micrornas silvia juliana serrano gómez bsc , msc coordinadora ficmac- lab

microRNAsmicroRNAs

Silvia Juliana Serrano Gómez BSc, MScCoordinadora FICMAC-Lab

Dogma central de la biología molecularDogma central de la biología molecular

TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓNARN: Acido Ribonucleico

• Tipos de ARN• mARN: Mensajero• Ribosomal RNA (rARN)• tranferenciaRNA (tARN)

ADN Vs. ARNADN Vs. ARN

ACIDOS NUCLEICOS: Grupo fosfato, azúcar y base nitrogenada.

Transcipcion genicaTranscipcion genica

ADN moldeRegión de transcripción - Promotor

Factores de transcripción

ARN Polimerasa

Generación de mARNGeneración de mARN

Splicing del mRNA

Generación de mARNGeneración de mARN

Traducción del ARNTraducción del ARN

Que es un microRNA?Que es un microRNA?

• Familia de pequeños ARNs (Small RNAs)

Secuencias de cadena sencilla no codificantes de ARN de aproximadamente 22 nucleotidos (nt) que regulan la expresión génica.

Pasos para la generación de un microRNA

1. Gen codificante de microRNA Transcrito de 70nt

2. Pre-miRNA forma estructura de tallo-orquilla (Stem-loop)

3. Pre-miRNA es procedaso por DICER en un miRNA de 21 – 25nt

microRNAsmicroRNAsComo regulan la Como regulan la expresiónexpresión génicagénica??

1. miRNA tiene complementariedad perfecta a secuencia target degradación del mRNA: RNAi

INHIBICION A NIVEL TRANSCRIPCIONALINHIBICION A NIVEL TRANSCRIPCIONAL

2. Unión imperfecta del miRNA al mRNA

INHIBICION A NIVEL POS-TRANSCIPCIONAL INHIBICION A NIVEL POS-TRANSCIPCIONAL (TRADUCCION)(TRADUCCION)

Como regular la expresión génicaComo regular la expresión génicaBiogénesis de los microRNAsBiogénesis de los microRNAs

RNAiRNAi

Precursor largoPrecursor largo

RNAse IIIRNAse III

70 nt

RNAse IIIRNAse III

Regulación génica

Unión parcial por el 3’UTR del mRNA

microRNAsmicroRNAsCaracterísticasCaracterísticas

Annu Rev Pathol. 2009 ; 4: 199–227

DURANTE EL DURANTE EL PROCESAMIENPROCESAMIENTO DEL MIRNATO DEL MIRNA

ALTERACIONES ALTERACIONES A NIVEL DE A NIVEL DE

TRANSCRIPCIÓTRANSCRIPCIÓNN

Supr

esor

es tu

mor

ales

y o

ncog

enes

Supr

esor

es tu

mor

ales

y o

ncog

enes

Bloquear transcripción de supresor tumoral

NO-Bloquea transcripción de

oncogén

Generalidades microRNAs en cáncer

• Secuencias corta de RNA (~22-5pb)

• Actúan a través que un complejo supresor (RISC)

– Degradación del mRNA blanco

– Represión de la traducción

• Un daño en le procesamiento del miRNA se puede traducir en

predisposición a cáncer

microRNAs en gliomas

miRNAs y expresion en gliomasmiRNAs y expresion en gliomasmiR-21miR-21

Determinación de niveles de miR-21

Proliferación microvascular: Reorganización de la matriz extracelular y capacidad de proliferación

qRT-PCR Northern blot

Rutas moleculares afectadas por miR-21Rutas moleculares afectadas por miR-21

Ensayos usando anti-miR-21

Blancos Blancos miR21miR21

ApoptosisApoptosisProliferaciónProliferación

InvasiónInvasiónMigraciónMigración

1

23

4

En ApoptosisEn Apoptosis

RUTA DE P53RUTA DE P53 RUTA DE TGFRUTA DE TGFΒΒ

Citoquina inhibidora del crecimiento

Estabilizar p53

Ruta de metaloproteinasas de matriz (MMP)Ruta de metaloproteinasas de matriz (MMP)

MMP: PEPTIDASAS – DEGRADACIÓN MATRIZ EXTRACELULAR

NIVELES AUMENTADOS EN GLIOMAS

Ruta mediada por PDC4Ruta mediada por PDC4

EFECTOS SOBRE LA EFECTOS SOBRE LA PROLIFERACIÓNPROLIFERACIÓN

mi-R21 y respuesta a quimioterapia (taxanos)mi-R21 y respuesta a quimioterapia (taxanos)

Niveles de expresión de miR-21 por RT-PCR Niveles de expresión de miR-21 por RT-PCR Regulacion de miR-21 por su inhibidorRegulacion de miR-21 por su inhibidor

Inhibidor del miR-21 incrementa la citotoxicidad Inhibidor del miR-21 incrementa la citotoxicidad del taxoldel taxol

Inhibición en un 50% del crecimiento celular Vs. Concentración taxol-inhibidor

Actividad de AKT: Contribuye a supervivenciaActividad de AKT: Contribuye a supervivenciaEnsayos Western-BlotEnsayos Western-Blot

Reducción de la expresión de p-AKT usando combinación del inhibidor y quimioterapia

Taxo

l

Ant

i-miR

-21

Taxo

l + A

nti-m

iR-2

1

Taxo

l

Ant

i-miR

-21

Taxo

l + A

nti-m

iR-2

1

miRNAs y apoptosismiRNAs y apoptosis

6,24% 6,24%

21,75% 18,74%24,68% 21,97%

Aumento de muerte celular por apotosis – Efecto aditivo

miR-21 y resistencia temozolamidamiR-21 y resistencia temozolamida

Ensayos de viabilidad celularEnsayos de viabilidad celular

Tratamiento con miR-21 hace células resistentes a tratamiento con TMZ

Ensayo de apoptosisEnsayo de apoptosis

TMZ: Induce apoptosismiR-21: Disminuye porcentaje de apoptosis

Cascadas de señalización Bax/Bcl2Cascadas de señalización Bax/Bcl2Bax: promotor de apoptosis, Bcl2: inhibidor de apoptosisBax: promotor de apoptosis, Bcl2: inhibidor de apoptosis

Expresión relativa del radio Expresión relativa del radio Bax/Bcl2Bax/Bcl2

Medición niveles Bax y Bcl2 por Medición niveles Bax y Bcl2 por western blotwestern blot

Aumento relación Bax/Bcl2: Promueve apoptosis Disminución de la relación Bax/Bcl2 contribuyen a resistencia a terapias

miR-7 y proliferaciónmiR-7 y proliferación

Primeros en reportar que miR-7 regula el EGFRBaja regulación de miR-7 en glioblastoma

Vía del EGFR-AKT

EGFR y AKT juegan un papel central EGFR y AKT juegan un papel central en los Glioblastomasen los Glioblastomas

Inmunoblot de EGFR

Inmunoblot de AKT: fosforilación en Ser173

Decrecimiento en la expresión de EGFR y de AKT

IRS-1/IRS-2 contienen sitios de unión del miR-7IRS-1/IRS-2 contienen sitios de unión del miR-7

miR-7 suprime la activación de AKT INDEPENDIENTEMENTEINDEPENDIENTEMENTE de la inhibición del EGFR

EGFR regula la actividad de AKT PERO, la inhibición de AKT por miR-7 es dependiente de la inhibición de EGFR?

Conclusiones (1)

• Los microRNAs son molecular de cadena sencilla de aproximadamente 20 nt que

regulan a expresión de diferentes genes

• Dos mecanismos de regulación:

– iRNA

– microRNA

• La gran mayoría de los miRNAs conocidos estas localizados en sitios frágiles

asociados con cáncer

• Daños en el procesamiento del miRNA esta relacionado con el desarrollo de

cáncer.

Conclusiones (2)Conclusiones (2)

• mirR21 es un oncogén sobre-expresado en glioblastomas y se encuentra asociado con resistencia a agentes quimioterapéuticos APOPTOSISAPOPTOSIS

• microRNA-7 (miR-7) es considerado un supresor tumoral que se encuentra sub-regulado en glioblastoma y suprime la expresión de EGFR y AKT PROLIFERACIÓN CELULARPROLIFERACIÓN CELULAR

• Representan un blanco terapéutico Uso de antagonistas