a plastic colorimetric resonant optical biosensor for multiparallel detection of label-free...

8
A plastic colorimetric resonant optical biosensor for multiparallel detection of label-free biochemical interactions Brian Cunningham * , Bo Lin, Jean Qiu, Peter Li, Jane Pepper, Brenda Hugh SRU Biosystems 14A Gill Street, Woburn, MA 01801, USA Abstract A high sensitivity plastic biosensor based on detection of changes in optical density on the surface of a narrow bandwidth guided mode resonant ®lter is demonstrated. Using sub-micron microreplication of a master sensor surface structure on continuous sheets of plastic ®lm, the sensor can be produced inexpensively over large surface areas. In this work, the sensor structure is incorporated into standard 96-well microtiter plates and used to perform a protein±protein af®nity assay. A surface receptor immobilization protocol demonstrating low nonspeci®c binding is used to detect an antibody with 8.3 nM sensitivity. By measuring the kinetic interaction of a protein±protein binding pair simultaneously at several concentrations, the af®nity binding constant can be quickly determined. # 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved. Keywords: Optical biosensor; Microreplication; Resonant ®lter; Genomics; Proteomics; Diagnostics 1. Introduction For the majority of assays currently performed for geno- mics, proteomics, pharmaceutical compound screening, and clinical diagnostic applications, ¯uorescent or colorimetric chemical labels are commonly attached to the molecules under study so they may be readily visualized [1±3]. Because attachment of a label substantially increases assay complexity and possibly alters the functionality of mole- cules through conformational modi®cation or epitope block- ing, various label-free biosensor technologies have emerged. Label-free detection phenomenologies include measuring changes in mass [4], microwave transmission line charac- teristics [5], microcantilever de¯ection [6], or optical density [7,8] upon a surface that is activated with a receptor mole- cule with high af®nity for a detected molecule. The wide- spread commercial acceptance of label-free biosensor technologies has been limited by their ability to provide high detection sensitivity and high detection parallelism in a format that is inexpensive to manufacture and package. For example, biosensors fabricated upon semiconductor or glass wafers in batch photolithography/etch/deposition processes are costly to produce and package if the sensor area is to be large enough to contain large numbers of parallel assays. Similarly, the requirement of making electrical connections to individual biosensors in an array poses dif®cult challenges in terms of package cost and compatibility with exposure of the sensor to ¯uids. In previous work, we have described a novel technology based upon a narrow bandwidth guided mode resonant ®lter structure that has been optimized to perform as a biosensor [9]. The sensor utilizes a sub-wavelength grating waveguide structure to provide a surface that, when illuminated with white light at normal incidence, re¯ects only a very narrow (resonant) band of wavelengths. The resonantly re¯ected wavelength is modi®ed by the attachment of biomolecules to the waveguide, so that small changes in surface optical density can be quanti®ed without attachment of a label to the detected biomolecule. Unlike optical detection approaches that rely upon interaction of detected molecules with an evanescent wave, the detection phenomenon in this work actually occurs within the waveguide, and thus, pro- vides for a strong interaction between surface binding events and the transduced signal. Further advantages of the sensor approach are that the resonant re¯ected signal is measurable with the sensor either dry or immersed in liquid, and the simplicity of the non-contact excitation/detection instru- mentation. The sensor structure, when fabricated on a glass substrate, demonstrated surface binding sensitivity of 4:2 10 13 g/mm 2 . Assays were performed that demon- strated the ability to perform a protein±protein binding assay with a sensitivity of 0.0167 nM for streptavidin, and the ability to measure attachment/detachment of molecules with molecular weight of 130 Da was demonstrated. Because sub-micron sensor feature de®nition and processing was Sensors and Actuators B 85 (2002) 219±226 * Corresponding author. Tel.: 1-787-933-7255. E-mail address: [email protected] (B. Cunningham). 0925-4005/02/$ ± see front matter # 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved. PII:S0925-4005(02)00111-9

Upload: brian-cunningham

Post on 04-Jul-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

� ������� �������� �� � � ������ ���� � � ������������������� � ��������� ���������� � ������ �

��� �� � ������ � �� � ��� ���� ���� ��� �� � ������ �� �� ������� �������� � � ���� ��� ������� �� ������ ���

��������

� ���� �� �������� ������� ���� � ����� ������� � ��� ��� � ������ �� ���� ��� ������ � � � �� � ���� ������ ���

�� � � !��� �� ��� ������" #�� � ������� ����������� � ������ �� � ������ ������� � �� ��� ������ � ������� !��� ���

�� � �� �� ������ � �$�� ������ �� ���� ������ ����" % ���� &� ��� �� � ������� �� � ������ � � ��� ��� '(� ���

������� ������ � � ���� � ���� � ���� )���� ��! ��� �����" � ������ ����� �������*��� ���� ��� ����� � �

�����!� �� �� � �� ���� � ������ � � ����� ��� +", - �� ��������" �� ������ � ��� &� ���� � ������ � � ���� )���� �� �� �

��� ������� ����� �� ������ � �� ���� �� ��� ��! ��� �� �� � � ��� � �� �� .���&�� ������ ��" � /00/ 1������ 2��� �� �"3" ���

����� ������"

�������� 4������ ���� �5 -���������� 5 6�� � � !���5 7� ����5 �������5 8��� �����

� ���� ������

9 ��� ��:��� � ������ ��� ��� ������ � �� �

����� �������� ������������� ���� � ���� � �� � �

��� ���� ���� ���� ��������� �� ;����� � ��������

�������� ������ �� ��� �� �������� � ��� ��������

� �� ����� � ���� ��� �� ������ �������*�� <=),>"

������� �������� � � � ����� ������ ������ � ������ �����

�����$��� � � ������� ����� ��� �� ��� ����� � ����

����� ����� � ����� �� ���!���� ������ ���&�

� �� ����� ��������� ���� � ���� ����� ���� ������"

��������� ������� ��� �� ����� � ����� ������ �

��� ��� � ���� <?>� ��� ��� �� ������ �� � ������

�������� <@>� ����� ������ ��;���� <(>� ������ �� ����

<A�+> �� � ������ ���� �� ��������� ��� � ����� ����

���� ��� ���� ��! ��� � � �������� �������" B�� ����

����� �������� ������� �� � ��������� ���� �

���� ����� ��� ��� ������� �� ���� ������� � �����

���� ������� �� �������� � � ���� ������� ���������� � �

���� ���� �� � �$�� ���� � �� ������� � � ���&���" 9

�$������ ���� �� ��������� �� ����� ���� �����

���� � ����� ������������C����C������� �������

�� ����� � ����� � � ���&��� �� ��� �� � ��� �� � ��

���� � ��� � � ��� ���� ����� � ������� ������"

2�������� ��� �.����� � � ��&� � ��������� � ���� �

� � �������� ���� �� � � ��� ���� ���!���� ������ ���

� ���� � ���&��� ��� � � ������������ ��� �$���� �

��� �� � � ;����"

% ������ &� � ���� �������� � ��� ���� ���

����� �� � � �� � ���� ������ ��� �� � � !���

������� ���� ��� ��� �����*�� � ���� �� � ���� �

<'>" B�� �� � �����*�� � ���� ����� ��� ���� � ��������

������� � ����� � ������ ����� �� ������ ���� ���

���� ����� �� ��� � ���� ��� �;���� �� � ��� �

D�� � �E �� � � ����� ����" B�� �� � ��� �;�����

����� ��� �� ���!�� �� ��� �������� � � ����������

� ��� ��������� � ���� ����� ��� ��� � ������ ������

�� ���� �� �� .�� ��!�� ����� �������� � � � �����

� ��� �������� ���������" # ��&� ������ �������

�������� ���� ��� �� � ������ � �������� ��������

��� � ��� ���� � ���� ��� ������� ��� �� � ����

& �������� ���� ����� ��� ��������� � � ����� ��

����� � � �� � � ������ ��� �� ������ �� �� � ��� ��

� � ��� �� ������ ��� ��" 9���� ���� ����� � ��� �� �

������ �� ���� ��� �� � � �;����� ��� �� �� ���������

��� ��� �� � ����� �� ������� � ��.���� � � ���

���������� � ��� �� ���� �$������ C������� � ����

�� ���� " B�� �� � �������� �� ��������� � �����

��������� ��� ������ ������ �� �� � �� �������� �

?�/� =0�=, �C��/" ������ �� ������ ���� ��� ������� ��� ������� � ���� � ���� )���� �� �� � �����

��� � �� �������� � 0"0=(A - � ���������� � � � ���

������� � ������ �������� �C�������� � � �������� ���

������� ����� � =,0 8� �� ��� ������" �������

������� �� � ������ ��! ��� � � ������ � ��

2� �� � � ������� � +@ D/00/E /=')//(

� ���� �� � ����" B��"F �=�A+A�',,�A/@@"� �!�� !������ ��� � ����G�����������"�� D�" �� � ����E"

0'/@�?00@C0/CH ) ��� � � ����� � /00/ 1������ 2��� �� �"3" ��� ����� ������"

�%%F 2 0 ' / @ � ? 0 0 @ D 0 / E 0 0 = = = � '

������ ����� ���� � ����� �������� ��� �� �

������� �� ������� � ��� ��� � � ���� ���������

��������� �� ���� �� ������� ������ ������ ������"

% ���� &� � ��� ��� ����� � �������� � � �

�������� � � �.������ � �� � ������� ���� �� ���������

� � ������ � ������� !��" 6���� ��� ���� �������

��! ��� � ���� � ������� ��� � ������������ ���

�� � ������� � ����� ��� �� ������ � ����� ���� �� ����

�� � �������� � ����� � ��� �� � ������� ������� �� �

�������! ��� ����������� �����" B�� ��� � � � �� �

��� ������� �� � ��� �� � �������� � ����� ��� ��

������� ���� �� ��������� ��� !�� ���� � � � ������

�������� � � �� ������ � � ������ ������ �� ��!��� �

�� �" -�� ����� ���� ��� ������� � ����� � �����

�� �������� ���� � � ������� �� ���� ������ ���� � �����

� ����� � ��� �� � � � ���� ��� ��������� �����

����� ���� �� ������� ������ � � ������ ������" % ����

&� � ��� ����� � ����� � ��� ������� �� � � �

��� ����� � �������� '(� ��� ������� ������� � � ���

������� � ��� ��� �� � ����� � ���� �������� ���� )

���� �� �� � ������ � �������" B�� ������� �� ��������

� ��� ���������������� �� � �� �� � � �� �.������ � �

�������� ����� �������������� �� ��"

� ��������� �� ����� �

"#�# ����� ���$� !�� %!���&!���

B�� �� � ������� �.���� � ���� � ��� � ���� � �

��� ��� ����� ��� � ��� �� � ��� �;����� ����� <=0�==>"

�� �� � 9��" =� ��� ���� � ������� �� ��������� �� �

� �������� � ��$ ������� ���� �� ������� ��� � ���

!�� � ����� �������� � ��$ �������" B�� ���� � �����

��� �� ������������ ���� � ���� � ���� ��$�� ��

�������� ��� "

9���� � + � " ������� ����� ����� ��� �� ��

�����" B�� @@0 � ���� �� �� ���� � ������� ��

��! �� � �������� ��� � �����#3 ������������ ��

������ � � � ������ � ��� �$���� � � ' �� �������

������ ���� � ������ �� ��� ������ � � ���������

����� ����� ���" B�� �$���� ����C����� ������

������ ����� � � � ��� ��� ���� '(� ��� ����

���� ������ ��� ����� � � � =/ ���� � ����" B��

�$���� �������� �� ��������� � � ��� ���� � �������

�� ���� � ��� �� ����� � ��� ����� ��� ��� � �

������� � ���� ��� � ����� ��/00 �" ���� ����� �� ����������� �� �����"

B�� ���� � ������� �� ��������� � � 0"00@ � " ����&

����� � ������ ��� �� ��������� � � ��� ���� � ��$�

��� �� ��� ����� ����� ��� � � � ����� � ���

������ ��� �����" B�� ��.��� ��$� � ��� � ��� �����

� ��� ����� ���� �� � � �� �����.�� ��� ���� �� �$����

� ��������� �����" B�� ���� ��$� ����� ������ ������

� ��� ������ ��� ������ � � �� ������ � �� �� ���

����� ���" 2� � �������� �� �������� �� ������

������� � =/0 � ����� ����� ��� ���� ��$�

���� � ������" 9�� � � ����� ����� ������� �

, � �� @ � " ������� ����� ����� � �� ��� �� ���

�� � ������ ��������� ��� ��� � �� ��� �� ���� D��� �

��� ���� ��! �� �����E � � �������� � ��� ����� �

�������� '(� ��� ������� ������ D���� � � 7�� �E

��� ��$�"

"#"# ���%!& !&�'!��� !�� !!&��� �% �&(��

���&��

���� ����� ����� ������� � ��� �� �� �� ���������

��� ��� � �� ��� �� ���� � � ���� ����� ���� ��� ��

�� &� �������� � �� �������� � ��� ������ � � &

�� ���� " ��� � �������� �� ������ �� ������

� ��� �� � � =0I ,���� ���������$����� � D�����E

����� � ���� � D������E � = �� � ��� �� �� � ����

���� � � ��" ��������� �� �� �� ��� ���� �� A0 �� �=0 �� "

� ������� �������� ����� ��� � � ���!�� ����

�� ����� �� ���� � ������ � ��� �� ���� � ��� �

���� ��� ������ <=/>" B�� ��� ����������� �� � ��

������� � 0"= �- � ���������� �������?�4�D?�?��������$������E�������� D��28B�� �����E� ����� ����

� @0 �- ����� ����� ��� D�� +"@E� � � ���&� ����

���� � ,0 �� " B�� �� � �� ��� ����� ��� ����

�*�� ��� � � �����.�� ��� ������ ��� ,0I �������

���� D2����E" B�� ����� �� �� � �� �� ��� �� �

�� ��� ����������� ���� �� ������ ��� ���" B���

����� � ������� ���� ��� ������ �� ���� � ��� ��� �

���� �� �/� =0=? ����C��/"

9��" =" 9������� ����� ���� � ����� ��� �� �" 9��� D�E ��� �����

����� ��� �� ���� � �������� ��� �� � ������� � � � ��� ���� �

��$� ��� �� ��� ����� � � � ����� � ������� ����" ���� ��� ��$� ��

����� ��� ������� ����� �� ������ � ��" B ������� �� � �������� D�E�

� ��� ���� � ����� ����� �� �������� �� ��� �������"

//0 �# )�����$�!� !�# * ������ !�� �&�!��� � �+ ,"��"- "�./""0

B�� ����� � ���� & �� � ��� ����� ��� ��� � ���

������� ���� � � ��� ������� � � ������������*��

���� )���� �� �� � � ������ " B�� ���� )����

������ �������� � ���� ����� �� ������� � � �������

%�7 � ����� ��� � ���� �������*�� ��� �� � ������

�� � ����� �������" B������ � ���� � ������

��*��� � ���� ��� �� � ������ �� �������� ����

�����*�� � ���� ��� �� ��������� �������1��������� ��

���� DJ�2)�17E �� &� ������� D2��� ��� ������

% �"E � ��� �� � � �������� ��� �� ��� ��� � ������

��� � � ��� ���� " B�� J�2)�17 ������� �� ����� ��

�����!����� � � ���� J�2 � ����� ������ �� � � ���

��� ����������� ������� ����� � ��� �17 ��� � ���

������� �� ��� � �� �� ��� ������" B�� J�2)�17

�� &� ������� ����� � ������� ��� ���� ������� ��

��� �� � ������ �� � ��� ����� �� � �� ��� ���� ���

� ����� � � � ���� ��� ��! ��� � ��� ��������" B��

�17 ��� ����� � ���� � �����!� �� �� � � ���� � �

��� �� �"

���� �������� � � ��� ����������� �� � ������ � � ���

���� � ������� ������� � �������� ������� ���� ��

������ ��� ���� ������ � ������ �� ��� �� ���� �

�� � ����� ���!��� � �$����� ��� � ��� � ���

������� � � ������� %�7" 9���� ��� ����������� �������

�� ������� ����� ������ �� ���!���� " B�� ��� ��

��������� ������ �� �$������ � �� � ���� � �����!�

������ ��� � ��� ���� ��! ���" 2�� �� ������� ����

��� ��� J�2)�17 ���� ��� �� �� &� ������� �� ���

����" B�� J�2)�17 ������� �� �$������ � ����� �

������ ���� ��� � �� � ���� " B���� ������� ����

��� � J�2)�17)���� �� &� ������� �� ������"

B�� J�2)�17)���� ������� �� �$������ � �� � �� ���

� � ������� %�7"

B �������� � ��� ������� �� � ��� ���� � / �� �

J�2)�17)���� D2��� ���E ����� � B��2 D� ����

� �� ����� ����� � 0"0=I B �� /0 � �������� �����

����� � �� +E �� ="0 ��C�� � �� ���� �� ����� � ���

�� � ������� � � � ������� �� ,A �� � = �" � ��� ����������� �� ���� � �������� � � ��� J�2)�17 D2����

���E ������� ����� ���� " ��� �������� ���� �� ��

���� �� ���&����"

"#2# .0 ��� (�! �&!��� �������

� ��������� ������ � ��� ������ ���� � ������ ��� ���

�� � � � � ������ ��� �;����� ��� �� �� �� � 9��" /" %

�� � ������ ��� �;����� �� � ��� � ���� ����� ����

������ ���� � �= �� ������� ��� � ��� ���� � ����������� � =00 �� ������� !�� ���� � � � �������� � �� ��� �� ���� ��� � ���� �� ����� ��� ���� � ���

������� �����" � ������� !�� �� �� ���� ��� ���

������ ��� !�� � ������ � �;����� ����� � � ������

��� � ��������� D4��� 4�����E" � ����� � �����

������ ��� C������� ����� �� �� ��� � � �� �� ����� �

� ���� �;���� ������ �� ������� �� ��� ����� ���� �

� ������� ����� ���� �� ��" B�� ������� ����� ����

�� � ��� ����� � ���� ���� ���� �� �� �������� �

��.�� ��" B�� � ����� � �� ��� ��� ������� � ������ �

��� '( ���� � �=@ �� ������� �� ��� ��� � ��� ��� �����"

� �������

2#�# �%�&� ����!�& ��$�!� !�� ��(��� ���%�����

K��� ��� � ��� ������� ����� ���� ��� (�����*��

�;����� �� � �� ������� �� �� � 9��" ," B�� ����

���� ���& ����� ��� ����� D�K3E �� +@A �� � � ��� �����

���� �� �������$���� D9K�-E � ��� �� � � ���& ��

="+ �" B�� ������� � ��� �� � � ������ ������ � ������

�� ���� ��� ������ ��� �� ��������� �� ������ � ���

�� � �K3 �� � ����� � ��� & ��������

� ��$ ������ �� ����� � ��� ������� ����� ����� � �

�� ��������� � ��� �K3 ����� D��K3E ��� �� ��� �

9��" /" % ����� ���� ���� � ������ ��� � � ��� ��� ����� � ��� �� � �������" 1���� ������� ��� ����� �� �� ��� � ��� � � ��� ���� � �

������� ����� �� ��" 1��� ��� ���� � ��� � � ������ �����" B�� ���� ���� �� � ����� � � ���� ����� ���� � ���� � ����� ��� � ��������� �����

��� �� � ������" B�� ��� � ���� ������� �������� ����� � � ������ �� � ���������"

�# )�����$�!� !�# * ������ !�� �&�!��� � �+ ,"��"- "�./""0 //=

����� �" B ������ �� � ��� �� � ������ ���� �

������ ��� �K3 � ��� '( ���� �� ������� � ���

D� � =�,,,E � � �����.�� ��� � ������ D� � =�?A/E" K���! � ��� ����� ���!��� �� � � ��K3C��� � �� � !��� �

���� � ����� � ��� ��� �� � �� �� ��� ������ �

����� � �������� �������" B�� ������ ����� � �K3

�� ��� � ������ ���� ��� ���� �� =@"@A ��

����� � � ����� ���!��� � � � � ==/ �" B��� ����� ��

����� ��� ��� ����� ���!��� � � �������������� �� ��

D� � ++ �E ����� ��������� � ������ � ������ �� �

�������� � ������ �� ���� ��� ��� ��� �� � ������" B��

��� ��� ������� � � ���� '( �� � ���� �� ="0A ��� ������ � � ��� ���� ����� � �� � � ������ ���� �

���� ������ ���"

2#"# 3����/(���� ������$ !��!�

� ���� )� ����� ��! ��� ����� �� ������ �

��� ����� ����� � ��� ������� ���� �" � ����$

� ���� ������� �� � ������ ������ DJ�/� J�2)�17�

J�2)�17)���� E �� ������ � � �$���� � ����

� �� ���� � � ��� � ������� %�7 D2����E" 1��� ����$

����� �� ������� ���� � ������� ������� �����

���� � � ���� � /= ���� ������� ������� �����"

������� ��� J�2)�17 ���� �� � �$������ � �� �

���� � ���� ����� � ���� �� � �� ���� � ���

��� ������� ���� �� ��� ������ � ��� �������� � ��$ � ���

���� ������ � � � �� �� ��� ��������� ������ ��� �

��� ���� � � �����" 8��� �� ����� ��� ����� ��� ���

� � � ������������ ����� "

9��" ? ���� ��� �K3 �����L���� ��� � � �� � ���

�������� �� ��� �� ���� �������*��� ����� ��� �

�������� � � J�/� J�/ � �J�2��17�� � � J�/��J�2��17����� � �������� � ��� �� � ������" B��� ��� � ������ ��� ��� ��� ������� � ��� �����

�K3 ����� �� ���� ������� ����� ����" B�� ����

� ������� ���� ��� �� � �� ������ ����� ��� �� � ����

������� � � � ��� �������*�� J�/� �� ��� �� ������

������� � ��� ������ � ��� J�2)�17 D-K � /000 8�E

�������" B�� ������ �� ��� �� ������ �������*��

J�2)�17 � � J�2)�17)���� D-K � ,?00 8�E �� ���

���������"

9��" @ �� � ��� �K3 ����� ��� �� �� � �� ��� � ����

� ��� �� � ���� �� �$���� � ����� � �� ���� �

� � ������� %�7 D0)+0 ��C��E � � ��� �� � � ������ �/0 �� " B�� J�2)�17 ������ D9��" @�E ������ ��� � ���

��� ��� ���� ��� ��� ����������� ������ D9��" @�E

��� ������ � � ����� � �����!� � ������ ���

��� � ������� %�7 �� ���� � �� ���� �" B�� J�2)�17)

���� ������ D9��" @�E ������ ��� ������ �� � �����!�

� ������ ��� ��� � ������� %�7L����� � �� � �K3

������ � ���� � ��� � �� ���� � �$���� � ���

���� %�7"

B�� �K3 ����� ��� ������ ���� /0 �� �� 9��" (� ��

������ �� � �� ��� � � ������� %�7 � �� ���� �

9��" (" � ����� �� �� ������ ��� �� ��� %�7 � �

�� ���� � � ��� ������� �K3 ����� �� ������� � � ���

� ��� � �� ���� %�7 ����� D="/@ ��C��� +",, -E �������� ��������� �� ��� ������� � �� �2� ����� "

2#2# )�!�!&��4!��� �% �����'�� ����$ (�����

�����!���

% �� � ����� ��� �� �������� ���� �� ��� � ��$� � �

��������� �����L ���� �� ���:��� � ��� ������� � ���

���� ��������� �� �� � � ���� �� � � ������� �� ���

�� L� �$����� � �� ������ � ���� � �����

��������� � ��! �� ����& ��� � � �������� � ��$ �� �����

��� ������" � ������ � ������� � � ��.�� �� �

��������� � � ��������� ������ ������������ !��� ���

9��" ," 6�������� � �� ���� �� � �� ��� � ����� ��� � ��� �� � ������� ���� � ������� ����� ��� ������ ��� ���"

/// �# )�����$�!� !�# * ������ !�� �&�!��� � �+ ,"��"- "�./""0

��� ��� ������ �� � ��� � � ������� �������� � � �

����� � ��� ��� �� � ����� ������ ���� �� <=,>"

B�� ������������ ���������� ������ �� ���� ��� � �

������ � ������ ���� ���������� ��� ���� � ��

�$������ � ���� �� �����$ �������� � ��$ �!���"

B�� ������������� ���� � ���� ����� �� � � ��

���D����� ?����� ����� ���E D�22� -K � (0�000E�

���� �� ���D�������� � ���������E D���� -K �A0�000E � � ���� �� ���D������ ���� �E D�1%� -K �(0�000E" B�� ������ �� �������� �� ������ � �

���� ����� ����� ���!���� " B�� ������������� ��

�������� � 0"' - J��� � ���� ��� D!����� ���� ���E

�� � � �� ���� � @ ��C��" B�� 0"' - J��� ����� ��

��� ���� �� �����C� �� ����� � ��� �$����� �" B��

������� � ��� ������������ ���������� !�� �� ���

����*�� �� ��� ��� � � ��.�� �� � ������ ��� � ����

��� �K3 � ��� �� � �� � ���� �� =0 � � ������F

D�E �� ��� �������� � 0"' - J��� ����� �� ��������

� � � �%J8 ������� ���� � � ��� �� � � ������

9��" ?" ���& ����� ��� ����� ������� � � ���� �� � ������ � ���� �� � ������ �������� ������" B�� � ��� � ������ ��� ��� ��� ������� � ���

����� �� ���� ������� �� � ����"

9��" @" 1$���� � J�/� �17� � � �17)���� ��������� ������� � ���� � �� ���� � � � ������� %�7" B�� J�/ ������ �������� � ������ �

�������� ���� �� �� � �� ���� ���� �$���� � �� ���� �� ���� ��� �17 ������ �������� � ������ � �������� �� �� �" B�� �17)����

������ ��� � �� � �� �� � � ������ ��� ��� � ������� %�7"

�# )�����$�!� !�# * ������ !�� �&�!��� � �+ ,"��"- "�./""0 //,

��� �� � ������ � @ �� � ��������� � ���������

������ �"

D��E B�� ����� �� ������ � � =00 �� � �1% ����� ������� � ��� ������� ���� � � ��� �� � � ������

� @ �� "

D���E B�� �1% ����� �� ������ � � ��� ��� �� � ���

��� �����" B�� �� � �� � ���� ��� ����� �

@ �� "

D��E �22 � � ��� �� ���� ����� ������ ��� �1%

������ ��� � ��� ���� ������ �� �������� �

�1%" � ����� � �� �� ���� ���� ���� �22 � � ���

� ������ � ����������� � ������ � � ����� � ��

�K3 ������ ����� ���& ����� �������" �����

������� � �1%)D�22)���E� ������ �� ��������" � ����

� =0 ����� ����� �� �������� � ��.�� ��"

B�� ������� � ��� �1%)D�22)���E� ���������� �� � �

���� �� ��� �� �� �� �� � 9��" A" B�� ���� ���� �

��� ��� � ������ ����� �� ��� ������ ���� ���

���� ��� ������ � �� �� ����� ���� ��� �� �����

���� � ����& ���� � � �� � ��� �� <=,>" ������� ���

� �� � ���� ���� � ��� ��������� ����& �� ����������� ��

������ ������ ��� ������ �� ���� ��� ����& ��� � ����

���� �� ���$������� @0 �M � � � ���� ��� �������� � ��$ �

9��" (" ���& ����� ��� ����� ����� �� � �� ��� � � ������� %�7 � �� ���� � ��� �17)���� ��������� ���� ���� � /0 �� � ������ " B�� ������

�� � � ������� � �������.���� ��� �� �� �� ��� "

9��" A" �K3 ����� ��� �� ���� �� ��� � ��� � ����� ������� � � ������������ �1%)D�22)���E� ���������" B�� ����& ��� � ���� ���� ��� � ���������

������ � � ��������� ������ ����� �� ����������� � � � ����& ��� � �@0 �M C ����"

//? �# )�����$�!� !�# * ������ !�� �&�!��� � �+ ,"��"- "�./""0

��� !�� �� ���$������� � � =�?'" #�� � ��� ����� ��������� � ���� �1% � :���� �� � ���� �� ������ �� ���

�K3 ����� � ���� �����.�� � ����� �������� � �� ��

������ �� � �� ��� � ���� ��������� ����& ���� �� ��

� 9��" +" � �� �� ����� ���� �� ���� �� � ��� !��

�@00 �M � ��������� �������� �� �������� �� �����

������ �����" #�� � ��� � �� ��� ����� � ����� �

���� � � � ��� �� ������ � ��������� �K3 ������ � ��

������ �� 0"00, � �� �� ������� ������ �� <'>" #�� � ���

����� ���� ������ � 9��" +� � �K3 ����� � 0"00, �

��� ���� � � � ����� ����& ��� ����� � 0"// �M "

� ����������

�� �������� � � ���� �� �������� ���� � � � ����

� �� ��� ������ � �������� � �� ������� � ������ ��

��� ������ ���� ��� � ���� �� �� � �� � �$�� ������

� ������ � � ��������� ������ ����� ���� �� ����

���� ������ � � ������ ������" ����� ����� ���� ��

����� �� ������ ��������� ��� ��� ��.��� ����� �� � � �

���� �� ��� � � ��������� ���� �� ��� ��� �� ����

� �������� ������� � � ��� ������ ����� � �������

����� ���� �� ��������� ��� ��� ���� � �������� ����

��� � ���� � ���� ����� � ������� � ������ �"

B�� �$����� �� �������� � ���� ��� �$������� �

��� ������� ���� � ������� �� �� ���� � ������ ����� �

���� )���� �� �� � � ������ " % ���� ����� ��� ������

������� � �������� ������� �� �� � ����� � ����� �

�������� ������� � � ������� � ��� � ������ � �� �� �

� ������ ��� ����������� ����� ��� ���� ���� �

�����!� ���� �� �� � � � � �� �� ��� �����"

B�� ���������� ������ �� ���� ������ ��� ��� � ����

�� � ������ � ���� )���� � ������ � � �� �������

������� �����"

%� �� � ��������� ���� ��� ������� � � �� ���� �����

� ���������� � ������ � � ������� ����� ��� ��� �

;����� � ���� ��� �� �� ���� ����� ����� � � ������

������ !����" 9 ���� �������� � ���������� � ���

�������� ������� ��� ��� ��� � �� ������� � �� ��

���� �� � � ��� ���� ���� �� ����� �� ��� ���

��������� ������ �����" B�� �� � ��������

������ �������� �����*�� � ����� ����� ��� ����

� ��� � ��� ������� �� � ������ �������" K����

���� ��� ���� �� ��&� � ��� �������� � ��� �����

�������� � � ����������� ���� �.��� ���� �� �����#3

������������ �� �.���� � ����� ��� ��� ��� � ���

����� ��� �� ����� �� �� � ����� �� � �� �� ����

�� �� ������ �� � �� ��� ��" K���� ��� ��� � &

�����*�� ��� ����� ����� �� � �� � ����������� � �� ��

��� ������� � ��� ��� ����� ����� � ����� �������

��� �� ������ ���� �� ���������� � � ��&�� �������"

2��� ���� �.��� �� ��� �� ������� � ��� �� �����

��� � ������ ���&�" B�� ����������� ���� �.��

����� � ���� & ��� �� ����� �� �� ��.�� ������

����� � �������� ���� � � �� ��� ����� � �������

!�� ���� �� ���� ��� ���� ��� ��" ��&� ���� ������� �

��������� ��� !�� ���� �� ��� ��� �� � �$�� ������

������ � �� ��� ������ � ������� ���� ���������

��!���� ������ ������� �������" #�� � � � �� ���

!�� ������ � �� � �������� � � �� ��� =000 �� �� �

������� �� � ��� ������ ����� � �� ��� ������ �

���� ��� ��� ���� ����� ������ � ����� ��������

�������� ��� ��� �� ���� � ��� ����������� "

4 � � ��� ��� ��� �!�� � ���� ����� � ��� ��������

�� � � ���� � �� ��� ����� �� ���� �� �� ��

9��" +" 1����� � ��� ������������ ���� ����& ��� ��� � ��� ������ � ����� � ��� �1%)D�22)���E� ���� �������"

�# )�����$�!� !�# * ������ !�� �&�!��� � �+ ,"��"- "�./""0 //@

�� ������" 2� � �$������ �.���� ������ ��� ���

��������� ���� ����� ������ ����� ��� ��� � � !��

���� ��� ������ �� � ������ �� ������� � �� �� ���

�� � ������" 2� � ����� �� ������ �� ������� �

����� ����� � ��� � ������ !�� ���� �� �� ���� ��� ���

������ ��� ���" B��� �� ������ ������� �������

�.���� ��������� � ���� � � ��������� ��� �

��������� �� � �� �� ���&��� �� � � � ������ � �$�� ��

�������" ��&� ���� ����� � ����� ��� ��������� � ��$

������ � ;���� �� �.���� � � ���� ��� �� � � � � ��"

B�� ������� � �$���� � � ��� ��� �� � � ���� �� � �����

������!�� � ����� � ��� ������� � � ��� �����

����� ���� �� ������� ������� ���� � ���� � � ������

� � ����� ���� ��� ������� ����� �����" ��������

� ��� �� � ������� � � ��� ����� ���� �� ������

������ � � ���;��� ; ��� ��� �� � ���������"

B�� ���� )���� �� �� � ����� ���� ��� �� ��� ��

�������� � ��� ����� ��� ��� � �������� ����� ��� ��� �

�17 ������� � � �� �����!� �� �� �� � � ��� �������

� ������ �� &� �������� ��� ���� �� ���� " B��

��� ��� ������� � ��� �K3 �������� � �� ��� ���

0"00= �� ������� � �� ���� �������� ��� �� �� ��

��! �� �� � ��� � ������ � � � ����� � 0"00, �" �����

�� � 0"00, � �� ���� ��� ��� � �� �������� ����� �

0"(= - �� ���������� � ��� ���� )���� �� �� � �����

��� � ��� ��! �� ����" B�� �� �������� ����� �� ��

����� � �� ��� ����� ��� � ����� �� �� � ��������

������ �������� D���� �� ������� � � ������E � �

� �� ����� � ������ ����"

� ����������

� ���� �� �������� ������� ���� � ����� ������� �

��� ��� � ������ �� ���� ��� ������ � � �

�� � ���� ������ ��� �� � � !��� �� ��� ������"

#�� � ������� ����������� � � ����� �� � ���

���� ������� � �� ��� ������ � ������� !��� ��� �� �

�� �� ������ � �$�� ������ �� ���� ������ ����" B��

�� � ������� �� � ������ � � ��� ��� '(� ���

������� ������ � � ���� � ���� � ���� )����

��! ��� �����" � ������ ����� �������*��� ����

��� ����� � � �����!� �� �� � �� ���� � ������ �

� ����� ��� +", - �� ��������" %� �� � ��������� ���� ���

�� � ��� �� � ������ � � ��������� ������ �����

����� � � ���� ��������� ������� � ������� � �

������� �� �� � � ������ � � ��� !���� � �� �����

�������� � � ������� ���� �����"

����������

<=> �"�" �� ���� -" -� � ������� � ����� �� �� � � �� ����

J���� ?0@ D/000E +,A)+?("

</> J" ����� � ��� � �"8" -����� � 2" 2��� �� �������F

��������� � � ����� � � ������� ������ ��" 4�� " ������ �"

== D/000E ?0+)?=/"

<,> 7" -�������� 2"�" 2������� �� �� � ���� � �� ������� �

������������� �� ��� ������ ��� � 2��� �� /+' D/000E =A(0)

=A(,"

<?> 9" ����� 1" 6���� 8"J" 9�� �� N" J�:&��� O" 4&������ ����*

������ ������� �� ����� � � � �������*��� � � ������*���

� ������ ���� �� � �������� �� � ��" ����" (' D=''AE /0?,)

/0?'"

<@> �" ������ �" �� � �" N���� 2� ������ ������� ����� � ���������

������� � � �.���������� ��������� � ���������� �����

���� ��� � ��� ��� ���������� ����" ����" ����" A@ D='''E

=+0/"

<(> 7" K�� 6"�" 8���� N"-" �� �� � B" B�� ���� 6"�" ���� �"

-�:����� ������� � ��������������� � ���� D�2�E ��� �

����� �������� J��" ������ �" =' D/00=E +@()+(0"

<A> K" ����� 6" �� �� �" 9���� ��� �" �������� �" N���� 9" -�����

8" 2�������� K" ��&�*� 8���� ������ ���� �� �� � D�� ��������

� � �����������E� 2� �" ������� � ( D=''/E =//)=/("

<+> �" ������ 7" 7������*� 4������ ���� � � �� ������� ���� �"

������� " =0 D=''@E '/,)',("

<'> �"B" �� � ����� �" ��� �" �� � �" ������ �������� �� � �

������� �� � ����� ���������� ����� ���� �.��� 2� �" ������� �

+= D/00/E ,=(),/+"

<=0> 6" -�� ��� � 2"2" K� �� J� �� ����� � ������ ������� ����"

����" ����" (= D'E D=''/E =0//"

<==> 2" �� �� 7"-" -��� 6�� � � ������� � �� � ����� �� ��

���� ��� �" 4��" 2�" ��" � =, D@E D=''(E '',"

<=/> 7" -�������� �" N����� 2"�" 2������� ����FCC ��������"���

��"�����"���C���C�����C2-�"����"

<=,> �" ������ 7" ������ �" 2� ��� �"��" 3����� �" 2������ 9"�"7"

����� ��� �" 7������ 8����� ��� � �������� ��������

��������*� � ��� ����� �� ������ ������F � ������ ��� ��

��� � � � ��� ���������� � � ������ �������� ��������

���������� �" ����" ����" ==@ D/E D/00=E =0+()=0'?"

//( �# )�����$�!� !�# * ������ !�� �&�!��� � �+ ,"��"- "�./""0