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  • 6/21/2016

    1

    Agilent HPLC Day:

    Consideraciones Prcticas en HPLC

    Facultat de Farmcia

    Universitat ValenciaBurjassot, 7 Juliol 2016

    Isidre Masana

    Agilent Technologies

    Especialista Productos UHPLC/MS

    9:30-10:15h

    Agilent InfinityLab LCs

    Agenda

    1. Preparacin y Seleccin de la Fase Mvil.

    2. Acondicionamiento HPLC y Columna.

    3. Preparacin de la Muestra.

    4. Consideraciones en la Inyeccin.

    5. Precauciones con la Columna.

    Procedimientos de lavado de columna.

    Influencia de los capilares de conexin.

    6. Trabajo con Gradientes de Concentracin.

    7. Consideraciones en la Deteccin.

    8. Resumen.

    Objetivo: Buenas Prcticas para trabajar correctamente y evitar

    problemas en U/HPLC.

    Idea / Recomendacin prctica. TroubleshootingTS

  • 6/21/2016

    2

    Agenda

    1. Preparacin y Seleccin de la Fase Mvil.

    2. Acondicionamiento HPLC y Columna.

    3. Preparacin de la Muestra.

    4. Consideraciones en la Inyeccin.

    5. Precauciones con la Columna.

    Procedimientos de lavado de columna.

    Influencia de los capilares de conexin.

    6. Trabajo con Gradientes de Concentracin.

    7. Consideraciones en la Deteccin.

    8. Resumen

    Objetivo: Buenas Prcticas para trabajar correctamente y evitar

    problemas en U/HPLC.

    Idea / Recomendacin prctica. TroubleshootingTS

    Consideraciones Operatorias en la

    Preparacin/Seleccin de la Fase Mvil (1) Emplear productos de elevada pureza* (10 l. eluy. 0.01% impureza => 1gr.).

    Muy importante con gradientes de concentracin, especialmente en anlisis de trazas a

    bajas : en estos casos utilizar disolventes calidad HPLC para gradientes + far UV.

    En isocrtico se pueden utilizer solventes HPLC ms econmicos.

    *Utilizar material perfectamente limpio y enjuagado con los propios disoventes.

    Deriva de lnea de base producida por la distinta

    absorbancia de la fase mvil inicial y final. El CH3-CN da menor deriva que CH3OH.

    min5 10 15 20 25

    mAU

    0

    50

    100

    150

    200

    250

    300

    350

    400

    DAD1 A, Sig=210,10 Ref=360,100 (GRAD0801\NV--0201.D) DAD1 B, Sig=230,10 Ref=360,100 (GRAD0801\NV--0201.D) DAD1 D, Sig=280,10 Ref=360,100 (GRAD0801\NV--0201.D)

    400mUA

    Blanco gradiente a 1ml/min

    de CH3OH /H2O 5 a 100%

    en 20 min.Columna 125 x 4mm 5 C18

    210nm

    350mUA

    230nm 20mUA280nm 1mUA

    Gradiente con

    Metanolcalidad HPLC

    Origen: impurezas presentes en la fase mvil; las debidas a

    eluyente inicial incrementan su rea proporcionalmente al

    tiempo de equilibrado de la columna.

    min10 12.5 15 17.5 20 22.5 25 27.5

    mAU

    0

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    DAD1 A, Sig=210,10 Ref=360,100 (GRAD0801\NV--1402.D) DAD1 B, Sig=230,10 Ref=360,100 (GRAD0801\NV--1402.D) DAD1 D, Sig=280,10 Ref=360,100 (GRAD0801\NV--1402.D)

    40mUA

    Blanco gradiente a 1ml/min de CH3CN

    /H2O 5 a 100% en 20 min.Columna 125 x 4mm 5 C18

    210nm

    16 mUA

    230nm 2mUA

    280nm 0mUA

    Gradiente con

    Acetonitrilo Calidad HPLC

    Pgina: 4

    TSTS

  • 6/21/2016

    3

    Disolventes HPLC: Mnimas Longitudes

    de Onda de Trabajo

    Al acercamos a la del Cut-off (aborbancia (eluyente)= 1 U.A. )

    aumentarn el ruido y la deriva de lnea de base en

    gradientes de concentracin y disminuirn la sensibilidad y

    rango de linealidad.

    Al aumentar la diferencia de absorbancia entre los

    disolventes mezclados por la bomba, aumentar el ruido

    de mezcla obtenido.

    Wavelength (nm)190 200 210 220 230 240 250 260

    Absorbance (

    AU

    )

    0

    0.2

    0.4

    0.6

    0.8 Espectros UV/VIS

    Metanol y

    Acetonitrilo

    200 210 220 230 240 250 nm

    200 220 240 260 280 300 320 340nmWavelength (nm)200 220 240 260 280 300 320

    Absorb

    ance (

    AU

    )

    0

    0.2

    0.4

    0.6

    0.8

    n-Hexano

    iso-OH

    CH2Cl2

    THF

    Agua + 100ppm Azida Sdica

    Acetona

    1 UAEspectros UV/VIS

    Utilizar acetonitrilo para

    trabajar a bajas longitudes de

    onda con gradientes de

    concentracin, el metanol da

    derivas de lnea de base muy

    apreciables.

    min5 10 15 20 25

    mAU

    0

    50

    100

    150

    200

    250

    300

    350

    DAD1 A, Sig=210,10 Ref=360,100 (GRAD0801\NV--1402.D) DAD1 A, Sig=210,10 Ref=360,100 (GRAD0801\NV--0301.D)

    Metanol

    350mUA

    Acetonitrilo

    16mUA

    Blanco gradiente a 1ml/min de Orgnico

    /Agua 5 a 100% en 20 min.Columna 125 x 4mm 5 C18

    400mUA

    Tomar como blanco/cero el espectro del eluyente de condiciones iniciales

    Pgina: 5

    TS

    TS

    Ojo: metanol a 210nm

    saturara celdas de

    6cm camino ptico

    210 250

    260220 340240

    220

    220

    TS

    5-40m

    Consideraciones Operatorias en la

    Preparacin de la Fase Mvil (2)

    Medir volmenes agua/orgnico por separado (los volmenes NO son aditivos).

    En isocrtico preparar la mezcla reduce el ruido de mezcla* de la lnea de base.

    Utilizar un tampn adecuado al pH de trabajo (pH= pKa tampn +/-1). Para un buen control del grado de ionizacin del analito y obtener tiempos reproducibles**

    Microfiltrar fase mvil (a diario en agua y en soluciones acuosas/ tampones). El agua ultrapura (HPLC) y las soluciones acuosas son un excelente medio de cultivo para el

    crecimiento de algas y microorganismos que luego obstruirn los filtros del cromatgrafo y de la

    columna. UHPLC exige microfiltrar por 0.2m

    Proteger a las soluciones acuosas de la luz con botellas color topacio.

    Las soluciones acuosas NO deben dejarse varios das sin renovar en el interior de las

    botellas, conductos, desgasificadores on-line,

    La adicin de >30% de solvente orgnico al agua/tampn evita el crecimiento de algas y

    microorganismos.

    Si no se va a emplear ms de un 70% de agua, el utilizar una mezcla con ms del 30% de solvente orgnico

    en la botella (en lugar de 100% agua) evitar tener que renovarla muy frecuentemente.

    Para estabilizar soluciones acuosas, cuando se trabaja a > 260nm. se puede adicionar azida

    sdica (p.e. 100ppm).

    Con acetonitrilo es preferible utilizar fosfatos potsicos en vez de sdicos (dada su mayor solubilidad).

    *Ruido de mezcla sistema bombeo: ruido irregular de baja frecuencia. // **Ver pg. 10. Especialmente para analitos con pKs prximos a pH trabajo.

    Pgina: 6

    TS

    TS

  • 6/21/2016

    4

    Problema n 1 = utilizar Agua HPLC

    GRAN RESERVA

    Problema Tpico con las Soluciones Acuosas

    Las soluciones acuosas NO deben dejarse varios das

    sin renovar en el interior de las botellas, conductos, desgasificadores on-line,

    Problema n 1* en HPLC !!!! (en usuarios sin experiencia)

    Pgina: 7

    TS

    Consideraciones Operatorias en la

    Desgasificacin de la Fase Mvil (3):

    La fase mvil se debe desgasificar en continuo o justo antes de su uso (siempre que la bomba se mezcle disolventes).

    Hoy en da se utiliza mayoritariamente desgasificacin en lnea por vaco* (la ms efectiva).

    Antiguamente se utilizaban: burbujeo de Helio, o Ultrasonidos+Vaco (3-5 min.), o Calentamiento (recomendado en soluciones acuosas), o Vaco+Agitacin.

    Con mezclas de eluyentes, un burbujeo excesivo de helio o demasiado tiempo de vaco o calentamiento aumentar la proporcin del componente menos voltil (p.e.

    agua).

    Al renovar eluyentes NO olvidarse del volumen interior del desgasificador; varia entre 1ml (microdegasser), 1.5mL (incorporado en bomba), 12mL (standard degasser 1100) y 36 ml (HP1050).

    Si el desgasificador y los tubos de conexin no se han purgado bien, el HPLC tardar mucho en equilibrarse y proporcionar tiempos de

    retencin repetitivos.

    Pgina: 8

    TS

  • 6/21/2016

    5

    Recomendacin de Tiempos Mnimos de

    Acondicionamiento Desgasificadores

    Pgina: 9

    Tiempos de purga en funcin degasser, flujo y tipo renovacin

    Volumenestimado

    (mL)

    Volumen tubo botella a degasser

    (puramente orientativo cambia

    dependiendo configuracin)

    Renovacin LIGERA (2-3 veces volumen a renovar) Renovacin de la misma fase o

    "semejante"

    Renovacin INTENSA (5 veces volumen a renovar)

    Renovacin de fases distintas o "no semejantes"

    Tiempo min. purga a

    2.5mL/min

    Tiempo min. purga a

    5mL/min

    Tiempo min. purga a

    2.5mL/min

    Tiempo min. purga a

    5mL/min

    G4225A: High Performance-Degasser (hasta 10mL/min) 0.45 10 10 5 21 10

    G1379A B: Micro-Degasser (hasta 5mL/min) 1 10 11 6 22 11

    Degasser integrated in 1260/1290 Pumps 1.5 10 12 6 23 12

    G1322A Standard Degasser (hasta 10mL/min) 12 10 22 11 44 22

    Degasser 1050 36 10 46 23 92 46

    Se pueden unir 2 canales en serie, si interesa aumentar la capacidad de desgasificacin (p.e. a flujos

    muy elevados).

    Si los filtros de toma de solvente estn en buen estado, ste debe fluir libremente simplemente por

    efecto de la gravedad.

    Si a flujos elevados (>3mL/min) se observa la aparicin de pequeas burbujas (efecto cavitacin), los

    filtros de toma de solvente deberan cambiarse (o limpiarlos por sonicacin).

    10-35m

    Acondicionado del HPLC y de la Columna

    ACONDICIONADO HPLC: ANTES DE BOMBEAR POR COLUMNA (crtico en UHPLC).

    Purgar bien todos los canales

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