a l'interface oxyde/solution aqueuse

Magistère des Sciences de la Matière Ecole Normale Supérieure de Lyon Université Claude Bernard Lyon 1

Stage 2003-2004 SALAGER Elodie 1ère année Option Chimie

REACTIONS PREBIOTIQUES : FORMATION DE MOLECULES « ENERGISEES » A

L’INTERFACE OXYDE/SOLUTION AQUEUSE

La formation de liaisons anhydride phosphorique « P-O-P », utilisées par les êtres vivants comme de véritables réservoirs d’énergie libre, n’est pas favorisée thermodynamiquement en milieu aqueux.

L’objet de ce stage a été d’étudier si l’adsorption préalable des précurseurs de l’adénosine triphosphate (ATP) sur des oxydes (l’alumine et la silice) peut rendre possible la formation de ces liaisons anhydride phosphorique.

Laboratoire de Réactivité de Surface, UMR 7609 Université Pierre et Marie Curie (Paris VI)

Tour 54-44, 1er et 2ème étage 4 Place Jussieu, 75252 Paris Cedex 05

http://web.ccr.jussieu.fr/lrs Mots-clés : chimie prébiotique, nucléotides, phosphates, adsorption spécifique Maîtres de Stage : Jean-François Lambert

Lorenzo Stievano juin-juillet 2004

Magistère des Sciences de la Matière Ecole Normale Supérieure de Lyon Université Claude Bernard Lyon 1

Stage 2003-2004 SALAGER Elodie 1ère année Option Chimie

REACTIONS PREBIOTIQUES : FORMATION DE MOLECULES « ENERGISEES » A

L’INTERFACE OXYDE/SOLUTION AQUEUSE

Laboratoire de Réactivité de Surface, UMR 7609 Université Pierre et Marie Curie (Paris VI)

Tour 54-44, 1er et 2ème étage 4 Place Jussieu, 75252 Paris Cedex 05

http://web.ccr.jussieu.fr/lrs Maîtres de Stage : Jean-François Lambert

Lorenzo Stievano

REMERCIEMENTS Je remercie tout d’abord Mme. Breysse, Directeur du Laboratoire de Réactivité de

Surface de l’université Pierre et Marie Curie, pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire.

Je remercie également M. Jean-François Lambert et M. Lorenzo Stievano pour m’avoir

encadrée. Travailler avec eux a été un plaisir et je les remercie pour leur gentillesse, leur aide et leurs conseils tout au long de ce stage.

Je tiens aussi à remercier Michel Bouchard et Christophe Colbeau de LIMHP de

Villetaneuse pour leur attention et leur aide. Merci à tout le personnel et tous les étudiants du laboratoire, notamment Fatou, Ahmed,

Sylvain, Céline, Vicente et Lingyu, qui m’ont accueillie chaleureusement et conseillée quand j’en avais besoin.

Enfin, un énorme merci à tous ceux qui m’ont permis de profiter de ce séjour à Paris et en

ont fait une expérience inoubliable.

1

I. INTRODUCTION Au sein de l’Université Pierre et Marie Curie, le Laboratoire de Réactivité de Surface,

rattaché au CNRS, est spécialisé dans l’étude des processus moléculaires intervenant dans l’élaboration de matériaux solides inorganiques et dans l’élucidation des mécanismes gouvernant la réactivité de surface.

Un des thèmes de recherche du Laboratoire de Réactivité de Surface est actuellement axé sur l’approche moléculaire de la synthèse et de la réactivité des matériaux catalytiques. Ceci donne une expérience reconnue au laboratoire en ce qui concerne l’étude de l’interaction entre les surfaces d’oxyde et les petites molécules en solution. Dans le cadre de la réorganisation du laboratoire, une nouvelle orientation apparaît : l’étude des molécules d’intérêt biologique et de leurs interactions avec les surfaces d’oxyde.

On peut ainsi s’intéresser à l’évolution prébiotique des molécules bioorganiques. En

effet, on pense que certains oxydes comme la silice, l’alumine ou les minerais argileux étaient déjà présents sur Terre en grande quantité durant l’ère prébiotique.

L’adénosine triphosphate (ATP, cf. annexe) est une substance essentielle à la vie actuelle, mais elle aurait aussi pu jouer un rôle important dans l’évolution prébiotique sur la terre primitive. Les liaisons « anhydride phosphorique » (P-O-P) sont utilisées par les êtres vivants comme de véritables réservoirs d’énergie libre. Le stockage de l’énergie se fait par phosphorylation de l’adénosine diphosphate (ADP) en ATP, qui sera ensuite libérée par simple hydrolyse (cf. annexe).

Cependant, puisque la formation d’ATP en milieu aqueux est thermodynamiquement

défavorable (endergonique), on peut se demander comment cette molécule a pu se former, en l’absence de cellules ou d’enzymes. Il est possible que les minéraux aient joué un rôle dans les processus chimiques de cette étape primordiale. L’adsorption de molécules à la surface d’un solide modifie en effet leur environnement et donc les données thermodynamiques : on peut parler d’une « phase adsorbée », quasiment bidimensionnelle, en équilibre avec la phase aqueuse voisine. Ainsi, la formation de liaisons anhydride phosphorique serait-elle possible en présence d’un oxyde ?

Des suggestions semblables ont été avancées dans la littérature sur les origines de la vie

depuis de nombreuses années [1], mais les études expérimentales sont rares. Certes, la phosphorylation de l’adénosine monophosphate (AMP) et diphosphate (ADP) a

été observée expérimentalement dans une suspension aqueuse de phosphate de calcium (solide) en présence d’ions cyanates [2], ainsi que la formation d’AMP à partir d’adénosine et de dihydrogénophosphate par irradiation de rayons UV, de photons à haute énergie ou de rayonnements électroniques dans l’espace [3].

L’adsorption d’AMP sur des précipités de phosphate de calcium et les effets de différents cations en solution ont également été étudiés [4], ainsi que celle de l’ATP, l’ADP et l’AMP sur de la montmorillonite, de la kaolinite et de l’alumine [5] ou de la silice [6], mais sans se soucier de l’éventualité d’une phosphorylation. De plus, cette étude, comme la plupart des autres, est purement phénoménologique : les mécanismes d’adsorption ne sont quasiment jamais abordés.

Durant ce stage, nous avons essayé de déterminer si des réactions de phosphorylation peuvent se produire par adsorption sur de la silice, qui possède une grande surface spécifique et modélise assez bien certains composants majeurs de la croûte terrestre.

2

II. PARTIE EXPERIMENTALE L’étude sera menée parallèlement sur de l’alumine, oxyde connu pour sa plus grande

réactivité.

II.1. Protocole d’adsorption Notre but est d’étudier la possibilité d’une formation d’ATP à partir d’ADP ou d’AMP et

d’ions phosphates inorganiques (Pi), par adsorption de ces composés sur la silice ou l’alumine.

Nous avons tout d’abord voulu observer les affinités des différents réactifs sur la silice et l’alumine. Pour cela nous avons utilisé du phosphate de sodium Na3PO4.12H20 (Aldrich) noté Pi, de l’hydrogénophosphate de sodium Na2HPO4 anhydre (HPi) et du dihydrogénophosphate de sodium NaH2PO4 anhydre (H2Pi) tous les deux fournis par Sigma ainsi que de l’adénosine, de l’adénosine monophosphate (AMP) et des sels de l’adénosine diphosphate ADP dihydraté et triphosphate ATP hydraté (les contre-ions sont des ions sodium). Ces composés, fournis par Acros, sont théoriquement instables à température ambiante et bien que la réaction de décomposition soit lente, ils sont stockés dans le compartiment à glace d’un réfrigérateur.

II.1.1. Adsorption sur silice La silice utilisée est de l’Aérosil de surface spécifique 380 m2/g fournie par Degussa. La méthode utilisée est l’adsorption sélective. Le principe de base est de laisser s’établir

les équilibres d’adsorption entre phase aqueuse et phase adsorbée, puis d’éliminer la phase aqueuse. Seules seront alors retenues à la surface du solide les molécules qui établissent une interaction spécifique avec la surface.

On ajoute une solution de volume 20 mL du ou des produit(s) à adsorber sur 500 mg de silice. Dans la présente étude, les adsorptions ont été réalisées à partir de solutions 0,01M en nucléoside/tide et (ou) en phosphates.

Le pH de la solution est mesuré avec un pH-mètre (Tacussel TT-processeur 2 muni d’une électrode combinée en verre) avant d’être mélangée, juste après le mélange, et à la fin de l’adsorption. Ces mesures peuvent donner des informations sur le mécanisme d’adsorption.

On laisse sous agitation pendant environ 20 heures, puis on sépare le liquide du solide par centrifugation (plusieurs fois 15 minutes à 8000 tours/min). Le solide est enfin séché à l’étuve à 50°C.

Les échantillons solides récupérés après adsorption sur silice et centrifugation seront identifiés par le suffixe « /S ».

II.1.2. Adsorption sur alumine L’alumine utilisée est une alumine γ (fournie par l’Institut Français du Pétrole). Les

particules de diamètre compris entre 100 et 150 µm ont été sélectionnées par tamisage. La méthode est identique à celle utilisée pour adsorption sur silice ; toutefois, nous avons

fait barboter du diazote dans la solution pour éviter la dissolution de dioxyde de carbone qui provoquerait la carbonatation de l’alumine, modifiant ainsi son état de surface.

Les échantillons solides récupérés après adsorption sur alumine et centrifugation seront identifiés par le suffixe « /A ».

II.2. Techniques de caractérisation Il nous a paru judicieux de déterminer tout d’abord les « empreintes digitales » des

réactifs et des produits possibles par diverses techniques spectroscopiques, afin de pouvoir identifier leur présence éventuelle dans les échantillons solides obtenus après adsorption.

3

II.2.1. Analyse thermogravimétrique L’analyse thermogravimétrique (ATG) permet de déterminer les pertes de masse de

l’échantillon par rapport à une référence inerte pendant une montée en température sous flux gazeux. L’analyse thermique différentielle (ATD) nous renseigne sur l’exothermicité ou l’endothermicité des phénomènes chimiques ou physiques observés. La balance thermogravimétrique utilisée est une SEIKO SSC 5200H assurant aussi l’analyse thermique différentielle et couplée à une interface informatique. Les creusets utilisés sont en platine et la référence est un creuset de platine vide. Les flux thermiques sont mesurés à l’aide de capteurs connectés aux deux creusets.

Les expériences d’ATG ont été effectuées sous flux d’air industriel (100 mL/min) avec un montée en température de 5°C/min entre 30 et 810 °C, suivie d’un palier de 30 minutes à 810°C.

On trace la DTG ou vitesse de perte de masse (% par rapport à la masse finale/min) en fonction de la température (°C) pour observer clairement les phénomènes thermiques.

II.2.2. Diffraction des rayons X (DRX) La diffraction des RX nous renseigne sur la structure cristalline de nos échantillons, en se

basant sur l’interaction de radiations électromagnétiques monochromatiques (Rayons X) avec une organisation périodique de diffuseurs atomiques. Toute phase cristalline (solide présentant une disposition périodique de la matière) donnera lieu à un phénomène de diffraction, manifesté par une série de faisceaux diffractés formant des angles 2θ caractéristiques avec le faisceau incident.

Les diffractogrammes sont enregistrés sur un diffractomètre de poudres (modèle D500 SIEMENS) équipé d’une anticathode en cuivre. On utilise la radiation Kα du cuivre (longueur d’onde moyenne : 1,5418 Å). L’acquisition des résultats est informatisée et régie par le logiciel DIFFRAC pour une plage d’angles 2θ comprise entre 10 et 70°.

II.2.3. Spectroscopie UV-Visible-PIR en réflexion diffuse. Tous les spectres UV-Visible-PIR des échantillons solides ont été enregistrés sur un

spectrophotomètre de type CARY 5E (Varian) muni d’une sphère d’intégration pour la réflexion diffuse. Les domaines de longueur d’onde sont compris entre 190 et 800 nm pour l’UV-Visible, et entre 800 et 2500 nm pour le proche IR. Les spectres sur poudres non compactées ont été obtenus en réflexion diffuse après tracé d’une ligne de base correspondant au Téflon (supposé parfaitement lisse et réfléchissant).

II.2.4. Spectroscopie infrarouge Les spectres sont effectués sur un spectromètre à transformée de Fourier BRUCKER

IFS66 avec des fenêtres de KBr. Le domaine de nombres d’onde est situé entre 400 et 4000 cm-1. Les spectres sont enregistrés en mode transmission sur des pastilles de KBr, obtenues en broyant une petite quantité du composé à analyser avec du bromure de potassium en poudre. Le mélange subit ensuite une pression d’environ 10 tonnes/cm2 dans un moule cylindrique de 13 mm de diamètre.

II.2.5. Spectroscopie UV-Visible en transmission Les spectres des échantillons liquides ont été enregistrés en absorbance avec le même

spectrophotomètre dans des cuves en quartz de 10,00 mm de coté. Une des cuves est remplie d’eau distillée et représente la référence, l’autre contient l’échantillon à étudier. Le domaine de longueurs d’onde étudiées s’étend de 190 à 800 nm.

4

II.2.6. HPLC La Chromatographie Liquide à Haute Performance HPLC est devenue une méthode de

séparation complémentaire de la Chromatographie en Phase Gazeuse pour l’analyse de solutés thermodégradables, comme c’est le cas pour nos produits.

L’appareil du LIMHP est une chromatographie de partage à polarité de phase inversée : elle utilise une phase stationnaire apolaire (silice greffée C18) et une phase mobile que nous avons composée d’eau et d’acétonitrile, en nous basant sur l’article de C. Vichard et T.A. Kaden [7]. Quelques gouttes d’acide phosphorique sont ajoutées afin d’ajuster le pH, ce qui permet d’affiner les pics. La détection se fait par mesure spectrophotométrique UV-Visible sur un intervalle de 190 nm à 300 nm.

Nous avons utilisé le système chromatographique HPLC Varian Prostar piloté par le logiciel POLYVIEW 2000-Diode Array Spectral processing Software.

III. RESULTATS ET INTERPRETATIONS

III.1. Etude préliminaire de la carbonatation de l’alumine Des études préliminaires au LRS ont révélé que l’alumine peut être carbonatée en

surface, ce qui complique considérablement l’interprétation des résultats d’adsorption. Afin de pouvoir déterminer l’éventuelle apparition de ce phénomène, nous avons utilisé plusieurs méthodes :

III.1.1. Spectres IR On carbonate l’alumine artificiellement par mise en suspension de 500 mg de γ-Al 2O3

dans 20 mL d’une solution d’hydrogénocarbonate de sodium (1 M) pendant toute la nuit. La solution est ensuite centrifugée deux fois 15 minutes à 8000 tours/min puis mise à sécher à l’étuve à 50 °C pendant une journée.

4 0 09 0 01 4 0 01 9 0 02 4 0 02 9 0 03 4 0 03 9 0 0

n o m b re d 'o n d e (c m -1 )

tran

smitt

ance

a lu m in ein d u s tr ie lleb ru te

a lu m in ec a rb o n a té e

3 4 4 0

1 4 0 01 5 7 0

1 0 9 51 3 7 5

3 46 5

3 2 9 0

1 62 0

1 5 1 0

La carbonatation se manifeste par l’apparition de trois bandes assez étroites, non

attribuables aux modes de vibration connus pour l’alumine : à 3290, 1570 et 1400 cm-1. Une bande moins intense mais très fine est également discernable à 1095 cm-1. Il n’est pas impossible que certaines de ces bandes soient présentes sur l’alumine industrielle que nous avons utilisée, mais en tout état de cause elles sont dans ce cas faibles et larges. Le degré de carbonatation de notre support γ-Al 2O3 est donc initialement faible.

5

III.1.2. ATG

0.00E+00

1.00E-01

2.00E-01

3.00E-01

4.00E-01

5.00E-01

6.00E-01

30 130 230 330 430 530 630 730 830

température(°C)

vite

sse

de p

erte

de

mas

se (

%m

final

e/m

in)

alumine carbonatée

alumine brute

275

450

58

On observe l’apparition de pics à 275 °C et 450°C pour l’alumine carbonatée. Ces pics

correspondent à une variation de masse due sans doute à la décomposition des carbonates. Les données de l’infrarouge sont bien confirmées : ces pics ne sont pas discernables pour l’alumine de départ : le degré de carbonatation initial de notre support est nul ou très faible.

III.1.3. DRX

10 20 30 40 50 60 70

angle 2 θ (°)

inte

nsité

(co

unts

)

aluminebrute

Aluminecarbonatée

15.7

19.5

32.6

37.2

39.5

39.5

37.232.246.2

46.2

67

67

61

18.2

La carbonatation de l’alumine cause l’apparition d’un nouveau pic de diffraction vers 2θ

= 15.7°. La phase responsable n’a pas encore été identifiée, mais ce résultat suggère qu’une carbonatation profonde aboutit à la formation d’une nouvelle phase cristalline.

III.2. Evolution du pH lors des adsorptions sur l’alumine

III.2.1. adsorption de phosphates Composé adsorbé

pH de la solution de départ

pH juste après le mélange avec l’alumine

pH à la fin de l’adsorption

Pi 10.69 9.93 8.96 HPi 8.7 10.02 9.63 H2Pi 4.61 7.53 9.24

6

Dans le cas de Pi et H2Pi, l’évolution du pH suite au mélange avec l’alumine peut être attribué à un effet tampon de la surface de l’alumine : PZC (point of zero charge) d’environ 8.2. Le cas de HPi est surprenant car on observe une basification alors que le pH dépasse déjà le PZC de l’alumine.

Après adsorption, les pH finaux (9 à 9,6) semblent plus élevés que le PZC de l’alumine : il est possible que le mécanisme d‘adsorption de ces composés sur l’alumine aboutisse à la libération d’ions hydroxydes (OH-). Ces résultats devront faire l’objet d’une étude plus approfondie.

La variation du pH aboutit probablement à un changement du degré de protonation des divers phosphates. Plus précisément, d’après la courbe de spéciation théorique (cf. annexe), les pH finaux se trouveraient dans la zone de prédominance de l’ion monohydrogénophosphate (HPi).

Cependant, juste après mélange, le pH 7.53 suggère qu’autant d’hydrogéno que de dihydrogénophosphate étaient en solution.

III.2.2. adsorption d’adénosine, AMP, ADP et ATP Composé adsorbé




forme prédominante

adénosine 6.50 7.10 7.50 adénosine AMP 2.33 3.09 5.47 AMP-/AMP2- ADP 2.41 5.45 7.16 ADP2-/ADP3- ATP 2.89 5.90 7.45 ATP3-/ATP4-

Les pH des solutions initiales ne sont pas très éloignés des valeurs théoriques. Dans tous les cas, le milieu devient plus basique lors du contact avec le support. Ici aussi on peut invoquer l’effet tampon du support. Ceci a peu de conséquences sur la spéciation de l’adénosine mais devrait aboutir à déplacer la spéciation des trois nucléotides vers des formes plus chargées négativement : l’AMP est un mélange d’AMP -/ AMP2-, l’ADP est également un mélange d’ADP2-/ ADP3- et l’ATP est sous forme ATP3-/ ATP4-. Ces renseignements seront importants pour l’interprétation des spectres IR.

III.2.3. adsorption de mélanges

i. adénosine et phosphates L’adsorption n’a été réalisée qu’avec HPi et H2Pi pour ne pas trop s’éloigner du pH de

l’adénosine seule. Les solutions ont été préparées en dissolvant les quantités nécessaires d’adénosine et de phosphate pour obtenir une concentration de 0.01M chacune pour un volume total de 20 mL. mélange pH prévu

théoriquement pH solution de départ


pH en fin d’adsorption

Adénosine+HPi 9.46 8.73 9.88 10.14 Adénosine+H2Pi 5.34 6.27 8.40 9.23

On observe également, juste après mélange, une basification du milieu. Ce phénomène est contraire à celui qu’on attendrait d’un effet tampon de l’alumine. De plus, le pH continue d’augmenter pendant l’adsorption, et le résultat final de l’adsorption en présence d’HPi est nettement supérieur à celui qu’on aurait pu attendre des données précédentes. En revanche, le pH final du mélange Adénosine + H2Pi est le même que celui pour H2Pi seul. Ici encore, on peut supposer la libération d’ions OH-.

D’après les pH finaux, ce sont l’adénosine neutre et l’hydrogénophosphate qui sont prédominants en fin d’adsorption.

7

ii. ADP et phosphates mélange adsorbé

pH prévu théoriquement


pH juste après mélange


forme prédominante

ADP+HPi 5.13 4.70 6.43 7.80 ADP3-+HPi/H2Pi ADP+H2Pi 3.19 2.61 4.80 6.82 ADP2-/ADP3-+ HPi/H2Pi

Ici, la basification est en accord avec l’effet tampon de l’alumine qui tend à imposer un pH après mélange proche du point de charge nulle (PZC : 8.2). Par ailleurs, les pH finaux ne sont pas très éloignés de ceux qu’on peut attendre des valeurs précédentes (ADP : 7.16, HPi : 9.63, H2Pi : 9.24)

III.3. Mesure des pH pour les adsorptions sur la silice

III.3.1. adsorption de phosphates Composé à adsorber


pH juste après le mélange avec la silice


forme prédominante

Pi 10.69 8.62 8.21 HPi HPi 8.70 7.47 7.57 HPi/H2Pi H2Pi 4.61 3.66 4.02 H2Pi

On observe initialement (au contact de la silice) une acidification de la phase aqueuse dans les trois cas. L’effet reste assez mineur, en accord avec le faible pouvoir tampon attendu pour la silice dans le domaine des pH intermédiaires (PZC de le silice : 2). Elle se poursuit au cours de l’adsorption pour le monophosphate (Pi), mais laisse place à une légère basification pour les deux formes acides.

III.3.2. adsorption d’adénosine, AMP, ADP et ATP Composé à adsorber

pH solution de départ

pH juste après le mélange avec la silice


forme prédominante

adénosine 6.50 4.88 2.52 adénosineH+ AMP 2.33 2.27 3.01 AMP ADP 2.41 3.02 2.56 ADP- ATP 2.89 2.72 2.55 ATP2-

La tendance générale est à l’acidification, sauf pour l’AMP à long terme. Le pH final est assez proche du PZC de la silice : on peut évoquer son effet tampon.

III.3.3. adsorption de mélanges

i. adénosine et phosphates Comme pour l’alumine, l’adsorption n’a été réalisée qu’avec HPi et H2Pi pour ne pas trop

s’éloigner du pH de l’adénosine seule. mélange pH solution

de départ pH juste après mélange


forme prédominante

Adénosine+HPi 8.73 7.18 7.56 adénosine+H2Pi/HPi Adénosine+H2Pi 6.27 7.4 4.92 adénosine+H2Pi

On observe une acidification initiale, suivie d’une basification du milieu pour le mélange (Adénosine+HPi). L’évolution est exactement inverse pour le mélange (Adénosine + H2Pi). Ces évolutions semblent être imposées par les phosphates.

8

ii. ADP et phosphates mélange pH solution

de départ pH juste après mélange


forme prédominante

ADP+HPi 4.70 4.46 4.55 ADP2-+H2Pi ADP+H2Pi 2.61 2.52 2.29 ADP-+H2Pi/H3Pi

Les pH nettement acides des solutions de départ ne varient pratiquement pas au cours de l’adsorption. Cette acidité est en accord avec l’effet de la silice.

III.4. Caractérisation des solides séchés

III.4.1. Phosphates adsorbés sur l’alumine (Pi /A, HPi /A, H2Pi /A)

i. ATG de Pi/A, HPi/A et H2Pi/A

30 130 230 330 430 530 630 730

température (°C)

vite

sse

de p

erte

de

mas

se (

%m

final

e/m

in)

Pi/A

HPi/A

H2Pi/A

alumine

500

485

500

Les courbes ont été décalées pour une meilleure visibilité, la légende suivra toujours

l’ordre des courbes. On observe un pic aux alentours de 500 °C. Ce pic, absent sur le support alumine nu, est sans doute dû à une réaction des phosphates adsorbés à la surface de l’alumine.

ii. UV-Visible-PIR de Pi/A, HPi/A et H2Pi/A

190 690 1190 1690 2190

longueur d'onde (nm)

abso

rban

ce

Pi

Pi/A

HPi/A

H2Pi/A

alumine

2243

1990

1500

1402

190

210

1921 22271380

9

On n’observe aucun changement significatif du spectre de l’alumine. Les bandes des espèces adsorbées sont peut-être trop faibles pour être détectées, et/ou cachées par les bandes de l’alumine.

iii. Spectre IR de Pi/A, HPi/A et H2Pi/A

400900140019002400290034003900

nombre d'onde (cm-1)

tran

smitt

ance

H2Pi.A

HPi/A

Pi/A

alumine

Pi

1655

14472305

32551008

16301367

1502

1045épaulement

Un épaulement apparaît vers 1045 cm-1. Il est possible qu’il soit dû à la bande d’élongation P=0 du phosphate (vers 1008 cm-1 dans le phosphate massique).

Une étude antérieure [8] de la dépendance en pH du spectre de l’orthophosphate nous invite à être prudents quant à l’interprétation du décalage des nombres d’onde.

iv. DRX de Pi/A, HPi/A et H2Pi/A

Dans la région étudiée, on n’observe aucun pic de diffraction à part les pics larges dus à l’alumine. On en déduit que les phosphates ne forment pas de phase massique séparée du support alumine, et donc qu’ils sont probablement adsorbés sur la surface de ce support.

25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

angle 2 θ (°)

inte

nsité

(co

unts

)

alumine

Pi/A

HPi/A

H2Pi/A

Pi

10

III.4.2. Phosphates adsorbés sur la silice (Pi /S, HPi /S, H2Pi /S)

i. ATG de Pi/S, HPi/S et H2Pi/S

37.52 237.52 437.52 637.52

température (°C)

vite

sse

de p

erte

de

mas

se (

%m

final

e/m

in)

Pi/S

HPi/S

H2Pi/S

silice

470

515

On observe la présence d’un pic de perte de masse pour les échantillons issus de l’adsorption du monophosphate et de l’hydrogénophosphate ; par contre l’échantillon obtenu par adsorption du dihydrogénophosphate ne donne aucun pic. Comme pour l’alumine, ces pics sont probablement dus à une réaction de phosphates adsorbés à la surface du support.

ii. UV-Visible-PIR de Pi/S, HPi/S et H2Pi/S

190 690 1190 1690 2190


abso

rban

ce

Pi

Pi/S-M

Pi/S

HPi/S

H2Pi/S

silice

190

1895

1937

2235

2235

2240

14001520

1975

2240

139013652200

1390

2245

1520

1390

1750

1750

Le spectre de Pi/S-M, mélange mécanique du phosphate avec la silice (1 mmol/g), est

enregistré pour comparaison. On peut noter que deux bandes larges non attribuées mais caractéristiques du phosphate

massique (Pi) sont observées à 1520 et 1750 nm pour le mélange mécanique, mais pas pour les échantillons obtenus par adsorption.

D’autre part, dans la région des harmoniques 2 νOH, on observe pour les échantillons obtenus par adsorption deux bandes distinctes respectivement à 1365 et 1390 nm. La première, sans doute attribuable aux groupes Si-O-H (cf. spectre de la silice nue), est surtout marquée pour H2Pi/S ; la seconde semble varier en proportion inverse, et est surtout marquée pour Pi/S , où elle domine clairement la bande à 1365 nm. Une étude plus poussée serait nécessaire pour déterminer si cette bande à 1390 nm doit être attribuée à des groupes P-O-H ou simplement aux OH de l’eau, mais en tout cas cette région paraît avoir un intérêt diagnostique.

11

iii. Spectre IR de Pi/S, HPi/S et H2Pi/S

400900140019002400290034003900


tran

smitt

ance

H2Pi/S

HPi/S

Pi/S

silice

PiSM

Pi

990épaulement

3255

2305

1655

1447

680

1620

1620

1005

800

785

550

550épaulement

3440

3440

On observe un épaulement sur la bande principale de la silice vers 990 cm-1 (élongation

P=O), ainsi que vers 550 cm-1 (déformations P-O-P).

iv. DRX de Pi/S, HPi/S et H2Pi/S

25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

angle 2 θ (°)

inte

nsité

H2Pi/S

HPi/S

Pi/S

Pi

Ici également, aucune phase massique nouvelle n’est formée lors du dépôt.

12

III.4.3. Adsorption d’adénosine, AMP, ADP et ATP

i. Adénosine, AMP, ADP et ATP adsorbés sur alumine (adeno/A, AMP/A, ADP/A et ATP/A)

a. ATG de adeno/A, AMP/A, ADP/A, ATP/A

30 130 230 330 430 530 630 730

température (°C)

vite

sse

de p

erte

de

mas

se (%

mfin

ale/

min

)

adeno/A

AMP/A

ADP/A

ATP/A

alumine

475

380

370

380520

455

455

290

On observe des évènements thermiques assez clairement marqués et non attribuables au

support, caractéristiques de la présence des composés organiques. Ces pics sont assez bien définis pour pouvoir espérer mesurer la quantité de produit adsorbé.

On pourra remarquer que l’adénosine ne présente qu’un pic. Ainsi le pic vers 380°C et le renflement vers 290°C pourraient être attribués aux groupes phosphoryle. Cette température est nettement différente de celle des phosphates libres : 500°C.

b. UV-Visible-PIR de adeno/A, AMP/A, ADP/A, ATP/A

190 690 1190 1690 2190


abso

rban

ce

ATP

ADP

AMP

Adenosine

Adeno/A

AMP/A

ADP/A

ATP/A

alumine

213 247

244

283238

247216

210

260

L’observation la plus remarquable est l’apparition d’un signal constitué de deux bandes

assez étroites vers 210 et 260 nm sur tous les échantillons. Ce signal n’existe pas sur l’alumine de départ, et est présent sur tous les échantillons adsorbés (Adeno/A, AMP/A, ADP/A, ATP/A). L’adénosine elle-même absorbe bien dans cette région (suite à une transition π-π*,), mais la forme du signal est nettement différente. Il pourrait s’agir de la

13

signature d’une adénosine modifiée par l’adsorption sur l’alumine ; ainsi, un groupe Al-(OH2)

+ acide pourrait interagir avec le système d ‘électrons π de l’hétérocycle. Ceci est cohérent avec les pH finaux, inférieurs au PZC de l’alumine.

c. Spectres IR de adeno/A, AMP/A, ADP/A, ATP/A

10001200140016001800


tran

smitt

ance

ATP

ATP/A

ADP

ADP/A

AMP

AMP/A

Adeno

Adeno/A

alumine

1600

1575

1475

141713301295

1475 1417

16001575 1475

1417

1330 1295

1330

1295

1100

1100

1100

1245

1210

1205

1245

1205

1295

1665

1710

1695

1690

Des bandes non attribuables au support apparaissent pour ATP/A, AMP/A, et dans une moindre mesure ADP/A. On peut donc supposer qu’elles sont dues aux espèces organiques adsorbées. Elles sont beaucoup moins nettes pour l’échantillon Adeno/A. Les bandes situées à 1575, 1475, 1417 et 1330 cm-1 sont communes aux échantillons ATP/A, ADP/A et AMP/A.

Une étude de la dépendance du spectre en pH montre de forts décalages selon le degré

d’ionisation de l’adénosine, l’AMP, l’ADP ou l’ATP [8]. Ainsi, l’une des bandes les plus intenses de ces spectres, située à 1605-1710 cm-1, pourrait être corrélée avec la protonation de l’hétérocycle.

L’interprétation des spectres des molécules adsorbées doit être faite avec prudence, car l’allure du spectre des nucléotides dépend de leur état de protonation (cf. annexe).

D’après les pH finaux des solutions d’adsorption et les courbes de spéciation théoriques, on s’attend à trouver l’adénosine sous sa forme neutre, l’AMP sous forme d’ions AMP-

/AMP2-, l’ADP sous forme de ADP2-/ADP3- et l’ATP sous forme de ATP3-/ATP4-. Effectivement, le spectre de AMP/A ressemble davantage à celui des formes déprotonées

(AMP- ou AMP2-) qu’à celui de la forme neutre (voir par exemple l’absence d’une bande vers 1700 cm-1, ou la position des deux bandes à 1417 et 1475 cm-1).

En résumé, l’observation des bandes d’absorption en IR moyen des échantillons adsorbés peut apporter des informations intéressantes sur l’état des molécules adsorbées. Il est difficile toutefois de tirer des conclusions sur l’existence ou non de liaisons P-O-P par cette technique.

d. DRX de adeno/A, AMP/A, ADP/A, ATP/A

Les diffractogrammes ont permis de vérifier l’absence de dépôt massique : les composés n’ont pas précipité à côté du support, ils se sont adsorbés.

14

ii. Adénosine, AMP, ADP et ATP adsorbés sur silice (adeno/S, AMP/S, ADP/S et ATP/S)

a. ATG de adeno/S, AMP/S, ADP/S, ATP/S

3 0 2 3 0 4 3 0 6 3 0

te m p é ra tu re (°C )

vite

sse

de p

erte

de

mas

se (

%m

final

e/m

in)

A d e n o /S

A M P /S

A D P /S

A T P /S

s ilic e3 8 2

4 3 0

4 1 7

L’absence d’évènement thermique bien marqué pour AMP/S semble indiquer que les quantités d’AMP adsorbées sur silice sont faibles dans nos conditions. Par contre, adéno/S, ADP/S et ATP/S donnent des signaux. Cependant leur amplitude reste bien plus faible que pour les échantillons adsorbés sur alumine : l’adsorption est moins favorable sur silice.

b. Spectres IR de adeno/S, AMP/S, ADP/S, ATP/S

400600800100012001400160018002000


tran

smitt

ance

ATP

ATP/S

ADP

ADP/S

AMP

AMP/S

Adenosine

Adeno/S

Aucune nouvelle bande n’apparaît. Ceci est conforme à l’analyse par ATG : trop peu de nucléotides ont été adsorbés.

c. UV-Visible-PIR de adeno/S, AMP/S, ADP/S, ATP/S

190 690 1190 1690 2190


abso

rban

ce

ATP

ADP

AMP

Adenosine

Adeno/S

AMP/S

ADP/S

ATP/S

silice

210

260

216

247

238 283

244

247213

15

On observe ici aussi le double signal, avec des maxima vers 210 et 260 nm, suggérant fortement la présence de nucléosides/nucléotides adsorbés (intensités, cf. annexe). Le pic à 260 nm est toujours le plus intense.

On peut remarquer que l’absorbance des échantillons issus d’une adsorption sur alumine est supérieure à celle de ceux issus de l’adsorption sur silice.

On ne détecte pas de tendance claire d’évolution des intensités relatives avec le degré de phosphorylation.

III.4.4. Adsorptions de mélanges

i. adénosine ou ADP et phosphates sur alumine

a.ATG de adenoHPi/A, adenoH2Pi/A, ADPHPi/A, ADPH2Pi/A

30 130 230 330 430 530 630 730

température (°C)

vite

sse

de p

erte

de

mas

se (

%m

final

e/m

in)

ADPH2Pi/A

ADPHPi/A

AdenoH2Pi/A

AdenoHPi/A

Alumine

390

365 430

430515

430

450

510250

En première approximation, et par comparaison avec les DTG des échantillons

nucléotides/alumine et phosphates/alumine donnés plus haut, on peut comprendre ces traces comme les sommes de deux composantes : un signal large, éventuellement composite, entre 350 et 450°C attribuable aux nucléosides/nucléotides, et un pic vers 510°C (surtout marqué pour les mélanges impliquant H2Pi) qui pourrait correspondre aux phosphates adsorbés. Cela ne signifie pas nécessairement que les deux espèces du mélange restent indépendantes l’une de l’autre ; le profil de dégradation thermique de l’adénosine, notamment, semble nettement modifié.

b.Spectres IR de adenoHPi/A, adenoH2Pi/A, ADPHPi/A, ADPH2Pi/A

10001100120013001400150016001700


tran

smitt

ance

ADPHPi/A

ADPH2Pi/A

ADP

alumine

AdenoHPi/A

AdenoH2Pi/A

adenosine

1475

1417 13301575

1210

Les échantillons obtenus par adsorption d’adénosine et phosphate ne montrent aucune bande attribuable aux molécules organiques ; l’adsorption doit être très faible. Quant aux échantillons obtenus par adsorption des mélanges (ADP + phosphates) sur alumine, ils sont indiscernables par cette technique des simples ADP/alumine.

16

c. UV-Visible de adenoHPi/A, adenoH2Pi/A, ADPHPi/A, ADPH2Pi/A

190 690 1190 1690 2190


abso

rban

ce

ADPH2P/A

ADPHP/A

adenoH2P/A

adenoHP/A

alumine

Ici encore, l’apparition des doubles bandes à 210 et 260 nm suggère l’adsorption de

l’adénosine ou de l’ADP.

ii. adénosine ou ADP et phosphates sur la silice

a.ATG de adenoHPi/S, adenoH2Pi/S, ADPHPi/S et ADPH2Pi/S

30 230 430 630

température (°C)

vite

sse

de p

erte

de

mas

se

ADPH2Pi/S

ADPHPi/S

AdenoH2Pi/S

AdenoHPi/S

silice

385

385

425

405

On peut observer des évènements thermiques bien visibles pour les échantillons issus de l’adsorption d’adénosine. Ceux des échantillons obtenus par adsorption d’ADP sont moins flagrants ; ils sont néanmoins visibles.

17

b.UV-Visible de adenoHPi/S, adenoH2Pi/S, ADPHPi/S, ADPH2Pi/S

190 690 1190 1690 2190


abso

rban

ce

ADPH2P/S

ADPHP/S

AdenoH2P/S

AdenoHP/S

silice

Dans le cas des mélanges d’adsorption contenant de l’adénosine (cf. annexe), les

amplitudes des pics sont plus faibles que pour l’adénosine seule : il est possible que moins de produit ait été adsorbé. En même temps, l’intensité relative du pic principal par rapport au second a encore augmenté.

Comme pour les échantillons adsorbés en l’absence de phosphate, ce sont ceux issus d’adsorption sur alumine qui présentent la plus forte intensité et l’intensité relative du pic principal est plus élevée pour les échantillons /S.

Dans le cas des adsorptions d’ADP + phosphates également, les amplitudes des pics sont plus faibles, et l’intensité du pic principal est, relativement au second, plus grande que sans phosphates (cf. annexe).

La plus faible amplitude des signaux suggère une plus petite quantité d’adénosine ou d’ADP adsorbée. Ceci était assez prévisible puisque le même volume d’adsorption contient deux fois plus de molécules pour autant de silice. Il est donc possible que moins de sites aient été disponibles pour l’adénosine ou l’ADP suite à l’adsorption des phosphates sur le support (d’après les parties III.3.1 et III.3.2., on sait que les phosphates peuvent s’adsorber sur les deux supports).

c. IR de adenoHPi/S, adenoH2Pi/S, ADPHPi/S, ADPH2Pi/S

40060080010001200140016001800


tran

smitt

ance

ADPHP/S

ADPH2P/S

ADP

silice

AdenoHP/S

AdenoH2P/S

adenosine

On n’observe aucune bande caractéristique : ceci est cohérent avec la plus faible quantité de produits adsorbés sur la silice, et avec les résultats obtenus pour l’adsorption d’adénosine ou d’ADP sur silice.

18

III.5. Analyse des solutions d’adsorption

III.5.1. UV-Visible-PIR en transmission Les spectres de solutions de concentration 0.001 M d’adénosine, d’AMP, d’ADP et

d’ATP ont été enregistrés.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

190 210 230 250 270 290 310


abso

rban

ce

adenosine

ATP

AMP

ADP

Un maximum d’adsorption commun aux quatre espèces se situe vers 254 nm. Cette

absorption est sans doute due au noyau aromatique (cf. supra) et ne permet pas de différencier les nucléosides/nucléotides. On pourrait envisager de doser la quantité de nucléotides en solution par photométrie dans l’UV ; malheureusement, nos essais indiquent qu’il est difficile d’obtenir des résultats quantitatifs reproductibles.

III.5.2. HPLC

i. produits de référence Le signal est enregistré sur la gamme 190-300 nm, zone dans laquelle nos composés

absorbent. Les chromatogrammes de référence sont réalisés avec des solutions de concentration 4.

10-4 M pour éviter de saturer la colonne. Le débit est réglé à 0.8 mL/minute et l’éluant se compose de 97% d’eau et 3% d’acétonitrile. Ces données ont été optimisées par plusieurs essais. Le pic de l’adénosine est ainsi très bien séparé des autres. Par contre, l’AMP, l’ADP et surtout l’ATP sortent en même temps que l’artéfact lié à l’eau injectée. Une mesure quantitative exigerait donc une optimisation encore plus grande du débit et de l’éluant, d’une part pour une meilleure séparation de ces trois derniers composés et d’autre part pour que la colonne les retienne plus longtemps.

Cependant, ces résultats préliminaires montrent qu’une analyse quantitative de mélanges adénosine/AMP/ADP doit être possible avec le système utilisé. Par contre, pour l’instant, la séparation ADP/ATP est trop faible pour discriminer ces deux produits.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

0 100 200 300 400 500 600

temps (s)

inte

nsité

ATP

ADP

AMP

Adenosine

116.4121.8

178.2

489.0

176.4

115.2120.0

163.2174.6

19

Echantillon temps (s) intensité (mAU) intégration (%) Adénosine 489.0 145 99,1

AMP 176.4 476 98.8 ADP 116.4 217 17.2

121.8 204 61.8 178.2 86.0 21.0

ATP 115.2 111 21.8 120.0 96.6 47.8 163.2 31.4 6.1 174.6 27.5 24.1

Les solutions de référence ont subi un vieillissement de 5 jours ; on peut voir que l’ADP

s’est déjà partiellement décomposé en AMP (tR=178 s) plus des phosphates. Malheureusement, nous n’avons pas eu le temps de passer les phosphates pour déterminer leur temps de rétention, mais dans ce chromatogramme le premier pic fin à tR=116 s semble être dû à l’ADP et le deuxième (tR=122 s) aux phosphates, tandis que le dernier (tR=178 s) est attribué à l’AMP.

De la même façon, la solution d’ATP utilisée doit avoir été largement hydrolysée (jusqu’à l’AMP).

ii. surnageant de quelques expériences d’adsorption

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 100 200 300 400 500 600

temps (s)

inte

nsité

Adeno+HPi/A

Adeno+HPi/S

ADP+HPi/A

ADP+HPi/S465.6

470.4

116.4121.8

175.9

221.4

117.0

123.0

177.0

Echantillon temps (s) intensité (mAU) intégration (%) Adéno+HPi/A 465.6 146 99.0 Adéno+HPi/S 470.4 154 99.1 ADP+HPi/A 117.0 83 8.1

123.0 103 59.9 177.0 84.9 32.0

ADP+HPi/S 116.4 192 13.6 121.8 202 61.6 175.9 90.8 21.8 221.4 5.33 0.6

L’intensité des doubles pics est inversée, ce qui nous pousse à supposer que le deuxième

pic serait du phosphate. Cependant, le mélange adénosine+HPi, qu’il ait été en contact avec la silice ou l’alumine, ne présente aucun pic autre que celui attribuable à l’adénosine. Le phosphate n’est peut-être pas détecté et les deux premiers pics seraient dus à des degrés d’ionisation différents. Ce dernier signal est toutefois retardé de 10 à 15 secondes pour des conditions identiques. Peut-être est-ce un effet des phosphates ?

20

IV. Conclusion L’objectif de ce stage était d’étudier la possibilité de former des liaisons anhydride

phosphorique « P-O-P » par adsorption des précurseurs sur silice ou alumine. Ceci nécessitait d’étudier en premier lieu le potentiel des différentes techniques à notre disposition pour l’identification et la quantification des espèces adsorbées.

Si plusieurs techniques mettent en évidence la présence de molécules adsorbées, elles n’ont pas toutes le même intérêt. En UV-Visible (transmission), les nucléosides et nucléotides adsorbés présentent une bande d’adsorption caractéristique et très sensible, mais qui ne permet pas de discriminer les différentes formes. En IR moyen, de nombreuses bandes attribuables aux molécules adsorbées sont identifiables, mais leur utilisation pour discriminer les espèces selon leur degré de phosphorylation est sujette à caution : elles sont plutôt sensibles au degré de protonation. Quant à l’analyse thermogravimétrique sous atmosphère oxydante, des évènements thermiques clairement attribuables à la décomposition des espèces adsorbées pourront être utilisées pour quantifier assez précisément l’adsorption. Toutefois, la seule technique qui puisse permettre une discrimination entre les formes de nucléotides présentant différents degrés de phosphorylation reste l’HPLC : bien que nos essais initiaux n’aient pas encore permis de distinguer clairement ADP et ATP, une optimisation des conditions d’analyse permettrait sans doute d’arriver à ce résultat.

Nous avons d’abord étudié séparément l’adsorption des monophosphates et celle des nucléosides/tides. Dans les deux cas, l’alumine semble adsorber des quantités nettement plus élevées que la silice (à l’opposée de ce qui avait été observé pour les acides aminés simples), ce qui en fait un candidat privilégié pour la suite des études.

L’observation des pH des solutions d’adsorption suppose un mécanisme d’adsorption plus complexe qu’une seule adsorption électrostatique qui devra être étudié en profondeur.

Nous avons ensuite testé des solutions de « mélanges », comprenant un précurseur de l’ATP et une forme de phosphate. Les mélanges adénosine + phosphate ou ADP + phosphate montrent lors des analyses la présence de composé adsorbés, que nous n’avons pas encore pu identifier formellement. Conformément à nos conclusions sur le potentiel des diverses techniques, cette identification ne peut se faire avec certitude qu’en phase liquide, c’est-à-dire après désorption : l’étape suivante consistera donc en la mise au point d’une procédure de désorption quantitative et non destructive.

Enfin, l’étude préliminaire des effets de la carbonatation de l’alumine pourra être utile à d’autres recherches menées au laboratoire.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES [1] G. Wächtershäuser, « before enzymes and templates : theory of surface metabolism », Microbiol. Rev., 52, 452-484, 1988. [2] Yukio Yamagata, « Prebiotic formation of ADP and ATP from AMP, calcium phosphates et cyanate in aqueous solution », Origins of Life and Evolution of the Biosphere, 29, p. 511-520, 1999. [3] Simakov Michael B., Kuzicheva Eugenia A., « Chemical evolution on the surface of the small bodies in the solar system and origin of life », Proceedings of Asteroids, Comets, Meteors, p.783-786, 2002. [4] Ana Claudia Tessis, Adalberto Vieyra, « Divalent Cations Modify Adsorption of 5’-AMP onto Precipitated Calcium Phosphate : A Model for Cation Modulation od Adsoptive Proceses in Primitive Aqueous Environments », Journal of Molecular Evolution, 43, p.425-430, 1996. [5] Judith Rishpon, Patrick J. O’Hara, Noam Lahav et James G. Lawless, « Intercation Between ATP, Metal Ions, Glycine, and Several Minerals », Journal of Molecular Evolution, 18, p. 179-184, 1982. [6] K. Hamdani et K.L. Cheng, « Adsorption of biochemically significant phosphates on silica, Colloids and Surfaces », 63, p. 29-31, 1992. [7] Vichard Christophe, Kaden Thomas A., « Phosphate diester hydrolysis in biological compounds by dinuclear metal complexes », Inorganica Chimica Acta, Vol. 357, Issue 8, p. 2285-2293, 2004. [8] Kenichi Nakanishi, Atsushi Hashimoto, Tao Pan, Mikihito Kanou and Takaharu Kameoka, « Mid-infrared Spectroscopic Measurement of Ionic Dissociative Materials in the Metabolic Pathway », Applied Spectroscopy, Vol.57, Number 12, 2003. [9] Heidar-Ali Tajmir-Riahi, « A comparative study of adenylic, guanylic and deoxyguanylic acids and their sodium salts as solid and in solution : structural information and conformational features », Biochimica et Biophysica Acta, 1009, p.168-176, 1989. [10] Caminiti Ruggero, Oratggi Giancarlo, Mazzei Raffaele Antonio, Ballirano Paolo, Rizzi Rita, « Powder X-ray data for adenosine C10H13N5O4 », Powder Diffraction, Vol. 15, No.2, p.112-115, June 2000.

ANNEXE

1. Molécules impliquées

a. Phosphates inorganiques:

“Pi”: orthophosphate P-P” : pyrophosphate

P

-O O-O-

O

P

O O-O-

O

P

-O-O

O

Les polyphosphates contiennent une ou des liaison(s) anhydride phosphorique (P-O-P).

b. Nucléotides:

Ils sont obtenus par phosphorylation des nucléosides (formation d’une liaison ester phosphate C-O-P). Le nucléoside étudié est l’adénosine noté Adéno :

N

NN

N

NH2

O

HOH

HH

HH

HO

Ses nucléotides sont nommés :

N

NN

N

NH2

O

HOH

HH

HH

OPHO

OH

O

AMP, pour adénosine monophosphate

N

NN

N

NH2

O

HOH

HH

HH

O

P

O

-O

OPHO

O-

O

Na+

Na+

ADP, adénosine diphosphate (sel disodique)

N

NN

N

NH2

O

HOH

HH

HH

O

P

O

-O

OPO

O-

OP

HO

-O

O

Na+

Na+

Na+

ATP, adénosine triphosphate (sel trisodique)

Par abus de notation, on nomme la molécule et ses formes ioniques ATP. Lorsqu’une précision est nécessaire, on note la charge. Pour celle-ci par exemple, on noterait ATP3-.

2. Données thermodynamiques

Adéno + Pi → AMP +H2O ∆rG° = +9,6 kJ/mol AMP + Pi → ADP +H2O ∆rG° = +36 kJ/mol ADP + Pi → ATP +H2O ∆rG° = +34,5 kJ/mol Et aussi:

AMP + P-P → ATP +H2O ∆rG° = +37,4 kJ/mol

3. Propriétés acido-basiques L’orthophosphate possède trois formes acido-basiques notés Pi, HPi, H2Pi et H3Pi.

P

-O O-O-

O H

P

-O O-OH

O

P

HO O-OH

O

P

HO OHOH

OH H

Pi HPi H2Pi H3Pi

H3PO4/H2PO4

- pKa 2.1 H2PO4

-/HPO42-

pKa 7.2 HPO4

2-/PO43-

pKa 12

0.00E+00

2.00E-03

4.00E-03

6.00E-03

8.00E-03

1.00E-02

1.20E-02

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

pH

conc

entr

atio

n

PO4 - - -

HPO4 - -

H2PO4 -

H3PO4

Graphe de spéciation pour une solution initiale 0.01M de Na3PO4

L’adénosine peut se protoner sur l’hétérocycle et l’activité acido-basique des nucléotides est due aux groupements phosphates. espèce pK1 pK2 pK3 pK4 pK5 Adénosine 3.4 12.4 AMP 2.5 3.8 6.21 ADP 2.6 4.0 6.4 ATP 4.1 6.5

Tableau des pKa donnés dans l’article de Kenichi Nakanishi et al. [8].

4. Spectres UV-Visible-PIR de référence

190 690 1190 1690 2190


abso

rban

ce

ATP

ADP

AMP

Adenosine

216

247

238

283

244

247213

5. Spectres IR de référence

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

5007009001100130015001700


tran

smitt

ance

phosphate

ATP

ADP

AMP

Adenosine

Le spectre de l’AMP sous sa forme acide semble être en accord avec celui de Heidar-Ali

Tajmmir-Riahi [9]. On peut noter qu’il y a assez peu de différence entre les différentes molécules, ce qui est

logique puisque la majeure partie du squelette est commune. 6. Diffractogrammes de référence de l’adénosine, de l’AMP, de l’ADP et

de l’ATP

a. Adénosine

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

10 20 30 40 50 60 70

angle 2 θ (°)

inte

nsité

(co

unts

)

Adenosine

Ce diffractogramme permet de vérifier la pureté du produit : les pics de diffraction sont en accord avec ceux donnés dans l’article de Caminiti et al. [10].

b. AMP

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

10 20 30 40 50 60 70

angle 2 θ (°)

inte

nsité

(co

unts

)

AMP

c. ADP

0

50

100

150

200

250

10 20 30 40 50 60 70

angle 2 θ (°)

inte

nsité

(co

unts

)

ADP

On pourra remarquer que, contrairement à l’adénosine et l’AMP, l’ADP est essentiellement amorphe à l’état solide.

d. ATP

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

10 20 30 40 50 60 70

angle 2θ (°)

inte

nsité

(cou

nts)

ATP

7. Résultats des spectres UV-Visible-PIR en réflexion diffuse

a. adénosine, AMP, ADP, ATP Intensités des bandes UV en réflexion diffuse des échantillons obtenus par adsorption sur

silice ou alumine d’un nucléoside/nucléotide : λ (nm) Adeno/A AMP/A ADP/A ATP/A 260 1,22 1,57 1,54 1,56 212 1,02 1,33 1,31 1,28 rapport 1,20 1.18 1.18 1.22 λ (nm) Adeno/S AMP/S ADP/S ATP/S 260 1,22 0,94 1,02 0,97 212 0,87 0,64 0,72 0,63 rapport 1,40 1.47 1.42 1.53

b. mélanges Voici les intensités des bandes UV en réflexion diffuse des échantillons obtenus par

adsorption sur silice ou alumine de mélanges : λ (nm) AdenoHPi/A AdenoHPi/S AdenoH2Pi/A AdenoH2Pi/S 261 1.14 1.14 1.31 1.21 212 0.88 0.78 1.02 0.84 rapport 1.30 1.46 1.28 1.44 λ (nm) ADPHPi/A ADPHPi/S ADPH2Pi/A ADPH2Pi/S 261 1.47 1.04 1.49 0.99 212 1.21 0.69 1.20 0.62 rapport 1.21 1.51 1.24 1.60

a l'interface oxyde/solution aqueuse

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