2_bacteriophage p1 cloning system

7/27/2019 2_Bacteriophage P1 Cloning System

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P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USAV o l . 8 7 , p p . 1 0 3 - 1 0 7 , J a n u a r y 1 9 9 0B i o c h e m i s t r y

B a c t e r i o p h a g e P 1 c l o n i n g s y s t e m f o r t h e i s o l a t i o n , a m p l i f i c a t i o n ,a n d r e c o v e r y o f DNA f r a g m e n t s a s l a r g e a s 1 0 0 k i l o b a s e p a i r s(DNA p a c k a g i n g / p a c c l e a v a g e / g e n o m e m a p p i n g / g e n e i s o l a t i o n )

NAT S T E R N B E R GE . 1 . d u P o n t d e N e m o u r s & C o . , E x p e r i m e n t a l S t a t i o n , C e n t r a l R e s e a r c h & D e v e l o p m e n t D e p a r t m e n t , W i l m i n g t o n , D E 1 9 8 8 0 - 0 3 2 8C o m m u n i c a t e d b y S y d n e y B r e n n e r , S e p t e m b e r 1 8 , 1 9 8 9 ( r e c e i v e d f o r r e v i e w J u n e 3 0 , 1 9 8 9 )ABSTRACT T h e d e v e l o p m e n t o f a b a c t e r i o p h a g e P 1 c l o n -i n g s y s t e m c a p a b l e o f a c c e p t i n g D N A f r a g m e n t s a s l a r g e a s 1 0 0k i l o b a s e p a i r s ( k b p ) i s d e s c r i b e d . T h e v e c t o r s u s e d i n t h i ss y s t e m c o n t a i n a P 1 p a c k a g i n g s i t e ( p a c ) t o p a c k a g e v e c t o r a n dc l o n e d D N A i n t o p h a g e p a r t i c l e s , t w o P 1 l o x P r e c o m b i n a t i o ns i t e s t o c y c l i z e t h e p a c k a g e d D N A o n c e i t h a s b e e n i n j e c t e d i n t oa s t r a i n o f E s c h e r i c h i a c o l i c o n t a i n i n g t h e P 1 C r e r e c o m b i n a s e ,a k a n ' g e n e t o s e l e c t b a c t e r i a l c l o n e s c o n t a i n i n g t h e c y c l i z e dDNA, a P 1 p l a s m i d r e p l i c o n t o s t a b l y m a i n t a i n t h a t D N A i n E .

c o l i a t o n e c o p y p e r c e l l c h r o m o s o m e , a n d a l a c p r o m o t e r -r e g u l a t e d P 1 l y t i c r e p l i c o n t o a m p l i f y t h e D N A b e f o r e i t i sr e i s o l a t e d . An e s s e n t i a l f e a t u r e o f t h e c l o n i n g s y s t e m i s at w o - s t a g e i n v i t r o p a c k a g i n g r e a c t i o n t h a t p a c k a g e s v e c t o r D N Ac o n t a i n i n g c l o n e d i n s e r t s i n t o p h a g e p a r t i c l e s t h a t c a n d e l i v e rt h e i r D N A t o E . c o l i w i t h n e a r u n i t e f f i c i e n c y . T h e p a c k a g i n gr e a c t i o n c a n g e n e r a t e 1 0 5 c l o n e s w i t h h i g h m o l e c u l a r w e i g h tD N A i n s e r t s p e r , I g o f v e c t o r DNA. U s i n g N o t I f r a g m e n t s f r o mE . c o l i DNA, i t w a s s h o w n t h a t t h e s y s t e m c a n c l o n e 9 5 - a n d1 0 0 - k b p f r a g m e n t s b u t n o t a 1 0 6 - k b p f r a g m e n t . P r e s u m a b l y ,t h e c o m b i n e d s i z e o f t h e l a t t e r f r a g m e n t a n d t h e v e c t o r D N A ( 1 3k b p ) e x c e e d s t h e h e a d f u l c a p a c i t y o f P 1 .T h e r e c e n t c o n s t r u c t i o n o f a d e t a i l e d l i n k a g e map o f t h eh u m a n g e n o m e ( 1 ) f a c i l i t a t e s t h e l o c a l i z a t i o n o f g e n e s t or e g i o n s o f a c h r o m o s o m e c o r r e s p o n d i n g i n s i z e t o 1 - 1 0m e g a b a s e s . F u r t h e r g e n e t i c l i n k a g e i s u s u a l l y c a r r i e d o u te i t h e r b y g e n e t i c m e a n s , i f s u i t a b l e p r o b e s a r e a v a i l a b l e , o r b yS o u t h e r n b l o t a n a l y s e s u s i n g p u l s e - f i e l d a g a r o s e g e l t e c h -n i q u e s . F i n a l l y , g e n e s a r e p r e c i s e l y l o c a l i z e d b y c l o n i n g h i g hm o l e c u l a r w e i g h t DNA i n s e r t s i n t o y e a s t a r t i f i c i a l c h r o m o -s o m e s ( Y A C s ) i n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ( 2 ) a n d b y DNA" w a l k i n g " a n d " j u m p i n g " s t r a t e g i e s u s i n g s e g m e n t s o f DNAc l o n e d i n t o c o s m i d v e c t o r s i n E s c h e r i c h i a c o l i ( 3 , 4 ) . T h em a j o r a d v a n t a g e o f t h e c o s m i d s y s t e m f o r c l o n i n g i s t h a ti n s e r t DNA c a n b e p a c k a g e d e f f i c i e n t l y i n t o p h a g e A p a r t i c l e s( 1 0 6 - 1 0 7 p h a g e w i t h i n s e r t s c a n b e p r o d u c e d p e r j k g o f v e c t o r )t h a t c a n i n j e c t t h e i r DNA i n t o c e l l s w i t h n e a r u n i t e f f i c i e n c y .H o w e v e r , t h e maximum a m o u n t o f DNA t h a t c a n b e c l o n e di n t o a n y o n e c o s m i d v e c t o r , 4 5 - 4 8 k i l o b a s e p a i r s ( k b p ) , i sl i m i t e d b y t h e s i z e o f t h e A h e a d . I n c o n t r a s t , YAC c l o n i n gv e c t o r s c a n a c c e p t a n d p r o p a g a t e DNA t h a t i s a s l a r g e a s2 0 0 - 8 0 0 k b p . D i s a d v a n t a g e s o f t h e YAC s y s t e m a r e ( i ) t h el o w e f f i c i e n c y o f t r a n s f o r m a t i o n w i t h v e c t o r DNA c o n t a i n i n gl a r g e i n s e r t s ( - 1 0 3 t r a n s f o r m a n t s a r e p r o d u c e d p e r l z g o fv e c t o r ) ; ( i i ) t h e d e c r e a s i n g t r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y w i t hi n c r e a s i n g i n s e r t s i z e ( P . H e i t e r , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) ;( i i i ) t h e n e e d t o p r o c e s s t r a n s f o r m a n t s i n d i v i d u a l l y p r i o r t os c r e e n i n g ; a n d ( i v ) t h e d i f f i c u l t y i n o b t a i n i n g l a r g e a m o u n t s o fi n s e r t DNA f r o m t r a n s f o r m e d c e l l s .T o o v e r c o m e s o m e o f t h e s h o r t c o m i n g s o f t h e c o s m i d a n dy e a s t c l o n i n g s y s t e m s a n d t o p r o v i d e a n a l t e r n a t i v e s y s t e m t o

c l o n e l a r g e m o l e c u l a r w e i g h t D N A s , a b a c t e r i o p h a g e P 1c l o n i n g s y s t e m h a s b e e n d e v e l o p e d a n d i s d e s c r i b e d h e r e .T h e P 1 s y s t e m p e r m i t s t h e c l o n i n g , i s o l a t i o n , a n d r e c o v e r y o fDNA i n s e r t s a s l a r g e a s 1 0 0 k b p w i t h a n e f f i c i e n c y t h a t i si n t e r m e d i a t e b e t w e e n t h a t o f c o s m i d s a n d Y A C s .MATERIALS A N D METHODS

P h a g e a n d B a c t e r i a l S t r a i n s . P l c m - 2 r-m- c l . 1 0 0 a m 9 . 1 6a n d P l c m - 2 r-m- c l . 1 0 0 a m 1 O . 1 a r e m u l t i p l y m u t a t e d P 1p h a g e t h a t w e r e u s e d h e r e t o p r e p a r e e x t r a c t s f o r i n v i t r op a c k a g i n g . J M 1 0 9 i s r e c A - h s d M ' h s d R - l a c ~ q ( 5 ) . N S 2 9 7 4i s J M 1 0 9 w i t h t h e A i m m 4 3 4 n i n 5 X 1 - c r e p r o p h a g e ( 6 ) . T h el a t t e r c o n t a i n s a c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s e d , c l o n e d P 1 c r er e c o m b i n a s e g e n e . S t r a i n N 9 9 i s d e s c r i b e d b y S h i m a d a e t a l .( 7 ) . N S 2 9 6 1 i s N 9 9 ( P l c m - 2 r-m- c l . 1 0 0 a m 9 . 1 6 ) a n d N S 2 9 6 2i s N 9 9 ( P l c m - 2 r-m- c l . 1 0 0 a m , 1 O . 1 ) .V e c t o r s . T h e c o n s t r u c t i o n a n d s t r u c t u r e o f t h e t w o P 1c l o n i n g v e c t o r s p N S 3 5 8 a n d p N S 5 8 2 a r e d e s c r i b e d i n F i g . 1 .T h e s t a r t i n g p l a s m i d i s p B S 6 9 ( 8 ) . I t c o n t a i n s t w o d i r e c t l yr e p e a t e d P 1 l o x P r e c o m b i n a t i o n s i t e s f l a n k i n g t h e p B R 3 2 2 b l a( a m p ' ) g e n e a n d m u l t i c o p y r e p l i c o n o n o n e s i d e , a n d t h e S .c e r e v i s i a e LEU2 g e n e o n t h e o t h e r . T o c o n s t r u c t t h e P 1c l o n i n g v e c t o r s t h e P 1 p a c k a g i n g s i t e ( p a c ) ( 9 , 1 0 ) w a s f i r s t

i n s e r t e d a s a 4 5 0 - b p Xho I / S a l I f r a g m e n t a t t h e u n i q u e XhoI s i t e i n t h e a m p r d o m a i n o f t h e v e c t o r . T h e a m i n o g l y c o s i d e3 ' - p h o s p h o t r a n s f e r a s e ( k a n r ) g e n e f r o m T n 9 0 3 ( 1 1 ) w a s t h e ni n s e r t e d a s a 1 . 3 - k b p A c c I f r a g m e n t i n t o t h e u n i q u e C l a I s i t ei n t h e LEU2 g e n e . T h e P 1 p l a s m i d m a i n t e n a n c e r e g i o nc o n t a i n i n g p l a s m i d r e p l i c o n a n d p a r t i t i o n s y s t e m s ( 1 2 ) w a st h e n i n s e r t e d a s a 7 . 2 - k b p Kpn I f r a g m e n t a t t h e u n i q u e K p nI s i t e . T o c o m p l e t e t h e c o n s t r u c t i o n o f p N S 3 5 8 , a p o l y l i n k e rc o n t a i n i n g u n i q u e B a m H I , Xba I , N o t I , S a l I , a n d S n a B Is i t e s w a s i n s e r t e d a t t h e u n i q u e BamHI s i t e . p N S 3 5 8 w a sc o n v e r t e d t o p N S 5 8 2 b y i n s e r t i n g t h e P 1 l y t i c r e p l i c o n ( 1 3 ) a sa 2 - k b p Hp a I f r a g m e n t i n t o t h e u n i q u e S n a B I s i t e o f p N S 3 5 8 .T h e a c t i v i t y o f t h a t r e p l i c o n i s r e g u l a t e d b y t h e l a c o p e r o np r o m o t e r ( 1 3 ) . A f i n a l v e c t o r u s e d , p N S 5 8 2 t e t l 4 , i s o n e i nw h i c h t h e p o l y l i n k e r i n p N S 5 8 2 i s r e p l a c e d b y t h e t e t r a c y -c l i n e r e s i s t a n c e ( t e t ) g e n e f r o m p B R 3 2 2 . p N S 5 8 2 t e t l 4 c o n -t a i n s u n i q u e BamHI a n d S a l I r e s t r i c t i o n s i t e s l o c a t e d i n t e t .S t a n d a r d D N A M e t h o d s . R e s t r i c t i o n e n z y m e s , T 4 DNAl i g a s e , a n d c a l f i n t e s t i n a l a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( C I P ) w e r ep u r c h a s e d f r o m New E n g l a n d B i o l a b s a n d w e r e u s e d a ss p e c i f i e d b y t h e v e n d o r . P l a s m i d DNA w a s i s o l a t e d b y t h ea l k a l i n e l y s i s m e t h o d o f B i r n b o i m a n d D o l y ( 1 4 ) . R e s t r i c t i o ne n z y m e - d i g e s t e d DNAs w e r e f r a c t i o n a t e d b y s t a n d a r d a g a -r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s i n l x TBE b u f f e r a s d e s c r i b e d b yC o h e n a n d S t e r n b e r g ( 1 5 ) o r i n f i e l d - i n v e r s i o n g e l s i n 0 . 5 xTBE b u f f e r . I n t h e l a t t e r c a s e , s a m p l e s w e r e f i r s t e l e c t r o -p h o r e s e d i n t o t h e g e l ( 6 x 6 i n ; 1 i n = 2 . 5 4 c m ) f o r 3 0 m i n a t1 0 0 V a n d t h e n s u b j e c t e d t o a s w i t c h i n g r e g i m e n o f 0 . 6 s e c

A b b r e v i a t i o n s : C I P , c a l f i n t e s t i n a l a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ; F I G E ,f i e l d - i n v e r s i o n g e l e l e c t r o p h o r e s i s ; YAC, y e a s t a r t i f i c i a l c h r o m o -some; I P T G , i s o p r o p y l f 3 - D - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e .

1 0 3

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .


2/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 7 ( 1 9 9 0 )am p-R _-

' ) r ix*BX h o l - S a l l P 1 p a c - * XholAccl k an Tn903-*Clal

P1 plasmid r e p l i c o n - * K p n lP o l y l i n k e r *BamHIcloning s i t e

_ p a ] e

amp-R | Ij]IfP;

p~~~~~~~e-SIpcs

Hpal P1 l y t i c SnaBir e p l i c o n +

pCs

F I G . 1 . Th e c o n s t r u c t i o n o f P 1 c l o n i n g p l a s m i d s p N S 3 5 8 a n dp N S 5 8 2 . Th e o r d e r o f s t e p s u s e d t o c o n s t r u c t p N S 3 5 8 a n d p N S 5 8 2a r e s h o w n . Th e l o c a t i o n o f r e s t r i c t i o n s i t e s u s e d t o c o n s t r u c t p N S 3 5 8a n d pNS582 i s s h o w n . Th e p o s i t i o n o f Xho I a n d B g l I I r e s t r i c t i o ns i t e s i n pNS358 a n d pNS582 i s s h o w n . T h e s e two r e s t r i c t i o n enzymeswere u s e d t o a n a l y z e h y b r i d s c o n t a i n i n g c l o n e d DNA i n s e r t s ( s e eF i g . 4 ) . -*, l o x P ; pBR322 a n d amp'; P 1 p l a s m i d r e p l i c o n ;k a n r gene T n 9 0 3 ; p a c ; X , P 1 l y t i c r e p l i c o n . K , Kpn I ; X ,X h o I ; B , BamHl; C , C l a 1 ; B g , B g l 1 1 .f o r w a r d / 0 . 2 se c b a c k w a r d w i t h a ramp f a c t o r o f 2 0 a t 2 2 0 Vu s i n g a PC750 ( H o e f e r ) f i e l d - i n v e r s i o n g e l e l e c t r o p h o r e s i s( F I G E ) a p p a r a t u s . E l e c t r o p h o r e s i s was c a r r i e d o u t a t roomtemperature w i t h o u t c o o l i n g f o r 2 h r .

P r e p a r a t i o n o f P a c a s e a n d H e a d - T a i l E x t r a c t s . L b r o t h ( 5 0 0m l ) was i n o c u l a t e d w i t h 5 m l o f a n o v e r n i g h t c u l t u r e o f e i t h e rN S 2 9 6 1 or NS2962 a n d t h e c u l t u r e s were grown a t 3 2 0 C t o a nO D 6 5 0 o f 0 . 6 . Th e t e m p e r a t u r e o f t h e c u l t u r e s was t h e nr a p i dl y r a i s e d t o 4 2 0 C a n d g r o w t h c o n t i n u e d a t t h a t t e m p e r -a t u r e f o r an a d d i t i o n a l 1 5 m i n . T h e t e m p e r a t u r e wa s t h e nl o w e r e d t o 3 8 0 C a n d g r o w t h c o n t i n u e d a t t h e l o w e r t e m p e r -ature f o r an a d d i t i o n a l 3 5 m i n ( f o r N S 2 9 6 1 ) or 1 6 5 m i n ( f o rN S 2 9 6 2 ) . Th e c u l t u r e s were t h e n r a p i d l y c h i l l e d t o 4 0 C a n dt h e c e l l s were p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( 1 0 m i n , 7 0 0 0 r p m i na S o r v a l l GSA r o t o r ) . C e l l s d e r i v e d f r o m t h e N S 2 9 6 2 c u l t u r ewere r e s u s p e n d e d i n 1 / 5 0 0 t h v o l o f c o l d b u f f e r c o n t a i n i n g 2 0mM T r i s H C I (pH 8 . 0 ) , 1 mM EDTA, 5 0 mM N a C I , a n d 1 mMp h e n y l m e t h y l s u l f o n y l f l u o r i d e , a n d t h e n s o n i c a t e d o n i c ew i t h t h e medium t i p o f a B r a n s o n s o n i f i e r a t s e t t i n g 5 f o r f o u r1 5 - s e c i n t e r v a l s . The s o n i c a t e d e x t r a c t was c e n t r i f u g e d f o r 3 0m i n a t 1 7 , 0 0 0 rpm i n a S o r v a l l S S 3 4 r o t o r a n d t h e s u p e r n a t a n t( t h e pacase e x t r a c t ) was a l i q u o t e d a n d s t o r e d a t - 8 0 C . T h i se x t r a c t i s s t a b l e t o s e v e r a l r o u n d s o f f r e e z i n g a n d t h a w i n g .Th e p e l l e t e d c e l l s f r o m t h e N S 2 9 6 1 c u l t u r e we re r e s u s p e n d e di n 1 / 5 0 0 t h v o l o f a c o l d b u f f e r c o n s i s t i n g o f 5 0 mM T r i s - H C I(pH 8 . 0 ) a n d 10% sucrose. F o r t y - m i c r o l i t e r a l i q u o t s were

t h e n t r a n s f e r r e d t o 1 . 5 - m l E p p e n d o r f t u b e s c o n t a i n i n g 4 , u l o fa l y s o z y m e s o l u t i o n ( 1 0 m g / m l ) a n d t h e t u b e s w e r e i m m e d i -a t e l y f r o z e n i n l i q u i d n i t r o g e n . T h e e x t r a c t i n t h e s e t u b e s i st h e h e a d - t a i l e x t r a c t .I n V i t r o P a c k a g i n g . T h i s r e a c t i o n i s d i v i d e d i n t o t w o s t a g e s .I n s t a g e 1 t h e p a c k a g i n g s i t e ( p a c ) i n t h e v e c t o r D N A i sc l e a v e d b y t h e p a c a s e e x t r a c t . I n s t a g e 2 t h a t DNA i sp a c k a g e d i n t o p h a g e p a r t i c l e s .T h e s t a g e 1 r e a c t i o n w a s p e r f o r m e d i n 1 5 j u l c o n t a i n i n g 1 0mM T r i s H C l ( p H 8 . 0 ) , 5 0 mM N a C l , 1 0 mM M g C l 2 , 0 . 1 m Me a c h d T T P , d G T P , d A T P , a n d d C T P , 2 mM d i t h i o t h r e i t o l , 1mM A T P , p a c - c o n t a i n i n g v e c t o r DNA, o r a l i g a t i o n r e a c t i o nm i x t u r e c o n t a i n i n g t h a t DNA a n d 0 . 1 - 0 . 5 / u l o f t h e p a c a s ee x t r a c t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s i n c u b a t e d f o r 1 5 m i n a t3 0 ' C . I n s t a g e 2 , 3 / u l o f a b u f f e r c o n t a i n i n g 6 mM T r i s H C I( p H 8 . 0 ) , 1 6 mM M g C l 2 , 6 0 mM s p e r m i d i n e , 6 0 mM p u -t r e s c i n e , 3 0 mM 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , a n d 1 / L I o f 5 0 mM ATPw e r e a d d e d t o t h e s t a g e 1 r e a c t i o n m i x t u r e a n d t h e e n t i r er e a c t i o n w a s t r a n s f e r r e d t o a n E p p e n d o r f t u b e c o n t a i n i n g af r e s h l y t h a w e d h e a d - t a i l e x t r a c t . T h e c o n t e n t s o f t h e t u b ew e r e v e r y v i s c o u s a t t h i s p o i n t a n d w e r e m i x e d b y g e n t l ys w i r l i n g w i t h a p i p e t t e t i p . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s i n c u -b a t e d f o r 2 0 m i n a t 3 0 C a n d t h e r e a c t i o n w a s s t o p p e d b ya d d i n g 1 2 0 , u l o f a s o l u t i o n o f 1 0 mM T r i s H C I ( p H 8 . 0 ) , 1 0 mMM g C i 2 , 0 . 1% g e l a t i n , a n d p a n c r e a t i c D N a s e I ( 1 0 , u g / m l ) . T h ec o n t e n t s o f t h e t u be w e r e V o r t e x m i x e d a n d t h e n i n c u b a t e df o r 1 5 m i n a t 3 7 C . T h i s c o n s t i t u t e s t h e p h a g e l y s a t e a n d c a nb e s t o r e d a t 4 C f o r w e e k s w i t h o u t l o s s o f p h a g e t i t e r .RESULTS

P 1 C l o n i n g V e c t o r s p N S 3 5 8 a n d p N S 5 8 2 . E a c h o f t h e s ev e c t o r s ( F i g . 1 ) c o n s i s t s o f t w o d o m a i n s t h a t a r e f l a n k e d b yP 1 l o x P r e c o m b i n a t i o n s i t e s t h a t a r e o r i e n t e d i n t h e s a m ed i r e c t i o n . R e c o m b i n a t i o n b e t w e e n t h e s e s i t e s m e d i a t e d b yt h e P 1 C r e r e c o m b i n a s e s e p a r a t e s t h e t w o d o m a i n s o f t h ev e c t o r i n t o d i s c r e t e c i r c l e s ( 1 3 , 1 6 , 1 7 ) . O n e o f t h e d o m a i n so f t h e v e c t o r h a s t h e p B R 3 2 2 p l a s m i d a m p r g e n e , t h e p B R 3 2 2m u l t i c o p y r e p l i c o n , a n d t h e P 1 p a c s i t e . T h e l a t t e r wa so r i e n t e d s o a s t o d i r e c t p a c k a g i n g c o u n t e r c l o c k w i s e o n t h ev e c t o r ( F i g . 1 ) . T h e s e c o n d v e c t o r d o m a i n c o n t a i n s a P 1p l a s m i d r e p l i c o n ( 1 2 , 1 8 ) , a k a n r g e n e f r o m T n 9 0 3 , a n d ap o l y l i n k e r c l o n i n g s i t e c o n t a i n i n g u n i q u e B a m H I , S n a B I , S a lI , N o t I , a n d X b a I s i t e s . p N S 5 8 2 d i f f e r s f r o m p N S 3 5 8 i n t h a ti t c o n t a i n s a l a c p r o m o t e r - r e g u l a t e d P 1 l y t i c r e p l i c o n i n t h ek a n r d o m a i n o f t h e v e c t o r .An i n V i t r o P 1 P a c k a g i n g S y s t e m . B a c t e r i o p h a g e P 1 p a c k -a g e s DNA b y a h e a d f u l m e c h a n i s m . T h e p r o c e s s i s i n i t i a t e dw h e n P 1 - e n c o d e d p a c a s e p r o t e i n s r e c o g n i z e a n d c l e a v e p a ci n t h e p h a g e DNA ( 9 , 1 0 ) . T h e DNA o n o n e s i d e o f t h a tc l e a v a g e i s t h e n p a c k a g e d i n t o a n e m p t y p h a g e p r o h e a d .O n c e t h e h e a d h a s b e e n f i l l e d , a s e c o n d DNA c l e a v a g e e v e n t( t h e h e a d f u l c u t ) o c c u r s t h a t s e p a r a t e s t h e DNA i n s i d e o f t h eh e a d f r o m t h a t o u t s i d e o f t h e h e a d . T h e h e a d f u l c l e a v a g e i sn o t s e q u e n c e s p e c i f i c . P h a g e t a i l s a r e t h e n a d d e d t o t h e f i l l e dh e a d s t o c o m p l e t e p a r t i c l e f o r m a t i o n . N o t e t h a t i n t h i sp r o c e s s p a c i s c l e a v e d o n l y d u r i n g t h e i n i t i a t i o n o f p a c k a g i n ga n d n o t a t i t s t e r m i n a t i o n . T h u s , t h e two e n d s o f t h e p a c k a g e dDNA a r e d i f f e r e n t .T h e i n v i t r o p a c k a g i n g r e a c t i o n d e s c r i b e d i n t h i s r e p o r to c c u r s i n t w o s t a g e s . I n t h e f i r s t s t a g e , t h e p a c s i t e o f t h ev e c t o r DNA i s c l e a v e d b y a s o n i c a t e d e x t r a c t t h a t l a c k sp h a g e h e a d s a n d t a i l s b u t c o n t a i n s e s s e n t i a l p h a g e p a cc l e a v a g e p r o t e i n s - t h e p a c a s e e x t r a c t . T h a t e x t r a c t wa sp r e p a r e d b y i n d u c t i o n o f a P 1 c m - 2 c l . 1 0 0 r - m - a m 1 0 . 1l y s o g e n ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . T h e f o u r m u t a t i o n sp r e s e n t i n t h e P 1 p r o p h a g e a r e i m p o r t a n t f o r t h e p r o d u c t i o no f a f u n c t i o n a l e x t r a c t . T h e c I . 1 0 0 m u t a t i o n ( 1 9 ) i s a t e m -p e r a t u r e - s e n s i t i v e P 1 r e p r e s s o r m u t a t i o n t h a t p e r m i t s r a p i dp r o p h a g e i n d u c t i o n b y s h i f t i n g t h e t e m p e r a t u r e o f an e x p o -n e n t i a l l y g r o w i n g l y s o g e n i c c u l t u r e f r o m 3 2 0 C t o 4 2 0 C . T h e

1 0 4 B i o c h e m i s t r y : S t e r n b e r g


3/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 7 ( 1 9 9 0 ) 1 0 5c m - 2 m u t a t i o n i s a d e l e t i o n o f 1 0 k b p o f p h a g e DNA ( 2 0 , 2 1 )t h a t c a u s e s a d e l a y i n c e l l l y s i s f o l l o w i n g p r o p h a g e i n d u c t i o n .T h i s p r o p e r t y i s u s e f u l t o p r o d u c e t h e h i g h l y c o n c e n t r a t e dp a c a s e e x t r a c t n e c e s s a r y f o r e f f i c i e n t p a c c l e a v a g e . T h er-m- m u t a t i o n ( 2 2 ) i n a c t i v a t e s t h e P 1 r e s t r i c t i o n a n d m o d i -f i c a t i o n e n z y m e t h a t m i g h t o t h e r w i s e d e g r a d e u n m o d i f i e dDNA a d d e d t o t h e p a c a s e e x t r a c t . T h e P 1 1 0 . 1 a m b e rm u t a t i o n b l o c k s t h e p r o d u c t i o n o f a l l " l a t e " P 1 p r o t e i n s ,i n c l u d i n g h e a d a n d t a i l p r o t e i n s ( 2 3 ) , b u t p e r m i t s t h e p r o d u c -t i o n o f t h e p a c r e c o g n i t i o n a n d c l e a v a g e p r o t e i n s ( 1 0 ) . Whent h e p a c a s e e x t r a c t w a s i n c u b a t e d w i t h a P 1 DNA f r a g m e n tc o n t a i n i n g p a c , a s m u c h a s 20% o f t h e f r a g m e n t w a s c l e a v e d( F i g . 2 ) . D e t a i l s o f t h e c l e a v a g e r e a c t i o n w i l l b e r e p o r t e de l s e w h e r e ( u n p u b l i s h e d d a t a ) .I n s t a g e 2 o f t h e p a c k a g i n g r e a c t i o n t h e p a c - c l e a v e d DNAg e n e r a t e d i n s t a g e 1 i s p a c k a g e d i n t o e m p t y p h a g e p r o h e a d s ,a n d t a i l s a r e a t t a c h e d t o t h e f i l l e d h e a d s t o c o m p l e t e t h e p h a g ea s s e m b l y p r o c e s s . T h e s t a g e 2 h e a d - t a i l e x t r a c t w a s p r e p a r e db y i n d u c t i o n o f a P 1 c m - 2 c l . 1 0 0 r-m- a m 9 . 1 6 l y s o g e n ( s e eM a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . T h e 9 . 1 6 a m b e r m u t a t i o n i s l o c a t e di n o n e o f t h r e e g e n e s n e c e s s a r y f o r p a c a s e f u n c t i o n ( 9 ) .I n V i t r o P a c k a g i n g o f V e c t o r DNA. To a s s e s s t h e e f f i c i e n c yo f t h e i n v i t r o p a c k a g i n g r e a c t i o n , p N S 5 8 2 v e c t o r DNA w a s

c l e a v e d a t o n e o f t h e r e s t r i c t i o n s i t e s i n t h e p o l y l i n k e r , l i g a t e dt o p r o d u c e c o n c a t e m e r s c o n s i s t i n g o f 3 - 1 0 v e c t o r u n i t s ( F i g .3 A ) , a n d t h a t DNA w a s t h e n p a c k a g e d i n v i t r o . T h e p h a g ep r o d u c e d g e n e r a t e 2 x 1 0 6 k a n r t r a n s f o r m an t s p e r / i g o fv e c t o r u s e d w h e n t h e i n f e c t e d s t r a i n ( N S 2 9 7 4 ) c o n t a i n s t h eA

B

4 u ncu t p ac f r a g m e n t - _ *p acc l e a v a g e : p a c - c u t 2

3 2 p a c - c u t 1 1 -3 2

s - p as - l o ,1 2 3 4

C r e r e c o m b i n a s e ( T a b l e 1 , l i n e s 2 a n d 5 ) . I f t h e i n f e c t e d s t r a i nd o e s n o t c o n t a i n C r e ( J M 1 0 9 ) t h e n t h e y i e l d o f k a n ' t r a n s -f o r m a n t s i s r e d u c e d - 5 0 - f o l d . P r e s u m a b l y , C r e - m e d i a t e dr e c o m b i n a t i o n b e t w e e n l o x P s i t e s i s n e c e s s a r y t o c y c l i z e t h ei n f e c t i n g l i n e a r DNA s o t h a t i t c a n b e f a i t h f u l l y m a i n t a i n e d i nt h e t r a n s f o r m e d c e l l s ( r e f s . 6 , 1 3 , a n d 1 6 ; F i g . 3 A ) . T h i sc o n t e n t i o n i s s u p p o r t e d b y t h e s t r u c t u r e o f p l a s m i d s p r e s e n ti n k a n r a m p s , k a n s a m p r , a n d k a n r a m p r t r a n s f o r m a n t s g e n -e r a t e d b y t h e i n v i t r o p a c k a g e d p h a g e ( F i g . 4 ; s e e a l s o r e f . 1 0 ) .T h e k a n r a m p s t r a n s f o r m a n t s c o n t a i n a p l a s m i d w i t h o n l y t h ek a n r d o m a i n o f p N S 5 8 2 ( F i g . 4 , l a n e 2 ) , t h e k a n s a m p rt r a n s f o r m a n t s c o n t a i n a p l a s m i d w i t h o n l y t h e a m p r d o m a i no f p N S 5 8 2 ( l a n e 4 ) , a n d t h e a m p r k a n r t r a n s f o r m a n t s c o n t a i nb o t h o f t h e s e p l a s m i d s ( l a n e 3 ) .F o r v e c t o r DNA t o b e p a c k a g e d , i t s s i z e m u s t b e l a r g ee n o u g h t o f i l l a n e m p t y P 1 h e a d . T h u s , i f d i g e s t e d p N S 5 8 2DNA ( - 1 6 k b ) i s n o t l i g a t e d ( T a b l e 1 , l i n e 1 ) , i f i t i s t r e a t e dw i t h C I P b e f o r e l i g a s e i s a d d e d ( l i n e s 3 a n d 6 ) , o r i f t h e l i g a t i o np r o d u c t s a r e p r e d o m i n a n t l y monomer o r d i m e r c i r c l e s ( d a t an o t s h o w n ) , t h e n t h e r e c o v e r y o f k a n r t r a n s f o r m a n t s i sr e d u c e d - 2 0 0 - f o l d ( T a b l e 1 ) .C l o n i n g o f H i g h M o l e c u l a r W e i g h t D N A F r a g m e n t s . Toa s s e s s t h e a b i l i t y o f t h e P 1 s y s t e m t o c l o n e f o r e i g n DNA

i n s e r t s , B a m H I - d i g e s t e d p N S 5 8 2 DNA t r e a t e d w i t h C I P w a sm i x e d w i t h E . c o l i DNA t h a t w a s p a r t i a l l y d i g e s t e d w i t hBamHI ( a v e r a g e f r a g m e n t s i z e , 4 0 - 8 0 k b p ) . T h e m i x t u r e w a sl i g a t e d a n d p a c k a g e d , a n d t h e l y s a t e w a s t h e n u s e d t o i n f e c tN S 2 9 7 4 . T h e y i e l d o f k a n r t r a n s f o r m a n t s w a s s t i m u l a t e d- 6 - f o l d b y t h e p r e s e n c e o f t h e E . c o l i DNA i n t h e l i g a t i o nr e a c t i o n m i x t u r e ( T a b l e 1 , l i n e s 6 a n d 7 ) , a n d - 7 0 % o f t h o s eA . e l . * . 1 ^ l


4/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 7 ( 1 9 9 0 )T a b l e 1 . C l o n i n g o f E . c o l i N o t I a n d BamHI f r a g m e n t s i n t op N S 5 8 2 D N A

K a n a m y c i n - r e s i s t a n tc o l o n i e s p e r A g o fv e c t o r D N AV e c t o r D N A I n s e r t D N A N S 2 9 7 4 J M 1 0 9

p N S 5 8 2 N o t I N o n e < 1 0 4p N S 5 8 2 N o t I N o n e 2 . 2 x 1 0 6 4 x 1 0 4p N S 5 8 2 N o t I C I P N o n e 2 . 0 x 1 0 4p N S 5 8 2 N o t I C I P E . c o l i N o t 1 * 8 . 0 x 1 0 4 2 x 1 0 3p N S 5 8 2 BamHI N o n e 1 . 7 x 1 0 6p N S 5 8 2 BamHI C I P N o n e 1 . 4 x 1 0 4p N S 5 8 2 BamHI C I P E . c o l i B a m H I t 9 . 6 x 1 0 4A l l o f t h e s e l i g a t i o n r e a c t i o n s e x c e p t t h e f i r s t o n e w e r e c a r r i e d o u ti n 2 0 , u l w i t h 4 0 0 u n i t s o f T 4 D N A l i g a s e ( N e w E n g l a n d B i o l a b s ) . T h ef i r s t r e a c t i o n m i x t ur e c o n t ai n e d n o l i g a s e . E a c h r e a c t i o n m i x t u r ec o n t a i n s 1 , u g o f v e c t o r DNA. FIGE o f t h e p r o d u c t s o f t h e r e a c t i o n si n d i c a t e s t h a t t h e r e a c t i o n i n l i n e 2 p r o d u c e d c o n c a t em e r s r a n g i n g i ns i z e f r o m 3 t o 1 0 v e c t o r u n i t s . A b o u t 6 0 o o f k an r t r a n s f o r m a n t sg e n e r a t e d b y t h e r e a c t i o n i n l i n e 4 h a v e i n s e r t s . A b o u t 7 0 % o o f t h e k a n rt r a n s f o r m a n t s g e n e r a t e d b y t h e r e a c t i o n i n l i n e 7 h a v e i n s e r t s .* E . c o l i D N A ( 3 j u g ) d i g e s t e d w i t h N o t I .t E . c o l i DNA ( 1 , u g ) p a r t i a l l y d i g e s t e d w i t h BamHI ( 4 0 - 8 0 k b p b a s e d

o n e t h i d i u m b r o m i d e s t a i n i n g o f f i e l d - i n v e r s i o n g e l s ) .t r a n s f o r m a n t s c o n t a i n e d p l a s m i d s w i t h i n s e r t e d E . c o l i DNAf r a g m e n t s . T h e i n s e r t s r a n g e d i n s i z e f r o m 2 5 t o 8 0 k b p .1 2 3 4 5 6 7 8 9 1I ( 1 1 1 2 1 . 3

' 4 - 2 3 kb4 - 9 . 4 k b4 - 6 . 6 k b

- 4 . 4 k b

4-2.3kb4 2 kb

F r a g m e n t s g e n e r a t e d b y t h e d i g e s t i o n o f r e p r e s e n t a t i v e i n -s e r t - c o n t a i n i n g p l a s m i d s w i t h B g l I I a n d X ho I a r e s h o w n i nF i g . 4 ( l a n e s 5 , 6 , a n d 1 0 - 1 2 ) . T h e s e DNAs c o n t a i n t h r e e o ft h e f o u r B g l I I / X h o I f r a g m e n t s p r e s e n t i n t h e k a n r p l a s m i d sw i t h o u t a n i n s e r t ( l a n e s 2 a n d 8 ) b u t a r e m i s s i n g t h e l a r g e s tv e c t o r B g l I I / X h o I f r a g m e n t , w h i c h c o n t a i n s t h e p o l y l i n k e rc l o n i n g s i t e . T h e DNA i n l a n e 1 1 c o n t a i n s a s m a l l 2 . 5 - k b pa m p r d o m a i n p l a s m i d i n a d d i t i o n t o a n i n s e r t - c o n t a i n i n g k a n rp l a s m i d ( s e e D i s c u s s i o n ) .To d e t e r m i n e t h e u p p e r l i m i t o f f r a g m e n t s i z e s t h a t c o u l db e c l o n e d i n t o t h e P 1 v e c t o r , N o t I f r a g m e n t s o f E . c o l i DNAw e r e c l o n e d i n t o N o t I - d i g e s t e d C I P - t r e a t e d v e c t o r DNA a n dt h e i n s e r t s w e r e a n a l y z e d b y FIGE ( 2 4 ) . A s w a s t h e c a s e f o rt h e c l o n i n g o f BamHI f r a g m e n t s , t h e p r e s e n c e o f i n s e r t DNAi n t h e l i g a t i o n r e a c t i o n m i x t u r e i n c r e a s e d t h e n u m b e r o f k a n rt r a n s f o r m a n t s r e c o v e r e d ( T a b l e 1 , l i n e s 3 a n d 4 ) , a n d - 6 0 %o f t h o s e t r a n s f o r m a n t s h a d i n s e r t s . T h e r e c e n t N o t I r e s t r i c -t i o n map o f E . c o l i ( 2 5 ) s u g g e s t s t h a t s i x o r s e v e n N o t If r a g m e n t s s h o u l d b e s m a l l e n o u g h t o b e c l o n e d i n t o t h e P 1v e c t o r . T h e s e f r a g m e n t s a r e 2 0 , 4 0 , 4 3 , 4 3 , 9 5 , 1 0 0 , a n d 1 0 6k b p . T h e f i r s t s i x h a v e b e e n c l o n e d w i t h t h e e x p e c t e de f f i c i e n c y ( e a c h i s r e p r e s e n t e d i n 1 0 - 2 0 % o f t h e k a n ' t r a n s -f o r m a n t s c o n t a i n i n g i n s e r t s ) b u t t h e l a s t o n e ( t h e 1 0 6 - k b pf r a g m e n t ) c o u l d n o t b e c l o n e d . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t 1 1 3k b p o f DNA ( t h e 1 0 0 - k b p f r a g m e n t p l u s 1 3 k b p o f t h e k a n 'd o m a i n o f p N S 5 8 2 DNA) c a n b e p a c k a g e d i n t o a P 1 h e a d , b u t1 1 9 k b p c a n n o t . FIGE w i t h N o t I d i g e s t s o f p l as m i d s c o n -t a i n i n g b o t h o f t h e 4 3 - k b p i n s e r t s , t h e 9 5 - k b p i n s e r t , a n d t h e1 0 0 - k b p i n s e r t i s s h o w n i n F i g . 5 .B o t h g e n e t i c a n d S o u t h e r n h y b r i d i z a t i o n a n a l y s e s w e r ec a r r i e d o u t t o e v a l u a t e t h e f i d e l i t y o f t h e c l o n i n g p r o c e s s ( d a t an o t s h o w n ) . C o n s i s t e n t w i t h p r e d i c t i o n s f r o m t h e N o t I mapo f E . c o l i ( 2 5 ) t r a ns f o r m at i o n o f a r e c A - t r p E s t r a i n o f E . c o l i[ N S 4 4 O r e c A ( 2 6 ) ] w i t h t h e 9 5 - k b p i n s e r t p l a s m i d c o n f e r r e d at r p + k a n r p h e n o t y p e a n d t r a n s f o r m a t i o n o f a r e c A - n a d As t r a i n o f E . c o l i ( N S 5 2 3 r e c A ( 2 6 ) ] w i t h t h e 1 0 0 - k b p i n s e r tp l a s m i d c o n f e r r e d a n a d + k a n r p h e n o t y p e . T h i s r e s u l t w a sc o n f i r m e d b y S o u t h e r n b l o t a n a l y s i s . T h u s , DNA d e r i v e df r o m t h e 9 5 - k b p p l a s m i d h y b r i d i z e s t o a t r p E g e n e p r o b e a n dDNA f r o m t h e 1 0 0 - k b p p l a s m i d h y b r i d i z e s t o a n a d A g e n ep r o b e . F i n a l l y , S o u t h e r n b l o t a n a l y s e s o f B g l I I / X h o I -d i g e s t e d D NA s f r o m t h e 9 5 - a n d 1 0 0 - k b p p l a s m i d s a n d f r o m

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3

4 - - _T 4 -_

F P 1-_-F I G . 4 . A g a r o s e g e l a n a l y s i s o f p l a s m i d s c o n t a i n i n g c l o n e d i n -s e r t s . A l l p l a s m i d D NAs w e r e d i g e s t e d w i t h B g l 1 1 a n d X h o I a n dw e r e a n a l y z e d o n 1% a g a r o s e g e l s . L a n e s : 1 , p N S 5 8 2 DNA; 2 ,p l a s m i d DNA f r o m a k a n r a m p s p N S 5 8 2 t r a ns f o r m an t o f N S 2 9 7 4 ; 3 ,p l a s m i d DNA f r o m a k a n r a m p ' p N S 5 8 2 t r a ns f o r m an t o f N S 2 9 7 4 ; 4 ,p l a s m i d DNA f r o m a k a n s a m p ' p N S 5 8 2 t r a n sf o r m an t o f N S 2 9 7 4 ; 5a n d 6 , p l a s m i d s c o n t a i n i n g BamHI i n s e r t s o f E . c o l i DNA [ p l a s m i di n l a n e 5 i s 7 8 - 8 0 k b p ( i n s e r t s i z e , 6 5 - 6 7 k b p ) a n d p l a s m i d i n l a n e 6i s 4 2 k b p ( i n s e r t s i z e , 2 9 k b p ) ] ; 7 , A H i n d I l l - d i g e s t e d DNA; 8 , B g lI I / X h o 1 - d i g e s t e d p N S 5 8 2 t e t l 4 DNA; 9 , A H i n d I l - d i g e s t e d DNA;1 0 - 1 2 , p N S 5 8 2 w i t h BamHI i n s e r t s o f E . c o l i DNA [ p l a s m i d i n l a n e1 0 i s 9 2 k b p ( i n s e r t s i z e , 7 7 k b p ) , p l a s m i d i n l a n e 1 1 i s 5 5 k b p ( i n s e r ts i z e , 4 0 k b p ) , a n d p l a s m i d i n l a n e 1 2 i s 8 4 k b p ( i n s e r t s i z e , 6 9 k b p ) ] .T h e s i z e s o f t h e p l a s m i d s w e r e d e t e r m i n e d b y s u m m i n g t h e s i z e s o ft h e B g I I I / X h o I f r a g m e n t s i n e a c h l a n e o f t h e g e l . T h e i n t e n s e 2 . 5 - k b pb a n d i n l a n e 1 1 i s t h e Xho I - d i g e s t e d a m p r d o m a i n o f p N S 5 8 2 t e t l 4 ,w h i c h i s a l s o p r e s e n t i n t h e c l o n e c o n t a i n i n g t h e 5 5 - k b p k a n r p l a s m i d .L a n e 1 3 c o n t a i n s a d d i t i o n a l DNA s i z e m a r k e r s . A r r o w s i n d i c a t e t h ep o s i t i o n s a n d s i z e s o f t h e A H i n d I l l m a r k e r f r a g m e n t s .

F 1 8 4 k '5 - 1 3 8 k b*9 2 k b

4 - 4 6 k b

F I G . 5 . F l G E o f c l o ne d E . c o l i N o t I f r a g m e n t s . A p u l s e - f i e l d g e la n a l y s i s o f c l o n e d E . c o l i N o t I f r a g m e n t s . M a r k e r s u s e d a r e s h o w ni n l a n e s 1 , 2 , 7 , a n d 1 1 - 1 3 . L a n e s : 1 , T 4 DNA ( - 1 6 0 k b p ) ; 2 , P 1 DNA( " 1 1 5 k b p ) ; 7 , a N o t I d i g e s t o f E . c o l i DNA; 1 1 , A DNA d i g e s t e d w i t hH i n d I I I ; 1 2 , BRL h i g h m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r ( l a r g e s t f r a g m e n t i s4 9 k b p ) ; 1 3 , a A g t 1 1 DNA l a d d e r ( 4 6 - , 9 2 - , a n d 1 3 8 - k b p m a r k e r s ) . A l lo t h e r l a n e s c o n t a i n DNA d i g e s t e d w i t h N o t 1 . L a n e s : 3 , p N S 5 8 2DNA; 4 , p N S 3 5 8 DNA; 5 , t h e 4 3 - k b p f r a g m e n t c l o n e d i n p N S 5 8 2DNA; 6 , t h e o t h e r 4 3 - k b p f r a g m e n t c l o n e d i n p N S 3 5 8 DNA; 8 , t h e1 0 0 - k b p f r a g m e n t c l o n e d i n p N S 5 8 2 ; 9 , t h e 9 5 - k b p f r a g m e n t c l o n e di n p N S 3 5 8 p r e p a r e d 1 0 0 g e n e r a t i o n s a f t e r t r a n s f o r m a t i o n ; 1 0 , t h es a m e p l a s m i d DNA a s i n l a n e 9 p r e p a r e d 2 0 0 g e n e r a t i o n s a f t e rt r a n s f o r m a t i o n .

1 0 6 B i o c h e m i s t r y : S t e r n b e r g


5/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 7 ( 1 9 9 0 ) 1 0 71 2 3 4 5

4 - 17kb4- 1Okb

7kb

3.5kb

F I G . 6 . A m p l i f i c a t i o n o f p N S 5 8 2 DNA c o n t a i n i n g t h e 1 0 0 - k b p E .c o l i n a d A N o t I i n s e r t . T e n m i l l i l i t e r s o f N S 2 9 7 4 ( F ' l a C i q c r e ' )h a r b o r i n g t h i s p l a s m i d was g r o w n t o a d e n s i t y o f 2 x 1 0 7 c e l l s a n dt h e n d i v i d e d i n h a l f . One h a l f o f t h e c u l t u r e r e c e i v e d 1 mM IPTG a n dt h e o t h e r h a l f d i d n o t . A f t e r a n a d d i t i o n a l 6 g e n e r a t i o n s o f g r o w t h ,p l a s m i d DNA was i s o l a t e d b y t h e m e t h o d o f B i r n b o i m a n d D o l y ( 1 4 ) .T h e g r o w t h r a t e o f c u l t u r e was t h e same w i t h o r w i t h o u t I P T G . L a n e s1 , 2 , a n d 3 c o n t a i n 3 % , 1 5 % , a n d 6 5 % , r e s p e c t i v e l y , o f t h e p l a s m i dDNA f r o m t h e c e l l s g r o w n w i t h o u t I P T G . L a n e 4 c o n t a i n s 3 % o f t h eDNA i s o l a t e d f r o m t h e c e l l s g r o w n w i t h I P T G . A l l DNAs wered i g e s t e d w i t h B g l 1 I a n d Xho I. T h e m i n o r b a n d s i n l a n e s 2 a n d 3 comef r o m t h e u n i t copy F ' 1 a C q p l a s m i d p r e s e n t i n N S 2 9 7 2 . L a n e 5c o n t a i n s a n E c o R I d i g e s t o f P 1 DNA.E . c o l i DNA s h o w e d t h a t t h e s e p l a s m i d s c o n t a i n t h e same E .c o l i DNA f r a g m e n t s as d o e s t h e E . c o l i genome.A m p l i f i c a t i o n o f C h i m e r i c P l a s m i d DNA b y t h e P 1 L y t i cR e p l i c o n . T h e r a t i o n a l e f o r p l a c i n g two r e p l i c o n s i n t h e k a n rd o m a i n o f p N S 5 8 2 i s t o p r o v i d e a l t e r n a t i v e r e p l i c a t i o n m o d e sf o r i n s e r t m a i n t e n a n c e a n d i n s e r t recovery. To a c h i e v e t h i se n d , t h e c e l l l i n e u s e d as r e c i p i e n t f o r p a c k a g e d DNA( N S 2 9 7 4 ) c o n t a i n s a l a C j r e p r e s s o r , w h i c h r e n d e r s t h e h i g hcopy n u m b e r la c p r o m o t e r - r e g u l a t e d l y t i c r e p l i c o n i n t h ep l a s m i d n o n f u n c t i o n a l . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , t h e p l a s m i di s s t a b l y m a i n t a i n e d a t o n e co py per c e l l b y t h e P 1 p l a s m i dr e p l i c o n . To recover l a r g e amounts o f p l a s m i d DNA f o rr e s t r i c t i o n a n a l y s i s a n d p o s s i b l e s u b c l o n i n g , i s o p r o p y l f 8 -D - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ( I P T G ) ( 1 m M) was a d d e d t o t h ec u l t u r e t o i n a c t i v a t e t h e l a C d repressor b e f o r e t h e DNA wasi s o l a t e d . A c o m p a r i s o n o f t h e r e l a t i v e amounts o f i n s e r t -c o n t a i n i n g p l a s m i d DNA r e c o v e r e d w i t h a n d w i t h o u t IPTG( F i g . 6 ) i n d i c a t e s t h a t c e l l s g r o w n f o r 6 g e n e r a t i o n s w i t h I P T Gc o n t a i n 2 5 t i m e s as much p l a s m i d DNA as d o c e l l s gr ownw i t h o u t I P T G . T h u s , l a n e s 3 ( - I P T G ) a n d 4 ( + I P T G ) c o n t a i nn e a r l y e q u a l amounts o f p l a s m i d DNA d e s p i t e t h e f a c t t h a tt h e DNA i n l a n e 3 i s f r o m 2 5 t i m e s as many c e l l s .

DISCUSSIONW e d e s c r i b e h e r e a t w o - d o m a i n P 1 c l o n i n g v e c t o r a n d an i nv i t r o P 1 p a c k a g i n g s y s t e m t h a t p e r m i t s t h e c l o n i n g o f f r a g -ments u p t o 1 0 0 k b p . T h e essence o f t h e v e c t o r i s a P 1p a c k a g i n g s i t e ( p a c ) , w h i c h i s n e e d e d t o i n i t i a t e t h e p a c k a g i n gprocess a n d two P 1 l o x P r e c o m b i n a t i o n s i t e s f l a n k i n g t h ec l o n e d i n s e r t , w h i c h a r e n e e d e d t o c y c l i z e t h e p a c k a g e dl i n e a r DNA f o l l o w i n g p h a g e i n f e c t i o n o f c e l l s c o n t a i n i n g t h e

P 1 C r e r e c o m b i n a s e . C y c l i z a t i o n i s n e c e s s a r y f o r t h e p r o p -a g a t i o n a n d m a i n t e n a n c e o f t h e v e c t o r p l a s m i d . I n s t r a i n sc o n t a i n i n g a l a d q r e p r e s s o r , t h e P 1 p l a s m i d r e p l i c o n m a i n -t a i n s t h e DNA a t a b o u t o n e c o p y p e r h o s t c h r o m o s o m e . I fI P T G i s a d d e d t o t h e m e d i u m t h e P 1 l y t i c r e p l i c o n i n t h ev e c t o r i s i n d u c e d a n d t h e c o p y n u m b e r o f t h e c h i m e r i cp l a s m i d i n c r e a s e s - 2 5 - f o l d i n 6 g e n e r a t i o n s . U n d e r t h e s ec o n d i t i o n s , 4 , u g o f c l o n e d f r a g m e n t i s n o r m a l l y r e c o v e r e df r o m 3 X 1 0 9 e x p o n e n t i a l l y g r o w i n g c e l l s .T h e s i z e o f t h e DNA t h a t i s c l o n e d i n t h e P 1 v e c t o r i sd e t e r m i n e d b y t h e h e a d f u l s i z e o f P 1 ( 1 1 0 - 1 1 5 k b p o f DNA)a n d b y t h e a m o u n t o f DNA b e t w e e n a n y t w o d i r e c t l yr e p e a t e d l o x P s i t e s i n t h e l i g a t e d c o n c a t e m e r ( F i g . 3 ) . I f t h ei n s e r t e d DNA f r a g m e n t i s > 1 0 0 k b p , t h e n t h e d i s t a n c eb e t w e e n l o x P s i t e s i n t h e k a n r d o m a i n o f t h e p l a s m i d w i l l b eg r e a t e r t h a n a P 1 h e a d f u l , a n d t h e p a c k a g e d DNA w i l l n o tc o n t a i n t w o l o x P s i t e s . When t h a t DNA i s i n j e c t e d i n t o aC r e - c o n t a i n i n g h o s t , i t w i l l n o t b e c y c l i z e d a n d , t h e r e f o r e ,w i l l n o t b e r e c o v e r a b l e a s a k a n r t r a n s f o r m a n t . I f t h e i n s e r t e dDNA f r a g m e n t i s s m a l l e r t h a n 1 0 0 k b ( F i g . 3 B a n d C ) i t c a nb e p a c k a g e d b e t w e e n l o x P s i t e s a n d w i l l b e c y c l i z e d a n dr e c o v e r e d a f t e r i n j e c t i o n . M o r e o v e r , a s P 1 p a c k a g e s b y ah e a d f u l m e c h a n i s m , i t i s p o s s i b l e t o p a c k a g e m u l t i p l e v e c t o ru n i t s f r o m a l i g a t e d c o n c a t e m e r , e a c h o f w h i c h may c o n t a i no n l y a s m a l l o r , i n f a c t , n o i n s e r t ( F i g . 3 B ) . When t h a t DNAi s i n j e c t e d i n t o a C r e - c o n t a i n i n g h o s t , e a c h o f t h e DNAsf l a n k e d b y d i r e c t l y r e p e a t e d l o x P s i t e s w i l l b e c y c l i z e d . I t i sc l e a r f r o m t h i s d i s c u s s i o n t h a t t o e n s u r e t h e c l o n i n g o f m o s t l yh i g h m o l e c u l a r w e i g h t f r a g m e n t s , t h o s e f r a g m e n t s s h o u l d b es i z e s e l e c t e d p r i o r t o t h e l i g a t i o n s t e p .T h e maximum s i z e f r a g m e n t t h a t c a n b e c l o n e d b y t h e P 1v e c t o r i s = 1 0 0 k b p . S i n c e t h i s i s m o r e t h a n t w i c e t h e s i z e o ft h e f r a g m e n t s t h a t c a n b e c l o n e d i n c o s m i d v e c t o r s , i t s h o u l db e p o s s i b l e t o u s e t h e P 1 c l o n e s t o w a l k o r j u m p a l o n gg e n o m i c DNA a t l e a s t t w i c e a s f a s t , a n d w i t h g r e a t e r f i d e l i t y ,t h a n i s now p o s s i b l e w i t h c o s m i d c l o n e s . M o r e o v e r , i t s h o u l db e p o s s i b l e t o d i r e c t l y c l o n e g e n o m i c c o p i e s o f g e n e s t h a t a r et o o b i g t o b e c l o n e d i n c o s m i d s - g e n e s i n t h e 4 0 - t o 8 0 - k b pr a n g e .

I w o u l d l i k e t o t h a n k D r s . K e n n e t h L i v a k a n d B r i a n S a u e r f o r t h e i rc r i t i c a l r e a d i n g o f t h i s m a n u s c r i p t .1 . D o n i s - K e l l e r , H . , G r e e n , P . , H e l m s , C . , e t a l . ( 1 9 8 7 ) C e l l 5 1 , 3 1 9 - 3 3 7 .2 . B u r k e , D . T . , C a r l e , G . F . & O l s o n , M . V . ( 1 9 8 7 ) S c i e n c e 2 3 6 , 8 0 6 - 8 1 2 .3 . M u r r a y , N . ( 1 9 8 6 ) i n L a m b d a 1 1 , e d s . H e n d r i x , R . , R o b e r t s , J . , S t a h l , F .& W e i s b e r g , R . ( C o l d S p r i n g H a r b o r L a b . , C o l d S p r i n g H a r b o r , N Y ) , p p .3 9 5 - 4 3 2 .4 . C o l l i n s , F . S . & W e i s s m a n , S . M . ( 1 9 8 4 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 8 1 ,6 8 1 2 - 6 8 1 6 .5 . Y a n i s c h - P e r r o n , C . , V i e i r a , J . & M e s s i n g , J . ( 1 9 8 5 ) G e n e 3 3 , 1 0 2 - 1 1 9 .6 . S a u e r , B . & H e n d e r s o n , N . ( 1 9 8 8 ) G e n e 7 0 , 3 3 1 - 3 4 1 .7 . S h i m a d a , K . , W e i s b e r g , R . A . & G o t t e s m a n , M . E . ( 1 9 7 2 ) J . M o / . B i o l .9 3 , 4 8 3 - 5 0 3 .8 . S a u e r , B . & H e nd e r s o n , N . ( 1 9 8 9 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 1 7 , 1 4 7 - 1 6 1 .9 . S t e r n b e r g , N . & C o u l b y , J . ( 1 9 8 7 ) J . M o l . B i o l . 1 9 4 , 4 5 3 - 4 6 8 .1 0 . S t e r n b e r g , N . & C o u l b y , J . ( 1 9 8 7 ) J . M o l . B i o l . 1 9 4 , 4 6 9 - 4 8 0 .1 1 . V i e i r a , J . & M e s s i n g , J . ( 1 9 8 2 ) G e n e 1 9 , 2 5 9 - 2 7 4 .1 2 . A u s t i n , S . , H a r t , F . , A b e l e s , A . & S t e r n b e r g , N . ( 1 9 8 2 ) J . B a c t e r i o l . 1 5 2 ,6 3 - 7 1 .1 3 . S t e r n b e r g , N . & C o h e n , G . ( 1 9 8 9 ) J . M o l . B i o l . 2 0 7 , 1 1 1 - 1 3 4 .1 4 . B i r n bo i m, H . C . & D o l y , J . ( 1 9 7 9 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 7 , 1 5 1 3 - 1 5 2 3 .1 5 . C o h e n , G . & S t e r n b e r g , N . ( 1 9 8 9 ) J . M o l . B i o l . 2 0 7 , 9 9 - 1 1 0 .1 6 . S t e r n b e r g , N . , S a u e r , B . , H o e s s , R . & A b r e m s k i , K . ( 1 9 8 6 ) J . M o l . B i o l .1 8 7 , 1 9 7 - 2 1 2 .1 7 . A b r e m s k i , K . E . , H o e s s , R . & S t e r n b e r g , N . ( 1 9 8 3 ) C e l l 3 2 , 1 3 0 1 - 1 3 1 1 .1 8 . Y a r m o l i n s k y , M . & S t e r n b e r g , N . ( 1 9 8 8 ) i n T h e B a c t e r i o p h a g e s , e d .C a l e n d a r , R . ( P l e n u m , New Y o r k ) , V o l . 1 , p p . 2 9 1 - 4 3 8 .1 9 . R o s n e r , J . ( 1 9 7 2 ) V i r o l o g y 4 8 , 6 7 9 - 6 8 9 .2 0 . l i d a , S . & A r b e r , W . ( 1 9 7 7 ) M o l . G e n . G e n e t . 1 5 3 , 2 5 9 - 2 6 9 .2 1 . I i d a , S . & A r b e r , W . ( 1 9 8 0 ) M o l . G e n . G e n e t . 1 7 7 , 2 6 1 - 2 7 0 .2 2 . G l o v e r , S . W . , S c h e l l , J . , S y m o n d s , N . & S t a c e y , K . A . ( 1 9 6 3 ) G e n e t .R e s . 4 , 4 8 0 - 4 8 2 .2 3 . W a l k e r , J . T . & W al k e r , D . H . ( 1 9 8 3 ) J . V i r o l . 4 5 , 1 1 1 8 - 1 1 3 9 .2 4 . C a r l e , G . , F r a n k , M . , O l s o n , M . ( 1 9 8 6 ) S c i e n c e 2 3 2 , 6 5 - 6 8 .2 5 . S m i t h , C . , E c o n o m e , J . G . , S c h u t t , A . , K l c o , S . & C a n t o r , C . R . ( 1 9 8 7 )S c i e n c e 2 3 6 , 1 4 4 8 - 1 4 5 3 .2 6 . S t e r n b e r g , N . ( 1 9 8 6 ) G e n e 5 0 , 6 9 - 8 5 .

B i o c h e m i s t r y : S t e r n b e r g

2_bacteriophage p1 cloning system

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