acsm nas neoplasias

ANTICORPOS MONOCLONAIS – Aplicações em Neoplasias 2011

ABSTRACT:

Over the last 30 years, therapeutic monoclonal antibodies have become an

increasingly important component of pharmacotherapy. Methods to generate

monoclonal antibodies to antigens of neoplastic cells have revolutionized our

understanding of cancer cell growth and differentiation, diagnosis, and treatment.

Monoclonal antibodies have been critical reagents for the discovery and

characterization of many key molecules involved in the behavior of neoplastic cells.

Currently, monoclonal antibodies are widely used in the differential diagnosis of

cancer and are key elements in the treatment of many forms of cancer. This review will

focus on the roles that monoclonal antibodies play in the treatment of hematological

malignancies. In particular, will be focused on acute myeloid leukemia and mature B-

cell neoplasms.

Key Words: monoclonal antibody, hematological malignancies, lymphoma, leukemia.

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RESUMO:

Nos últimos 30 anos, os anticorpos monoclonais para fins terapêuticos tornaram-se

componentes cada vez mais importantes na farmacoterapia. Os métodos para gerar

anticorpos monoclonais para antígenios de células neoplásicas têm revolucionado a

nossa compreensão sobre o crescimento e a diferenciação de células cancerígenas, o

seu diagnóstico e tratamento. Os anticorpos monoclonais foram reagentes críticos

para a descoberta e caracterização de muitas moléculas chave envolvidas no

comportamento de células neoplásicas.

Atualmente, os anticorpos monoclonais são amplamente utilizados no diagnóstico

diferencial do cancro e são elementos chave no tratamento de muitas formas de

cancro. Esta revisão vai-se focar nas funções que os anticorpos monoclonais,

aprovados até à data, desempenham no tratamento de doenças hematológicas. Em

particular, vai-se focar na leucemia mielóide aguda e neoplasias das células B maduras.

Palavras-chave: Anticorpos monoclonais, neoplasias hematológicas, linfoma, leucemia.

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ÍNDICE

1 Introdução ---------------------------------------------------------------------------------------- --4

2 Métodos--------------------------------------------------------------------------------------------5

3 Anticorpos Monoclonais -----------------------------------------------------------------------6

3.1 Definição ---------------------------------------------------------------------------------------6

3.2 Obtenção --------------------------------------------------------------------------------------9

3.3 Mecanismo de Ação -----------------------------------------------------------------------19

3.4 Aplicação em Neoplasias Hematopoieticas-------------------------------------------21

3.4.1 Leucemia Mielóide Aguda--------------------------------------------------------------22

3.4.2 Linfoma Não-Hodgkins------------------------------------------------------------------26

3.4.3 Leucemia Linfocitica Crónica ---------------------------------------------------------36

3.5 Vantagens e Inconvenientes -------------------------------------------------------------43

3.6 Perspectivas Futuras de Utilização -----------------------------------------------------45

4 Conclusão --------------------------------------------------------------------------------------47

5 Bibliografia ------------------------------------------------------------------------------------48

6 Agradecimentos ------------------------------------------------------------------------------53

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1 INTRODUÇÃO

Nas últimas 3 décadas, os Anticorpos monoclonais (AcsM) tornaram-se cada vez mais

importantes para a farmacoterapia e tiveram um impacto significativo sobre a

descoberta de fármacos e no desenvolvimento de processos. Estima-se que mais de

500 AcsM estão actualmente em desenvolvimento, e que cerca de 30 AcsM

encontram-se aprovados pela Food and Drug Administration (FDA). A maioria dos que

já estão aprovados são para indicações oncológicas, mas a aplicação terapêutica está a

alargar-se para doenças auto-imunes, respiratórias, metabólicas e do sistema nervoso

central. Uma consequência importante da expansão da terapia com AcsM é a sua co-

administração com regimes farmacoterapêuticos estabelecidos.(1)

Até à data, existem seis AcsM aprovados pela FDA para o tratamento de neoplasias

hematológicas, o seu uso terapêutico levou à melhoria dos resultados e a uma

diminuição da toxicidade relativamente aos regimes de quimioterapia convencionais. A

redução da toxicidade resulta da sua especificidade para as células neoplásicas

afetando pouco as células não neoplasicas.(2)

Este trabalho vai-se focar principalmente nos AcsM aprovados pela FDA para uso

terapêutico nas neoplasias hematológicas, nomeadamente na leucemia mielóide

aguda e neoplasias das células B maduras.

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2. MÉTODOS:

Nesta revisão, os suportes bibliográficos utilizados consistem em artigos científicos,

livros e Web sites. A obtenção de artigos foi possível através de pesquisas no PubMed

com várias combinações de diversas palavras-chave, nomeadamente, Antibody,

Monoclonal antibody, Hematological malignancy, Lymphoma, Non-Hodgkin lynphoma,

follicullar lymphoma, Leukemia, Acute myeloid leukemia, Chronic lymphocitic

leukemia, CD20, CD33, CD52 Rituximab, Ofatumumab, Alemtumumab, Gemtuzumab,

Lintuzumab, Ibritumomab Tiuxetan, Tozitumomab, Brentuximab, Campath, Mylotard,

Zevalin, Rituxan, Bexxar, Adcetris, Radioimmunotherapy, immunoconjugate.

Nos artigos obtidos com este método, certificou-se a existência de publicações

relevantes e/ou Web sites nas suas bibliografias e, nesse caso, procedeu-se à pesquisa

para obter o artigo, no PubMed ou Google. Quando o acesso ao artigo completo foi

restrito, considerou-se o resumo do mesmo, apesar da informação ser limitada. Alguns

Web sites também remeteram para outros.

Para justificar a falta de qualquer contribuição relevante, note-se que este

procedimento foi conduzido desde a segunda quinzena de Agosto de 2011 até à última

semana de Dezembro de 2011.

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3 ANTICORPOS MONOCLONAIS:

3.1 DEFINIÇÃO

Os anticorpos (Acs) são moléculas de imunoglobulina bivalente com forma de Y do

sistema imunitário dos vertebrados (Figura 1), que exibem um nível extremamente

elevado de diversidade na especificidade de ligação a antigénios (Ags) alvo. Isto deve-

se ao seu domínio variável (V), que consiste numa sequência de aminoácidos única

presente nas suas cadeias leves e pesadas, que reconhece diferentes Ags e que são

gerados por inúmeros rearranjos do DNA cromossomal durante a maturação dos

linfocitos B.(3)

Fig. 1- Estrutura geral de IgG e suas regiões críticas para cada função. 6

Em 1975, os investigadores Georges Köhler e Cesar Milstein conseguiram, ao fundir

células de mieloma com linfocitos B produtores de Acs com determinada

especificidade, criar um novo tipo de célula, designada por hibridoma, que se

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multiplica em cultura, mantendo uma linha celular “imortal” e produtora de Acs com

uma determinada especificidade, os AcsM. Os AcsM são uma preparação pura de Acs

que são especificos para um único Ag. (4)

Inicialmente, os AcsM eram de origem murina e eram gerados através da tecnologia de

hibridoma. Devido às diferenças entre o sistema imunitário humano e o do rato, estes

AcsM eram geralmente (embora nem sempre) ineficazes no tratamento do cancro em

humanos, devido à impossibilidade de se administrar infusões repetidas. Os avanços

tecnológicos na engenharia de proteínas recombinantes e ratos transgénicos levaram

ao desenvolvimento de AcsM quiméricos, humanizados e totalmente humanos, o que

ajudou a resolver estas limitações e acelerou o desenvolvimento de Acs com uso

terapêutico. (5)

Os AcsM murinos derivam inteiramente de ratos usando a tecnologia do hibridoma,

que envolve a fusão de células de mieloma imortalizadas com células B de ratos

imunizados. Nos seres humanos, estes Acs têm utilidade clínica limitada, porque têm

uma semi-vida curta quando em circulação, são imunogénicos e dificilmente induzem

respostas imunes efetoras nos humanos. A sua principal utilização tem sido a de

servirem como agentes alvo para radioisótopos ou citotoxinas que matam as células

tumorais alvo. Actualmente existem somente dois Acs murinos radiomarcados

aprovados para uso na terapia oncológica, o ibritumomab tiuxetan e o tositumomab.(5)

O desejo de reduzir a imunogenicidade e aumentar a eficiência imunológica dos Acs

levou à produção de AcsM quiméricos e humanizados. Os AcsM quiméricos são

construídos fundindo as regiões variáveis de murino com as regiões constantes de

humano. Os AcsM humanizados foram construídos enxertando Acs humanos com

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regiões de ligação a Ags de murino. A maioria dos AcsM aprovados para a terapêutica

do cancro são humanizados. (5)

Os AcsM totalmente humanos foram desenvolvidos para reduzir ainda mais a

imunogenicidade associada aos AcsM quiméricos, os quais ainda mantêm alguns

componentes murinos. Estes são produzidos usando ratos transgénicos (animais

transgénicos portadores de um sistema imunitário "humano"). O panitumumab e o

ofatumumab são dois AcsM totalmente humanos que se encontram aprovados para

uso clínico.(5)

Embora existam várias classes / subclasses de imunoglobulinas em humanos,

atualmente os Acs para fins terapêuticos são na sua maioria do isotipo IgG1, devido à

sua semi-vida sérica longa e a sua grande capacidade de desempenharem funções

efetoras, relativamente às outras classes / subclasses.(6)

A estrutura básica da IgG1 humana é um heterodímero de ~ 150 kDa, constituído por

duas cadeias leves e duas pesadas em associação covalente e não-covalente, dividido

em três partes de proteínas independentes: dois domínios Fab e um domínio Fc,

ligados por um polipeptido flexível formando a região hinge (Figura 1). Os N-terminais

de cada cadeia leve e pesada encontram-se ligados às regiões variáveis (VL e VH), que

determinam a sua afinidade / especificidade de ligação às moléculas de Ag. O resto da

molécula de Ac, conhecida como a região constante, consiste num domínio CL,

constituinte da cadeia leve, e um domínio CH, dividido nas regiões CH1, hinge, CH2 e

CH3, constituindo a cadeia pesada. Enquanto a região variável determina a ligação aos

Ags alvo, é o domínio Fc que desencadeia as funções efetoras ligando-se a recetores

celulares tipo Fc (FcγRI, FcγRII e FcγRIII) e ao componente C1q do complemento. (6)

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3.2 OBTENÇÃO

O método convencional de obtenção de AcsM, foi descrito por Kholer & Milstein, em

1975. Este método começa com a imunização de ratinhos com um determinado Ag, a

obtenção das células B produtoras de Acs com a especificidade seleccionada e que, ao

fundirem-se com um plasmócito de mieloma, vai originar hibridomas, cada um deles

produtor de Acs rigorosamente iguais e com igual especificidade para um só dos

epitopos (grupo químico determinante) do Ag. Cada hibridoma, depois de isolado, vai

multiplicar-se, assegurando a produção de um determinado AcM (Figura 2). Pela

primeira vez foi possível obter AcsM, homogéneos, da mesma classe e com a mesma

especificidade, produzidos por hibridomas que são células estáveis, que se

reproduzem em cultura, com carácter de continuidade ilimitado, o que assegura uma

produção fácil e praticamente ilimitada de AcsM.(4)

Fig. 2- Método convencional de obtenção de AcsM. (4)

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A produção de AcsM em células de mamíferos consiste num longo processo que

envolve as etapas de transfeção do gene de interesse para o interior das células,

seleção de clones, a adaptação a diferentes condições de cultura, cultura em

biorreatores e aumento de escala até ao nível industrial.(7)

O processo começa com o desenvolvimento duma linhagem celular adequada. Se o

objetivo for a produção de pequenas quantidades de AcsM, as células de rim do

macaco verde Africano são as mais apropriadas. No entanto, não são as mais

adequadas para processos de produção em larga escala, uma vez que perdem

capacidade de produção ao longo do tempo. (8) Nesse caso, as células mais utilizadas

atualmente para esta aplicação são as células de ovário de hamster chinês, uma vez

que têm as vantagens de serem seguras para uso em seres humanos, apresentam

facilidade de transfeção, possuem um poderoso sistema de amplificação de genes, têm

facilidade de adaptação para o crescimento em suspensão e em meio livre de soro, e a

capacidade de crescer em altas densidades.(7)

As células de hibridoma foram muito usadas durante várias décadas na produção de

AcsM, no entanto, são cada vez menos usadas devido à sua sensibilidade às alterações

ambientais e aos compostos tóxicos formados durante o crescimento celular, o que

dificulta a sua cultura em grande escala. (8)

A transfeção consiste na introdução do DNA nas células e envolve várias etapas, desde

a concepção do vetor de expressão, da definição do método de transfeção (sistema de

expressão e de sistema de entrega de DNA) até à seleção das células transfetadas com

as características mais desejáveis.(8)

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Os vetores devem exibir três características principais: níveis de expressão

independentes do seu local de integração no genoma, níveis de expressão

correlacionados com o número de cópias do transgene integrado e a manutenção da

eficiência de expressão ao longo do tempo. Devido a estes requisitos, os vetores

usados são normalmente plasmídeos. Os plasmídeos são moléculas circulares de DNA,

que existem nas células bacterianas para além do seu cromossoma principal, e como

possuem pelo menos uma origem de replicação podem replicar-se dentro das células.

(7)

A capacidade de expressar genes em células de mamíferos requer o uso de dois tipos

de elementos: os promotores, que conduzem a expressão do gene recombinante,

promovendo e posicionando o inicio da transcrição; e os potenciadores (enhancers),

que aumentam a transcrição. Os promotores/potenciadores mais utilizados são

provenientes do vírus símio 40 (VS40) e do citomegalovírus (CMV). (7)

Para estabilizar e promover a translação do transcrito primário podem ser usados

sinais de poliadenilação, sequências de Kozac e sequências intervenientes. Os sinais de

poliadenilação derivados de VS40 e da hormona de crescimento bovina são os mais

usados e pensa-se que prolongam a meia-vida do RNAm no citoplasma e permitem a

translação eficiente. A sequência de Kozac é óptima para circundar o codão de

iniciação dos genes dos mamíferos e é usada para melhorar a iniciação translacional do

RNAm do gene de interesse. As sequências intervenientes consistem em intrões que

são incluídos nos vectores de expressão. (7)

As moléculas de plasmideo vão ser integradas aleatoriamente no genoma hospedeiro,

e o local de integração vai influenciar a taxa de transcrição do gene recombinante, um

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fenómeno conhecido como “Efeito da Posição”. Dependendo da cromatina

circundante ao local de integração, a expressão do produto pode ser alta, baixa ou

mesmo nula. Para ultrapassar o efeito da posição, foram desenvolvidas várias

estratégias, tais como o uso de elementos anti-repressores a flanquear os vetores, a

integração de vetores em loci cromossomais específicos com cromatina aberta

(altamente transcritas) ou o uso de factores regulatórios nucleares. (7;8)

A introdução do gene pretendido na célula hospedeira de mamífero pode ser realizada

por diversos métodos, de forma transiente ou estável, dependendo da aplicação

pretendida e de factores técnicos e económicos. (7)

A produção de AcsM para fins clínicos ou comerciais é normalmente efectuada por

transfeção estável, uma vez que é possível obter uma expressão contínua do produto

por períodos de tempo prolongados permitindo a produção de grandes quantidades

(Kg/ano). (7)

A transfeção estável é conseguida pela integração do DNA no genoma da célula

hospedeira. Para garantir a integração, normalmente usa-se um gene marcador que é

transfetado em conjunto com o gene de interesse, e as células transfetadas (que

produzem o AcM) são identificadas e selecionadas pelas características do produto do

gene marcador. Isto é, no entanto, um passo trabalhoso e demorado que envolve um

investimento considerável em recursos/equipamento. (7)

A transfeção transiente é uma aproximação mais rápida e económica para a produção

de AcsM. É muito similar à estável, mas distingue-se pela eliminação dos passos de

identificação e seleção das células que integraram os plasmideos no genoma. Uma vez

que o DNA do produto é mantido/replicado como unidade extracromossomal, a

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capacidade de expressão é rapidamente perdida, somente permitindo a produção de

de pequenas quantidades de AcsM, pelo que não é usada para produção em larga

escala. (7)

Devido às diferenças entre os sistemas estáveis e transiente em termos de inserção do

plasmideo no genoma, os factores que influenciam o nível de expressão das células

transfetadas também são diferente. No sistema transiente, a eficiência da transfeção é

um dos factores mais importantes, consistindo na percentagem de células a expressar

DNA. Por outro lado, nos sistemas estáveis, a frequência de integração do DNA no

cromossoma (numero de cópias) e a posição da integração torna-se mais importante.(7)

Como foi mencionado anteriormente, na transfecção estável, é transfectado um gene

marcador com o gene de interesse, conferindo uma vantagem selectiva para as células

hospedeiras. Os genes marcadores normalmente usados são a dihidrofolato redutase

(DKFR) e a glutamina sintetase (GS). (7;8)

O sistema de expressão da DKFR, usado com células de ovário de hamster chinês, é

baseado na codificação do gene dkfr para a enzima DKFR, que está envolvida no

metabolismo de nucleótidos, catalisando a conversão de dihidrofolato em

tetrahidrofolato. Neste sistema a vantagem selectiva dada à célula transfectada é a da

resistência à geneticina. Então a selecção é feita cultivando as células em meio

contendo geneticina e sem hipoxantina e timidina. Este sistema permite um processo

de amplificação do gene que aumenta a capacidade de produção da celular, pelo uso

de metotrexato (MTX) que inibe a enzima DKFR. Usando concentrações cada vez

maiores de MTX, as células transfectadas contendo o gene dhfr vão ter de aumentar a

sua capacidade de sintetizar DHFR, amplificando o gene dhfr, no sentido de

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sobreviverem. Como a unidade de amplificação é maior que o tamanho do gene dhfr,

o gene de interesse que está localizado no mesmo vector de expressão que o gene

dhfr é também amplificado. (7;8)

Em contraste, o sistema GS explora o metabolismo da glutamina nas células de

mamíferos. A formação de glutamina segue uma via de biossintese enzimática a partir

do glutamato e amónia usando a enzima GS. Sem glutamina no meio de crescimento,

esta enzima GS é vital para as células de mamífero em cultura. Como algumas linhas

celulares não expressam enzima GS suficiente para a sobrevivência, é possível usar um

gene GS transfetado como um marcador seletivo permitindo o crescimento num meio

livre de glutamina. (7)

O sistema GS é mais vantajoso em termos de tempo relativamente ao sistema DHFR

durante o desenvolvimento, e requer menos cópias do gene recombinante por célula,

permitindo uma selecção mais rápida das linhas celulares mais produtivas. (7)

Para a introdução do gene de interesse (e do gene marcador, no caso da transfecção

estável) nas células de mamíferos, foram desenvolvidos vários sistemas de entrega de

DNA, sendo a transferência com genes não virais o sistema mais adequado em

processos produtivos. Estes métodos incluem precipitação cálcio-fosfato,

electroporação, lipofecção e transferência mediada por polímero. (7)

A precipitação cálcio-fosfato (CaPO4) é o método de transferência de plasmideos mais

usado, e baseia-se na formação de precipitado de DNA que entra nas células de

mamíferos via uma vesícula endocítica e tem a vantagem de ser económica e de

resultar em vários tipos de células. Contudo, a sua eficiência e reprodutibilidade são

baixas. (7)

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A electroporação é um método simples e rápido. O gene é entregue dentro da célula

por um campo eléctrico que interrompe o gradiente de voltagem da membrana

plasmática, criando poros reversíveis que permitem a entrada do DNA. Embora tenha

menos especificidade quanto ao tipo de células, relativamente a outros métodos de

transfeção, os parâmetros como o pico de voltagem e o tempo de descarga necessitam

de ser otimizados para cada caso. Com este método também resulta uma mais baixa

viabiliade celular pós-transfecional. Consequentemente a electroporação é mais usada

em trabalhos pequenos que requerem níveis mais baixos e mais rápidos de produção.

(7;8)

A lipofeção e a polifeção são os métodos mais recentes, e provavelmente os mais

simples, de transfeção. A lipofecção consiste numa transferência catiónica de gene

mediada por lípidos, onde lipossomas cationicos formam um complexo com o DNA

carregado negativamente. Este método pode ser realizado na presença ou ausência de

soro, com pouca ou nenhuma toxicidade, bem como com células suspensas ou ligadas.

No entanto, a quantidade de DNA e de lípidos usados bem como a razão entre eles

afeta a eficiência de transfeção pelo que tem de ser otimizado. (7;8)

A polifeção, por seu turno, refere-se a transferência de genes mediada por polímeros

cationicos, que interagem com o DNA formando um poliplexo que protege o DNA da

degradação, antes da chegada ao núcleo. Este método pode ser usado em culturas em

suspensão livres de soro. E tal como a lipofeção, a otimização do protocolo tem de ser

determinada empiricamente para cada cultura celular. (7;8)

Após a transfeção as células são sujeitas a um processo de monitorização/selecção que

dura desde a recuperação do crescimento após a transfeção, passando pela clonagem

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de célula única, amplificação, suspensão, adaptação sem soro, até à selecção final dos

clones. (7)

Após a transfeção, as células produtoras de AcsM são seleccionadas sendo sujeitas a

condições de cultura específicas que apenas permitem a sobrevivência e crescimento

dos clones celulares que expressem o gene marcador. Estes clones são transferidos

como células únicas para um segundo recipiente de cultura, onde as culturas são

expandidas para produzir populações de clones. Os clones são depois avaliados em

termos de crescimento e título do produto, e os maiores produtores são selecionados

para nova cultura e análise, para confirmar se os níveis de produtividade se mantêm. (7)

Estes clones inicialmente selecionados têm uma produtividade que pode não ser a

ótima. Para melhorar isto, as células podem ser sujeitas a sucessivas sessões de

exposição a concentrações cada vez mais altas de inibidores dos marcadores selectivos

(MTX), o que resulta na amplificação dos genes. O gene de interesse que expressa o Ac

pode ser co-amplificado com o gene do marcador seletivo, resultando num aumento

dos níveis de expressão a produtividade de AcsM. (7)

Tradicionalmente, a amplificação é realizada com uma abordagem de diluição

limitante e é um processo de sceening demorado e trabalhoso. De facto, a seleção e

monitorização de um clone altamente produtivo e estável num curto espaço de tempo

é actualmente o maior desafio. Então, devido à carga de trabalho que representa, a

seleção é feita baseada somente numa característica – o nível de expressão. Contudo,

há outras propriedades celulares que podem ser importantes no processo produtivo e

que deveriam ser incluídas na monitorização, tais como, a capacidade do clone crescer

em meio sem soro, a resistência à apoptose, as características celulares (i.e. o tamanho

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celular tem sido considerado determinante de produtividade), estabilidade na

formação do produto e a robustez geral da linha celular sob o stress e as condições do

biorreactor. É particularmente importante que o nível produtivo de AcsM dos clones

seleccionados se mantenha estável por longos períodos de tempo (pelo menos 60

gerações), uma vez que o aumento de escala do processo de cultura para níveis

industriais leva um tempo significativo. (7;8)

Após a obtenção das células produtoras de AcsM, estas têm de ser sujeitas a um

processo de adaptação a novas condições, o que pode impor algumas limitações ao

desenvolvimento do processo de produção. (7)

A produção em larga escala de AcsM em biorreatores é feita com o crescimento celular

em suspensão. Isto é porque a razão superfície/volume das culturas em suspensão é

muito mais alta que em culturas aderentes. No entanto, a maioria das células de

mamíferos crescem naturalmente em aderência e o seu crescimento em suspensão

requer um processo de adaptação. Esta adaptação não é possível para todos os tipos

celulares, o que limita a escolha da linha celular e pode ser muito demorado. (7)

A adaptação das células que crescem em aderência num meio contendo soro, a

crescerem em suspensão faz-se normalmente usando o mesmo meio mas mudando as

células para recipientes com agitação de 50-80 rpm. Para garantir uma adaptação bem

sucedida, alguns parâmetros são críticos, tais como a densidade e viabilidade do

inoculo inicial. Num processo de adaptação, há uma grande proporção das células que

não sobrevivem. Então é de extrema importância que a baixa proporção que sobrevive

seja suficiente para que expansão não demore demasiado. Por esta razão, a cultura em

suspensão deve de ser iniciada com uma densidade celular adequadamente elevada.

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Deve manter-se uma monitorização apertada da cultura durante o período de

adaptação, com o crescimento celular e viabilidade avaliados frequentemente. Os

níveis de produção também devem ser verificados, uma vez que mudam durante a

adaptação. (7;8)

O soro é um componente essencial em qualquer meio de cultura para proliferação

celular, mas tem muitas desvantagens, nomeadamente os altos custos e o risco de

transmissão de doenças de animais a humanos. Um dos principais objetivos na cultura

celular para fins comerciais é o uso de meios sem soro e sem proteínas, o que requer o

desenvolvimento de um soro específico para cada linhagem celular. (7)

Têm-se feito esforços para identificar suplementos substitutos do soro que preencham

os requisitos nutricionais complexos das células de mamíferos, o que normalmente é

feito por metodologias muito demoradas. Para ultrapassar isso, o desenho

experimental estatístico pode ser usado como uma forma eficiente de monitorizar um

grande número de suplementos do meio e identificar os mais importantes para o

crescimento celular e produção de AcsM, acelerando o processo de desenvolvimento

do meio sem soro. (7)

Mesmo após a definição química do meio sem soro, a adaptação celular ao novo meio

pode ser um processo longo, uma vez que ainda não está fisiologicamente bem

entendido. Para esta adaptação podem-se usar dois tipos de aproximação, a direta

onde o soro é completamente removido num único passo, e a gradual/sequencial

onde a concentração de soro no meio é reduzida lentamente. (7)

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Apesar de ainda não existir nenhuma forma fácil de acelerar a adaptação, o uso de

grandes densidades de inoculo, bem como as trocas de meio, centrifugando as células

e ressuspendendo em meio novo, podem de alguma forma abreviar o processo. (7)

3.3 MECANISMO DE AÇÃO

Os AcsM matam as células neoplásicas por múltiplos mecanismos, incluindo a indução

da apoptose, inibição do crescimento celular, citotoxicidade mediada pelo

complemento (CMC), citotoxicidade celular Ac-dependente (CCAD), e sensibilização à

quimioterapia ou radioterapia. Em parte devido a este aumento da sensibilidade à

quimioterapia, as terapias com AcsM levam a melhores resultados quando usado em

combinação com a quimioterapia. (2)

Numerosos estudos, incluindo in vitro, in vivo e estudos clínicos, indicam que as

funções efetoras dos Acs são mecanismos de ação particularmente importantes,

nomeadamente a CCAD e a CMC, sendo que ambas são primeiramente despoletadas

pela interação direta do domínio Fc do Ac com o seu ligante correspondente. (6)

A CCAD é um mecanismo efetor citolitico que envolve a destruição da célula

cancerígena revestida com Acs por recrutamento de células efetoras (tais como as

células natural killer, macrófagos e neutrófilos). Esta depende da ligação do Ac ao

receptor FcγRIIIa e leva à destruição das células alvo por exocitose de grânulos

citoliticos constituídos pelo complexo perfurima/granzima B (Figura 3). (5;6)

A CMC é uma cascata citolitica conhecida como a “via clássica” do sistema do

complemento, e é mediada por uma série de proteínas do complemento (C1-C9) que

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se encontram em abundância no soro. Esta cascata começa com a ligação de C1q ao

domínio Fc das moléculas do Ac ligadas à superfície das células cancerígenas e leva à

citolise (Figura 3). (5;6)

Os AcsM aprovados pela FDA que têm como principal mecanismo de acção a CCAD

são o rituxumab e o ofatumumab, no entanto a sua actividade é também parcialmente

dependente da CMC. Em contraste, o alemtuzumab induz CMC e não CCAD. (5)

Fig. 3- Mecanismo de funções efectoras de CCAD e CMC. (6)

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3.4 APLICAÇÕES EM NEOPLASIAS HEMATOPOIETICAS

Existem atualmente seis AcsM aprovados pela FDA para o tratamento de neoplasias

hematológicas (Tabela 1). Com os tratamentos com AcsM obteve-se uma melhoria dos

resultados e uma redução da toxicidade comparativamente com os regimes de

quimioterapia convencionais. (2)

Tabela 1: Anticorpos monoclonais aprovados pela FDA (7)

NOME GENERICO

NOME COMERCIAL

Ag ALVO TIPO INDICAÇÃO TERAPEUTICA

Gentuzumab ozagamicin

Mylotard® CD33 Humanizado IgG4

LMA

Rituximab Rituxan®, Mabthera®

CD20 Quimérico LNH-B, LLC

Ibritumomab tiuxetan Zevalin® CD20

Murino conjugado com

90-ItrioLNH-B

Tositumomab Bexxar® CD20Murino

conjugado com 131-Iodo

LNH-B

Ofatumumab Arzerra® CD20 Humano IgG1 LLC

Alemtuzumab Campath® CD52 Humanizado IgG1

LLC

Como é verdade para muitos tratamentos de cancro, os resultados obtidos com os

regimes de AcsM combinados são variáveis. Algumas neoplasias hematológicas com o

mesmo diagnóstico respondem bem, enquanto outras mostram pouca ou nenhuma

resposta. A resistência aos AcsM, nestes tratamentos combinados, ocorre

principalmente por razões desconhecidas, mas há indícios de que as diferenças que

contribuem para a resistência incluem a perda de expressão do Ag-alvo, o aumento da

expressão de inibidores do complemento e a modulação das vias de sinalização

celulares associadas com a apoptose ou a regulação do crescimento celular. (2)

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3.4.1.Leucemia Mielóide Aguda:

A leucemia mielóide aguda (LMA) é a forma mais comum de leucemia em adultos. A

sua incidência aumenta com a idade e a doença manifesta-se normalmente após os 60

anos. (9)

A terapia para a LMA envolve quimioterapia de indução intensiva, que resulta numa

remissão completa em cerca de 75% dos doentes com idade inferior a 60 anos. No

entanto, os índices de remissão diminuem rapidamente com a idade, e os doentes

idosos apresentam co-morbilidades que os impedem de tolerar altas doses de

quimioterapia. Em consequência, a sobrevida média dos doentes idosos com LMA é

inferior a 6 meses (10) e menos de 30% dos doentes sobrevive mais de 3 anos (11) .

A maioria das células de LMA expressam uma série de Ags restritos, nomeadamente

CD11a, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33 e CD64. O Ag CD33 é muito útil para a distinção

entre células mielóides e células linfóides. Estudos recentes demonstraram que uma

fração relativamente grande de populações de leucemias linfóides pode expressar

alguns desses Ags mielóides (CD33, CD13, CD65, CD15), o que amplia o valor dos

respectivos Acs no tratamento dos subtipos de leucemia. Estes Ags podem servir como

alvos para a terapia mediada por AcsM usando um dos vários mecanismos de acção.

Estes incluem CMC, CCAD, e entrega de radionuclídeos, produtos químicos ou toxinas.

(2)

Embora exista uma infinidade de possíveis Ags alvos nas células de leucemia mielóide,

apenas alguns emergiram como clinicamente relevantes com base numa variedade de

fatores, incluindo a especificidade de expressão (linhagem específica), a

22 FFUL


disponibilidade de AcsM clinicamente úteis e, recentemente, a demonstração de

expressão nas células estaminais da leucemias. (2)

O Ag CD33 é uma glicoproteína de superfície celular geralmente expresso em células

mielóides, incluindo nas células de leucemia mielóide. É o menor membro da família

Siglec (ácido siálico de ligação de lectinas Ig-relacionados), e é uma glicoproteína de 67

kDa expressa pelos percursores mielóides bem como pelos monócitos maduros, e em

menor quantidade pelos neutrófilos. O CD33 está envolvido nas interacções celulares

dependentes do ácido siálico e na adesão das células mielóides em certas fases da sua

diferenciação. A cauda citoplasmática do CD33 contém dois motivos baseados em

tirosina, ambos com potencial imunológico inibitório. Assim, o CD33 pode servir como

um receptor inibitório. A ligação de um AcM com o CD33 induz a apoptose e inibe a

proliferação das células mielóides normais e das células de leucemia. (2)

O Gemtuzumab Ozogamicina (Mylotarg®; Wyeth-Ayerst, Madison, NJ) (GO), é um

fármaco imunoconjugado em que um AcM anti-CD33 se encontra ligado

covalentemente a um derivado semi-sintético da caliqueamicina [Oldham,2008], a

NAc-γ caliqueamicina. (11)

A caliqueamicina é um antibiótico citotóxico muito potente originalmente isolado da

Microspora echinospora ssp. Acredita-se que esse antibiótico se intercala no DNA do

mieloblasto, desencadeando o processo de apoptose. (12)

23 FFUL


O GO é um AcM humanizado tipo IgG4. O Ac é ligado à N-acetil-gama caliqueamicina,

através de um ligante bifuncional e 50% do Ac é carregado com 4-6 moles de

caliqueamicina por mole de Ac. (2)

Após a ligação ao CD33, cada molécula de GO é endocitada por um mecanismo

mediado por clatrina (Figura 4). Seguindo através da via endocítica, as moléculas de

GO ligadas ao recetor passam para lisossomas, onde as condições são suficientemente

acidicas para facilitar a hidrólise eficiente da coliqueamicina e a redução na sua forma

citotoxica ativa. (11)

Fig. 4- Acção do Gemtuzumab ozogamicin na célula alvo. (11)

O principal desafio de farmacocinética para o GO é a sua ligação às células saudáveis

no sangue periférico, o que diminui a sua eficácia. Tais células expressam níveis de

CD33 suficientemente elevados para concorrerem com as células-alvo, que residem

principalmente na medula óssea. Uma opção para superar este problema é a

24 FFUL


administração de várias doses de GO. A justificação para esta abordagem é que as

células na periferia ficam saturadas com o imunoconjugado após a primeira dose, e as

doses subsequentes de tratamento vão atuar principalmente nas células alvo. Pelo

mesmo raciocínio, o tratamento com uma dose superior permitiria saturar as células

periféricas e actuar eficazmente nas células-alvo na medula óssea. Uma preocupação

óbvia inerente ao aumento da dosagem é relativa aos efeitos tóxicos que podem

incorrer. Por esta razão, são necessários estudos mais aprofundados para testar estas

abordagens. (11)

Este fármaco foi aprovado, em 2000, pela FDA para a terapia da recidiva de LMA em

doentes com mais de 60 anos, que não são candidatos aos esquemas convencionais. (2)

Mas a sua aprovação foi concedida ao abrigo dos regulamentos de aprovação

acelerada da FDA com base nas taxas de resposta global (TRG) registadas em três

estudos não comparativos, pelo que foram necessários estudos clínicos posteriores.

No entanto estes estudos não demonstraram evidências dos benefícios clínicos em

doentes com LMA. Um dos estudos de fase III comparou o uso do produto em doentes

recentemente diagnosticados com LMA com idades entre os 18 e 60 anos, e concluiu

que a adição do GO à quimioterapia não melhorou a sobrevida relativamente à sua

não adição e que aumentou a taxa de toxicidade fatal induzida. (13) Como resultado, em

Outubro de 2010, a Pfiser (que adquiriu o fármaco à Wyeth) retirou voluntariamente o

produto dos mercados nos Estados Unidos. Na Europa, o fármaco permanece

disponível. (13)

O Lintuzumab, também é um AcM humanizado que tem como alvo a proteína CD33.

Como é um AcM inalterado, depende exclusivamente da sua propriedade inerente de

25 FFUL


mediar os efeitos diretos através da ligação à CD33 e activar as células efetoras através

do seu domínio Fc. (2) Estudos in vitro demonstraram que o lintuzumab se liga

especificamente ao CD33 e apresenta múltiplos mecanismos de acção,

nomeadamente, induz funções efetoras através de CMC, fagocitose celular Ac-

dependente, e CCAD mediada por células natural killer (NK). Também foi demonstrado

que inibe a produção de citocinas inflamatórias via sinalização direta. (10)

O Lintuzumab foi testado em mais de 350 doentes e foi, em geral, bem tolerado.

Mesmo em doses baixas e em monoterapia, foi obtida remissão completa em vários

doentes com LMA avançada. Além disso, no cenário de doença residual mínima,

induziu remissão molecular em doentes com leucemia promielocítica aguda. (10)

Com base na actividade antileucémica demonstrada num ensaio clínico de fase 2 com

lintuzumab em monoterapia, colocou-se a hipótese do seu desenvolvimento em

associação com quimioterapia. No ensaio de fase 3, com doentes em recidiva ou com

LMA refractária que receberam quimioterapia com ou sem baixa dose de lintuzumab

(12 mg/m2 por dia, em 4 dias consecutivos), a melhoria na taxa de remição completa

atribuível ao AcM não teve significância estatística (36% vs 28%, P = 0,28). (10)

3.4.2 Linfoma Não-Hodgkin:

A incidência de linfoma não Hodgkin (LNH) aumentou dramaticamente desde 1970 até

meados de anos 90, e de acordo com a American Cancer Society aproximadamente

65540 casos foram diagnosticados nos Estados Unidos em 2010, fazendo do LNH o 7º

tipo de cancro mais comum. (14; 15)

26 FFUL


A classificação do LNH de Indolente (também designado de baixo grau ou de

crescimento lento) ou Agressivo (também designado de alto grau ou de crescimento

rápido) baseia-se na evolução clínica do linfoma. (15)

No LNH indolente, o curso clínico do linfoma é lento, os doentes raramente

apresentam sintomas na fase inicial, o que leva a que este não seja detetado durante

algum tempo. Mesmo após o diagnóstico, os doentes podem não necessitar de

tratamento imediato (por vezes durante meses ou anos). (15)

Quando é necessário iniciar tratamento, este é quase sempre eficaz, levando à

redução e/ou ao desaparecimento da doença. No entanto, é frequente a doença

recidivar, o que requer novo tratamento. (15)

O LNH agressivo evolui mais rapidamente, tende a apresentar mais sintomas e requer

tratamento imediato na maioria dos casos. Estes linfomas tendem a responder bem ao

tratamento. Na realidade, a cura completa é mais provável do que nos LNH indolentes.

(15)

O quadro seguinte apresenta os principais tipos de LNH:

Tabela 2: Principais tipos de linfoma não-Hogkin (15)

27 FFUL


Os resultados do tratamento para o LHN têm melhorado significativamente ao longo

da última década, especialmente devido ao desenvolvimento do AcM anti-CD20, o

Rituximab (RTX). (16)

Exceto para o mieloma, quase todas as neoplasias das células B maduras expressam

CD20, o alvo do RTX (Rituxan, MabThera, Genentech, South San Francisco, CA). O RTX

foi o primeiro AcM a receber aprovação da FDA, em 1997, para o tratamento do

cancro, nomeadamente o linfoma folicular (LF). (2)

Fig. 4- Modelo computacional da molécula de Rituximab mostrando a estrutura secundária. A estrutura primária do oligosacárido está na parte superior esquerda (37)

O RTX é um Ac IG1-kappa quimérico humano/rato que incorpora regiões variáveis de

murino e regiões constantes kappa e Fc humanas para diminuir o desenvolvimento de

imunoglobulinas anti-rato e possíveis resistências. (17)

O CD20 é uma fosfoproteína transmembranar não glicosilada com função pouco clara,

mas há evidências de que tem a atividade dos canais de cálcio e tem um papel na

regulação da ativação e crescimento de células B. O sucesso da terapia com RTX

reflete, em grande medida, determinadas características do CD20 que o tornam um

28 FFUL

http://www.sciencephoto.com/image/7309/large/A6170222-Rituximab_drug_molecule-SPL.jpg


excelente alvo para terapia com AcsM: o CD20 não é internalizado após a ligação com

o Ac, permanece na superfície celular após a ligação e é expresso em todas as fases de

maturação das células B, mas não em células B precursoras na medula óssea ou

noutras células. Infelizmente, nem todas as neoplasias de células B maduras

expressam altos níveis de CD20 uma vez que existem evidências de que a eficácia do

RTX se correlaciona com o nível de expressão de CD20. (2)

O RTX exerce efeitos antineoplasicos através de mais do que um mecanismo de ação.

Os mecanismos predominantes que induzem a morte celular são a CCAD, a CDC e a

apoptose. (17)

O RTX provoca depleção das células B que expressam CD20, normais e neoplásicas. O

nadir da contagem de células B do sangue periférico ocorre 24-72 h após a infusão

inicial e retorna aos valores normais cerca de 9 meses após cessação da terapia. Os

doentes toleram melhor a diminuição das células-B do que a diminuição de outros

leucócitos (granulócitos ou células T), porque a imunoglobulina, o principal produto

dos linfócitos B, têm uma meia-vida entre duas a três semanas. As terapias com Acs

para outros alvos, como CD33 ou CD52 causam diminuição dos granulócitos e

aumentam o risco de infeção, o que não é tão facilmente corrigido. (2)

Devido à sua alta prevalência o LF é a neoplasia mais frequentemente tratada com

RTX. Os resultados da terapêutica são significativamente melhores com a

quimioterapia combinada que inclui RTX em relação à que não o inclui. No entanto, o

RTX em monoterapia também demonstra atividade, induzindo a remissão completa

em muitos doentes. De facto, a monoterapia com o RTX em doentes com LF teve em

geral uma TRG de 43%, uma taxa de remissão completa (TRC) de 4% e um tempo

29 FFUL


médio de progressão (TMP) de 8,1 meses. As situações clínicas em que a monoterapia

beneficia mais os doentes do que a terapia combinada incluem doentes que não

toleram regimes terapêuticos com citotóxicos. No entanto, os resultados obtidos com

a terapia combinada sem RTX são melhores do que a monoterapia com RTX. Os

resultados típicos do tratamento de LF com ciclofosfamida, doxorubicina, vincristine e

prednisona (CHOP) são de 60-80% de TRG e 20% TRC. (2)

Na maioria das neoplasias das células B maduras, a terapia combinada com RTX e

quimioterapia aumenta a TRG, TMP e a sobrevivência sem eventos (SSE) relativamente

à quimiotepia ou ao RTX individualmente. Esta conclusão foi clara desde os primeiros

estudos publicados comparando a quimioterapia CHOP vs CHOP mais RTX. Os doentes

que receberam seis infusões de RTX com seis doses de CHOP tiveram uma TRG de 95%

com 55% TRC e 40% de resposta parcial (RP), a duração da resposta e TMP não foram

alcançados após os 29 meses de observação. Num estudo com LF avançado as

diferenças foram ainda mais impressionantes, os doentes tratados somente com CHOP

tiveram TRG e TRC de 57% e 10% e TMP de 15 meses enquanto os resultados dos que

foram tratados com CHOP e RTX foram TRG de 81%, TRC de 41% e TMP de 32 meses. (2)

Além das infecções devidas à diminuição das células-B, a toxicidade do RTX inclui febre

aguda, calafrios, náuseas, vómitos, broncoespasmo, e hipotensão. As maiorias destes

efeitos secundários são devidos a reações imunes ao produto ou à lise das células B

neoplásicas. As reações imunes em geral ocorrem durante ou logo após a infusão e

podem ser graves, ou mesmo fatais. As reações mais graves têm sido rotuladas de

"síndrome de libertação de citocinas". (2)

30 FFUL


Relatórios recentes indicam que o tratamento do LNH de células B com RTX pode estar

associado com a reincidência de linfoma CD20-negativo, e a frequência da perda de

CD20 após o tratamento com RTX varia bastante (24, 56, 60 e 94%). (18)

Têm sido sugeridos vários mecanismos de resistência ao RTX, incluindo a selecção de

clones CD20-negativos como consequência da exposição ao RTX, os epitopos CD20

serem mascarados pelo próprio RTX, ou a verdadeira perda do Ag CD20 devido a

alterações genéticas e epigeneticas. (18)

O RTX é um bom candidato para a terapêutica de manutenção devido ao seu perfil de

eficácia e segurança favoráveis, permitindo assim que a terapêutica prolongada

melhore o resultado sem comprometer a qualidade de vida. No LNH indolente, o

tratamento de manutenção com RTX sugere claramente uma melhoria nas respostas

seguintes aos resultados obtidos com a monoterapia inicial com RTX ou com

quimioterapia. (17)

Em Janeiro de 2011 a FDA aprovou o uso do RTX no tratamento de manutenção em

doentes com LF avançado que responderam ao tratamento inicial com RTX mais

quimioterapia (tratamento de indução). Esta aprovação, foi baseada num estudo que

envolveu 1217 doentes com LF avançado e que mostrou que a administração continua

a cada dois meses, durante dois anos, em doentes que responderam ao tratamento

inicial com o RTX e quimioterapia quase dobrou a probabilidade de estes viverem sem

que a doença piore (sobrevivência sem progressão ou SSP) comparativamente com

aqueles que pararam o tratamento. (19)

31 FFUL


A Radioimunoterapia (RIT) representa outra abordagem terapêutica que permite a

entrega de uma dose terapêutica de radiação a tumores disseminados. Atualmente os

AcsM radiomarcados aprovado para o tratamento de LNH folicular são o iodo-131-

tositumomab (131I-TST, Bexxar ®; GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC, EUA),

que não está aprovado na União Europeia (UE) e o ítrio-90 ibritumomab tiuxetan (90Y-

IT, Zevalin ®; Bayer Schering Pharma AG, Berlin, Alemanha). Ambos têm como alvo o

Ag CD20. A RIT é uma opção no tratamento estabelecido a partir da segunda recidiva e

o 90Y-IT obteve recentemente um parecer positivo da Agência Europeia de

Medicamentos (EMEA) sobre a sua utilização como terapia de consolidação após

tratamento de primeira linha. (20)

O radioisótopo 90-ítrio (90Y) está ligado covalentemente ao AcM ibritumomab através

do quelador de alta afinidade, o tiuxetan (Figura 5). O 90Y é um emissor beta de alta

energia (2,3 MeV) com uma semi-vida física de 64 horas. Mais de 90% da radiação

emitida é absorvida em 5 mm e este comprimento corresponde a um diâmetro de 100

a 200 células, permitindo assim uma entrega altamente precisa de radiação sem a

necessidade de isolamento ou blindagem do doente. A radiação provoca danos

celulares tanto nas células alvo do linfoma como nas células vizinhas e pode ser eficaz

nos casos de tumores pobremente vascularizados e nos que expressam Ags de forma

heterogénea. (20)

32 FFUL


Fig. 5: 90Y- Ibritumomab tiuxetan. (21)

O 90Y-IT está atualmente aprovado na UE para o tratamento de doentes adultos com

LNH folicular de células B CD20-positivas com recidiva após tratamento com RTX. (20)

O esquema de tratamento inclui a infusão de 250 mg/m² de RTX no dia 1 e 8 seguida

de uma dose terapêutica de 90Y-IT no dia 8 por via intravenosa durante 10 minutos . (20)

O pré-tratamento com RTX é feito para melhorar a biodistribuição dos radionuclídeos

e para reduzir a sua ligação aos CD20 em células B normais em circulação, na medula

óssea e no baço. Devido ao 90Y ser um emissor beta puro, o radioisotopo 111-índio

(111I), que é um emissor gama, é usado como um substituto para estudar a clearance e

a biodistribuição, usando câmaras de imagem gama como parte dos estudos. A

primeira infusão de RTX é seguida de uma aplicação de 5 mCi de 111In-IT com a

finalidade de geração de imagens. Os exames com câmaras gama são realizados

dentro de 24 a 48 horas. Os estudos de dosimetria mostram que a aplicação de 90Y-IT

resulta numa exposição à radiação mínima dos órgãos que não são alvo, mas falha em

demonstrar uma correlação significativa entre a biodistribuição do AcM radioativo e a

33 FFUL


toxicidade hematológica. Esta falta de correlação levou à aprovação de 90Y-IT dentro da

UE sem a necessidade de estudos de imagem. (20)

Os ensaios clínicos de fase I / II mostraram uma melhoria na biodistribuição do

radioimunoconjugado, após pré-tratamento com rituximab, na dose de 250 mg/m². A

dose máxima tolerada (DMT) determinada foi de 0,4 mCi / kg (ou 14,8 MBq / kg), para

doentes com contagem de plaquetas superior a 150 mil/mL, e 0,3 mCi/kg (ou 11,1

MBq / kg) para doentes com trombocitopenia ligeira (contagem de plaquetas

>150000 /mL, mas < 100000 / mL). Outro estudo confirmou a segurança do

tratamento com 90Y-IT, em doentes com trombocitopenia, com uma dose de 0,3

mCi/kg. Os doentes com risco aumentado de toxicidade hematológica devem ser

excluídos do tratamento. (20)

O 90Y-IT está aprovado nos EUA desde 2002 para doentes com LF CD20+ ou LNH das

células B transformado, refratário ou recidivo após rituximab. Na UE a licença é restrita

ao tratamento de LF CD20+ refratário ou recidivo ao rituximab. A terapia com 90Y-I é a

única aprovada na EU após falha do tratamento com rituximab. (20)

O Tositumomab (TST) é um AcM murino tipo IgG2a lambda que tem como alvo o Ag

CD20. É produzido em cultura de células de mamíferos livre de antibióticos e é

composto por duas cadeias pesadas gama 2a de murino, de 451 aminoácidos cada, e

duas cadeias leves lambda, de 220 aminoácidos cada. O seu peso molecular

aproximado é de 150 kD (Figura 6). (22)

34 FFUL


Fig. 6: Tositumomab (23)

Quando o TST está conjugado covalentemente com 131I, é mais conhecido pelo seu

nome comercial, Bexxar ®. O isotopo 131I é um emissor β e um emissor γ. A particula β

tem uma energia média de 191,6 KeV, uma energia máxima de 0,61 mEv, e um alcance

de 0,8mm nos tecidos. O raio-γ tem uma energia de 364,5 KeV. A semivida física do 131I

é de 8,1 dias. A emissão gama permite visualizar o Bexxar ® através de uma câmara de

gama e é necessária para a determinação da quantidade adequada de medicamento a

ser administrado. (24)

Quanto ao mecanismo de acção, este AcM tem maior capacidade de mediar a adesão

homotipica do que o RTX, o que se correlaciona com sua maior capacidade de induzir a

apoptose. In vitro, a indução da apoptose parece exigir o cross-linking do CD20 pelo Ac

anti-CD20, quer através de interações Ac-Ac quer através de interações com o Fc dos

receptores. Os dados in vitro e in vivo sugerem que o TST parece induzir a apoptose

através de mecanismos adicionais independentes da região FC. Além disso, a apoptose

induzida por TST não envolve a clássica fragmentação do DNA, ou processamento da

caspase. O TST não faz activação do complemento. (25)

35 FFUL


O 131I-TST está aprovado pela FDA para o tratamento do LNH das células B CD20+

indolente recidivo ou refratário, incluindo a doença refratária ao RTX, ou LNH

transformado. (25)

A administração de TST (Ac não marcado) com131I-TST (Ac marcado) em doentes

envolve uma colaboração entre o oncologista e a medicina nuclear e envolve dois

passos, o dosimétrico e o terapêutico. Os doentes recebem no dia 1 uma dose de TST

seguida de uma dose de 131I-TST, e seguidamente são sujeitos a vários scans com

câmaras gama em momentos diversos ao longo da semana seguinte. Os dados obtidos

permitem determinar a atividade do 131I-TST em cada doente e calcular a dose

terapêutica a ser administrada a fim da exposição corporal total à radiação ser de 75

cGy. (26)

As contra-indicações ao tratamento incluem alergia de iodo, gravidez, contagem de

plaquetas < 100000/mL, contagem absoluta de neutrófilos <1500/mL, insuficiência

renal ou hepática, medula óssea linfomatosa >25% ou soropositividade major para Acs

humanos anti-rato. (26)

3.4.3 Leucemia Linfocítica Crónica:

A leucemia linfocítica crónica (LLC) das células B é a leucemia mais comum nos países

ocidentais, com uma incidência anual de 3 a 5 novos diagnósticos por cada 100,000, na

sua maioria em idosos. (17) O prognóstico da LLC é bastante variável: alguns doentes

vivem uma vida normal durante anos com a doença estável e sem qualquer

intervenção, outros sofrem um curso de doença agressivo e desgastante com uma

36 FFUL


rápida progressão, tratamentos árduos e morte precoce. Assim, as taxas de sobrevida

global podem ir de menos de 2 a mais de 15 anos (mediana de 9 anos) após o

diagnóstico. Não existe nenhuma cura para esta doença com excepção do transplante

alogeneico de células estaminais aplicável a uma pequena porção dos doentes. (27)

A descoberta de aberrações cromossómicas recorrentes e relevantes para o

prognósticos nas células de LLC, via citogenética convencional e hibridização in situ

fluorescente (FISH), introduziu a estratificação dos casos de LLC de acordo com a

presença ou ausência de anomalias genéticas chave. Deleções/mutações no

cromossoma 17p13, o sítio do supressor de tumor TP53 (gene p53), estão associadas

com a resistência ou falha logo após a quimioterapia. Uma vez refratária ao

tratamento à base de análogos de purina, tais como a fludarabina, os doentes

pertencem à categoria de pior prognóstico com uma sobrevida global média de menos

de 12 meses. Da mesma forma, as deleções/mutações no cromossoma 11q22-23

(inclui o locus do gene ATM) correlacionam-se com doença avançada precoce,

especialmente nos nódulos linfáticos, menor tempo para o primeiro tratamento e

diminuição da sobrevivência a longo prazo após quimioterapia. (27)

A LLC é caracterizada pela acumulação progressiva de linfocitos maduros

fenotipicamente malignos, provavelmente uma combinação de resistência à apoptose

e uma componente de proliferação continua. As células de LLC normalmente co-

expressam CD5, CD23, CD19, CD79b e CD20, mas o nível de expressão de CD20,

CD79b, e de imunoglobulina de superfície é baixo quando comparado com os linfocitos

B normais. (28)

37 FFUL


Os fármacos de primeira linha, aprovados pelas agencias reguladoras incluem agentes

alquilantes, como o clorambucil, a ciclofosfamida e a bendamustina, o análogo de

purina, a fludarabina, e o AcM anti-CD52, o alemtuzumab (ALM). A aprovação explícita

do RTX, para imunoquimioterapia combinada para tratamento da LLC não tratada, foi

dada pela EMEA em Fevereiro de 2009. Nunca foi demonstrado o benefício do

tratamento para a sobrevida dos doentes com LLC em fase inicial da doença. (27)

De acordo com ensaios clínicos de fase II e III, a imunoquimioterapia combinada com

fludarabina, ciclofosfamida, e RTX (FCR) é atualmente o regime de primeira linha mais

ativo, com uma TRG de 95%, 44% de TRC e SSE de 51,8 meses. O regime FCR

demonstrou ser significativamente melhor do que o tratamento só com FC (TRG

88,4%, 21,7% TRC, SSE 32,8 meses), embora induza mais mielossupressão,

particularmente neutropenias. (27; 29)

Os grupos de estudo continuam a investigar modificações ao regime FCR, a fim de

otimizar a sua eficácia e diminuir a sua toxicidade (isto é, pela redução da dose de FC,

o aumento da dose de RTX, adição de mitoxantrona ou ALM, por exemplo). (27)

O Ofatumumab (Arzzera TM, GlaxoSmithKline, Philadephia, PA, HuMax-CD20TM,

Genmab, Copenhagen, Denmark) (OFA) é um Ac IgG do tipo 1 humanizado, de 2ª

geração, que se liga a um segmento do CD20 que contém uma pequena laçada ( loop)

extracelular junto da região N-terminal da segunda grande laçada extracelular. (28) Tem

maior afinidade para o CD20 que o RTX e liga-se a um epítopo diferente mais perto da

superfície da célula (Figura 7), teoricamente melhorando a ativação do complemento e

o acesso das células efetoras para destruírem o alvo por CCAD. (2)

38 FFUL


Fig. 7- Sitios de ligação do Rituximab e Ofatumumab no CD20. (28)

O OFA exibe múltiplas atividades via CMC, ADCC, e tem mostrado acentuar a morte

celular de linhas celulares resistentes ao RTX. Existe a hipótese que o aumento da CMC

demonstrado pelo OFA está relacionado com a sua ligação ocorrer mais próxima à

membrana celular. (28)

Coiffier et al relataram num estudo de fase I / II em LLC recidivante / refratária com

uma TRG de 50%, mas a duração de resposta média foi de apenas 3,7 meses. (30) No

entanto, a duração média do tratamento seguinte foi de 12 meses. Posteriormente, foi

realizado um estudo internacional de fase II com 138 doentes com LLC refratária dupla

(refratária à fludarabina e alemtuzumab; n = 59) e LLC refratária à fludarabina com

linfadenopatia volumosa (>5 cm) (aqui o alemtuzumab foi considerado uma opção

menos viável). A TRG foi de 47% -58% com uma SSE mediana de 5,7- 5,9 meses e uma

sobrevida mediana 13,7-15,4 meses. O OFA foi bem tolerado, mas foi reportada uma

39 FFUL

http://hcp.gsk.com/content/images/190389/201261/MOA-Figure-1-large.png


incidência de 25% de complicações infecciosas. (31) Estes resultados clínicos

impressionantes em LLC de risco muito elevado levou à aprovação do OFA pela FDA,

em 2009, para o tratamento de doentes com LLC refratário a outras formas de

quimioterapia. (2)

O OFA tem sido bem tolerado, e os efeitos adversos mais reportados são os

relacionados com a perfusão. A maioria dos efeitos secundários ocorrem no dia da

infusão e são de graus 1 ou 2. Estes são geralmente febre, calafrios, falta de ar,

erupções cutâneas e urticária. Apenas 12% dos doentes apresentam complicações

infecciosas de grau 3 ou pior, embora sem queda significativa dos níveis de

imunoglobulina sérica. Observa-se toxicidade hematológica de grau 3 ou 4 em 15% dos

doentes doa quais 6% apresentaram grau 3 ou 4 de neutropenia. (28)

O Alemtuzumab (Campath-1H, Campath ® / MabCampath ®; Bayer Schering Pharma,

Berlin) (ALM) é um AcM totalmente humanizado do tipo IgG1 contra o recetor CD52,

uma glicoproteína ancorada na superfície celular expressa em células B e T humanas,

células NK, eosinófilos e macrofagos. (27)

Fig. 8 - Imagem do ALM. (32)

40 FFUL


As células estaminais hematopoiéticas, eritrócitos e plaquetas não expressam CD52 na

sua superfície pelo que se encontram protegidas da citotoxicidade induzida. Em

contraste, os neutrófilos expressam CD52 em baixos níveis, pelo que sofrem lise

mediada pelo complemento e explica as neutropénias observadas com o uso clínico do

ALM. (27)

O ALM foi inicialmente aprovado para doentes com LLC refratária à fludarabina. No

estudo piloto com ALM em 93 doentes com LLC refractária à fludarabina, a TRG foi

33%, e apenas 2% de TRC. O TMP para doentes que responderam à terapia foi de 9,5

meses, mas houve uma melhora na sobrevida em 32 meses, em comparação com 16

meses para todos os doentes. É de notar, que o ALM parece ter atividade em doentes

que não respondem à quimioterapia devido à presença de mutações no gene p53. Isto

foi confirmado num estudo com 36 doentes de LLC refratário à fludarabina tratados

com ALM, 15 dos quais com mutações ou deleções no p53. (33)

O ALM demonstra uma eficácia impressionante no tratamento da doença do sangue

periférico e nos compartimentos de medula óssea, no entanto tem menor atividade

em linfadenopatias volumosas (>5cm). Infelizmente, muitos doentes refractários à

fludarabina têm linfadenopatias significativas, pelo que o benefício do tratamento com

ALM é, portanto, limitado. (33; 34)

Num esforço para superar esta limitação, foram investigadas terapias de combinação,

acrescentando RTX, fludarabina, FC, ou FCR ao ALM. Embora as TRG relatadas sejam

encorajadoras, não está claro que qualquer destas combinações permitam superar

significativamente as limitações do ALM no tratamento de doentes com

41 FFUL


linfadenopatias. Além disso, a quimioimunoterapia combinado com ALM é

potencialmente muito tóxica. (34)

O ALM, foi mais recentemente aprovado para a utilização em LLC não tratada

previamente. Foi realizado um estudo de fase III com 297 doentes com LLC progressiva

sem tratamentos prévios em que comparou o ALM com o clorambucil. Este estudo

demonstrou uma TRG significativamente superior, bem como uma maior SSE para o

ALM relativamente ao clorambucil (TRG, 83% vs 56%; P < 0,001% e TRC,24% vs 2%; P<

0,001). O ALM em monoterapia ou em combinação é uma boa opção para doentes

com mutações no 17p ou no p53, uma vez que tem sido demonstrada a sua eficácia

nestes casos. (33)

Não existe nenhum protocolo estabelecido para a terapia de manutenção da LLC. O

ALM foi avaliado neste cenário com alguns resultados interessantes, mas o entusiasmo

foi temperado pela alta toxicidade observada. (33)

Clinicamente, este AcM reduz os linfócitos normais das linhagens B e T, resultando

numa profunda e ocasional linfopénia de longa duração com imunossupressão

concomitante. Isto tem sido associado a um risco aumentado de infeções oportunistas,

especialmente em doentes pré-tratados intensivamente. A infeção com

Cytomegalovírus (CMV) é a mais comum e requer a monitorização cuidadosa dos

doentes, de acordo com as guidelines publicadas. A profilaxia anti-infecciosa com

cotrimoxazol e aciclovir, ou equivalente, é obrigatória durante o tratamento e deve

continuar por pelo menos 6 meses após a cessação do ALM. (27)

42 FFUL


3.5 VANTAGENS E INCONVENIENTES

O trunfo dos AcsM sobre a utilização de outros fármacos é a sua especificidade. Os Acs

podem selectivamente reconhecer pequenas modificações em proteínas, péptidos e

moléculas orgânicas, bem como mudanças conformacionais que podem estar

associadas a alterações na atividade de enzimas, recetores ou outros componentes

biologicamente ativos de uma célula. (35)

Os Acs circulantes têm semi-vidas de 7-14 dias, quando não são destinados a linfócitos

circulantes. Quando comparados com pequenos fármacos, com semi-vidas de minutos

a horas, os Acs têm grande vantagem no período de tempo em que estão no corpo

para manter o bloqueio. (35)

Os ensaios clínicos iniciais com AcsM produziram alguns efeitos antitumorais

impressionantes, mas a maioria dessas experiências ilustraram os obstáculos a uma

terapia bem sucedida. A maioria dos AcsM empregues nos primeiros ensaios clínicos

foram obtidos a partir ratos, e os doentes expostos desenvolveram resposta imunitária

contra esses AcsM, o que limitava o número de tratamentos que esses doentes

poderiam receber de forma segura. Mas as técnicas de engenharia molecular têm

superado este obstáculo, e agora é possível criar imunoglobulinas completamente

humanas. No entanto, estas abordagens não inibem a produção de Acs anti-idiotipo. (35;

36) Além disso, devido à sua grande dimensão molecular (~150kDa), os AcsM não são

eficientes a penetrarem células vivas para alvos intracelulares e a sua

biodisponibilidade é baixa quando administrados oralmente. (6; 35)

Alguns Ags tumorais são eliminados ou secretado. Os Acs que têm como alvo estes

Ags vão-se ligar na circulação, limitando a quantidade de Acs não ligados disponíveis

43 FFUL


para se ligarem ao tumor. As barreiras que impedem a distribuição dos Acs dentro dos

tumores incluem (a) vascularização tumoral desordenado, (b) aumento da pressão

hidrostática nos tumores e (c) heterogenenicidade na distribuição dos Ags nos

tumores. Estima-se que, devido a estas barreiras, uma molécula de IgG levará dois dias

para percorrer 1 mm e 7-8 meses para viajar um centímetro dentro de um tumor. As

estimativas para uma molécula de Ac menor, como um fragmento Fab, são um dia

para percorrer 1 mm e dois meses para percorrer 1 cm. Se os Acs alcançarem os seus

alvos, há pouca evidência de que vão mediar CCAD eficazmente in vivo. Para que isso

ocorra, devem de estar presentes no tumor um número suficiente de células efetoras,

tais como macrófagos, células NK, ou células T citotóxicas. Finalmente, sabe-se que

muitos tumores secretam compostos que desregulam a resposta imune, ou que têm

diminuição de células efetoras como consequência de hipoxia. Apesar destes

impedimentos, os dados pré-clínicos e clínicos continuam a demonstrar que a terapia

com AcsM tem um papel importante no arsenal oncológico. (36)

Outra questão, são os custos extremamente elevados das atuais terapêuticas com

AcsM, principalmente devido ao uso de sistemas de expressão em células de

mamíferos e os processos de purificação em grande escala que são necessários. A

administração continua de dose elevadas, que é muitas vezes necessária para manter

uma concentração sérica de AcM eficaz para induzir uma resposta clínica, não só limita

os atuais regimes / aplicações clínica devido aos efeitos colaterais relacionados com a

dose, mas também reduz os seus potenciais campos de indicação. (6)

44 FFUL


3.6 PRESPECTIVAS FUTURAS

Em esquemas de terapia combinada, a terapia com AcsM melhora claramente os

resultados do tratamento das neoplasias hematológicas. O momento ideal e os

regimes de combinação são áreas de investigação em curso. O melhor entendimento

dos mecanismos de ação dos AcsM e das combinações deve levar à melhoria da sua

atividade e à redução dos efeitos colaterais. No que respeita aos AcsM desses regimes

de tratamento, fazem-se esforços para encontrar melhores Ags-alvos de superfície,

melhorar a afinidade das ligação, melhorar a interação com as células efetoras, e

reduzir a imunogenicidade. A imunogenecidade é reduzida com o uso de Acs

totalmente humanizados e a melhoria da afinidade pode ocorrer com a engenharia de

proteínas ou a seleção de epitopos alternativos no Ag-alvo. A melhoria da interação do

AcM com as células efetoras tem potencial para aproveitar mais plenamente o poder

do sistema imunológico para combater a neoplasia. (2; 5)

A interação entre o AcM e as células efetoras depende principalmente da ligação ao

Fc, pelo que as investigações em curso têm como foco a melhoria da qualidade dessa

ligação Fc através da engenharia de proteínas. Outra abordagem para a melhoria da

interação entre célula efetora/AcM é a melhoria da qualidade das células efetoras

através da expansão e/ou ativação. Uma abordagem intrigante para a melhoria dessa

interação é a criação de Acs bivalentes (diabodies), que consiste na construção de uma

proteína que se liga tanto às células alvo como às células efetoras. Já há relatos da

criação de Acs trivalentes e até de maior valência, mas quanto maiores os Acs menor a

penetração no tumor apesar de terem semi-vidas maiores e maior actividade ligante. (2)

45 FFUL


Para os tumores sólidos, como o linfoma, a penetração do tumor pelo Ac é uma

questão importante. Esta questão pode ser um problema menor para o caso da

leucemia, mas mesmo nesta há formação de nódulos ou acumulações de massas na

medula e outros tecidos. Para investigar o significado do tamanho dos Acs na

penetração do tumor e na eficácia da terapia, os investigadores testaram fragmentos

de Acs gerados por proteólise ou por engenharia genética. Estes fragmentos têm

menores pesos moleculares, variando entre 25 e 100 kDa, do que os Acs intactos (150

kDa). Infelizmente, os fragmentos de Ac têm desvantagens, incluindo a perda das

funções efetoras e curta semivida. (2)

A tabela 3 lista os AcsM atualmente em ensaios clínicos, para a terapêutica de

neoplasias hematopoieticas, que incorporam algumas dessas melhorias.

Tabela 3: Anticorpos monoclonais em estudos clinicos (2; 5)

NOME GENERICO

NOME COMERCIAL

Ag ALVO TIPO INDICAÇÃO TERAPEUTICA

Lintuzumab SGN-33 CD33 Humanizado LMABrentuximab

vedotinSGN-30 CD30 Quimérico Linfoma Hogkins

MDX-60 CD30 Humano Linfoma Hogkins

Epartuzumab hLL2, LymphoCide

CD22 Humanizado LNH

Mapatuzumab TRM-1 TRAIL-R1 Humano LNH, Mieloma

Apolizumab HUlD10, Remitogen

HLA-DRB Humanizado LLC, LNH

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4 CONCLUSÕES

Os AcsM revolucionaram o arsenal terapêutico contra o cancro, sendo hoje elementos

chave no tratamento de muitas formas de cancro, particularmente nas neoplasias

hematopoieticas. A sua inclusão nos tratamentos oncológicos levou à melhoria dos

resultados terapêuticos e à diminuição da toxicidade relativamente aos regimes

convencionais de quimioterapia, mas ainda ocorrem muitas falhas no tratamento.

Atualmente os AcsM aprovados pela FDA têm como alvos os Ags CD33 das células

mielóides, o CD20 das células linfoides B, e CD52 expresso nas células linfoides. No

entanto, o seu uso ainda é emergente e a compreensão do seu potencial requer a

otimização do uso dos AcsM atualmente disponíveis e um esforço concertado para

assegurar que os programas de desenvolvimento de novos AcsM são baseados em

princípios científicos robustos.

47 FFUL


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6 AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha orientadora, a Professora Doutora Maria Leonor Correia pelo

empenho, dedicação e disponibilidade para contribuir valiosamente na concretização

do presente revisão. E, também, aos meus amigos e família por serem uma

extraordinária fonte de apoio.

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acsm nas neoplasias

Documents

cancro e

metablicas e

frmacos e

e que cerca

em particular

descoberta e caracterizao

o seu diagnstico e tratamento

vantagens e inconvenientes