agilent technologies dna fish id solution
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Agilent Technologies DNA Fish ID Solution
Identificación de pescados–Impacto en el mercado
Legislación
Industria
Consumidores
Sostenibilidad
Dirección de Cadena de suministro
Valor del producto, satisfacción del cliente
Métodos basados en Proteinas o DNA Uso para análisis de fraudes potenciales, mal etiquetado o casos de substitución
Métodos de identificación de pescados - Tradicional
Regulatory Fish Encyclopedia:U.S. Food and Drug Administration, 1993-2009
Métodos de identificación de pescados – DNA
Secuenciación Alta inversión incial (> 100K $) Alto coste de mantenimiento No aplicable con muestras mezcladas Métodos de elección para nuevas especies.
PCR-RFLP Discriminación entre especies sumamente relacionadas Trabaja con mezclas Bajo coste inicial
Método de identificación de pescados– PCR RFLP
Food Control 16 (7), 601-607, (2004)
http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5989-2982EN.pdf
J Agric Food Chem 53 (9), 3388-3357 (2005)
Mitocondrias: Alto número de copias Comunmente empleado el gen Cytochrome B (CytB) o Cytochrome Oxidase I (COX1) La secuencia del CytB aporta información para especies de pescados.
La PCR RFLP es un metódo acreditado/aprobado en muchos países. Transferencia del método a 2100 Bioanalyzer para mejorar el análisis edición 2004 y 2005 por Stephen Garrett de Campden BRI (Reino Unido)
Extraer el ADNAmplificar la región de interés en ADN
Fragmentar el ADN para generar los modelos especificos
PCR RFLP
El Agilent DNA Fish ID solution es un método simple, rápido y preciso basado en el screening del ADN para la identificación de diferentes especies de pescados frescos y procesados .
Mejorar la calidad de los productos
Reducir el impacto medio ambiental de actividades ilegales en la industria pesquera.
Mantener los registros adecuados para el cumplimiento con las regulaciones gubernamentales.
Agilent DNA Fish ID Solution
2100 Bioanalyzer VS Capillary Electrophoresis system
Gel analisi
s
Preparación de los chips(5 - 15 min): Procedimiento simple para seguir el protocolo Bajo volumen de muestra (1 µl)
Run y Detección (30 min): Alta sensiblidad (0.1 ng of DNA) Datos en formato digital
Analisis: Analisis automatizado (tamaño y cuantificación) Comparación entre muestras y runs Alta resolución(5 bp diferencia) + precisión (± 10%)
Preparar y correr el gel (1 - 3 h):
Grandes volumenes de muestra necesarios
Ticción, desteñido y adquisición de imagenes
(0.5 – 1 h):Baja sensiblidad (>50 ng DNA)
Las imagenes necesitan ser digitaizadas
Analisis:Resolución restringida
Alta variabilidad de tamaño No precisión cuantitativa
información < 1 h > 2 h
2100 BioanalyzerLab-on-a-chip system
gelelectrophoresi
s tradicional
Agilent DNA Fish ID Solution -
Purificación de la muestra
< 1 h(dependiendo # muestras)
Amplificación de secuencias de identificación de
especies
~ 1.5 h
Generación de modelos de especiesespecíficos
~2.5 h
< 1 h(dependiendo de # muestras)
Análisis de modelos usando el RFLP Decoder
~ 6 h de muestra al resultado
1. Utilizar 40 mg – 1 g tejido (fresco, congelado, o procesado)Homogenización opcional
2. Digerir con Proteinasa K Digestion BufferIncubar a 65oC for 10 min Total Time: 15 min
3. Obtener el ADN de la spin column 5 min
4. Lavar con High Salt Buffer (1X)
Lavar con 80% Etanol (3X) 5 min
5. Eluir ADN 5 min
Paso 1: Extracción de ADN de tejidos en peces usando el Agilent DNA Fish ID Solution
< 1 hr deltejido al DNA
Page 9 April 21, 2023Public
Alto rendimiento de la variedad A de muestras de pescado
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0
2
4
6
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10
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14
16
18
AtlanticSalmon -
wild
Tilapia-wild
Catfish -farm
PacificCod -wild
Tilapia-farm
Scallop -wild
TroutReinbow
- farm
Dover -wild
Tuna -wild
Salmon -farm
BasaSwai -farm
SnapperPacific-
wild
Rango de rendimiento: 2-18 µg en 40 mg tejidoPureza: Media de 2.19 A260/A280 PCR Requerimientos: 0.5 – 500 ng
To
tal y
ield
, µ
g
To
tal y
ield
, µ
g
Competitor Kits Agilent Kit
Average 260/280: 1.41
Average 260/280: 2.09
Extracciones de variedades de especies de pescado
Rendimiento en diferentes muestras alternativas
(40 mg por muestra)D
NA
Yie
ld,
ug
6.6µg 3.7µg
43µg
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Step 2: PCR
cytb
PCR Amplicon
PCR Master Mix
PCR Cycling
1.5-2 hrs
Fish Primer Mix
+ 1 µl Extracto ADN de pescado O
Control positivo ADN de Salmon
April 21, 2023Public
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Sal
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farm
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)
Validación de la amplifiación de diferentes especies de pescado
April 21, 2023Public
SPECIES 1
Polymerase Chain Reaction (PCR) – Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP)
Dig
erir
con
Enzy
me
A
Dig
eri
r c
on
E
nzy
me
B
Digerir con
Enzyme C
SPECIES 2
EL
EC
TR
OF
OR
ES
IS
PCR: Amplificar con
primers genéricos para peces
Muestra ADN
PCR productos:“amplicon”
April 21, 2023Public
Step 3: Digestión con Enzimas de restricción
Digerir con DdeI
Dig
erir
co
n
Ha
e II
I
Digerir con Nla III
PCR Amplicon
Inactivar Enzimas con EDTA @ 65°C x 15 min
(2 hr tiempo de digestión)
April 21, 2023Public
Step 4: Bioanalyzer Lab-On-A-Chip Electrophoresis
ABC
A
B C
Preparar Fish ID ChipAñadir PCR-RFLPproductos
Correr muestra en el Agilent 2100 Bioanalyzer
Analizar resultad
os
• Descongelar los reactivos• Preparar gel/dye mix
• Seleccionar aplicación• Click START• <30 min run
• Cargar muestra ( 1 µL)•Agitar 1 minuto
April 21, 2023Public
Digestión restrictiva de los amplicons de diferentes muestras de pescados
Pa
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DdeI
Hae III
Nla III
April 21, 2023Public
Interpretación de Resultados – RFLP Decoder Software
April 21, 2023Public
Pattern 1(Dde I)scoring panel
Pattern 2(Hae III)scoring panel
Pattern 3(Nla III)scoring panel
Sample selectionPuntuación combinada:
Indica la mayoría de las especiesEl valor de la Puntuación indica la
calidad del emparejamiento.
Histograma:La Separación de las principales especies de aquellas con menor puntuación ofrece una mayor confianza en el resultado.
Entrada manual o Automatica de los productos digeridos
Paso 5: Coincidencia de modelos con el RFLP Decoder Software
Rangos de puntuación para cada enzima en relación a las especiesPuntuación combinada de las 3 digestiones en relación a una especie. April 21, 2023
Public
Coincidencia de patrones: RFLP Report
Page 19 April 21, 2023Public
Modelos de RFLP con mezclas de pescados
Limites de detección en mezclas: 5%
CodHaddockMixture
April 21, 2023Public
Resumen de Agilent DNA Fish ID Solution
Fácil de usar y simple Los Reactivos + Equipo+ software = Solución completa Patrones de base de datos de especies específicas elimina la necesidad de autentificado de muestra en la misma prueba
Resultados rápidos de un amplio rango de muestras De la muestra al resultado en un solio día de trabajo usando un protocolo simple Aplicable a pescados crudos, cocidos, ahumados, secos y salados
Resultados precisos y fiables Basados en un metodo fiable aprovado y acreditado en muchos paises. Base de datos ampliable por el usuario y teóricos perfiles de más de 200 especies.
• Agilent DNA Fish ID Ensemble - 5500-0100• Agilent DNA Isolation Kit - 5500-0051• Agilent PCR-RFLP Fish ID Kit - 5500-0001• Agilent DNA 1000 Kit - 5067-1504
• Agilent RFLP Decoder Software, Fish - G5301A
• Agilent 2100 Bioanalyzer with chip priming station and IKA vortex mixer – G2939AA
Agilent DNA Fish ID Solution:Referencias:
Muchas gracias!
HUGO_MINGO@AGILENT.COMAMPARO_DAVILA@AGILENT.COM
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