün üstüne yerleştir
%4 ve %5 hipertonik salinhazırlanması - 2
%4 ve %5 hipertonik salinhazırlanması - 2
Bardakta çözülen solüsyonu bu tüpün üstüne yerleştirilen enjektörün 25 ml’likkısmına kadar ilave et
İç tıpa alınarak ucundaki siyah lastikli kısmı enjektörün içine oturt
Yukarıdan aşağı doğru pistonu yavaşyavaş iterek bu sırada Falcon tüpe filtreden sıvıyı süz
%4 ve %5 hipertonik salinhazırlanması - 3
%4 ve %5 hipertonik salinhazırlanması - 3
MEKANİZMAMEKANİZMA
Havayolunu döşeyen sıvının ozmolaritesinde ↑
İndirektDirekt
Bronş mukozasında damar permeabilitesi ↑
Submukozal bezlerde mukus yapımı ↑
Mast hücre aktivasyonuDuyu siniri uçlarının
uyarılması
Havayolu lümenindeki sekresyonlarınklirensinin ↑
Havayolu lümenindeki sekresyonlarınklirensinin ↑
Altın standart teknik yokAncak geçerli olanlar varAltın standart teknik yokAncak geçerli olanlar var
Yüksek out-put ~1 ml/dkUltrasonik nebulizatörle(De Vilbiss Ultra Neb 99) İzotonik (%0.9) veya hipertonik(%3, %4, %5) NaCl (salin) solüsyonu aerosol halindeFarklı zaman periyotlarında (5 dk, 7 dk) toplam 3 kez inhale ettirilir (12-30 dk)Bu sırada hastaya belli komutlar verilerek ayrı bir kaba tükürmesi, steril bir kaba balgam çıkarması söylenir
Tüplerin BağlanmasıTüplerin Bağlanması
2pc
4 parça
1 pc
ağızlık (mouth piece)
T-tube
Distile su
Aquapack(20 ml HS)
Hipertoniksalin
Hasta için öneriler – 1Hasta için öneriler – 1
Öncesinde diş fırçalanırNebülizasyon sırasında postür, oturur ve dik pozisyonda olmalıdırBuruna klip takılabilirBuharı ağızlıktan inhale ederBu süre boyunca tidal solunum yapar ve her 20 sn’de bir kez yavaş derin nefes alır
Hasta için öneriler – 2Hasta için öneriler – 2Yassı epitel hücre kontaminasyonunuazaltmak içinİnhalasyon sırasında aşırı tükrük olursa ayrı bir kaba tükürürHer indüksiyon periyodu sonunda burnunu temizler, ağzını ve boğazını suyla çalkalar ve yutar, ağız mukozasını gazlıbezle tahriş etmeden kurular Hafifçe öne eğilerek derin bir öksürükle steril petri kabına balgam çıkarır
Balgam İndüksiyonu - 1Balgam İndüksiyonu - 1Hastaya işlem hakkında ayrıntılı bilgi verilirBazal SFT ölçülür (pre-bronkodilatörFEV1, en az 3 kez)2 puff (200 μg) salbutamol(MDI + spacer) ile inhale ettirilir10-15 dk sonra FEV1 ölçülür (post-bronkodilatör)Eğer post-bronkodilatör FEV1 >%60 (beklenen) ya da >1 lt ise devam edilir
Balgam İndüksiyonu – 2Balgam İndüksiyonu – 2Pirojensiz steril hipertonik salin ya sabit konsantrasyonda (%3 veya %4.5) ya da artan konsantrasyonlarda (%3,4,5) kullanılır (20 ml)5 veya 7 dk arayla (<21 dk/toplam) indüksiyon yapılır. (Ya da; 1,4 ve 5 dk, sonra 3 kez 5 dkarayla)Her indüksiyon periyodu sonunda FEV1ölçülür
Balgam İndüksiyonu – 3Balgam İndüksiyonu – 3
Yeterli miktar ve kalitede balgam çıkaramaz ise %4 ve %5 salin ile devam edilir. Ancak FEV1’de düşüş %10 veya 200 ml’den fazla olmamalıdırEğer post-bronkodilatör FEV1’e göre %10 veya 200 ml’den fazla, ancak %20 ya da 400 ml’den az FEV1 düşmüş ise diğer 7 dk aynı salin konsantrasyonu kullanılır
Balgam İndüksiyonu – 4Balgam İndüksiyonu – 4
FEV1 en iyi post-bronkodilatör değerin %20 (veya 400 ml)’sinden fazla düşerse ya da semptom olursa işleme son verilir
Hasta 2 puf kısa etkili β2 agonist ile tedavi edilir
FEV1 bazal değerin %5’ine kadar yükselmesi için hasta izlemde tutulur
Yüksek riskli hastada alternatif protokol - 1Yüksek riskli hastada alternatif protokol - 1
İşlem öncesi hastaya gerekli bilgi sunulurGüvenlik önlemi alınır. Ekipman hazırlanırBronkodilatör öncesi FEV1 ölçülür200 μg inhale salbutamol verilir10-15 dk sonra post-bronkodilatör FEV1ölçülür (%20 düşüş değeri hesaplanır)%0.9 steril salin solüsyonuyla başlanır; 30 sn, 1 dk ve 5 dk inhale ettirilir, her periyot sonrası FEV1 değeri ölçülür
Yüksek riskli hastada alternatif protokol – 2Yüksek riskli hastada alternatif protokol – 2
Balgam çıkaramazsa HS %3’e arttırılır, 30 sn, 1 dk ve 2 dk inhalasyon yaparYine yeterli balgam yoksa %4.5’a arttır. 30 sn, 1 dk, 2 dk, 4 dk ve 8 dk süreyle inhalasyon yaparHer indüksiyon süresi sonunda FEV1 ölçümPost-bronkodilatör değere göre FEV1’de >%20 düşüş ya da semptom olursa işlem durdurulurHasta spontan olarak öksüremez ise 4-8 dksonra öksürüp balgam çıkarması söylenir
Teknikte Önemli NoktalarTeknikte Önemli Noktalar
Aynı kişide indüksiyonlar arasındaki inhalasyon süresi sabit tutulmalı
15-21 dk standart süre
2 indüksiyon arasında 48 saat ara olmalı
İnhale edilen hipertonik solüsyonun volümü
Solunum hızı (dakikada 1 kez hafif derin nefes alarak tidal solunum yapar)
Balgamın İşlenmesi – 1Balgamın İşlenmesi – 1Tüm balgam örneği ya da gözle görülen visköz kısımlar ayrılarak 2 saat içindeişlemden geçirilmelidir50 ml opak polipropilen santrifüj tüpün ağırlığını tart (polistiren tüp kullanma)Balgam örneğini bu tüpe transfer ederek ağırlığını tartBalgamın ağırlığını hesaplaFosfat tamponlu salin = PBS veya normal salin ile 1:10 dilüsyonda %0.1 DTT solüsyonunu günlük taze hazırla (9 ml PBS + 1 ml Sputolysin®)
Dithiothreitol (DTT)Dithiothreitol (DTT)
Rezidüel mukusa hapsolmuş hücrelerin likefaksiyonla açığa çıkmasını sağlar
Disülfit bağlarını parçalar. Bu bağlar müsinöz glikoproteinlerle çapraz bağyaparak balgamı jel formunda tutar
Çok az hücre hasarına yol açar
Hücre eldesi için yararlı ancak bazıimmünolojik teknikler için uygun değil
Balgamın İşlenmesi – 2Balgamın İşlenmesi – 2Balgam miktarına eşdeğer volümde %10 Sputolysin® ekle (1 ml DTT 1gr balgam)Bu karışım 3-5 kere (15”) vortekslenirTüpü bench rocker’da oda ısısında 15 dkbeklet (tam homojenizasyon için)(48 μm naylon gazlı bezden filtre edilebilir)Bu karışım 2500xg (+4°C) 15 dk(veya 300-1500xg, 10-15 dk) santrifüj etÜstte kalan süpernatanı pipetle 1 ml tüplere al ve -20,-80°C’de sakla (soluble mediatör)
Balgamın İşlenmesi – 3Balgamın İşlenmesi – 3
Altta kalan hücre peleti, Ringerli laktat(veya PBS) ile resüspande edilerek volüm 1 ml’ye tamamlanır, hafifçe karıştırılır10 μl hücre süspansiyonu + 10 μl tripanmavisi ile hücre canlılığına bakılır (>%50)Bu karışımdan 10 μl alıp Neubauer manualhemositometride toplam hücre sayımıyapılır (ml’deki hücre sayısı)
Toplam hücre sayısı= (toplam hücre x karede/x kare)X10.000Xörneğin volümü2.600.000=104/1X10.000X2.5 cc
Balgamın İşlenmesi – 4Balgamın İşlenmesi – 4
Toplam hücre sayısından yassı hücre kontaminasyon yüzdesini hesapla (<%20 olmalı)
Sitospin slaytta, optimal hücre (40-60x103)yoğunluğu elde etmek için uygun miktarda Ringerli laktat solüsyonu ile resüspande edilir (dilüsyon faktörü için TCC/160.000. 2.600.000:160.000=16.25 ml-2.5 ml=14 ml RL ekle. Böylece her slaytta 40.000 hücre)
Balgamın İşlenmesi – 5Balgamın İşlenmesi – 5Hücre konsantrasyonu 1x106 hücre/ml’yeayarlanır. 40-65 μl (450-650 x 103
hücre) hücre süspansiyonu her sitospineilave edilirEn az 6 kodlanmış sitospin hazırlanır. Her cytofunnel’a 200 μl hücre süspansiyonu konur600 rpm (22xg)’de 6 dk santrifüj edilir (Shandon III Cytocentrifuge)
Balgamın İşlenmesi – 6Balgamın İşlenmesi – 6
24-48 saat havada kurumaya bırakılırDiff-Quick (Giemsa ve Wright) ile boyanırEn iyi boyanan slaytlardan 400 intaktnon-skuamöz toplam hücre sayılarak diferansiyel hücre dağılımı elde edilirToplam hücre sayısının yüzdesi olarak ifade edilirKodlanmış slaytlar çift kör okuyucular tarafından değerlendirilmelidir
İnvaziv yassı hücreli akciğer kanserinde indükte balgam örneği
Atipik mikobakteri enfeksiyonu olan hastanın indükte balgamında aside-rezistans basiller
Astımlı hastanın indükte balgam örnekleri
İndükte balgamda eozinofiller
Astımlı hastanın indükte balgamında eozinofil
KOAH’lı hastanın indükte balgamında makrofajlar
J Allergy Clin Immunol 2002; 109; S100-101
Normal yetişkinde indükte balgamda diferansiyel hücre sayıları
Normal yetişkinde indükte balgamda diferansiyel hücre sayıları
Hücre sayısı Median (%)
Makrofaj 60.8
Nötrofil 36.7
Eozinofil 0.0
Lenfosit 0.5
Bronş epitel hücresi 0.3
Metakromatik hücre 0.0
İndükte Balgamın Klinik Anlamıİndükte Balgamın Klinik AnlamıHÜCRE TİPİ ARTIŞIN NEDENLERİEozinofilik Kontrolsüz astım
Astımsız eozinofilik bronşitAllerjen ve kimyasal duyarlandırıcı maruziyetiSteroide cevap veren kronik havayolu darlığı
Nötrofilik Sigara içmekHava kirleticileri (ozon)EndotoksinİnfeksiyonSteroide dirençli astım
Lenfositik SarkoidozisChlamydia pneumoniaİnterstisyel akciğer hastalıkları
Balgam İndüksiyonuBalgam İndüksiyonu
Erken alınan örneklerErken alınan örnekler
Santral hava yollarından geliyor, mukus fazla
Geç alınan örneklerGeç alınan örnekler
Surfaktan yüksek, periferik havayolu ve alveollerden geliyor
İndükte BalgamBronş yıkamasıİndükte BalgamBronş yıkaması
Santral (proksimal) havayolu lümeninden gelen sekresyonlar
Santral (proksimal) havayolu lümeninden gelen sekresyonlar
BronkoalveolarlavajBronkoalveolarlavaj Periferik havayolu lümenindenPeriferik havayolu lümeninden
Bronş biyopsisiBronş biyopsisi Santral havayolu duvarından hücre örneğiSantral havayolu duvarından hücre örneği
İndükte BalgamEozinofil ve nötrofilden zengin, lenfosit ve makrofaj daha az
AVANTAJLARIAVANTAJLARI DEZAVANTAJLARIDEZAVANTAJLARIBRONKOSKOPBRONKOSKOPİİ Biopsi ve BAL alınabilir
Yapısal değişiklikle ilgili bilgi verirİmmün histokimya, insituhibridizasyon, elektron mikroskopiSegmental allerjenprovokasyonuBronşial yıkama (invitroçalışma için hücre eldesi)
Eğitimli personel ve pahalıekipmanİnvazivAlveolar ve bronşiyalmateryal karışabilirKanla kontamine olabilirBiopsi örneği sadece büyük havayolundan alınabilirHücre sayısı verimliliği düşük
İİNDNDÜÜKTE KTE BALGAMBALGAM
Nispeten noninvazivProksimal havayolundan direkt örnekler alınabilirTekrarlanabilirGeçerlidir Basit, pratik, ucuz ve güvenilirGeniş sayıda hastada çalışma mümkün
Bronkokonstriksiyon riski varBaşarı oranı ~%80İşlenme yöntemi biraz fazla iş yükü gerektiriyorHemen sonuç alınamıyor (zaman sorunu var) (en az 100 dakika gerekli)
Balgam inceleme yönteminin, özel tekniklerin uygulanmasını
kolaylaştırmak amacıyla daha standart hale gelmesi ve geliştirilmesi
gereklidir
Balgam inceleme yönteminin, özel tekniklerin uygulanmasını
kolaylaştırmak amacıyla daha standart hale gelmesi ve geliştirilmesi
gereklidir
Özel TekniklerÖzel Teknikler
Flow sitometri
İn situ hibridizasyon
PCR
İmmün sitokimyasal boyanma
İn vitro hücre kültürü
Genetik analiz
Cevap Bekleyen SorularCevap Bekleyen SorularGüvenilir hücre sayıları için en düşük kabul edilebilir hücre viabilitesiHücreler ve sıvı fazda yapılacak ölçümler üzerinde balgamın işlenme zamanının uzamasının etkisiSıvı faz ve hücreler üzerinde sallamaya karşısabit durmanın etkisiHücre morfolojisinde santrifüj hızının etkisiHücre sayısı ve sıvı faz için naylon filtreden geçirmenin etkisi
Dr. F. ÖzerAtopik astımlılarda antilökotrien tedavinin, allerjenleuyarılan havayolu enflamasyonu üzerine etkisi (2003)Dr. Ö. AbadoğluThe effect of montelukast on eosinophil apoptosis: inducedsputum findings of patients with mild persistent asthma. (Allergol Immunopathol 2005; 33: 105-11)Dr. E. KurtThe effect of natural pollen exposure on eosinophilapoptosis and its relationship to bronchialhyperresponsiveness in patients with seasonal allergicrhinitis. (Ann Allergy Asthma Immunol 2005; 95: 72-8)Dr. A. Berna DursunMevsimsel allerjik rinitli hastalarda indükte balgam örneklerinde sisteinil lökotrien ve matriks metalloproteaz-9 ile doku matriks metalloproteaz inhibitör-1 düzeylerinin değerlendirilmesi ve bu faktörlerin bronş aşırı duyarlılığı ile ilişkisinin araştırılması (2006)
top related