agilent technologies dna fish id solution

Agilent Technologies DNA Fish ID Solution

Identificación de pescados–Impacto en el mercado

Legislación

Industria

Consumidores

Sostenibilidad

Dirección de Cadena de suministro

Valor del producto, satisfacción del cliente

Métodos basados en Proteinas o DNA Uso para análisis de fraudes potenciales, mal etiquetado o casos de substitución

Métodos de identificación de pescados - Tradicional

Regulatory Fish Encyclopedia:U.S. Food and Drug Administration, 1993-2009

Métodos de identificación de pescados – DNA

Secuenciación Alta inversión incial (> 100K $) Alto coste de mantenimiento No aplicable con muestras mezcladas Métodos de elección para nuevas especies.

PCR-RFLP Discriminación entre especies sumamente relacionadas Trabaja con mezclas Bajo coste inicial

Método de identificación de pescados– PCR RFLP

Food Control 16 (7), 601-607, (2004)

http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5989-2982EN.pdf

J Agric Food Chem 53 (9), 3388-3357 (2005)

Mitocondrias: Alto número de copias Comunmente empleado el gen Cytochrome B (CytB) o Cytochrome Oxidase I (COX1) La secuencia del CytB aporta información para especies de pescados.

La PCR RFLP es un metódo acreditado/aprobado en muchos países. Transferencia del método a 2100 Bioanalyzer para mejorar el análisis edición 2004 y 2005 por Stephen Garrett de Campden BRI (Reino Unido)

Extraer el ADNAmplificar la región de interés en ADN

Fragmentar el ADN para generar los modelos especificos

PCR RFLP

El Agilent DNA Fish ID solution es un método simple, rápido y preciso basado en el screening del ADN para la identificación de diferentes especies de pescados frescos y procesados .

Mejorar la calidad de los productos

Reducir el impacto medio ambiental de actividades ilegales en la industria pesquera.

Mantener los registros adecuados para el cumplimiento con las regulaciones gubernamentales.

Agilent DNA Fish ID Solution

2100 Bioanalyzer VS Capillary Electrophoresis system

Gel analisi

s

Preparación de los chips(5 - 15 min): Procedimiento simple para seguir el protocolo Bajo volumen de muestra (1 µl)

Run y Detección (30 min): Alta sensiblidad (0.1 ng of DNA) Datos en formato digital

Analisis: Analisis automatizado (tamaño y cuantificación) Comparación entre muestras y runs Alta resolución(5 bp diferencia) + precisión (± 10%)

Preparar y correr el gel (1 - 3 h):

Grandes volumenes de muestra necesarios

Ticción, desteñido y adquisición de imagenes

(0.5 – 1 h):Baja sensiblidad (>50 ng DNA)

Las imagenes necesitan ser digitaizadas

Analisis:Resolución restringida

Alta variabilidad de tamaño No precisión cuantitativa

información < 1 h > 2 h

2100 BioanalyzerLab-on-a-chip system

gelelectrophoresi

s tradicional

Agilent DNA Fish ID Solution -

Purificación de la muestra

< 1 h(dependiendo # muestras)

Amplificación de secuencias de identificación de

especies

~ 1.5 h

Generación de modelos de especiesespecíficos

~2.5 h

< 1 h(dependiendo de # muestras)

Análisis de modelos usando el RFLP Decoder

~ 6 h de muestra al resultado

1. Utilizar 40 mg – 1 g tejido (fresco, congelado, o procesado)Homogenización opcional

2. Digerir con Proteinasa K Digestion BufferIncubar a 65oC for 10 min Total Time: 15 min

3. Obtener el ADN de la spin column 5 min

4. Lavar con High Salt Buffer (1X)

Lavar con 80% Etanol (3X) 5 min

5. Eluir ADN 5 min

Paso 1: Extracción de ADN de tejidos en peces usando el Agilent DNA Fish ID Solution

< 1 hr deltejido al DNA

April 21, 2023Public

Alto rendimiento de la variedad A de muestras de pescado

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

AtlanticSalmon -

wild

Tilapia-wild

Catfish -farm

PacificCod -wild

Tilapia-farm

Scallop -wild

TroutReinbow

- farm

Dover -wild

Tuna -wild

Salmon -farm

BasaSwai -farm

SnapperPacific-

wild

Rango de rendimiento: 2-18 µg en 40 mg tejidoPureza: Media de 2.19 A260/A280 PCR Requerimientos: 0.5 – 500 ng

To

tal y

ield

, µ

g

To

tal y

ield

, µ

g

Competitor Kits Agilent Kit

Average 260/280: 1.41

Average 260/280: 2.09

Extracciones de variedades de especies de pescado

Rendimiento en diferentes muestras alternativas

(40 mg por muestra)D

NA

Yie

ld,

ug

6.6µg 3.7µg

43µg


Step 2: PCR

cytb

PCR Amplicon

PCR Master Mix

PCR Cycling

1.5-2 hrs

Fish Primer Mix

+ 1 µl Extracto ADN de pescado O

Control positivo ADN de Salmon


http://www.stratagene.com/products/showCategory.aspx?catId=25

http://rds.yahoo.com/_ylt=A9G_bDnZJZxKsh0BjKWjzbkF/SIG=12ns4cm1p/EXP=1251833689/**http:/media.biocompare.com/bcimages/spotlight/sp367_stratagene.jpg

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Pac

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Co

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farm

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)

Validación de la amplifiación de diferentes especies de pescado


SPECIES 1

Polymerase Chain Reaction (PCR) – Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP)

Dig

erir

con

Enzy

me

A

Dig

eri

r c

on

E

nzy

me

B

Digerir con

Enzyme C

SPECIES 2

EL

EC

TR

OF

OR

ES

IS

PCR: Amplificar con

primers genéricos para peces

Muestra ADN

PCR productos:“amplicon”


Step 3: Digestión con Enzimas de restricción

Digerir con DdeI

Dig

erir

co

n

Ha

e II

I

Digerir con Nla III

PCR Amplicon

Inactivar Enzimas con EDTA @ 65°C x 15 min

(2 hr tiempo de digestión)


Step 4: Bioanalyzer Lab-On-A-Chip Electrophoresis

ABC

A

B C

Preparar Fish ID ChipAñadir PCR-RFLPproductos

Correr muestra en el Agilent 2100 Bioanalyzer

Analizar resultad

os

• Descongelar los reactivos• Preparar gel/dye mix

• Seleccionar aplicación• Click START• <30 min run

• Cargar muestra ( 1 µL)•Agitar 1 minuto


Digestión restrictiva de los amplicons de diferentes muestras de pescados

Pa

cif

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farm

)

Sn

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wil

d)

DdeI

Hae III

Nla III


Interpretación de Resultados – RFLP Decoder Software


Pattern 1(Dde I)scoring panel

Pattern 2(Hae III)scoring panel

Pattern 3(Nla III)scoring panel

Sample selectionPuntuación combinada:

Indica la mayoría de las especiesEl valor de la Puntuación indica la

calidad del emparejamiento.

Histograma:La Separación de las principales especies de aquellas con menor puntuación ofrece una mayor confianza en el resultado.

Entrada manual o Automatica de los productos digeridos

Paso 5: Coincidencia de modelos con el RFLP Decoder Software

Rangos de puntuación para cada enzima en relación a las especiesPuntuación combinada de las 3 digestiones en relación a una especie. April 21, 2023

Public

Coincidencia de patrones: RFLP Report


Modelos de RFLP con mezclas de pescados

Limites de detección en mezclas: 5%

CodHaddockMixture


Resumen de Agilent DNA Fish ID Solution

Fácil de usar y simple Los Reactivos + Equipo+ software = Solución completa Patrones de base de datos de especies específicas elimina la necesidad de autentificado de muestra en la misma prueba

Resultados rápidos de un amplio rango de muestras De la muestra al resultado en un solio día de trabajo usando un protocolo simple Aplicable a pescados crudos, cocidos, ahumados, secos y salados

Resultados precisos y fiables Basados en un metodo fiable aprovado y acreditado en muchos paises. Base de datos ampliable por el usuario y teóricos perfiles de más de 200 especies.

• Agilent DNA Fish ID Ensemble - 5500-0100• Agilent DNA Isolation Kit - 5500-0051• Agilent PCR-RFLP Fish ID Kit - 5500-0001• Agilent DNA 1000 Kit - 5067-1504

• Agilent RFLP Decoder Software, Fish - G5301A

• Agilent 2100 Bioanalyzer with chip priming station and IKA vortex mixer – G2939AA

Agilent DNA Fish ID Solution:Referencias:

Muchas gracias!

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