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Version 3 Last Updated 21 July 2016

Instrucciones de uso

Para la medida cuantitativa de IgM frente al Chikungunya Virus en

suero (citrato) y plasma humano.

Este producto es sólo para uso en la investigación y no está diseñado

para uso diagnóstico

ab177848Anti-Chikungunya Virus IgM Human ELISA Kit

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Tabla de ContenidosINTRODUCCIÓN1. ANTECEDENTES 22. DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO 4

INFORMACION GENERAL3. PRECAUCIONES 54. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD 55. REACTIVOS INCLUIDOS 56. COMPONENTES REQUERIDOS, NO INCLUIDOS 67. LIMITACIONES 68. CONSEJOS TÉCNICOS 7

PREPARACION DEL ENSAYO9. PREPARACIÓN DE REACTIVOS 810. TOMA DE MUESTRAS Y CONSERVACIÓN 811. PREPARACIÓN DE MUESTRAS 912. PREPARACIÓN DE LAS PLACAS 9

PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO13. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO 10

ANALISIS DE DATOS14. CÁLCULOS 1315. VALORES TÍPICOS DE LAS MUESTRAS 15

RECURSOS16. ESPECIFICACIONES ANALÍTICAS DEL ENSAYO 1517. INTERFERENCIAS 1718. RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS 1719. NOTAS 19


INTRODUCCION

1. ANTECEDENTESEl kit de Abcam Anti-Chikungunya Virus IgM Human ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) está diseñado para la determinación cuantitativa de anticuerpos de clase IgM frente al virus Chikungunya en muestras de suero y plasma humano.El kit incluye una placa de 96 pocillos que ha sido cubierta con anticuerpos anti-Human que se unen a los anticuerpos presentes en la muestra. A continuación, los controles y las respectivas muestras se añaden a los pocillos y se realiza una incubación. Tras un primer lavado, el antígeno del virus Chikungunya se añade a los pocillos y se realiza otra incubación. A continuación, los pocillos se lavan de nuevo y se añaden anticuerpos anti-Chikungunya biotinilados. Después de la incubación y un lavado final, se añade el conjugado “Streptavidine peroxidase (SP)” que se une a los anticuerpos biotinilados específicos para el virus Chikungunya. El TMB es catalizado por la enzima SP para generar un producto color azul que cambia a amarillo cuando se añade la solución ácida de parada (Stop Solution). La densidad de color amarillo es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos IgM anti Chikungunya capturados en la placa.El virus Chikungunya es un virus del género Alphavirus (familia Togaviridae) llevado por artrópodos (arthropod borne virus). El género Alphavirus contiene al menos 24 especies. Consisten en viriones envueltos en lípidos con un diámetro entre 50 y 60 nm y se transmiten por la picadura de mosquitos infectados. Tras un periodo de incubación de 1 a 12 días se desarrolla la fiebre Chikungunya. Chikungunya significa “enfermedad del hombre retorcido”, en referencia a los síntomas incapacitantes que genera. La enfermedad consiste en una infección viral aguda caracterizada por una rápida transición entre un estado saludable y un estado que incluye dolores articulares severos y fiebre alta. La temperatura sube rápidamente, hasta incluso 40°C, y se acompaña frecuentemente de escalofríos y temblores. Después de varios días, la fiebre puede ir y venir durante varios ciclos. El dolor articular se da preferentemente en las articulaciones pequeñas y en zonas con lesiones anteriores. Los pacientes normalmente evitan el


INTRODUCCION

movimiento lo máximo posible. Las articulaciones pueden inflamarse y mostrar acumulación de fluidos. Estos síntomas pueden durar desde 1 semana hasta varios meses y están acompañados de mialgia. La enfermedad cursa con la aparición de una erupción cutánea que suele aparecer el primer día de la enfermedad, aunque a veces lo haga posteriormente. Normalmente aparece como un enrojecimiento en la cara y el cuello, que evoluciona a una erupción maculopapular o macular que puede ser pruriginosa. Esta última lesión suele aparecer en el tronco, las extremidades, cara, palmas de las manos y plantas de los pies, por orden de frecuencia. En ocasiones también se observan petequias. Otros síntomas son dolor de cabeza, fotofobia, dolor retro-orbital, inflamación de garganta con signos de faringitis, náuseas y vómitos. Ocasionalmente, sin embargo, se observa artralgia y poliartritis (que duran meses o incluso años), a veces con destrucción de articulaciones. Otras secuelas muy poco frecuentes son la encefalitis y meningoencefalitis, ambas con altos niveles de mortalidad. El virus tiene una gran importancia en África y Asia. Entre el 20% y más del 90% de la población tropical y subtropical muestra signos serológicos de infección. El incremento de la prevalencia de mosquitos Aedes en el Norte de África y en Sudamérica aumenta la posibilidad de epidemias. Infecciones por el Virus Chikungunya pueden ocurrir en Europa Central debido a viajeros que vuelven de países tropicales o subtropicales.

Especies Enfermedad Síntomas Mecanismo de infección

Virus Chikungunya (Alphavirus)

Fiebre Chikungunya

Fiebre, exantema, dolor articular, artralgia y poliartritis, a veces con destrucción de articulaciones. En raras ocasiones encefalitis y meningoencefalitis.

Transmisión por la picadura de mosquito Aedes albopictus (Africa)Aedes aegypti (Africa, Asia)

La presencia de infección viral puede ser identificada por

Serología: Detección de anticuerpos por IF, ELISA.


INTRODUCCION

2. DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO

Preparar todos los reactivos, muestras, controles y

estándares.

Añadir las muestras, estándares y controles a los

pocillos.

Después de lavar, añadir el anticuerpo biotinilado a

cada pocillo e incubar.

Después de lavar, añadir el SP-Conjugate a cada

pocillo e incubar.

Después de lavar, añadir el sustrato TMB a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente. Añadir la

Stop Solution a cada pocillo. Medir inmediatamente.


INFORMACION GENERAL

3. PRECAUCIONES Por favor lea las instrucciones antes de comenzar el ensayo.Todos los componentes del kit han sido formulados y testados para funcionar como un kit. Cualquier modificación en los componentes o procedimientos puede resultar en una disminución de la eficacia del kit.

4. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDADGuarde el kit a 2-8°C inmediatamente después de recibirlo.La información sobre la conservación de cada componente del kit se encuentra en la lista de reactivos incluidos. Las condiciones de conservación de los reactivos preparados se encuentran en la sección 9. Preparación de reactivos.

5. REACTIVOS INCLUIDOS

* Contiene 0.1% Bronidox L después de la dilución

Componente CantidadConservación

(antes de la preparación)

Anti-Human (IgM) Coated Microplate (12 x 8 wells) 96 pocillos 2-8°C

IgM Sample Diluent*** 100 mL 2-8°C

Stop Solution 15 mL 2-8°C

20X Washing Solution* 50 mL 2-8°CChikungunya Virus antigen Solution 1 (Liofilizado)**** 6 tubos 2-8°C

Chikungunya Virus biotinylated antibody Solution 2**** 6 mL 2-8°C

Streptavidin Conjugate** 6 mL 2-8°C

TMB Substrate Solution 15 mL 2-8°C

Chikungunya Virus IgM Positive Control**** 1.5 mL 2-8°C

Chikungunya Virus IgM Cut-off Control**** 2 mL 2-8°C

Chikungunya Virus IgM Negative Control*** 1.5 mL 2-8°C


INFORMACION GENERAL

** Contiene 0.2% Bronidox L*** Contiene 0.1% Kathon**** Contiene 0.02% Kathon y 0.02% Bronidox L después de la

reconstitución

6. COMPONENTES REQUERIDOS, NO INCLUIDOSEstos componentes no están incluidos en el kit pero son necesarios para realizar el ensayo:

Lector de microplacas capaz de medir absorbancias a 450 nm o 620 nm.

Incubador de 37°C

Pipetas de un canal y multicanal para volúmenes de entre 10 µL y 1000 µL

Opcional: Lavador de placas automático

Vortex

Agua desionizada o agua destilada reciente

Tubos desechables

Cronómetro

7. LIMITACIONES Este kit de ELISA está diseñado para investigación, no para su

utilización en ensayos diagnósticos.

Todos los componentes de origen humano utilizados para la producción de estos reactivos han sido testados para la detección de anticuerpos anti-HIV, anti-HCV y anti HBsAg siendo negativos. Sin embargo, todos los componentes deben tratarse y manipularse como potencialmente infecciosos.

El componente Chikungunya Virus antigen Solution 1 está inactivado. Sin embargo, todos los componentes deben tratarse y manipularse como potencialmente infecciosos. Es necesario llevar guantes durante la realización del ensayo. Se recomienda


INFORMACION GENERAL

manipular la Chikungunya Virus antigen Solution 1 en una cabina de seguridad BSL2.

Utilize solamente pipetas y material limpio. No intercambie los tapones de los reactivos para evitar

contaminación cruzada. Cierre los viales de reactivos inmediatamente después de su uso

para evitar evaporación y contaminación microbiológica. Revise los viales de conjugado y controles después de abrirlos por

primera vez y sucesivas veces para descartar contaminación microbiológica.

Para evitar la contaminación cruzada y falsos positivo, pipetee las muestras y el conjugado, sin salpicar, en la parte más baja del pocillo.

8. CONSEJOS TÉCNICOS Evite la formación de burbujas al mezclar o reconstituir los

reactivos. Evite la contaminación cruzada de muestras y reactivos

cambiando las puntas entre la adición de las muestras, los estándares y los reactivos.

Asegúrese de que las placas están bien selladas o cubiertas durante las incubaciones.

La retirada completa de las soluciones durante los lavados es necesaria para obtener lecturas precisas.

El formato de este kit se basa en el número de ensayos. Un ensayo se refiere a un solo pocillo. El número de pocillos que contienen la muestra, los controles y los estándares puede variar dependiendo del ensayo. Se recomienda revisar el protocolo de forma completa para confirmar que este kit se adapta a sus necesidades. Por favor, contacte con nuestro servicio de Soporte Técnico si necesita cualquier información adicional.


PREPARACION DEL ENSAYO

9. PREPARACIÓN DE REACTIVOSEquilibrar todos los reactivos, muestras y controles a temperatura ambiente (18-25°C) antes de su utilización.

9.1 1X Washing Solution:Preparar 1X Washing Solution diluyendo 20X Washing Solution con agua desionizada. Para preparar 200 mL de 1X Washing Solution es necesario mezclar 10 mL de 20X Washing Solution con 190 mL de agua desionizada. Mezclar bien cuidadosamente.

9.2 1X Chikungunya Virus Solution 1:Añadir 1 mL de 1X Washing Solution a cada vial. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación lenta. La solución reconstituida es estable durante 24 horas a 2-8°C.

Las demás soluciones se encuentran ya preparadas listas para su uso.

10.TOMA DE MUESTRAS Y CONSERVACIÓN Utilizar muestras de suero o plasma (citrato) para este ensayo. Si

el ensayo se realiza durante los primeros 5 días después de la obtención de la muestra, ésta debe guardarse a 2-8°C. Si no, la muestra debe ser alicuotada y congelada (-20°C a -80°C). Si las muestras han sido congeladas, después de la descongelación deben mezclarse bien antes de realizar el ensayo.Se deben evitar los ciclos repetidos de congelación-descongelación.No se recomienda la utilización de muestras que han sido inactivadas por calor.

ASSAY PRE


PREPARACION DEL ENSAYO

11.PREPARACIÓN DE MUESTRAS Antes del ensayo, las muestras deben ser diluidas 1:100 con IgM

Sample Diluent. Añadir 10 µL de muestra a 1 mL de IgM Sample Diluent para obtener una dilución 1:100. Mezclar bien cuidadosamente.

12.PREPARACIÓN DE LAS PLACAS La placa de 96 pocillos incluida en el kit está preparada y lista

para su uso. No es necesario lavar la placa antes de su utilización. Las tiras que no se utilicen deben meterse de nuevo en su

envoltorio y deben ser guardadas a 4°C. Para cada ensayo, al menos 1 pocillo debe ser utilizado como

blanco, omitiendo la adición de la muestra y el conjugado. Por razones estadísticas, se recomienda que cada estándar y cada muestra se ensaye un mínimo de dos veces (por duplicado).


PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO

13.PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO Equilibre todos los materiales y reactivos preparados a

temperatura ambiente antes de su utilización. Por favor, lea el protocolo detenidamente antes de realizar el

ensayo. La fiabilidad del ensayo depende del seguimiento estricto del protocolo descrito.

Si se realiza el ensayo ELISA en un sistema automático recomendamos incrementar el número de lavados de 3 a 5 y el volumen de la solución de lavado (Washing Solution) de 300 µL a 350 µL.

Todos los controles (Chikungunya Virus IgM Positive, Chikungunya Virus IgM Negative y Chikungunya Virus IgM Cut-off ) deben ser incluidos en cada ensayo.

Se recomienda realizar los ensayos de los estándares, controles y muestras por duplicado.

13.1 Preparar todos los reactivos, estándares y muestras como se ha indicado previamente.

13.2 Separar las tiras que no se vayan a utilizar del resto de la placa y guardarlas de nuevo en su envoltorio conteniendo el desecante, sellar y guardar a 4°C.

13.3 Añadir 50 µL de los controles o de las muestras diluidas a los pocillos correspondientes. Reservar un pocillo para el blanco de sustrato.

13.4 Cubrir los pocillos con la lámina que contiene el kit e incubar durante 1 hora a 37°C.Measure output on a microplate reader.

13.5 Retirar la lámina, aspirar el contenido de los pocillos y lavarlos 3 veces con 300 µL de 1X Washing Solution. Evitar salpicar los otros pocillos durante los lavados. El tiempo de cada lavado debe ser al menos superior a cinco segundos. Después del último lavado, retirar la 1X Washing Solution por aspiración o decantación. Invertir la placa y depositarla sobre papel limpio para retirar el exceso de líquido.

ASSAY PRE



Nota: La retirada total de líquido en cada paso es esencial para el buen funcionamiento del ensayo.

13.6 Añadir 50 µL de 1X Chikunguya Virus Solution 1 a todos los pocillos excepto al blanco. Cubrir con la lámina.

13.7 Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. No exponer a la luz directa.

13.8 Repetir los lavados descritos en el paso 13.5.13.9 Añadir 50 µL de 1X Chikunguya Virus Solution 2 a todos

los pocillos excepto al blanco. Cubrir con la lámina. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. No exponer a la luz directa.

13.10 Repetir los lavados descritos en el paso 13.5.13.11 Añadir 50 µL de SP Conjugate a todos los pocillos excepto

al blanco. Cubrir con la lámina. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. No exponer a la luz directa.

13.12 Repetir los lavados descritos en el paso 13.5.13.13 Anadir 100 µL de TMB Substrate Solution a todos los

pocillos.13.14 Incubar durante 15 minutos exactos a temperatura

ambiente en oscuridad.13.15 Añadir 100 µL de Stop Solution a todos los pocillos en el

mismo orden y a la misma velocidad que se ha añadido la TMB Substrate Solution.

Nota: Todo el color azul que aparece durante la incubación se convierte en amarillo. Las muestras con una señal positiva muy fuerte pueden causar una precipitación oscura que corresponde al cromógeno. Estos precipitados influyen en las medidas de densidad óptica. En estos casos se recomienda la predilución de las muestras con PBS, por ejemplo 1:1. Después se debe diluir la muestra 1:100 con IgM Sample Diluent y multiplicar los resultados de Unidades Estándar por 2 (ver sección 14. Cálculos).

13.16 Medir la absorbancia a 450 nm durante los 30 minutos después de la adición de la Stop Solution.

ASSAY PRE



Se recomienda la lectura dual de la absorbancia tomando 620 nm como longitud de onda de referencia.


ANALISIS DE DATOS

14.CÁLCULOSPara que el ensayo se considere válido es necesario que se cumplan los siguientes criterios:

Blanco de sustrato: Valor de la absorbancia <0.100 Control negativo: Valor de la absorbancia <cut-off Control Cut-off: Valor de la absorbancia 0.150-1.300 Control positivo: Valor de la absorbancia >cut-offSi estos criterios no se cumplen, el ensayo no es válido y debe repetirse.

Cálculo de resultadosCalcular la media de las absorbancias de cada muestra restando el blanco y comparar con el valor del control Cut-off.El valor del control cut-off es la absorbancia media de los pocillos con el control cut-off.Ejemplo: Absorbancia de control cut-off Pocillo 1 = 0.156 Absorbancia de control cut-off Pocillo 2 = 0.168

Media del control Cut-off: (0.156+0.168)/2=0.162

Interpretación de los resultadosSe considera que una muestra es positiva si la absorbancia es al menos un 10% mayor que el valor de cut-off.Las muestras con un valor por debajo del 10% más que el Cut-off o por debajo del mismo deben considerarse no concluyentes (zona gris), es decir, ni positivas ni negativas. Se recomienda en estos casos repetir el ensayo utilizando muestras frescas. Si los resultados del segundo ensayo están de nuevo por debajo del 10% más que el Cut-off o por debajo del Cut-off la muestra ha de considerarse negativa.Una muestra se considera negativa cuando la absorbancia es menor que el 10% menos que el Cut-off.


ANALISIS DE DATOS

Resultados en Unidades Estándar

(𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑎𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 (𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎) 𝑥10𝐶𝑢𝑡 ‒ 𝑜𝑓𝑓 ) = 𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝐸𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟

Ejemplo:

(1.786 𝑥100.38 ) = 47 𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝐸𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟

Cut-off: 10 Unidades EstándarZona Gris: 9-11 Unidades EstándarNegativo: <9 Unidades EstándarPositivo: >11 Unidades Estándar


ANALISIS DE DATOS

15.VALORES TÍPICOS DE LAS MUESTRAS

PRECISIÓN-

Suero Positivo Débil Intra-ensayo Inter-ensayon= 23 3

Media 0.62 0.61%CV 4.8 7.3

Suero Positivo Fuerte Intra-ensayo Inter-ensayon= 24 3

Media 1.36 1.36%CV 3.4 2.9

16.ESPECIFICACIONES ANALÍTICAS DEL ENSAYO

ESPECIFICIDAD-La especificidad es >90% y se define como la probabilidad de que el ensayo resulte negativo en ausencia del analito especifico.SENSIBILIDAD-La sensibilidad es >90% y se define como la probabilidad de que el ensayo resulte positivo en presencia del analito específico.REACTIVIDAD CRUZADA-No se ha observado reactividad cruzada usando muestras Rf y muestras conteniendo anticuerpos frente a Bordetella pertusssis, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Dengue Virus, TBE, Helicobacter pylori, HSV 2, Leishmania, Mycoplasma y Schistosoma. No se puede descartar la reactividad cruzada con anticuerpos frente a Borrelia, CMV y Toxoplasma.Es probable encontrar interferencia con la estimulación policlonal de las infecciones por EBV. En presencia de Mononucleosis infecciosa (Pfeiffer ́s Disease, infección por EBV) puede ocurrir una estimulación


ANALISIS DE DATOS

policlonal de linfocitos B. Esto puede resultar en reacciones no específicas en la detección de anticuerpos de la clase IgM. Por este motivo se recomienda excluir la infección por EBV por diagnóstico diferencial.La reactividad con anticuerpos frente al Virus O ́Nyong Nyong no puede descartarse.


RECURSOS

17. INTERFERENCIASNo se observaron interferencias al añadir triglicéridos, bilirrubina o hemoglobina en exceso a las muestras.

18.RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS Problema Causa Solución

Tiempo de incubación muy corto.

Intentar incubación toda la noche a 4°C.

Puede formarse un precipitado después de añadir el sustrato si la concentración de la diana es muy alta.

Incrementar el factor de dilución de las muestras.

Utilización de tipo de muestra incompatible.

La detección puede ser reducida o nula en tipos de muestras no probadas anteriormente.

Señal débil

Muestra preparada de manera incorrecta.

Asegurar la preparación y dilución correcta de las muestras.

Burbujas en los pocillos.

Asegurar que no hay burbujas en los pocillos al medir las absorbancias.

Todos los pocillos no han sido lavados igual.

Comprobar que los canales del lavador de placas no están obstruidos. Lavar bien tal y como está recomendado.

Mezcla de reactivos incompleta.

Asegurar que todos los reactivos están bien mezclados.

Pipeteo inconsistente. Utilizar pipetas calibradas para asegurar un pipeteo preciso.

CV alto

Preparación o conservación inconsistente de las muestras.

Asegurar la preparación consistente de las muestras y las condiciones de conservación óptimas (por ejemplo, minimizar los ciclos de congelación/descongelación).


RECURSOS

Problem Cause Solution

Los pocillos no están suficientemente lavados.

Lavar bien los pocillos tal y como recomienda el protocolo.

El Wash Buffer está contaminado. Preparar Wash Buffer nuevo.

Ruido de fondo (background)

Se ha esperado demasiado para leer la placa después de añadir la Stop Solution.

Leer la placa inmediatamente después de añadir la Stop Solution.

Conservación incorrecta del kit de ELISA.

Guardar todos los reactivos como se recomienda. Puede ser que no todos los reactivos deban guardarse en las mismas condiciones.

Baja sensibilidad.

Utilización de tipo de muestra incompatible.

La detección puede ser reducida o nula en tipos de muestras no probadas anteriormente.


RECURSOS

19.NOTAS


RECURSOS

RESOURCES 23

UK, EU and ROWEmail: [email protected] | Tel: +44-(0)1223-696000

AustriaEmail: [email protected] | Tel: 019-288-259

FranceEmail: [email protected] | Tel: 01-46-94-62-96 GermanyEmail: [email protected] | Tel: 030-896-779-154 SpainEmail: [email protected] | Tel: 911-146-554 SwitzerlandEmail: [email protected] Tel (Deutsch): 0435-016-424 | Tel (Français): 0615-000-530

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