การทาเอนไซมใหบรสทธ

นลน วงศขตตยะ

เทคโนโลยชวภาพ คณะวทยาศาสตร

มหาวทยาลยแมโจ

ทาไมตองทาเอนไซมใหบรสทธ

ปนดดา สารปนเปอน ไมตองการ?

โป ป ป ณฐกต โปรตนปนเปอน?

พมพทอง เพอการศกษาอยางละเอยด โดยเฉพาะ

วระวรรณ ศกษาปฏกรยา จรงปาว?

ไ ไ อาภาพร กน เปนเอนไซมเปาหมายหรอไม

วรญญา ใชประโยชนทางการคาญญ

เอกชย เพอใชอยางจาเพาะ

สดารตน เพอเพมประสทธภาพ

อาภาพร ทราย ศกษาคณสมบต

ส ส ป ส เกษมสนต เพอทดสอบประสทธภาพ

อญชล เพอศกษาการใชประโยชนหลายๆดาน เชน การแพทย ฯลฯ

ปยะพร ทราบการทาปฏกรยาอยางถกตอง

วมลสร ศกษาโครงสราง วมลสร ศกษาโครงสราง

ผสด ดดแปลง ใชประโยชน

สพตรา ศกษาปรมาณ วาจะใชเทาไร ในปฏกรยา

สารสา ศกษากจกรรมของเอนไซม

ทาไมตองทาใหบรสทธ

เพอทราบการทางานของเอนไซม-ทราบเมตาบอลซม และวถของเอนไซม จะไดรปฏกรยา ไคเนตกส การควบคมการทางานเอนไซม, จะไดรปฏกรยา ไคเนตกส การควบคมการทางาน

หากทราบการทางานในภาวะปกตแลว เมอมภาวะไมปกตจะไดแกไข ไ ไ ไ และทราบขอมลไดตรงจด เชน ภาวะไมมเอนไซม แลคเตส ยอยนม

สามารถออกแบบยา ทเปน 3D structure ได เพมมลคาใหตวเอนไซม เปนยา

อนๆอกมากมาย อนๆอกมากมาย

Vdo Tipranavir

อะไมเลส

เชอแบคทเรย S11 (1/10) ดน บานสารสา สวน บรเวณตนกลวย

Activity 0.001488 U/ml 1.4 mU/ml สารอนๆทโปรตน ปน

หวงวา activity amylase higher Media C glucose (control), soluble starch, กากถวเหลอง, แปงขาวเจา

ไ ทาไมตองแบคทเรย

เอกชย วงชวตสน สกดไดใชเวลาสน

ใ ใ ไ ไ ไ เกษมสนต ใชในอสาหกรรมได ธรกจได นาลาย??? ขยะแขยง ผลตไดเรอยๆ

ปฏบตการ enzyme purification

S11 amylase ??? U/ml culture conditionmedia Thurs culture condition media Thurs

C, media, temp, time, pH, aeration Prot?? Lowry method – std‐ BSA

Crude enz  (NH4)2SO4  chromatographyg p y

Enzyme/protein purification สกดเอนไซมจากไหน?

b ll l เซลลพช เซลลสตว เซลลจลนทรย นาเลยงเซลล subcellular fractions (e.g. mitochondria, membranes)

ทาอยางไรใหคงสภาพกจกรรมของเอนไซมเหมอนเดม

Physical boundaries of protein stability Physical boundaries of protein stability pH, Temperature, salt concentration, oxygen sensitivity, storage, mechanical forcessensitivity, storage, mechanical forces

ทาเอนไซมใหบรสทธมขนตอนอยางไร

สกดเอนไซมใหออกมาอยในรปของของเหลว

ไ ใ ทาเอนไซมใหบรสทธดวยขนตอนการแยกสารตางๆ

ตรวจสอบความบรสทธของเอนไซมจ ข

ไ ใ ใ ป ไ ไทาเอนไซมใหอยในรปของเหลวไดอยางไรDisruption and homogenization of cells, tissue, etc

ใชเทคนคตางๆ เชน shearing, grinding, sonication, F h ll di tiFrench pressure cell disruption

Isolation of organelles; solubilization of gmembranes

Excreted proteins Excreted proteins

เอนไซมจากธรรมชาตอาจจะมนอย ทาใหเพมขนไดอยางไรเอนไซมจากธรรมชาตอาจจะมนอย ทาใหเพมขนไดอยางไรRecombinant DNA technology is a very useful tool for 

protein purificationprotein purification

for 'overproduction' of proteins using i texpression vectors

for application of 'tags' to proteins pp g p for excretion of proteins into the culture mediummedium

Enzyme/protein purificationEnzyme/protein purificationแลวจะวดคาอะไรบาง

How is purification measured?How is purification measured? Enzyme activity (U/ml) crude enz + soluble 

h DNS d l (1)starch = sugar DNS  std = glucose (1) Prot Lowry method crude (2)y ( ) Specific activity (U/g protein) 10 l /20 t10amylase/20 prot

10 amylase/10 prot highy / p g Purification tablePh i l h d SDS PAGE l fil i Physical methods: SDS‐PAGE, gel filtration

Purification table Total amount of enzyme (U): Activity (U.ml‐1) x volume (ml)

Specific activity (U.mg­1): Activity (U.ml‐1) / protein content (mg.ml‐1) Activity (U.ml ) / protein content (mg.ml )

Yield (%):T l f f ifi i / l f Total amount of enzyme after a purification step / total amount of enzyme before that step

Purification factor: Specific activity of enzyme after a purification step / specific activity before 

that stepp

E / t i   ifi tiEnzyme/protein purificationวธทาใหโปรตนบรสทธ ตวอยางวธทาใหโปรตนบรสทธ

1. Precipitation methods2 Separation based on

ตวอยาง

1. Ammonium sulfate precipitation2. Separation based on 

molecular size3. Separation based on charge

p p2. Gel filtration3. Ion‐exchange chromatography

4. Separation based on specific interaction with other biomolecules

4. Bio‐affinity chromatography5. Hydrophobic interaction 

chromatography5. Separation based on other 

principles

chromatography

การตรวจสอบความบรสทธของเอนไซม

Quantitation of total protein Spectrophotometry method  Chemical method

Lowry method Bardford method

Assay of enzymatic activityS bstrate red ction Substrate reduction

Product production 

ใ ไ ความสามารถจาเพาะในการทางานของเอนไซม การเพมความ

บรสทธ และปรมาณผลผลต

ความสามารถจาเพาะในการทางานของเอนไซม (specific activity)

จานวนหนวยของเอนไซมตอมลลกรมของโปรตน จานวนหนวยของเอนไซมตอมลลกรมของโปรตน

คาการเพมความบรสทธ (fold purification) ของเอนไซม

การเพมความบรสทธ = ความสามารถจาเพาะในการทางานของเอนไซมในแตละชนสวน

ความสามารถจาเพาะในการทางานเอนไซมทจดเรมตน ความสามารถจาเพาะในการทางานเอนไซมทจดเรมตน

ปรมาณผลผลต (yield)

ปรมาณผลผลต = จานวนหนวยของเอนไซมหลงจากขนตอนทาใหบรสทธ

จานวนหนวยของเอนไซมในขนตอนการเตรยมเรมตน× 100%

Purification table (example)Purification table (example)

Step Volume Total Total Specific YieldPurification

activity protein activityfactor

(ml)          (U)           (mg)        (U/mg)       (%)_____________

CE  (1) 500 3,000 15,000 0.2100 ‐‐

AS  (2) 100 2,400 4,000 0.680 3.080 3.0

IEC (3) 45 1,440 500 2.948 14.5

GF  (4) 50 1,000 125 8.033 40.0

_________  __________________________________________________ Steps: (1) Crude cell extract; (2) ammonium sulfate fractionation;  (3) ion exchange chromatography; (4) gel filtration.

Ammonium sulfate precipitation การละลายของโปรตนจะเปลยนแปลงไปตามความเขมขนของประจ (ionic strength ซง

แปลงาย ๆ วาความเขมขนของประจ) และความเขมขนของเกลอในสารละลาย โดยการละลาย ของโปรตนเพมขนเมอใชความเขมขนของเกลอตา ๆ เรยกปรากฏการณนวา การเพมการละลาย

ดวยเกลอปรมาณนอย (salting-in) แตเมอเพมความเขมขนของประจหรอเพมความเขมขนของเกลอ การละลายของโปรตนจะเรมลดลง และทความเขมขนของประจสง ๆ การละลายของของเกลอ การละลายของโปรตนจะเรมลดลง และทความเขมขนของประจสง ๆ การละลายของโปรตนจะลดลงจนถงจดทโปรตนตกตะกอนเกอบสมบรณในสารละลาย ปรากฏการณนเรยกวา

การตกตะกอนดวยความเขมขนของเกลอทใสลงไปในสารละลาย (salting-out)

โปรตนกบไอออนของเกลอเขาแยงจบโมเลกลอสระของนา กลาวคอ ทความเขมขนของเกลอสง ๆ พนธะโมเลกลของนาจะถกจบดวยไอออนของเกลอเปนสวนใหญ พนธะโมเลกลของนาจงไมๆ พนธะโมเลกลของนาจะถกจบดวยไอออนของเกลอเปนสวนใหญ พนธะโมเลกลของนาจงไมเพยงพอทจะจบกบโปรตน ทาใหโปรตนจบกนเองมากกวาจบกบโมเลกลของนา และตกตะกอนในสารละลาย

What do you need to do?

What technique do you want to use? Ion exchange Size exclusion Hydrophobic interaction Affinity Affinity 

Ion exchange chromatographyIon exchange chromatography

Separates compounds based on their charges

Resin type C ation exchanger Anion exchanger

Net charge of com pound of

+ -com pound of interestC harge of resin - +C harge of resin - +

Size exclusion chromatography

Size exclusion chromatography/gel filt tifiltration

Separates molecules by size

Hydrophobic interaction Hydrophobic interaction

chromatographyg p y Separates molecules based on their hydrophobicityhydrophobicity

Affinity chromatography

The desired molecules bind to the matrix‐b d li d hil th t f thbound ligand while other components of the mixture that have no affinity for the ligand are washed through the column