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  • Diapositiva 1
  • microRNAs microRNAs Silvia Juliana Serrano Gmez BSc, MSc Coordinadora FICMAC-Lab
  • Diapositiva 2
  • Dogma central de la biologa molecular T RANSCRIPCIN Y TRADUCCIN ARN: A cido R ibo n ucleico Tipos de ARN mARN: Mensajero Ribosomal RNA (rARN) tranferenciaRNA (tARN )
  • Diapositiva 3
  • ADN Vs. ARN ACIDOS NUCLEICOS : Grupo fosfato, azcar y base nitrogenada.
  • Diapositiva 4
  • Transcipcion genica ADN molde Regin de transcripcin - Promotor Factores de transcripcin ARN Polimerasa
  • Diapositiva 5
  • Diapositiva 6
  • Generacin de mARN
  • Diapositiva 7
  • Splicing del mRNA Generacin de mARN
  • Diapositiva 8
  • Traduccin del ARN
  • Diapositiva 9
  • Que es un microRNA? Familia de pequeos ARNs (Small RNAs) Secuencias de cadena sencilla no codificantes de ARN de aproximadamente 22 nucleotidos (nt) que regulan la expresin gnica. Pasos para la generacin de un microRNA 1. Gen codificante de microRNA Transcrito de 70nt 2. Pre-miRNA forma estructura de tallo-orquilla (Stem-loop) 3.Pre-miRNA es procedaso por DICER en un miRNA de 21 25nt
  • Diapositiva 10
  • microRNAs Como regulan la expresin gnica? 1.miRNA tiene complementariedad perfecta a secuencia target degradacin del mRNA: RNAi INHIBICION A NIVEL TRANSCRIPCIONAL 2. Unin imperfecta del miRNA al mRNA INHIBICION A NIVEL POS-TRANSCIPCIONAL (TRADUCCION)
  • Diapositiva 11
  • Como regular la expresin gnica Biognesis de los microRNAs RNAi Precursor largo RNAse III 70 nt RNAse III Regulacin gnica
  • Diapositiva 12
  • Unin parcial por el 3UTR del mRNA
  • Diapositiva 13
  • microRNAs Caractersticas Existen alrededor de 300 en el genoma (1-3% genes expresados) UNA DE LAS MAS GRANDES CLASES DE GENES REGULADORES Regulan diferentes procesos celulares Ciclo celular, diferenciacin, desarrollo, metabolismo y enfermedades humanas (diabetes, desordenes inmunolgicos, neurodegenerativos y cncer) Aproximadamente el 50% se encuentran en sitios fragiles Regiones de amplificacin: Asociados con cncer Ubicacin en el genoma Regiones intragenicas 50% en unidades de transcripcin como intrones o exones de transcritos codificantes y no codificantes
  • Diapositiva 14
  • Alteracin en la expresin de los miRNAs Perdida de su funcin
  • Diapositiva 15
  • Annu Rev Pathol. 2009 ; 4: 199227 D URANTE EL PROCESAMIENTO DEL MI RNA A LTERACIONES A NIVEL DE TRANSCRIPCIN
  • Diapositiva 16
  • Supresores tumorales y oncogenes Bloquear transcripcin de supresor tumoral NO-Bloquea transcripcin de oncogn
  • Diapositiva 17
  • Generalidades microRNAs en cncer Secuencias corta de RNA (~22-5pb) Actan a travs que un complejo supresor (RISC) Degradacin del mRNA blanco Represin de la traduccin Un dao en le procesamiento del miRNA se puede traducir en predisposicin a cncer
  • Diapositiva 18
  • microRNAs en gliomas
  • Diapositiva 19
  • miRNAs y expresion en gliomas miR-21 Determinacin de niveles de miR-21 Proliferacin microvascular : Reorganizacin de la matriz extracelular y capacidad de proliferacin qRT-PCRNorthern blot
  • Diapositiva 20
  • Rutas moleculares afectadas por miR-21 Ensayos usando anti-miR-21
  • Diapositiva 21
  • Blancos miR21 Apoptosis Proliferacin Invasin Migracin 1 2 3 4
  • Diapositiva 22
  • En Apoptosis R UTA DE P 53 R UTA DE TGF Citoquina inhibidora del crecimiento Estabilizar p53
  • Diapositiva 23
  • Ruta de metaloproteinasas de matriz (MMP) MMP: P EPTIDASAS DEGRADACIN MATRIZ EXTRACELULAR N IVELES AUMENTADOS EN GLIOMAS
  • Diapositiva 24
  • Ruta mediada por PDC4 E FECTOS SOBRE LA PROLIFERACIN
  • Diapositiva 25
  • Diapositiva 26
  • p53 JNY TOPORS TP53BP2 HNRPX DAXX JNY TOPORS TP53BP2 HNRPX DAXX p63 miR-21 Transcripcin genes TGF DAXX JNK miR-21
  • Diapositiva 27
  • MMP TIMP3 RECK miR-21 p21 PDC4 p53 miR-21
  • Diapositiva 28
  • mi-R21 y respuesta a quimioterapia (taxanos)
  • Diapositiva 29
  • Sealizacin a travs de factores de crecimiento en GMBs C LULAS DE GLIOBLASTOMA U251 (PTEN mutado) LN229 (PTEN Silvestre) Perdida de PTEN: Peor Pronostico
  • Diapositiva 30
  • Niveles de expresin de miR-21 por RT-PCR Regulacion de miR-21 por su inhibidor
  • Diapositiva 31
  • Inhibidor del miR-21 incrementa la citotoxicidad del taxol Inhibicin en un 50% del crecimiento celular Vs. Concentracin taxol-inhibidor
  • Diapositiva 32
  • Accin sobre AKT C LULAS DE GLIOBLASTOMA U251 (PTEN mutado) LN229 (PTEN Silvestre) Perdida de PTEN: Peor Pronostico
  • Diapositiva 33
  • Actividad de AKT: Contribuye a supervivencia Ensayos Western-Blot Reduccin de la expresin de p-AKT usando combinacin del inhibidor y quimioterapia Taxol Anti-miR-21 Taxol + Anti-miR-21 Taxol Anti-miR-21 Taxol + Anti-miR-21
  • Diapositiva 34
  • miRNAs y apoptosis 6,24% 21,75% 18,74% 24,68% 21,97% Aumento de muerte celular por apotosis Efecto aditivo
  • Diapositiva 35
  • miR-21 y resistencia temozolamida
  • Diapositiva 36
  • Ensayos de viabilidad celular Tratamiento con miR-21 hace clulas resistentes a tratamiento con TMZ
  • Diapositiva 37
  • Ensayo de apoptosis TMZ: Induce apoptosis miR-21: Disminuye porcentaje de apoptosis TMZ: Induce apoptosis miR-21: Disminuye porcentaje de apoptosis
  • Diapositiva 38
  • Cascadas de sealizacin Bax/Bcl2 Bax: promotor de apoptosis, Bcl2: inhibidor de apoptosis Expresin relativa del radio Bax/Bcl2 Medicin niveles Bax y Bcl2 por western blot Aumento relacin Bax/Bcl2: Promueve apoptosis Disminucin de la relacin Bax/Bcl2 contribuyen a resistencia a terapias Aumento relacin Bax/Bcl2: Promueve apoptosis Disminucin de la relacin Bax/Bcl2 contribuyen a resistencia a terapias
  • Diapositiva 39
  • miR-7 y proliferacin Primeros en reportar que miR-7 regula el EGFR Baja regulacin de miR-7 en glioblastoma Primeros en reportar que miR-7 regula el EGFR Baja regulacin de miR-7 en glioblastoma
  • Diapositiva 40
  • EGFR PI3K AKT IRS1 IRS2 miR-7
  • Diapositiva 41
  • Va del EGFR-AKT
  • Diapositiva 42
  • EGFR y AKT juegan un papel central en los Glioblastomas
  • Diapositiva 43
  • Inmunoblot de EGFR Inmunoblot de AKT: fosforilacin en Ser 173 Decrecimiento en la expresin de EGFR y de AKT
  • Diapositiva 44
  • IRS-1/IRS-2 contienen sitios de unin del miR-7
  • Diapositiva 45
  • INDEPENDIENTEMENTE miR-7 suprime la activacin de AKT INDEPENDIENTEMENTE de la inhibicin del EGFR EGFR regula la actividad de AKT PERO, la inhibicin de AKT por miR-7 es dependiente de la inhibicin de EGFR?
  • Diapositiva 46
  • Conclusiones (1) Los microRNAs son molecular de cadena sencilla de aproximadamente 20 nt que regulan a expresin de diferentes genes Dos mecanismos de regulacin: iRNA microRNA La gran mayora de los miRNAs conocidos estas localizados en sitios frgiles asociados con cncer Daos en el procesamiento del miRNA esta relacionado con el desarrollo de cncer.
  • Diapositiva 47
  • Conclusiones (2) A POPTOSIS mirR21 es un oncogn sobre-expresado en glioblastomas y se encuentra asociado con resistencia a agentes quimioteraputicos A POPTOSIS P ROLIFERACIN CELULAR microRNA-7 (miR-7) es considerado un supresor tumoral que se encuentra sub-regulado en glioblastoma y suprime la expresin de EGFR y AKT P ROLIFERACIN CELULAR Representan un blanco teraputico Uso de antagonistas

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