5. Bölüm

Sütteki Enzimler

Doç. Dr. Ebru ŞENEL

Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Süt Teknolojisi Bölümü

Enzim Canlı hücreler tarafından sentezlenen organik ve

katalitik bileşiklerdir. “Biyokatalizör” olarak

adlandırılmaktadır. Diğer katalizörlerden kolloidal

protein yapılarından dolayı duyarlılıkları ile

ayrılmaktadır. Bu nedenle şöyle tanımlanabilir;

Enzim; organizma tarafından protein yapısında

üretilen ve çok düşük miktarları bile, gerek hücre

içinde ve gerekse hücre dışındaki biyokimyasal

reaksiyonları gerçekleştiren spesifik organik

maddelerdir.

Enzimlerin Sınıflandırılması Hidrolazlar

Oksi-redüktazlar

Transferazlar

Liyazlar

İzomerazlar

Ligazlar

Hidrolazlar Bu grup süt endüstrisi açısından önemli enzimlerdir.

Bu enzimler substrata su vererek hidrolitik bölünmeyi

katalizlemektedir.

Hidrolazlar grubunda;

-ester bağlarına etki yapan ve dolayısıyla oluşumunu

ve parçalanma olayını katalizleyen “esterazlar”

(lipazlar, fosfatazlar, ve sülfatazlar),

-proteinlere etki ederek peptit bağlarının çözünmesini

sağlayan “proteazlar”

- Glukozid bağlara etki eden “karbohidralazlar”

(heksosidazlar, poliazlar) yer almaktadır.

Oksi-redüktazlar

Bu grup, bir maddeden diğer maddeye elektron ve

hidrojen iyonlarını taşıyarak biyolojik oksidasyonu

katalizleyen enzimlerdir.

Oksidasyon ve redüksiyon substratın parçalanma

işlemi ile bağlantılıdır.

Bu ana gruba süt enzimlerinden peroksidaz, katalaz,

ve ksantioksidaz enzimleri girmektedir.

Transferazlar

Grup transferlerini gerçekleştiren molekülün bazı gruplarını

diğer bir substrata taşıyan enzimlere transferaz veya

transfer enzimleri denilmektedir. Bunlarda taşıdıkları

gruplara göre;

Fosfor grubu taşıyan transfosforilazlar

Dezaminleşme ve aminleşmeyi yapan transaminazlar

Metil grubu taşıyan transmetilazlar

Açil grubunu akseptöre taşıyan transaçilazlar

Liyazlar

Çift bağlara grup ekleyen veya bunlardan grup ayıran enzimlerdir. İki bileşiği yeni bir madde verecek şekilde bağlar veya bölerler.

Alkol fermentasyonunda ;

prüvik asidi asetaldehit + CO2 (karboksilazlar)

Aminoasitlerin aminler (dekarboksilazlar)

Hekzodifosfat 2 (triyofosfat) (aldolazlar)

İzomerazlar Molekül içi değişmeleri katalizlerler. Örneğin;

Heksofosfataz,

Glukoz -6-fosfat fruktoz-6-fosfat

katalize eder.

Ligazlar ATP’ nin veya diğer fosfatların prifosfat bağlarını

parçalayıp iki molekül arasında yeni bağların oluşumunu kataliz eden enzimlerdir.

Örneğin; pirüvat karboksilaz, asetil ko-A sentetaz gibi.

Süt teknolojisi açısından önem taşıyan enzimler oksiredüktazlar ve hidrolazlar sınıfında yer almaktadır. Diğer grupta yer alan enzimler süt bileşiminde bulunan maddelerin biyosentezinde veya mikroorganizmaların yer aldığı metabolizmalarda katalitik görev yaparlar.

Enzimlerin yapısı Enzimler protein yapısındadırlar. Bu kısmına apoenzim

denir. Fakat aktif hale gelebilmeleri için protein unsurlarının yanı sıra, bunlarla bağ yapabilecek yardımcı maddelere gereksinim duymaktadır.

Protein yapısında olmayan bu maddelere koenzim veya prostetik grup olarak isimlendirilmektedir.

Apoenzim + koenzim Holoenzim (aktif enzim)

Apoenzim; hücre tarafından yapılan çok karışık protein yapısında ve sıcağa duyarlı bir maddedir. Aktif olmayan polipeptid zincirlerine sahiptir.

Bu kısım enzimin hangi maddeye yani hangi substrata etki edeceğini tayin etmektedir.

Koenzim; basit yapıda olup, küçük moleküllü ve inaktif bir kısımdır. Apoenzimi aktif yapar ve enzimin substrat üzerine nasıl etki edeceğini gösterir. Sıcağa ve dış etkilere karşı dayanıklı olup organik ve inorganik yapıda olabilmektedir. Mineraller ve vitaminler koenzim olarak görev yaparlar.

Enzim aktivitesini etkileyen faktörler

Sıcaklık

pH değeri

İyon bileşimi

Diğer faktörler

Sıcaklık; sıcaklık artışı enzimatik reaksiyonları hızlandırmaktadır. Belirli sıcaklık dereceleri arasında etkilemektedir. Çok yüksek sıcaklıklarda protein yapısında olduklarından katalitik aktiviteleri kaybolmaktadır.

Hayvansal enzimler 37 °C

Bitkisel enzimler 20- 25 °C

Bakteriyel enzimler 20-37 °C

pH değeri; enzimler kolloidal protein yapısında olduklarından pH değişimlerinden etkilenmektedir. optimum pH değerleri enzimlerin karakterize etmektedir. Optimum pH değerlerinin altında veya üstünde enzimatik reaksiyonların hızları düşmektedir.

İyon bileşimi; ortamdaki iz elementlerde anyonlar ve katyonlar aktivatör olarak önem taşımaktadır. Bunların varlığı reaksiyonların gerçekleşip gerçekleşmemesini belirler. Örneğin; rennin enzimi ile peynir pıhtısının oluşumunda enzimatik fazın ikinci aşaması Ca++ iyonlarının varlığı ile oluşmaktadır.

Diğer faktörler;

Enzim konsantrasyonu, redoks potansiyeli ve substrat konsantrasyonu gibi faktörlerde enzim aktivitesine etki etmektedir.

Örneğin; alkol fermantasyonu sonucu oluşan alkol miktarı belirli bir miktarın üzerine çıktığında mikroorganizmaların otolizine yol açar.

Belirli bir dereceden sonra sıcaklık, soğukluk, rutubet eksikliği, ışık gibi etmenler kısmen veya tamamen enzim aktivitesini önlemektedir.

Sütte Bulunan Enzimler İnek sütü çok sayıda doğal enzim (tanımlanmış

yaklaşık 70 enzim) içermektedir ve toplam süt proteinlerinin küçük bir fraksiyonu olmasına rağmen enzimlerin süt teknolojisinde önemli rolleri vardır

En küçük molekül büyüklüğüne sahip enzimde 100 civarında aminoasit bulunmaktadır

Sütte bulunan enzimler 2 kaynaktan ileri gelir;

Sütün “doğal enzimleri”, meme dokusu hücrelerinden, kan plazması ile lökositlerden ve salgı hücre stoplazmasından süte geçmektedir

Süte kontamine olan mikroorganizmalar tarafından sentezlen grup ise “mikrobiyel kaynaklı enzimler” olarak nitelendirilmektedir.

Her iki grupta yer alan enzimler süt ve ürünlerinde meydana gelen biyokimyasal reaksiyonlarda katalizör olarak rol almakta ve sütün yapısında, tat ve aromasında olumlu veya olumsuz bazı değişiklere neden olmaktadır

Bazı doğal süt enzimleri,

süt ve süt ürünlerine uygulanan ısıl işlemin derecesini ve etkinliğini belirlemek için indikatör olarak kullanılmaktadır.

Bazı enzimler ise mastitis gibi meme hastalıklarının belirlenmesinde kullanılmaktadır.

Yeni doğan canlının bağışıklık sisteminin ve bağırsak florasının geliştirilmesi gibi bazı fonksiyonları içermektedir

Çizelge .Sütte bulunan bazı önemli enzimler ve fonksiyonları

Enzim Fonksiyonu/kullanım alanı/etkisi

Proteaz

Lipaz

Alkali fostafaz

–gulutamiltranspeptidaz

Sülfidril oksidaz

Süperoksit dismutaz

Ksantin oksidaz

Laktoperoksidaz

Laktoz sentetaz

N-acetil- β-D-glukozaminidaz

UHT sütün jelleşmesi

Hidrolik ransidite

Pastörizasyon testi

Meme bezlerine aminoasit

konsantrasyonunun artırılmasında

Yanmış/pişmiş tadın uzaklaştırılmasında

Oksidasyonun engellenmesinde

Oksidasyon katalizinde

Bakteri inhibisyonunda

Meme bezlerinde laktoz biyosentezinde

Mastitisin belirlenmesinde

Enzimlerin süt ve ürünlerinde teknolojik olarak sağladığı yararlar ve kullanım alanları şöyle özetlenebilir;

Süte koruyucu amaçla katılan maddelerin ve peroksit varlığının belirlenmesinde,

Pastörizasyon kontrolünde ve ısıl işlemin derecesinin tespitinde,

Meme hastalıkları başta olmak üzere patolojik ve fizyolojik rahatsızlıkların teşhisinde,

Koyulaştırılmış süt, dondurma ve bazı peynirlerde görülen kristalleşme kusurlarının önlenmesinde,

Süt ve süt ürünlerinin tat-aroma niteliğinin geliştirilmesinde,

Krema ve peynirin olgunlaştırılmasında,

Peynir üretiminde sütün pıhtılaştırılmasında

Alkali fosfataz ve Asit fosfataz Fosfataz, fosforik asidin monoesterlerini hidrolize eden

bir fosfomonoesteraz’dır. Sütte farklı pH’larda optimum aktivite gösteren iki farklı fosfataz enzimi bulunmaktadır. Bu enzimler

asit fosfataz (EC 3.1.3.2)

alkali fosfataz (EC 3.1.3.1)

olarak adlandırılmaktadır.

Asit fosfataz, termostabil bir enzimdir ve pastörizasyon sıcaklıkları ile 88 ºC/ 30 dk ısıl işlem koşullarında aktivitesini koruyabilmektedir. Bu enzimin tamamen inaktif olabilmesi için 100 ºC /1 dk ısıl işlem uygulaması gerektiği belirtilmektedir. Asit fosfataz enzimi belirli koşullarda UHT sterilizasyonunda bile aktif kalabilmektedir. Ancak, bu enzimin ısı stabilitesi pH’ya bağlıdır ve düşük pH değerlerinde ısı stabilitesi daha yüksektir

Alkali fosfataz, teknolojik açıdan asit fosfataza göre daha fazla önem taşımaktadır. Bu enzim alkali pH’da çalışan bir hidrolazdır ve asit fosfataz gibi hem serum fazında serbest formda hem de ksantinoksidaz ile birlikte yağ globül membranına absorblanmış mikrozomlarda bulunmaktadır. pH 9.0-10.5 arasında optimum aktivite gösterirken, pH 5.0’de aktivitesi azalmakta ve 63 °C / 30 dk, 70 °C / 90 s, 72 °C / 15 s, 80 °C / 0.45 s ısıl işlem normlarında inaktif duruma geçmektedir. Alkali fosfataz ısıya oldukça duyarlıdır ve sütün pastörizasyon kontrolünde indikatör enzim olarak kullanılmaktadır

Laktoperoksidaz Sütte doğal olarak bulunan laktoperoksidaz ilk

tanımlanan enzimler arasında yer almaktadır. Hidrojen peroksit gibi peroksitleri parçalayarak açığa çıkan oksijen atomunu okside olabilen maddelere taşımaktadır.

Bu enzimin optimum çalışma pH’sı 6.8’dir

Isıl işleme karşı oldukça stabil olup pastörizasyon normlarının üzerinde inaktif hale geçmektedir. Klasik pastörizasyon sıcaklıklarında laktoperoksidaz enzimi önemli ölçüde aktivitesini koruyabildiğinden pastörize sütlerin raf ömrünün uzatılmasında da etkili olabilmektedir

Peroksidaz enzimi sıcaklık zaman kombinasyonlarına bağlı olarak, 72 °C / 30 dk, 75 °C / 2.5 dk, 80 °C / 5 s -3.5 dk, 85 °C / 0.13 s ısı uygulamalarında inaktif olmaktadır.

Bu enzimin reaktive olmadan tamamen inaktivasyonu için 85 °C / 10 s ısıl işlem uygulanması gerektiği bildirilmiştir

Ksantinoksidaz

Ksantioksidaz (XO), sütte serum fazında çözünür formda ve yağ globül membran ile ilişkili halde bulunmaktadır. Büyük oranda yağ globül membranında lipoproteinlere absorlanmış mikrozomlarda alkali fosfataz ile birlikte yer almaktadır .

Ksantinoksidaz; aldehitler, ksantin, hipoksantin, NADH gibi bileşenlerin oksidasyonunu katalize eden spesifik olmayan bir enzimdir

Optimum aktivite pH’sı 6-9 arasındadır

Ksantinoksidaz, pastörizasyon sıcaklığında (75 °C / 15s) aktif iken 70 °C / 4 dk ısıl işlem sonunda inaktif olmaktadır (Metin, 1996). Ancak, bu enzimin tamamen inaktivasyonu için 77 °C / 15 dk ısıl işlem uygulanması gerektiği bildirilmektedir (Kitchen, 1985). Bazı araştırmacılar 80 °C / 15 s ısıl işlem ile ksantioksidazın aktivitesinin %70’ni kaybettiği ifade ederken (Farkye ve Imadifon, 1995) Sharma ve ark. (2009), 85-90 °C’de ısı uygulaması ile ksantinoksidazın tamamen inaktif hale geçtiğini bildirmektedir.

Katalaz Katalaz enzimi hidrojen peroksidi su ve oksijene katalize

edebilme yeteneğine sahip doğal bir süt enzimidir. Somatik hücre sayısı yüksek ve mastitisli sütlerde katalaz aktivitesi artmakta ve dolayısıyla sütte istenmeyen kalitenin bir göstergesi olarak kullanılmaktadır

Bu enzimin optimum çalışma sıcaklığı 38 °C, pH’sı ise 7 civarındadır

Katalaz enziminin ısı stabilitesi yüksektir. Tampon ortamda 70 °C’de 30 dakikalık ısıl işlem sonucunda katalaz aktivitesinin tamamen, 72 °C’de 15 s ısıl işlem sonunda ise %60 oranında kaybolduğu belirlenmiştir

Katalaz enzimi pastörizasyon yeterliliğinin test indikatörlerinden birisi olarak kabul edilmektedir. Son zamanlarda, sütte aktif katalaz enziminin varlığı, termizasyon uygulanmış sütten üretilen peynirler için bir indikatör olarak değerlendirilmektedir.

Proteinazlar Proteinazlar, proteinler üzerine etki eden bir enzim

grubudur. Bazı proteazlar mikrobiyel kaynaklı iken, bazıları kandan süte geçmektedir.

İnek sütünde plazmin, plazminojen, plazminojen aktivatörleri, trombin, katepsin D, asidik süt proteazları ve aminopeptidazları içeren çok sayıda proteaz bulunmaktadır

Proteinazların neden olduğu biyokimyasal değişimler bazı süt ürünlerinin kalite özellikleri üzerine olumlu veya olumsuz etkisi olmaktadır. Örneğin; peynir olgunlaşması sırasında aminoasit birikimi karakteristik tat-aromanın belirginleşmesinde etkili iken, belirli düzeyin üzerinde aminoasit birikimi tat/aroma kusurlarına yol açabilmektedir.

UHT sütlerde ise, depolama süresince karşılaşılan jelasyon proteinazların varlığı ile ilişkilendirilmektedir.

Plazmin, sütün temel proteolitik enzimidir ve yaklaşık pH 7.5’da ve 37°C’de optimum aktivite gösterdiği için genellikle süt alkali proteinazı olarak adlandırılmaktadır .

Plazmin, sütte hem aktif enzim formunda hem de inaktif zimojen ve plazminojen formunda bulunmaktadır ve aktif enzim ile inaktif enzim arasındaki oran 1:5’dir .

Plazminin spesifik aktivitesi plazmin inhibitörleri ve plazminojen aktivatörlerine bağlıdır ve bu enzim ısıya karşı oldukça stabildir. 72 °C’ de 15 saniye süre ile gerçekleştirilen pastörizasyon sonucunda plazmin aktivitesinin sadece %10-17’si azalmaktadır

Plazmin, hem β-CN hem de αs2-CN etki etmektedir. -CN, plazmin ile degradasyona karşı biraz daha dirençlidir. Kazeinin degragasyon ürünleri tat bozukluğu ve acı tadın oluşumuna neden olmaktadır.

Plazmin aktivitesi peynir üretiminde rennet ile koagülasyon süresi, pıhtı sıkılığı ve sinerez gibi özellikleri de etkilemektedir.

Asit proteazların

optimum aktivite gösterdiği pH değeri 4’dür.

Asit proteazlar, alkali proteazlara oranla ısıya karşı daha duyarlıdır. Bu enzim, 60 °C/10 dk ısıl işlemden sonra aktivitesinin %70’ini, 78 °C/10 dk ısıl işlem sonrasında ise aktivitesinin %1’ini koruyabilmektedir.

Asit proteazlar, β- ve -CN’ye oranla α-CN’yi daha fazla hidrolize edebilmektedir ve peynir olgunlaşmasında önemli rol oynamaktadır.

Lipoprotein Lipaz

Lipoprotein lipaz (LPL) sütte trigliseridlerin hidrolizasyonundan (lipoliz) sorumlu doğal bir enzimdir .

LPL, süt türüne göre değişkenlik göstermekle birlikte büyük oranda kazein miselleri ile ilişkili olarak plazmada ve yağ globül membranında yer almaktadır .

Yağ globül membranı herhangi bir fiziksel nedenle hasar görmediği sürece LPL trigliseridler üzerinde etki göstermemektedir

LPL aktivitesi sonucu trigliseridlerden optimum koşullar altında her dakikada 2 μmol serbest yağ asidi oluşmaktadır.

LPL, ısıya oldukça duyarlı bir enzimdir ve pastörizasyon sıcaklığında aktivitesinin büyük kısmını (~%97), 72°C’ de 11.8 s veya 75 °C’de 15 s’de ise aktivitesinin tamamını kaybetmektedir