Étapes … exposition toxico-cinétique toxico-dynamique
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Étapes …Étapes …
Exposition
Toxico-cinétique
Toxico-dynamique
Cycle Cycle cellulaire/cellulaire/
GénotoxicitGénotoxicitéé
Atteintes à Atteintes à la la
membranemembrane
Stress oxydantStress oxydant
EpigénétiquEpigénétiquee
MétabolisatiMétabolisationon
Santé Santé mitochondrialmitochondrial
ee
Apoptose / Apoptose / NécroseNécrose
CytosqueletCytosquelettestes
ProliférationProlifération
Mécanismes de cytotoxicitéMécanismes de cytotoxicité
Signalisation Signalisation CellulaireCellulaire
Étude de la GénotoxicitéÉtude de la Génotoxicité
Developed by Bruce Ames and his colleagues in the 1970s.
Tests the mutagenicity of different compounds Is used by FDA to test many chemical rapidly and
inexpensively Uses special bacteria that are very sensitive to many
mutagenic agents
Test de Mutagenèse : Test Ames (1)Test de Mutagenèse : Test Ames (1)
Characteristics of mutants strains of S.typhimurium used for Ames Test
cannot synthesize histidine.
are very susceptible to additional mutations because they lack the normal repair mechanisms found in bacteria.
more permeable than wild-type bacteria to external chemicals, including potential mutagens.
Different mutant strains of S.typhimurium with different mutations in their DNA
TA 1535 has a base substitution that produces a missense mutation in the gene coding for the first enzyme of histidine synthesis. The mutant enzyme has a proline where a leucine is in the wild-type enzyme.
TA 100 is very similar to 1535, but is also supposed to detect a different range of mutagens.
TA 1537 has a frameshift mutation (deletion of one nucleotide) in a different gene than is mutated in 1535.
TA 1538 has a different frameshift mutation (insertion of one nucleotide) in the same gene that is mutated in TA 1537.
TA 98 is similar to 1538 but is supposed to detect more mutagens than 1538 does. TA 102 is significantly different from the others. It has an ochre mutation which
means that it has a nonsense mutation. This mutation occurs in the same gene as is mutated in the strain TA 1535.
Test de Mutagenèse : Test Ames (2)Test de Mutagenèse : Test Ames (2)
Mise en évidence de la fragmentation de Mise en évidence de la fragmentation de l’ADN sur gel d’agarosel’ADN sur gel d’agarose
• Fragments chromosomiques ou isolement de chromosomes entiers
• Migration anormale pendant la mitose
• Pas d’incorporation dans les noyaux des cellules filles
• Condensation + Membrane Micronoyaux
Visualisation par coloration spécifique et appréciation de leur taux comparé au taux de base
Substance génotoxique ADN
Induction de micro-noyauxInduction de micro-noyaux
Induction de micro-noyauxInduction de micro-noyaux
Induction de micro-noyauxInduction de micro-noyaux
Induction de micro-noyauxInduction de micro-noyaux
0
40
80
120
160
200
Solvant 5 µM 10 µM 20 µM Col
CB
NM
NZen+Vit E Zen
Vit E prévient la production de micronoyaux
Prévention partielle quelle que soit la concentration en Zen
Fusions centriques Cassures
Test d’Aberrations ChromosomiquesTest d’Aberrations Chromosomiques
Anneaux Lacunes (Gap)
0
5
10
15
20
25
30
35
control 10µM 20µM 40µM
% d
es a
berr
ations c
hro
mosom
iques
Zen
Zen + Vit E
Induction d’aberrations chromosomiquesInduction d’aberrations chromosomiques
Mutation Research, 365, 139-149. (2005)Mutation Research, 365, 139-149. (2005)
Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) :
Technique d’électrophorèse qui permet la
détection de cassures de l’ADN (différents types
de dommages) sur des cellules individualisées
Test de Comète Test de Comète (SCGE)(SCGE)Test de Comète Test de Comète (SCGE)(SCGE)
Préparartion des lames : Inclusion des cellules dans de l’agarose sur lames de microscope
Lyse: Triton X-100, 2.5 M NaCl
Nucleide; ADN compact
Déroulement de l’ADN : pH alcalin
Electrophorèse: pH> 13
Neutralisation
Coloration de l’ADN
Microscopie à Fluorescence
Analyse (100 comètes)
% ADN dans la queue est liée à la fréquence des cassures
Cellule individualisée
La Comète
Nucleoid; ADN relaché
Les boucles d’ADN cassé migrent vers l’anode formant la queue de la comète
Noyau non endommagé Noyau légèrement endommagé
Noyau endommagé Noyau fortement endommagé
Longueur
Analayse d’image par ordinateur
% ADN dans la queue(% ADN migrant)
Moment(ADN migrant x Longueur)
Classe 0
Classe 4Classe 3
Classe 1 Classe 2
W. Hassen & H. Bacha / 2ème Colloque Euro-Méditerranéen 13-16
Nov. 2006
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Control 5 µM 25 µM 50 µM 75 µM 100 µM
ZEN concentrations (µM)
Buffer
FPG
EndoIII
DN
A d
am
ag
e (
Arb
itra
ry u
nit
s s
core
)
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