- 1 -

الجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية

République Algérienne Démocratique Et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

Laboratoire de Microbiologie Appliquée

THESE DE DOCTORAT

En Biologie

Option : Microbiologie Fondamentale et Appliquée

Présenté par

ABEKHTI ABDELKADER

THEME

Membre du Jury :

Président : HENNI Jamal Eddine Prof. Université d‘Oran

Rapporteur : KIHAL Mebrouk Prof. Université d‘Oran

Co-Rapporteur : DAUBE Georges Prof. Université de Liège (Belgique )

Examinateur : ABDELWAHAD Djamal Eddine Prof. Université de Tlemcen

Examinateur : ABOUNI Bouziane Prof Université de Sidi Bel-Abbès

Examinateur : BENMECHERENE Zineb MCA. Université d‘Oran

Évaluation et valorisation du procédé traditionnel de conservation des dattes

« Btana » et détermination de leur biodiversité microbienne.

- 2 -

Remerciement

Au début je remercie dieu le tout puissant pour ses miséricordes et de m’avoir donner le courage et la

persévérance d’aller jusqu’au bout de cette thèse de doctorat.

Je tiens à remercie le Pr Kihal Mabrouk pour m’avoir accueilli au sein du Laboratoire de Microbiologie

Appliquée. Je tiens à remercier aussi très particulièrement le Pr. Georges Daube pour m’avoir accueilli dans

son laboratoire durant mon séjour scientifique à Liège en Belgique. Je tiens à le remercier pour son aide

précieuse, ses conseils, son « objectivité » et sa manière d’interpréter les résultats, ce qui m’a permis d’avancer

dans mon travail de recherche. Il m’est aussi d’un agréable devoir de lui adresser un grand merci pour la

sympathie, la confiance et la liberté d’action dont j’ai bénéficié tout au long de cette Thèse. Mes vifs

remerciements à mon cher collaborateur Bernad Taminau qui m’a appris le goût de la biologie moléculaire et

les analyses des donnés de séquençage. Je le remercie pour sa contribution à l’achèvement de cette thèse.

Je tiens à remercier aussi l’ensemble de l’équipe du laboratoire de microbiologie des denrées alimentaires

(université de Liège) et ceux de l’équipe de la société spin-off « Quality Partner », en particulier Guy, Nicolas,

Véronique, Carine, Assia, Laurent, Sébastien, Emilie, Sophie, Déborah, Cristina, Pedro…, et à tous les

membres du département des denrées alimentaires. Merci bien pour les bons moments qu’on a vécu

ensemble et l’ambiance qu’on a partagé pendant ce séjour de 18 mois.

Je remercie aussi les professeurs, Henni Jamal Eddine (Université d’Oran), Abdelwahad Djamal Eddine

(Université de Tlemcen), Benmecherene Zineb (Université d’Oran), et le Pr Abouni Bouziane (Université de

Sidi Bel-Abbès) pour avoir accepter de juger ce travail.

Mes remerciements vont aussi à mes chers collègues et étudiants de l’université de Biskra pour avoir veillé à

l’avancement de mon parcours scientifique et de me faciliter la tâche de la recherche. Je remercie bien sûr les

membres de ma famille particulièrement mes parents, ma femme mes frères et ma sœur pour leur

encouragement incessant.

- 3 -

الملخص

تعتبر طرٌقة الحفظ التقلٌدي للتمر المسماة بالبطانة من اشهر وسائل الحفظ لهذا المنتوج الذي ٌكثر استهلاكه

تتمحور هذه الدراسة بالتعرٌف بهذا المنتوج الغذائً وكذا توضٌح طرٌقة تصنٌعه . فً الجنوب الجزائري

من حٌث الجانب المٌكروبٌولوجً حاولنا التعرف على التنوع البٌولوجً للكائنات . على المستوى التقلٌدي

تمت الاستعانة . المجهرٌة المتواجدة فً هذا الغذاء والمتمثلة فً البكترٌا والخمائر وكذا الفطرٌات الخٌطٌة

200تقنٌة العزل استخلصت اكثر من . بوسائل تقلٌدٌة وكذا متطورة جزٌئٌة للتعرف على التنوع المجهري

عزلة خمٌرة بغرض تحدٌد خصائصها البٌوحٌوٌة ,23 عزلة بكتٌرٌة 44عزلة مجهرٌة وقد اختٌر منها

النتائج أثبتت ان البكترٌا السائدة فً هذا الوسط الحٌوي تشمل أساسا العصٌات المتبوغة . والفٌزٌولوجٌة

Bacillus وكذلك بعض الأنواع من Streptococcus salivarius, Lactobacillus saki ,

Klebsiella pneumonia.. ًاما الخمائر فقد شملت وجود المقاومة منها للضغط الاسموزي وه

Zygosaccharomyces rouxii,. Lachancea thermotolerans, Pichia subpelliculosa

Hanseniaspora opuntiae , Kluyveromyces delphensis.

فً اطار اخر تم تقٌٌم واستحداث تقنٌة لاستخلاص الحمض النووي بغرض معاٌنة العٌنات عن طرٌق تقنٌة

دعمت هاته . من الجٌل الثانً لتحدٌد القواعد الازوتٌة لحمض النووي للمجهرٌات المسماة بالبٌروسٌكونسٌن

الدراسة الملاحظة الأولى المتمثلة فً سٌادة البكتٌرٌا العصوٌة المتبوغة فً البطانة وأوضحت جانبا كبٌرا

فً جانب اخر تمت دراسة خصائص . من التنوع البٌومجهري لم ٌتم تحدده بالطرٌقة التقلٌدٌة للزرع والعزل

وقد أثبتت تاقلمها مع وسط التمر الغنً s 28 الخمائر المعزولة والمعرفة بتقنٌة الجزٌئٌة للحمض النووي

. الخصائص الانزٌمٌة اشارت الى وجود انزٌمات متخصصة باستطاعتها تفكٌك جزٌئات التمر. بالسكرٌات

وقد قمنا أٌضا بمحاكاة وسط التمر بواسطة استعمال محلول للتمر معقم للتعرف على قدرات الخمائر

المعزولة على تحمٌض التمر وافراز نتائج التخمر المسؤوولة على الحمائض التً وجدت فً بعض البطانة

الدراسة أٌضا شملت تحٌد التنوع البٌومجهري للفطرٌات عامة بواسطة التقنٌة الجزٌئٌة السابقة . المدروسة

فً عدٌد من العٌنات واظهرت أٌضا تنوع لم Zygosaccharomyces rouxii والتً أثبتت سٌادة نوع

.ٌعرف من قبل بهذه الدقة

التخمر التنوع الكائنات الدقٌقة، . الحفظ التقلٌدي. تحلٌل الحمص النووي. التمور : الكلمات المفتاحيىة

حٌوي-التشخٌص، النشاط التقنً

- 4 -

Résumé

Onze échantillons du produit dattier traditionnel Btana préparé par DBM, UBM ont fait l‘objet d‘un

dénombrement microbien et isolement des souches représentatives. L‘identification moléculaire a

démontré la dominance des bacilles sporulants dans le produit Btana. L‘analyse statistique a révélé une

différence significative dans la distribution des souches bactériennes dans les deux types de Btana. Les

tests d‘identification classique ont permis de sélectionner 42 isolats représentatifs parmis plus de 200

souches étudiées. D‘après l‘analyse du gène codant pour l‘ARN 16S, on a recensé 20 espèces

bactériennes. Avec une dominance des espèces appartenant au genre Bacillus (30.9% des espèces

identifiées). D‘autre part, 28.6% des isolats appartiennent aux genres Staphylococcus et Enterococcus.

Parmi les groupes bactériens minoritaires, deux isolats représentent le genre Peanibacillus (présents

uniquement dans le UBM) et une espèce de Streptococcus salivarius, Lactobacillus sakei et Klebsiella

pneumonia. L‘étude de l‘activité enzymatique des souches a montré que les hydrolases des sucres sont

modérément exprimées parmi les bacilles testés. Pour les analyses métagénomiques, trois protocoles

d‘extraction ont été choisis et comparés pour leur rendement et pureté d‘ADN. De par son rendement le

protocole de CTAB a permis un rendement nettement supérieur au deux autres protocoles. Les donnés de

pyroséquençage ont révélé que le phylum des Firmicutes est la plus dominante ayant 84.79% des OTUs

découverts. Ce phylum est quasi dominé par les Bacillalles (90.20%) dont le genre Bacillus est

fréquement détecté (39.53%). L‘espèce Bacillus megaterium a été observée dans tous les échantillons

toutefois sa distribution est très hétérogène. L‘analyse dupositionnement multidimensionnel non

paramétrique (nMDS) a motré que les Btana de type UBM se regroupent contrairement aux autres Btana

(DBM).

Le pyroséquençage ciblant l‘ARN 26S26S de la population fongique a montré la dominance des

Saccharomycètes dans la majorité des échantillons. L‘étude de 23 souches de levures représentatives a

révélé la présence de 5 différentes espèces dans les échantillons de Btana analysés. Zygosaccharomyces

rouxii, Lachancea thermotolerans, Pichia subpelliculosa, Hanseniaspora opuntiae et Kluyveromyces

delphensis. Le caractère osmophile représenté par un développement dans 50 et 60% de glucose a été

observé pour tous les isolats testés. Les souches ont fait l‘objet d‘une étude du pouvoir enzymatique et de

fermentation dans un extrait de datte pendant 21 jours.

Mots clés : Dattes, Phoenix dactylifera, Btana, aliments traditionnel, pyroséquençage, biodiversité

microbienne

- 5 -

Summary:

Eleven samples of the traditional date product ― Btana‖ prepared by direct and indirect

method were submitted to classical and metagenomic analysis in order to characterize their

microbial diversity. A total of 42 representative isolates were picked from all clusters and

subjected to molecular identification. 16S rRNA gene sequencing revealed the presence of 20

species within 30.9% belonged to the genus Bacillus, 28.6% of the Staphylococcus, and

Enterococcus genus. Within the minority represented species, two isolates were identified as

Paenibacillus (isolated from UBM exclusively), Streptococcus salivarius, Lactobacillus sakei

and Klebsiella pneumoniae. API ZYM test showed that the bacilli species have a weak hydrolase

activity. In order to prepare samples for metagenomic analysis we have tried 3 protocols of DNA

extraction to evaluate their yield in DNA recovery and quality. Results showed that CTAB

modified method provide the best DNA yield. Metagenomic analysis showed that Firmicutes

were the most abundant phyla with 84.79% of the total pyrosequencing reads, within, Bacillalles

represented 90.20% ±15.12% composed mainly of Bacillus genus (39.53%). Bacillus

megaterium was shared by all the samples; however its distribution varied widely among

samples. The nMDS analysis showed that the UBM samples clustered together.

Pyrosequencing of 26S26S RNA gene showed the dominance of Saccharomycetes in the

majority of the samples. Twenty three representative yeasts were isolated and identified. The

results allow the identification of five species Zygosaccharomyces rouxii, Lachancea

thermotolerans, Pichia subpelliculosa, Hanseniaspora opuntiae et Kluyveromyces delphensis,

within Zygosaccharomyces rouxii is the most represented in both metagenomic and traditional

analysis. The yeast isolates were all osmophilic and have a variable biochemical and enzymatic

profiles as demonstrated by API ZYM and fermentation assay in date extract.

Key words: Dates, Phoenix dactylifera, Btana, traditional food, pyrosequencing, microbial biodiversity

- 6 -

List des abréviations

ANOVA : Analyse de la variance

ATP : Adénosine-5'-triphosphate

BHI : Brain heart infusion

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

CCD : Charge-Coupled Device

CTAB : Bromure de cétyl triméthyl ammonium

CWBI : Centre Wallon de Biologie Industrielle

DBM : Direct Btana méthod

EDTA : Éthylène Diamine Tétra Acétique

HPLC : High-performance liquid chromatography

ITS : Internal Transcribed Spacer

MIDs : Multiduplexages

MRS : Gélose de Man, Rogosa, Sharpe

NMDs : Nonmetric Multidimensional Scaling

OTUs : Operational taxonomic unit

PCR : Polymerisation chaine reaction

PTP : Picotiterplate

PVP : Polyvinylpyrrolidone

RAPD : Random amplified polymorphic DNA

RFLP : Restriction fragment length polymorphism

UBM : Undirected Btana method

- 7 -

Sommaire

Contexte général de l‘étude : ............................................................................................................. - 14 -

Introduction ....................................................................................................................................... - 18 -

Synthèse Bibliographique ................................................................................................................. - 23 -

I- Etude de la diversité des aliments traditionnels.............................................................................. - 24 -

1- Définition des aliments traditionnels: ........................................................................................ - 24 -

3- La fermentation au service des produits traditionnels : ............................................................. - 27 -

4- Les perspectives de la fermentation en tant que moyen de conservation des aliments ............. - 28 -

II- La qualité microbiologique et la diversité microbienne des aliments traditionnels : ................ - 31 -

- Les majeurs groups microbiens impliqués dans les produits traditionnels fermentés : .................. - 34 -

b- Levures : ....................................................................................................................................... - 35 -

c- Champignons filamenteux (Moisissures) : ................................................................................... - 35 -

III- Synthèse bibliographique des connaissances sur les dattes et leur qualité microbiologique : .. - 35 -

1- La valeur nutritionnelle ............................................................................................................. - 36 -

2- Les enjeux socioéconomiques de la production des dattes en Algérie : .................................... - 37 -

3- Facteurs de détérioration de la qualité des dattes ..................................................................... - 38 -

4- La qualité microbiologique des dattes : ..................................................................................... - 39 -

a- Études de la diversité microbienne des dattes : ......................................................................... - 39 -

b- Les microorganismes impliqués dans la détérioration des dattes : ............................................ - 44 -

5- Techniques de conservation des dattes ...................................................................................... - 45 -

a- Traitement thermique: ............................................................................................................... - 45 -

b- Stockage à froid: ........................................................................................................................ - 46 -

c- Fumigation: ................................................................................................................................ - 46 -

6- Essais d‘amélioration des conditions de conservation des dattes : ............................................ - 46 -

7- Les méthodes de conservation traditionnelles des dattes : ........................................................ - 48 -

- Bajou .............................................................................................................................................. - 49 -

- Khabia ............................................................................................................................................ - 49 -

- Btana ............................................................................................................................................... - 50 -

Méthode directe ................................................................................................................................. - 50 -

Méthode indirecte .............................................................................................................................. - 50 -

IV- Outil de l‘étude de la biodiversité microbienne des produits traditionnels : ............................. - 53 -

1- L‘approche culturale .................................................................................................................. - 53 -

1-1 Limites des méthodes de culture classique : .............................................................................. - 54 -

1-2 Stratégies innovantes d‘enrichissement et d‘isolement ............................................................. - 55 -

- 8 -

2- Méthodes de culture indépendantes pour palier les limites des approches culturales : ............. - 56 -

2-1 Méthodes basées sur l‘amplification PCR : ............................................................................... - 57 -

2-2 L‘amplification aléatoire d'ADN polymorphe (Random Amplified Polymorphic DNA ou

RAPD) ............................................................................................................................................ - 58 -

2-3 Polymorphisme de longueur des fragments de restriction (Restriction fragment length

polymorphism (RFLP ): ................................................................................................................. - 58 -

2-4 l‘Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) : ............................................... - 59 -

2-5 Analyse de l‘espace intergéniques ribosomales (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis : RISA) : -

59 -

2-6 La technique d‘électrophorèse sur gel du gradient de dénaturation (Denaturating Gradient Gel

Electrophoresis –DGGE- ): ............................................................................................................ - 59 -

2-7 La TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis) : .......................................................... - 60 -

2-8 Le Polymorphisme de conformation des simples brins (Single-Strand Conformation

Polymorphism (SSCP)) : ................................................................................................................ - 61 -

3- Les techniques basées sur l‘hybridation. ................................................................................... - 61 -

3-1 La méthode d‘hybridation in-situ par fluorescence (FISH) : ..................................................... - 61 -

4- Les techniques d‘étude de la biodiversité microbienne par séquençage des gènes: .................. - 61 -

4-1 Séquençage de Sanger : ............................................................................................................. - 62 -

4-2 Technologies de séquençage de seconde génération ................................................................. - 62 -

V- La mesure de la de biodiversité microbienne : .......................................................................... - 65 -

1- Les estimateurs de richesse spécifique : .................................................................................... - 65 -

2- Les courbes de raréfaction : ....................................................................................................... - 66 -

3- Les indices de diversité : ........................................................................................................... - 66 -

- L‘indice de Simpson ....................................................................................................................... - 66 -

- L‘indice de diversité de Shannon ................................................................................................... - 67 -

- L‘indice de l‘équitabilité J .............................................................................................................. - 67 -

VI- Limites des approches modernes d‘étude de la biodiversité microbienne : .............................. - 67 -

1- Limites liées à l‘extraction et les procédés d‘optimisation: ...................................................... - 67 -

Matériel et méthodes ......................................................................................................................... - 71 -

1- Description générale du projet de thèse: .................................................................................... - 72 -

2- Matière première de préparation du Btana : .............................................................................. - 73 -

3- Prélèvement et description des échantillons : ............................................................................ - 73 -

4- Détermination des populations microbiennes ............................................................................ - 74 -

5- Identification des isolats bactériens. .......................................................................................... - 74 -

6- Identification des isolats de levures et étude de leur profil fermentaire. ................................... - 75 -

7- Optimisation de l‘extraction d‘ADN du produit Btana en vue d‘une étude métagenomique de la

microflore microbienne: ................................................................................................................. - 76 -

- 9 -

7-1 - 78 -Préparation des échantillons de Btana et de l‘extrait cellulaire : ...................................... - 78 -

7-2 Protocols A: DNeasy plant kit .................................................................................................. - 78 -

7-3 Protocols B: CTAB (modifié de Probeski et al., 1997) ............................................................. - 79 -

7-4 Protocol C : CTAB-DNeasy ...................................................................................................... - 80 -

7-5 Purification de l‘extrait d‘ADN : ............................................................................................... - 80 -

8- Évaluation de l‘efficacité des protocoles d‘extraction d‘ADN ................................................. - 81 -

a- Amplification de l‘ADN extrait ................................................................................................ - 81 -

b- Électrophorèse du produit de PCR ............................................................................................ - 82 -

c- Analyse statistiques des données de l‘extraction d‘ADN : ........................................................ - 82 -

9- Analyse métagenomique de la microflore bactérienne et fongique par la technique de séquençage

haut-débit « pyroséquençage » ....................................................................................................... - 82 -

8-1 Préparation des amorces taguées : ............................................................................................. - 82 -

8-2 Préparation de la librairie des clones ......................................................................................... - 83 -

8-3 Dosage des produits de PCR ..................................................................................................... - 83 -

8-4 Réalisation des banques et amplification clonale par PCR en émulsion : ................................. - 84 -

8-5 Le pyroséquençage : .................................................................................................................. - 85 -

8-6 Traitement des séquences de lectures et analyse des données ................................................... - 85 -

- Analyse de la qualité des séquences de lecture (reads). ............................................................... - 86 -

- Triage.............................................................................................................................................. - 86 -

- Enlèvement des bruits de fond (denoising) .................................................................................... - 86 -

- Alignement, groupement des OTUs et affiliation taxonomique des séquences ............................. - 86 -

Resultats et discussion ....................................................................................................................... - 89 -

1- Identification de souches bactériennes isolées du produit traditionnel Btana ........................... - 91 -

Article 1: ............................................................................................................................................ - 91 -

Identification of bacterial strains isolated from the traditional date product ―Btana‖ produced in south

regions of Algeria. .......................................................................................................................... - 92 -

The microbial counts recorded for the Btana samples. ........................................................................ - 97 -

Fig. 10. Phylogenetic tree of the bacteria strains isolated from Btana product prepared according to the

neighbor joining methods using BLAST logarithm ......................................................................... - 100 -

Table.5 The enzymatic profile of the representatives‘ bacilli isolated from Btana samples. ........... - 101 -

Table 6 Phenotipical clustering of the selected rods strains. ............................................................. - 103 -

Fig. 11. A: RAPD profile of representative Enterococcus species (E. mundtii: .............................. - 104 -

B: RAPD profile of representative Staphylococcus species isolated from Btana product ( ............. - 104 -

Table. 7 : phenotipical clustering of the selected cocci strains. ......................................................... - 106 -

2- Optimisation de l‘extraction d‘ADN à partir du produit dattier Traditionnel Btana ............... - 110 -

Article 2: Optimization of DNA extraction from the Algerian traditional date‘s product ―Btana‖ - 111 -

- 10 -

3- Analyse métagenomique de la flore bactérienne associée au produit traditionnel « Btana » .. - 122 -

Article 3: Metagenomic analysis of the bacterial microbiota linked to the Algerian traditional date

product ―Btana‖ ............................................................................................................................ - 123 -

4- Analyse metagenomic de la flore fongique associée au produit traditionnel « Btana » et isolement

des levures dominantes. ................................................................................................................ - 144 -

Article 4: Metagenomic analysis of the fungi microbiota linked to the Algerian traditional date product

―Btana‖ ......................................................................................................................................... - 148 -

Discussion génerale ......................................................................................................................... - 170 -

Conclusion générale et perspectives : ............................................................................................. - 179 -

Références bibliographiques ........................................................................................................... - 182 -

ANNEXES ...................................................................................................................................... - 199 -

- 11 -

Liste des tableaux

Table 1. Les principaux événements dans le développement des aliments traditionnels fermentés .... - 26 -

Tableau 2. Recueil des principaux microorganismes détectés dans les dattes .................................... - 43 -

Tableau 3. Principe, les performances et les limites de chaque technologies ...................................... - 63 -

Tableau n° Conditions de culture des groupes microbiens .................................................................. - 74 -

Table.5 The enzymatic profile of the representatives‘ bacilli isolated from Btana samples. ............. - 101 -

Table 6 Phenotypical clustering of the selected rods strains. ............................................................. - 103 -

Table. 7 : phenotypical clustering of the selected rods strains. .......................................................... - 106 -

Table. 8 Concentration and purity of crude and purified DNA from Btana samples with protocols (A, B, C)

and PCR efficiency. Different letters in the same row indicates significant different values. ........... - 117 -

Table 9. The parameters of Btana samples, PCA counts and DNA concentration ............................ - 140 -

Table 10. Summary of the metagenomic statistics of the Btana samples ........................................... - 141 -

Table 11. Distribution of the most abundant phylotypes in the Btana samples (%) .......................... - 141 -

Table 12. Composition and characteristics of the Btana samples. ..................................................... - 154 -

Table 13. Contribution of OTUs to sample differentiation ............................................................... - 159 -

Table 14. Chemical characteristics of the representative yeasts isolated from Btana samples ......... - 160 -

Table 15. result of API ZYM test of the isolated yeast ..................................................................... - 166 -

- 12 -

Liste des figures

Figure 1. Khabia (mode de préservation traditionnelle des dattes) ................................................... - 50 -

Figure 2 Btana dans un sac en plastique ............................................................................................ - 51 -

Figure 4. Btana sérvi .......................................................................................................................... - 51 -

Figure 5 . Préparation de Btana (méthode indirecte) .......................................................................... - 52 -

Figure 6. Les différentes approches moléculaires appliquées à l‘écologie des aliments. ................... - 57 -

Figure 7. Principe de T-RFLP ............................................................................................................ - 59 -

Figure 8. Principe DGGE et TGGE (Muyzer et al., 1993) ................................................................. - 60 -

Figure 9. Technologie GS 454 ........................................................................................................... - 65 -

Fig. 10. Phylogenetic tree of the bacteria strains isolated from Btana product prepared according to the

neighbour joining methods using BLAST logarithm ....................................................................... - 100 -

Fig. 11. A: RAPD profile of representative Enterococcus species isolated from Btana product…..- 104 -

B: RAPD profile of representative Staphylococcus species isolated from Btana product. .............. - 104 -

Fig. 12 0.8% Gel electrophoresis of 16S RNA amplicon products extracted from 11 Btana samples

with three DNA extraction protocols (a: DNeasy, b: CTAB, c: CTAB-DNeasy) and purified with

Nucleospin kit (P). ............................................................................................................................ - 115 -

Fig. 13 Mean values of DNA yield from three protocols A: DNeasy, B: CTAB, C: CTAB-DNeasy) and

yield after DNA purification from protocols DNeasy (AP) and CTAB (BP). The box whiskers indicate

the minimum and maximum values. ................................................................................................ - 116 -

Fig. 14 Mean values of absorption ratio (260/280) used to check DNA purity from the three protocols

A:DNeasy, B: CTAB, C: CTAB-DNeasy) and after DNA purification from DNeasy (AP) and CTAB

(BP). The box whiskers indicate the minimum and maximum values. ............................................ - 117 -

Figure 15. Diversity of major bacterial phyla in the eleven Btana samples ..................................... - 143 -

Fig. 16. Phylogenetic tree of the yeast strains isolated from Btana product prepared according to the

neighbour joining methods using BLAST logarithm ....................................................................... - 155 -

Fig. 17. Distribution of phyla in the Btana samples as identified by pyrosequencing analysis ...... - 156 -

Fig 18. Distribution of fungal family in the Btana samples as determined by metagenomic analysis- 157

-Fig. 19. Dendrogram of clusters of Btana samples generated using the Bray–Curtis resemblance

matrices with group-average linking. ............................................................................................... - 158 -

Fig. 20. Fermentation product of date extract after 48 (A), 96h (B) and 21 days (C) of yeast

fermentation...................................................................................................................................... - 161 -

- 13 -

Contexte général de l’étude

- 14 -

Contexte général de l’étude :

Dans les temps passés, les anciennes générations ont découvert que sous des conditions de conservation

particulières, certains produits alimentaires développent des aromes, flaveurs et aspects particuliers.

Certaines de ces modifications plaisent beaucoup à la population et peuvent leur procurer des bienfaits

pour la santé tout en assurant une longue disponibilité et durabilité des produits (Hsieh et al., 2008). Au

fil du temps, ces procédés traditionnels ont été hérités, reproduits, et même transportés vers d‘autres

régions par l‘exode, les campagnes de conquêtes et la migration. Ainsi le développement des

connaissances locales ont pu affiner différent procédés de transformation traditionnelle pour en produire

de nouveaux produits indigènes (Bourdichon et al., 2012). Autour de ces pratiques sont émergées des

habitudes populaires comme les festivités, célébrations, et ritualités qui sont devenues une partie

intégrante de la culture locale (Hsieh et al., 2008)

La production des aliments traditionnels se fait dans les ménages ou par de petites industries familiales

moyennant des techniques relativement rudimentaires qui constituent une voie très économique de la

conservation et la production de produits plus savoureux (Panagou et al., 2013, Gülümser et al., 2010).

Très récemment, la maîtrise des sciences des aliments ainsi que la compréhension des besoins

nutritionnels ont suscité l‘intérêt aux aliments traditionnels pour leurs attributs biologiques et sanitaires

(UNIDO, 2010). Il faut également souligner que les aliments fermentés traditionnels ont vu leur

importance croître grâce à leur typicité et leurs qualités organoleptiques originales. Dans ce contexte la

quasi-totalité des aliments traditionnels sont fermentés, et préparés à base des matières premières

d‘origine animale ou végétale et sont vus comme des écosystèmes microbiens dont l‘importance

nutritionnelle, sanitaire et sociale est indéniable (Agbobatinkpo et al., 2013 ; Nguyen et al., 2010;

Parkouda et al., 2010 ). Malheureusement ces aliments restent loin d‘être parfaitement connus et nous n‘

avons qu‘une connaissance limitée de l‘impact du procédé de préparation sur la composition

nutritionnelle de l‘aliment ainsi que sur le rôle de leur fraction microbienne. Ces produits occupent une

place importante dans l‘alimentation de nombreuses populations dans le monde et représentent un

élément important de la ration alimentaire des habitants par un approvisionnement de 20à 40%de la ration

alimentaire (Campbell-Platt, 1994), particulièrement dans certaines régions des pays en développement

- 15 -

où la réfrigération n‘est pas toujours un élément de choix en comparaison avec les procédés de

fermentation qui prolongent la durée de vie des produits et améliorent leur valeurs nutritives.

Sur le plan réglementaire, il y a eu l‘édification d‘un cadre législatif des aliments traditionnels et des

essais pour définir et établir des critères de qualité pour l'identification de l'authenticité des produits

(Bourdichon et al., 2012). Parmi les définitions retenues; on qualifie le produit traditionnel comme étant

un produit authentique fréquemment consommé ou associé à des saisons ou célébrations spécifiques, dont

le savoir faire est transmis d‘une génération à une autre, et préparé naturellement selon un mode

correspondant à un héritage gastronomique, très distingué et connu par des qualité sensorielle typique à

des pays ou à des régions particulières (Vanhonacker et al., 2013; Guerrero et al., 2009).

Récemment certains produits traditionnels fermetés ont été classés parmi les aliments fonctionnels après

avoir démontré leur contribution dans le contrôle de la physiologie de l‘organisme et la l‘apportde

nombreux besoins vitaux (Franz et al., 2014 ; Arroyo-López et al., 2011). Néanmoins le défi majeur des

produits traditionnels est l‘amélioration de leur compétitivité par la recherche et l‘identification des

innovations qui garantissent la sécurité et couvrent les besoin des consommateurs et leurs attentes. En

dehors la maîtrise de la qualité des produits traditionnels, d‘autres objectifs s‘affichent en annexe comme

la vulgarisation scientifique de ces patrimoines culturaux et sociaux par la création des bases de données

descripteuses ainsi que de questionnaires pour capter l‘avis du consommateur via à vis ces produits

(Vanhonacker et al., 2013 ). Aussi de nombreux pays dans le monde se voient en phase avec l‘évolution

des habitudes alimentaires des populations qui s‘orientent de plus en plus vers les produits naturels. Ainsi,

des programmes de recherche nationaux et internationaux ont été mis au point pour caractériser, recenser,

et mettre à niveau le système de production des aliments traditionnels. Des exemples concrets de la

sauvegarde et de la mise à niveau des pratiques traditionnelles sont rencontrés dans de nombreux pays

américains, européens, et asiatiques. Le projet européen TRUEFOOD – Traditional United Europe Food (

FOOD -CT-2006-016264) financé par la commission européenne dans le cadre de 6ème programme

cadre de recherche et de développement européen (6PCP-D) attéste de l‘intérêt grandissant donnés aux

produits traditionnels (TRUEFOOD, 2009). D‘autre part, dans le continent africain des efforts

considérables se sont consentit par les autorités locaux et en collaboration avec d‘autres institutions

- 16 -

étrangères dans le but de promouvoir la richesse culturelle traditionnelles locales à l‘instar du projet

danois-africain impliquant Danemark- Ghana, Burkina Faso, Benin et dont l‘intitulé est « Capability

Building for Research and Development in Traditional Fermented Processing in West Africa ». Un autre

exemple des projets de partenariat euro-africains orientés vers les aliments traditionnels c‘est le projet

AFTER (Africain food tradition revisited by research » coordonné par le CIRAD (Centre de coopération

internationale en recherche agronomique pour le développement - France). Ce projet mobilise des équipes

interdisciplinaires de 7 pays africains et 4 pays européens. Son ambition est d‘améliorer la qualité

d‘aliments traditionnels africains en vue de répondre aux goûts des consommateurs urbains en Afrique et

même en Europe (http://www.after-fp7.eu). D‘ailleurs il n‘est plus étonnant de voir des publications

dans des revues scientifiques prestigieuses traitant la qualité et la production des aliments traditionnels

d‘origine africaine (Compaoré et al., 2013b ; Padonou et al., 2009).

L‘aspect microbiologique des aliments traditionnels suscite d‘avantage d‘intérêt vu le rôle

primordial que jouent les microorganismes dans le développement des caractéristiques des produits

(Oguntoyinbo et al., 2011).

La décennie passée a connu une transition spectaculaire dans la compréhension de l‘écologie microbienne

des produits traditionnels grâce au développement des techniques d‘identification et de typages

moléculaires (Cocolin and Ercolini, 2008 ; Cocolin et al, 2013). D‘autres approches ont permet de

découvrir les relations entre les populations microbiennes et le développement des caractères

organoleptiques des produits ce qui a donné une vision claire sur le rôle que joue certains

microorganismes dans l‘appariation des attribues alimentaires (Jung et al., 2013). Plus loin, l‘étude de la

biodiversité microbienne a élargi les connaissances des microbiologistes en matière du contrôle et de

maîtrise des problèmes liés à la production des aliments traditionnels ainsi que la détermination de la

flore normale des produits et celle d‘origine exogène. Ainsi il est devenu possible de passer à de grande

échelle de production en toute sécurité et maîtrise de qualité finale.

Grâce à des techniques de mise en culture plus performantes mais surtout grâce à l‘utilisation de

techniques moléculaires, notre vision de la diversité microbienne dans la quasi totalité des écosystèmes,

- 17 -

des produits traditionnel, s‘est considérablement améliorée (Ercolini, et a., 2012, Ferrari et al., 2005 ;

Stevenson et al., 2004 ; Frohlich et al., 2000).

Les techniques de culture à haut débit ont permet d‘accéder à la fraction difficilement cultivable

et à l‘extraordinaire diversité microbienne et plus précisément d‘étudier la dynamique des communautés

bactériennes par des approches plus affinées (Ferrari et al., 2005 ). D‘autre part, les techniques de

séquençage haut débit de seconde génération (NGS : Next Generation Sequencing) ont permet d‘analyser

directement le matériel génétique microbien d‘un échantillon prélevé de l‘écosystème sans passer par les

techniques traditionnelles de culture et d‘isolement (Ercolini, et al., 2012).

- 18 -

Introduction

- 19 -

Les études traitant de la diversité microbienne des produits traditionnels de façon approfondie

restent peu nombreuses voire inexistantes pour certains produits indigènes. C‘est le cas du produit dattier

« Btana » préparé exclusivement dans le sud des pays de Maghreb en particulier le sud algérien. Il y en a

différentes nomination selon les régions mais le mode de production ne change pas beaucoup.

Dans le passé, les populations de la région dépendaient des dattes pour leur nourriture ainsi que

pour subvenir à leurs autres besoins par le biais de la commercialisation des dattes dans le cadre du troc

(Arditi, 1995). Aujourd‘hui le mode de vie des populations du sud algérien s‘est nettement amélioré

grâce aux différents programmes d‘agriculture lancés après l‘indépendance, ce qui a permis la

diversification des rations alimentaires et a permis l‘émergence de nouvelles techniques de culture.

Néanmoins l‘abandon des pratiques traditionnelles comme la production de Btana dans certaines localités

créerait un fossé profond entre les générations anciennes et actuelles qui s‘ajoute aux autres aspects de

pertes culturelles (comme le mode d‘irrigation traditionnel « Alfagara », le refroidissement de l‘eau par

« Garba »,..).

Pour faire une contribution à vulgariser ce patrimoine culturel, notre étude s‘est attachée, d‘une part à

caractériser le procédé traditionnel de conservation de dattes « Btana » selon les régions et les techniques

utilisées. Cependant, il existe très peu d‘informations sur cette pratique traditionnelle dont la complexité

est renforcée par une variabilité de préparation inter et intra-région. Ainsi une démarche de diagnostic

participatif a été suivie et choisie comme le seul modèle scientifique valable dans ce genre d‘étude attaché

à la sociologie et aux habitudes populaires. Sur le plan microbiologique, il a été question d‘améliorer nos

connaissances sur les communautés microbiennes qui constituent une fraction importante de la

biodiversité du Btana. Tout d‘abord, nous avons souhaité décrire la complexité de la diversité

microbienne et réaliser une synthèse regroupant tous les outils culturaux et moléculaires, récemment

développés, permettant l‘isolement et l‘identification des microorganismes, ainsi que les techniques

récemment développés comme les séquenceurs de deuxième génération. Ces approches permettront une

meilleure caractérisation de la biodiversité microbienne de l‘écosystème du Btana.

- 20 -

Sur le plan pratique, une analyse comparative des communautés bactériennes associées à ce

produit a été conduite sur des échantillons de Batna préparé selon deux méthodes de préparation (directe

et indirecte) dans trois régions géographiques (Adrar (Sali), Elmegiar, Ziban (Orlal, Tolga). En plus, il a

été question de tester les effets des paramètres spécifique des échantillons (origine, mode de préparation,

âge, pH, aw) sur la variabilité de communauté bactérienne. Les résultats des analyses métagénomiques

sont obtenus après optimisation d‘extraction d‘ADN et le pyroséquençage des petits fragments d‘ADN

16s et 26S issus de la flore microbienne présente. Pour s‘approcher davantage à la biodiversité de Btana,

il a été nécessaire d‗isoler des souches représentatives et définir leur éventuelles propriétés fonctionnelles

(physiologiques et enzymatiques) pour déterminer celles qui auraient des activités importantes dans

l‘élaboration des caractéristiques de Btana. A notre connaissance, il n'existe pas d'études relatives à

l'isolement et l'identification des germes responsables de cette fermentation. Ce présent travail se propose

de combler ce vide pour contribuer à améliorer la connaissance dans la matière et découvrir les facteurs

éventuels de maîtrise de la qualité hygiénique et nutritionnelle de cet aliment.

Au début, une étude bibliographique présente les connaissances actuelles afin de situer le contexte

socio-économique et scientifique dans lequel s‘inscrit le sujet. Cette revue bibliographique

comprend trois parties. La première partie décrit des généralités sur la place des produits traditionnels

et leurs caractéristiques microbiologiques et chimiques. La deuxième partie bibliographique s‘est

consacré à présenter de manière détaillée les connaissances actuelles sur les dattes et leur mode de

conservation ainsi que les différentes contributions faites par nombreux chercheurs pour améliorer les

conditions de conservation des dattes.

Enfin, la troisième partie présente les outils classiques et moléculaires couramment utilisés dans les

études des écosystèmes microbiennes ainsi que leurs avantages et limites.

Sur le plan expérimental, nous avons effectué des analyses microbiologiques classiques sur des

échantillons de Btana pour faire d'abord l'inventaire des microorganismes intervenant dans cette

fermentation.

- 21 -

Notre étude a été boosté par l‘utilisation de la technique de séquençage de seconde génération

« le pyroséquençage » qui nous a permet d‘étudier encore plus largement le Btana par le criblage à haut-

débit de la majorité de la diversité microbienne existante. La puissance de cette nouvelles technique a

offert des potentialités intéressantes qui aideront à élargir encore plus nos connaissances sur les

microorganismes impliquées dans la conservation de Btana. Plus loin, et en complément avec l‘approche

moléculaire, il n‘était pas question de s‘affranchir de l‘approche culturale qui s‘avère nécessaire pour à la

compréhension du fonctionnement des microorganismes dans leur écosystème alimentaire « Btana ». La

culture des échantillons de Btana, nous a permis d‘isoler plus de 200 souches. L‘identification

moléculaire a été réalisée en utilisant les marqueurs génétiques universels ADN 16s pour les souches

bactériennes et l‘ADN 26S26S pour les levures. Puis nous avons procédé à la caractérisation

biochimique, physiologique, moléculaire et enzymatiques des certaines souches représentatives

bactériennes et fongiques (levures). Les souches de levures ont ensuite fait l‘objet d‘un suivi de

fermentation in vivo de l‘extrait de dattes et dont les métabolites ont été suivis par dosage HPLC au bout

d‘une période de 21 jours.

En résumé les résultats de la partie pratique de thèse sont présentés dans 4 chapitres :

- Le premier chapitre a été consacré à l‘étude des populations microbiennes par l‘approche culturele qui a

abouti à l‘isolement et la caractérisation de plus de 200 souches.

- Le Chapitre II présente le développement d‘une méthode d‘extraction d‘ADN pour optimiser le

procédé de caractérisation moléculaire de la biodiversité microbienne qui dépendant énormément de la

qualité et le rendement en ADN génomique qui est d‘ailleurs le facteurs limitant des études moléculaires.

- Le Chapitre III est consacré à la description du microbiote bactérien grâce à une approche

moléculaire à l‘aide du pyroséquençage.

- Le Chapitre VI porte sur l‘étude de la biodiversité de la flore fongique de Btana puis une

caractérisation biochimique, enzymatique et moléculaire de 21 levures isolées. Les résultats du potentiel

fermentaire des levures dans l‘extrait de dattes sont aussi présentés.

- 22 -

Enfin, ce document comporte une discussion générale et un exposé des perspectives envisageables

pour approfondir la connaissance sur le produit traditionnel base de datte « Btana » de même que le rôle

que joue les différents microorganismes dans son élaboration et conservation.

Il est à noter, que la bibliographie de l‘introduction et de la partie synthèse bibliographique ainsi que

celui de la partie pratique soit présentée à la fin du document..

- 23 -

Synthèse

Bibliographique

- 24 -

I- Etude de la diversité des aliments traditionnels

1- Définition des aliments traditionnels:

La première étape de la compréhension des enjeux liés aux aliments traditionnels est de leur trouver une

définition qui les distingue des autres produits à caractère industriel. Les spécialistes ont définit « aliment

traditionnel » tout aliment appartenant à une culture particulière et préparé à partir des ressources locales

disponibles. Ces aliments ont une signification socioculturelles couvrant tous les aspects liés à leur la

production à savoir les techniques d‘acquisition et de transformation, l‘usage, la composition, ainsi que

les conséquences nutritionnelles de leur consommation (Kuhnlein et al., 2009)

La tendance prédominante dans les marchés agro-industriels révèle un intérêt croissant de la part des

consommateurs envers des produits traditionnels ayant leurs racines dans les différentes cultures

populaires et perçu comme authentique (Van de Kop et al., 2006). La préférence envers ce qui est

typique est, en grande mesure, une réaction face aux changements rapides qu‘entraîne la

globalisation. Cependant, si les produits traditionnels d‘origine existent depuis longtemps en tant que

réalités historiques, culturelles, économiques et sociales, ce n‘est qu‘au début des 21 siècles que ces

produits ont fait une connaissance légale et médiatiques (Kuhnlein et al., 2009). Pour cette raison,

l‘appauvrissement du patrimoine culturel lié à la production des aliments traditionnels est devenu une

situation urgente qui soulève l‘attention des universitaires et des responsables des politiques (Kwik,

2008). Les scientifiques sont devenus très intéressés par la promotion des produits traditionnels, car

ils sont conscients de leur potentiel nutritionnels et fonctionnels.

Sur le plan microbiologique, une grande partie des produits traditionnels sont l‘ouvre des

microorganismes qui constituent une partie intégrante de ces aliments et dont les caractéristiques finales

sont régie par la présence ou non des flores microbiennes particulières.

Dans les pages suivantes seront abordés, le rôle des aliments traditionnels dans l‘alimentation de

nombreuses populations dans le monde.

2- Histoire et développement de connaissance sur les produits traditionnels :

Après le séchage, la fermentation est la plus ancienne méthode de conservation des aliments. Elle est

devenue populaire avec la succession des générations, car elle ne se limite pas à la conservation des

- 25 -

aliments, mais elle permet aussi de fournir différentes variété de goûts, de formes ainsi que d‘autres

qualités sensorielles (Smid and Hugenholtz, 2010; Campbell-Plat, 1994)

La production d‘aliments fermentés a débuté comme un processus naturel dans lequel les aliments

disponibles ainsi que les conditions environnementales régnant ont permis la sélection des

microorganismes particuliers qui ont modifié et conservé les aliments. Pendant les Moyens-Âges, les

variétés des aliments et boissons fermentés dépendaient principalement des matières premières existantes

et des goûts et des préférences des populations locales (Tou et al., 2007).

Les populations se sont familiarisées avec ces produits fabriqués dans leur région et certains de ces

produits sont devenus une partie intégrante essentielle de leur régime et habitude alimentaire. Ce savoir

faire lié à la conservation des aliments a été propagé oralement loin de son lieu d‘origine d‘une région à

une autre par le biais de la migration et les différentes épisodes de conquêtes et de guerres (Prajapati and

Nair, 2008).

Les produits traditionnels jouaient un rôle social spectaculaire durant les mariages, nomination et sevrage

des nouveaux nés, et durant les festivités et les prières spirituelles (Hounhouigan et al., 1993). D‘autre

part, la fermentation des produits alimentaires assure un moyen naturel de gestion des stocks des familles

et facilite le transport des nourritures pour les paysans nomades (Simango, 1997).

D‘autre part, les produits fermentés sont une source des nutriments importants, en particulier pour les

protéines, les acides aminés, et les facteurs de croissances. Ces attributs étaient certainement méconnus

par les anciennes générations qui en ont tiré profits pendant longtemps sans le savoir (Smid and

Hugenholtz, 2010). Avec le temps, les gens ont appris les attribues thérapeutiques et nutritionnels des

aliments fermentés, ce qui a donné une plus grande popularité à ce type de produits (Hounhouigan et al.,

1993).

Actuellement on qualifie certains produits traditionnels d‘« aliments fonctionnels » dont les attributs ont

été mis en évidence par des études approfondies et des projets de recherche très vastes, par conséquence,

les connaissances liées à certains produits traditionnels se sont développées et ont même permis d‘en

produire à grande échelle commerciale (Hsieh et al., 2008).

- 26 -

Cependant, un grand nombre de ces produits restent méconnus ou non étudiés. Le tableau n°1 relate, les

principales étapes de développement de connaissance sur la fermentation et les produits traditionnels :

Tableau 1. Les principaux événements dans le développement des aliments traditionnels fermentés,

d‘après Ross et al. (2002), Prajapati and Nair (2003), avec un mis à jour.

Date ou période Development/Location

6000–4000 AC Lait aigre consommé comme aliment en inde

7000 AC Production du fromage en Iraq suite à la domestication des animaux

6000 AC Production de Vin en Proche-Orient

5000 AC Description des attributs nutritionnels et sanitaire du lait et boisson fermentés.

4000 AC Découverte de l‘utilisation des levures pour la production du pain par les

égyptiens

2000 AC-1200 Développement de différents types du lait fermenté dans de nombreuses

régions.

1750 AC Fermentation de la bière d‘orge par les sumériens

1500 AC Préparation de saucisse de viande par les anciens babéliens

300 AC Les chinois développent la conservation des légumes par fermentation

500–1000 Développement des aliments fermentés à base de légumes et de céréales

1500 Fermentation of sauekraut et de yoghourt

1851 Développement de la pasteurisation par Louis Pasteur

1877 Observation du Bacterum lactis (Lactococcus lactis) dans le lait par John

Lister

1881 Publication sur le brassage du koji et de saké

1907 Publication du livre: Prolongation of Life ; par Eli Metchnikoff qui décrit les

bienfaits thérapeutiques du lait fermetés.

1900–1930 Application de la microbiologie en fermentation par usage des souches

définies.

1928 Découverte de l‘activité antagoniste de la nisine contre des bactéries lactiques

par Rogers et Whittier

1953 Commercialisation de la nisine en Grande Bretagne et dans d‘autre pays (50

pays)

1970 –présent Développement des produits contenant des cultures probiotiques ou des

bactéries isolées des intestins (Bifidobacteria)

1990 –Présent Déchiffrement du code génétique de nombreuses bactéries lactiques isolées

des produits fermentés.

2002 La première liste validées et autorisée des microorganismes à usage dans

l‘industrie laitier par IDF et l‘EFFCA

2012 Approbation de la liste des microorgaismes GRAS à usage dans nombreux

produits fermetés par IDF et l‘EFFCA

- 27 -

3- La fermentation au service des produits traditionnels :

La fermentation entraîne des modifications importantes de l‘aliment en ce sens qu‘elle améliore les

caractéristiques organoleptiques des denrées alimentaires, leur valeur nutritionnelle et leur qualité

sanitaire (Salunkhe et al., 1985 ; Kadam, 1999). De plus, la fermentation augmente la digestibilité des

carbohydrates, et la disponibilité des micronutriments et contribue à l‘élimination d‘éléments toxiques et

de facteurs antinutritionnels existants dans certains produits végétaux (Prajapati and Nair, 2008).

De façon générale, la fermentation, consiste en une transformation de la matière première brute (d‘origine

végétale ou animale) à une variété de produits à valeurs ajoutées sous l‘action des microorganismes. Cela

montre combien la connaissance de ces acteurs microbiens est primordiale pour comprendre le processus

de fermentation mis en place. Le premier pas a été mené par le célèbre microbiologiste français Louis

Pasteur dans le 19 siècle, depuis lors, il est considéré comme le père de la fermentation microbienne

(Bourdichon et al., 2012).

Il existe plusieurs voies de fermentations, dont la fermentation alcoolique, la fermentation lactique,

la fermentation butyrique et la fermentation propionique. Les fermentations alcoolique et lactique sont

les plus connues et les plus couramment utilisées par les microorganismes. La fermentation alcoolique,

principalement réalisée par les levures telle que S. cerevisiae, produit de l‘éthanol et du CO2. La

fermentation lactique est réalisée par les bactéries lactiques pour produire principalement de l‘acide

lactique et d‘autres métabolites tels que l‘éthanol et le CO2 (Makhloufi, 2011).

De façon générale, la fermentation procure différents avantages aux aliments parmi lesquels on cite

1- La conservation et la préservation de l‘aliment via la production des métabolites inhibiteurs

comme les acides organiques (acide lactique, acide acétique, acide formique, etacide

propionique), éthanol, dioxyde de carbone (CO2), diacetyl, reuterine, bacteriocines. La

fermentation est souvent corrélée avec un abaissement de l‘activité de l‘eau ce qui va empêcher

le développement microbien (Gaggia et al., 2011).

2- La fermentation contribue à la sécurité du produit traditionnel par l‘inhibition des

microorganismes pathogènes (Adams and Nicolaides, 2008) et l‘élimination des produits toxiques

(Ray and Panda, 2007).

- 28 -

3- La fermentation améliore la valeur nutritionnelle et la qualité organoleptique du produit (van

Boekel et al. 2010).

Dans le temps actuel, on recense de centaines des produits fermentés parmi lesquels on peut citer, le lait

fermenté (Dahi, kurut, Lben, fromages, yaourt), les céréales fermentés (Cassava, Gergoush …), fruits

(fermented masau ) légumes (Idli, Hawaijar.), poissons (Jeotgal.), viande (salami , nem chua), graines

(Maari, Bikalgais, Kantong) et d‘autre produits mixtes qui ne cessent d‘émerger (Jashbhai et al., 2008 ;

Parkouda et al., 2010, Thorsen et al., 2011, Compaoré et al., 2013a ; Kpikpi et al., 2009 ; Guan et al.,

2011 ; Aidoo et al., 2006 ; Jeyaram et al., 2008 ; Nyanga et al., 2007).

La liste des matières premières à partir du quelles les produits fermentés sont fabriqués est très longue.

Généralement on admet la classification selon les critères suivants (Dirar, 1993; Iwuoha and Eke, 1996;

Steinkraus, 1997; Gadaga et al., 1999):

♦ Selon, les microorganismes impliqués dans la fermentation (levures, moisissures, bactéries)

♦ Selon le type de produit : ex ; boisson, produit céréale, produit laitier

♦ Selon la nature des produits: fruit, céréales, tubercules.

♦ Selon la méthode de préparation: back-slopping, fermentation spontanée, culture starter

♦ Selon la localisation géographique: produit originaire d‘un pays ou région spécifique ; roquefort, …

La préparation des produits traditionnels est toujours faite dans les demeures des particuliers ou sous

forme d‘une activité artisanale limitée dans l‘espace. Notons que certains produits traditionnels ont

franchit cette barrière est sont maintenant produits à grande échelle (ex : Kimchi). Dans le passé, il n‘y

avait pas des donnés fondés sur les produits fermetés ni sur leur impact économique, nutritionnel et

sanitaire. Néanmoins, ces derniers années, de nombreux articles et livres sont consacrés à ces produits

indigènes et leurs différents impacts sur tous les aspects de la vie de producteurs et de consommateurs

(Cagno et al., 2012, Arroyo-López et al., 2012).

4- Les perspectives de la fermentation en tant que moyen de conservation des aliments

La fermentation spontanée (naturelle) est réalisé par les microorganismes accompagnant la matière

première ou ceux existant dans l‘environnement ou le milieu de production. Pratiquement, la majorité des

aliments fermentés indigènes sont fabriqués de cette manière (Cagno et al., 2012). Ces aliments sont

- 29 -

produits dans les demeures à une petite échelle de production et la plupart suit des procédés similaires de

fabrication, avec une étape de trempage ou de mouillage des matières premières solides dans l‘eau et une

étape de réduction de la taille du produit à fermenter soit manuellement ou par broyage ou mouture à

l‘aide des moulins traditionnels (Prajapati and Nair, 2008). Après cela les produits sont laissé à

fermenter. Cependant, des essais d‘inoculation de la matière première par une portion ou résidus d‘un

produit pré-fermenté ont permis d‘accélérer le procédé de fermentation et ensuite d‘arriver à contrôler

tous les changement indésirables liés au goût et à l‘aspect du produit fermenté (Bourdichon et al., 2012).

Cette méthode de fermentation est maintenant généralisée et connue sous le nom de « Back-slopping »

(Nout et al., 1995; Holzapfel, 1997).

L‘intervention des professionnels a conduit au développement des cultures starters pouvant être

directement inoculées dans le produit à fermenter. Cet avancement en technique de fermentation remplit

un tas des objectifs autant qu‘il garantissent aussi l‘originalité et la typicité du produit fermenté. L‘usage

de culture starter a amélioré la fermentation, diminué l‘apport en microorganismes pathogènes, diminué le

taux des facteurs antinutritionnels, augmenté la valeur nutritionnelle du produit de même que les flaveurs

et le goût du produit fermenté (Bourdichon et al., 2012)

Pratiquement, le processus de fermentation couvre une panoplie de besoins des populations: son coût très

réduit, permet de limiter l‘altération des aliments et, dans certaines conditions, inhibe le développement

des microorganismes à risque sanitaire (Prajapati and Nair, 2008).

Dans de nombreux pays du monde, des études ont été menées sur des aliments traditionnels pour répondre

à certains nombre des objectifs.

Premièrement, préserver l‘identité culturelle et le savoir faire local lié à la production des

aliments traditionnels, car les populations indigènes souffrent d‘une perte accrue dans la connaissance

traditionnelle vu la disparition graduelle des gens âgés imprégnés des traditions de la société et

l‘indifférence permanente des jeunes générations des pratiques ancestrales jusqu‘alors héritées et

sauvegardées (Kuhnlein et al., 2009).

Un autre objectif d‘intérêt plus large s‘affiche dans la philosophie de ces études, il concerne la

protection de la biodiversité des aliments qui mène par la suite à une sauvegarde des ressources naturelle

- 30 -

utilisé pour la préparation des produits traditionnelle et ainsi la conservation des ressources génétique

disponibles (Bourdichon et al., 2012).

Parmi les objectifs visés à long terme, figure la volonté de répondre ces pratiques traditionnelles à

d‘autres régions ayant les mêmes ressources et les conditions de préparation des produits traditionnels

(Kuhnlein et al., 2009). Sur le plan scientifique, il faudra chercher les moyens techniques adéquats

répondants aux objectifs affichés ci-dessus et démontrer l‘utilité de ces aliments traditionnels sur le plan

sanitaire, nutritionnels et sociale. Les composants biologiques des aliments traditionnels sont les premiers

acteurs qui interviennent dans le développement des caractéristiques finales des produits. D‘où l‘intérêt

de les identifier et les caractériser d‘une manière approfondie pour limiter les phénomènes de défaillance

qui accompagnent souvent la production de ces aliments ainsi que le risque sanitaire qui n‘est pas

toujours écarté à toutes les étapes de la production.

Ces dernières années ont connus un bouleversement flagrant dans le Développement des

méthodologies d‘échantillonnage et d‘analyses physico-chimiques et microbiologiques, dont le résultat

est l‘amélioration des connaissances sur les communautés microbiennes impliquées dans la production

des produits traditionnels.

Les observations empiriques ont conclu que l‘activité microbienne soit déterminée par des

potentialités enzymatiques intrinsèques en fonction de l‘environnement biotique composé d‘interactions

entre les micro-organismes, et de l‘environnement abiotique dans lequel interviennent les facteurs

physico-chimiques et la composition biochimique de la matière première (Prajapati and Nair, 2008). Cette

investigation élargira notre compréhension aux problèmes de production des aliments traditionnels

(fermentation), et permettrait la découverte de nouveaux culture starters et la détermination de la diversité

microbienne du produit fermenté ainsi que la distinction entre la microflore normale essentielles au

produit fermenté et celle originaire de la contamination exogène (Lv et al. 2012). Aussi, nous pourrions

rapprocher les mystères scientifiques reliant les flaveurs et les aromes des produits fermentés à des

microflores particulières. Les chercheurs ont aboutit au résultat que la qualité du produit fermenté peut

être liée aux propriétés intrinsèques du produit tel que ses propriétés physiques, chimiques, ou

organoleptiques, et sa méthode de production et les conditions spécifiques qui prévalent durant la

production (Ramesh and Montet 2014).

- 31 -

Tous ces facteurs, favorisent la sélection des groupes microbiens particuliers qui sont adaptés et

sélectionnés pendant longtemps et dont les activités jouent un rôle essentiel dans le développement des

attributs sensoriels et à la sécurité et la conservabilité de l‘aliment. Pour ces raisons, l‘identification, le

typage et la caractérisation de ces microorganismes s‘avère de grande importance surtout pour l‘innocuité

du produit et la désignation des cultures starters afin de contrôler la fermentation et préserver les profils

sensoriel original de l‘aliment traditionnel (Guinane et al., 2005; Smit et al., 2005).

II- La qualité microbiologique et la diversité microbienne des aliments

traditionnels :

Le constat général montre que les aliments fermentés produits et consommés partout dans le monde ne

présentent pas un réel risque sanitaire pour les consommateurs, sauf dans le les pays en voie de

développement, où ces produits requièrent une attention particulière du point de vue sanitaire et

nécessitent un travail laborieux pour limiter les risques qui accompagnent leur préparation (Ramesh and

Montet 2014).

Les procédés traditionnels appliqués ne permettent pas toujours d‘obtenir des produits de qualité

hygiénique et organoleptique satisfaisante (Tamang, 2005; Jeyaram et al., 2010).

En effet certains microorganismes pathogènes sont retrouvés dans ces aliments (Abriouel et al., 2007;

Parkouda et al., 2010; Line et al., 2011) car certains germes sont capables de résister au pH acide

résultant de la fermentation comme certaines souches acido-tolérantes d‘E. coli entérohémoragique

ou de résister à des traitements thermiques par sporulation comme Bacillus cereus (Chen et al., 2009).

Les sources de contamination sont multiples. On en cite, l‘utilisation d‘une eau insalubre, les insectes et

mouches qui s‘attaquent au produit durant la préparation, la vaisselle et les ustensiles impropres,

l‘absence de l‘hygiène corporelle des manipulateurs ainsi que l‘état crasseux des lieux et de l‘atmosphère

de travail. De nombreuses études ont démontré que la fermentation spontanée des produits traditionnels

ne garantisse pas souvent la qualité du produit désiré. Cette dernière est étroitement liée à la nature des

matières premières utilisées de même que leur qualité chimique et microbiologique (Ramesh and Montet

2014)..

- 32 -

D‘autre part, l‘usage des substrats naturels et leur microflore associée, ainsi que le potentiel d‘erreurs

induites par les préparateurs engagés lors de pratique traditionnelle, aura pour effet une instabilité et

variabilité dans la qualité microbiologique de l‘aliment (Bourdichon et al., 2012).

La fermentation du produit est spontanée par la participation d‘une culture mixtes des levures,

moisissures et bactéries. Certains de ces groupes agissent en parallèle tandis que d‘autre en manière

séquentielle avec une alternance des flores dominantes durant la fermentation (Bourdichon et al., 2012).

Parmi les autres facteurs dictant la nature de la microflore développée dans les produits traditionnels on

peut citer : l‘activité de l‘eau, le pH, la température et la composition de la matrice alimentaire (Blandino

et al., 2003).

Selon un grand nombre de chercheurs, la fermentation assure elle même la sécurité du produit

traditionnel. Elle inhibe la croissance, la survie et la production des toxines pour la majorité des bactéries

pathogènes. La présence des acides organiques (particulièrement l‘acide lactique et acétique) issus de la

fermentation est le premier responsable de cet effet inhibiteur. L‘inhibition est fonction du

microorganisme concerné, de la température, la quantité de la forme dissociée de l‘acide et le pouvoir

tampon de l‘aliment qui agit en faveur des microorganismes indésirable (Ramesh and Montet 2014).

Un pH inférieur à 4 est suffisant pour inhiber le développement des bactéries pathogènes, mais le taux de

contamination dépond de certains éléments dont la quantification est très difficile, comme le niveau de

contamination de la matière première ou l‘eau ajoutée durant la préparation et le degré d‘hygiène pratiqué

durant la préparation (Adams and Nicolaides, 1997; Nout and Mortarjemi, 1997).

Les produits traditionnels sont différents en matière d‘exposition au risque sanitaire microbienne. Pour la

plus part, ce risque est moindre tandis que il s‘est avéré désastreux pour certains. C‘est le cas de flagrants

l‘intoxication causée par la consommation du produit traditionnel à base d‘haricot et de noix de coco

Tempe bonkrek (Tempe Bungkil Kelapa) originaire de nombreux cas de mortalité (40%) pendant des

années (1934, 1970's, 2007) causées par Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans (BGC) (van

Veen, 1967; Steinkraus, 1983, Somprasong et al., 2010). Heureusement, ces cas sont rarement recensés

pour les produits fermentés (Ramesh and Montet 2014). Toutefois, l‘estimation des problèmes sanitaires

originaires des produits traditionnels est difficile à faire compte tenu de la difficulté d‘établir une relation

- 33 -

de « cause-effet » entre certains toxi-infections alimentaires et le manque accrue dans les donnés de

surveillance épidémiologique (Thorsen et al., 2011).

Des travaux menés sur le comportement des bactéries pathogènes dans un nombre des produits

traditionnels ont confirmé l‘innocuité de produits traditionnels sans exclure le risque dans certaines

conditions. Le suivi de la croissance et de la survie des bactéries entéropathogènes ; Bacillus cereus

Campylobacter jejuni, et Escherichia coli entérotoxinogène dans deux types de panade; Togwa

(traditionnelle, artificielle) a montré que les panades artificielles (non inoculées par les cultures starters)

ont supporté le développement de ces bactéries pendant la fermentation (pH≥5.2) alors qu‘elles sont

totalement inhibées dans les panades traditionnelles (inoculées) après 24 à 48 de fermentation

(Kingamkono et al., 1995).

À partir de ces constats, la connaissance de la biodiversité microbienne des aliments traditionnels

s‘impose comme moyen utile pour évaluer les risques et assurer le contrôle de la fermentation et la

sécurité microbiologique de ces aliments (Guyot, 2010).

À cet égard, il y a un engouement pour l‘utilisation des critères standards pour produire les aliments

traditionnels à l‘échelle commerciale. En l‘occurrence, le concept de GRAS (Generally Recognised As

Safe: généralement considéré sûr) a été mis en place pour la première fois dans l‘Etats Unis de

l‘Amérique par la FDA (Food and Drug Administration) et dont l‘usage mondial est en plein expansion.

En revanche les européens, ont fait leur propre système de contrôle des microorganismes à intérêt

alimentaire et industriel, il s‘agit du concept ― QPS : Qualified Presumption of Safety (présomption de

sécurité). Ce concept a pour vocation d‘harmoniser les approches conduites pour l‘évaluation de la

sécurité des microorganismes utilisés dans l‘alimentation humaine et animale par les différentes autorités

et instances (EFSA 2007, Bourdichon et al., 2012 ).

Ce principe vise en priorité l‘évaluation des microorganismes présentant une incertitude ou ayant un

grand risque sanitaire (Lei et al., 2006).

La majorité des microorganismes auxquels on a attribué des effets probiotiques avaient pour origine des

aliments traditionnels ou le microbiota intestinal humain (Bourdichon et al., 2012 ; Foulquié Moreno et

al., 2006). Ainsi ils étaient toujours consommés avec les aliments ou avaient été étroitement liés aux

hommes pendants des siècles sans causer des effets indésirables (Donohue and Gueimond, 2011)

- 34 -

La Fédération Internationale De Laiterie (IDF) et l‘association européenne des fabricants de ferments à

usage agro-alimentaire (European Food and Feed Cultures Association (EFFCA) ont produit

conjointement un inventaire référencié (2002, IDF Inventory) des microorganismes utilisés dans

l‘alimentation sans danger historique (Mogensen et al., 2002a; Mogensen et al., 2002b). Cet inventaire est

affiné et mis à jours périodiquement (Bourdichon et al., 2012). Actuellement la liste est composée de 62

genres et 195 espèces bactériennes et 69 espèces fongiques (levures et moisissures) d‘importance

alimentaire (Bourdichon et al., 2012).

- Les majeurs groups microbiens impliqués dans les produits traditionnels fermentés :

Nous n‘avons qu‘une image très imparfaite des microorganismes des produits traditionnels. La nature des

microflores, leurs interactions entre elles et avec la matrice alimentaire, leur équilibre au cours de la

fermentation, leur origine, leur impact sur les caractéristiques sensorielles sont autant de pistes à

approfondir (Guyot, 2010).

a- Bactéries

Les bactéries sont omniprésentes dans les aliments, certaines sont responsables des altérations

alimentaires tandis que d‘autres comme les Clostridium sont des agents causatifs des intoxications

alimentaires très graves (Joshi et al., 2006). D‘où la complexité de s‘assurer de l‘innocuité des groupes

bactériens présents dans les aliments. Les bactéries lactiques comme Lactobacillus, Pediococcus,

Streptococcus, Oenococcus sont les principaux composants microbiens des produits fermentés

traditionnels. Les bactéries acétiques qui oxydent l‘alcool en acide acétique viennent en second lieu. Ce

dernier groupe bactérien est longtemps utilisé pour la production de vinaigre des fruits (Joshi and

Sharma, 2010).

En troisième lieu, figurent certaines espèces de Bacillus (Bacillus subtilis, B. licheniformis and B.

pumilus) qui détiennent une forte activité protéolytique et qui accumulent une grande quantité

d‘ammonium qui augmente l‘alcalinité du produit fermenté. Ce type de fermentation, connu sous le nom

de « fermentation alcaline » est souvent observé dans les aliments riches en protéines comme les haricots,

les fèves de cacao et bien d‘autres légumes (Ramesh and Joshi, 2014). Les graines des plantes comme le

sésame, le melon sont aussi favorables pour la fermentation alcaline pour en produire des produits

- 35 -

traditionnels tels que l‘orgi (graines de melon) et l‘origi saro (graines de sésame) (Battcock and Azam Ali

2001).

b- Levures :

Les levures et les moisissures sont très répondues dans la nature. Elles sont présentes sur les

vergers, les vignobles, dans l‘air, sur le sol et dans le tractus intestinal des animaux.

Il a été rapporté que les levures sont impliquées dans la production de différents types des aliments et

boissons traditionnels (Ongol and Asano, 2009). En dépit de leur présence quasi certaine, leur rôle au sein

des aliments traditionnels demeure peu investi. Certaines se sont avérées indispensables à la production

des aliments, comme les représentants de la famille des Saccharomycacae, particulièrement

Saccharomycess cerevisiae impliquée dans la production du pain et des boissons alcoolisés.

Les deux levures; Schizosaccharomyces pombe et Saccharomyces bulderi sont quasi dominantes dans

les boissons fermentés à base de maïs et de millet (Papalexandratou et al., 2013 ; Battcock and Azam Ali

2001). D‘autre part, le genre Pichia est beaucoup impliqué dans la fermentation et l‘altération des

aliments (Abriouel et al., 2011 ; Ongol and Asano, 2009 ; Martorell et al., 2007).

c- Champignons filamenteux (Moisissures) :

Les moisissures forment un groupe microbien important autant altérant que bénéfique. Les

espèces d’Aspergillus sont souvent impliquées dans la pourriture et les changements indésirables des

aliments traditionnels (Nmout, 2001). D‘un autre coté, certaines espèces de Pénicillium sont associées à la

maturation et l‘aromatisation de nombreux types de fromage (Bourdichon et al., 2012). Les Pénicillium

et les Aspergillus spp sont aussi des agents d‘intoxication majeurs par la production des mycotoxines

comme la patuline, et les aflatoxines (Joshi et al. 2013).

III- Synthèse bibliographique des connaissances sur les dattes et leur qualité

microbiologique :

La datte est parmi les fruits les plus anciens. Des traces découvertes en Iraq (Mésopotamie)

montrent que la culture des dattes fut réalisé 3000 AJC. La longévité des palmiers dattiers, sa large

distribution et la répartition de différentes cultivars, montre pour combien il est difficile d‘estimer

- 36 -

l‘origine et l‘aire de l‘apparition de cette arbre dicotylédonée (Wrigley, 1995). On croit que la culture des

dates se fût répondu depuis son origine dans le golf d‘Arabie, le moyen orient et le nord de l‘Afrique à

d‘autres régions dans le monde. Cette propagation a accompagnée l‘expansion de l‘islam pour atteindre

l‘Afrique, le sud de l‘Espagne et le Pakistan. Les dattes jouaient un rôle essentiel dans la sédentarisation

des populations dans le désert où les conditions de vie sont très hostiles (Chao and Krueger 2007).

Naturellement les dattiers sont très résistants aux conditions climatiques hostiles, son développement

optimale se fait à une température entre 12.7 à 27.5°C et peut supporter jusqu‘à 5°C et plus de 40°C. Sa

culture s‘étend dans les régions situées entre 15°N et 35°N du Maroc jusqu‘à l‘est de l‘inde (Zaid and de

Wet, 2002a).

1- La valeur nutritionnelle

Les dattes sont les fruits bien connus du palmier dattier, L‘origine de la nomination de la datte

vient du latin, « dactylus » qui l‘a emprunté au grec « dactylos », dont le sens est « doigt », par allusion à

la forme du doigt.

Le fruit du dattier est une baie, allongés mesurant jusqu'à 5 cm de longueur, ou ronde et dont

son seul noyau est à l‘intérieur du fruit et entouré par un parenchyme fibreux donnant un péricarpe

entièrement charnu.

La datte possède une composition originale qui la différencie nettement des autres fruits. Elle

est surtout commercialisée et consommée sous forme de datte sèche, c'est-à-dire partiellement

déshydratée. Elle ne renferme plus alors que 15 à 20 % d'eau en moyenne (au lieu de 65 à 70 % dans la

datte fraîche). Elle concentre évidemment sa matière sèche, ce qui entraîne des modifications sensibles

dans sa composition, et lui donne des caractéristiques nutritionnelles tout à fait particulières (Vayalil,

2012). La teneur en glucides de la datte sèche atteint 64 à 69 % c'est-à-dire 3 à 5 fois ce que l'on trouve

dans les fruits frais. Cette teneur est comparable à celle des autres fruits séchés du marché (60 à 65 %

pour l'abricot, la banane, la poire ou la pomme séchés, 66 % pour le raisin sec). Il s'agit en majorité de

fructose et de glucose (chacun représentent environ les 2/5 des glucides totaux), et pour une moindre part

de saccharose (environ 1/5 du total). On note aussi la présence de petites quantités de sorbitol.

- 37 -

Les dattes présentent des teneurs faibles en composés protidiques, généralement moins

de 3% et de 0,5 à 1 % dans les fruits frais. La composition des lipides reste très faible (moins de 1 %)

selon Vayalil (2012).

Les minéraux et les oligo-éléments sont remarquablement abondants dans ce fruit : la datte sèche

en renferme 1,5 à 1,8 g aux 100 g (2 à 3 fois plus que les fruits frais). C'est un des fruits les plus riches en

potassium (plus de 677 mg aux 100 g), en calcium (62 mg) et en magnésium (58 mg), ainsi qu'en fer (3

mg). Le cuivre, le zinc, le manganèse sont également présents à des niveaux intéressants.

Le profil vitaminique de la datte sèche se caractérise par des teneurs tout à fait appréciables et

variables selon les types de dattes et leur provenance. Particulièrement les caroténoïdes et les vitamines

du groupe B sont présents en quantités appréciables, Par contre, la vitamine C (qui atteignait 15 mg dans

la datte fraîche) a disparu totalement dans la datte séchée (Munier, 1973).

La datte séchée est l‘un des fruits les plus riches en fibres : elle en apporte de 8.1 à 12.7 % du

poids sec (Al-Shahib and Marshall, 2002). Il s'agit pour l'essentiel plus de 85 % des constituants

pariétaux insolubles, la pectine, la cellulose, l‘hémicellulose et la lignine selon Benchabane (1996).

Les acides aminés suivants sont rapporté dans les dattes: Isoleucine, Leucine, Lysine,

Méthionine, Cystine, Phénylalanine, Tyrosine, Thréonine, Tryptophane, Valine, Arginine ,Histidine,

Alanine, Acide aspartique, Acide glutamique, Glycocolle, Proline, Sérine (Elleuch et al., 2008).

Enfin, des études récentes ont montré que la consommation des dattes réduit le risque de

diverses maladies chroniques. Elles ont aussi une activité antioxydant due à la présence de composés

hydrosolubles ayant un effet d'élimination des radicaux libres telle que les composés phénoliques

(principalement les acides cinnamiques) et les flavonoïdes (Al-Humaid et al., 2011 ; Boudries, 2007).

2- Les enjeux socioéconomiques de la production des dattes en Algérie :

L‘importance socio-économique et environnementale de la phœniciculture est indéniable. En

effet, la culture des palmiers dattier est souvent menée en culture mixte avec d‘autres catégories de

plantes. Ceci a permis la stabilisation et la subsistance de nombreuses familles.

Dans les oasis des régions sahariennes et présahariennes, le patrimoine génétique du palmier

dattier est exceptionnel. Jaradat and Zaid (2004) ont rapporté plus de 1500 variétés connues à l‘échelle

mondiale, rien qu'en Algérie, on a inventorié plus de 940 variétés (Hannachi, 1995).

- 38 -

En Algérie la phoeniciculture couvre une superficie très importante dans le sud du pays, elle

s‘étend sur l‘ensemble des régions du sud-est du pays : région de Ziban, Oued-Righ, Tolga, Ouargla,

Oued-souf et dans le Sud-ouest : région de Touat, Tidikelt, Gourara et Beni Abbasse (Acourene et al.,

1997). Le palmier dattier occupe, actuellement, une superficie de 120830 ha soit environ 3% de la surface

agricole utilisée au niveau de 17 wilayas seulement. Le nombre de palmier est estimé à 13.000.000 avec

une production de 400 000 Tons de dattes dont 50 % est représenté par la variété noble Deglet-Nour

(Kacem-Chaouche et al., 2005). Cependant 4 wilayas représentent 83,6% du patrimoine phoenicicole

national : Biskra 23%, Adrar 22%, El-oued 21% et Ouargla 15% (Anonyme, 2002).

Sur le plan mondial la production des dattes a été chiffrée à 5,09 millions de tonnes en 2007 (FAO,

2007). Quantitativement l‘Algérie représente 7% de la production mondiale mais du point de vue

qualitatif elle occupe le premier rang grâce à la variété Deglet-Nour, la plus appréciée mondialement

(Beni Abbas, 2011).

3- Facteurs de détérioration de la qualité des dattes

De part leur faible teneur en eau, les dattes pourraient être facilement stockées sans conditions de

conservation particulières, pourtant, l‘industrialisation de la production des dattes, le conditionnement et

le stockage nécessite l‘usage des équipements et moyens sophistiqués.

Les dattes sont soumises à des altérations physiques et biologiques par l‘effet des facteurs climatiques et

le développement des microorganismes nuisibles.

Un taux d‘humidité très fort limite la maturation des dattes en agissant sur la transpiration. On a démontré

qu'un degré hygroscopique environ 6-90 % empêche toute maturation et entraîne des accidents

physiologiques chez les dattes non encore mures par engorgement d'eau par les dattes et qui finissent par

éclater. En revanche une humidité très faible provoque un desséchement des dattes qui deviennent

dépréciées. D‘autre part une forte précipitation au moment de la maturation des dattes, provoqueraient des

craquelures dans la peau et de pourriture des dattes, cet accident est fatal pour la récolte.

De même, le stockage des dattes à des températures élevées est accompagné d‘un noircissement de la

peau des dattes et le dépôt des cristaux de sucres sur les fruits.

- 39 -

Sur le plan biologique, les levures sont les agents les plus importants d‘altération de la datte. Les levures

les plus observées appartiennent aux genres: Saccharomyces, Hanseniaspora et Candida. La

contamination est étroitement liée à l‘humidité de l‘atmosphère qui est responsable de la détérioration des

fruits en une courte durée de conservation (El-Shaick, 1986). À leur tour, les bactéries sont responsables

de l‘aigrissement des dattes par suite de fermentation des sucres en acide lactique ou acide acétique

(Tantaoui et Boisson, 1991). Les insectes ravageurs dégradent les dattes stockées et causent une perte de

poids et une dépréciation de la valeur commerciale du fruit. Elles sont dues essentiellement au Myeloîs

phoenicie (ver de la datte) et à Oligonychus afrisiaticus (Bouferoua) (Ferry, 1995).

Les parties suivantes relatent les principaux travaux réalisés les groupes microbiens responsables de la

détérioration des dattes ainsi que les techniques d‘amélioration de leur conservation.

4- La qualité microbiologique des dattes :

Il est utile de préciser que ce rapport ne reprend pas l‘intégralité des études ayant trait aux dattes, mais

seulement les travaux présentant un aide méthodologique ou constituant une base référentielle en matière

d‘approche scientifique envisageable et réalisable pour déboucher à l‘étude du produit traditionnel à base

de datte « Btana ». D‘autre part, il est fort à constater qu‘aucune étude à ce jour ne s‘est intéressée à la

biodiversité des dattes traditionnellement conservées en matière de microflore (indigène, apportée).

La plupart des articles consultés sont orientés vers l‘aspect biotechnologique et l‘exploitation industrielle

et pharmaceutique des dattes, comme l‘activité antioxydant des dattes, la bioconversion de ses

carbohydrates en molécules à valeur ajoutée (acide citrique, acide lactique…) ou la valorisation de sous

produit des dattes (Dattes à faible valeur marchande, noyaux) en jus, vinaigre, crème, sirop et en

production de biomasse. Le nombre des études consacrées à l‘étude de la qualité microbiologique des

dattes sont rares et font pour les plus part l‘objet d‘un simple dénombrement et description de la

microflore associées aux dattes.

a- Études de la diversité microbienne des dattes :

Il n‘y a pas une espèce particulière qui domine les dattes qui peut être considéré comme la flore originale

des dattes vu la variabilité des espèces fréquemment isolées des dattes (Tableau. 2). Pourtant, il y a une

tendance d‘isolement fréquent des espèces appartenant au genre Aspergillus (A. niger, A. flavus et A.

- 40 -

ochraceus ) qui ont dominé certains dattes originaire de l‘Egypte : Abdel-Sater and Saber, 1999 ; Ragab

et al., 2001) UAE : Shenasi et al., 2002) Maroc : Hasnaoui et al (2010), KSA : Hammed, 2012). En plus

Djerbi (1983) a constaté que les moisissures communément détectées sur les dattes appartiennent au

genre Aspergillus, il les considère même les principales espèces responsables de l‘altération des fruits des

dattes avec les espèces d’Alternaria. Les espèces de Penicillium sont détectées en moindre importance

(Abdel-Sater and Saber, 1999 ; Ragab et al., 2001).

Taouda et al (2013) ont montré que toutes les variétés de dattes analysées (14 variétés) sont contaminées

par les levures (0.6 à 4.9 Log10 ufc/g) et les moisissures (0.5 à 3.8. Log10 ufc/g). 50% des levures isolées

appartiennent à Saccharomyces cervisae alors que les autres levures appartiennent à Zygosaccharomyces

fermentati, Hansenula anomala, Lodderomyces elongisporus et Kluyveromyces fragilis. Les moisissures

sont représentées par Aspergillus niger (l‘espèce majoritaire), Penicillium notatum et Rhizopus oryzae.

L‘étude met en évidence une importante contamination par les GAMT (0.6 à 4.9 Log10 ufc/g) et les

bactéries sulfutoréductrices (0 à 4.9 Log10 ufc/g ) et l‘absence des coliformes. En revanche, les

coliformes, Staphylococcus aureus et Salmonella, n‘ont pas été détectées. L‘étude révèle que les deux

variétés Lulu et Degluet nour sont moins prônées à la contamination microbienne, tandis que la variété

molle Boufeggous est la plus contaminée. Cette observation semble contradictoire autant qu‘Atia (2011)

ait constaté que la variété de Degluet nour a été la plus contaminée parmi les dattes analysées (Asabei El-

Arose fut le moins contaminées). À notre connaissance, la composition des dattes varie considérablement

entre les cultivars, mais il n y‘ a pas des concrètes évidences sur leur relation avec la susceptibilité des

variétés des dattes au développement microbienne. Cette observation a été confirmée par Al Jasser (2010)

qui a montré que la variété de Khlas est très sensible à la contamination microbienne contrairement à la

variété Sukri résistante au développement microbien. Ces études nécessitent d‘autres expérimentations

pour déceler les réels facteurs impliqués dans cette distribution hétérogène des microorganismes dans les

dattes.

Al Hazzani et al ( 2014) ont fait une étude exhaustive sur la qualité microbiologique de 12 variétés des

dattes collectés de trois marchés en Riyadh, Medina et Al Kharj en Arabie Saoudite, toutes les variétés

de dattes étaient contaminées par les moisissures tandis que les bactéries sont détectées dans quelques

variétés uniquement. Au totale 20 espèces représentant neuf genres (Aspergillus, Penicillium, Fusarium,

- 41 -

Rhizopus, Curvularia, Cladosporium Alternaria, Bipolaris, et Mucor) de moisissures ont été détectées.

Aspergillus niger constituait l‘espèce dominante. Cette dernière et trois autres espèces (A. flavus F.

oxysporum, F. solani) furent isolées de toutes les variétés analysées. De même 6 espèces de Bacillus (B.

subtilis, B. thurengenesis, B. stearothermophilus, B. brevis, B. mycoides, et B. megaterium) ont été

détectées sur les variétés des dattes qui présentent une contamination bactérienne.

Moore et al (2002) ont examiné des dattes fraiches commercialisées en Arabie Saoudite. Le nombre

moyen des champignons rencontrés est 5,3 x102 UFC/g, constitué d‘un mélange de deux types de clonies

fongiques. L‘analyse des séquences ITS de l‘ARN 5.8S-26S des colonies isolées, a permis

l‘identification de deux espèces appartenant à Cladosporium cladosporioides et Sporobolomyces roseus.

Ces deux champignons sont déjà connus pour leur implication dans des infections opportunistes d'origine

fongique. Au terme de cette étude, les auteurs recommandent une vigilance lors de la consommation des

dattes et un respect des bonnes pratiques hygiéniques. Pareillement, Shenasi et al (2002) se sont

intéressées au suivi de l‘évolution de la microflore des dattes au cours de la maturation. Pour cela, il ont

analysé vingt cinq variétés de dattes durant différents stades de maturation, ces analyses ont porté sur la

détermination du nombre total des bactéries mésophiles, , la présence des aflatoxines, d‘Aspergillus

aflatoxinogène et de bactéries lactiques. Les prélèvements ont été réalisés aussi bien sur les dattes fraiches

que sur des dattes stockées en conditions d'humidité élevée. Les résultats obtenus montrèrent que le taux

de micro-organismes était très élevé durant le premier stade de maturation « Kimiri » mais il diminua

durant le stade de maturation suivant " Rutab " et continuait à décroitre à la fin du dernier stade de

maturation "Tamar". Les aflatoxines ont été détectées dans 12% des échantillons, alors que les

Aspergillus aflatoxinogènes ont été isolées depuis 40% des échantillons analysés, et ceci durant le stade

de Kimri seulement. Les bactéries lactiques ont été observées durant le stade du Rutab dans certaines

variétés.

Dans une autre étude Al-Shaickly et al (1980) ont déterminé l‘ampleur de la contamination des dattes

durant la maturation, ils ont suivi l‘apparition de la flore fongique et bactérienne sur 4 variétés de dattes

iraquiennes, ceci leurs a permis de constater que la contamination par les bactéries et les levures

n‘étaient pas régulière contrairement aux moisissures qui étaient présentes durant tous les stades de

maturation. En plus les analyses de ces dattes ont montré que le nombre de moisissures augmente en

- 42 -

fonction de la maturation, ce qui donne un nombre élevé au moment de la récolte lors de la maturation

complète des dattes. D‘autre part, il y a peu des études sur la qualité microbiologique des dattes produites

en Maroc et la Tunisie, les deux pays voisins de l‘Algérie et avec lesquels serait très utile de faire une

comparaison de la diversité microbienne des dattes vu leur proximité et les conditions géo-

environnementales et sociales similaires à ceux en Algérie. Au Maroc Hasnaoui et al (2010) confirme la

susceptibilité des dattes au développement des champignons.

Les différents travaux réalisés sur la qualité microbiologique des dattes sont focalisé sur la contamination

par les champignons filamenteux et peu d‘études se sont intéressées à la totalité de la microflore

microbienne (Hammed 2012, Hasnaoui et al (2010). Certes les moisissures font la microflore majoritaire

de dattes récoltées, mais ce groupe microbien devient minoritaire au cours de la conservation sous froid

ou après un traitement physique ou chimique comme il a été prouvé par plusieurs auteurs (Hammed,

2012). Donc le risque est limité aux dattes en frac n‘ayant subit aucun traitement préalable.

Sur le plan ethnobotanique, les dattes sont depuis longtemps considérés avoir des aptitudes

antimicrobiennes contre les microorganismes pathogènes. De ce fait, l‘engouement des chercheurs a été

suscité afin de valider cette observation empirique. Les travaux de Pr Sallal AK (1989) sur l‘effet de

l‘extrait de la variété Bahri sur le développement de Staphylococcus aureus, Salmonella typhi,

Pseudomonas aeruginosa et Bacillus subtilis. L‘extrait à 20% (w/v) a permet une inhibition de 80 à 90%

des isolats testés et la germination des spores de B. subtilis (100%). Par ailleurs, l‘observation par le

microscope électronique a montré une modification de la structure de la paroi cellulaire de B. subtilis

(Élongation et dépression) sous l‘effet de l‘extrait de datte. Plus tard l‘auteur, a montré, dans une autre

étude l‘effet antibactérien de l‘extrait de datte sur Streptococcus pyogenes et son activité hémolytique.

Le collaborateur de Sallal et al (1999), Shraideh et al (1998) a affirmé que l‘extrait de datte est aussi

efficace dans les traitements prophylaxiques contre la levure infectieuse Candida albicans.

- 43 -

Tableau 2. Recueil des principaux microorganismes détectés dans les dattes Moisissures Levures Bactéries Type de datte Techique d‘Identification

Ibrahim, S.

and Rahma,

2009

Bayero

University,

Kano,

Nigeria

Rhizopus sp. (Mucor sp. Torula sp.

Penicillium sp. Aspergillus sp.

Alternaria

ND ND Dattes marché Classique

Hashem et al

2014

Arabie

Saudi

(Abha)

ND Zygosaccharomyces rouxii,

Hanseniaspora(H.

guilliermondii, H. uvarum ,

H. Opuntiae)

Pichia kudriavzevii,

Issatchenkia orientalis

Wickerhamomyces anomalus

Yarrowia lipolytica ,

ND Datte pourries D1/D2 domain of the 26S

rRNA gene

Al Hazzani, et

al., 2014

Arabie

Saudi

Aspergillus (A.niger, A. flavus, A.

terreus)

Alternaria alternate

Penicillium stolonifer

Fusarium (F.oxysporum, F. Solani

F.monoliforme)

Rhizopus stolonifer

Curvularia lunata

ND Staphylococcus aureus ,

Escherichia coli Bacillus(

Marché Classique , API 50 CH/ B

Ragab et al.,

2001

égypt. Aspergillus (A. niger, A. flavus, A.

ochraceus)

Penicillium chrysogenum

ND ND Marché Classique

Abdel-Sater

and Saber

(1999)

Aspergillus,

Penicillium

ND ND Marché Classique

Hammed 2012 Arabie

Saudie

(Al-

Hofuf)

Aspergillus (A. niger. A. flavus. A.

parasiticus).

Zygosaccharomyces mellis,

Debaryomyces hansenii,

Candida lipolytica,

Torulaspora delbrueckiiwer

Coliformes,totaux et

fécaux.

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Dattes

conditionnées

Classique

Hasnaoui et al

2010

Figuig,

Maroc

Aspergillus niger NI Coliform, Bacillus,

bactéries lactiques

staphylococcus

Dattes matures Classique

Taouda et al.

(2013)

Morocco

(Fez )

.

Aspergillus niger,

Penicillium notatumand

Rhizopus oryzae.

Saccharomyces cervisae.

Zygosaccharomyces

fermentati

Hansenula anomala.

Lodderomyces elongisporus

Kluyveromyces fragilis

Bactéries aérobies totales

les bactéries

sulfitoreducteurs

Marché Classique

Aidoo et al.

(1996),

Glasgow Aspergillus flavus

A. parasiticu

NI coliform

Staphylococcus aureus

Escherichia coli, Bacillus

cereus lactic acid bacteria

Dattes

conditionnées

Classique

Risiquat, 2013 Nigeria. NI NI Staphylococcus aureus,

Streptococcus sp

Proteus mirabilis,

Enterobacter sp

Escherichia coli

Salmonella sp.

Dattes molles

et sèches

Classique

Al Jasser,

2010

Arabie

Saudie

(Riyadh et

al hasa)

NI NI Bactéries aérobies totales

Bactéries sporulées

Dattes

conditionnées

stokée à

diféretes

températures

Atia, 2011 Libya Aspergillus (A. niger, A. flavus, A.

ficuum, A. japonicus, A. phoenicis, A.

terreus et A. caesilleus),

Cladosporium (C. cladosporioides),

Penicillium (P. chrysogenum, P. brevi-

compactum, P. digitatum, P. duclauxi,

P. frequantans, P. spinulesum, P.

purpurogenum, P. uriticae)

Fusarium (F. oxysporium et F.

moniliforme).

Mucor (M. hiemalis et M. racemosus)

Chalaropsis state

NI NI Marches et les

particuliers

Classique

Moore et al

(2002)

El Ahssae ,

Arabie

Saudie

Cladosporium cladosporioides Sporobolomyces roseus ND Marches l'ARN 5.8S-26S (ITS)

Abekhti et al.,

2013

Algeria

(Adrar)

ND ND Coliforms fécaux

Klebsiella (K. terrigena,

K. pneumonia et K.

oxytoca)

Yersinia enterocolica

S. aureus

Produit à base

de Datte

« Btana »

Classique, API 20 E

- 44 -

b- Les microorganismes impliqués dans la détérioration des dattes :

Les dattes sont particulièrement vulnérables à la pourriture surtout après de fortes pluies durant les

derniers stades de leur maturation. L‘altération pourrait même avoir lieu dans des mauvaises conditions

de gestion de stock.

Récemment Hashem et al. (2014) ont exploré la diversité des levures des dattes pourries. L‘observation

microscopique a confirmé le développent des levures dans les tissus des dattes visiblement pourries. Les

auteurs ont analysé les séquences du domaine D1/D2 du gène ARN 26S pour identifier 10 levures

isolées des dattes pourries. Ainsi six genres ont pu être identifiés, il s‘agit de 3 espèces représentatives du

genre Hanseniaspora spp (H. guilliermondii, H. uvarum KKUY-0078 et H. opuntiae KKUY-0152). Les

autres espèces isolées sont Pichia kudriavzevii, Yarrowia lipolytica, Wickerhamomyces anomalus,

Zygosaccharomyces rouxii et Issatchenkia orientalis.

L‘équipe a conclu que la pourriture des dattes est manifestée par une fermentation alcoolique due au

développement des levures. Pour cette raison ils ont comparé leur potentiel de production d‘éthanol à

partir d‘extrait de datte. Les résultats ont montré que la quantité d‘éthanol produite ne varie pas

considérablement entre les espèces, elle est comprise entre 48.44 et 67 g/l. Les deux espèces P.

kudriavzevii et H. uvarum sont les plus performante en matière de production d‘éthanol alors que Z.

Rouxii et Y. lipolytica sont modérément les moins productive.

Dans la même démarche, Ibiso (1988) a isolé 4 moisissures depuis des dattes stockées en vracwx,

Aspergillus niger, Botryodiplodia theobromae, et quelques espèces de Rhizopus et Penicillium.

Il a rapporté que B. theobromae a provoqué chez les dattes une maladie de stockage connue par :

« Black Rot ». Les fruits infectés sont recouverts au bout de deux jours d‘infection d‘un mycélium gris.

La datte devient noire dans le huitième jour et au fur et à mesure de l‘avancement de l‘infection, les fruits

perdent progressivement leurs valeurs nutritives, et dans le 20ème

jour le taux de sucres a baissé de

98,85%, conduisant à une énorme perte de récolte. Dans une autre étude Salik et al (1979) ont porté une

intention particulière à la détérioration des dattes molles, ainsi ils ont mis en évidence le rôle des levures

et des bactéries lactiques dans la diminution de la période de préservation des dattes conditionnées. Selon

cet auteur, L‘altération de dattes se manifeste, par abaissement du pH ce qui rend les dattes aigres et par

- 45 -

conséquent, dépréciées par les consommateurs. Pour rappel, le premier travail apparu dans la littérature

portant sur l‘état microbiologique des dattes, remonte aux années 1931, lorsque Melliger (1931) a

constaté que les variétés égyptiennes dites « Amhat » ont suffisamment de sucres pour inhiber la

croissance de levures, alors que les variétés dites « Hayami » n‘ont pas suffisamment de sucres, ce qui

les rend sensibles à la croissance et l‘acidification par les levures. Ce constat a été confirmé par Mark

(1940) qui a montré l‘incapacité de levures à se développer sur des dattes américaines riches en sucres

(65-70% du poids sec). Mark (1940) ajoute que l‘acidification des dattes est due non seulement aux

levures mais à d‘autres groupes microbiens, à savoir les bactéries acétiques et les bactéries lactiques.

5- Techniques de conservation des dattes

Il existe différentes techniques qui s‘avèrent utile pour éviter la détérioration de la qualité des dattes

(Barreveld, 1993). Ces techniques sont classées en traitements non thermiques qui englobent la

fumigation, l‘irradiation et le conditionnement sous atmosphère modifiée. Parmi les techniques de

conservation thermique on note le traitement thermique, la déshydratation, le stockage à froid et la

transformation en confiture. Parmi ces techniques, la fumigation est le procédé le plus apprécié et utilisé

par les conditionneur de dattes.

a- Traitement thermique:

Le traitement thermique est parmi les méthodes conventionnelles qui assurent la sécurité et augmente la

durée de validité des aliments. Par ce procédé le risque microbiologique associé aux dattes est très réduit

Holdsworth, 2004). Le traitement détruira les insectes présents, et diminuera l‘activité des enzymes et

affectera le développement microbien (Homayouni et al., 2014).

La stérilisation complète des dattes est impossible du fait de la fragilité de la chair des dattes. Pour cette

raison on applique une pasteurisation partielle de 60 à 65°C dont l‘effet est suffisant pour prolonger la

durée de vie des dattes (Barreveld, 1993). D‘autre part, une maturation artificielle est réalisée grâce à

l‘accélération du processus d‘inversion enzymatique et l‘élimination des tannins.

- 46 -

b- Stockage à froid:

Le stockage à froid assure une durabilité des produits alimentaires, il réduit l‘activité microbienne, inhibe

les enzymes végétales et ralentie les réactions chimiques et biologique. L‘effet de ce type de conservation

sur la qualité microbiologique des dattes est détaillé plus loin

c- Fumigation:

Neuf type de gaz fumigeant sont utilisés pour la conservation des dattes, actuellement deux gaz sont

d‘usage courant, il s‘agit du Reldan (méthyle de Chlorpyriphose) et de la phosphine (PH3).

Le bromure de méthyle (BrCH3), anciennement utilisé comme gaz de fumigation par les conditionneurs a

été banni d‘usage dans certains pays (le Règlement européen CE1005/2009 l‘a interdit à partir du 19 mars

2010). Le phosphure d'hydrogène ou phosphine (PH3) ne présente pas les mêmes performances que le

BrCH3 contre la pyrale de datte (Ectomyelois ceratoniae) et la flore microbienne qui est lui associée.

C‘est pourquoi la recherche d‘une alternative au bromure de méthyle s‘est imposée

6- Essais d’amélioration des conditions de conservation des dattes :

La sauvegarde des dattes contre la contamination microbienne a été l‘objet d‘un nombre limité d‘études

(Jemni et al, 2013 ; Jemni et al, 2014, Attia, 2011 ; Mrabet et al, 2008 ; Hammed, 2008 ; Al Jasser, 2010)

dans une perspective de remplacer les méthodes de conservation conventionnelles basées sur l‘utilisation

des produits chimiques par des méthodes douces et durables.

Notre recherche bibliographique a été restreinte aux études sérieuses qui emploient des moyens

techniques fiables et dont les débouchés sont utiles à notre travail.

Jemin et al (2014), ont tenté de mettre un procédé de conservation physicochimique utilisant les rayons

UV-C, l‘ozone (O3) et l‘eau ionisée (alcaline et neutre). Une combinaison du traitement par les rayons

UV-C (6, 22 kJ m2) et l‘ozone O3 (0, 55 mg/l) a donné une réduction de 1, 63 log ufc/g pour les levures

et moisissures et de 0,8 log ufc/g pour les germes totaux et de 1,11 log ufc/g pour les coliformes. D‘autres

résultats satisfaisants ont été obtenus par d‘autres techniques de préservation basées sur l‘eau ionisée. Les

effets secondaires de ces techniques sur la qualité physicochimique des dattes furent négligeables.

Hammed (2013) s‘est intéressé à la qualité des dattes produites et conditionnées en Arabie Saoudite. Son

premier travail s‘est consacré à l‘impact des conditions de conditionnement et de stockage sur la qualité

- 47 -

microbiologique des dattes pendant 6 mois. En premier lieu il a évalué la microflore totale après le

processus du conditionnement qui comporte les étapes suivantes : rinçage des fruits à l‘eau, lavage à

l‘aide de l‘eau chlorée, puis un séchage avec l‘air chaud et finalement le conditionnement sous vide

partiel dans des sacs de polyéthylène très épais. Les sacs conditionnés sont ensuite stockées à froid (4-

7°C). L‘analyse des dattes fraichement conditionnées a montré la présence d‘une grande concentration

des germes totaux mésophiles : 103-10

5 ufc /g et les moisissures : 10

2-10

3 ufc /g (Aspergillus niger a été

identifié dans 95% des isolats). Le nombre de levures détectées se situa entre 76 et 1,4 x102 ufc/g dans

50% des échantillons analysés. L‘auteur attribua la contamination par les moisissures au fait que les

dattes sont récoltées au cours de deux mois secs et venteux; Juillet et Aout, ce qui facilite la

contamination des fruits par les spores des moisissures. L‘autre constat important, est la diminution de la

contamination au fur et à mesure du stockage à froid. Après deux mois de stockage le taux de

contamination par les germes totaux a baissé par 2 à 3 logs. Les moisissures et les levures ont persisté

pendant cette période de stockage, néanmoins leur nombre a été considérablement réduit. Un grand

nombre d‘isolats ont été assignés à Zygosaccharomyces mellis, réputée pour son caractère psychrophile

(Barnett et al., 2000). Le même auteur l‘avait identifiée comme étant le principal agent d‘altération des

dattes au stade du Rutab (Hamad, 2008). Le 4ème

mois de conservation a confirmé la tendance à la

diminution de la microflore microbienne et fongique, toutefois les levures ont pris le dessus et devinrent

la microflore majoritaire. Les analyses ont permis l‘identification de deux levures à savoir Z. mellis,

Candida lipolytica. De même pour les échantillons stockés pendant 6 mois, les spécifications

microbiologiques sont largement respectées sauf un échantillon, où le nombre des levures a atteint

4,1.103 UFC/g composé principalement de Debaryomyces hansenii et Torulaspora delbruecki. De cette

étude, il ressort que le procédé de stockage contribue efficacement à l‘élimination d‘une grande partie de

la contamination microbienne des dattes brutes (et compris des bactéries pathogène : Staphylococcus

aureus), qui est effective au fur et à mesure du stockage. Le problème de la persistance des levures n‘est

pas facile à résoudre du fait de leur caractère psychrophile et osmophile.

Dans le même contexte, Al Jasser (2010), met en valeur l‘utilité de la conservation des dattes à froid. Il

prouve que à une température de -19°C il est possible d‘éliminer presque la totalité de la population

microbienne au bout de 6 mois de conservation. Cet objectif, ne fut pas atteint au cours du stockage à 4°C

- 48 -

et à 26°C, où on n‘y a pas observé un changement significatif de toute la microflore microbienne.

Néanmoins ce travail a été simplement descriptif, et ne donne pas des informations précises sur l‘identité

de la microflore en question. Encore il met en avance la stabilité microbienne des dattes grâce à leur

composition chimique. L‘auteur fait référence à d‘autres travaux sur l‘effet de température de

conservation sur le développement des microorganismes (Rygg et al (1956): Possibilité de conservation

de Deglet Noor pendant 1 année à 0°C et plus d‘une année à -17.5°C mais moins d‘un mois à 27°C ;

Bejamin et al. (1976) rapportent que la température optimale de conservation de la variété Zadhi est

comprise entre -3 et 5°C.

Attia, (2011), a testé 3 procédés de conservation des dattes, à savoir; la pasteurisation par l‘air chaud, le

lavage par l‘eau stérile, et le traitement par 3.75 ml/l de trois huiles essentielles (L‘huile d‘œillet, huile de

gingembre et l‘huile d‘olive). L‘huile d‘œillet diminue significativement le taux de contamination

fongique jusqu‘a 100 % dans la variété Deglet Nour, alors qu‘elle ralentit le développement dans les deux

variétés Elak et Asabei. L‘étude a montré aussi que l‘huile d‘oillet est plus efficace que le conservateur

chimique benzoate de sodium.

Par ailleurs, Hassan (1979) a testé un essai du prolongement de la durée de conservation des dattes

molles à humidité élevée, par l‘utilisation des conservateurs chimiques. Tout d‘abord il a trempé les

dattes molles dans une solution de Propionate de calcium et de Benzoates de sodium, ensuite il a mis les

dattes dans des jarres, puis il a inoculé les dattes par deux agents d‘altération fréquentes des produits

sucrés: Saccharomyces rouxii et Aspergillus niger, puis il a conservé les dattes à différentes températures,

, il s‘est avéré que les dattes traitées par les conservateurs chimiques, n‘ont pas subis d‘altérations,

contrairement aux dattes molles non traitées.

7- Les méthodes de conservation traditionnelles des dattes :

Pour conserver les dattes, les communautés locales ont développé à travers le temps un savoir faire

ancestral en matière de plantation, pollinisation, gestion de l‘irrigation, récolte et stockage. En Algérie, la

production des dattes atteint 6,439,670 tons dont 60% sont représentées par les dattes communes

(Anonyme 2010a). La production occupe toutes les régions situées sous l'Atlas Saharien, depuis la

frontière Marocaine à l'Ouest jusqu'à la frontière Est Tuniso-libyenne à l'est et de nord au sud du pays, il

s'étend depuis la limite sud de l'atlas saharien jusqu'à Reggan à l'ouest Tamanrasset au centre et Djanet à

- 49 -

l'est. Cependant les principales régions productrices demeurent celles de l'est principalement les

palmeraies de l'Oued Righ, des Zibans, du Souf, de la cuvette de Ouargla et du M'zab. A l'ouest, ce sont

les palmeraies de l'Oued Saoura, du Tout, du Gourara et du Tidikelt.

La récolte se fait par des hommes attachés à des cordes qui récupèrent les dattes avec beaucoup de soins

sur une bâche qui entoure le palmier cela permet de recueillir les dattes qui tombent des régimes. Par

contre, dans le cas des dattes sèches, les régimes entiers sont récoltés et jetés sur la bâche.

La tradition fait que les dattes récoltées sont triées en lots homogènes et séchées sur les terrasses des

maisons avant leur acheminement vers les lieux de stockage. Les fruits de haute qualité sont

essentiellement consommés à l‘état frais; ceux de moindre qualité sont souvent transformés ou conservés.

La conservation des dattes se fait selon plusieurs procédés Les dattes à moitié mûre ou " M'nagar"

peuvent être directement conservée au froid (par congélation).

Depuis longtemps, les habitants des les régions phoénicicoles, pratiquent différentes méthodes de

conservation. Pour ce faire, ils réalisent des aménagements à l'intérieur des maisons pour construire

d‘armoires murales dites (Bajou), ou directement dans des ustensiles (jarres ou Khabia), et de peaux de

chèvres ou sacs en tissu (Btana) (Belguedj et al., 2008)

- Bajou

C'est une sorte de coffre creusé dans le mûr en plâtre dont les côtés sont enduits de pâte de datte pour

favoriser l'étanchéité (Ilbert et al., 2005 ). Ce mode de conservation est propice aux dattes molles, demi

molles ou même sèches. Le Bajou est munies de petites ouvertures d‘aérations sur la partie supérieure

(BELGUEDJ et al., 2008).

- Khabia

Les dattes sont empilées dans des grandes jarres qui ressemblent à une sorte de grands réservoirs

arrondis maçonnés en plâtre gris (argiles), dans une pièce qui sert de magasin. Ce mode est pratiqué pour

les dattes molles (Figure 1).

Les dattes sont pressées dans les jarres afin d‘éliminer les poches d'air; la jarre est ensuite fermée

hermétiquement et placée dans un endroit frais et sec. On peut en Puiser au fur et à mesure des besoins

avec un scalpel ou branche en bois ou métallique.

- 50 -

Au pied du Khabia se trouve un trou muni d‘un bout de roseau faisant l‘orifice de robinet qui laisse couler

lentement le suc mielleux ( Assel ou miel) qui se dégage des dattes comprimées.

Figure 1. Khabia (mode de préservation traditionnelle des dattes) http://img.over-

blog.com/150x112/3/40/45/76/album-photos-2/DSC00172-copie-1.JPG

- Btana

C‘est le mode de conservation traditionnel le plus utilisé dans le sud algérien. Les dattes sont récoltées

après leur maturation et séchage. Après triage de dattes de par leur qualité, elles sont écrasées dans le

"Btana", sorte de sac en peau d'animaux, en toile, et en récipients en plastique (Figures 2, 3 et 4).

Il y a deux modes de préparation de Btana (direct et indirect).

Méthode directe

Les dattes molles telles que la variété de Ghars, sont directement empilées, entassées puis pressées dans

le Btana jusqu'à expulsion de l'air. Ces dattes se conservent bien sans changement de leur humidité.

(Cauvet, 1914).

Méthode indirecte

Les dattes sèches et demi-molles; Hmira, Takarboutch, Timjuhert sont conservées par le mode indirecte.

Ainsi les dattes sont d‘abord, rincées avec de l‘eau froide pour enlever la poussière et éliminer toute

matière étrangère ou débris des insectes ou oiseaux. L‘opération est effectuée à l‘aide des récipients et sas

métalliques perforés. Puis un rinçage avec l‘eau chaude bouillante ; l‘étape est reproduit plusieurs fois

jusqu‘au ramollissement des dattes. Ensuite les dattes se sont amalgamées et laissées reposées pour se

ramollir. Les étapes précédentes favorisent la transformation des dattes en pâtes qui seront par la

suite empilées par couches dans des sacs propres en plastique ou en toile ou plus originellement en peaux

vieilles de chèvre.

- 51 -

Entre chaque couche de pâte on exerce une légère pression pour mieux répartir les dattes et exclure

l‘air résiduel, puis on fait un saupoudrage d'un mélange broyé d'épices séchées : le Basilic (Ocinum

basilicum L.,), le Genévrier (Juniperus communis L.), le Romarin (Rosmarinus officinalis L.), l‘Armoise

(Artemisia vulgaris) en vue d‘apporter une odeur agréable au BTANA et renforcer la qualité gustative des

dattes. Lorsque le sac est rempli entièrement, on l‘attache hermétiquement, et on le met à exposer au

soleil, pendant deux jours en hiver ; ou une demi-journée en été. Le sac est périodiquement retourné pour

exposer ses deux faces au soleil. Les sacs sont par la suite mis dans un endroit sec et à l‘abri des

ravageurs et des insectes. Après un mois ou plus (période non déterminée précisément par les paysans,

mais dans notre étude on a limité la conservation à un mois) de conservation les dattes seront prêt à la

consommation.

Figure 2. Btana dans un sac en plastique Figure 3. Btana dans un sac en toile.

Figure 4. Btana

- 52 -

La figure 5 suivante les étapes de la fabrication de Btana.

Figure 5. Préparation de Btana (méthode indirecte)

Empilage et malaxage des

pâtes

Entassement et remplissage

des sacs

Empicessement

Commercialisation

Alimentation du bétail

Transformation en

BTANA

Triage

Rinçage avec de l’eau

bouillante

Rinçage avec de l’eau

froide

Attachement et sellage

des sacs

Exposition au soleil

Stockage

Consommation

- 53 -

IV- Outil de l’étude de la biodiversité microbienne des produits traditionnels :

Notre connaissance des populations microbiennes associées aux produits traditionnels est encore

très fragmentaire et progresse au rythme de l‘évolution des méthodologies mises en ouvre pour les décrire

(Guyot, 2010). Il est donc nécessaire d‘améliorer ces connaissances pour surveiller l‘évolution des

communautés microbienne durant le procédé de fabrication et leur relation avec l‘évolution des

caractéristiques organoleptiques et des changements physico-chimiques qui auront lieu au sein des

produits traditionnels. Cependant, dans la plupart des écosystèmes alimentaires, ces études se heurtent de

véritables défis autant que les communautés microbiennes sont denses et diversifiées (Curtis et Sloan,

2004). Ainsi, de par leur diversité, leur fonctionnement en consortia, leur évolution rapide et leurs

caractères culturaux spécifiques, les microorganismes sont difficilement isolés et l‘identification de

souches présentant un intérêt alimentaires passe souvent des techniques de culture classiques à la mise en

œuvre de techniques moléculaires.

1- L’approche culturale

La composition spécifique des communautés microbiennes a longtemps été abordée par

isolement de souches sur des milieux de cultures artificiels plus ou moins sélectifs dans des

conditions nutritionnelles (matière organique, sels minéraux, facteurs de croissance) et physiques

(température, O2, pH, aw…) préalablement identifiées. Cette technique a été mise au point pour réaliser

des cultures pures par Koch et Pétri à la fin du 19ème

siècle et a constitué une étape importante en

microbiologie par la mise en place des outils nécessaires au développement de la taxonomie bactérienne,

de l‘étude des pathologies d‘origine microbienne, de l‘étude de la biodiversité microbienne des aliments

et la compréhension du rôle des microorganismes dans les différents écosystèmes (Pelczar et al., 1993).

Cette approche passe généralement par une étape d‘isolement des cultures pures, parfois précédée d‘une

phase d‘enrichissement visant à favoriser la croissance d‘un microorganisme précis. L‘identification des

souches isolées repose alors sur des critères morphologiques et microscopique (forme des cellules,

mode de groupement, aspect macroscopique comme la pigmentation et la forme des colonies/hyphes ou

les organes de fructification…), complétés au besoin par des réactions biochimiques (test de

l‘oxydase, de catalase par exemple) et caractérisation physiologique.

- 54 -

Les conditions de culture utilisés pour l‘enrichissement peuvent être soient électifs ou sélectifs pour

l‘isolement des microorganismes aux phénotypes particuliers. Cette démarche favorise la croissance des

microorganismes les plus adaptés aux conditions installées au départ.

Les techniques basées sur la culture des microorganismes reste toujours les techniques de référence

pour l‘étude des microorganismes d‘intérêt alimentaire, et elles sont préférentiellement utilisées dans

le cadre réglementaire et les microbiologistes en disposent un recul plus important que celui des

méthodes moléculaires (Gaüzere, 2012). Pourtant l‘utilisation des techniques de culture innovantes et le

développement de nouveaux milieux de culture devraient être encouragé par le faite qu‘elles permettent

d‘obtenir des souches pures et d‘en faire une étude physiologique et métabolique (Ripka., 2005).

1-1 Limites des méthodes de culture classique :

Les étapes d‘enrichissement et d‘isolement sont nécessaires pour accéder aux caractéristiques

phénotypiques. Néanmoins elles ne permettent d‘accéder qu‘à un nombre réduit des espèces présentes

dans un écosystème. Bien que les techniques de culture sont traditionnellement utilisées pour l‘étude

des microorganismes, Il a été fréquemment rapporté que les comptages directs en microscopie

dépassaient de plusieurs ordres de grandeur le nombre de cellules viables dénombrées par culture sur

boîtes de Pétri (Gaüzere, 2012). Cette difficulté d‘ordre technique est directement liée aux conditions de

croissance in vitro hautement artificielles (Terzieva et al., 1996).

Ainsi, le milieu de culture utilisé ne peut être adéquat à tous les microorganismes et l'ensemble des

paramètres de la niche biologique ne peuvent être reproduites pour convenir à toute la communauté

microbienne présente. Dans ces conditions, certaines microorganismes hors de leur écosystème naturel

peuvent passer à un état viable mais non-cultivable. D‘autres populations numériquement inférieures

peuvent supplanter des populations majoritaires mais moins adaptées au milieu de culture. Un autre

inconvénient vient de l‘envahissement de la gélose par certaines espèces de microorganismes (Bacillus

spp, moisissures) encombrant le dénombrement et l‘isolement des souches (Taha et al., 2007b).

Ceci est du à la sélectivité intrinsèque des milieux de culture d‘une part et de l‘inhibition de la croissance

en raison de concentrations élevées des substrats (exemple des microorganismes oligotrophes). D‘autre

part les populations enrichies et adaptés au milieu liquide peuvent être incapables de se développer sur

des milieux solides probablement suite à l‘absence de communication intercellulaire. Récemment il a été

- 55 -

mis en évidence que les microorganismes symbiotes ou syntrophes ne pourront être obtenus en culture

pure, sans leurs partenaires obligatoires. À ce regard, certains auteurs proposent l‘utilisation d‘extraits

cellulaires dans les milieux de culture pour favoriser la croissance de microorganismes impliqués dans

des relations synergiques (Connon et Giovannoni, 2002 ; Stevenson et al., 2004 ; Ferrari et al., 2005).

Parmi les autres défis de l‘approche classique, la découverte des microorganismes se retrouvant dans un

état physiologique connu sous le nom de "viable mais non cultivable" juste après leur séparation de leur

milieu naturel. Cet état de vie est provisoire du fait que certaines expériences ont montré que ces cellules

sont capables de croissance dans des conditions de culture très particulières (Cocolin et al., 2013).

1-2 Stratégies innovantes d’enrichissement et d’isolement

La difficulté principale de la précédente approche est de reproduire au laboratoire les paramètres

originaux de l‘habitat dont proviennent les échantillons obtenus (Postec, 2005). Récemment, des avancés

spectaculaires dans la culture des microorganismes ont été accomplies et qui ont rendu possible la culture

des microorganismes incultivables jusqu'à présent (Ferrari et al., 2005 ; Leadbetter, 2003). Certaines de

ces méthodes ont impliqué une composition modérée des milieux de culture plus proche des conditions in

situ naturelles. In vitro, les milieux de culture tendent à fournir de grande concentration en nutriments.

Ces milieux se sont avérés désastreux pour le développement d‘un grand nombre des groupes microbiens.

L‘utilisation de faibles, voire très faibles concentrations en nutriments, est devenue une stratégie efficace

pour augmenter la diversité microbienne au sein des cultures d‘enrichissement (Ferrari et al., 2005).

Plus récemment Connon et Giovannoni (2002) ont développé une stratégie de culture à haut

débit, dans des puits de faibles volumes de milieu appauvrie en nutriments (1 µL). L‘apport des substrats

à des concentrations similaires au milieu in situ naturel (environ 3 ordres de grandeur de moins que les

milieux classiques de laboratoire) a permis de cultiver jusqu‘à 14% des microorganismes d‘origine

marine, soit 14 à 1400 fois plus que les techniques de culture traditionnelles. .

D‘ailleurs, l‘isolement de certaines bactéries a été facilité par une technique d‘encapsulation dans des

microbilles du gel dans lesquelles se sont formées des micro-colonies isolées grâce à la cytométrie de flux

(Zengler et al., 2002). Cette méthode a permis de réaliser des cultures à haut débit, et d‘obtenir des

microorganismes très diversifiés. De plus, des outils nanotechnonologiques ont été développées afin

- 56 -

d‘isoler des cellules bactérienne comme les pinces optiques et les micromanipulateurs (,Joseph et al.,

2003 ; Frohlich and Konig 2000 ; Huber et al., 2000c).

Même si ces nouvelles techniques de culture représentent un réel potentiel et une avancée considérable

permettant d‘isoler de nouveaux microorganismes, elles s‘avèrent cependant encore inadaptées pour

appréhender la totalité de la biodiversité des écosystèmes. Ainsi une vaste majorité de la « vraie »

diversité pourrait être ignorée si l‘on s‘attache uniquement aux méthodes de culture (Gaüzere, 2012).

En outre, les stratégies de culture innovantes requièrent une énorme quantité de l‘échantillon à analyser

posant ainsi un autre problème d‘ordre technique. Donc l‗amélioration des techniques de culture ne

suffit pas pour remédier à la « Great plate count anomaly » (Staley and Konopka, 1985). D‗après

Donachie et al. (2007) des stratégies associant à la fois une culture à haut débit et la biologie moléculaire

seront nécessaires pour appréhender toute l‗étendue de la diversité microbienne.

2- Méthodes de culture indépendantes pour palier les limites des approches culturales :

Durant la dernière décennie, l‘utilisation de nouvelles techniques indépendantes de la culture a connu

un essor considérable, représentant une alternative puissante à l‘identification des microorganismes par

des approches culturales (Amann et al., 1995). L‘un des principaux avantages de ces méthodes est

qu‘elles permettent d‘analyser la diversité de nombreux échantillons simultanément en éliminant les

biais liés à la culture et à l‘utilisation de grandes quantités de boîte de Pétri et différents milieux de

culture (Robert et al., 2009).

- 57 -

Figure 6. Les différentes approches moléculaires appliquées à l’écologie des aliments.

Les gènes cibles couramment utilisés lors de l‘analyse de communautés microbiennes sont ceux

de l‘opéron ribosomal, particulièrement l‘ARNr 16S chez les bactéries et le gène ARNr 26S26S chez les

microeucaryotes. L‘utilisation des régions ITS permet une meilleure séparation taxonomique des levures

et de certaines bactéries d‘un écosystème (Jany et Barbier, 2008). Les gènes codant pour les ARN

ribosomiques sont ubiquistes et possèdent en parallèle des régions conservées (utilisés comme cibles pour

des amorces spécifiques ou universelles) et variables pour l‘identification spécifiques d‘espèces et pour la

détermination de la diversité globale d‘un écosystème par une analyse comparative des séquences

d‘ADNr 16S et ADNr 26S. Les méthodes utilisant ces marqueurs sont très nombreuses et mettent en

jeux plusieurs approches généralement couplées à la réaction de polymérisation en chaîne

(Polymerase Chain Reaction, PCR). D‘autres techniques incluent l‘association et la réassociation

d‘ADN, l‘hybridation ADN-ADN ou ARNm-ADN, ne font pas appel à la PCR (Cocolin et al., 2013).

2-1 Méthodes basées sur l’amplification PCR :

Ces méthodes permettent la caractérisation des communautés microbiennes par séparation physique des

acides nucléiques sur gel d‘électrophorèse selon la taille, les séquences et la conformation de séquences

- 58 -

donnant ainsi un "profil" ou une "empreinte génétique" de la communauté microbienne. Ces techniques

reposent sur deux principales étapes à savoir l‘extraction des acides nucléiques et l‘amplification par

Polymerase Chain Reaction.

2-2 L’amplification aléatoire d'ADN polymorphe (Random Amplified Polymorphic DNA ou

RAPD)

Le principe consiste à utiliser un ou plusieurs amorces très courtes (~10 pb) qui se fixent sur plusieurs

sites du génome et permettent l‘amplification de fragments d‘ADN. La séparation des fragments

d‘ADN amplifiés par électrophorèse sur gel produit une empreinte caractéristique.

La simplicité de cette technique en fait la méthode de base pour observer des variations de

population (Atienzar et Jha, 2006). Malheureusement la faible reproductibilité de la technique limite son

usage pour les échantillons complexes, mais elle reste intéressant pour le typage des souches

microbiennes pures (Savelkoulet al., 1999).

2-3 Polymorphisme de longueur des fragments de restriction (Restriction fragment length

polymorphism (RFLP ):

Cette technique repose sur une digestion des produits PCR par un groupe des enzymes de restriction

puis une migration des fragments obtenus en gel d‘agarose. La digestion des amplicons permet

d‘obtenir des fragments de différentes tailles suivant la diversité microbienne au sein de la population

étudiée.

La technique Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) met en ouvre par Liu

et al (1997) a permis de diminuer la complexité des profils, en prenant en compte que les fragments

terminaux obtenus grâce à l‘utilisation d‘amorces marquées par un fluorochrome lors de l‘étape

d‘amplification PCR. L‘application à des mélanges microbiens complexes conduit à des profils

électrophorétiques trop confus. Les produits de restriction des différentes espèces peuvent se superposer

et se confondre.

- 59 -

Figure 7. Principe de T-RFLP (1) extraction d‘ADN, amplification par PCR en utilisant une amorce avec

fluorescence (2). Digestion du produit de PCR (3). Electrophorèse (4) analyse des fragments fluoresçants (5)

Grüntzig et al., 2002

2-4 l’Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) :

C‘est une méthode de RFLP appliquée aux gènes ribosomaux. Cette technique permet d‘identifier

des profils spécifiques d‘espèces microbiennes (mais son utilisation pour étudier des échantillons

complexes reste délicate en raison du nombre important de bandes obtenues (Dahllof, 2002 ; Wu et al.,

2006).

2-5 Analyse de l’espace intergéniques ribosomales (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis : RISA) :

La RISA permet une discrimination des fragments amplifiés, correspondant aux régions

intergéniques ITS (Internal Transcribed Spacer), ou de l‘IGS (Intergenic Spacer) à l‘aide d‘un couple

d‘amorces suivie par une électrophorèse qui les séparent en fonction de leur taille située entre 50 et 1

500 pb suivant les espèces bactériennes (Ranjard et al., 2001).

L‘automatisation de cette technique (ARISA) a permis une comparaison quantitative des

communautés étudiées (Guedegbe, 2008)

2-6 La technique d’électrophorèse sur gel du gradient de dénaturation (Denaturating Gradient

Gel Electrophoresis –DGGE- ):

Cette technique a été développée par Muyzer et al.(1993) puis elle s‘est généralisée dans plusieurs

laboratoires pour étudier la composition microbienne des aliments. La technique est basée sur la

séparation d‘un mélange d‘ADN double-brin de même taille dans un gel de polyacrylamide par action

simultanée de la chaleur et d‘un gradient linéaire de dénaturant (urée, formamide). Il est donc possible de

- 60 -

distinguer des fragments de taille identique, mais de séquences différentes, en jouant sur leur résistance à

des contraintes dénaturantes. Pratiquement, après extraction de l‘ADN de l‘échantillon à analyser,

une région variables du gène d‘intérêt (bien souvent le gène de l‘ARNr 16S) est amplifiée par PCR. Au

cours de la migration par électrophorèse, les bandes ayant une mobilité propre, peuvent correspondre à

une espèce ou à un groupe d'espèces taxonomiquement proches ou non. Les bandes obtenues après

migration peuvent ensuite être excisées, récupérées, réamplifiées puis séquencées afin d‘identifier les

populations présentes (Cocolin et al., 2013).

2-7 La TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis) :

Consiste à séparer par électrophorèse les fragments d‘ADN en appliquant un gradient de température fixe

et constant tout au long de la migration (Muyzer and Smalla 1998).

La DGGE et la TTGE sont actuellement deux méthodes de choix en microbiologie alimentaire, surtout

pour le suivi de la dynamique de la population microbienne. Elles ont été utilisées premièrement pour

étudier des aliments fermentés comme la pâte de maïs (Pozol) par Ampe et al. (1999) et les fromages

traditionnels par Randazzo et al. (2002). Depuis lors d‘autres produits traditionnels sont étudiés par cette

technique.

Figure 8. Principe DGGE et TGGE (Muyzer et al., 1993) : 1 : Extraction d‘ADN 2 : Amplification des

marqueurs génétique (ADN 16S) par des amorces associées à un GC-clamp. 3 : Électrophorèse, sous un gradient de

dénaturation chimique (DGEE) ou thermique (TGEE). 4 : Excision et réaamplification des fragments séparés.5 :

Séquençage des fragments.

- 61 -

2-8 Le Polymorphisme de conformation des simples brins (Single-Strand Conformation

Polymorphism (SSCP)) :

La séparation électrophorétique des produits PCR se fait selon la structure tridimensionnelle que peuvent

avoir les molécules simples brins d‘ADNr suite à une dénaturation par un agent chimique ; la

formamide, l‘hydroxyde de sodium, l‘urée et l‘hydroxyde de méthylmercurique (Natarajet al., 1999). Les

différentes conformations sont en fonction des séquences des espèces bactériennes (Lee et al., 1996).

3- Les techniques basées sur l’hybridation.

Ces méthodes permettent la détermination de la diversité des microorganismes sans passer par la PCR et

ainsi permettent d‘éviter les biais liés à l‘amplification PCR.

3-1 La méthode d’hybridation in-situ par fluorescence (FISH) :

C‘est une technique de microscopie et de biologie moléculaire, qui permet, d‘avoir une image

qualitative et quantitative des populations microbiennes au sein de l‘écosystème étudié. Des sondes

d‘oligonucléotides marquées par des fluorochromes sont utilisées pour rechercher une séquence de

nucléotides complémentaire spécifique d‘un groupe de microorganismes (famille, genre, espèce).

Généralement les sondes cibles du domaine « Bacteria » sont combinées avec d‘autres sondes plus

spécifiques (Dorigo et al., 2005). Après hybridation, la communauté microbienne est examinée par le

microscope à epifluorescence.

En effet les difficultés liées à cette technique sont ; la nécessité de fixer les cellules pour une

perméabilisassion de la paroi microbienn, le nombre assez faible des populations microbiennes pouvant

être révélées simultanément, les microorganismes autofluorescents, et l‘état physiologique des

micoorganismes cibles et le choix de lasonde et du fluorochrome (Filion, 2008, Amann et al., 1996). Des

améliorations se sont introduites sur le procédé : TSA-FISH (Tyramide Signal Amplification of FISH) et

CARD-FISH (Catalyzed Reporter Deposition-FISH) par Biegala et al (2003) et Pernthaler et al (2002a).

4- Les techniques d’étude de la biodiversité microbienne par séquençage des gènes:

Il existe différentes techniques pour identifier une communauté de bactéries grâce à l‘étude des

séquences des gènes marqueurs (ADN16S, ARN26S). Dans un premier temps, on extrait l‘ADN total

- 62 -

de microorganismes présents dans l‘échantillon (ADN génomique). Après purification, on procède à

l‘amplification des gènes cibles à l‘aide des amorces universelles. L‘étape du séquençage varie selon la

technique utilisée, les techniques les plus connues sont le séquençage de Sanger et le pyroséquençage

(objet de notre étude).

4-1 Séquençage de Sanger :

Cette technique nécessite 2 étapes distinctes ; la formation de la librairie des clones et le séquençage.

La librairie des clones est constituée par la manière suivante: le gène d‘intérêt d‘une communauté

microbienne est amplifié par PCR, puis chaque amplicon est inséré dans un plasmide et(cloné dans une

bactérie hôte, le plus souvent de type E. coli (type).

Les bactéries intégrant les gènes dans leur génome deviennent des hôtes recombinants et seront isolés

individuellement et miss en culture (Weisburget al., 1991). À la fin, chaque clone est séquencé sous des

condition particulières de PCR (faible concentration de désoxynucléotides marqués avec des

fluorochromes différents). Les amplicons issus de cette amplification sont de taille croissante et sont

détectables par électrophorèse. Selon la fluorescence des bandes du gel on détermine la nature du

nucléotide terminal. (A, T, G ou C). Ainsi on obtiendra une séquence complète du gène d‘intérêt amplifié

au préalable (référence). Cette technique est la plus exacte en matière de résolution taxonomique et elle a

permis depuis longtemps le progrès de connaissance en diversité microbienne des aliments traditionnels,

malheureusement ses applications sont limitées par la difficulté des étapes préliminaires de clonage et

de transformation bactérienne qui sont relativement pénalisantes en termes de coût et de temps ce qui

diminue pratiquement le nombre de produits analysés.

4-2 Technologies de séquençage de seconde génération

De nouvelles techniques de séquençage à haut débit ont été mises au point ces dernières

décennies pour palier aux défauts inhérents à la technique de Sanger, ces techniques sont qualifiées de

seconde génération (next-generation sequencing, NGS). Il existe actuellement trois technologies

majeures de séquençage à haut débit: 454 Genome Sequencer (Roche); Solexa Genetic Analyzer

(Illumina); SOLiD (Applied Biosystems). Les différences entre ces technologies résident dans la

- 63 -

technique utilisée, la taille des fragments produit, le rendement, le type de données générées et le taux

d‘erreur qui est lui associé.

Tableau 3. Principe, les performances et les limites de chaque technologie du séquençage

Méthodes de

séquençage

millions de

bases par

série

coût par

base

longueur de la

lecture en

paires de bases

Sanger 0,07 0,1 >700

454 pyroséquençage 400 0.003 400-900

SOLiD/SOLEXA 2000 0.0007 35

Pour le besoin de notre étude de la biodiversité microbienne du produit dattier traditionnel « Btana », le

choix a été porté sur la nanotechnologie 454 GS FLX vu sa rapidité et la capacité à générer environ 900

Mb (Mega base pair) par réaction de séquençage avec des fragments de longueur moyenne de 450 pb. La

technologie met en ouvre une plaque (picotitrées) contenant 1,6 millions de puits, et une PCR en

émulsion (emPCR) dans des billes microréacteurs qui permettent de réaliser jusqu‘à 300 000 réactions de

PCR en parallèle, ainsi qu‘une technologie informatique de pointe pour l‘acquisition, le traitement et

l‘analyse des images.Sur le plan pratique, la méthode de séquençage 454 repose sur le suivi de la réaction

de synthèse de l‘ADN à travers le largage d‘un pyrophosphate inorganique (PPi) et l‘émission dune

luminescence par un système luciférine/ luciférase (Fig 7).

Le processus de séquençage commence par la production d‘une banque d‘ADN simple brin à partir de

l‘ADN génomique par nébulisation ensuite les deux extrémités de chaque fragment d‘ADN (mono brin)

sont attachées par légation avec deux adaptateurs (A et B). Ensuite les fragments d‘ADN sont mis en

contact avec des billes en moyenne des sondes oligonucléotidiques complémentaires avec les séquences

des adaptateurs. Après, les billes sont mises dans des bulles micoréacteurs contenant tous les substrats

nécessaire à la polymerisation. Une PCR par émulsion est réalisée pour donner des millions de séquences

identiques recouvrent chaque bille ensuite les billes porteuses de l‘ADNsb amplifié sont placées

- 64 -

dans des plaque contenant des micropuits où s‘effectue la réaction du pyroséquençage. Durant cette

réaction, la séquence complémentaire du fragment amplifié est synthétisée à partir de nucléotides

(dATP, dGTP, dCTP et dTTP), ajoutés successivement en présence d‘enzymes. Si le nucléotide

introduit correspond à la séquence, il sera inséré et libérera un pyrophosphate (PPi) qui est ensuite

transformé en ATP par l‘ATP sulfurylase. Une luciférase intègre cet ATP à une luciférine en

formant une oxyluciférine qui émet un signal lumineux capté par une caméra CCD (en anglais,

Charge Coupled Device). Entre chaque ajout de nucléotide, les nucléotides en surplus dans le milieu

réactionnel sont dégradés par une apyrase et le puits est lavé avant l‘introduction d‘un nouveau

nucléotide. Le processus se continue avec l‘ajout d‘un autre nucléotide et le signal lumineux peut

ensuite être associé à l‘ordre d‘incorporation des nucléotides, ce qui permet de déterminer l‘enchainement

des séquences de chaque fragment d‘ADN immobilisé sur une bille (Ronaghi al., 1998).

De plus, l‘autre intérêt capital de la technique de pyroséquençage réside dans la possibilité d‘utiliser de

codes-barres (MID) que l‘on place en aval des adaptateurs. Ce code-barres constitué de nucléotides

prédéterminés permet de séquencer et de tracer différents échantillons en parallèle sur la même plaque.

Néanmoins, la performance assurée par cette technologie, ne l‘empêche pas d‘être une source d‘erreurs et

d‘avoir des limitées et des biais méthodologiques comme les autres techniques. La plus grande limite du

pyroséquençage par la technologie du Roche (454) vient de la succession de plusieurs nucléotides

identiques connues sous le nom d‘homopolymères qui représentent la source majeure d‘erreurs de

séquençage par cette méthode (Huse et al., 2007).

Une autre source d‘erreur possible est la présence résiduelle de nucléotides injectés au cours des

cycles précédents du fait de la baisse de l‘activité de l‘enzyme apyrase chargé de la dégradation des

nucléotides non incorporées. Cette erreur est appelée « carry forward ». Par évidence ces erreurs

limitent l‘utilité de cette méthode pour le séquençage de nouveaux génomes et la détection de

mutations mais sont avantage principale est la taille des fragments d‘ADN cible générés qui demeure plus

importante que celles des autres technologies.

- 65 -

Figure 9. Technologie GS 454. Les réactions se réalisent sur des billes de capture présentes en excès (A).

Chaque bille est déposée dans un puit (B). Le séquenceur capte un signal lumineux issu de l‘activité de la luciférase

et de la sulfurylase et le produit sous forme d‘un pic (C). Les nucléotides en excès sont détruits par une apyrase(C)

V- La mesure de la de biodiversité microbienne :

Les données génétiques des gènes cibles récoltés après l‘analyse des échantillons sont traitées de façon à

déterminer la diversité microbienne présente. Cette diversité est déterminée par des outils

bioinformatiques et statistiques selon plusieurs méthodes :

Les estimateurs de richesse spécifique (en espèces) tels que Chao (Chao, 1987), ou encore l'estimateur

ACE (Chao and Lee, 1992);

Les courbes de raréfaction utilisées pour déterminer le taux de couverture d‘échantillonnage (découverte

de nouvelle OTUs).

Les indices de diversité, qui permettent d‘évaluer la variabilité taxonomique de l‘écosystème étudié,

tels que l'indice de Shannon (Shannon, 1948) et l'indice de Simpson (Simpson, 1949).

1- Les estimateurs de richesse spécifique :

- 66 -

La relation entre la variation génétique des espèces et leur abondance dans un échantillon peut être

analysée selon une batterie d‘estimateurs parmi , tels que Chao1 ou ACE, calculent la richesse totale d‘un

échantillon en estimant les espèces rares totales à partir du nombre d‘espèces rares observées

(Hughes et al., 2001)

2- Les courbes de raréfaction :

La raréfaction estime le nombre d‘espèces dans un échantillon pour un nombre d‘individus

donné. En prenant en compte un nombre croissant d‘individus et en effectuant des retirages

aléatoires, il est possible de déterminer les écarts de richesse entre échantillons (Hughes et al.,

2001). Ainsi il est possible de connaître l‘effort d‘échantillonnage d‘une communauté par le

traçage des courbes de raréfaction qui relient le nombre d‘espèces (ou OTUs) obtenues en fonction du

nombre de séquences analysées.

3- Les indices de diversité :

Bien que la validité empirique des indices de diversité dérivés de méthodes moléculaires

ait été récemment remise en question (Bent and Forney, 2008), leur utilisation reste néanmoins valable

dans un cadre comparatif. La diversité α, c‘est à dire la richesse en espèces au sein d‘un écosystème local,

est calculé conjointement à partir des indices de diversité de Shannon (1948) accompagné de l‘indice

d‘équitabilité de Piélou (1966) ainsi que de l‘indice de diversité de Simpson (1949) afin d‘extraire un

maximum d‘informations et de mieux comprendre la structure des communautés.

Ces indices de diversité classique, peuvent être calculés facilement lorsque qu‘on réalise des

inventaires moléculaires basés sur le gène de l‘ARNr 16S par exemple (Schloss and Handelsman,

2005).

- L’indice de Simpson : Permet d‘évaluer la diversité d'un écosystème en mesurant la richesse en

taxons et l'abondance de chaque taxon. L'indice est compris entre 0 (diversité nulle) et 1 (diversité

maximale).

Soit ni l'abondance du taxon i et N l'abondance de tous les taxons. L'index de Simpson est 1-D.

- 67 -

- L’indice de diversité de Shannon : est un indice non paramétrique qui prend aussi en compte la

richesse en taxons et l'abondance de chaque taxon et plus celui-ci est grand, plus le niveau de

diversité est important.

Où Pi est la proportion de la diversité totale représentée pour chaque taxon i. Shannon quantifie

l'incertitude de prédire l'identité (taxon) d'un individu qui est pris au hasard dans l'ensemble de données.

Ainsi, un écosystème muni d'une seule espèce a un H'=0 (incertitude nulle).

- L’indice de l’équitabilité J: Permet d‘évaluer le degré de régularité de la répartition du nombre

d‘individus par espèce (valeur comprise entre 0 et 1). La valeur est proche de 1 quand il n‘y a pas

d‘espèces dominantes. Au contraire, elle est proche de 0 quand la communauté est dominée par

certaines populations. Cet indice est généralement plus faible dans les écosystèmes perturbés qui

sont dominés par les espèces les plus adaptées.

N : Nombre total d‘individus. S : Nombre total d‘espèces.

VI- Limites des approches modernes d’étude de la biodiversité microbienne :

L‘utilisation de techniques de seconde génération en complément avec les outils bioinformatiques permet

d‘obtenir une image globale de la communauté microbienne dans un écosystème. Cependant, il est

nécessaire de prendre en compte les limiter et les erreurs (les biais) pour éviter d‘obtenir des fausses

conclusions.

De plus, bien qu'une quantité énorme d'informations soit générée, il reste indispensable de s'appuyer

également sur les méthodes de culture afin de pouvoir compléter les résultats obtenus, car les méthodes

culture indépendantes ne donnent accès qu‘à une information semi-quantitative, de par les biais survenant

aux étapes d‘échantillonnage, d‘extraction et de manipulation de l‘ADN. Elles ne permettent donc pas

d‘estimer précisement la biomasse microbienne (Volant and Zinger, 2009).

1- Limites liées à l’extraction et les procédés d’optimisation:

En dépit des avantages des méthodes culture indépendantes dans l‘étude de la diversité

microbienne, elles restent toutefois objet d‘amélioration pour surmonter les limitations méthodologiques.

- 68 -

L‘extraction d‘ADN est l‘étape cruciale dans l‘analyse de la diversité microbienne puisqu‘elle est

une source majeure de biais. L‘efficacité d‘extraction et la pureté de l‘ADN obtenu sont dépendantes de la

composition de la matrice étudiée d‘une part et de la nature des microorganismes présents d‘autre part.

Généralement les méthodes d‘extraction d‘ADN commencent par une lyse cellulaire, puis des lavages

successifs dans différents solutions (tampons) pour précipiter les protéines, les polysaccharides, les

polymères organiques et d‘éliminer les débris cellulaires.

Les méthodes utilisées pour extraire les acides nucléiques doivent garantir l‘élimination des substances

inhibitrices des ADN polymérases telles que les polyphénols.

La déstabilisation des parois cellulaires est cruciale pour la suite des étapes d‘extraction. Les techniques

utilisées sont le vortex avec billes de verres, le CTAB (bromure de cétyl triméthyl ammonium), le

broyage à l'azote liquide, la sonication, et les digestions enzymatiques (Van Burik et al, 1998).

Les tampons d‘extraction contiennent de l‘EDTA, du Tris/HCl et un détergent. L‘EDTA est un

composant de chélation qui lie le magnésium, entre autres métaux.

Le magnésium est un cofacteur pour la DNAse. En liant le Mg à l‘EDTA, l‘activité de

la DNAse présente est diminuée (Somma, 2007). La combinaison Tris/HCl donne à la solution une

capacité d‘atténuation du pH (un pH faible ou un pH élevé endommage l‘ADN).

Les kits commerciaux, facilitent la récupération d‘ADN grâce à l‘adsorption d‘ADN sur les colonnes qui

permettent plusieurs lavages successifs. L‘ADN est finalement élué dans un tampon d‘élution.

Cependant, les performances des kits sont mis en question quand ‗il s‘agit d‘une matrice complexe ou

lorsque les concentrations des acides nucléiques dépassent la capacité de rétention du Kit. Dans ce cas, le

recours aux méthodes classiques est inévitable.

Les techniques classiques comprennent des lavages successifs au phénol-chloroforme-alcool-isoamylique

afin d'éliminer la majorité des protéines présentes. Un dernier lavage permet d'enlever les résidus de

phénol (Tel-Zur et al , 1999). Finalement, l'ADN est précipité à l'aide d'un alcool. L'isopropanol ou

l'éthanol.

Selon Stankiewicz et al (2000), il est nécessaire d‘optimiser la technique d‘extraction d‘ADN compte

tenu des facteurs suivants :

– obtention d‘une quantité et de qualité de l‘ADN optimales,

- 69 -

– réduction du coût d‘extraction, vu le nombre important d‘échantillons à extraire,

– adaptation de protocole d‘extraction pour les laboratoires peu équipés,

–Nécessité de travailler sur des matrices particulières (riche en sels, visqueuse, polyphénoles,

protéines…).

Les matrices d‘origine végétale (comme les dattes) sont riches en composés phénoliques dont la présence

est inhérente à l‘extraction d‘ADN à cause de leur liaison de façon covalente aux protéines et acides

nucléiques au cours de l‘homogénéisation (Ripoll et al., 2011). Des antioxydants sont communément

utilisés pour limiter l‘action des polyphénols comme, le β-mercaptoéthanol, qui pourrait être remplacé par

le bisulfie de sodium, non toxique et moins coût eux (Aljanabi et al., 1999). La molécule de PVP est

aussi recommandé pour l‘adsorption des composés phénoliques à pH bas, (Peterson et al., 1997).

Néanmoins, à des concentrations élevées, le PVP co-précipite avec l‘ADN et devient un inhibiteur de

PCR (Varma et al., 2007).

Les polysaccharides sont particulièrement problématiques car ils co-précipitent avec l‘ADN. Ils rendent

les pipetages et la migration sur gel difficiles, causant des anomalies dans les cinétiques de réassociation

et interfèrent avec les activités enzymatiques telles que les ligases, nucléases (Varma

et al., 2007).

L‘addition de NaCl à une concentration supérieure à 0,5 M est connue pour éliminer les polysaccharides

(Fang et al., 1992) et aboutit à une amélioration de l‘amplifiation (Kawata et al., 2003).

Le NaCl est souvent utilisé avec le détergent ionique CTAB qui convient pour l‘extraction et la

purification d‘ADN de végétaux et d‘aliments d‘origine végétale. Ce composé est particulièrement utile

pour la suppression des polysaccharides et des composés polyphénoliques qui affectent la

pureté et la qualité de l‘ADN (Wagner et al., 1987).

D‘autre part, le lavage avec les solvants organiques favorise l‘élimination des protéines dont la polarité

dans ces phases organiques change.

Cependant le choix du mélange est déterminant pour la qualité de l‘ADN, ainsi l‘extraction au

phénol/chloroforme améliore les quantités d‘ADN extrait ainsi que leur qualité par rapport à un lavage

avec le chloroforme seul (Ripoll et al., 2011).

- 70 -

La température de centrifugation influe aussi sur la séparation des phases. Ainsi une

centrifugation à 4 °C au lieu de 25 °C favorise l‘obtention d‘une interphase plus compacte entre les

phases aqueuses et organiques, permettant une meilleure séparation (Benbouza et al.,2006)..

L‘extraction d‘ADN à partir des matrices succulentes donne souvent un ADN en précipité mucilagineux

blanchâtre de nature polysaccharidique ou glycoprotéique. La contamination de l‘ADN par ces molécules

induirait des amplifications aléatoires ou inhibe carrément la PCR. l‘élimination de ces composées est

obtenue par suspension d‘ADN dans une solution de NaCl 1 M plutôt que dans du TE (Ghosh et al.,

2009).

Les donnés présentés précédemment ont constitué la base charnière de cette thèse tant sur le plan

analytique que l‘interprétation. Les méthodes utilisées sont inspirées de la littérature et adaptées selon les

besoins et la spécificité du produit du Btana, objet de cette étude.

Dans la partie suivante nous allons présenter la démarche méthodologique adaptée au cours de cette

étude, ainsi que les principaux résultats obtenus.

- 71 -

Matériel et méthodes

- 72 -

1- Description générale du projet de thèse:

La thématique du projet est originale et s‘inscrit dans un axe de recherche actuellement en

développement. Il s‘agit de l‘évaluation de l‘efficacité des procédés traditionnels de conservation à

maîtriser la qualité des aliments. Ainsi des programmes de recherche ont été élaborés dans de nombreux

pays pour l‘amélioration des aliments traditionnels et pour élucider le rôle déterminant des groupes

microbiens et des pratiques traditionnelles dans les procédés mis en œuvre en vue d‘une application

industrielle (voire la partie bibliographique.).

D‘après des études préliminaires (Abekhti et al., 2013, Abekhti et al., 2014) nous avons constaté que

les pâtes de datte (Btana) constituent un milieu favorable pour la fermentation microbienne suite à la

composition des dattes et les conditions de leur conservation. Au cours de ces travaux, une réduction

progressive des flores microbiennes est observée le long de la période de conservation. Cependant une

flore osmophile persistante douée d‘activité antimicrobienne a dominé le produit à la fin de la période de

conservation, ce qui suggère son rôle dans le contrôle des autres microflores. Malheureusement l‘étude

était restreinte à un faible nombre d‘échantillons et d‘analyse physicochimiques (pH, teneur en eau) et

microbiologiques et demeure ainsi insuffisante pour la compréhension des différentes interactions

possibles entre les communautés microbiennes.

Dans la littérature, la plupart des travaux publiés jusqu‘alors concernaient en premier lieu la qualité

physicochimique des dattes et leur valorisation biotechnologique comme substrat de base pour la

production des substances à valeur ajoutée, et de la biomasse. Cependant les études concernant l‘aspect

microbiologique de cet aliment font défaut et portent sur des simples analyses des flores d‘altération des

dattes conditionnées.

Dans le cadre de notre étude, nous allons utiliser conjointement les techniques microbiologiques

classiques (Les techniques culturales traditionnelles d‘enrichissement-isolement et caractérisation

biochimique et physiologique) et les techniques moléculaires d‘écologie microbienne (pyroséquençage).

Les approches culturales et moléculaires, permettant chacune de répondre à des questions différentes et

bien précises, s‘avèrent donc complémentaires et grâce à ces techniques la diversité microbienne pourra

- 73 -

être plus ou moins correctement estimée. Les techniques moléculaires employées dans le cadre de cette

étude sont basées sur l‘extraction d'ADN génomique des souches isolées et directement à partir des

échantillons de Btana. Enfin l‘efficacité de l‘étude de la diversité microbienne de Btana repose

énormément sur l‘optimisation du procédé d‘extraction d‘ADN de la communauté microbienne présente.

Un grand effort a été mené dans ce sens par l‘utilisation de différents protocoles d‘extraction. Après la

mis au point du protocole optimale une analyse des séquences d‘ADN ribosomique (16S et 26 S) a été

effectuée après amplification par PCR. Une telle démarche apporte sans doute de nouvelles connaissances

sur la biodiversité microbiennes des dattes et leur microflore autochtone.

2- Matière première de préparation du Btana :

Les dattes sont les ingrédients de base pour la préparation de Btana. Les cultivars utilisés

appartiennent généralement aux variétés communes (Ghars, Hmira) qui s‘écoulent difficilement sur les

marchés nationaux et internationaux. Elles sont cultivées et consommées en général dans les régions de

production.

Il existe plusieurs variétés qui se distinguent par leurs couleurs, formes et tailles. Les variétés les plus

utilisées dans la préparation du Btana sont, Ghars dans les zones Sud-Est de pays (Biskra, Oued righ

(Elmeghier), Ghardaia et Ouargla) et Hmira, Takarboutch et Tinacer dans les régions Sud-Ouest (Béchar,

Adrar).

Dans le cadre de notre étude, nous avons entrepris deux campagnes d‘échantillonnage dans les deux

régions, vu la différence de conditions climatiques qui règnent dans ces régions. Le choix a été porté sur

les variétés fréquemment utilisées dans l‘élaboration du Btana. Ainsi le Btana à base de la variété Hmira a

été retenu dans la zone sud-Ouest et le Ghars dans la zone Sud-Ouest.

Les échantillons de Btana ont été collectés dans des foyers, des micro-ateliers de transformation et des

vendeurs sélectionnés de façon aléatoire.

3- Prélèvement et description des échantillons :

- 74 -

Une fiche d‘enquête a été préparée pour décrire de façon précise et approfondie le procédé traditionnel de

fabrication de Btana. Cette description a été réalisée dans le but de faire une caractérisation du produit

alimentaire et pour repérer les différents facteurs impliqués dans la détermination de sa qualité finale.

En plus, l‘origine des dattes entières, leur mode de stockage et la période qui s‘écoulée entre leur récolte

et leur transformation ont été déterminés.

Les échantillons de Btana prélevés ont été mis immédiatement dans une glacière contenant des pains de

glace puis au réfrigérateur à 4°C jusqu‘au moment de l‘isolement qui s‘est fait le même jour au

laboratoire.

4- Détermination des populations microbiennes

Vingt cinq grammes de chaque échantillon on été ajoutés à 225 ml de l‘eau peptonnée tamponnée (voir

annexe 1) dans un sac Stomacher stérile. La solution a ensuite été homogénéisé dans un

homogénéisateur péristaltique de type Stomacher pendant 1 minute. Après dissolution du Btana, et

préparation des dilutions décimales, un volume approprié de l‘inoculum a été cultivé dans les conditions

de cultures présentées dans le tableau suivant.

Tableau 4. Conditions de culture des groupes microbiens

Groupe microbien Milieu de culture

(annexe 1)

Condition

d‘incubation

Température Temps

d‘incubation

Germes aérobies

mésophiles totaux

PCA aérobie 30°C 72 h

Germes

anaérobies totaux

BHI Anaérobie 30°C 72 h

Bactéries

lactiques

MRS Anaérobie 30°C 48 h

Flore fongique YGC aérobie 25 °C + 72 h

5- Identification des isolats bactériens.

Les colonies obtenues ont été examinées pour en choisir des isolats représentatifs de formes distinctes.

Une colonie a été choisie pour chaque phénotype observé et les souches ont été classées préalablement

- 75 -

en fonction des caractères suivants : Gram, morphologie (microscopique et macroscopique), mode de

regroupement (microscope), mobilité (gélose mannitol mobilité), catalase (effervescence après ajout de

H2O2).

Ainsi 204 colonies de bactéries et de 41 levures ont été examinées.

Les souches bactériennes ont été finalement regroupées en 4 groupes selon les critères suivants :

Groupe 1 : Bacilles mobile Gram positive catalase positive présumés des Bacillus sp :

Groupe 2 : Cocci Gram positif catalase positive présumés des Staphylococcus sp:

Groupe 3 : Cocci Gram positif catalase négatif présumés des Streptocococcu et Enterococcus :

Groupe 4 : Autres isolats.

La caractérisation des souches isolées a été poursuivie grâce à des les tests biochimiques, physiologiques,

enzymatique et moléculaires (gène d‘ADN16S) développés dans l‘article 1.

6- Identification des isolats de levures zt étude de leur profil fermentaire.

Les données recueillies lors de l‘étude de la microflore bactérienne, ne satisfaisaient pas les

besoins du travail, car il a été conclu que la fermentation de Btana n‘est pas l‘ouvre des bactéries

détectées. À ce regard un travail complémentaire de l‘identification de la microflore fongique

(principalement les levures) a été envisagé dans cette perspective et aussi d‘après la littérature qui met en

cause de nombreuses levures responsables de l‘altération et la fermentation des dattes conservées. Pour ce

faire, on a suit les mêmes démarches faites pour la flore bactérienne à savoir, un isolement classique des

souches représentatives, étude de leur propriété biochimiques et physiologiques puis identification

moléculaire par le gène ARN 26S.

L‘autre volet de l‘étude a concerné la mesure du pouvoir fermentaire des souches de levures

isolées et leur caractéristiques biochimiques et physiologiques. L‘étude du pouvoir de fermentation des

souches a été effectuée dans un extrait de datte qui a été stérilisé puis inoculé par les isolats et mis à

fermentation pendant 21 jours dans des conditions d‘anaérobiose pour simuler les conditions de Btana.

Les paramètres de fermentation incluant la valeur de pH, les acides organiques et l‘éthanol se sont suivis

par un prélèvement et dosage après 48 h, 96 h, 15 et 21 jours d‘incubation

- 76 -

Le dosage des sucres et des acides organiques dans le Btana et ceux de l‘extrait de datte ainsi que les

produits de fermentation des levures ont été réalisés par HPLC dans le laboratoire de CWBI sous la

direction du Dr. Hiligsman. Le protocole d‘analyse est présenté en détail dans l‘article n°4.

Dans les parties suivantes nous allons présenter les protocoles de l‘étude moléculaire et

métagenomique qui ont été réalisés dans le laboratoire de microbiologie des denrées alimentaires et celui

de la société spin-off Quality Partner (siège Liège, Belgique) fondée par le Pr. Georges Daube.

Notons que le traitement des donnés brutes de pyroséquençage a été réalisé par Dr. Bernard Taminau

collaborateur scientifique à l‘Université de Liège.

7- Optimisation de l’extraction d’ADN du produit Btana en vue d’une étude

métagenomique de la microflore microbienne:

En parallèle de l‘approche culturale limitée à l‘isolement des microorganismes viables et favorables à la

culture dans nos conditions de laboratoire, il est devenu courant de coupler cette approche classique avec

une approche moléculaire pour s‘affranchir de la difficulté d‘obtenir une image plutôt complète de la

diversité microbienne du produit traditionnel Btana. Le facteur limitant de l‘étude de la biodiversité

microbienne présent dans l‘écosystème est de pouvoir récupérer la totalité du matériel génétique

microbienne disponible. Un tel défi est inhérent à toute les démarches basées sur l‘étude des marqueurs

génétiques comme le gène codant pour ARN 16S et ARN 26S des bactéries et levures respectivement.

Afin de s‘assurer que les échantillons retenus contiennent une quantité suffisante et représentative

de la matrice d‘ADN (minimum: 2 ng/µL) prévu pour le pyroséquençage, il était indispensable

d‘optimiser le procédé d‘extraction de l‘ADN microbien total. La difficulté liée à cette étape d‘extraction

d‘ADN provient du faible rendement après l‘étape de l‘extraction et de la mauvaise qualité obtenue suite

à la présence des inhibiteurs et à la dégradation des acides nucléiques. Un tel extrait d‘ADN ou d‘ARN

conduit à une mauvaise interprétation de la variabilité des marqueurs génétiques étudiés et mène à une

fausse analyse de la biodiversité microbienne de l‘écosystème examiné. À cause de ces limites l‘étape

- 77 -

d‘extraction d‘ADN est inhérente aux méthodes indépendantes de la culture microbienne (Abriouel et al.,

2006).

En générale, le protocole d‘extraction de l‘ADN se décompose en 2 phases principales : une lyse des

cellules permettant de libérer le matériel génétique, et une purification de l‘ADN permettant de le

débarrasser des débris cellulaires, des protéines et polysaccharides qui lui sont associés. Le choix

d‘une méthode d‘extraction d‘ADN est un compromis incluant le coût et le travail nécessaire pour avoir

le rendement souhaité. La méthode doit être aussi adaptée à la composition chimique de la matrice et les

inhibiteurs de PCR qui pourraient exister dans les produits analysés.

Il existe de nombreux protocoles à disposition pour isoler et purifier l'ADN de différents types de

matrices alimentaires. Néanmoins, en ce qui concerne l‘extraction d‘ADN à partir des fruits et des

produits complexes, le choix est difficile du faite de la complexité de la composition de ces matrices

(Cankar et al. 2006).

Selon Vayalil (2012), Les dattes présentent une composition complexes caractérisée par une forte

concentration des polysaccharides (cellulose, amidon, lignine, acide uronique et galacturonique), sucres

(fructose, glucose, maltose, mannose , saccharose), caroténoïdes, polyphénoles (tannins, anthocyanines,

flavonoides, phytosteroles…), des minérales (Potassium (K), Phosphore (P), Magnesium (Mg), et le

calcium (Ca). Ces composés interférent avec les enzymes et les réactifs chimiques utilisés lors de

l‘extraction d‘ADN, ce qui diminue considérablement l‘efficacité de nombreux protocoles et kits

d‘extraction d‘ADN et affecte négativement la réaction de PCR (Probeski et al.,1997; Gudenschwager et

al., 2012; Mamlouk et al., 2011).

Après un nombre de tentatives préliminaires, nous nous sommes rendu compte de la nécessité

d‘optimiser le protocole d‘extraction d‘ADN à partir du produit dattier « Btana ». À ce regard des auteurs

recommandent l‘utilisation du polymère solide le PVP (polyvinyl pyrrolidone) et du détergeant ionique

CTAB (hexadecyltrimethyl ammonium bromide) pour éliminer les polyphénoles et les polysaccharides

respectivement (Probeski et al., 1997; Jara et al., 2008).

- 78 -

Les méthodes combinant l‘usage du CTAB et du PVP ne sont pas coûteuses en comparaison des

kits d‘extraction commerciaux, néanmoins le choix de la concentration des polymères et la durée de

traitement est sujet à une optimisation adéquate.

Pour le besoin de notre étude nous avons comparé deux protocoles d‘extraction d‘ADN à base de CTAB

avec le kit commercial DNeasy plant kit (QIAGEN, GmbH, Hilden, Germany).

L‘efficacité des protocoles a été évaluée en fonction de la qualité et la quantité d‘ADN obtenu, ainsi que

la possibilité d‘amplification du gène ADNr 16S et l‘électrophorèse des amplicons dans un gèle

d‘agarose. Les trois protocoles sont présentés dans les paragraphes suivants.

7-1 Préparation des échantillons de Btana et de l’extrait cellulaire :

Onze échantillons de Btana collecté précédemment ont été utilisés pour l‘évaluation des protocoles

d‘extraction d‘ADN. 25 grammes du produit ont été pesés et homogénéisé jusqu‘à la dissolution totale

dans un broyeur de type Stomacher avec 225 ml du tampon phosphate saline composé de 8.5 g/l

NaCl, 1.1 g/l K2HPO4, 0.32 g/l KH2PO4, pH 7.4.

Ensuite, 1 ml du broyat exempt de fibres et de noyaux des dattes a été centrifugé à 14,000 rpm pendant 10

min pour récolter les cellules microbiennes.

Le culot de chaque échantillon est traité selon les protocoles suivants :

7-2 Protocols A: DNeasy plant kit

Le protocole a été réalisé selon les recommandations du fabricant avec une brève modification après la

lyse chimique où une étape de lyse par action mécanique des billes de verre a été introduite pour

accélérer la lyse cellulaire et la libération des matériels génétiques bactériens.

Suite à la centrifugation des broyats cellulaires, les culots de cellules sont repris dans 450µL de tampon

TE (50 mM Tris-HCl pH 8, 10mM EDTA)

Les échantillons ont été ajoutés à 3 g des microbilles de verre (710-1180µm, Sigma, USA) ensuite placés

dans un dans un vibro-broyeur (Vortex Genie, Scientific Industries) pendant 10 s à fréquence maximale.

les échantillons ont ensuite été incubés à 65°C pendant 10 minutes.

- 79 -

Afin de précipiter les détergents utilisés au cours de l‘extraction, les protéines et les polysaccharides,

les échantillons ont été incubés 5 minutes dans la glace après ajout de 130 µL de tampon AP2, puis le

lysat cellulaire a été centrifugé 5 minutes à 14,000 rpm .

Les surnageants ont été prélevés et transférés dans les colonnes fournies avec le kit (QIAshredder Mini

spin column) puis centrifugés 3 minutes à 14,000 rpm . 1,5 volumes du tampon AP3/E ont été ajoutés

au filtrat et mélangés par pipetage et renflouement.

le mélange a ensuite été placé dans les colonnes DNeasy MiniSpin Column et centrifugé 1 minute

à 8000 rpm. Après élimination du filtrat, 500 µL de tampon AW ont été ajoutés sur la colonne, puis

centrifugés à nouveau 1 minute à 8000 rpm. Cette étape a été répetée deux fois de suite.

Pour éluer l‘ADN, la colonne est placée dans un microtube de 2 ml. Puis 50 à 100 µL de tampon

AE (10mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9) ont été ajoutés directement sur la membrane, incubés 5

minutes à température ambiante, puis centrifugés 1 minutes à 10000 g. Le filtrat obtenu constitue de

l‘ADN élu dans le tampon AE.

7-3 Protocols B: CTAB (modifié de Probeski et al., 1997)

- Préparation du tampon de lyse (digestion):

La solution de digestion contient en partie 100mM Tris (pH 8), 1.4M NaCl, 30mM EDTA (pH 8) a été

autoclavée à 120C° pendant 15 min. Ensuite 2% de polyvinylpyrrolidone (PVP, Sigma-Aldrich, St Louis,

USA) et 2% CTAB (cethyltrimethyl ammoniumbromide, Sigma-Aldrich, St Louis, USA) ont été ajoutés

après filtration sur filtre stérile (0.22µm). Le β-mercaptoethanol (1%, v/v) et le lysozyme (40 mg/l) ont

été ajoutés au tampon de lyse préchauffé (56 °C) juste avant la digestion. Cinq cent millilitres de cette

solution est ajouté au culot cellulaire placé dans un tube Eppendorf (2 ml). Le mélange a été brièvement

agité en inversant manuellement le tube. L‘homogénéisation est complétée par un vortexing vigoureuse

pendant 20 secondes.

Les microtubes ont ensuite été incubés à 56°C dans un thermomixeur (Eppendorf AG, Hamburg,

Germany) pendant 1 heure.

Après la lyse cellulaire, 3 g des microbilles de verre (710-1180µm, Sigma, USA) ont été ajoutées dans les

microtubes pour détruire les parois cellulaires par action mécanique dans un vibro-broyeur (Vortex

- 80 -

Genie2, Scientific Industries) pendant 10 s. Ensuite 20µl de l‘enzyme protéinase K (20 mg/ml) ont été

ajoutés au lysat pour finaliser la destruction des cellules et libérer les acides nucléiques. L‘incubation est

réalisée à 56°C pendant 1 heure.

La solution obtenue après la digestion enzymatique est centrifugée à 12,000 rpm pour 5 minutes.

Le surnageant est mis dans un tube Eppendorf de 2 ml auquel on ajoute 1V de la solution chloroforme-

alcool isoamylique (24 :1) et mélangé légèrement par inversion de phase. L‘émulsion formée, est

centrifugée à 12 000 /min pendant 10 minutes. La phase aqueuse supérieure est prélevée puis transférée

dans un nouveau tube et mélangé avec ½ V d‘une solution de NaCl (5M). Après homogénéisation, 2

volumes d‘éthanol absolu (100%) froid (-20°C) ont été ajoutés et l‘ADN a été laissé à précipiter pendant

10 min à -20°C.

Les microtubes sont ensuite centrifugés (12 000 t/min, 10 minutes, 4°C) et le surnageant a été éliminé.

Le culot récupéré constitue l‘ADN génomique total qui se précipite au fond des tubes. Ce dernier est

gentiment rincé à l‘aide de 200 µl d‘éthanol 70° pour éliminer les sels résiduels. Le culot d‘ADN est

ensuite séché en centrifugeant les tubes ouverts (12000 rpm, 5 minutes, 25°C) pour faciliter l‘évaporation

de l‘alcool et les substances de l‘extraction. Le culot d‘ADN est remis en suspension dans 50 µl d‘eau

stérile à grade moléculaire.

7-4 Protocol C : CTAB-DNeasy

Un aliquote de 1 ml de broyat obtenu lors de l‘étape de la préparation de l‘échantillon est utilisé pour

extraire l‘ADN total de la communauté bactérienne présente dans le produit Btana.

En effet, ce protocole est une combinaison entre le protocole CTAB décrit précédemment et celui du kit

DNeasy. Ainsi les échantillons sont traités comme dans les premières étapes du protocole de CTAB (lyse

cellulaire, lyse enzymatique, purification protéique par le chloroforme-alcool isoamylique). La phase

aqueuse (contenant de l‘ADN) est prélevée puis introduite dans une colonne (DNeasy MiniSpin Column,

QIAGEN). Ensuite le protocole est poursuivi selon la recommandation du fabricant du kit.

7-5 Purification de l’extrait d’ADN :

La purification a été effectuée à l‘aide de DNA-clean-up NucleoSpin kit (Macherey, Nagel GmbH,

Düren, Germany) selon les recommandations du producteur. Le protocole est présenté dans l‘annexe 2.

- 81 -

8- Évaluation de l’efficacité des protocoles d’extraction d’ADN

Les différents protocoles d‘extraction ont été évalués en terme du rendement et de pureté à l‘aide d‘un

NanoDrop (ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer)

Généralement, les acides nucléiques absorbent à 260 nm, tandis que les protéines absorbent à 280

nanomètres. Pour vérifier la contamination de l'extrait d'ADN par les protéines on mesure le ratio

DO 260 / 280 (ADN / Protéines). Cette valeur doit être comprise entre 1.7 et 2. Les valeurs de DO 260 /

280 au-dessous de 1.7 indique une probable contamination par les protéines. Le spectrophotomètre

permet également d‘estimer la quantité d'ADN grâce à la mesure de l‘absorbance à 260 nm.

a- Amplification de l’ADN extrait

L‘amplification de l‘ADN constitue une étape essentielle pour vérifier la qualité de l‘ADN extrait.

En absence d‘agents inhibiteurs des milliers de copies de fragment d‘ADN amplifiés sont produits à la fin

des cycles d‘amplification ce qui justifie l‘efficacité du protocole d‘extraction effectuée. L‘électrophorèse

met en évidence la formation des amplicons qui devraient correspondre à une taille présumée à l‘aide des

amorces d‘amplification.

Les extraits d‘ADN issus des protocoles sont amplifiés avec le Taq DNA polymerase (2.5U, Fastastart,

Roch, Germany) dans un volume du milieu réactionnel de 20 µl contenant :

2 µl de l‘extrait d‘ADN.

2 µl de dNTPs (2mM).

1.6 µl de MgCl2 (25 mM).

2 µl du tampon de PCR (10×).

0.8 µl des amorces (10 µM) :

16S-1500 F (Annexe 4).

16S-1500 REV (Annexe 4)

0.2 µl de Taq DNA polymerase (2.5U, Fastastart, Roche, Germany).

2µl du serum albumin bovine (BSA, Invitrogen, USA).

- 82 -

L‘amplification a été réalisée à l‘aide d‘un thermocycleur (Mastercycler gradient, Eppendorf, Westbury,

NY) sous le programme suivant (températures, nombre et durée de cycles):

- Dénaturation initiale à 94 ºC pendant 5 min.

- 35 cycles de :

Dénaturation: 94 ºC pendant 30 s,

Hybridation: 56ºC pendant 30 s.

Élongation 72 ºC pendant 1 min.

- Élongation finale à 72 ºC pendant 5 min.

b- Électrophorèse du produit de PCR

Le produit de PCR a subi une électrophorèse dans un gel d‘agarose 0.8% en tampon TAE (annexe 3) puis

a été visualisé sous UV par le system de transillumination (Gel Doc ™

EZ imager, Bio-Rad), le protocole

de l‘électrophorèse est détaillé dans l‘annexe 3.

c- Analyse statistiques des données de l’extraction d’ADN :

Les concentrations de l‘ADN extrait sont exprimées en moyenne de deux valeurs de mesure ± erreur

standard. L‘analyse de la variance ANOVA sert à analyser les données issues des protocoles testés (À, B,

C). la valeur α est fixé à 0.05. Les comparaisons a posteriori (post hoc) sont effectuées avec la

comparaison multiple de Tukey pour déterminer les différences de pureté et du rendement entre les

protocoles. L‘effet de la purification sur le rendement d‘ADN a été déterminé par la mesure répétée de

l‘ANOVA. Ces analyses statistiques ont été réalisées à l‘aide du programme GraphPad Prism 5.01

9- Analyse métagenomique de la microflore bactérienne et fongique par la technique

de séquençage haut-débit « pyroséquençage »

8-1 Préparation des amorces taguées :

La librairie des clones sera amplifiées grâce à des amorces fusionnées qui contiennent les

séquences d‘adaptateurs directionnel A et B (Roche Diagnostics Belgium NV, Vilvoorde, Belgique) qui

permettent de réaliser un séquençage d‘amplicons bidirectionnel et à partir desquels le pyroséquençage

peut débuter. Les nucléotides de l‘adaptateur sont fusionnés à l‘extrémité 5‘ de l‘amorce comportent

aussi une clé permettant l‘identification des puits du pyroséquençage et les séquences MID (Multiplex

- 83 -

Identifier). Ces marqueurs de multiplexage (codebar ou MIDs) permettent de reconnaître les séquences

obtenues par pyroséquençage et de les trier en fonction de leur échantillon d‘origine.

Onze couples de MIDs permettant de séquencer un mélange d'amplicons issus des 11 échantillons

de Btana ont été sélectionnés. La liste des MIDs est donnée en annexe 5.

Les amorces taguées utilisées ciblent la région variable V1-V3 du gène bactérien codant pour

l‘ARN ribosomal16S et du gène codant pour l‘ARN ribosomal 26S pour la population fongique.

Pour les amorces bactériennes on utilise le couple des amorces E9-29 F et E514-430 R et les amorces

NL1 et NL4 pour la flore fongiques (séquences en annexe 4).

8-2 Préparation de la librairie des clones

Chaque échantillon a été amplifié de manière indépendante en utilisant les amorces taguées dans

un milieu réactionnel contenant les conditions:

5 U de l‘enzyme FastStart high fidelity polymerase (Roche Diagnostics, Germany),

1x PCR tampon PCR,

200 µM de dNTPs (Eurogentec, Liege, Belgium),

0.2 µM du primers E9-29 and E514-430pour lres bactéries ou NL1 NL4 pour les levures

100 ng de l‘ADN extrait de chaque échantillon dans un volume de 100 µl.

Le program de PCR a été réalisé à l‘aide d‘un thermocycleur (Mastercycler gradient, Eppendorf,

Westbury, NY) sous le programme suivant (températures, nombre et durée de cycles):

Dénaturation initiale à 94 ºC pendant 15 min.

30 cycles de :

Dénaturation: 94 ºC pendant 40 s,

Hybridation: 56ºC pendant 40 s.

Élongation 72 ºC pendant 1 min.

Élongation finale à 72 ºC pendant 7 min

8-3 Dosage des produits de PCR

Les amplicons de tous les échantillons ont été purifiés selon les recommandations de Roche.

- 84 -

Les produits de PCR (amplicons) ont été soumis à une électrophorèse dans un gel d‘agarose à 1%.

Les fragments d‘ADN correspondant à la taille présumée (1500 pb) sont excisés et purifiés avec le kit de

purification de produit de PCR : SV PCR purification kit (Promega Benelux B.V., Leiden, the

Netherlands).

La qualité et la quantité des produits de PCR sont déterminés par dosage (PicoGreen d‘ADN

double brin) avec fluromètre (Isogen Life Science NV). Les concentrations des onze échantillons ont

été déterminées, puis réunis par dilution à une concentration équimoléculaire finale de 100 ng dans un

même microtube constituant la librairie d‘amplicons multiplexés pour faire le pyroséquençage.

8-4 Réalisation des banques et amplification clonale par PCR en émulsion :

Cette technique permet d‘amplifier clonalement un très grand nombre de molécules d‟ADN en

parallèle. Les amplicons d‘ADN amplifiés sont mis en contact avec des billes de la streptavidine qui

possède une forte affinité pour la biotine lié aux extrémités des adaptateurs B. Ainsi, uniquement les

fragments d‘ADN présentant un ligand B seront retenus par les billes. Théoriquement un seul fragment

d'ADN va être fixé sur chaque bille (avec un ratio nombre de billes/nombre de molécule d'ADN respecté).

Les billes sont ensuite placées dans une émulsion contenant les composés nécessaires à la réaction

d‘amplification, et permettant d‘individualiser chaque bille dans des bulles qui servent de microréacteurs.

Le fragment d'ADN fixé sur la bille va pouvoir être amplifié à partir de l'amorce de l‘adaptateur libre

A.

Suite à une dénaturation, la molécule d‘ADN simple brin néo-synthétisée reste fixée sur la bille, et va

être utilisée pour la synthèse d‘une autre matrice à partir de l‘amorce A biotinylés présente dans le milieu

réactionnel. Les molécules d‘ADN simple brin de départ sont réutilisées par une autre amorce B fixée sur

la bille.

La PCR en émulsion est réalisée par 50 cycles en suivant le protocole du kit lib-A Medium Volume de

Roche. Ceci permet d‘obtenir des billes recouvertes en surface par des millions de fragments

d‘ADN, prêts à être séquencés (thèse Varin, 2013, Faugier 2010, Gaüzere, 2012).

- 85 -

8-5 Le pyroséquençage :

Après amplification, les microgouttelettes (microréacteurs) sont dissociées, et les microbilles

porteuses de l‘ADN largement amplifié sont transférées dans des plaques picotitrées (Picotiterplate :

PTP, GS Junior Titanium Picotiterplate kit, Roche) en fibre optique contenant 1,4 million de puits dont le

diamètre (40 µm) va permettre de ne récupérer qu‘une seule bille par puits.

Différents couches de billes sont successivement déposées dans les puits de PTP fixé sur un

support (Bead deposition device, Roche) : des billes contenant les enzymes indispensable au

pyroséquençage (ADN polymérase, sulfurylase, luciférase), et des billes permettant de combler le

volume de puits (packing beads) pour ne récupérer qu‘une seule bille par puits. La PTP est enfin chargée

dans le GS Junior. A l'intérieur de chaque puits, se déroule la réaction de pyroséquençage, basée

sur la détection du pyrophosphate relâché lors de la réaction de polymérisation de l‘ADN. Les

nucléotides sont ajoutés les uns après les autres dans un ordre défini. Si le nucléotide ajouté

correspond à celui attendu par la polymérase, il est incorporé dans le brin en cours de synthèse

(d‘élongation) et libère un Pyrophosphate. Ce dernier sera utilisé par l‘ATP sulfurylase pour générer de

l‘ATP. En présence de molécule d‘ATP, la luciférase oxyde la luciférine en oxyluciférine en

émettant un signal lumineux. L‘enzyme Apyrase dégrade les nucléotides non adéquats à chaque cycle

d‘addition séquentielle des nucléotides. Ainsi, il est possible de réaliser 400 000 réactions de

séquençage en parallèle. Le signal lumineux est détecté par une caméra CCD qui permet de capturer les

images après addition de chaque nucléotide. L‘analyse des différentes images capturées permet la

déduction de la séquence des différents fragments d‟ADN par connaissance de l‘ordre dans lequel les

4 nucléotides sont ajoutés automatiquement. Ceci est traduit en Pyrogramme.

Des logiciels bioinformatiques sont ensuite utilisés pour identifier les séquences initiales des

différents amplicons d‘extrait d‘ADN.

8-6 Traitement des séquences de lectures et analyse des données

Les séquences reçues de séquenceur 454 GS Junior sont sous le format SSF (standard flowgram

files) . Ces fichiers compilent les séquences et toutes les informations de qualité sur les lectures (reads)

- 86 -

ayant permis le séquençage (Roche_Applied_Science, 2008). C‘est à partir de ce format que commence

l‘analyse bioinformatique menant à l‘identification des microflores des 11 échantillons Ces fichiers sont

convertis en format FASTA par la commande sfffile du logiciel de Roch

- Analyse de la qualité des séquences de lecture (reads).

Lors du pyroséquençage, plusieurs erreurs peuvent être introduites et conduisent à des erreurs

d‘interprétation microbiologique. L‘analyse de qualité du séquençage et l‘élimination des séquences très

courtes et celle très longues, ayant de nombreux bases indéterminées (N), les lectures répétées est faite à

l‘aide du programme du Roche Pyrocleaner. Le score de qualité est noté sur une échelle de 0 pour une

faible qualité à 40 pour une très bonne qualité. Les séquences ne répondant pas aux critères de

qualité (Q minimum…) requis pour la poursuite de l‘analyse sont éliminées.

Les séquences sont par la suite traité à l‘aide de la plateforme (pipeline) Mothur qui comporte différents

paramètres et logiciels de traitement des données (Shcloss et al., 2009).

- Triage

C‘est l'épuration et le nettoyage des séquences par découpage des séquences de trop faible qualité qui

sont trop courtes ou avec un nombre trop important de bases ambigües (« N ») sont éliminées du

processus d'analyse. Dans notre cas nous avons éliminé les séquences qui ne présentent pas d‘homologie

avec les barcoodes (MIDs), les amorces utilisées (plus d‘une divergence), ou contenant plus de deux

bases indéterminées (N). Puis les séquences ont été triées en fonction des échantillons grâce à la

reconnaissance des marqueurs de multiplexage (MIDs).

- Enlèvement des bruits de fond (denoising)

Le logiciel Pyronoise (Quince et al., 2009) est utilisé pour le retrait des séquences (signaux) issues de

bruit de fond et les séquences plus courtes que 425 bps et celle contenant plus de 8 homopolymères.

- Alignement, groupement des OTUs et affiliation taxonomique des séquences

Les séquences nettoyées ont été alignées sur la base de données SILVA (Pruesse et al.,

2007) . Avant l‘alignement, les séquences ont été vérifiées pour les chimères par la commande

ChimeraSlayer (Haas et al., 2011) implanté dans le program Mothur.

- 87 -

Les séquences retenues ont été classées en unités taxonomiques opérationnelles (OTUs), par groupement

par le calcul de matrices de distances entre chaque paire de séquences avec un seuil fixé (0,03) ainsi les

séquences présentant au moins 97% d‘homologie entre elles, ont été regroupées dans le même OTU.

L‘assignement taxonomique et l‘identification au niveau de l‘espèce a été réalisée par analyse

BLASTN à partir de la base de donné SILVA (http://www.arb-silva.de/) selon un seuil d‘homogénéité

de 80%. Les séquences appartenant à des chloroplastes ont été éliminées. Les indices de diversité ont

été obtenus par le biais du programme Mothur. Les estimateurs de richesse spécifique Chao (Chao,

1987), ACE (Chao and Lee, 1992) et l‘indice de couverture Good (Good‘s coverage, Good, 1953) ) ont

été déterminés. De même pour, les courbes de raréfaction présentant le nombre d‘OTUs obtenus en

fonction du nombre de séquences à 97% de similarité selon Colwell et al. (2004). Ce paramètre permet

de déterminer le taux de couverture d'échantillonnage. Pour étudier la diversité et la structure des

communautés microbiennes dans les deux types de Btana, les indices de diversité β de Shannon

(Shannon, 1948), et de Simpson (Simpson, 1949) ont été calculés. Ces indices permettent de quantifier

la biodiversité dans chaque échantillon étudié. Le test non paramétrique de Kruskal Wallis utilisant

l‘analyse de la variance (one way) par groupe a été utilisé pour déterminer la différence dans l‘abondance

relative des groupes phylogénétiques bactériens dans les échantillons étudiés. Ce test a été réalisé avec le

program XLStat 2007 (Addin soft, Brooklyn, USA). Le même program a été utilisé pour déterminer une

éventuelle corrélation (Spearman corrélation) entre les phylums microbiens et les paramètres liés aux

échantillons de Btana à savoir (pH, aw, age). L‘ordination non paramétrique multidimensionnelle

(NMDs) a été appliqué sur les donnés d‘OTUs d‘une part et d‘autre part sur les paramètres de

Btana (Age, aw et pH) pour déceler l‘effet de ces dernières sur la distribution des OTUs dans les

échantillons de Btana. Les groupes d‘OTUs communes entre les échantillons (selon leurs

origines) ont été visualisés par le diagramme de Venn. Pour les OTUs issues de l‘analyse

métagénomique de la flore fongique, la comparaison a été conduite par la mesure de l‘indice

d‘abondance Bray-Curtis afin de comparer les communautés fongiques selon les méthodes de

préparation (directe ou indirecte). Les données ont par la suite été visualisées par groupement

hiérarchique, les calculs sont été fait par le program PRIMER 6 v6.1.16 (Primer-E Ltd,

- 88 -

Plymouth, UK). Les OTUs ont de nouveau été testées pour leur contribution à la distribution des

échantillons par le test SPRIM du programme PRIMER.

- 89 -

Resultats et discussion

- 90 -

Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude ont été valorisés et présentés sous forme des

articles où les protocoles techniques et l‘approche de l‘analyse des données sont d‘avantage détaillés ou

référés à leurs références originales, des données complémentaires sont présentées dans les annexes.

Les articles rédigés sont :

1- Article 1: Identification of bacterial strains isolated from the traditional date product ―Btana‖ :

produced in south regions of Algeria.

2- Article 2: Optimization of DNA extraction from the Algerian traditional date‘s product ―Btana‖.

3- Article 3: Metagenomic analysis of the bacterial microbiota linked to the Algerian traditional date

product ―Btana‖.

4- Article 4: Metagenomic study of the fungal community of the traditional date product ―Btana‖

and characterisation of the most abundant strains.

- 91 -

1- Identification de souches bactériennes isolées du produit

traditionnel Btana

Le thème de cette partie de thèse s‘inscrit dans le cadre de la caractérisation de certains isolats

représentatifs des dattes conservées par la méthode traditionnelle « Btana ». Le sujet se situe parmi les

travaux scientifiques visant l‘exploration de l‘écologie microbienne des aliments traditionnels et l‘étude

de fonctionnement des souches microbienne dans l‘écosystème traditionnel. D‘ailleurs il est reconnu que

des microorganismes dominent la plupart des aliments et sont les principaux acteurs de la détermination

de leur qualité. Cependant, on connaît peu de choses sur leur diversité. Il manque donc les données de

base nécessaires pour comprendre les facteurs structurant la composition des communautés microbiennes

dans ce type d‘aliment de large consommation dans les régions de sud algérien. Sur le plan social, les

savoirs faire liés aux habitudes alimentaires comme celui de la transformation des variétés communes en

« Btana » sont sérieusement menacés de disparition car la stratégie agricole actuellement adoptée favorise

la plantation des variétés à valeur marchande, ce qui aura des retombés considérables sur les cultivars de

qualité commerciale inférieure, et par conséquent, les habitudes alimentaires qui y sont liées. Les

objectifs spécifiques de cette partie de thèse engobent :

1- Exploration de la diversité microbienne et la qualité hygiénique des produits dattiers préparés

dans les régions de sud-est et sud-ouest algérien (Btana).

2- Analyser l‘effet des conditions liées au produit dattier « Btana » sur la distribution de la

communauté microbienne.

3- Choisir des taxons intéressants dans chaque groupe taxonomique sur la base de caractères

pertinents (adaptations environnementales dans le milieu de datte, pour des études plus détaillées

(activité enzymatique, potentiel de fermentation, analyses génotypiques spécifiques).

4- Agrandir la base de données des séquences de l‘ADN ribosomique 16S de bactéries, et, grâce à

de nouveaux échantillons et réalisation d‘une collection de bactéries d‘origine autochtone.

Ce travail a été valorisé sous forme de l‘article suivant :

Article 1:

- 92 -

Identification of bacterial strains isolated from the traditional date product “Btana”

produced in south regions of Algeria.

Abekhti Abdelkader*1,2,3

, Taminau Bernard 1 Kihal Mebrouk

2, Daube Georges

1.

1 University of Liège, Faculty of Veterinary Medicine, Food Sciences Department, Sart Tilman, B43b 4000

Liege, Belgium

2 Laboratory of Applied Microbiology, Department of Biology, Faculty of Science, Oran University, BP16,

Es-senia 31000 Oran, Algeria

3 Department of Natural and Life Sciences, Faculty of Exact Sciences and Natural and Life Sciences,

University of Biskra, BP 145, 07000 Biskra, Algeria

Summary

Eleven samples of the traditional date product ― Btana‖ prepared by direct (DBM) and indirect

method (UBM) were analysed to characterize their bacterial diversity. A total of 42 representative isolates

have been chosen foro molecular identification. 16S rRNA gene sequencing revealed the presence of 20

species within 30.9% belonged to the genus Bacillus, 28.6% of the Staphylococcus, and Enterococcus

genus. Within the minority represented species, two isolates were identified as Paenibacillus (isolated

from UBM exclusively), Streptococci salivarius, Lactobacillus sakei and Klebsiella pneumoniae.

Preliminary results indicate that IBM are more selective for spore former bacilli contrary to DBM that

show more diversity in the bacterial flora with a prevalence of Enterococcus. API ZYM test showed that

the bacilli species have a weak hydrolase activity.

Key words: Btana, Dates, traditional food, bacterial diversity

Introduction

Btana is a traditional date product obtained by processing of ripen date fruits, It is widely consumed in the

rural regions of maghrebian countries. It is a significant part of the diets of the local population in South

of the Algeria, especially in the regions of Ziban (Biskra), Oued Righ Adrar and Beni Abbas. The

traditional date product Btana is usually consumed in household or sometimes it is commercialized in the

rural regions either for consumption or for preparation of sweet dishes and some greediness. In the normal

condition, Btana could be stored for more than two years without any noticeable alteration.

- 93 -

By far Btana is considered one of the popular valorisation forms of date cultivars which don‘t reach the

appreciated market quality as the noble cultivar ―Degluet Nour‖ that is being widely exported. However

the shelf-life of the packaged Degluet Nor is very short at ambient temperature (less than two month) in

comparison of Btana product. Recently many attempts have been done to optimize shelf life of

commercialized dates by applying chemical and physical hurdles like fumigants, vacuum storage,

chlorine (NaClO), ozone (O3), ultraviolet (UV) radiation, heat treatment, freezing or irradiation

(Jemni et al., 2014). However these methods are even expensive or not effective and are depreciated by

consumers who tend gradually for more biological product (Settanni and Corsetti, 2008; Cocolin et al.,

2011). Btana is regarded as natural preservation method that reduces postharvest loss linked to microbial

and insect infestation. Hitherto there is no scientific data about this traditional product, or its microflora

and their dynamic during preservation. Many questions rise concerning the reasons of the stability of

shelf-life of this food-stuff that is more likely to be linked to microbial activity. Thus, the study of the

bacterial composition of Btana would lead to a wealth of information concerning type and distribution of

microbiota in the product.

In general two methods are applied for Btana preparation. The direct Btana method (DBM) is practiced

in eastern south of Algeria (Ziban, Ghardaia, Oued righ and Oued souf), it use soft dates varieties

(especially Ghars cultivar) that are directly amassed into bags by manual pressure. Then bags are stored in

dry conditions about one month to enhance past consistence. By contrast, indirect Btana method (IBM) is

used in western Algerian south, where hard date varieties are often encountered. First of all dates were

cleaned up with fresh water to eliminate impurities using cleaned performed metallic containers. Usually

the villagers soaked dates in hot water to soften date fleshes, then, dates were amalgamated and mixed

thoroughly. At the end of this step, we obtain a paste of date which is usually piled up in proper plastic

bag, or in linen bag or very originally into an old goat skin. The dates paste is piled by layers, with a

strength manual pressure to exclude the residual air from the bag. Sometimes small amount of a grind

mixture of aromatic dried plants as like as basil (Ocinum basilicum L.), juniper (Juniperus communis L.),

rosemary (Rosmarius officinalis L.), wormwood (Artemisia herba-alba L. ) are dispersed on Btana past to

improve the flavour (Abekhti et al., 2013). After filling, bags are attached and closed hermetically. A

short exposure to sun helps to perform the quality of the paste which takes a good consistence. Then the

- 94 -

bags are stocked in a dry place and away from insects and the stock destructors. After one month of

preservation dates would be able for consumption, this period may take several months in some region

depending to the habitant needs.

The production of Btana relies on rural household technology using simple tools. Despite the importance

of Btana in the diet of numerous population in south of Algeria, our understanding of the microorganisms

associated with this food and the microbial succession taking place during preservation of Btana is

limited. The aim of this study was to assess the microorganisms associated with Btana and to reveal the

diversity of microorganisms occurring in the two type of Btana, using a combination of phenotypical and

genotypical methods.

Materials and methods

A total of 11 samples belonging to the date traditional product ―Btana‖ were collected randomly from

housekeeping and selected retail over four region in the south of Algeria country (Sali, Elmeghier, Orlal,

Tolga) and transported immediately in a cooler containing ice to the laboratory for analyses. Twenty five

g of each sample was suspended in 225 ml of buffered peptone water (BPW) and was subsequently

homogenized with a stomacher for 3 min. After Serial dilutions, 1.0 ml of the appropriate dilution was

pour plating in Plate Count Agar (Oxoid, Basingstoke, UK) for enumeration of total aerobic bacteria,

after 72 of aerobic incubation at 30°C. MRS (Oxoid) and BHI agar (Merck) were seeded with 1 ml of

each dilution and incubated in anaerobiosis at 30°C using anaerobic jars with GENbox anaer

(bioMérieux, Marcy-l‘Etoile, France) for 48 h to enumerate LAB and total anaerobic bacteria

respectively.

After incubation, the colonies appearing on the selected plates were counted and expressed by the colony-

forming unit (UFC) per gram. A representative number of colonies per morphology from each sample

were purified by successive streaking on the corresponding agar then microscopically examined by

colony and cells morphology using phase-contrast microscopy. The working purified isolates were grown

on nutrient agar plate or in BHI broth and stored at 4 °C.

Further, the cultures were characterized by Gram and catalase reaction. Isolates showed Gram-positive

and catalase positive reaction was further examined for spore-forming ability by heating BHI broth for 10

min at 80 °C and subsequent incubation at 30°C.

- 95 -

Motility was checked with Motility-mannitol test. In addition, nitrate reduction, citrate utilisation;

acetoine production (VP) test was carried out as follow; Nitrate reduction was tested in peptone nitrate

broth containing 3.0 g/L, Meat extracts 5.0 g/L, Peptone, 1.0 g/L Potassium nitrate. After 24 h of

incubation the results were cheeked after addition 0.5 ml of alpha-napthylamine followed by 0.5 mL

of sulphanilic acid. Citrate utilisation was cheeked by colony streaking on Simmon citrate agar slant

containing (1.0 g/l NH4H2PO4) , 1.0 g/l (K2HPO4) , 5.0 g/L, NaCl, 2.0 g/l Sodium citrate , 0.2 g/l

MgSO4, and 0.08 g/L of the dey Bromothymol blue. Acetoine production was examined by the Voges-

Proskauer test on the Glucose phosphate broth (Clak and Lubs) according to Guiraud (1998). BHI broth

was also used to assess the ability of strains to develop at pH: 4.5 and 9.6 and at temperatures of

8°C , 44°C and 55°C . Halotolerance and osmotolerance were tested by the ability to growth in BHI

broth supplemented with NaCl and sucrose at a final concentrations of 6.5% , 10% (w/v) and 10, 15 and

20 % (w/v) respectively. Ability of isolates to use various carbohydrates was investigated using classic

gallery composed of red phenol base (Difco) supplemented with 1% of the carbohydrate and by the

commercial API 20 NE system (bioMérieux, Marcy l‘Etoile, France) following the manufacturer‘s

instructions.

Determination of enzymatic activity

Starch hydrolysis was evaluated on inorganic salts starch agar. Cultures of isolates were spread in bold

lines on the starch agar medium. After visible growth, the agar surface was flooded with lugol iodine to

cheek for the starch hydrolysis shown by the formation of visible translucent halo around the colonies

(Vera et al., 2012). Casein hydrolysis was determined on streak-inoculated agar mixed from 6 ml

liquefied agar and 2 ml sterile skimmed milk. Haemolysis activity was also examined by growing the

isolates on 5 % horse blood using Columbia Blood Agar base (Oxoid), at 37 °C for 24 h. Further

enzymatic activities were assessed using the semiquantitative APIZYM (bioMérieux) system (Wawron et

al., 2011). Hence, a culture suspension corresponding to 5 McFarland standard was prepared for each

strains then 65 µl of the suspension were inoculated in each of the 20 reaction well in the APIZYM strip

and incubated for 4 h at 37°C. Enzymatic activities were recorded after addition of the APIZYM reagents

A and B according to the manufacturer's instructions. The intensity of the colour was measured on a scale

from 0 to 5 by comparing the colour developed within 5 min to the API-ZYM colour reaction chart.

- 96 -

DNA extraction and PCR.

Representative strains were, grown overnight in brain heart infusion BHI and stored with 25% of glycerol

at -20 C until being subjected to DNA extraction.

DNA was extracted from fresh colonies culture by the DNeasy Tissue Kit (Qiagen) used for isolation of

genomic DNA from Gram-positive bacteria. In short, pure colonies were dissolved in 200 µl of BPS

solution and Centrifuged for 5 min at 300 x g. Then the cell pellet was resuspended in 2 ml microtube

containing 180 µl DNeasy lysis buffer (20 mM Tris-Cl[pH 8.0], 2 mM Sodium EDTA, 1.2% Triton X-

100) and 20 mg/ml lysozyme. The mixture was vigorously vortexed then incubated for 30 min at 37°C.

Then extraction was continued according to the manufacturer‘s protocol. The purified DNA was eluted in

a final volume of 50 µL of sterile ARN free water. The yield (ng) and purity (absorbance ratio at 260/280)

of extracted genomic DNA were determined spectrophotometrically using the Nano Drop® ND-1000

(Labtech International, UK).

The integrity of the extracted DNA was further checked by PCR for amplification of the 16S rRNA gene.

PCR reactions were carried out using 20 µl volumes each containing: 2 µl extracted DNA, 2 µl

of dNTPs (2mM), 1.6 µl of MgCl2 (25 mM), 2 µl PCR buffer (10×), 0.8 µl of each primer (10 µM) 16S-

1500 F: 5‘-GAG- TTT-GAT-CMT-GGC-TCA-G-3‘ (Eurogentec, 3968107, Tm=60°C) 16S-1500

REV: 5‘-TAC-GGT-TAC-CTT-GTT-ACG-AC-3‘ (Eurogentec, 3968108 Tm=58 °C.) and 0.2 µl of Taq

DNA polymerase (2.5U, Fastastart, Roch, Germany). The PCR program was performed with a

Mastercycler gradient (Eppendorf, Westbury, NY) under the following conditions: Initial denaturation at

94 ºC for 5 min, 35 cycles of 94 ºC for 30 s, 56 ºC for 30 s and 72 ºC for 1 min with a final extension at

72 ºC for 5 min. Then, PCR products were stained with gel green and run in 0.8% agarose gel and

visualized by UV transillumination system (Eastman Kodac Company, Scientific Imaging Systems,

Rochester). After purification the DNA extracts were deposited for sequencing by the GIGA centre

(Liège, Belgium)

Sequence analysis and phylogenetic tree construction (liege)

The sequences obtained with forward and reverse primers from each strain were edited and merged into a

single sequence covering about the entire 16S rRNA gene, then sequences were assembled using the

CodonCode Aligner software program (version 3.0.2) and compared to those present in the

- 97 -

GenBank public database using the online BLAST program. Sequence data were aligned with the

ClustalX package and a phylogenetic tree was drawn using the ClustalX program (National Center

for Biotechnology Information) and visualized with the TreeView program.

Results and discussion

Bacteria associated with Btana samples:

The results of bacterial enumeration, of the different traditional Btana samples are summarized in Table 4.

Colony counts are represented as colony forming units (cfu) cfu/g (mean ± SD). Briefly, the aerobic count

in all Btana samples is ranged from 1.6 x 102 to 3.02 x 10

6 UFC/g (Table 2). Orlal samples recorded the

highest number (106 ±1.6 x 10

5 ufc/g) followed by Sali samples 3.4 x 10

5 ± 6 x 10

4). Low loads were

observed in Tolga (1.5 x 103±10

3) and Elmeghier samples (1.6 x 10

2 ufc/g). Thus the preparation method

does not affect in great manner the bacterial load.

In contrast, the anaerobic bacteria count was low and ranged between 0 to 3 x 105 cfu/g. Presumptive

LAB were detected at very low concentration and were not even detected in some samples. Although we

have recorded some colonies on MRS medium, primary tests revealed that a few isolates present the

common features of LAB (Gram and catalase), the majority of the isolates are yeasts or Bacillus spp that

can grow normally on MRS medium. When the samples are considered according to their preparation

method, the F test that compare variance showed no significant difference between the mean of the total

bacteria of the two Btana methods (DBM, UBM). (P>0.05).

Table .4

The microbial counts recorded for the Btana samples.

Samples Samples type and

origin Aerobic count Anaerobic count MRS count

BT1 J (Sali),UBM 3 x 103 30 10

BT2 D (Orlal),DBM 3 x106 7 x 103 1.1 x 102

BT3 G (Orlal), DBM 2.4 x 102 2 x 102 1.9 x 102

BT4 H (Orlal), DBM 3 x 102 ND 20

BT5 I(Orlal), DBM 1.8 x 103 3.1 x 102 30

BT6 B (Orlal), DBM 3 x 106 3 x105 1.7 x105

BT7 L (Tolga), DBM 7 x 102 30 50

BT8 K (Lemghier), DBM 1. 6 x 102 4.7 x 104 1 x 103

BT9 E (Sali), UBM 1.7 x 103 8 x 103 10

BT10 F (Sali), UBM 1 x 106 ND ND

BT11 A (Orlal), DBM 2.2x 103 3 x102 20

- 98 -

After initial characterisation, 204 colonies were selected at random from the different plates according to

their morphological characteristics. The media used for isolation of the colonies and the isolates forms are

summarized in Table 4.

First, the isolates were grouped in three main groups: group 1: rod shaped, Gram-positive, catalase

positive bacteria, showing motility and the ability to form endospores, these isolates were presumptively

identified As Bacillus spp. Group 2: Gram-positive, catalase-positive cocci shaped are presumptively

identified as Staphylococci. Group 3: Gram-positive, catalase negative cocci considered as presumptive

Enterococcus. Minor groups represent Gram positive catalase negative bacteria (presumptive LAB) and

gram negative bacteria. Then, the isolates of each group were cluster according to their results to the

physiological and biochemical tests and a similarity matrix was obtained. Following cluster analysis, a

total of 42 representative isolates were picked from all clusters and subjected to molecular identification

by 16S rRNA gene sequencing In total 20 species have been identified within the representative isolates.

Samples from Orlal showed the highest number of species (16) followed by Sali and Tolga (7 species),

where Elmeghier sample were dominated by one specie. 16S rRNA gene sequencing revealed that 30.9%

of the selected isolates (13) belonged to the genus Bacillus, 28.6% of the isolates (12) to Staphylococcus

orEnterococcus genus. Within the minority represented species, two isolates were identified as

Paenibacillus, Streptococci salivarius, Lactobacillus sakei and Klebsiella pneumoniae with 98–100%

similarity to the original GenBank sequences.

Within Bacillus strains, the isolate belonging to the cluster 1 were close to B. pumilus based on their 16S

rRNA gene sequence similarity (99–100%). Analysis of strain distribution shows that B. pumilis strains

are found in both type of Btana. Isolates from cluster 2 were identified as B. endophyticus (100%

similarity to GeneBank sequences), they show the ability to develop in broth supplemented with 10%

NaCl, and however no haemolysis or hydrolysis of starch and casein were observed. The anaerobic

growth was not observed in this cluster. The isolates were able to hydrolyse rhamnose and manithol, but

not lactose and sorbitol. In addition the isolates belonging to this cluster were exclusively found in Ziban

samples. The cluster 3 was assigned to B. amyliquefaciens following the 16S RNA gene identification.

Indeed phenotypical characters confirm this result as the isolates are strict aerobic bacteria that have a

potent amylase and urease activity and produce readily acid from lactose as so as growth ability in BHI

- 99 -

broth supplemented with 10% (w/v) NaCl. The results confirm the identity of the isolates which would be

misidentified with B. subtilis (Fritze, 2004).

An uncertain identification was obtained for strains belonging to the cluster 4 (GP4, GP14) following the

16s RNA gene identification that show that the strains could be either B nelsonii or B. circulans but with

very low homogeneity score. The phenotypical traits of the two strains originating from Orlal were very

different from the described species and have not been recorded before. Negative growth at 50°C and at

7% NaCl could misidentified the species with B. nealsonii, however the lack of starch hydrolysis activity

and the ability to produce acetoine (vp+) which had been reported to be negative previously for B.

nealsonii as so as the carbohydrate pattern assign the isolates to another species. Based on these

observations and the low score of homogeneity of the 16S RNA gene sequencing, we suggest further

molecular tests to ascertain the identity of the strains like DNA-DNA hybridisation and targeting other

genetic markers.

Within the cluster 5, the isolates; HP1 and LB1 cannot be differentiated on the basis of 16S rDNA

sequence. The score similarity of GenBank database is similar for B. cereus (99%) and for B.

thuringiensis (99%). Beside other genetic marker (cry, plc, gyrA, gyrB genes) that could differentiate the

two strains, some authors propose production of parasporal bodies as a good standard phenotypic

character that differentiate B. thuringiensis from B. cereus (Postollec et al., 2010; Thorsen et al., 2011;

Ahaotu et al., 2013). Hence, HP1 and LB1 were concluded as B. cereus because of absence of parasporal

bodies‘ formation. They present further the diagnostic features for identification of B. cereus that rely on

ability to provoke haemolysis and to hydrolyze lecithin, and the inability to ferment mannitol (Thorsen et

al., 2011)

Although less than that observed for the fermentation of carbohydrates, variability among the different

strains was also seen in terms of the enzymatic activities assayed using the API-ZYM method ). It has

been shown that enzymes produced were characterized by high activities in relation to esterase lipase,

lipase, esterase, and naphtol-AS-BI- phosphohydrolase. The glycosyl hydrolase activity was recorded for

only two strains for β-galactosidase (Paenibacillus macerans; FP2 and Bacillus endophyticus; IP10) and

for β-glucuronidase B safensis; FP4, B. Pumilis; EP1). α-galactosidase and β-glucosidase activities were

- 100 -

shared by the majority of the Bacillus strains (except B. endophyticus, B safensis) and Paenibacillus spp

for β-clucosidase). However N-acetyl--glucosaminidase was exclusively recorded for B pumilis strains.

No activities related to α-glucosidase, alkaline phosphatase and chymotrypisn were recorded. B cereus

Fig. 10. Phylogenetic tree of the bacteria strains isolated from Btana product prepared

according to the neighbor joining methods using BLAST logarithm (http://blast.st-

va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

- 101 -

strains (LB1 and HP1) produced the most enzymes with a great activity, including trypisn enzyme. JP3

isolate belonging to B. endophyticus is the only strain that show a glucosaminidase and α-fucosidase

activities whereas the other isolates (IP10, LP7) belonging to the same species, showed differences in

their enzymatic profiles. The observed difference may reflect a geographic variation in types of bacterial

enzymes present. The isolate HP3 identified as Klebsiella pneuminae (HP3) shows a strongest enzymatic

profile expressed by 12 produced enzymes. The high activity was recorded for esterase, naphtol-AS-BI-

phosphohydrolase, α-galactosidase, and N-acetyl-glucosaminidase.

Examination of the strains‘ enzymatic profile does not ever come in favour of the adaptation of the

isolated strains to the date composition. The Btana product is prepared from date fruit that have has a

great content of carbohydrates including disaccharide and simple sugars like ―sucrose, glucose, fructose

and maltose and other complexes carbohydrate fibres (Vaylil, 2012). The only glucosyl hydrolase

activities frequently encountered were a strong α-galactosidase activity and β-glucosidase. Nevertheless

these activities have not the same extent in all strains and were expressed in the present of specific

substrates like a-galactosidase enzyme that is linked to lactose availability.

Table.5 The enzymatic profile of the representatives‘ bacilli isolated from Btana samples.

- 102 -

In other hand, the acid pH recorded for Btana product revealed by Abekhti et al.(2014) is resulted from

yeast rather than bacterial activity. Indeed, a wide range of traditional fermented product are typically

dominated by Bacillus spp like B. pumilus, B. circulans B. safensis responsible for their high pH through

alkaline fermentation and proteins hydrolysis into amino acids and ammonia (Agbobatinkpo et al., 2013).

Thus, the presence of the bacillus strains in Btana product do not provide a useful information to consider

that the strains are adapted to the chemical composition of Btana but rather suggest that they are

environment contaminants. In other hand, the different bacillus species observed could be explained by

the disparity of the hygienic quality of the date fruits used in Btana preparation.

The safety of Btana samples (particularly DBM samples) is compromised by the presence of pathogenic

strains of B. cereus found in Tolga and Orlal samples. This is due to the spontaneous aspect of the

fermentation of Btana where the microbiological risk cannot be totally ruled out ( Ahaotu et al., 2013;

Thorsen et al., 2010). However it is difficult to imagine that B. cereus could develop in such product

owing to its poor protein content which is necessary to the development of Bacillus (Odunfa, 1985).

Further a bacterial load of 103–10

5 CFU/g is necessary to speak about the health concern for this

bacterium according to European recommendations (EFSA, 2005; Thorsen et al., 2011).

- 103 -

Table 6 Phenotipical clustering of the selected rods strains.

Phenotipical

group

Clust 1 Clust 2 Clust 3 Clust 4 Clust 5 Clust 6

Representatives Strains(N°)

Tests

EP1(4) FP4(2)

FP6(1)

LP20 (7) DP6(3),

GP10

LP7 (4) JP3 (3)

LP10(1)

IP14, IP10 GP4 GP14 (5)

HP1, LB1 (2)

IB2(1) FP2 (1)

ANA D - + - + - -

NO3 - - - + + +

Spore + + + + + + +

STAR - - ++ - + + +

CASE + - + - + - -

NACL 6.5% + + + - - - -

NACL 10% D D - - - - -

PH 9,6 + + - + + + -

Ph 4,5 + + - + + - +

Growth at

44°c

+ + + + + - +

55°c - - - - - - +

Β-hemolyse + - - - ++ - +

VP + - + + + - +

Cit - - - - - - -

lactose - - + + + + +

Acid from

glucose + + + + + + +

Urée D - + + + - -

rhamnose D + - - - + +

manithol + + + - + + +

sorbitol + - + + + -

lecithin ND ND ND + + ND ND

16 s RNA BLAST hit

B. pumilis B. endophytucis

B. amyloliquefaciens

B. nealsonii /circulans

B. cereus Paenibacillusxylanexedens

P. Macerans,

Within the cocci group, Staphylococcus, Enterococcus and Streptococcus species have been detected in

Btana samples. Biochemical tests clustered most of the analysed strains into well-separated groups

representing individual species except for clust 7 (Table 7) that represent a heterogeneous group, due to

- 104 -

the narrow differences observed in the strain‘s biochemical profiles. Representative isolates tentatively

identified based on 16S rRNA gene sequencing were also subjected to RAPD profiling in order to

facilitate discrimination of confusing isolates with different and low similarity score.

Fig. 11. A: RAPD profile of representative Enterococcus species (E. mundtii: BM1, IB1, IP17; E.

faecium: LB2, DP5, FP13, JM1, AP7; E. faecalis: IP16, KB1, IM1, HP6) isolated from Btana product.

B: RAPD profile of representative Staphylococcus species isolated from Btana product (S.

epidermidis: Ap3, Er5, AP17, GP15; S. pasteuri: AP1, ER3; S capitis: FP5; unidentified: DR2; S

hominis: JM2

Within the clust 1; twelve Saphylococcus pasteuri isolates were identified in Sali and Orlal samples, all of

which showed 99% sequence similarity to the closest Genbank sequence and nearly 98% to each other.

However, Genbank proposed an ambiguous identity with S. warneri due to the high similairity between

the much closed species (Bergeron et al., 2011; Behme et al., 1996). Only the present of the yellow

pigment and the high urease activity, have confirmed the identity of the strains as S. pasteuri (Deh Sheikh

A

B

- 105 -

and Hosseini, 2013 Götz et al., 2006). The representative strains from this group gave a similar RAPD

pattern with the exception of DR2 strains (cf., Fig 11 ).

The majority of the strains belonging to the cluster 2 were isolated from Orlal samples (one strains from

Sali sample); they were identified as Staphylococcus epidermidis and shared 100% identity with each

other and 99.9% similarity with the nearest Genbbank sequences,. RAPD profiling shows tow different

patterns for the four strains. While AP3, ER5 and GP15 present the same pattern, AP7 provide distinctive

pattern. S. capitis and S. hominis composed a distinct clusters and RAPD pattern and are rarely in Sali

samples. However S. hominis and S pasteuri that belong to the S. epidermidis group are not frequently

found in food but in human samples (Irlinger, 2008). Kloos and Schleifer, (1975b) found that

Staphylococcus hominis is prevalent on human skin and it is usually found in second or equal number to

S. epidermidis. Euzéby (2003) reported that S. capitis is commonly associated with the skin of

humans and the hides of warm-blooded animals. Also it is well known that many Staphylococci

species are common inhabitant of human skin and mucous membranes of individuals manipulating food

and animals, and are able to contaminate raw products and processed foods if these are not handled

properly (Cunha et al., 2006). Recently S. hominis have been isolated from fish fermented product. This

suggest that are prevailing in water foodstuff, and their presence in IBM might be originated from water

used during Btana preparation. In other side, Staphylococci predominates the microflora of high

osmophilic food owing to their higher resistance to NaCl and particularly their lower oxygen demands

(Pirone and Manganelli, 1990; Samelis et al., 1998). Btana product can then support the growth of

staphylococcus species and different species were observed to prevail in each type of Btana examined.

Previous study demonstrated the permanent presence of Staphylococcus spp in high sugar foods like

sugar thick juice (Justé et al., 2008). Besides, some Staphylococcus spp have previously been reported to

grow at aw as low as 0.83. It had been also shown that the presence of solutes in the medium contribute to

sucrose tolerance of Staphyococcus species. Thus it could be hypothesised that the presence of high

proline content in date enhance osmotolerance of Staphylococcus strains and contribute to intracellular

homeostasis (Robert et al., 2000). The strains identified within the cluster 5 are assigned to Entercocus

mundtii. Indeed they present the key features of the species; like the characteristic yellow pigments that

agree with the phenotypic description of E. mundtii specie (Naser et al., 2005). Regarding RAPD

- 106 -

fingerprinting, E mundtii isolates were shown to have the same RAPD patterns except the strain IB1

wherein some variation in amplified bands were observed (Fig.). E. mundtii strains were mainly

encountered in Orlal DBM samples. Three Enterococcus faecalis strains were identified in the cluster 6

and showed 99.9% identity to Genbank, and all these were isolated from DBM samples (Lemeghiar and

Tolga) and present a similar unique RAPD band. Three isolates identified within the cluster 7 are

assigned to Enterococcus faecium, they were isolated from three samples (Orlal, Lemghier and Sali)

while tow other species were identified in the same cluster (HP6 :E. lactis, AP7 : Streptococcus

salivarius). The isolate JM1 has a very low homogeneity score with the Genbank database, the most close

species is E. mundtii (91%). RAPD fingerprinting does not show any variation to the other

strains.According to our results, Staphylococcus spp are the prevalent cocci genus in both DBM (Orlal)

and IBM (Sali) samples, whereas the predominant species was S. epidermidis. Also, we found no

differences in the frequency of isolation of E. mundtii and E faecium strains that were widespread in all

type of Btana except Elmaghier sample that was quasi dominated by the species (E. mundtii). It is

important to note that the Orlal samples (DBM) exhibited the greater diversity in species, and have

representative of almost all isolated species with the exception of S. pasteuri found in a Sali samples. The

RAPD-PCR profiles may reliably distinguish Staphylococcus and Enterococcus species.

Table. 7 : phenotipical clustering of the selected cocci strains.

Conclusion

Phenotipical group Clus 1 (7) Clu 2 (10) Clu 3 (12) Clu 4 (4) Clus 5(12) Clus 7

Representatives Strains(number)

Tests

Ap1(2), Db1(3), Eb3(2)

Ap3(4), ap16(3), ap2(1), Eb5(2)

Bm1 (8), Ib1 (2), ip17(2)

Ip16(1), Kb1(2), Lm1

Dp6(1), Hp6* (lactis) (1),

Fp13(4),

Jm1(1), Lb2(3), Ap7(2)

Fp5(3)

pigments + - + - - -

G 45°C + + + + + +

pH 9,6 + + + + + +

6,5% NaCl + + + + + +

10% NaCl + + - - + +

60°C/30mi + + + + + +

Manith + - + + + +

catalase + + - - - +

CAS - + + + + -

NIT + + - - - +

Esculine - - + + + -

VP + + + + + +

Gas from glucose - - - - - -

hemolyse - - - - - -

16 s RNA BLAST hit S pasteuri S. epidermidis E. mundtii E. faecalis E. faecium

S capitis

- 107 -

Identification of isolates in this study demonstrated that bacilli spore former bacteria are the main

bacterial flora hinting prevailed in the traditional date product Btana. Data analysis showed the presence

of distinct species in both types of Btana but a high count was found in UBM samples.

It is well known that Bacillus spp are usually reported to be the main micro-organisms responsible for the

fermentation of high pH foods (Parkouda et al., 2009; Ouoba et al., 2008b). Thus their presence in Btana

could be regarded as an environment contamination that is believed to be originating from raw material

and utensils used in Btana preparation. In addition the occurrence of Bacillus spp and also the subsequent

domination observed in some samples is likely to have originated through the ubiquitous presence of

airborne bacilli spores in the environment that carry a high genetic diversity and concentration depending

on the geographical locations. Further the selective pressure induced by the high sugar content of Btana

product reflects the natural selection of the bacilli spore former bacteria which would presumably

acquired during the prolonged preservation period. However, there are no data about the involvement of

Bacillus species in date or date product spoilage, thus it might be assumed that most Bacilli spore former

bacteria detected Btana, either did not germinate or were not metabolically active. The other bacteria

detected (Staphylococcus and Streptococcus spp) are originated from external contamination during Btana

preparation. The raw dates, water, utensils, bags of storage and the drying environment in which Btana

preparation is hold are the main sources of this contamination. By far, preliminary results indicate IBM

are more selective of spore former bacilli contrary to DBM that show more diversity in the bacterial flora

with a prevalence of Enterococcus and Staphylococcus species. Nevertheless, additional data are

required for the other microbial flora (yeast and fungi) that could carry a functional role during data

preservation.

References:

1. Jemni, M., Oton, M., Ramirez, J. G., Art e-ern andez, F., Chaira, N., Ferchichi, A., 2014.

Conventional and emergent sanitizers decreased Ectomyelois ceratoniae infestation and

maintained quality of date palm after shelf-life. Postharvest Biology and Technology, 87, 33-41.

2. Cocolin, L., Dolci, P., Rantsiou, K., 2011. Biodiversity and dynamics of meat fermentations: the

contribution of molecular methods for a better comprehension of a complex ecosystem. Meat

Science 89, 296–302.

3. Settanni, L., Corsetti A., 2008. Application of bacteriocins in vegetable food biopreservation. Int.

Journal of Food Microbiology 121, 123–138.

- 108 -

4. Wawron, W., M, Bochniarz., Szczubial, M., 2011. Enzymatic activity of yeasts isolated from the

inflamed mammary secretion in dairy cows.

Polish Journal of Veterinary Science 14, 65-68.

5. Vera, J., Castro, J., Contreras, R., González, A., Moenne, A., 2012. Oligo-carrageenans induce a

long-term and broad-range protection against pathogens in tobacco plants (var. Xanthi).

Physiology Molecular Plant Pathology 79, 31–39.

6. Fritze, D. 2004. Taxonomy and systematics of the aerobic endospore forming bacteria: Bacillus

and related genera. In

Bacterial Spore Formers ed. Ricca, E., Henriques, A.O. and Cutting, S.M. pp. 17–34. Norfolk,

UK: Horizon Bioscience.

7. Postollec, F., Bonilla, S., Baron, F., Jan, S., Gautier, M., Mathot, A.G., et al., 2010. A

multiparametric PCR-based tool for fast detection and identification of sporeforming bacteria in

food. International Journal of Food Microbiology 2010, 18

8. Thorsen, L., Abdelgadir, W.S., Rønsbo, M.H., Abban, S., Hamad, S.H., Nielsen, D.S., Jakobsen,

M., 2011. Identification and safety evaluation ofBacillus species occurring in high numbers

during spontaneous fermentations to produce Gergoush, a traditional Sudanese bread snack.

International Journal of Food Microbiology 146(3), 244–252.

9. Ahaotu, I., Anyogu, A., Njoku, O.H., Odu, N.N., Sutherland, J.P., Ouoba, L., 2013. Molecular

identification and safety of Bacillus species involved in the fermentation of African oil beans

(Pentaclethra macrophylla Benth) for production of Ugba. International Journal of Food

Microbiology 162(1), 95-104.

10. Vayalil, P.K., 2012. Date fruits (Phoenix dactylifera Linn): an emerging medicinal food. Critical

Reviews in

Food Science and Nutrition, 52: 249-271.

11. Agbobatinkpo, P.B., Thorsen, L., Nielsen, D.S., Azokpota, P., Akissoe, N., Hounhouigan, J.D.,

Jakobsen, M., 2013. Biodiversity of aerobic endospore-forming bacterial species occurring in

Yanyanku and Ikpiru, fermented seeds of Hibiscus sabdariffa used to produce food condiments in

Benin. International Journal of Food Microbiology 163, 231–238.

12. Bergeron, M., Dauwalder, O., Gouy, M., Freydiere, A.-M., Bes, M., Meugnier, H., Benito, Y.,

Etienne, J., Lina, G., Vandenesch, F., 2011. Species identification of staphylococci by

amplification and sequencing of the tuf gene compared to the gap gene and by matrix-assisted

laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. European journal of clinical

microbiology and infectious diseases 30, 343-354.

13. Behme, R,J., Shuttleworth, R., McNabb, A., Colby, W.D., 1996. Identification of staphylococci

with a self-educating system using fatty acid analysis and biochemical tests. Journal of Clinical

Microbiology 34, 3075-3084

14. Götz, F., T. Bannerman, and K.-H. Schleifer. 2006. The genera Staphylococcus and

Macrococcus, p. 5-75. In M. Dworkin (ed.), Procaryotes, vol. 4. Springer, New York, NY.

15. Irlinger, F., 2008. Safety assessment of dairy micoorganisms: Coagulase negative Staphylococci.

International Journal of Food Microbiology 126, 302-310.

16. Kloos, W. E., Schleifer, K.H., 1975b. Isolation and characterization of staphylococci from human

skin. II: Description of four new species: Staphylococcus warneri, Staphylococccus capitis,

Staphylococcus hominis, and Staphylococcus simulans. International Journal of Systetatic

Bacteriology 25, 62-79.

17. Euzéby, J.P., 2003. List of bacterial names with standing in nomenclature. Available online on 04

May 201 1 at: http://www.bacterio.cict.fr/s/staphylococcus.html.

- 109 -

18. Cunha, M.L.R.S., Rugolo, L. M. S. S., Lopes, C. A. M., 2006. Study of virulence factors in

coagulase-negative staphylococci isolated from newborns. Mem Inst Oswaldo Cruz Rio de

Janeiro 101(6), 661-668.

19. Pirone, G., Manganelli, E., Diaferia, C., 1990. Caratterizzazione di batteri lattici isolati da salami

tipo Napoli. Industria Conserve 65, 33-35.

20. Samelis, J., Metaxopoulos, J., Vlassi, M., Pappa, A., 1998. Stability and safety of traditional

Greek salami Ð a microbiological ecology

study. International Journal of Food Microbiology 44, 69-82.

21. Justé, A., Lievens, B., Frans, I., Klingeberg, M., Michiels, C.W., Willems, K.A., 2008. Present

knowledge of the bacterial microflora in the extreme environment of sugar thick juice. Food

Microbiology 25, 831-836.

22. Robert, R., Le Marrec, C., Blanco, C., Jebbar, M., 2000. Glycine betaine, carnitine and choline

enhance salinity tolerance and prevent the accumulation of sodium to a level inhibiting growth of

Tetragenococcus halophila. Applied and Environmental Microbiology 66, 509-517.

23. Naser, S.M., Thompson, F.L., Hoste, B., Gevers, D., Dawyndt, P., Vancanneyt, M. Swings, J.,

2005. Application of multilocus sequence analysis (MLSA) for rapid identification of

Enterococcus species based on rpoA and pheS genes. Microbiology 151, 2141-2150

- 110 -

2- Optimisation de l’extraction d’ADN à partir du produit dattier

Traditionnel Btana

L‘objectif de cette partie est l‘optimisation de l‘extraction d‘ADN à partir des échantillons de

Btana. La préparation de l‘échantillon pour les analyses moléculaires est une étape critique qui ne doit pas

être sous estimée. Pour cette raison le choix du protocole d‘extraction d‘ADN, est d‘une importance

capitale. Dans le cas contraire il y aura des biais qui empêchent toute interprétation cohérente. L‘objectif

était de déterminer la méthode d‘extraction d‘ADN permettant de récupérer le plus d‘ADN génomique

tout en éliminant les inhibiteurs de PCR de la matrice de Btana. Nous avons donc comparé différentes

combinaisons de procédures de lyse et de purification. Les méthodes utilisée reposent sur la lyse

enzymatique avec du lysozyme et de la proteinase K (3) et les méthodes physiques tel que le broyage

avec des billes. Le kit commercial DNeasy® (QIAGEN, Germany) a été aussi utilisé pour cette étude.

Concernant la purification de l‘ADN, une combinaison de méthode de purification à

l‘hexdecyltrimethylammonium bromide (CTAB), le polyvinylpyrrolidone (PVP ) et le NaCl intégrant un

traitement final au phénolchloroforme- alcool isoamyl, et le kit commercial NucleoSpin ® Kit (Clontech,

UK) ont été utilisé. Les rendements ont été mesurés par le spectrofluorimètre NanoDrop® ND-1000 et la

pureté par le rapport d‘absorption 260/280 nm. Au final, une PCR du gène codant pour l‘ ARN

ribosomal 16S suivi d‘une électrophorèse sur gel d‘agarose (0.8%) valide les protocoles mis en ouvre.

D‘après nos résultats, la méthode d‘extraction et de purification du protocole d‘extraction «

phénol-chloroforme » permet d‘obtenir un rendement très supérieur à celui obtenu avec le kit Qiagen,

elle est donc plus adaptée pour extraire l‘ADN d‘échantillons présentant des faibles quantités de matériel

biologique, et de nombreux inhibiteur de PCR comme c‘est le cas pour les dattes et le Btana.

L‘essentiel du travail est présenté dans l‘article suivant :

- 111 -

Article 2: Optimization of DNA extraction from the Algerian traditional date’s product

“Btana”

Abekhti Abdelkader*1,2,3

, Taminau Bernard 1 Kihal Mebrouk

2, Daube Georges

1.

1 University of Liège, Faculty of Veterinary Medicine, Food Sciences Department, Sart Tilman, B43b 4000

Liege, Belgium

2 Laboratory of Applied Microbiology, Department of Biology, Faculty of Science, Oran University, BP16,

Es-senia 31000 Oran, Algeria

3 Department of Natural and Life Sciences, Faculty of Exact Sciences and Natural and Life Sciences,

University of Biskra, BP 145, 07000 Biskra, Algeria

Abstract

Btana is traditional preservation method that can sustain date‘s supply during many years in comparison

to the commercial storage methods. However no scientific informations are available about biological

factors that contribute to the successful of this method. Bacterial communities are a major key in

preservation of many foods. Culture independent techniques are the most powerful tools to enhance

bacterial diversity studies, but their efficiencies start with DNA extraction step. Therefore we have

studied 3 protocols of DNA extraction from 11 Btana samples to evaluate their yield in total microbial

DNA recovery. Protocols were based on a commercial kit DNeasy (QIAGEN, Germany) and two

modified CTAB extraction methods (combined CTAB-DNeasy protocol, modified CTAB protocol) using

polyvinyl pyrrolidone (PVP) and treatment with high salt solution (5M NaCl). Protocols were compared

for quantity of DNA extracted using NanoDrop® ND-1000 Spectrophotometer and quality of DNA by

260/280 nm absorption ratio. The total extracted DNA was cheeked by PCR amplification of the 16S

rRNA and visualized by electrophoresis on agarose gel (0.8%). Results showed that CTAB modified

method provide the best DNA yield; however purification with NucleoSpin® Kit (Clontech, UK) was

mostly needed for amplifying the DNA template. DNeasy kit protocol gave an amplified high quality

DNA, but poor yields were obtained from date samples.

Keywords : Traditional foods; Dates; Btana; DNA extraction; CTAB.

Introduction

Date palm (Phoenix dactylifera) is a monocotyledon tree grown in many regions of the world.

The edible parts of P. dactylifera is the ripe fruit which has a high nutritional value and contains a

remarkable content of vitamins, fiber, sugars, salts and trace amount of fat and proteins (Vayalil 2012; Al-

Shahib and Marshall 2003). In South Algerian rural cities, dates represent a major source of income for

many families and are daily consumed practically during the holy month of Ramadan, popular festivities,

funerals and to welcome guests. The local population has developed a number of date preservation

methods to overcome the post harvesting lost. The basic method is named Btana which involve

- 112 -

transformation and storage of date at ambient temperature. Preparation of this product is still performed

by deep rooted food culture of the rural Algerian communities and is highly appreciated. A necessary

need urge us to study this traditional date products because it represent a local knowledge that should be

maintained and scientifically understood to find out all factors that might contribute to the preservation of

this local heritage. In recent years several high throughput molecular techniques have been successfully

used to detect and survey bacterial flora in traditional foods (Abriouel et al., 2006; Greppi et al., 2013;

Mukisa et al., 2012; Nam et al., 2012). Nevertheless, some difficulties have severely limited the depth

characterization of microbial diversity by theses new edge techniques (Pinto et al., 2007). The ability to

extract a representative and sufficient amount of total DNA is one of the most concerns of microbiologist.

The most pitfalls for microbial diversity studies frequently arise from low DNA yield, no suitable purity,

degradation, that lead to altered informations on diversity richness (Thakuria et al., 2008). DNA

extraction has therefore been highlighted as a limitation of culture-independent methods (Abriouel et al.,

2006). Choosing an extraction method often involves a trade-off between cost (materials and labor), the

optimal yield of DNA and the removal of substances that could interfere with the PCR reaction (Cankar et

al., 2006). Like other fruits, date presents many drawbacks for DNA extraction due to its complex

composition and the presence of a broad range of polysaccharides, carbohydrates, polyphenolics, fibers

and a high content of salts which can interfere with enzymatic and chemical reactions during DNA

extraction (Boudries et al., 2007; Vayalil 2012). Many authors revealed that the presence of these

molecules affects negatively the classical extraction protocols and many commercial kits (Probeski et al.,

1997; Gudenschwager et al., 2012; Mamlouk et al., 2011). The use of the solid polymer PVP (polyvinyl

pyrrolidone) and the ionic detergent CTAB (hexadecyltrimethyl ammonium bromide) was proposed as a

powerful alternative to remove polyphenols and polysaccharides respectively (Probeski et al., 1997; Jara

et al., 2008). CTAB protocols which often combine the use of treatments with PVP and high salt

solution, are cheap extraction methods compared to commercial kits, however many modifications were

carried out on the initial protocol proposed by Doyle and Doyle (1990) to suit the particularities of each

food matrices (Michiels et al., 2003; Jara et al., 2008, Mamlouk 2011). Here we compared a commercial

kit of DNA extraction; DNeasy Blood and Tissue kit (QIAGEN, GmbH, Hilden, Germany) with two

modified CTAB protocols to assess their efficiencies in bacterial DNA extraction from the Algerian

- 113 -

traditional date‘s product ―Btana‖. The protocols efficiency was verified by DNA yield, purity and

amplification of the 16SRNA gene.

Materials and methods

Preparation of samples

Eleven samples of date products ―Btana‖ were collected from different localities in the South of Algeria.

Twenty five grams of date past was homogenized in sterile bag with 225 ml of phosphate buffered saline

(8.5 g NaCl, 1.1 g K2HPO4, 0.32 KH2PO4, pH 7.4) using Stomacher apparatus, then 1 ml of each

sample was centrifuged for 10 min at 14,000 rpm to harvest bacterial cells. Pellets were treated according

to three protocols: DNeasy(A), CTAB(B), DNeasy-CTAB (C). Crude DNA from each protocol was

purified with Nucleospin (Clontech, UK) kit according to the manufacturer‘s instructions.

Protocols A: DNeasy kit

Qiagen DNeasy Plant kit (QIAGEN, Germany) was used following the manufacturer‘s recommendations

with introduction of a grinding step as mentioned below.

Protocols B: CTAB (modified by Probeski et al., 1997)

The extraction buffer contained [100mM Tris, pH 8, 1.4M NaCl, 30mM EDTA, pH 8] was autoclaved

and 2% of polyvinylpyrrolidone (PVP, Sigma-Aldrich, St Louis, USA), 2% CTAB (cethyltrimethyl

ammoniumbromide, Sigma-Aldrich, St Louis, USA) were added after filter sterilization. Before use 1%

(v/v) β-mercaptoethanol and 40mg/ml of lysozyme were added to the solution.

The buffer was preheated (56°C) and added (500µl) to the pellet, then homogenized by vortexing for 5 s.

Microtubes were then incubated at 56 °C in a Thermomixer (Eppendorf AG, Hamburg, Germany) for 1h.

The lysis step was followed by grinding with approximately 3 g of 710-1180µm diameter acid-washed

glass beads (Sigma, USA) in a bead beater instrument (Vortex Genie2, Scientific Industries) for 10s.

Then 20µl of Proteinase K were added to the pellet, and incubated at 56°C for 1 h.

The solution obtained after enzymatic digestion was centrifuged (12,000 rpm) for 5 minutes. Afterword,

supernatant was cooled at room temperature, overlapped with 1V Alcohol isoamilic:chloroform (1:24)

and mixed thoroughly by inverting the tubes to form an emulsion. Then a centrifugation was performed

- 114 -

(12,000 rpm) for ten minutes. The aqueous phase was recuperated, treated with ½ V of 5M NaCl ,

precipitated with 2V of absolute cold ethanol (-20°C) and stored at -20°C during 10 min.

Crude ADN pellet was obtained by centrifugation at 12,000 rpm for 10 min then washed with 200µl of

cold 70% ethanol, and re-suspended in sterile RNA free water.

Protocols C : CTAB-DNeasy

Samples were treated as mentioned in the early step of CTAB protocol. The upper aqueous phase

obtained after alcohol isoamilic:chloroform treatment was directly transferred to a DNeasy column and

treated according to the manufacturer instructions.

DNA recovery

DNA concentration and purity were checked by spectrophotometric measure using NanoDrop ND-2000

spectrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington DE) according to the manufacturer's instructions (the

absorption ratio 260/280 nm was considered to assess purity of DNA). The extracted DNA was further

checked in PCR for amplification of the 16S rRNA gene.

PCR reactions were carried out using 20 µl volumes each containing: 2 µl extracted DNA, 2 µl of dNTPs

(2mM), 1.6 µl of MgCl2 (25 mM), 2 µl PCR buffer (10×), 0.8 µl of each primer (10 µM) 16S-1500 F: 5‘-

GAG-TTT-GAT-CMT-GGC-TCA-G-3‘ (Eurogentec, 3968107, Tm=60°C) 16S-1500 REV: 5‘-TAC-

GGT-TAC-CTTGTTACGAC-3‘ (Eurogentec, 3968108 Tm=58 °C.) and 0.2 µl of Taq DNA polymerase

(2.5U, Fastastart, Roch, Germany) and 2µl Bovine Serum Albumin (BSA, Invitrogen, USA). The PCR

program was performed with a Mastercycler gradient (Eppendorf, Westbury, NY) under the following

conditions: Initial denaturation at 94 ºC for 5 min, 35 cycles at 94 ºC for 30 s, 56 ºC for 30 s and 72 ºC

for 1 min with a final extension at 72 ºC for 5 min.

DNA purification

The extracted DNA samples were purified with the genomic DNA-clean-up NucleoSpin kit

(Macherey, Nagel GmbH, Düren, Germany) according to the manufacturer's recommendations.

Then, PCR products were run in 0.8% agarose gel and visualized by UV transillumination

system (Eastman Kodac Company, Scientific Imaging Systems, Rochester).

Statistical analysis

- 115 -

Values of different parameters were expressed as the mean of duplicate determinations ± standard error.

ANOVA analysis was used to analysis data within and between protocols (A, B, C) with α value selected

at 0.05. Post hoc analysis was performed with Tukey multiple comparison test to see the difference of

DNA yield and purity between the methods.

For comparison of the effect of purification on DNA quality and yield, repeated measures ANOVA were

used. The statistical analyses were performed using GraphPad Prism 5.01 software.

Results

In the present study, we have assayed 3 different DNA extraction protocols from the traditional

date products ―Btana‖ to see the most suitable extraction method that yield best quality and quantity of

the total microbial DNA for metagenomics or other downstream applications. The PCR products of 16S

rRNA gene visualized by electrophoresis were further used to confirm the effectiveness of the protocols

(Fig. 1 and 2). Table 1 summarized the yield of DNA and A260/280 obtained with 11 Btana samples by

the various extraction methods using Nanodrop spectrophotometer. Results are presented as mean of

duplicate measure ± standard deviation.

M A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A1p A2p A3p A4p A5p A6p A7p A8p A9p A10p A11p

b

M B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B1p B2p B3p B4p B5p B6p B7p B8p B9p B10p B11p

c

M C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11

Fig. 12 0.8% Gel electrophoresis of 16S RNA amplicon products extracted from 11 Btana samples with three

DNA extraction protocols (a: DNeasy, b: CTAB, c: CTAB-DNeasy) and purified with Nucleospin kit (P).

The commercial DNA extraction kit DNeasy (A) allowed a moderate DNA amounts ranging from 5.70 to

28.60 ng/µl (P>0.05). However, DNeasy kit was the most efficient in DNA amplification as eight (1, 4, 5,

7, 8, 9, 10, and 11) out of the eleven samples were amplified after this protocol, although DNA quality

- 116 -

was not satisfactory. After purification, a substantial amount of DNA (69.8%) was lost but DNA purity

was almost ameliorated and all samples were successfully amplified.

DNA yields using CTAB protocol (B) record a concentration ranged from 18.80 ng/µl to 437 ng/µl and

varied strongly according to the samples (P<0.05). Samples (1, 3, 4, 5, 8, and 10) were strongly inhibited

before purification. A great lost (55.65%) in DNA yield was observed after purification as stated by

ANOVA matched pairs test (P<0.05). The ratio A260/A280 was slightly increased after purification

leading to an improvement in amplification and signal intensity (Fig.2,3).

Fig. 13 Mean values of DNA yield from three protocols A: DNeasy, B: CTAB, C: CTAB-DNeasy) and yield

after DNA purification from protocols DNeasy (AP) and CTAB (BP). The box whiskers indicate the

minimum and maximum values.

- 117 -

Fig. 14 Mean values of absorption ratio (260/280) used to check DNA purity from the three protocols

A:DNeasy, B: CTAB, C: CTAB-DNeasy) and after DNA purification from DNeasy (AP) and CTAB (BP). The

box whiskers indicate the minimum and maximum values.

Table. 8 Concentration and purity of crude and purified DNA from Btana samples with protocols (A, B,

C) and PCR efficiency. Different letters in the same row indicates significant different values.

Protocol A (DNeasy) Protocol B

(CTAB)

Protocol C (CTAB-

DNeasy)

Protocol A P

(DNeasy)

Protocol B P

(CTAB)

DNA (ng/µl) 13,60 ± 1.9a 100,6 ± 63.65b 5,182 ± 0.9a 4,168 ± 0.74a 61,94 ± 30.04a

DO260/280 1,56 ± 0.1a 1,607± 0.14a 2,61 ±0.63a 3,059 ± 0.72a 2,422 ± 0.42a

Amplification

(positive

samples/11)

8 5 3 11 10

Protocol (C) produced the poorest yields as amplification was partially successful for only 3 samples

(3, 5, and 6). DNA purification loses a substantial DNA yields and brought no efficiency in amplification,

except for sample 2 (result not shown). Statistical results, indicated a significant difference (P<0.01) in

DNA extracted by the various protocols. Post hoc analysis using Tukey‘s analysis showed that the

statistically significant difference detected was between the CTAB Protocol (B) and both [DNeasy (A),

CTAB-DNeasy (C)] protocols (P<0.05). However no significant difference was found between Protocol

A and C (P>0.05). DNA purity analysis showed no significant difference between the tested protocols

(P>0.05) according to ANOVA analysis (Table.1). A significant effect (P<0.05) was found between the

amplification and used extraction protocol, however no relationship was found between DNA

concentration and 260/280 ratio and DNA amplification (P>0.05).

Discussion

In food microbiology, many protocols were developed for DNA extraction from food matrices to

study their microbial diversity by independent culture methods. The effectiveness of DNA extraction

depends on food properties, particularly their contents of complex molecules that often co-extracte with

DNA or inhibit its amplification like organic carbon, proteins, pigments (Jara et al., 2008). Other

contaminants arise with the extraction method undergone (Gudenschwager et al., 2012). So it is crucial to

- 118 -

choose adequate methods that provide an unbiased isolated DNA for reflecting true representation of the

microbial community.

The main criteria for validation of these methods are based on quantitative and qualitative analysis (Jara

et al., 2008). Some studies were conducted on total genomic of date‘s part (leaves, fruits, roots) for

botanic and phytopathologic purposes (Arif et al., 2010). However, no relevant studies hitherto intended

to study the microbial diversity of dates or traditional date‘s products (like Btana) by direct extraction of

microbial DNA. We therefore evaluated three methods for quality and yield of the extracted DNA from

11 Btana samples. The DNA extraction protocols followed involved combinations of mechanical,

chemical and enzymatic lysing procedures. Two protocols (B, C) were a modified CTAB protocol, and

one protocol (A) was a commercial kit widely used in DNA extraction (DNeasy). Chemical composition

of Btana is not yet known; by contrast date‘s composition is well defined. They are rich in carbohydrates

like glucose, fructose and sucrose, and represent a good source of fibers (6.4–11.5%) as well as many

essential minerals (0.10–916 mg/ 100 g dry weight), flavonoids, and phenolic compounds (Benmeddour

et al., 2012). The presence of the aforementioned elements makes microbial DNA extraction more

difficult and can inhibit the activity of enzymes responsible for DNA synthesis or interfere in the

quantification of nucleic acids by spectrophotometric methods (Moyo et al., 2008). Protocols (B, C) used

the cationic surfactant CTAB that had been increasingly applied to extract DNA and RNA from plant

tissues and in particular polysaccharide-rich plants (Wang and Stegemann 2010). β-mercaptoethanol and

PVP are thought to forms complex hydrogen bonds with polyphenolic compounds and help their

precipitation and separation from DNA by centrifugation (Wang and Stegemann 2010). Many authors

brought modification on the CTAB protocol to fit to the sample characteristics by coupling with silica

column, adding up the volume of extraction buffer, or treatment with NaCl solution (Sánchez-Hernández

and Gaytán-Oyarzún 2006; Ghosh et al., 2009; Sharma and Purohit 2012). NaCl together with CTAB is

known to remove polysaccharides that interfere with several biological enzymes such as polymerases,

ligases and restriction endonucleases (Arif et al., 2010). However the suitable NaCl concentration

mentioned in literature varies between 0.02 M and 6 M (Aljanabi et al., 1999, Ghosh et al., 2009).

Therefore we tried to improve DNA extraction with the CTAB method by including a step of treatment

- 119 -

with 5M NaCl solution and by elution with column spin DNeasy (Protocol B) using DNA binding

methodology (Clements et al., 2008).

The commercial kit DNeasy was expected to perform better in DNA yield and quality as well as for PCR

reaction. Nevertheless, it failed to isolate a good yield of pure DNA as high as that achieved with the

modified CTAB method (B) (Fig. 3). Moreover, the positive PCR product analyzed on agarose gels,

showed less band‘s signal in comparison with protocol (B). Regardless these limits DNeasy kit seemed to

be better than the previous protocol (B) in elimination of PCR inhibitors compounds from DNA extract

and was the most suitable for PCR amplification.

The modified CTAB method (B) gave a much better yield in DNA, compared to the other methods (Fig.

3). Two main steps might be responsible of these efficiencies. Treatment with the high salt solution (5M

NaCl) which separate polysaccharides from cell extract and BSA added during amplification, who act as

an antioxidants to deal with problems related to residual phenolics responsible for PCR failure according

to many authors (Yang et al., 2007). The optimized protocol gave higher yield than those extracted using

various other protocols. However some samples were inhibited during amplification indicating that PCR

inhibitors were not totally eliminated. The DNA quality was further enhanced by purification that leads

to amplification of most DNA extracts. CTAB-DNeasy method lead to a good DNA quality in most

samples, however low recoveries were obtained may be because of a lack of cell lysis, decrease of the

efficiency of spin columns by polysaccharide contamination or due to DNA losses during buffer washing

(Wang and Stegemann 2010). In other hand purification with Nucleospin enhanced the quality of the

DNA thanks to the elimination of interfering substances coextracted with DNA; however it seemed to be

also deleterious for DNA recovery (Mamlouk et al. 2011).

In conclusion, we have successfully performed optimization of DNA extraction from the

traditional date product ―Btana‖ suitable for downstream analysis. Results, suggest that the CTAB

extractions coupled with salt solution treatment yield more DNA than those methods using spin-bind

column elution; however there is a need to purification step to remove most PCR inhibitors. It is clear that

purification diminishes in somehow DNA recovery from the traditional date product ―Btana‖; however

the yield remain still above the detection limit of next generation sequencing like pyrosequencing that

- 120 -

needs as little as pectograme amounts of DNA. More work is still need to assess the impact of the CTAB-

DNA extraction protocol on the estimation of the microbial diversity present in ―Btana‖ using a well

defined community structure samples.

References

1- Abriouel H, Ben Omar N, Lopez RL, Martinez–Canamero M, Keleke S, Galvez A (2006) Culture–

independent analysis of the microbial composition of the African traditional fermented foods poto poto and

degue by using three different DNA extraction methods. Int J Food Microbiol 111:228–233

2- Aljanabi S, Forget L, Dookun A (1999). An improved and rapid protocol for the isolation of

polysaccharide and polyphenol–free sugarcane DNA. Plant Mol Biol Reporter 17: 1–8

3- Al-Shahib W, Marshall RJ (2002) Dietary fiber content of 13 varieties of date palm (Phoenix

dactylifera L). J Food Sci Technol 37:719-721

4- Arif IA, Bakir AM, Khan HA et al (2010) A simple method for DNA extraction from mature date palm

leaves: impact of sand grinding and composition of lysis buffer. Int J Mol Sci 11: 3149–3157

5- Benmeddour Z, Mehinagic E, Meurlay D L, Louaileche H (2012) Phenolic composition and antioxidant

capacities of ten Algerian date (Phoenix dactylifera L.) cultivars: A comparative study. J Funct Foods

5:346–354

6- Boudries H, Panagiotis K, Damaso HM (2007) Carotenoid composition of Algerian date varieties at

different edible maturation stages. Food Chem 101:1372–1377

7- Cankar K, Stebih D, Dreo T, et al (2006) Two mini–preparation protocols to DNA extraction from plants

with high polysaccharide and secondary metabolites. Afr J Biotechnol 5(20):1864–1867

8- Doyle JJ, Doyle JL (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13–15

9- El–Zayat M, Abdusalm K, Shamlool A, Djerbi M, Hadidi A (2002) Phytoplasma detected in date palm

trees infected by Al–Wijam in Kingdom of Saudi Arabia. In: Proceedings of the Date Palm International

Symposium, Windhoek: Namibia, 230– 6

10- Ghosh R, Paul S, Ghosh SK, Roy A (2009) An improved method of DNA isolation suitable for

PCR–based detection of begomoviruses from jute and other mucilaginous plants. J Viral Methods

159:34–39

11- Greppi A, Rantisou K, Padonou W, Hounhouigan J, Jespersen L, Jakobsen M, Cocolin L (2013). Yeast

dynamics during spontaneous fermentation of mawe and tchoukoutou, two traditional products from Benin.

Int J Food Microbiol 165:200–207

12- Gudenschwager O, González–Agüero M, Defilippi BG (2012). A general method for high–quality RNA

isolation from metabolite–rich fruits. S Afr J Bot 83:186–192

13- Jara C, Mateo E, Guillamón J.M, Torija M.J, Mas A (2008) Analysis of several methods for the extraction

of high quality DNA from acetic acid bacteria in wine and vinegar for characterization by PCR–based

methods. Int J Food Microbiol 128: 336–341

14- Mamlouk D, Hidalgo C, Torija MJ, Gullo M (2011) Evaluation and optimisation of bacterial genomic

DNA extraction for no–culture techniques applied to vinegars. Food Microbiol 28:1374–1379

- 121 -

15- Michiels A, Van den EW, Tucker M, Van Riet L, Van Laere A (2003) Extraction of highquality genomic

DNA from latex–containing plants. Anal Biochem 315: 85–89

16- Moyo M, Amoo S O, Bairu M W, Finnie J F, Van Staden J (2008) Optimising DNA isolation for medicinal

plants. S Afr J Bot 74:771–775

17- Mukisa IM, Porcellato D, Byaruhanga YB, Muyanja CM, Rudi K, Langsrud T, Narvhus JA (2012) The

dominant microbial community associated with fermentation of Obushera (sorghum and millet beverages)

determined by culture–dependent and culture–independent methods. Int J Food Microbiol 160:1–10

18- Nam YD, Yi SH, Lim SI (2012) Bacterial diversity of cheonggukjang, a traditional Korean fermented food,

analyzed by barcoded pyrosequencing. Food Control 28:135–142

19- Pinto AD, Forte V, Guastadisegni MC, Martino C, Schena FP, Tantillo G (2007) A comparison of DNA

extraction methods for food analysis. Food Control 18:76–80

20- Probeski S, Bailey LG. Baum BR (1997) Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants

containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Molecular Biology Rep 15: 8–15

21- Sharma KK, Sharma S, Karp M, Kuhad RC (2012) Ligninolytic enzymes improve soil DNA purity:

Solution to methodological challenges of soil metagenomics. J Mol Catal B: Enzym 83:73–79

22- Thakuria D, Schmidt O, Mac Siúrtáin M, Egan D, Doohan FM (2008) Importance of DNA quality in

comparative soil microbial community structure analyses. Soil Biol Biochem 40:1390–1403

23- Vayalil PK (2012) Date fruits (Phoenix dactylifera Linn): an emerging medicinal food. Crit Rev Food Sci

Nutr 52:249–271

24- Wang L, Stegemann JP (2010) Extraction of high quality RNA from polysaccharide matrices using

cetyltrimethylammonium bromide. Biomater 31:1612–1618.

25- Yang ZH, Xiao Y, Zeng GM, Xu ZY, Liu YS (2007) Comparison of methods for total community DNA

extraction and purification from compost. Appl Microbiol Biotechnol 74:918–925

- 122 -

3- Analyse métagenomique de la flore bactérienne associée au

produit traditionnel « Btana »

.

Dans cette étude, l‘analyse taxonomique du marqueur génétique ADN 16s issue de l‘ADN

totale de la communauté bactérienne des Btana a permis d‘atteindre une plus grande

profondeur dans l‘analyse de la diversité bactérienne des de dattes transformées en Btana,

mettant en évidence un nombre bien de taxons plus élevé que dans les études précédemment

réalisées sur les dattes, incluant tout de même des taxons non détectés auparavant. Les deux

types des échantillons de Btana (méthode directe et indirecte) ont montré une dominance des

bactéries Bacilalles qui représente 90.20% des lectures totales. Le genre Bacillus était le plus

dominant (39.53%). l‘analyse NMDS des données de pyroséquençage a révélé une

structuration spatiale des communautés bactériennes, caractérisée par une composition

bactérienne significativement différente entre les échantillons de Btana (directes) tandis que

il y a un groupement des échantillons de btana préparés par la méthode indirecte. La distinction

des échantillons de Btana (méthode indirecte) a été le résultat de la présence massive de

Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus xylanexedens et Planomicrobium JN082684. D‘autre

part, les analyses de la corrélation entre les paramètres intrinsèques de Btana à savoir ; l‘âge, le

pH et l‘activité de l‘eau, ne renseignent sur aucune relation entre ces paramètres et les groupes

bactériens détectés.

Ce travail a été valorisé sous forme de l‘article suivant :

- 123 -

Article 3: Metagenomic analysis of the bacterial microbiota linked to the Algerian

traditional date product “Btana”

Abekhti Abdelkader*1, 2, 3

, Taminiau Bernard 1 Kihal Mebrouk

2, Daube Georges

1.

1 University of Liège, Fundamental and Applied Research on Animal and Health (FARAH), Faculty of

Veterinary Medicine, Department of Food Sciences, Sart-Tilman, B43b 4000 Liege, Belgium

2 Laboratory of Applied Microbiology, Department of Biology, Faculty of Science, Oran University, BP16,

Es-senia 31000 Oran, Algeria

3 Department of Natural and Life Sciences, Faculty of Exact Sciences and Natural and Life Sciences,

University of Biskra, BP 145, 07000 Biskra, Algeria

*corresponding author:

Abekhti Abdelkader abekhti2008@yahoo.com

Abstract

In this study we have highlighted the bacterial diversity of the Algerian traditional date product ―Btana‖

which is produced in the south of Algeria by direct (DBM) and indirect method (UBM) using the high

throughput molecular technique ―pyrosequencing‖. Metagenomic analysis yielded a total of 103.379

reads with a total of 606 OTUs detected. The Firmicutes represented 84.79% of the total pyrosequencing

reads. Phylogenetic analysis revealed that the Bacilalles represent 90.20% ±15.12% of the total reads.

Among the phylotypes detected, Bacillus was the most dominant genus (39.53%). Bacillus megaterium

was shared by all the samples; however its distribution varied widely among samples. The nMDS analysis

showed that the UBM samples clustered together. Three main OTUs were found in UBM samples;

Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus xylanexedens and Planomicrobium JN082684. Correlation

analysis showed no association between the parameters of the samples of the samples (Age, pH, aw) and

the specific microbiota.

Key words: Pyrosequencing, microbial diversity, traditional product, Dates Btana.

Introduction:

Traditional food products are playing an important role in the diet of local populations in many countries

around the world. These products are a major source of valuables nutrients, growth factors and other

health benefits as well as a symbolic attributes of many ethnic groups (Schoustra et al., 2013). Recently

an ongoing interest is being paid to these foods depicted by an increasing number of published papers as

well as many national and international coordinate projects (Bonomo et al, 2010). African and Asian

- 124 -

traditional products are the most studied owing to the rural living of population who usually transform

vegetables (fruit and legume), meat and milk via a well-known traditional process inherited through

generations (Greppi et al., 2013; Oguntoyinbo and Narbad, 2012; Obadina et al., 2009; Chang et al.,

2008). These practices ensure a stable food supply to the local populations during lengthy periods of food

shortage. Btana is a kind of a traditional date product produced in the South of the Algeria, especially in

the regions of Ziban (Biskra), Oued Righ Adrar and Beni Abbas. The product is consumed at home or

commercialized in south region of Algeria and could be preserved for more than two years without any

visible spoilage. In the past this product was almost the sole available food to honour voluntary workers,

to welcome guest and as subsistence during long-lasting travel. Usually, Btana is offered with fermented

milk (Leben) to make a complete and energetic meal. Btana is prepared by compression of date‘s fruit in

cotton or plastic sheets or formerly in clean sheep skin from which ―Btana‖ word is derived. In general

two methods are applied for Btana preparation. The direct Btana method (DBM) is practiced in eastern

south of Algeria (Ziban, Ghardaia, Oued righ and Oued souf), it use soft dates varieties (especially Ghars

cultivar) that are directly amassed into bags by manual pressure. Then bags are stored in dry conditions

about one month to enhance past consistence. By contrast, indirect Btana method (UBM) is used in

western Algerian south, where hard date varieties are often encountered. Farmers harvest dried dates from

the date palm, select the suitable dates, soak them in the boiled water to soften their flesh and then allow

them to drain. In some case, aromatic plants like Basilica (Ocinum basilicum) and Rosemary (Rosmarinus

oficinalis) are added to improve the flavour. After drainage, dates are stacked in the form of fine layers in

bags and then allowed to ripe (when past become less gooey) in the sealed plastic bags for several weeks.

Once the Btana is matured, it can be consumed and preserved for more than two years. Btana is

considered as natural preservation method that reduces postharvest loss linked to microbial and insect

infestations. However, there is no scientific data about this traditional product and the dynamic of its

bacteria microbiota during preservation. The study of the microbiota will provide a load of informations

regarding the type and the distribution of the bacteria in the Btana product. Recently, culture-independent

molecular methods have overcome the conventional culture-dependent techniques which often lead to

underestimation and misidentification of the microflora (Mukisa et al., 2012; Oguntoyinbo et al., 2011).

High throughput techniques such as pyrosequencing have facilitated understanding the structure and

- 125 -

composition of the food microbiota by generating a large amount of DNA sequences through a massively

parallel sequencing-by-synthesis approach (Ye et al., 2011). The overarching purpose of this study is to

characterize and compare the bacterial communities of Btana product prepared with both direct Btana

method (DBM) and indirect (UBM) methods. The complex composition of Btana needed optimization of

total DNA extraction protocol by an adapted CTAB method, then DNA total was submitted to high-

throughput pyrosequencing to investigate the diversity and structure of bacterial group trough 16S rRNA

gene libraries analysis.

Material and methods

Btana samples were collected from Zibane, Elmeghier and Adrar regions according to the method of

preparation and the potential zone of production. The Ziban and Elmeghier samples were produced by

the DBM method whereas samples from Adrar were produced by the UBM method. Ten grams of each

sample was used for pH and water activity (aw) measurement (Abekhti et al., 2013). Then 25g of sample

were homogenized in sterile bag with 225 ml of alkaline phosphate buffer using Stomacher apparatus.

One ml of homogenate was used to count total microbial colony at 30° C using plate count agar (PCA).

Subsequently, 1.5 ml of each sample was centrifuged for 10 min at 14,000 rpm to harvest bacterial cells

for DNA extraction using CTAB methods.

Metagenomic analysis

Best quality extracted DNA samples were further amplified by targeting V1-V3 variable regions of the

bacterial 16S rRNA gene with the primer pair E9-29 F and E514-430 R. Each primer was tagged with

common titanium adapters (A or B) and sample-specific multiplex identifiers (MIDs) linked to the 5´ end

of the each primer. The PCR programs consisted of an initial denaturation for 15 min at 94°C, followed

by 25 cycles of (denaturation at 95 °C for 40 s, annealing at 56 °C for 40 s, with an extension at 72 °C for

1 min) and final elongation step at 72 °C for 7 min. PCR products were purified with the Wizard SV PCR

purification kit (Promega, Belgium) and equal amounts of each of the 11 PCR products were pooled

together and subsequently amplified by emulsion PCR.

Pyrosequencing analysis:

Pyrosequencing was performed with the 454 GS Junior (Roche, Germany) according to the

manufacturer‘s instructions. The sequencing reads from the different Btana samples were analysed using

- 126 -

the MOTHUR package developed by Schloss et al. (2009). The sequences were trimmed and sorted

according to their multiplex identifier (barcod). The Pyronoise algorithm (Quince et al., 2009) was used

to remove reads of low quality i.e. sequences shorter than 425 bps and containing more than 1 ambiguous

base (Ns) and sequences with homopolymeric track longer than 8 bases were also removed. The

sequences were aligned with the reference database SILVA (Pruesse et al., 2007) followed by removing

potential chimeric sequences using the ChimeraSlayer command (Haas et al., 2011) implemented in the

MOTHUR. Finally, the remaining sequences were clustered into operational taxonomic units (OTUs)

using the nearest neighbour algorithm with a 0.03 distance cut off and taxonomically assigned by

comparisons against the SILVA database using the BLASTN algorithm with 80% homogeneity cut off.

Statistical analysis:

The OTUs clusters served also to calculate the Shannon–Weaver diversity index (Shannon and Weaver,

1963), the inverted Simpson‘s evenness index, the Chao1 and the ACE estimates of richness (Chao and

Bunge, 2002) and to generate a rarefaction curves for each sample (Colwell and Coddington, 1994), the

estimated Good‘s coverage was also determined (Good, 1953). The Batana parameters (Age, aw, pH,

PCA) were analysed to weigh their correlation with community variation. An OTU-based comparison

was performed using the Bray-Curtis dissimilarities between the micro flora to compare the overall

bacterial communities of the Btana samples according to their origin and preparation methods (DBM or

UBM). Results were then visualized by the three axes non metric multidimensional scaling (nMDS) plots

(Schloss et al., 2009). Besides, we assessed also the relative contribution of the OTUs to sample‘s

distribution along the axes.

The one-way analysis of variance was performed to assess differences in the Btana parameters and

differences in the biodiversity index. The Nonparametric Kruskal–Wallis one-way analysis of variance

by ranks was applied to verify differences in the relative abundance of the phylogenetic bacterial

groups among the studied samples using the XLStat 2007 (Addin soft, Brooklyn, USA). Other

statistical analyses were performed with MOTHUR, STAMP and R programs.

Results

1- Characteristics of the Btana

- 127 -

Btana samples were found to be acid, with pH ranging between 4.67 to 6.15. The ANOVA one way

analysis (P>0.05) did not show any significant difference between the characteristics of the samples.

However a negative correlation was observed between age and aw (r = -0.65, a = 0.05). No association

was found between the characteristics of the Btana and its preparation method, however, the lowest pH

values were recorded for the Btana prepared by the UBM method in the Adrar region.

Information about the Btana samples, origin of sampling, Age, aw, pH and PCA are summarized in Table

1.

Analysis of the sequences

A total of 103.379 reads were generated in a single pyrosequencing run from the eleven 16S rRNA

libraries. The quality control parameters filtered out 44.852 high quality sequences which included also

the plant chloroplast and the plant mitochondria sequences (12670 sequences), these were all removed

from the dataset analysis.

2- Diversity analysis:

Clustering of the remaining 32.182 bacterial sequences (average length 479 bps) with 97% of identity led

to the identification of 606 OTUs. The Rarefaction curves showed different patterns for the eleven

samples regardless of their origins (Figure 1). The curves of the sample B3, B6, B7 (Zibane), B9, B10 and

B11 (Adrar) flatter very soon after a small increase of the sequence‘s number which indicates that there is

a few number of phylotypes in these samples. In contrast, the curves of the sample B1, B2, B4, B5

(Zibane) and B8 (Elmaghier) did not ever attaint the asymptote phase indicating that sequencing effort

was far limited to obtain total diversity. On the other hand, the Good‘s coverage at the similarity level of

97% (Table 3) is very high in all samples (98.08 to 99.91%) except for sample B5 (76%) pointing out the

detection of most bacterial phylotypes.

The species richness (OTUs richness) observed by rarefaction curves is consistent with the diversity

indices. The Chao1 richness indice differs significantly in the DBM samples (P<0.05) but not in the UBM

samples (P >0.05). The Shannon diversity (H) has range between 0.07 and 4.77. The Simpson indice

reveals a significant divergence in the DBM samples (P<0.05). The B1, B4 and B5 communities are

remarkably evenly diverse (0.11, 0.04, 0.01 respectively) but the samples B3, B6 and B7 are dominated

by few phylotypes (0.62, 0.98) containing rare bacteria.

- 128 -

3- Bacterial microflora composition of the Btana

The taxonomic assignment of the pyrosequencing reads from the Btana samples showed good resolution

at all taxonomic levels and classified the indentified OTU within 8 phyla. These phyla contained diverse

taxonomic lineages represented by 19 classes, 33 orders, 86 families, 201 genera and 606 species. Out of

32.182 captured reads, 45 sequences (0.18%) could not be assigned to any known phylum and were

considered unclassified. Moreover, the proportion of the unclassified phylotypes at low taxonomic rank is

also important. We found 73 (0.23%) of unclassified sequences at the class level, 170 sequences (0.53%)

at the order level, 389 sequences (1.24%) at the family level and 1243 sequences (3.89 %) at the genus

level. However, a small number of the OTUs (phylotypes) are abundant in the samples when the others

are either singletons or rare. Consequently the observed diversity is affected by this variation. Therefore

we divided the bacterial population into three subgroups according to their relative abundance. We

defined the rare phylotypes to those phylotypes which are less than 1%, the subdominant between 1% and

5%, and the dominant above 5%. Thus 592 OTUs (97.85% of OTUs) were considered the rare among all

the OTUs. The rare OTUs represent 19.85 % of the total population. The subdominant subgroup account

for 8 OTUs (17.37 % of total population) while those of the predominant species (OTUs) accounted for 6

species and surprisingly represent an abundance of 63.44% of the total population. It was noted that out of

606 detected species, 459 OTUs (75.87 % of the total species) were detected only one time in the studied

samples with 224 singletons phylotypes. The number of the unique phylotypes detected indicates that the

analysis resolution is very high and it permits to differentiate samples according to their microbial

diversity.

Among the OTU discovered, Firmicutes represent more than 84.79%. Proteobacteria represent the next

most dominant phyla (10.61%) followed by Actinobacteria (3.01%) and Bacteroidetes (1.14%). In

addition we have identified other minor phyla such as Cyanobacteria (0.16%), Candidate division TM7

(0.04%), Deinococcus-Thermus (0.03%), and Acidobacteria (0.01%) (Figure 2).

The majority of the samples were dominated by members of Firmicutes phylum; Ziban samples: B1, B2,

B3, B6, B7 (average 91.90% ±11.77), Elmaghier sample (B8) and Adrar samples (87.42% ±17.12) except

samples B4 and B5 from Ziban region that contained only 46.60% and 26.63% of Firmicutes

respectively.

- 129 -

The Proteobacteria were identified in all samples with a varying range from 0.006 to 34.78%, and are

uniformly distributed within the samples. High levels were recorder in the UBM sample B11 (34.78%),

and in the other samples from the DBM B1 (15.38%), B4 (30.58%) and B8 (26.84%). The Proteobacteria

were found in low abundances in B3 (0.03%), B6 (0.06%), and B7 (0.06%) from Ziban, and B9 (0.03%)

from Adrar region. Other phyla were present in some samples only. Bacteroidetes were detected in Ziban

(B2:5.29%, B4:6.29%, B5:1.46%, B6:0.12%) and Elmeghier samples (B8:6.18%). The Actinobacteria

were mainly detected in the Ziban sample B5 (50.69%). Low OTUs number was detected in B1, B2, B4

(Zibane), B8 (Elmeghier), B10 and B11 (Adrar). Unclassified phyla were remarkably detected in the

sample B4 (1.10%) and B5 (1.17%) from the Ziban region.

The most abundant phylum Firmicutes was dominated by members of the Bacilli class belonging mainly

to Bacilalles (76.81% of Firmicutes), Lactobacillales (20.71%) and Clostridales (1.85%).

Erysipelotrichales and unclassified class are detected as low abundant (0.48 and 0.29% respectively).

Community comparison indicates that out of the 11 samples, only two samples are not dominated by

Bacilalles; B6:0.32% (Ziban), B8:2.32% (Elmeghier). The other samples are highly dominated by

Bacilalles group (average 90.20% ±15.12%).

Table 4 shows some representative phylotypes detected in Btana samples. Among the detected

phylotypes, Bacillus is the most abundant genus (39.53%) accounting for a total of 56 species level

phylotypes. Twenty three species are identified or previously classified (Table 4). The genus includes also

33 unclassified phylotypes (Bacillus. sp). It is noteworthy that the most unidentified species in all samples

belong to the genus Bacillus. Sample B1 (Ziban) contain the high number of Bacillus species (38

species).

Bacillus megaterium was detected in the eleven samples. However its distribution varied widely among

the samples and was dominant in two Ziban DBM samples: B3 (77.06%) and B7 (92.52%).

The other majors Bacillus species detected are Bacillus malacitensis and Bacillus safensis. Other

Bacillus’s species were identified in very small proportions. The Peanibacillus genus encompasses almost

17.54 % of the total population discovered. It was found with dominant proportion particularly in the

UBM samples, represented by P. xylanexendes in B11 (36.64%), P. polymyxa in B9 (20.11%) and B10

- 130 -

(22.82%). P. xylanexendes was also detected in DBM sample B4 (10.96%) and P. polymyxa in B10

(13.68%), B9 (8.36%) and B7 (3.95%).

The other Bacillaceae like Terribacillus aidingensis represent 9.27% of the total population and are

predominant in the Ziban Btana B1 (29.34%). Within the Staphylococcaceae, the Staphylococcus was the

most frequent genus (4.77% in total population). Staphylococcus epidermidis was dominant in B2

(41.37%) and Staphylococcus equorum subsp.equorum in B11 (9.62%). Staphylococcus hominis was

moderately represented in B5 (1.39%) and B2 (1.24%).

The Lactobacillales are found in eight samples and represented by 21 phlyotypes among which the

Enterococcus (Enterococcus mundtii, Enterococcus gallinarum, Enterococcus sp) encompass an

overall of 93.45% in the order of Lactobacilleles. Results indicated that the Enterococcus is the third

frequent genus detected (16.04% of total OTUs). Enterococcus mundtii was the most represented species

(60.69%). Surprisingly it was dominant (99.1%) in the sample (B6). Beside this observation, B2, B7 and

B11 samples contain a relative load of Enterococcus mundtii.

The Clostridiales were mostly detected in Ziban and Elmeghier samples; B1 (13.77%), B2 (3.91%), B5

(11.11%), B8 (4.01%). Among the 52 phylotypes identified, only 22 phylotypes were identified at family

level. Within Clostridiales Peptostreptococcaceae represent 41.89%, and Peptostreptococcaceae

EU775188 represent the most abundant phylotype (19.36%) present in B1, B2, B3, B4, B5 and B8. None

of the members of Peptostreptococcaceae is identified at low taxonomic rank. The Clostridium genus,

represented only 0.40% of the total population, and 25.29% of the total Clostridiales. Among the 11

species assigned to Clostridium, 4 species were singletons: the C. sp JN792364 (B2), the C. botulinum

(B3), the C. tertium (B5), and the C. sp FN436090 (B8).

In Proteobacteria phyla, Adrar samples (B10, B11) contain Gammaproteobacteria members exclusively,

whereas other samples have diverse Proteobacteria classes.

The Gammaproteobacteria was the most represented Proteobacteria in the analyzed sample (51.14%);

however they were not evenly distributed within the samples. Instead of Acinetobacter junii that was

detected in B1, B2, B4, B5, other phylotypes were found in one or at most in two samples.

Enterobacteriaceae members (19.41% of the Proteobacteria) were highly dominated by Pantoea

sp.CWB600: B1, B2 (8.534%), Enterobacter sp: B1, B8 (3.17%) and Cronobacter muytjensii: B10

- 131 -

(7.59%). On the other side, the Xanthomonadaceae family were represented by Stenotrophomonas

present in the sample B4 (2.67% of the total Proteobacteria).

Among Alphaproteobacteria we have recorded a high level of Rhodobacteraceae (33.68% of the

Proteobacteria) mainly Paracoccus sp (20.24%) detected in B4, B5, and B8. The Caulobacteraceae

detected (15.18%) belong mostly to Caulobacter sp. HGR25 and Phenylobacterium.

The Microvirga sp, was the relevant Rhizobiales that is shared between Ziban (B2, B4 and B5) and

Elmeghier (B8) samples. Other Rhizobiales such as Rhizobium, Aminobacter, Parvularcula sp. JN628332

and Methylobacterium sp. FJ504420 were also detected. The Rickettsiales were represented by one

phylotype (Rickettsia FJ193723) with low levels in B2, B6, and B8. The Rhodospirillales present in the

samples were assigned to the Acetobacteraceae where Gluconobacter cerinus detected in B2 was the

most relevant species (6.28% of the Alphaproteobacteria).

The Betaproteobacteria (31.84% of the Proteobacteria) were formed by one major order

(Burkholderiales), and other low frequencies orders (Rhodocyclales, Neisseriales and Nitrosomonadales).

The Burkholderiales were dominated by Comamonadaceae’s species: Acidovorax JF925025,

Comamonas sp. HM.AF10, Comamonas sp. JF098775, and Diaphorobacter sp. JF736627. These species

were found in Ziban and Elmeghier samples: B1, B2, B4, B5, and B8. Methyloversatilis JN177681 is the

sole member of the Rhodocyclales detected in B1, B4, B5, and B8.

Among the few phylotypes assigned to Bacteroidetes we identified Cloacibacterium JF036131 in Ziban

samples (B2, B4, B5 and B1) and Chitinophagaceae sp. (B8) and Flavobacteriaceae sp (B4) in

Elmeghier samples. The Actinobacteria members detected in Ziban (mainly B1, B5 and B4) and in

Elmeghier samples belong to Actinomycetales ordre. The Micrococcaceae family (20.87% of the

Actinobacteria) was dominated by Kocuria species that represent in total 11.92 % of Actinobacteria and

0.33% of the total population. The most abundant species belong to Kocuria palustris (B2, B4, and B5)

and Kocuria rosea (B2, B4, B5 and B8). Coriobacteriaceae (14.64% of the Actinobacteria) in particulier

Collinsella (C. aerofaciens, C. DQ796625, C. GQ491218) were found in B1 representing 5.76% of the

total Actinobacteria. Corynebacterium’s species (found with dominant frequency in B5) are represented

by 28 phylotypes and 12 unclassified species. A very important frequencies of Microbacteriacae

(13.74% of Actinobacteria) like Frigoribacterium sp JF178155 (B4), Microbacterium testaceum (B4),

- 132 -

Microbacterium liquefaciens (B1, B2, B4, B5) were also detected. The Propionibacteriaceae (12.09 % of

Actinobacteria) were mostly detected in B1 and B5 when Bifdobacteriacae (0.04% of the Actinobacteria)

were detected in Ziban sample B1.

4- Comparison of the bacterial microflora of the Btana from the various regions

The Venn diagram (Figure 3) was generated according to the origin of the samples. It shows 7 shared

OTUs (Enterococcus sp, Bacillus megaterium, Comamonas sp. HM.AF10, Staphylococcus epidermidis,

Paracoccus sp, Staphylococcus equorum subsp.equorum and Acidovorax JF925025) between DBM and

UBM accounting for 36.90% of the total sequences. Besides overlapping of the species, the sequences

incidence of the OTUs shows clearly that few OTUs are abundant which mean that the OTUs overlap is

less important. Moreover, the species are most often shared within the Btana type (DBM, UBM) rather

than between the Btana origins. The Adrar samples produced by UBM (B9, B10 and B11) shared 7

species; Bacillus safensis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus

xylanexedens, Terribacillus aidingensis and Planomicrobium JN082684. In addition, there is a low level

of specific OTUs for each sample.

Seventy four (74) OTUs are overlapped between DBM samples (Ziban and Elmeghier samples) with 2

commons species; Bacillus malacitensis and Bacillus megaterium. However, the sequence incidence of

the shared OTUs is very low (5.89 %). Elmeghier sample (B8) shared 81 OTUs in total with Ziban

samples. This result could be partially explained by the close distance (90 km) between the two regions

(Elmaghier and Ziban).

The weighted UniFrac test using phylogenetic distances between randomly selected sequences, confirmed

that the bacterial communities from the DBM and the UBM samples are significantly different (P<0.001).

So far, the non-metric multidimensional scaling (Figure 4) shows that the bacterial communities from the

DBM are randomly scattered without any specific influence of the origin of the samples. In opposite,

UBM samples cluster together along the first ordination axis (nMDS1). Three OTUs contribute mostly to

the spatial distribution of the UBM samples; Paenibacillus polymyxa (r=0.81, P<0.01), Paenibacillus

xylanexedens (r=0.55, P<0.01) and Planomicrobium JN082684 (r=0.42, P<0.05). Some DBM samples

(B2 and B4, B3 and B7) were very close to each other in the plot suggesting similarities in the

- 133 -

compositions of the bacterial community. Nevertheless they differ from the other DBM samples

belonging to the same region (B1, B5, B6) and from B8 (Elmeghier) prepared by the same method.

Discussion

Metagenomic results:

Pyrosequencing-based analysis of 16S rRNA genes provides a powerful and useful tool to study the

microbial diversity of a variety of traditional food items (Chao et al., 2009; Oguntoyinbo et al., 2007). To

our knowledge, this is the first study of the microbial diversity of the traditional date product ―Btana‖ by

high throughout pyrosequencing technique. For this, a thorough study of the bacterial community was

done to have a full insight of the microbiota of the product ―Btana‖. The high resolution of

pyrosequencing was approved by the detection of several bacterial groups consistently with dominant and

minor populations. The Bacterial microflora was found in outer surface of most of the dates because of

the environmental factors of its spread (wind, rain, water flux etc.). Whereas, amalgamation of dates

during ―Btana‖ preparation enhances microbial distribution and further modifies its parameters such as

oxygen availability, pH and aw.

Results revealed that Bacilli (Bacillaceae and Paenibacillaceae) were broadly dominating in all samples

although not all samples have the same sample-specific species. Bacillus and Bacillus like bacteria were

commonly dominant in eight samples whereas Enterococcus and Staphylococcus are predominant in three

samples produced by DBM method (Ziban and Elmeghier). The rest major groups of bacteria present in

the ―Btana‖ were found as; Paenibacillus, Planomicrobium, and Terribacillus. The Paenibacillus, the

Planomicrobium, and the Terribacillus were previously grouped under the genus Bacillus but recently

they have been reclassified and regrouped based on their phylogenetic and chemotaxonomic properties

(Paenibacillus: Ash et al., 1993; Planomicrobium: Yoon et al., 2001; Terribacillus: An et al., 2007).

The common features of these bacteria are their environmental origin, facultative anaerobic mode of

nutrition and osmotolerant ability (De Vos et al., 2009). The development of strictly aerobic bacteria in

―Btana‖ would have been inhibited because of the low oxygen availability which affects their tolerance to

non-ideal pH and aw conditions (Mossel, 1975). Hence, the majority of the observed species in micro

flora of the ―Btana‖ are facultative anaerobes. In addition, Btana have high osmopressure resulted from

the high sugar content in dates (Vaylil, 2012). Grant (2004) revealed that the high-sugar foods (with low

- 134 -

water activity) are mainly dominated by xerophilic fungi and osmophilic yeasts. However the presence of

halotolerant bacteria in these foods was often reported, although the osmotic stress imposed by cations

(salts) and uncharged organic solutes (like sucrose) is not the same (Williams and Hallsworth, 2009).

Recently a halotolerant bacterium Tetragenococcus halophilus was found in dominance (>99%) in a high

sugar product ―thick juice‖ (Juste´et al, 2008). Thus it is evident to find many halotolerant bacteria in

Btana samples like; Corynebacterium, Acinetobacter, Acidovorax, Propionibacterium, Staphylococcus

and Peptostreptococcus in the ―Btana‖ samples (De Vos et al., 2009). Moreover, osmotolerance is linked

with the availability of osmoprotectants in the surrounding medium to help bacteria to maintain the

internal haemostasis (Williams and Hallsworth, 2009). Interestingly, it was reported that dates are very

rich in proline (12-369 mg/100g), choline (6.30- 9.90 mg/100g), betaine (0.4 mg/100g), and also contains

a high level of potassium (703-1130 mg/100g) (Kchaou et al., 2013; El-Sohaimy and Hafez, 2010; Al-

Shahib and Marshall, 2002; Favier et al., 1993). The uptake of the aforementioned compounds plays a

key role in cellular adaptation to a hypertonic environment thus permits some bacterial groups to sustain

in the osmotic conditions of the ―Btana‖ (Vilhelmson and Miller, 2002). According to literature data, no

growth is possible in such conditions of Btana, particularly, because of the low pH conditions and the

water activity (Northolt et al., 1995). Thus the present microbiota would remain in dormant state.

Although this would be a conservative approximation, further research efforts are required to explain the

bacterial capability of withstanding such a highly concentrated sugar products and to study the factors

which confer microbial resistance against osmotic stresses along with other parameters as new prevailing

ideas suggest that water activity is not a definitive parameter that dictates the limits of microbial activity

in all types of the environmental niches (Williams and Hallsworth, 2009).

Another notable point is that the majority of the detected bacteria are spore formers bacteria (Bacillus,

Paenibacillus, Terribacillus). Unlike the majority of fermented foods dominated by LAB, Bacillus sps

were implicated in fermentation of traditional foods based on leaves, seeds, and seafood in Africa

(Okpehe: Oguntoyinbo et al., 2007; Hawaijar: Jeyaram et al., 2008a, Jeotgal: Guan et al., 2011).

Moreover, Bacillus species were isolated also from similar high osmopressure food items like honey

(Miriam and Iurlina, 2005).

- 135 -

Adrar Btana prepared through boiled water treatment (UBM) exhibited a common dominance of three

species (Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus xylanexedens and Planomicrobium JN082684). On the

other hand, although water is added during Btana preparation but the final water activity was not higher

than the DBM samples. obviously because in Adrar region, citizens use dried Date‘s varieties like Hmira,

Takarboutch and Tgaza for Btana preparation instead of soft variety (Ghars) used in DBM (Boulal et al.,

2010, Charlery de La Masselière, 2004). Likewise, data analysis shows that bacterial community of UBM

samples is less diversified than DBM, composed mainly of spore former bacteria. The nMDS analysis

showed that the community present in the ―Btana‖ was randomly distributed in dates before preparation.

As in the UBM method, boiled water is used to wash the dates thus it selects spore forming bacteria that

sustain the boiled water. On the other hand, the DBM method lack the bacterial selection effect thus the

initial microbiota persist during preservation. Also, the great geographical distance between the Adrar

region and the two other regions Ziban and Elmeghier (about 1300 km) could account for the difference

among the microbial communities present in the Btana. Thus we conclude that boiled water treatment

reduces mostly the vegetative form bacteria. Some other species like Terribacillus aidingensis,

Bacillus_malacitensis, Bacillus_safensis, Acidovorax JF925025 and Comamonas sp.HM AF10 were

detected in almost all ―Btana‖ samples regardless of its type, indicating a well adaptation to the Btana

product. In case of the species found unequally in the Btana product, they are most likely to be

environmental contaminants. Also, the presence of vegetative aerobic bacteria like Kocuria,

Acinetobacter GQ096364, Acinetobacter junii and Acidovorax JF925025 should be investigated if no

recent contamination from a secondary source is expected. Generally, the Btana is prepared in open air

places that facilitate catching of such types of bacteria. Raw dates could also represent a potent vehicule

of some plant origin bacteria like Enterococcus mundtii (Collins et al., 1986) and the human skin

inhabitant bacteria Staphylococcus epidermidis that might be transferred to Btana during manual

preparation.

The detection of a low number of pathogenic bacteria were reported in some samples (B1:

Staphylococcus aureus; B2: Clostridium GQ158426, Bacillus cereus; B3: C. botulinum; B4 and B5:

Kocuria palustris) underlines the need of more strict hygienic practices during preparation of the Btana

product. However, further investigation is needed to examine the viability of these bacteria because

- 136 -

pyrosequencing analysis is a semi quantitative technique that does not verify the viability of the detected

microorganisms, in particular for the spore former bacteria (Amend et al., 2010b).

Conclusion

For an accurate study of the microbial diversity by the NGS analysis, it is well established to optimize the

DNA extraction. Here, we have succeeded to isolate a good DNA yield with the classical CTAB method

from the traditional date product ―Btana‖ that was suitable for further molecular analysis. Results

obtained from the 16S rDNA targeted metagenomic analysis, give us more detailed view of the bacterial

communities in the Btana and also show high prevalence of the spore forming Bacillus as well as its

relatives. This study also revealed that the culturing dependent methods are still important to study the

viable organisms and are appropriate for investigations of the bacterial adaptation to the osmotic stresses.

The preparation of the Btana influences the microbial diversity because hot water treatment applied

during the UBM lead to a tremendous reduction in bacterial load of the Btana. In contrast, the DBM is

better method for conservation of the initial diversity but food conditions are most likely to be responsible

for the selection of the microflora. Moreover, the Btana produced by the DBM are more prone to the

Enterococcus and the Staphylococcus prevalence in comparison with the UBM. It is noteworthy to

precise that this investigation was performed on random samples; therefore future studies have to

standardize the Btana characteristics for more accurate comparison to avoid variation linked with the

sampling plan. Beside this, more intention should be paid on bacterial functionality and the other

microbial groups (Yeasts) in development of the product characteristics.

Acknowledgments:

We are grateful to Bilal Ahmed Latif for his revision of the English in this article. This work has been

partially financed by the Algerian government‘s grant n°48/2012 and by the Spin-off ―Quality Partner

liege-Belgium‖.

References:

1. Abekhti, A., Zarour, K., Boulal, A., Benmechernene, Z. and Kihal, M. 2013. Evaluation of

Microbiological Quality of the Date Fruit Product ―Btana‖ Produced in Adrar South Algeria.

Journal of Microbiology Research 3(5), 163-170.

- 137 -

2. Al-Shahib, W., Marshall, R.J., 2002. Dietary fiber content of 13 varieties of date palm

(Phoenix dactylifera L). Journal of Food Science and Technology 37, 719-721

3. Amend, A.S., Seifert, K.A., Bruns, T.D., 2010b. Quantifying microbial communities with 454

pyrosequencing: does read abundance count? Molecular Ecology 19, 5555–5565

4. An, S.Y., Asahara, M., Goto, K., Kasai, H., Yokota, A., 2007. Terribacillus saccharophilus gen.

nov., sp. nov. and Terribacillus halophilus sp. nov., spore-forming bacteria isolated from field soil

in Japan. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 57, 51–55.

5. Ash, C., Priest, F. G., Collins, M.D., (1993). Molecular identification of rRNA group 3 bacilli

(Ash, Farrow, Wallbanks and Collins) using a PCR probe test. Proposal for the creation of a new

genus Paenibacillus. Antonie van Leeuwenhoek 64, 253–260.

6. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Volume 3: The Firmicutes. Editors: Paul De Vos,

George Garrity, Dorothy Jones, Noel R. Krieg, Wolfgang Ludwig, Fred A. Rainey, Karl-Heinz

Schleifer and William B. Whitman.

7. Bonomo, M.G., Salzano, G., Ricciardi, A., 2010. Influence of autochthonous starter

cultures on microbial dynamics and chemical-physical features of traditional fermented

sausages of Basilicata region. World Journal of Microbiology and. Biotechnology 27 (1), 137-

146.

8. Boudries, H., Panagiotis, K., Damaso, H.M., 2007. Carotenoid composition of Algerian date

varieties at different edible maturation stages. Food Chemistry 101, 1372–1377.

9. Boulal, A., Benali, B., Moulai, M., Touzi, A., 2010. Transformation des déchets de dattes de la

région d‘Adrar en bioéthanol.Revue des Energies Renouvelables 13 (3), 455 – 463.

10. Sánchez-Hernández, C., Gaytán-Oyarzún, J.C., 2006. Two mini–preparation protocols to DNA

extraction from plants with high polysaccharide and secondary metabolites. African Journal of

Biotechnology 5(20), 1864–1867.

11. Chang, Y.C., Wang, J.Y., Selvam, A., Kao, S.C., Yang, S.S., Shih, D.Y.C., 2008. Multiplex PCR

detection of enterotoxin genes in Aeromonas spp. from suspect food samples in Northern Taiwan.

Journal of Food Protection 71, 2094–2099

12. Chao, A., Colwell, R.K., Lin, C.W., Gotelli, N.J., 2009. Sufficient sampling for asymptotic

minimum species richness estimators. Ecology 90, 1125–1133.

13. Chao, A., Bunge, J., 2002. Estimating the Number of Species in a Stochastic Abundance Model.

Biometrics 58, 531-539.

14. Charlery De La Masseliere, Bernard., 2004. Fruits des terroirs fruits défendus » Identités,

Mémoires et Territoires, Presses universitaires du Mirail.

15. Cocolin, L., Dolci, P., Rantsiou, K., 2011. Biodiversity and dynamics of meat fermentations: the

contribution of molecular methods for a better comprehension of a complex ecosystem. Meat

Science 89, 296–302.

- 138 -

16. Collins, M.D., Farrow, J.A.E., Jones, D., 1986. Enterococcus mundtii sp. nov. International

Journal of Systematic Bacteriology 36, 8-12.

17. Colwell, R. K., Coddington, J.A., 1994. Estimating terrestrial biodiversity through extrapolation.

Philosophical Transactions of the Royal Society of London 345, 101-118.

18. El-Sohaimy, S.A., Hafez, E.E., 2010. Biochemical and nutritional characterizations of date palm

fruits (Phoenix dactylifera L.). Journal of Applied Sciences Research 8, 1060-1067.

19. Favier, J.C., Ireland, R.J., Laussucq, C., Feinberg, M., 1993. Répertoire général des aliments.

Table de composition des fruits exotiques, fruits de cueillette d‘Afrique. Tome III, Ed.

ORSTOM, Lavoisier, INRA.

20. Good, I.J., 1953. The population frequencies of species and the estimation of population

parameters. Biometrika 40 (3-4), 237-264

21. Grant W.D. 2004. Life at low water activity. Philosophical transactions of the royal society of

London 359, 1249-1266.

22. Greppi, A., Rantsiou, K., Padonou, W., Hounhouigan, J., Jespersen, L., Jakobsen, M., Cocolin,

L., 2013. Determination of yeast diversity in ogi, mawè, gowé and tchoukoutou by using culture-

dependent and -independent methods. International Journal of Food microbiology 165, 84–88.

23. Guan, L., Cho, K.H., Lee, J.H., 2011. Analysis of the cultivable bacterial community in Jeotgal, a

Korean salted and fermented seafood, and identification of its dominant bacteria. Journal of Food

Microbiology 28, 101-113.

24. Haas, B.J., Gevers, D., Earl, A.M., Feldgarden, M., Ward, D.V., Giannoukos, G., Ciulla, D.,

Tabbaa, D., Highlander, S.K., Sodergren, E., Methé, B., DeSantis, T.Z., and Human Microbiome

Consortium., 2011. Chimeric 16S rRNA sequence formation and detection in Sanger and 454-

pyrosequenced PCR amplicons. Genome Research 21, 494-504.

25. Jeyaram, K., Mohendro, W., Singh, T., Premarani, A., Ranjita Devi, K., Selina Chanu, N.,

Talukdar, C., Rohinikumar Singh, M., 2008a. Molecular identification of dominant microflora

associated with Hawaijar: A traditional fermented soybean food of Manipur, India. International

Journal of Food Microbiology 122, 259–268.

26. Justé, A., Lievens, B., Frans, I., Klingeberg, M., Michiels, C.W., Willems, K.A., 2008. Present

knowledge of the bacterial microflora in the extreme environment of sugar thick juice. Food

Microbiology 25, 831–836.

27. Kchaou, W., Abbès, F., Blecker, C., Attia, H., Besbes, S., 2013. Effects of extraction solvents

on phenolic contents and antioxidant activities of Tunisian date varieties (Phoenix

dactylifera L.). Industrial Crops and Products 45, 262-269.

28. Miriam, O., Iurlina, R.F., 2005. Characterization of microorganisms in Argentinean honeys from

different sources. International Journal of Food Microbiology 105, 297-304.

29. Mossell, D.A.A., 1975. Water and micro-organisms in foods, a synthesis. In R. B. Duckworth

(ed.) "Water Relations of Foods", Academic Press, London.

- 139 -

30. Mukisa, I.M., Muyanja, C.M.B.K., Byaruhanga, Y.B., Schüller, R.B., Langsrud, T., Narvhus,J.A.,

2012. Gamma irradiation of sorghum flour: effects on microbial inactivation, amylase activity,

fermentability, viscosity and starch granule structure. Radiation Physics and Chemistry 81, 345-

351.

31. Northolt, M.D., Frisvad, J.C., Samson, R.A., 1995. Occurrence of food-borne fungi and factors

for growth. In: Samson, R.A., Hoekstra, E.S., Frisvad, J.C., Filtenborg, O. (Eds.), Introduction to

food-borne fungi. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, 322 pp

32. Obadina, A.O., Oyewole, O.B. and Odusami, A.O. 2009. Microbiological safety and quality

assessment of some fermented cassava products lafun, fufu, gari. Scientific Research and Essays

4(5), 432-435.

33. Oguntoyinbo F.A., Narbad, A.,2012. Molecular characterization of lactic acid bacteria and in situ

amylase expression during traditional fermentation of cereal foods. Food Microbiology 31, 254–

262.

34. Oguntoyinbo, F.A., Tourlomousis, P., Gasson, M.J., Narbad, A., 2011. Analysis of bacterial

communities of traditional fermented West African cereal foods using culture independent

methods. International Journal of Food Microbiology 145, 205-210.

35. Oguntoyinbo, F.A., Sanni, A.I., Franz, C.M.A.P., Holzapfel, W.H., 2007. Phenotypic diversity

and technological properties of Bacillus subtilis species isolated from Okpehe, a traditional

fermented condiment. World Journal of Microbiology and Biotechnology 23, 401-410.

36. Probeski, S., Bailey, L.G., Baum, B.R., 1997. Modification of a CTAB DNA extraction protocol

for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Molecular Biology

15, 8-15.

37. Pruesse, E., Quast, C., Knittel, K., Fuchs, B.M., Ludwig, W., et al., 2007. SILVA: A

comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data

compatible with ARB. Nucleic Acids Research 35, 7188-7196.

38. Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T.P, 2009. Accurate determination of microbial diversity from

454 pyrosequencing data. Nature Methods 6, 639-641.

39. Schoustra, S.E., Kasase, C., Toarta, C., Kassen, R., Poulain, A.J., 2013. Microbial Community

Structure of Three Traditional Zambian Fermented Products: Mabisi, Chibwantu and Munkoyo.

PLoS ONE 8(5): e63948. doi:10.1371/journal.pone.0063948.

40. Schloss, P.D., S.L. Westcott, T. Ryabin, J.R. Hall, M. Hartmann, E.B. Hollister, R.A. Lesniewski,

B.B. Oakley, D.H. Parks, C.J. Robinson, J.W. Sahl, B. Stres, G.G. Thallinger, D.J. Van Horn and

C.F. Weber, 2009. Introducing mothur: Open-Source, Platform-Independent, Community-

Supported Software for Describing and Comparing Microbial Communities. Applied and

Environmental Microbiology 75(23), 7537-7541.

41. Shannon, C.E., Weaver, W., 1963. The mathematical theory of communication. University of

Illinois, Urbana.

- 140 -

42. Thakuria, D., Schmidt, O., Mac Siúrtáin, M., Egan, D., Doohan, F.M., 2008. Importance of DNA

quality in comparative soil microbial community structure analyses. Soil Biology and

Biochemistry 40, 1390–1403.

43. Vayalil, P.K., 2012. Date fruits (Phoenix dactylifera Linn): an emerging medicinal food. Critical

Review in Food Science and Nutrition 52, 249-271.

44. Vilhelmson, O., Miller, K., 2002. Humectant Permeability Influences Growth and Compatible

Solute Uptake by Staphylococcis aureus Subjected to Osmotic Stress. Journal Food Protection

65(6), 1008–15.

45. Wang, L., Stegemann, J.P., 2010. Extraction of high quality RNA from polysaccharide matrices

using cetyltrimethylammonium bromide. Biomaterials 31, 16121618.

46. Williams, J.P., Hallsworth, J.E., 2009. Limits of life in hostile environments: no barriers to

biosphere function?. Environmental Microbiology 11, 3292-3308.

47. Yang, Z.H., Xiao, Y., Zeng, G.M., Xu, Z.Y., Liu, Y.S., 2007. Comparison of methods for total

community DNA extraction and purification from compost. Applied Microbiology and

Biotechnology 74, 918–925.

48. Yoon, J.H., Kang, S.S., Lee, K.C., Kho, Y.H., Kang, K.H. Park,Y.H., 2001. Planomicrobium

koreensegen. nov., sp. nov., a bacterium isolated from the Korean traditional fermented seafood

Jeotgal, and transfer of Planococcus okeanokoites (Nakagawa et al. 1996) and Planococcus

mcmeekinii (Junge et al. 1998) to the genus Planomicrobium. International Journal of Systematic

and Evolutionary Microbiology 51, 1511–1520.

Tables and figures

1-Tables:

Table 9. The parameters of Btana samples, PCA counts and DNA concentration

Samples Origin Age

(months)

Aw pH PCA

(UFC/g)

BT1 Ziban(DBM) 10 0,54 5,97 2,25E+03

BT2 Ziban (DBM) 11 0,64 5,38 3,02E+06

BT3 Ziban (DBM) 12 0,6 5,29 2,40E+02

BT4 Ziban (DBM) 11 0,55 5,85 3,60E+02

BT5 Ziban (DBM) 7 0,53 6,15 1,80E+03

BT6 Ziban (DBM) 12 0,42 5,57 1,02E+06

BT7 Ziban (DBM) 11 0,6 5,18 7,00E+02

BT8 Lamghier (DBM) 24 0,425 4,88 1,60E+02

BT9 Adrar (UBM) 3 0,65 5,83 1,75E+03

BT10 Adrar (UBM) 15 0,49 4,67 3,02E+06

BT11 Adrar (UBM) 8 0,548 4,77 3,03E+03

DBM: Direct Btana method, UBM: Indirect Btana method

Aw, water activity, PCA: Plate count agar

- 141 -

Table 10. Summary of the metagenomic statistics of the Btana samples

Sample

Number of

bacterial 16S

RNA

sequences

Number of

OTU

Singleton

OTUs

Estimated OTUs

richness Shannon Simpson ESC

(%) Chao1 ACE

BT1 2.949 172 28 187 178 3,57 0,11 99,15

BT2 2.753 108 39 151 183 2,39 0,21 98,55

BT3 3.675 17 5 20 21 0,8 0,62 99,86

BT4 1.706 176 66 259 246 3,89 0,04 96,13

BT5 517 203 122 386 603 4,77 0,01 76,74

BT6 3.422 12 5 15 16 0,07 0,98 99,85

BT7 3.169 9 3 11 15 0,35 0,86 99,91

BT8 3.123 155 59 202 223 2,47 0,22 98,08

BT9 3.480 24 6 28 30 1,83 0,2 99,8

BT10 4.320 16 5 26 22 1,34 0,35 99,88

BT11 3068 18 3 20 22 1,74 0,23 99,87

ESC: estimated good coverage

Table 11. Distribution of the most abundant phylotypes in the Btana samples (%)

Blast hit BT1 BT2 BT3 BT4 BT5 BT6 BT7 BT8 BT9 BT10 BT11

Bacillus megaterium 11,53 0,11 77,06 5,51 0,58 0,09 92,52 0,03 32,84 3,52 1,86

Enterococcus mundtii 0,00 1,09 0,00 0,29 0,00 99,09 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10

Paenibacillus xylanexedens 0,14 0,84 0,08 10,96 0,00 0,00 3,25 0,00 8,39 13,68 36,64

Planomicrobium JN082684 1,05 0,18 2,23 3,22 0,00 0,00 0,00 0,00 6,44 52,04 8,25

Terribacillus aidingensis 29,37 0,11 15,48 0,23 0,00 0,03 3,22 0,00 19,83 0,97 0,10

Paenibacillus polymyxa 0,00 0,07 0,05 0,00 0,00 0,09 0,03 0,00 20,26 22,87 7,20

Staphylococcus

epidermidis/warneri 0,00 41,12 0,00 0,53 0,39 0,00 0,00 0,03 0,06 0,00 0,00

Enterococcus sp. 0,03 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 41,56 0,00 0,00 0,00

Psychrobacter sp.TSBY-

37/celer 0,00 0,40 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 25,46

Bacillus malacitensis 4,51 1,02 1,20 10,08 1,74 0,06 0,44 0,00 1,38 0,00 0,68

Bacillus safensis 0,00 9,63 0,46 2,46 0,00 0,06 0,41 0,00 4,86 0,07 0,75

Enterococcus sp. 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 17,48 0,00 0,02 0,00

Bacillus licheniformis 0,00 14,64 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Bacillus spp 10,61 0,15 0,08 0,23 2,90 0,03 0,03 0,19 0,17 0.00 0,20

Acidovorax JF925025 1,63 0,69 0,00 1,29 0,39 0,00 0,00 9,89 0,00 0,00 0,00

Staphylococcus equorum

subsp.equorum 0,00 0,15 0,00 0,29 1,35 0,00 0,00 0,26 0,06 0,00 9,26

Stenotrophomonas spp 0,14 0,00 0,00 4,98 0,00 0,00 0,00 6,00 0,00 0,00 0,00

Lactococcus GQ358879 0,00 9,77 0,00 0,23 0,39 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Pantoea sp.CWB600 0,00 0,25 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 9,26

Bacillus sp.13965 0,14 0,29 0,11 7,91 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,32 0,03

Paracoccus sp. 0,00 0,00 0,00 4,04 2,71 0,00 0,00 1,06 0,00 0,00 0,00

Comamonas sp.HM AF10 2,34 1,05 0,00 2,05 0,97 0,00 0,00 0,61 0,03 0,00 0,00

Corynebacterium JQ085721 0,00 0,00 0,00 0,00 6,77 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Corynebacterium spp 0,64 0,25 0,00 0,59 4,64 0,00 0,00 0,38 0,00 0,02 0,00

Cronobacter muytjensii 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 6,00 0,00

Methyloversatilis JN177681 0,51 0,00 0,00 0,29 1,16 0,00 0,00 4,00 0,00 0,00 0,00

Bacillus marisflavi 0,00 0,04 0,00 0,94 0,00 0,00 0,00 0,00 4,80 0,00 0,00

- 142 -

Corynebacterium

unculturedbacterium/efficiens 0,00 0,00 0,00 0,06 5,03 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Propionibacterium GU940713 2,17 0,18 0,00 1,82 0,58 0,00 0,00 0,13 0,00 0,00 0,00

Variovorax GU233844 0,00 0,00 0,00 4,51 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Cloacibacterium JF036131 1,15 0,33 0,00 1,93 0,58 0,00 0,00 0,13 0,00 0,00 0,00

Turicibacter JN173082 2,03 0,76 0,03 0,29 0,77 0,00 0,00 0,22 0,00 0,00 0,00

Peptostreptococcaceae

EU775188 1,63 1,38 0,14 0,18 0,39 0,00 0,00 0,06 0,00 0,00 0,00

Diaphorobacter JF736627 1,80 0,25 0,00 1,17 0,19 0,00 0,00 0,22 0,00 0,00 0,00

Kocuria palustris 0,17 0,04 0,00 0,76 2,32 0,00 0,00 0,29 0,00 0,00 0,00

Enterobacter sp. 0,03 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 3,43 0,00 0,00 0,00

Lactococcus GQ267992 0,00 0,15 0,00 0,12 2,51 0,00 0,00 0,67 0,00 0,00 0,00

Flavobacteriaceae sp. 0,00 2,36 0,00 0,18 0,19 0,12 0,00 0,54 0,00 0,00 0,00

Comamonas JF098775 0,92 0,25 0,00 1,06 0,97 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 0,00

Corynebacterium sp. 0,00 0,00 0,00 0,06 3,09 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Rummeliibacillus sp.R-26276 0,00 0,00 2,94 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,07 0,00

Staphylococcus hominis 0,00 1,24 0,00 0,00 1,35 0,00 0,00 0,38 0,00 0,00 0,00

Microbacterium spp 0,03 0,00 0,00 2,23 0,58 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Planomicrobium spp 0,00 0,00 0,00 0,35 2,32 0,00 0,00 0,06 0,00 0,00 0,00

Rothia JF163110 0,00 0,00 0,00 0,00 2,51 0,00 0,00 0,06 0,00 0,00 0,00

Kocuria rosea 0,00 0,11 0,00 0,41 1,93 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 0,00

Kokuria spp 0,07 0,04 0,00 0,41 1,93 0,00 0,00 0,06 0,00 0,00 0,00

Flavobacteriaceae sp. 0,00 2,36 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,00 0,00 0,00

Micrococcus sp.B5W22-1 0,07 0,00 0,00 0,06 2,13 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Acinetobacter junii 0,81 0,18 0,00 0,59 0,19 0,00 0,00 0,29 0,00 0,00 0,00

Peanibacillus spp 0,24 0,62 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 0,49 0,39 0,10

Kocuria sp.CNJ787PL04 0,27 0,04 0,00 0,00 1,35 0,00 0,00 0,19 0,00 0,00 0,00

Desemzia HE576063 0,00 0,00 0,00 0,18 1,55 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 0,00

Microbacterium liquefaciens 0,98 0,07 0,00 0,41 0,19 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Phenylobacterium sp. 0,41 0,00 0,00 0,00 0,19 0,00 0,00 1,06 0,00 0,00 0,00

Paracoccus spp 0,10 0,00 0,00 0,06 1,35 0,00 0,00 0,13 0,00 0,00 0,00

Brachybacterium HM259190 0,00 0,00 0,00 0,06 1,35 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 0,00

Dermabacteraceae

Brachybacterium squillarum 0,00 0,00 0,00 0,06 1,35 0,00 0,00 0,03 0,00 0,00 0,00

Xanthomonadaceae HQ121111 0,00 0,00 0,00 0,64 0,77 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Ruminococcaceae EU775207 1,25 0,07 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,06 0,00 0,00 0,00

Peptostreptococcaceae

FJ681620 0,54 0,54 0,00 0,00 0,19 0,00 0,00 0,06 0,00 0,00 0,00

Globicatella sanguinis 0,00 0,00 0,00 0,12 1,16 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Actinomyces sp. 0,00 0,04 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,22 0,00 0,00 0,00

Caulobacter sp.HGR25 0,00 0,00 0,00 0,06 0,19 0,00 0,00 0,93 0,00 0,00 0,00

Peptostreptococcaceae

FJ510969 0,78 0,33 0,03 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Micrococcaceae sp. 0,00 0,25 0,00 0,23 0,39 0,00 0,00 0,26 0,00 0,00 0,00

Brachybacterium GQ031869 0,00 0,00 0,00 0,12 0,77 0,00 0,00 0,16 0,00 0,00 0,00

Microvirga sp. 0,00 0,25 0,00 0,12 0,58 0,00 0,00 0,06 0,00 0,00 0,00

Bacillus cereus 0,00 0,11 0,00 0,41 0,00 0,00 0,00 0,00 0,40 0,02 0,07

Clostridium GQ898344 0,92 0,00 0,05 0,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,00 0,00 0,00

Bacillus foraminis 0,34 0,00 0,00 0,00 0,58 0,00 0,00 0,06 0,00 0,00 0,00

- 143 -

Paracoccus sp.MBIC3024 0,34 0,00 0,00 0,00 0,19 0,00 0,00 0,03 0,00 0,00 0,00

Brevundimonas EF600592 0,00 0,00 0,00 0,35 0,19 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Nitrosomonadaceae

HQ755617 0,34 0,04 0,00 0,12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Paracoccus yeei 0,00 0,00 0,00 0,18 0,19 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 0,00

Others 19,98 6,17 0,06 24,56 33,86 0,44 0,10 7,04 0,00 0,01 0,06

Figures:

Figure 15. Diversity of major bacterial phyla in the eleven Btana samples

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11

Firmicutes

Proteobacteria

Actinobacteria

Bacteroidetes

unclassified

Cyanobacteria

Candidate_division_TM7

Deinococcus-Thermus

Acidobacteria

- 144 -

4- Analyse metagenomic de la flore fongique associée au produit

traditionnel « Btana » et isolement des levures dominantes.

Les données recueillies lors de l‘étude de la microflore bactérienne, ne satisfaisaient pas les

besoins du travail, car il a été conclu que la fermentation de Btana n‘est pas l‘ouvre des bactéries

détectées. À ce regard un travail complémentaire de l‘identification de la microflore fongique

(principalement les levures) a été envisagé dans cette perspective et aussi d‘après la littérature qui met en

cause de nombreuses levures responsables de l‘altération et la fermentation des dattes conservées. Pour ce

faire, on a suit les mêmes démarches faites pour la flore bactérienne à savoir, un isolement classique des

souches représentatives, étude de leur propriété biochimiques et physiologiques puis identification

moléculaire par le gène ARN 26S, puis étude métagenomique par le biais de pyroséquençage.

Au globale 46 souches de levures sont sélectionnées et sont identifiées et groupées de manière

préliminaire d‘après leur propriétés morphologiques, biochimiques et physiologiques. Ceci nous a permis

de choisir 23 souches représentatives pour le séquençage du gène ARN 26S. La similarité avec la base de

donnés de Genbank a révélé la présence de 5 différentes espèces dans les échantillons de Btana analysés.

La souche la plus représentées est Zygosaccharomyces rouxii, ( 9 isolats). Les espèces de Lachancea

thermotolerans (6 isolats) et Pichia subpelliculosa (5 isolats) ont été détectées exclusivement dans les

Btana de Sali et Orlal respectivement. Deux isolats sont assignés à Hanseniaspora opuntiae (2) et une

souche de Kluyveromyces delphensis isolées uniquement de l‘échantillon d‘Elmeghier.

L‘analyse métagenomique nous a permis de déterminer plus profondément la diversité de la flore

fongique dans le produit Btana. Les donnés ont confirmé plus loin la dominance des ascomycètes

(particulièrement les saccharomycètes) dans les échantillons étudiés. Il en ressort que l‘espèce dominante

étant toujours Z. rouxi et ceci dans la majorité des échantillons. Cette espèce a constitué 35,40 % de la

population totale détectée avec une fréquence de 0.04 à 99.98%.

D‘autres Saccharomycètes telle que Saccharomycopsis fibuligera, et Torulaspora delbrueckii

sont aussi bien représentés (7,61 et 7,2 % respectivement). Notons aussi la présence à faible fréquence

- 145 -

de Pichia kudriavzevii, P. kluyveri et Lachancea thermotolerans. À l‘exception de L thermotolerans ces

espèces n‘ont jamais été isolées dans nos échantillons de Btana par l‘approche classique. D‘autre part,

lors du pyroséquençage aucune séquence n‘a été affiliée aux espèces ; P subpelliculosa, Hanseniaspora

opuntiae et Kluyveromyces delphensis isolées précédemment dans les échantillons de Btana. Ceci mis en

cause les difficultés et les limites liés à l‘interprétation et l‘analyse de données issues du pyroséquençage.

Plus loin, les champignons filamenteux ont signalé leur grande présence dans certains

échantillons. Ils sont constitués principalement de la classe des Eurotiales, notamment les genres :

Aspergilus, et Peicillium.

D‘autres moisissures sont mises en évidence e l‘occurrence des Mucorales (Rizopus et Mucor).

Au totale l‘abondance des moisissures a représenté au totale 20% de l‘ensemble des séquences retenues.

Vraisemblablement, ces moisissures sont rencontrées durant l‘étape de l‘isolement, néanmoins elles ont

eté ignorées pour des raisons objectives liées à l‘intérêt de notre l‘étude.

L‘autre volet de l‘étude a concerné la mesure du pouvoir fermentaire des souches de levures

isolées et leur caractéristiques biochimiques et physiologiques.

Le caractère osmophile représenté par un développement dans 50 et 60% de glucose a été

observé dans tous les isolats testés.

L‘étude du pouvoir de fermentation des souches a été effectuée dans un extrait de datte qui a été

stérilisé puis inoculé par les isolats et mis à fermentation pendant 21 jours dans des conditions

d‘anaérobiose pour simuler les conditions de Btana. Les paramètres de fermentation incluant la valeur de

pH, les acides organiques et l‘éthanol se sont suivis par un prélèvement et dosage après 48 h, 96 h, 15 et

21 jours d‘incubation. Généralement le pH s‘est baissé sous la valeur 5 pendant les premiers 48h selon les

espèces, cette régression étant consécutive jusqu‘aux 15 jours (de 5.2 ± 0.02 à 3.88± 0.25) où on a

constaté une stabilisation de pH pour tous les souches étudiés. L‘analyse par HPLC a montré l‘abondance

de fructose et de glucose dans l‘extrait de datte, une faible concentration de saccharose a été aussi

déterminée. La concentration des sucres diminue significativement au fur et à mesure de la fermentation

et produit en parallèle des quantités variables d‘éthanol, lactate, acétate, formate, et de succinate.

- 146 -

Kluyveromycess produit du glucose et de fructose après 96 h d‘incubation probablement par l‘activité

d‘invertase sur le sucre ou les autres carbohydrates disponibles.

K. delphensis et L. thermotolerans consomment la majorité du glucose et du fructose fournis au bout du

premier 48 h, ceci a été traduit par une baisse de pH et production d‘éthanol et d‘autres métabolites.

Le saccharose est modérément consommé par toutes les souches de levures. Pour le cas de Z. rouxii, les

souches n‘ont guère utilisé le glucose durant toute la période de fermentation ce qui confirme la faculté de

cette espèce plutôt fructophilique. Le saccharose est utilisé pendant les derniers stades de fermentation

vraisemblablement après l‘épuisement du fructose. L‘espèce H. opuntiae préfère tout de même le fructose

est laisse une grande quantité du glucose dans le milieu à la fin de la fermentation. Cette espèce

consomme moins de sucres en comparaison avec les autres souches mais en revanche elle baisse très

rapidement le pH de l‘extrait de datte.

Les souches de K. delphensis sont les plus préformantes en matière de fermentation de l‘extrait de datte

en produisant le lactate comme substrat majoritaire, et aussi d‘acétate et de succinate mais moins

d‘éthanol. Les souches appartenant au Pichia subpelliculosa sont les plus faibles dans la fermentation de

l‘extrait de datte (pH finale 4.12) malgré qu‘elles aient consommé la plus grande quantité de glucose. En

autre elles oxydent aisément le méthanol et l‘éthanol et gardent leurs viabilités après 21 jours de

fermentation.

Nous n‘avons pas mis en évidence, un effet reproductible entre le potentiel fermentaire des souches et

leurs échantillons correspondant. Les valeurs de pH de la majorité des échantillons ne reflètent pas

réellement le potentiel de fermentation des souches, donnant ainsi des conclusions ambiguës.

L‘étude de l‘activité enzymatique des souches de levures montre une importante activité de Leucine

arylamidase Esterase (C4) et de Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase pour les isolats de L. thermotolerans,

K. delephensis et P. subpelliculosa. Ces enzymes spécifique à des substrats lipidiques ne semblent pas

d‘intérêt dans la dégradation des substances présentes dans les dattes qui sont principalement riches en

polysaccharides. Ces substances serait dégradé par d‘autre enzyme telles que les glucosidases qui sont

grandement exprimés par toutes les souches étudies (β-glucosidase et l‘α-glucosidase pour Z. rouxii et de

- 147 -

K. delphensis). Cependant, il semble difficile d‘établir une fois encore une relation entre le potentiel

enzymatique des souches de levures et la composition finale des échantillons de Btana, néanmoins les

analyses des donnés a montré que L. thermotolerans qui domine l‘échantillon (BT10) et qui exprime une

forte activité de β-glucosidase et produit des concertations importantes en lactates et acetates est

probablement l‘origine de l‘acidification de l‘échantillon (pH= 4,67) et la production de lactates et

acétates détectés dans l‘échantillon. La même observation a été faite pour l‘échantillon A. Toutefois il y a

d‘autre espèces plus acidififiant (K. delphensis) de l‘extrait de dattes que L. thermotolerans et pour

lesquelles il n‘était pas possible d‘établir une relation avec la concentration des métabolites de

fermentation dans les échantillons de Btana analysés !!.

L‘intégrité de cette étude est présentée dans l‘article suivant :

- 148 -

Article 4: Metagenomic analysis of the fungi microbiota linked to the Algerian traditional

date product “Btana”

Abekhti Abdelkader*1, 2, 3

, Taminiau Bernard 1 Kihal Mebrouk

2, Daube Georges

1.

1 University of Liège, Fundamental and Applied Research on Animal and Health (FARAH), Faculty of

Veterinary Medicine, Department of Food Sciences, Sart-Tilman, B43b 4000 Liege, Belgium

2 Laboratory of Applied Microbiology, Department of Biology, Faculty of Science, Oran University, BP16,

Es-senia 31000 Oran, Algeria

3 Department of Natural and Life Sciences, Faculty of Exact Sciences and Natural and Life Sciences,

University of Biskra, BP 145, 07000 Biskra, Algeria

*corresponding author:

Abekhti Abdelkader abekhti2008@yahoo.com

Abstract

Btana is a traditional date product prepared in South region of Algeria. The study gighlights the fungal

diversity of this product with a focus on the yeast microflora. Metagenomic analysis of 26S26S RNA

gene with pyrosequencing technique reveal the dominane of Saccharomycetes class in the majority of the

samples, with the osmophilic yeast Zygosaccharomyces rouxii as a dominant species. Twenty three

representative strains were selected for 26S26S rDNA sequencing. According to GENBANK similarity,

five different species were identified in the traditional date product ―Btana‖. The predominant isolated

yeast was Zygosaccharomyces rouxii and Lachancea thermotolerans . Other species were identified

Pichia subpelliculosa, Hanseniaspora opuntiae and Kluyveromyces delphensis. The majority of yeasts

isolated and identified in the present study are known as osmophilic yeast and were previously isolated

from rich sugar product. A fermentation assay was undergone in date extract with the selected yeast

strains to see their fermentation potential.

Key words : Dates, Btana, fermentation, traditional food, pyrosequenicing, yeasts.

Introduction

Given the continued importance of fermented foods to the global population, much effort has been put

towards describing the microbial communities responsible for different food fermentations to better

improve and manipulate their production and safety. The date fruits are thought to be resistant to

microbial spoilage because of their low water activity, high acidity and sugar content, as a consequence of

drying process. In general date fruit products have sufficiently low water activity to inhibit bacterial

growth. However several authors report date spoilage by means of various microbial population. The

- 149 -

growth of microorganisms occurs mostly on the outer surfaces of the date fruits with a load of a few

hundreds to thousands per gram. Thus, local population in phoenicol region particularly in south of

Algeria have developed some traditional technology to preserve date fruits from spoilage like date Juice

(Ozaoaza), vinegar of date, and date jam. In other way, a substantial amount of date are transformed to a

date past locally named as ―Btana‖ product. This product is manufactured under uncontrolled

conditions,with direct (DBM) and undirected method (UBM) which are based on empirical knowledge

and remain a traditional art in homes, and in small-scale industries. Btana preparation methods were

previously described by Abekhti et al. (2013). The traditional preservation method seems to be a

spontaneous fermentation that involves yeast population as have been revealed by the reduced pH of the

date product after a period of storage (Abekhti et al., 2013). The type of microorganisms isolated from

date and date products includes coliforms, lactic acid bacteria, yeasts and moulds (Abekhti et al., 2013).

Obviously, yeast and moulds communities are adapted to Btana conditions like high sugar content.

However, like many other traditional fermented product, short informations are available about their

microbial diversity and the functional role of its autochthon microflora. It has been already noticed that,

the fermentation relies mainly on the microbiota present on the fruit‘s surfaces and to some extent from

the utensils used during the fermentation process (Fleet, 2003). The quality of Btana produced in South

Algeria varies considerably. While a number of factors may determine this quality. It is generally

considered that the microbial species, especially yeast community responsible for the fermentation

will exert a strong influence. However after Btana production and under the anaerobic conditions, the

medium conditions tend to select yeast community to the detriment of the other microbial microflora.

Yeast has a great ability in fermentation controlling and flavour production (Fleet, 2003; Jolly et al.,

2006). They express a high level of enzymatic activities (Viana et al., 2008) and produce a varied range of

fermentation metabolites. Some authors present analysis results of different date‘s cultivars. However

their findings cannot be considered to be representative of the microbial ecology of the date

fermented product Btana. Indeed, several authors reported the presence of many yeast involved in

fermentation of a number of kind of date‘ product like vinegar (Ould El Hadj et al., 2001). Quantitative

data on the populations of microbial species that develop during the course of Btana storage have

not been reported. Such information is fundamental to better understanding of the microbiology

- 150 -

and biochemistry of the fermentation and its impact on product quality, and will provide the

basis for developing some derived biotechnology that involve the performed Btana microflora for

production of products of more reliable, commercial values. The date microflora study has been

underground starting from the 19th century by Mrack et al. (1942) who reported for the first time, the role

of yeast in spoilage of commercialized date fruits.

Most of the classical approaches used in date microflora studies are very limited in their scope. It is

obvious that the culture-based techniques are biased toward a very small fraction of the inhabiting

microbiota (1% according to some authors). Culture independent tools as so as metagenome-based

approaches offer a more comprehensive view of the genetic complexity of natural microbial communities,

in food matrices, allowing us to better assess their microbial taxonomic diversity (Bokulich and mills,

2012). Pyrosequencing, as the first commercially available NGS technique, has been widely used in food

microbiology. It has been used to study the bacterial diversity of a number of fermented foods, like

kimchi (Park et al., 2012). The main objectives of this study were to study the fungal microflora

associated with Btana product and to identify the dominant fungi species and investigating their

phenotypical and metabolic product and the enzymatic activity. The influence of the Btana characteristics

on the distribution of the fungi microflora was also studied. .

Material and methods:

Strain isolation: Yeasts associated with Btana were isolated by serial dilution method. About 25 g of

each of the eleven Btana samples was transferred to 225 ml of sugar-supplemented alkaline phosphate

buffer to prevent osmotic shock and to help recovery of sublethally injured yeasts (Combina et al., 2012).

The solution was broiled with a Stomacher apparatus for 10 min. Then 0.1 ml of each sample was spread

on YGC agar (95765, Sigma) containing Yeast extract (5 g/l), D(+)-Glucose ( 20 g/), Chloramphenicol (

0.1 g/l ) and Agar (14.9 g/l), pH 6.6. After 24-96 h of incubation at 25°C. The isolated colonies were

directly examined and their purity was verified by visualizing cells under microscope. The isolates were

then characterized based on their physiological and morphological properties according to Barnett et

al.(2000)The tests included fermentation of carbon compounds (glucose, sucrose, maltose, galactose and

lactose), osmotolerance on BHI media containing 50% and 60% (w/w) glucose, growth on media with 1%

and 0.5 % acetic acid and in the presence of 1% ethanol and methanol.

- 151 -

Enzymatic potential was assayed with the commercial API ZYM system. For this purpose a cell

suspension of 5 McFarland of the representative strains was prepared to inoculate the 20 cupules of the

API ZYM strips with 65 µl of cell suspension each. The inoculated galleries were incubated at 30 ºC for 6

h. All the reactions were evaluated by direct observation, according to the standard operational procedure

supplied by the manufacturer.

Preparation of date extract and dosage of metabolite during fermentation by HPLC analysis:

The date extract solution was used to mimic the condition of Btana product as it is difficult to enhance

such study on this date product, owing to its solid state and the difficulty of obtain a completely solute

solution from the product. Further the dissolution step is onerous and might underestimate the yielded

metabolite during the yeast growth. For date extract preparation, 500 g of date‘s fruit were suspended

in 1000 ml of MilliQ water and macerated using Stomacher apparatus. Otherwise the remained date

past was boiled in water till total dissolution. Then, date extract was passed through double layer of

muslin cloth to exclude all large undigested particles. The filtrate was sterilised by autoclaving. An

aliquot of 10 ml of date extract was drawn for chemical composition study.

Each strain was grown overnight in YGC plate and then inoculated in the date extract with 2 McFarland

standards in physiological water. The sterile date extracts were inoculated with l ml of each representative

yeast. Then, four series of inoculated extract was incubated at 30 °C for 48h, 96h, 15 days and 21 days

respectively under anaerobic conditions. In each time we withdraw a tube, measure pH and centrifuge 5

ml of the date extract at 13000 g for 10 min and the supernatants were filtered through a 0.2 µm cellulose

acetate membrane (Sartorius, Minisart). The organic acid analysis standard is a lyophilized mixture of

sodium oxalate, sodium citrate, sodium malate, sodium succinate, sodium formate, and sodium acetate.

The standard is supplied as a set of 6 vials. Each vial of the lyophilized mixture is reconstituted in 1.0 ml

deionized water prior to use. The glucose, fructose, sucrose, ethanol, formate, acetate, propionate,

butyrate, lactate and succinate were analyzed using a HPLC equipped with a differential refraction

index detector. The HPLC analysis was carried out using an Agilent 1110 series (HP Chemstation

software) witha Supelcogel C-610H column preceded by a Supelguard H precolumn (oven temperature

40°C), 0.1% H3PO4 (in MilliQ water) as the isocratic mobile phase at a flow rate of 0.5 mL min-1

and a

differential refraction index detector (RID, heated at 35°C). The process lasted for 35 min at a maximum

- 152 -

pressure of 60 bar (Masset et al., 2010). Samples of Btana were further analysis for sugar and

fermentation metabolites as previously cited.

Molecular identification of yeasts strains:

2.4.1. DNA extraction: DNA is extracted from the yeast strains cells by using the commercial kit

(DNeasy kit, Qiagen ) and used as the template for PCR to amplify the D1/D2 domains of the 26S26S

rRNA gene with the primers NL1 (5‘-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3‘) and NL4 (5‘-

GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3‘) according to Hesham et al. (2006). The PCR products were purified

to remove excess of primers and nucleotides by the PCR purification kit (Qiagen), and then deposited to

sequencing by the GIGA centre (Liège, Belgium). The obtained sequences were manually cleaned and

assembled with the DNA Baser Sequence Assembler v4.16 (evaluation version, 2014, Heracle BioSoft

SRL, www.DnaBaser.com). The assembled contigs were aligned with the online Genbank database using

BLAST program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) and the percent homology scores were

generated to identify yeast isolates. Phylogenetic tree of the identified species and the closest known

strains were also generated by the neighbour-joining algorithm.

Metagenomic analysis:

Before pyrosequencing analysis, DNA was extracted from the pellet of Btana samples using the CTAB

methods (Abekhti et al., submitted to Annals of Microbiology). The DNA samples were stored at −20°C

before pyrosequencing analysis. The RNA 26S PCR gene libraries were generated for the 11 samples.

The oligonucleotide design included 454 Life Sciences A or B sequencing titanium adapters (Roche

Diagnostics Belgium NV, Vilvoorde, Belgium). Unique multiplex identifiers (barcodes) for each sample

were attached to the 5′ end of each primer (NL1 and NL4). Amplification was performed using a Master

system gradient apparatus (Eppendorf AG, Hamburg, Germany) in a final volume of 100µl containing 5

U of FastStart high-fidelity polymerase (Roche Diagnostics Belgium NV), 1× enzyme reaction buffer,

200 µM dNTPs (Eurogentec, Belgium), 0.2 µM of NL1 and NL4, and 100 ng of genomic DNA

Thermocycling conditions were as follows: initial denaturation at 94°C for 15 min, followed by 25 cycles

of 94°C for 40 s (denaturation), 56°C for 40 s (annealing), 72°C for 1 min (elongation), and a final

elongation step of 7 min at 72°C. The PCR products were run on a 1% agarose electrophoresis gel and the

DNA fragments were extracted and purified using an SV PCR purification kit (Promega Benelux B.V.,

- 153 -

Leiden, the Netherlands). The amplicons quality was assessed using a PicoGreen double-stranded DNA

(dsDNA) quantitation assay (Isogen Life Science NV), then amplicons were sequenced using the Roche

GS-Junior Genome Sequencer (Roche Diagnostics Belgium NV).

Sequence treatment and Statistical analysis:

The sequencing reads from the different Btana samples were analysed using the MOTHUR package

developed by Schloss et al. (2009). The sequences were trimmed and sorted according to their multiplex

identifier (barcodes). The Pyronoise algorithm (Quince et al., 2009) was used to remove reads of low

quality i.e. sequences shorter than 425 bps and containing more than 1 ambiguous base (Ns) and

sequences with homopolymeric track longer than 8 bases were also removed. The sequences were aligned

with the reference database SILVA (Pruesse et al., 2007) followed by removing potential chimeric

sequences using the ChimeraSlayer command (Haas et al., 2011) implemented in the MOTHUR. Finally,

the remaining sequences were clustered into operational taxonomic units (OTUs) using the nearest

neighbour algorithm with a 0.03 distance cut off and taxonomically assigned by comparisons against the

SILVA database using the BLASTN algorithm with 80% homogeneity cut off.

The OTUs clusters served also to calculate the Shannon–Weaver diversity index (Shannon and Weaver,

1963), the inverted Simpson‘s evenness index, the Chao1 and the ACE estimates of richness (Chao and

Bunge, 2002) and to generate a rarefaction curves for each sample (Colwell and Coddington, 1994), the

estimated Good‘s coverage was also determined (Good, 1953). The Btana parameters (age, aw, pH, PCA)

were analysed to weight their correlation with community variation. An OTU-based comparison was

performed to compare the overall fungal communities of the Btana samples according to their preparation

methods (DBM or UBM). The cluster dendrogram were based on the distance similarity by Bray–Curtis

coefficient of the OTU composition of the samples then we assessed the relative contribution of the OTUs

to sample‘s similarity and dissimilarity. Analyses were conducted using PRIMER 6 v6.1.16 software

(Primer-E Ltd, Plymouth, UK) and mothur.

Results and discussion

The aw, pH, carbohydrates concentrations, and the sample‘s characteristics and the isolated strains are

presented in table 12. No correlation was observed between the Btana composition/method/parameters

- 154 -

(P>0.05). Surprisingly we have recorded a low number of fungi in the studied samples, moulds are

abundantly present only in some samples (BT9); therefore we gave more interest to the yeast strains only.

In sum 46 strains were selected and identified. After morphological, biochemical and physiological

characterization, 23 representative strains were selected for 26S rDNA sequencing. According to

Genbank similarity, five different species were identified in the traditional date product ―Btana‖. The

predominant isolated yeast was Zygosaccharomyces rouxii, (9 isolates in Ziban samples and one strains

from Sali samples). The next predominant strains were Lachancea thermotolerans (6 strains) and Pichia

subpelliculosa (5 strains) found exclusively in Sali and Orlal samples respectively. Three strains was

identified as Hanseniaspora opuntiae, two (2) strains in Sali and and one (1) in Ziban. Oued righ sample

was dominated by one yeast species Kluyveromyces delphensis, this sample was dominated by moulds

(result not shown). The diversity of yeasts associated with Btana product may be closely related to the

raw material used and the regional climate where they are produced.

Table 12. Composition and characteristics of the Btana samples.

Sam

ple

s

Ori

gin

an

d

met

ho

de

aw

pH

Sac

char

ose

s

Glu

cose

s

Fru

cto

ses

Su

ccin

ate

Lac

tate

Fo

rmia

te

Ace

taat

e

Eth

ano

l

Iden

tifi

ed y

east

BT11 Sali.

Adrar 0.548 4.77 7.85 101.07 105.95 7.05 13.33 ND ND ND AL1. AY1

BT6 Ourlal.

Biskra 0.42 5.57 0.44 36.85 33.26 1.22 2.68 ND ND ND BC2. BC1

BT2 Ourlal.

Biskra 0.64 5.38 1.67 28.07 23.15 0.65 2.30 ND 0.07 ND DM2. DL4

BT9 Sali.

Adrar 0.65 5.83 9.38 90.70 70.23 1.69 5.69 ND 0.24 0.27 ND

BT10 Sali.

Adrar. 0.49 4.67 2.19 58.14 51.31 0.00 27.43 ND 0.23 ND FL2.FL6. FC1. FC2

BT3 Ourlal.

Biskra 0.6 5.29 6.10 85.33 77.02 1.84 5.06 ND 0.24 ND GP1. GD3

BT4 Ourlal.

Biskra 0.55 5.85 4.85 105.40 100.27 4.53 10.50 ND ND ND HC1

BT5 Ourlal.

Biska 0.53 6.15 4.86 103.19 97.53 5.04 5.27 ND ND ND IC1

BT1 Ourlal.

Biskra. 0.54 5.97 56.17 84.16 73.63 2.44 2.63 ND 0.18 ND ND

BT8 Lamghiar

OED 0.45 4.88 9.76 111.09 124.54 ND ND ND ND ND KL1

BT7 Tolga.

Biskra 0.6 5.18 4.45 125.29 150.21 ND ND ND ND ND LL1

Concentration of sugar, organic acid and alcools are exspressed by (mg/ml)

The majorities of yeasts isolated and identified in the present study are known as osmophilic

yeasts and were previously isolated from rich sugar product. Z rouxi was frequently isolated from honey.

It showed a positive growth at very low water activity (as low as 0.62) growing in relatively high NaCl

concentrations (20% (w/v); aw: 0.85 (Tokuoka, 1993). Hanseniaspora (Kloeckera) species are commonly

- 155 -

found in soil, leaves, and fruits; they start alcoholic fermentation of fruit extracts and can also spoil

beverages. This apiculate yeast have a common presence in fruit juices and fermenting musts (,Nyanga et

al., 2008; Cadez et al., 2006). The presence of H opuntiae and Z. rouxi in date was already reported by

Hashem et al.(2014) in rotten dates from Abha market (KSA). In addition, L. thermotolerans was

commonly isolated from soft drinks, fruit juices, raisins, raw sugar and marzipan sweet.

Fig. 16. Phylogenetic tree of the yeast strains isolated from Btana product prepared according to the

neighbour joining methods using BLAST logarithm

Pyrosequencing:

Pyrosequencing gives, as expected, a broad picture of the fungal communities in the studied Btana

samples. In total 122 997 sequence reads were obtained after sequences treatment. Both cultural and

metagenomic approaches demonstrated the dominance of Ascomycota phyla. While Ascomycota

constituted >76% (46 OTUs) of total sequences of the pyrosequencing reads, they formed 100% of the

obtained isolates.The next phyla Basidiomycota account for 10 OTUs (13% of total sequences) whereas

- 156 -

Zygomycota were represented by 7 OTUs (10% of total sequences). Two OTUs (0.77% of total

sequences) remain unclassified.

Although Ascomycota were the predominant phyla in most of the samples, Zygomycota was also

dominant in two samples (K from DBM and E from UBM) and Basidiomycota in sample H (DBM).

Saccharomycetes were the most abundant class in the studied samples; the highest proportions were

detected in G (99.9%), D (99.88), and A (82.05%) samples, all from Orlal region. However three samples

(BT8, BT4, and BT9) present a very low proportion of Saccharomycetes (0.06, 0.87 and 1.57%

respectively) but in other hand they were dominated by Zygomycetes and polyporoid, fruiting fungi

(Agaricomycetes) in the case of the sample (BT4).

Fig. 17. Distribution of phyla in the Btana samples as identified by pyrosequencing analysis

76%

13%

1%10%

Ascomycota

Basidiomycota

Fungi_unclassified

Zygomycota

- 157 -

Fig 18. Distribution of fungal family in the Btana samples as determined by metagenomic analysis

The main genera detected were Zygosaccharomycesrepresented by one species (Z rouxii) that was

the most detected species in the Btana samples (35.40% of the total population) and found in all samples

with a frequencies varying from 0.04 to 99.98%. Other Sacharmomycetes frequently detected are

Saccharomycopsis fibuligera, Torulaspora delbrueckii with 7.61 and 7.2 % of total reads respectively.

Other species like Pichia kudriavzevii, P. kluyveri and Lachancea thermotolerans were also detected.

Nevertheless these yeasts (except L thermotolerans) were not ever isolated from any of the Btana

samples. In other hand, our pyrosequencing data did not contain any sequences affiliated to P

subpelliculosa, Hanseniaspora opuntiae and Kluyveromyces delphensis isolated formerly from the Btana

samples:

By far, members of Eurotiales (Aspergilus, Mucore, Peicillium) were widely detected in Btana samples.

Most notably, Aspergillus oryzae (DBM) and A. niger (DBM, UBM) were the most represented in this

class. Other filamentous fungi belonging to Mucorales like Rizopus and Mucor were frequently detected.

Theses fungi were already reported as the main deterioration agents of date during postharvest

preservation Indeed, fungi belonging to these genera were found during cultivation step although they

were ignored in our isolates collection. The presence of the filamentous fungi is ranged at 20%, such

0%

20%

40%

60%

80%

100%

BT1 BT2 BT3 BT4 BT5 BT6 BT7 BT8 BT9 BT10 BT11Saccharomycetaceae Mucoraceae TrichocomaceaeSaccharomycopsidaceae Auriculariaceae MalasseziaceaePhaeosphaeriaceae Cladosporiaceae DipodascaceaeFungi_unclassified Davidiellaceae LeptosphaeriaceaeChaetomiaceae Microascaceae AgaricaceaeDebaryomycetaceae Cystofilobasidiaceae TremellaceaeNectriaceae Hypocreales_unclassified ErythrobasidiaceaeSchizosaccharomycetaceae Erysiphaceae CrepidotaceaePsathyrellaceae Teratosphaeriaceae Ustilaginaceae

- 158 -

abundance is intriguing since many fungus are a potent sources of mycotoxines. In other hand, the

fruiting fungi Auricularia sp was encountered in most Btana samples (eight samples), however the

sequences belonging to this group were withdraw from the subsequent diversity analysis. In addition to

avoid the biases linked to the singleton and rare microflora, the analysis was restricted to the phylotypes

that represent at least 1% in one of the studied samples. Thus 28 of 65 OTUs were selected for subsequent

analysis.

Fig. 19. Dendrogram of clusters of Btana samples generated using the Bray–Curtis resemblance matrices

with group-average linking.

Hierarchical plotting of Clusters was generated using the Bray–Curtis resemblance matrices

generated for the square-root transformed phylotypes abundance data (with group-average linking).

revealed two main clusters, that separate sample (BT4 and BT8) from the other samples, theses two

samples are characterized by an abundance presence of filamentous fungi (particularly Rhizopus

stolonifer ). The second cluster is composed of many subgroups. It reveals the near composition of tow

DBM samples (BT2 and BT3) which cluster at ≥90% similarity level. Other clusters were observed for

UBM samples (BT10 and BT11 at ≥50% similarity) and DBM samples (BT7, BT1, BT5 at ≥52%

similarity). Two out-groups were also observed (BT9 and BT6).

SIMPER analysis reveals that samples have a low and approximate average of similarity, 17.26% for

DBM and 16.87% for UBM. Seven (7) OTUs (phylotypes) contribute to similarity of DBM within Z.

Rouxii (60.85%), Rhizopus stolonifer (13.99%) and Torulaspora delbrueckii (4.95%) are the most

responsible of similarity. However Z. Rouxii is the main responsible of similarity of UBM samples

- 159 -

(90.79%). Overall DBM and UBM samples have 82.98% average dissimilarity score. The most OTUs

driving statistically significant differences in fungal community composition between the two types of

Btana are shown in Table 3.

Table 13. Contribution of OTUs to sample differentiation

Average abundance

Phylotypes (OTUs) DBM UBM Average

Dissimilarity

Dissimilarity

standard

deviation

Contribution

%

Cumulative

contribution.%

Z. rouxii 4000,5 3846,67 21,65 1,38 26,09 26,09

S. fibuligera 190,63 2612 11,56 0,73 13,93 40,02

Phaeosphaeria nodorum 18,25 1878 8,9 0,68 10,73 50,75

Rhizopus oryzae 24,75 1348,33 8,13 0,67 9,79 60,54

Aspergillus niger 556,13 1184 7,25 0,82 8,74 69,28

Rhizopus stolonifer 978,38 1 6,41 0,54 7,72 77

Torulaspora delbrueckii 1107,5 19 4,81 0,47 5,8 82,8

Malassezia restricta 476,88 12,33 1,86 0,45 2,24 85,04

Toxicocladosporium 424 0 1,77 0,56 2,13 87,17

Aspergillus oryzae 319,38 1 1,45 0,52 1,74 88,92

Malassezia globosa 353,5 0,33 1,37 0,46 1,65 90,57

Physiological and biochemical testing of the selected strains reveal that all the strains fermented

glucose except K. delphensis. Z. rouxii, K. delphensis and H. Opuntiae do not ferment sucrose in the

contrary of L. thermotolerans. Maltose is fermented by Z rouxii and L thermotolerants that also ferment

galactose with P. subpelliculosa. In the other hand, P. Subpelliculosa strains used citrate as a sole carbone

source. Negative result was recorded for nitrate assimilation for all the tested strains (results not shown).

Osmotolerance test shows that all the isolated strains are osmophilic and grow very well in 50 and 60%

glucose broth. Regarding ethanol and organic acid resistance, we recorded that P. subpelliculosa strains

were the only strains that support growth in 1% ethanol medium. However we recorded a positive growth

in 1% methanol for P. Subpelliculosa strains, Lachancea thermoltoerances and klyuveromycess delphesis.

By far, no strains were able to grow in 1% acetic acid medium. The Z. rouxii strains support 0.5% acetic

acid medium.

- 160 -

Table 14. Chemical characteristics of the representatives‘ yeast isolated from Btana samples

Genbank score based on 26S gene

FG FS FM FGA LAC MAL 50% 60% ETH METH AC 1%

AC 0.5%

GAZ 48

pH 48

pH 96

pH 15

pH 21d

Viab

AL1 L. thermotolerans + + + + - + + + - + - + (++) 4.17 4.24 3.95 3.99 +++

AMB1 Z. rouxii + - + - - + + + - - - + (-) 4.15 4.09 3.91 3.91 F

AY1 L. thermotolerans + + + - + + + - + - (+++) 4.14 4.18 3.95 3.99 +++

BC1 P. subpelliculosa + + - + - + + + + + - (++) 4.39 4.16 4.1 4.11 +++

BC2 H. opuntiae + - - - - - + + - - - - (+) 4.1 4.06 3.88 3.88 +++

DL1 (3)

P. subpelliculosa + + - + - + + + + + - - (-) 4.45 4.26 4.16 4.14 +++

DL4 P. subpelliculosa + + - + - + + + + - - (+/-) 4.45 4.28 4.11 4.12 +++

DM2 Z. rouxii + - + + - + + + - - - + (-) 4.2 4.11 4.02 3.97 TF

FC1 L. thermotolerans + + + + - - + + - + - + (+++) 4.13 4.18 3.9 3.9 +++

FC2 H. opuntiae + - + + - - + + - - - - (++) 3.97 4.01 4.08 4.09 +++

FL2 L. thermotolerans + + + + - - + + - + - - (+++) 4.15 4.1 3.92 3.99 ++

FL6 H. opuntiae + - - - - - + + - - - - (?) 4.07 4.05 3.84 3.87 +++

GP1 Z. rouxii + - + + - + + + - - - + (+) 4.23 4.12 3.96 3.96 TF

GD1 Z. rouxii + - + - - + + + - - - + (-/+) 4.14 4.07 4.06 3.97 (-)

HC1 Z. rouxii + - + - - + + + - - - + (-) 4.21 4.13 4.15 4.15 F

IL1 Z. rouxii + - + + - + + + - - - + (-) 4.12 4.02 3.97 3.98 F

KL1 (4)

K. delphensis - - + + + - + (-) 4.01 3.86 3.43 3.47 F

LL1 Z. rouxii + - - + + + - - - + (-) 4.2 4.09 4.07 4.07 F

General features aspect of date extract fermentation:

Changes in biochemical parameters during date extract fermentation by the yeast strains are presented in

Figure 20.

In order to take an overview about the metabolic activity of the isolated strains and their role during Btana

preservation, the model of date extract was used to mimic Btana condition whereas it was very difficult to

enhance the experiment with Btana samples owing to their solid state and the difficulty to sterilize the

integral date past. Date extract was seeded under anaerobic conditions with each isolated strains, then

their metabolic activity was followed in the span of 21 days. Sugars concentration progress (sucrose,

glucose and fructose) and changes in pH , ethanol, lactate, acetate, succinate and formeate products were

monitored during fermentation of the date extract.

- 161 -

Fig. 20. Fermentation product of date extract after 48 (A), 96h (B) and 21 days (C) of yeast fermentation.

(g/ml)

As observed in Figure 20. the pH behavior was not the same for all the studied strains. In overall, pH

dropped in the first 48 below pH 5 for all the strains and continues to decrease over the following period

till 15 days wherein, pH remained fairly constant. At the end of the fermentation period (fixed at 21 days),

the pH decrease from an initial pH of 5.2 ± 0.02 to 3.88± 0.25. It is very known that yeast accomplish an

- 162 -

alcoholic fermentation in anaerobic conditions, where pyruvate is converted to ethanol and carbon

dioxide (Munroe, 1994), however in the presence of oxygen, the yeast oxidize completely the produced

pyruvate to carbon dioxide and water while producing energy for the cell growth. The date extract

fermented with K. delphensis strains showed a markedly faster pH drop (1.73± unit) compared to the

other species particularly P. subpelliculosa strains which were the less acidifying strains (0.77 ±unit ).

The differences in date extract pH over the fermentation period could be attributed to the availability of

fermentable sugars and their metabolic products as well as the presence of enzymes produced by

microbes in the inoculated date extract as compared to the control. This matter is thoroughly discussed in

below.

Regarding date extract composition, Fructose, and glucose were identified as the main sugar followed by

a very low content of sucrose. The concentration of these carbohydrates decreased significantly (p<0.05)

by the yeast activity and yielded a variable amount of ethanol, lactate, acetate, formate, and succinate, as

its typical products (Figure20). However the date extract inoculated by Kluyveromycess showed a

precipitous increase in fructose and glucose concentration during the last step of fermentation in

comparison to the previous 96 hour step. This increase in glucose and fructose concentration is

spectacular and might be due to the activity of the invertase enzyme on sucrose. Or might be the result of

the yeast enzymatic action on the other available poycarbohydrate present in date extract.

Within the result, we see that strains of P. subpelliculosa and L. thermotolerans left some traces of

glucose at the end of the fermentation. K. delphensis and L. thermotolerans were the only strains able to

exhaust the most of the glucose and fructose present in the Btana during the first 48 hour. The result is

obvious by pH reduction and the production of a high amount of ethanol, lactates, succinates which

increase particularly after 96 hours of fermentation. Results shows that sucrose present in the date extract

is poorly used by the strains that prefer other available carbohydrates. It is the case of Z. rouxii strains that

prefer fructose rather than sucrose (which is consumed during the late stage of fermentation) whereas they

didn‘t use glucose throughout the period of fermentation. Many authors confirmed that

Zygosaccharomyces are fructophilic and use fructose rapidly than saccharose or glucose (Leandro et al.,

2013; Leandro et al., 2011). In other hand, literature review indicates that these yeasts showed a

discrepancy in glucose and fructose utilization as described by Berthels et al. (2004). Although fructose is

- 163 -

used concomitantly with glucose, the latter is depleted first from the medium. Berthels et al. (2004)

explained this discrepancy on the basis of differences in kinetic properties of sugar transporters and

hexokinases. Sohrabvandi et al (2009c) noticed that Z. rouxii DSM 2535 and 2535 utilize

monosaccharides (glucose and fructose) noticeably greater than disaccharides (sucrose). Recently,

Leandro et al. (2014) have discovered that ZrFfz1 gene is essential in the fructophilic behavior of Z.

rouxii. He supposed that this gene is a good candidate to improve the fructose fermentation performance

of industrial Saccharomyces cerevisiae strains. Z. rouxii strains sustain, very poorly in date extract after

21 day of fermentation. Like Z. rouxii, Hanseniaspora opuntiae also prefer fructose rather than glucose

and left an important amount of glucose in the medium after 21 days of fermentation. Nynaga et al.(2013)

report the contrary of this finding and reported that H. opuntiae produced more biomass from glucose

than from fructose and found that fructose is the most abundant residual sugar in the fermented must

rather than glucose that was totally depleted from the medium. This issue should be verified in the future

studies with focus on biomass production during date extract fermentation. By far, H. opuntiae strains use

a less amount of sugars in comparison to the previous species, but it decrease very fast the pH though the

concentration of the methanol and the produced acids are in the same range as for the other species. L.

thermotolerans strains brought pH down to 3,99 ± and survive after 21 days of incubation. Whereas K.

delphensis are the most performed in fermentation of date extract with the production of some amount of

lactateas the main metabolite responsible for pH decrease. The strains produce also a considerable amount

of acetate and succinate, However they are the less producer of ethanol.

Pichia subpelliculosa is the less acidifying yeast as the final pH was 4.12, but it was able to complete the

fermentation leaving the low amount of glucose in comparison to the other strains. In addition they

sustain alive after 21 days of fermentation, and oxidize easily methanol and ethanol.

The fermentation survey shows that ethanol was produced and then consumed (Fig. 5), which was similar

to the trend observed in dynamic yeast populations. During the first 48 h, ethanol was the main end-

product for all strains except for P. subpelliculosa strains which produce lactate as the main product in

parallel to production of a variant array of other fermentation product (succinate, formiates, lactates and

acetates) and a weak amount of ethanol. In term of yield, the amount of ethanol produced after 96 hours

of fermentation was 2.67-7.67 g/l. Then, it decreases at the end of fermentation except for the strains P.

- 164 -

subpelliculosa that continue to produce ethanol and the other metabolites. For the other species there was

an increase in concentration of lactates and formiates at the end of fermentation (21 days) and a

fluctuation in production of acetates and succinates. We noticed that the produced lactates might be the

origin of the pH decrease in the date extract.

We did not find any stable effect of the fermentation potential of the strains and their corresponding Btana

samples except samples dominated by Z rouxii (except BT10 and BT11), which showed a pH value above

5 units. The sample K that supports the growth of the high acidifying strains; K delphensis, have a low

pH value (4.88). Further, sample (BT10 and BT11) from Sali that support also the growth of the moderate

acidifying specie L. thermotolerans have a pH above 4 (4.77 and 4.67 respectively). By contrary sampler

(BT6) that support the growth of the second acidifying strains Hanseniaspora opuntiae record a high pH

value (5,57). The others samples (BT6, BT2, BT9, BT3, BT4, BT5, BT1, BT7 ) dominated by the less

acidifying species P. subpelliculosa and Z rouxii corroborate to the evident and record a high pH ranging

between 6.15 and 5.28. However the number of yeast in samples also do not account for the final pH as

stated by sample (BT10) that recorded the low number of yeast population, however it have the low pH

within the studied samples.

Determination of enzymatic profile of the yeast isolates

Hydrolase profiles, obtained from API-ZYM system, are presented in table 4. The examined species

showed significant differences in the number and activity of the released hydrolases.

The activity of, α-mannosidase, chymotrypsin, phosphatase, and trypisn N-benzoyl was not found in any

of the yeast species. It was also determined that all of the isolates expressed an interesting activity of

estérase (C4), estérase lipase (C8), lipase (C14), naphtol-AS-BI-phosphohydrolase and in less content

leucine arylamidase, valine arylamidase and cystine arylamidase. The strains belonging to L.

thermotolerans, K. delephensis and P. subpelliculosa were characterized by a high activity of leucine

arylamidase Estérase (C4) and Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase.

β-glucosidase activity was expressed in all yeast strains except DL3 (Z. rouxii) and K. delphensis that in

turn express exclusively α-glucosidase and β-galactosidase enzymes, whilst N-acetyl—glucosaminidase

was recorded for L. thermotolerans, P. subpelliculosa and the strains DL3 (Z. rouxii,). The later yeast is

- 165 -

the only species to secrete β-glucuronidase. Moreover L. thermotolerans and P. subpelliculosa

demonstrate a high activities of α-fucosidase.

It is very difficult to find a link between the yeast activity and the final composition of the Btana samples,

however interesting findings were observed. Data analysis showed that L. thermotolerans found as

dominant yeast in Btana sample (BT10) have a high glucosidase activity and produce an important

amount of lactates and acetates.Therefore its presence and activity in the sample, might be the origin of

the low pH(4.67) and the high content in lactates and acetate (27.43 g/l) recorded in this sample. A similar

finding was stated in Btana sample (BT11) from which a high number of L. thermotolerancs strains were

also detected. However there is a discrepancy in our results since (as stated above) that L. thermotolerans

acidified faintly the date extract (4.00) in comparison to other species which need more investigation to

divulge the real link between the enzymatic and acidification activity for this species.

The strong β-glucosidase activities expressed by Z rouxii, L. thermotolerans and P. subpelliculosa help

to hydrolyze all glucose poly-sugars linked by either α- or β-linkages like cellulose, 1-3,1-4-b-glucans,

xyloglucans present in date cell wall and other antinutritive glucose containing hemicelluloses (Simon,

2008).

Beside the hydrolytic activity, it is well known that β-glucosidases are the key enzymes in the enzymatic

release of aromatic compounds from glycosidic molecules present in fruit juices (Palmeri and Spagna,

2007). Further it was reported that β-glucosidase of yeast is associated with alcohol production in orange,

peach, strawberry, cherry and of several fruits juices (Arrizon et al., 2011).

Klyvuromycess strains were the only isolates that produced β-galactosidase with high activity. This

enzyme is used in the hydrolysis of lactose, and it is commercially produced by Kluyveromyces lactis

(Romo-Sánchez et al., 2010).

The proteolytic enzymes of arylamidases (aminopeptidases) catalyze the hydrolysis of N-terminal

aminoacids and liberate aminoacids from the proteins or peptides in the medium (Dodor and Tabatabai,

2007). We do not think that these features are very important in Btana production owing to the low

content of protein and aminoacids in date fruit; however these activities would be of great technological

importance and could be further investigated as starter culture candidates for production of other date

products enriched with exogenous proteins to enhance taste and flavour. By far the absence of

- 166 -

phosphatase activity and the merely limited activity of alkaline phostphatase responsible for hydrolysis

of phospholipids – the main component of membrane cells- indicate that the strains lack the virulence

factors and thus could be regarded as safe for Btana consumer (Łukaszuk et al., 2005).

Table 15. Result of API ZYM test of the isolated yeast according to the universal chart (Biomérieux)

Conclusions

This study determined the fungal microflora of two different traditional date product

Btana. Results showed that in general community structure in DBM and UBM do not vary well in

term of species but rather in abundance at a limit extent. Perhaps more sampling are needed to

detect the real microbial divergence between the two studied Btana products. We showed the

advantage of next generation technique ―pyrosequencing‖ on the discovery of the hidden fungal

diversity not shown by culture dependent approach. Z. rouxi was the dominant yeast involved in

the fermentation of Btana in both types. Other yeasts are also well represented. Study of the

biochemical and enzymatic proprieties of the yeast isolate gave a broad view about their eventual

behaviour in the Btana product. However, the correlation between the yeast and their

corresponding origin samples did not provided a good conclusion about the factors the shape the

L.

thermotolerans Z. rouxii

P.

subpelliculosa H. opuntiae K. delphensis

Alkaline phosphatase 1 0 2

0

Esterase (C4) 5 2 5

5

Esterase lipase (C8) 3 2 5

3

Lipase (C14) 3 2 3

3

Leucine arylamidase 1.5 1 1

1.5

Valine arylamidase 2 3 2

2

Cystine arylamidase 2 1 2

2

Trypisn N-benzoyl 0 0 0

0

Chymotripsin 0 0 0

0

Phosphatase 0 0 0

0

Naphtol-AS-BI-

phosphohydrolase 5 3 5

5

α-galactosidase 1 2 2

1

β-galactosidase 0 0 0

1.5

β-glucuronidase 0 0 0

0

α-glucosidase 0 0 0

1.5

β-glucosidase 5 5 3

0

N-acetyl--

glucosaminidase 3 0 5

0

α-mannosidase 0 0 0

0

α-fucosidase 3 1 4

2.5

- 167 -

Btana proprieties, which urged us to search for natural relation that link the yeast to the Btana

product. Neverthless this research has revealed the high level of heterogeneity in species

composition and functional capacity of yeast isolate and remain the first study that use

successfully molecular and NGS techniques to enhance comprehension about traditional date

products.

References

1. Arrizon, J., Mateos, J.C., Sandoval, G., Aguilar, B., Solis, J., Aguilar, M.G., 2011. Bioethanol

and xylitol production from different lignocellulosic hydrolysates by sequencial fermentation.

Journal of Food Process Engineering 34, 437-454.

2. Berthels, N.J., Cordero-Otero R.R., Bauer, F.F., Thevelein, J.M., Pretorius, I.S., 2004.

Discrepancy in glucose and fructose utilization during fermentation by Saccharomyces cerevisiae

wine yeast strains. FEMS Yeast Research 4, 683-689.

3. Bokulich, N.A., Mills, D.A., 2012. Next-generation approaches to the microbial ecology of food

fermentations. BMB 45, 377-389.

4. Cadez, N., Rasper, P., Smith, M.T., 2006. Phylogenetic placement of Hanseniaspora–Kloeckera

species using multigene sequence analysis with taxonomic implications: descriptions of

Hanseniaspora pseudoguilliermondii sp. nov. and Hanseniaspora occidentalis var. citrica var.

nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Miccrobiology 56, 1157-1165.

5. Chao, A., Bunge, J., 2002. Estimating the Number of Species in a Stochastic Abundance Model.

Biometrics 58, 531-539.

6. Colwell, R.K., Coddington, J.A., 1994. Estimating terrestrial biodiversity through extrapolation.

Philosophical Transactions of the Royal Society of London 345, 101-118.

7. Combina, M., Pérez-Torrado, R., Tronchoni, J., Belloch, C., Querol, A., 2012. Genome-wide

gene expression of natural hybrid between Saccharomyces cerevisiae and S. kudriavzevii under

enological conditions. Int J Food Microbiol 157: 340–345

8. Dodor, D.E., Tabatabai, M.A., 2007. Arylamidase activity as an index of nitrogen mineralization

in soils. Communications in Soil Science and Plant Analysis 8, 2197-

2207.

9. Fleet, G.H., 2003. Yeasts in fruit and fruit products. In: Boekhout, T., Robert, R. (Eds.), Yeasts

and Food. Beneficial and Detrimental Aspects. Behrs Verlag, Hamburg, pp. 267–288.

10. Good, I.J., 1953. The population frequencies of species and the estimation of population

parameters. Biometrika 40 (3-4), 237-264

11. Guiraud, J.P., 1998. Microbiologie Alimentaire. Technique et Ingénierie, Série Agroalimentaire.

Dunod, Paris.

12. Haas, B.J., Gevers, D., Earl, A.M., Feldgarden, M., Ward, D.V., Giannoukos, G., Ciulla, D.,

Tabbaa, D., Highlander, S.K., Sodergren, E., Methé, B., DeSantis, T.Z., and Human Microbiome

Consortium., 2011. Chimeric 16S rRNA sequence formation and detection in Sanger and 454-

pyrosequenced PCR amplicons. Genome Research 21, 494-504.

13. Hashem, M., Hesham, A.E-L., Alrumman, S.A., Alamri, S.A., Moustafa, M.F.M., 2014.

Indigenous yeasts of the rotten date fruits and their potentiality in bioethanol and single-cell

protein production. International Journal of agriculture and Biology 16, 752-758.

- 168 -

14. Hesham, A., Wang, Z., Zhang, Y., Zhang, J., Lv, W., Yang, M., 2006. Isolation and identification

of a yeast strain capable of degrading four and five

ring aromatic hydrocarbons. Annals of Microbiology 56, 109-112.

15. Jolly, N., Augustyn, O., Pretorius, I., 2006. The role and use of non-Saccharomyces yeasts

inwineproduction. South African Journal of Enology and Viticulture 27,15-39.

16. Leandro, M.J, Cabral, S., Prista, C., Loureiro-Dias, M.C., Sychrová., H. 2014. The High Capacity

Specific Fructose Facilitator ZrFfz1 is Essential for the Fructophilic Behavior of

Zygosaccharomyces rouxii CBS 732T. Eukaryotic Cell November 13 (11), 1371-1379.

17. Leandro, M.J., Sychrová, H., Prista, C., Loureiro-Dias, M.C., 2013. ZrFsy1, a High-Affinity

Fructose/H+ Symporter from Fructophilic Yeast Zygosaccharomyces rouxii. PLoS ONE 8(7):

e68165. doi:10.1371/journal.pone.0068165.

18. Łukaszuk C., Krajewska-Kułak E., Niczyporuk W., Theodosopoulou E., Hatzopulu A.,

Krawczuk-Rybak M., Wojtukiewicz M., 2005. Variations of enzymatic activity and biotypes of

the yeast like fungi strains isolated from cancer patients. Annales Academiae Medicae Bialostoc

50 (supl), 16-19

19. Masset, J., Hiligsmann, S., Hamilton, C., Beckers, L., Franck, F. Thonart, P., 2010. Effect of pH

on glucose and starch fermentation in batch and sequenced-batch mode with a recently isolated

strain of hydrogen-producing Clostridium butyricum CWBI1009. International Journal of

Hydrogen Energy 35, 3371-3378.

20. Mrak, E.M., Phaff, H.J., Vaughn, R.H., 1942. Yeasts Occurring on Dates. Journal of Bacteriology

43 (6), 689-700.

21. Nyanga, L.K., Nout, M.J., Smid, E.J., Boekhout, T., Zwietering, M.H., 2013. Fermentation

characteristics of yeasts isolated from traditionally fermented masau (Ziziphus mauritiana) fruits.

International Journal of Food Microbiology 166, 426-432.

22. Ould El Hadj M. D., Sebihi, A.H., Siboukeur, O., 2001. Qualité hygiénique et caractéristiques

physico-chimiques du vinaigre traditionnel de quelques variétés de dattes de la cuvette de

Ouargla. Revue des Energie Renouvelables, Production et valorisation-biomasse (NS), 87-92.

23. Palmeri, R., Spagna, G., 2007. β-Glucosidase in cellular and acellular form for winemaking

application. Enzyme and Microbial Technology 40(3), 382-389.

24. Park, E.J., Chun, J., Cha, C.J., Park,W.S., Jeon, C.O., Bae, J.W., 2012. Bacterial community

analysis during fermentation of ten representative kinds of kimchi with barcoded pyrosequencing.

Food Microbiology 30, 197-204.

25. Pruesse, E., Quast, C., Knittel, K., Fuchs, B.M., Ludwig, W., et al., 2007. SILVA: A

comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data

compatible with ARB. Nucleic Acids Research 35, 7188-7196.

26. Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T.P, 2009. Accurate determination of microbial diversity from

454 pyrosequencing data. Nature Methods 6, 639-641.

27. Romo-Sánchez, S., Alves-Baffi, M., Arévalo-Villena, M., Úbeda-Iranzo, J.,

Briones-Pérez, A., 2010. Yeast biodiversity from oleic ecosystems: Study of their

biotechnological properties. Food Microbiology 27, 487-492.

28. Schloss, P.D., Westcott, S.L., Ryabin, T., Hall, J.R., M. Hartmann, E.B. Hollister, R.A.

Lesniewski, B.B. Oakley, D.H. Parks, C.J. Robinson, J.W. Sahl, B. Stres, G.G. Thallinger, D.J.,

Van Horn C.F., Weber, 2009. Introducing mothur: Open-Source, Platform-Independent,

Community-Supported Software for Describing and Comparing Microbial Communities. Applied

and Environmental Microbiology 75(23), 7537-7541.

29. Shannon, C.E., Weaver, W., 1963. The mathematical theory of communication. University of

Illinois, Urbana.

- 169 -

30. Simon, O., Verdauung und Resorption. In: Jeroch H, Drochner W, Simon O, eds. Ernährung

landwirtschaftlicher Nutztiere. 2nd

ed. Stuttgart: Eugen Ulmer; 2008:109-133 (in German).

31. Sohrabvandi, S., Razavi, S.H., Mousavi, Mortazavian, S.M., Rezaei, A.M., (2009c). Application

of Saccharomyces rouxii for the production of non-alcoholic beer. Food Science and

Biotechnology 18, 1-6.

32. Tokuoka, K., 1993. Sugar and salt-tolerant yeasts. Journal of Applied Bacteriology 74, 101-110.

33. Viana, F., Gil, J., Genovés, S., Vallés, S., Manzanares, P., 2008. Rational selection of non-

Saccharomyces yeasts for mixed starters based on ester formation and enological traits. Food

Microbiology 25, 778-785.

- 170 -

Discussion génerale

- 171 -

Onze échantillons du produit dattier traditionnel Btana préparé par DBM, UBM ont fait l‘objet

d‘un dénombrement microbien et isolement des souches représentatives.

Les Germes totaux sont compris entre 1,6 x 102 et 3 x 10

6 UFC/g. Ces germes étaient présents

aussi bien dans le DBM (Orlal : 106 ±1,6 x 10

5 ufc/g) qu‘en UBM (Sali : 3,4 x 10

5 ± 6 x 10

4).

Les bactéries anaérobies sont moins importantes (0 à 3 x 105 UFC/g) et sont même non

détéctables dans certains échantillons. Les bactéries lactiques sont rarement rencontrées dans les

échantillons analysés. L‘analyse de données n‘a pas révélé un effet significatif du type de méthode de

préparation de Btana sur la charge microbienne des dattes. Ceci a été statiquement validé par le test de F

qui compare la variance des moyennes du nombre des bactéries détectées dans les deux types de Btana

(P>0.05).

L‘isolement de souches microbiennes par des approches systématiques et par séquençage

des gènes ribosomaux microbiens permettrait de constituer une base de données de qualité, spécifique à

nos sites d‘échantillonnage. Cette base de données pourrait dans une certaine mesure combler le manque

d‘informations sur la qualité microbiologique du produit Btana

L‘identification moléculaire a démontré la dominance des bacilles sporulant dans le produit

Btana. Les tests d‘identification classique ont permis de sélectionner 42 isolats représentatifs de plus de

200 souches étudiées. D‘après l‘analyse du gène codant pour l‘ARN ribosomal 16S, on a recensé 20

espèces bactériennes parmi les espèces identifiées. Il n y avait pas une distribution régulière des espèces

selon le type de Btana. Les échantillons de DBM prélevés à Orlal ont enregistrés au totale 16 espèces

alors que le même type de Btana prélevé à Elmeghier a été dominé par une seule espèce. L‘identification

moléculaire a confirmé la dominance des espèces appartenant au genre Bacillus (30.9% des espèces

identifiées). D‘autre part, 28.6% des isolats appartiennent aux genres Staphylococcus et Enterococcus.

Parmi les groupes bactériens minoritaires, deux isolats représentent le genre Peanibacillus (présents

uniquement dans le UBM) et les espèces Streptococci salivarius, Lactobacillus sakei et Klebsiella

pneumoniae.

- 172 -

La technique de typage moléculaire RAPD a été utilisée avec succès pour distinguer les souches

d‘identité ambiguë appartenant aux genres de Stapylococcus et Streptococcus.

Les Staphylococcus sont les cocci majoritaires aussi bien dans les échantillons de DBM et UBM.

Alors que S. epidermidis étant l‘espèce dominantes. La fréquence d‘isolement des isolats d’Enterococcus

mundtii et d‘ E faecium est similaire dans les deux types de Btana mis à part l‘échantillon d‘Elmeghier

qui est quasi dominé par d‘E.mundtii.

La dominance des Bacillus spp dans les dattes est l‘origine de la dispersion de leurs spores

ubiquistes dans l‘environnement. En plus, la sélectivité des Btana induits par la forte concertation de

sucres et la faible activité de l‘eau rendent le Btana hostile pour la majorité des bactéries. Après

préparation de Btana, les bactéries sporulées s‘installent au fur et mesure de l‘avancement de la

conservation pour devenir la flore majoritaire. Les Staphylococcus à leur tour s‘adaptent à l‘écosystème

de Btana grâce à leur propriété osmophile via l‘accumulation des solutés compatibles. La présence des

autres groups bactériens est spectaculaire et ne pourrait être expliqué que par une contamination étrangère

ou même une présence dans un état de métabolisme inactif.

Les résultats recueillis au cours de cette étude indiquent que la méthode d‘UBM est plus sélective

pour les bacilles sporulés que la méthode DBM. Cette dernière s‘est vraisemblablement prévalue par les

espèces d’Enterococcus et Staphylococcus.

L‘étude du potentiel enzymatique des souches montrent aussi la préférence des bacilles aux

substrats protéiques et lipidiques. Les hydrolases des sucres sont modérément exprimées parmi les

bacilles testés. Une faible activité d‘α-galactosidase et de β-glucosidase a été détectée dans toutes les

souches testées à l‘exception de B. endophyticus, B safensis, et Paenibacillus spp pour le β-glucosidase.

L‘isolat identifié en tant que Klebsiella pneuminae a montré une forte activité enzymatique exprimé par la

production de 12 enzymes. Au dépit des informations obtenues sur la biochimie et la physiologie des

souches isolées, cette approche d‘isolement et d‘identification des souches bactériennes ne semble pas

satisfaisante pour couvrir la diversité bactérienne totale du produit de Btana. À cet effet nous nous

sommes penchés sur l‘approche moléculaire, indépendante de la culture pour mieux caractériser cette

- 173 -

diversité. Pour commencer il était nécessaire d‘optimiser le protocole d‘extraction d‘ADN à partir de la

matrice de Btana. À cet égard, trois protocoles ont finalement été choisis et comparés par leur rendement

et pureté d‘ADN. Il s‘agit du kit commercial DNeasy et un protocole de CTAB modifié, et une

combinaison de protocole CTAB-DNeasy. Les modifications engendrées sur le protocole CTAB

impliquent une augmentation de la concentration de lysozyme et l‘addition d‘une étape de broyage à

l‘aide des billes en verre. Au cours de l‘étape de séparation des acides nucléiques nous avons introduit un

traitement par une solution hyper saline (NaCl 5M). De par son rendement le protocole de CTAB a

permis un rendement nettement supérieur aux deux autres protocoles. L‘efficacité du protocole a été mise

en exergue par l‘amplification du gène codant pour l‘ARN ribosomal 16S et l‘électrophorèse des

amplicons obtenus dans un gel d‘agarose. En revanche le kit commercial DNeasy n‘a pas donnée un bon

rendement d‘ADN malgré qu‘il se soit avéré performant dans l‘élimination des inhibiteurs de PCR et

l‘amplification de tous les échantillons analysés.

L‘optimisation du protocole d‘extraction d‘ADN nous a mené à faire une étude métagénomique

de la flore bactérienne par la nouvelle technologie de séquençage à haut débit (pyroséquençage) par le

séquenceur 454 GS (Roche). Les données de séquençage par analyse de la région V1-V3 du gène codant

l‘ARN ribosomal 16S ont générés 103.379 séquences qui ont conduit à l‘identification de 606 OTUs.

Ce nombre inclut aussi 224 singletons et 459 OTUs détectés une fois uniquement dans les échatillons de

Btana. Bien que représentant une forte proportion du nombre total d‘OTUs (36.96 %), ces singletons

ne représentaient qu‘un faible pourcentage du nombre total de séquences mettant ainsi en évidence

la présence d‘un grand nombre de taxons rares. Malheureusement, 45 OTUs (0.18%) n‘ont pas pu

étre identifiés à tous les rangs taxonomiques.

Les analyses phylogénétiques ont révélé que les phylotypes détectés sont répartis dans 7

kingdom/phyla essentiellement dominés par les Firmicutes représentaient le phylum majoritaire

constituant à lui seul près 84,79% puis les Proteobacteria (10,61%), les Actinobacteria (3,01%) les

Bacteroidetes (1,14%) et d‘autres rares phylum. Parmi les Firmicutes, les Bacilalles sont les dominants

constituant à eux seuls près de 76,81% de Firmicutes, suivis dans une moindre mesure par les

Lactobacillales (20,71%) et les Clostridales (1.85%). Sur l‘ensemble des échantillons analysés, le

- 174 -

genre Bacillus est le plus dominant (39,53%) comptant au totale 56 phylotypes. L‘espèce Bacillus

megaterium a été détectée dans tous les échantillons mais en abondance sensiblement variable (elle

domine deux échantillons de DBM avec 92,52 et 77,06% ). B. malacitensis et B. safensis sont aussi

détectées. Le genre Peanibacillus occupe la deuxième place dans les Bacillales représentant 17.54 % de

la population détectée. Ce genre domine exclusivement les échantillons de Sali (UBM). On y a détecté

principalement P. xylanexendes, et P. Polymyxa.

Le genre de Staphylococcus est aussi détecté à l‘ordre de 4.77%. Staphylococcus epidermidis

domine un échantillon de type DBM (41.37%).

Les Lactobacillales se sont détectés dans 8 échantillons représentés par 21 phylotypes. Les espèces

d’Enterococcus dominent 93.45% de ce class et représente le troisième genre fréquemment isolé des

échantillons de Btana. L‘espèce Enterococcus mundtii étant la plus représentée (60.69%) et quasi

dominante dans un échantillon.

D‘autre part, l‘analyse NMDs des données de pyroséquençage du gène ARN 16S a révélé une

structuration spatiale des communautés bactériennes issues de la méthode de Btana indirecte (UBM),

caractérisée par une composition bactérienne significativement similaire mais différente de celle de la

méthode directe (DBM). Le test d‘UniFrac pondérée (weighted UniFrac) utilisant la distance

phylogénétique confirme la divergence des communautés de type de Btana (P<0.001). Les échantillons de

UBM partagent 7 OTUs: Bacillus safensis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Paenibacillus

polymyxa, Paenibacillus xylanexedens, Terribacillus aidingensis et Planomicrobium JN082684. Parmi

lesquels Paenibacillus polymyxa (r=0.81, P<0.01), Paenibacillus xylanexedens (r=0.55, P<0.01) et

Planomicrobium JN082684 (r=0.42, P<0.05) contribue significativement à la distinction de ce type de

Btana. Pour les Btana DBM, seulement deux espèces sont communs entre tous les échantillons à savoir

Bacillus malacitensis et Bacillus megaterium. Les échantillons de Btana présente une grande diversité

d‘espèces rares et également d‘espèces communes, mais se différenciaient fortement par

l‘abondance de ces espèces.

- 175 -

D‘autre part, il est constaté que le Btana de type UBM dispose d‘un pool d‘espèces commun plus large

que celui de type DBM, cependant les paramètres de Btana n‘ont pas pu etre mis en relation avec cette

différenciation.

Enfin, nous avons conclu que les données recueilles lors de l‘étude de la microflore bactérienne,

ne satisfassent pas les besoins du travail, car il a été conclu que la fermentation de Btana n‘est pas l‘ouvre

des bactéries détectées aussi bien que l‘occurrence et l‘abondance de certaines espèces dans les

échantillons de Btana est fortement liés à l‘effort d‘échantillonnage, tant bien sur l‘origine que

pendant les phases d‘extraction d‘ADN, de PCR, ou de pyroséquençage.

À ce regard un travail complémentaire de l‘identification de la microflore fongique

(principalement) les levures a été envisagé dans ce perspective et aussi d‘après la littérature qui met en

cause nombreuses levures responsables de l‘altération et la fermentation des dattes conservées. Pour ce

faire, on a suit les mêmes démarches faites pour la flore bactérienne à savoir, un isolement classique des

souches représentatives, étude de leur propriété biochimiques et physiologiques puis identification

moléculaire par le gène ARN 26S, puis étude métagénomique par le biais de pyroséquençage.

Au globale 46 souches de levures sont sélectionnées et sont identifiées et groupées de manière

préliminaire d‘après leur propriétés morphologique, biochimiques et physiologiques. Ceci nous a permis

de choisir 23 représentatifs souches pour le séquençage du gène ARN 26S. la similarité avec la base de

donnés de Genbank a révélé la présence de 5 différentes espèces dans les échantillons de Btana analysés.

La souche la plus représentées est Zygosaccharomyces rouxii, ( 9 isolats). Les espèces de Lachancea

thermotolerans (6 isolats) et Pichia subpelliculosa (5 isolats) ont été détecté exclusivement dans les

Btana de Sali et Orlal respectivement. Deux isolats sont assignés à Hanseniaspora opuntiae (2) et une

souche de Kluyveromyces delphensis isolées uniquement de l‘échantillon d‘E lmeghier. Le caractère

osmophile representé par un développement dans 50 et 60% de glucose a été observé dans tous les isolats

testés.

L‘étude du pouvoir de fermentation des souches a été effectuée dans un extrait de datte qui a été

stérilisé puis inoculé par les isolats et mis à fermentation pendant 21 jours dans des conditions

- 176 -

d‘anaérobiose pour simuler les conditions de Btana. Les paramètres de fermentation incluant la valeur de

pH, les acides organiques et l‘éthanol se sont suivis par un prélèvement et dosage après 48 h, 96 h, 15 et

21 jours d‘incubation. Généralement le pH s‘est baissé sous la valeur 5 pendant les premiers 48h selon les

espèces, cette régression étant consécutive jusqu‘aux 15 jours (de 5.2 ± 0.02 à 3.88± 0.25) où on a

constaté une stabilisation de pH pour tous les souches étudiés. L‘analyse par HPLC a montré l‘abondance

de fructose et de glucose dans l‘extrait de datte, une faible concentration de saccharose a été aussi

déterminée. La concentration des sucres diminue significativement au fur et à mesure de la fermentation

et produit en parallèle des quantités variables d‘éthanol, lactate, acétate, formate, et de succinate.

Etonnamment nous avons remarqué que Kluyveromycess ait produit du glucose et de fructose après 96 h

d‘incubation probablement par l‘activité d‘invertase sur les sucres et les autres carbohydrates présents

dans l‘extrait de datte.

K. delphensis et L. thermotolerans consomment la majorité du glucose et du fructose fournis au

bout du premier 48 h, ceci a été traduit par une baisse de pH et production d‘éthanol et d‘autres

métabolites.

Le saccharose est modérément consommé par toutes les souches de levures. Pour le cas de Z.

rouxii, les souches n‘ont guère utilisé le glucose durant toute la période de fermentation ce qui confirme

la faculté de cette espèce plutôt fructophilique. Le saccharose est utilisé pendant les derniers stades de

fermentation vraisemblablement après l‘épuisement du fructose. L‘espèce H. opuntiae préfère tout de

même le fructose est laisse une grande quantité du glucose dans le milieu à la fin de la fermentation. Cette

espèce consomme moins de sucres en comparaison avec les autres souches mais en revanche elle baisse

très rapidement le pH de l‘extrait de datte. Les souches de K. delphensis sont les plus préformantes en

matière de fermentation de l‘extrait de datte en produisant le lactate comme substrat majoritaire, et aussi

d‘acétate et de succinate mais moins d‘éthanol. Les souches appartenant au Pichia subpelliculosa sont les

plus faibles dans la fermentation de l‘extrait de datte (pH finale 4.12) malgré qu‘elles aient consommé la

plus grande quantité de glucose. En autre elles oxydent aisément le méthanol et l‘éthanol et gardent leurs

viabilités après 21 jours de fermentation.

- 177 -

Nous n‘avons pas mis en évidence, un effet reproductible entre le potentiel fermentaire des souches et

leurs échantillons correspondants. Les valeurs de pH de la majorité des échantillons ne reflètent pas

réellement le potentiel de fermentation des souches, donnant ainsi des conclusions ambiguës.

L‘étude de l‘activité enzymatique des souches de levures montre une importante activité de

leucine arylamidase esterase (C4) et de naphtol-AS-BI-phosphohydrolase pour les isolats de L.

thermotolerans, K. delphensis et P. subpelliculosa. Ces enzymes spécifiques à des substrats lipidiques ne

semblent pas avoir d‘intérêt dans la dégradation des substances présentes dans les dattes qui sont

principalement riches en polysaccharides. Ces substances seraient dégradées par d‘autre enzymes telles

que les glucosidases qui sont grandement exprimés par toutes les souches étudiées (β-glucosidase et l‘α-

glucosidase pour Z. rouxii et de K. delphensis). Cependant, il semble difficile d‘établir une fois encore le

potentiel enzymatique des souches de levures et la composition finale des échantillons de Btana,

néanmoins les analyses des données a montré que L. thermotolerans qui domine l‘échantillon BT10 et

qui exprime une forte activité de β-glucosidase et produit des concentrations importantes en lactates et

acétates serait probablement à l‘origine de l‘acidification de l‘échantillon (pH= 4,67) et de la production

de lactates et acétates détectés dans l‘échantillon. La même observation a été faite pour l‘échantillon

BT11. Toutefois il y a d‘autre espèces plus acidififiante (K. delphensis) de l‘extrait de dattes que L.

thermotolerans et pour lesquelles il n‘était pas possible d‘établir une relation avec la concentration des

métabolites de fermentation dans les échantillons de Btana analysés.

Les méthodes utilisées au cours de cette étude ont souligné l‘importance de caractériser les

communautés microbiennes d‘un point de vue phylogénétique et biochimique, quoique ces

techniques n‘ont apporté que peu de renseignements définitifs sur le rôle des microorganismes dans

le Btana. En effet, il existe plusieurs alternatives pour lier la présence des groupes microbiens et leur

rôle fonctionnel. La capacité d‘utilisation de substrats et les activités enzymatiques de souches isolées

semblent très informatives. À ce propos nos analysent sont très limitées et n‘ont concernés que les

composantes majoritaires des dattes. D‘autres approches telle que la production et la résistance aux

antibiotiques peut également renseigner sur la compétitivité de la souche au sein de la communauté de

Btana. Cependant, comme il est difficile de mener ces études in situ, les études in vitro ne permettent pas

- 178 -

de déterminer de façon précise la fonction qu‘occupe la souche dans son milieu (Btana), car les

performances métaboliques de la souche in situ peuvent être influencées par ses interactions avec

les autres et les conditions du milieu

- 179 -

Conclusion générale et

perspectives :

- 180 -

Après la réalisation de ces inventaires taxonomiques, il serait nécessaire d‘établir un lien plus

détaillé entre la composition et la fonction des communautés microbiennes identifiées. En effet,

bien que les méthodes utilisées dans cette thèse aient permis de caractériser les communautés

microbiennes d‘un point de vue phylogénétique, elles apportent généralement peu de renseignements sur

le rôle de ces microorganismes dans le produit Btana.

Dans ce contexte, il existe plusieurs alternatives permettant de lier la structure phylogénétique à la

structure fonctionnelle des communautés microbiennes. Comme l‘étude des les gènes ribosomaux et en

parallèle un ou plusieurs gènes fonctionnels d‘intérêt.

Enfin, l‘ensemble des observations réalisées au cours des ces travaux a souligné l‘importance du

maintien des méthodes traditionnelles de culture et d‘isolement pour l‘identification précise et la

compréhension du rôle fonctionnel des microorganismes dans la Btana. En effet, bien que les

méthodes moléculaires facilitent l‘accès aux microorganismes non cultivables, elles présentent la

difficulté de faire des inventaires constitués pour une large part de microorganismes inconnus,

empêchant ainsi toute hypothèse sur leur rôle fonctionnel dans le produit de Btana à l‘instar des

Agaromyces dont on ne sait pas l‘origine, ni comment ils contaminent les dattes qui sont produites dans

des régions tropicales très chaudes de même pour le grand nombre des espèces de Bacillus qui sont mal

identifiées.

De plus, les méthodes de culture permettent de pallier les biais liés aux approches moléculaires

comme la difficulté d‘extraire l‘ADN de certains groupes microbiens et la nature complexe des dattes qui

se lie à l‘ADN au cours du procédé de l‘extraction.

L'utilisation des analyses multivariées s'est révélée fort utile pour corréler la distribution de la

microflore microbienne en fonction des variables étudiés. Malheureusement, il y eu des limites dans le

nombre des paramètres considérés et le nombre des échantillons jugés insuffisant pour pouvoir liéer les

paramètres avec la communauté microbienne détectée.

Le suivi des voies métaboliques de la fermentation de l‘extrait de datte par les différentes levures

sélectionnées a permis alors de suggérer des liens entre ces levures et leur fonctions éventuelles au sein de

- 181 -

l‘environnement de Btana. Bien que cette approche soit sujette à quelques limites méthodologiques, elle

permettrait néanmoins d‘estimer ce qui se fait naturellement dans le cœur de ce produit traditionnel.

En conclusion, les résultats obtenus ont souligné l‘intérêt de l‘utilisation des nouvelles techniques

de séquençage à haut débit permettant de mettre en évidence une diversité majoritairement sous estimée

par les techniques classiques. Cette constatation ouvre la voie à de nombreuses interrogations concernant

le rôle biologique des nombreux taxons mis en évidence. Il sera donc nécessaire d‘en prendre

compte dans les études futures, et de tenter d‘identifier les fonctions potentiellement réalisées par ces

organismes. Les futures études devront aussi se focaliser sur les relations de la communauté microbienne

avec certains paramètres physicochimiques de Btana dont il faudra décrire avec plus de précision

l‘impact réel sur ces communautés.

- 182 -

Références

bibliographiques

- 183 -

1. Abekhti A., Daube G., Kihal M. 2014. Isolation and identification of dominant osmophilic

Leuconostoc strains from traditional date product ―Btana. Int Food Res J 21(4), 1297-

1304.

2. Abekhti A., Zarour K., Boulal A., Benmechernene Z., Kihal M. 2013. Evaluation of Microbiological

Quality of the Date Fruit Product ―Btana‖ Produced in Adrar South Algeria. J Microbiol

Res 3(5), 163-170.

3. Abriouel H., Ben Omar N., Lopez R.L., Martinez–Canamero M., Keleke S., Galvez A. 2006.

Culture–independent analysis of the microbial composition of the African traditional

fermented foods poto poto and degue by using three different DNA extraction methods.

Int J Food Microbiol 111, 228-233

4. Abriouel H., Benomar N., Lucas Lopez R., Martinez -Canamero M., Ortega E., Galvez A. 2007.

Differentiation and characterization by molecular techniques of Bacillus cereus group

isolates from poto poto and degue, two traditional cereal-based fermented foods of

Burkina Faso and Republic of Congo. J Food Prot 70, 1165-1173.

5. Abriouel H., Benomar N., Perez Pulido, R., Canamero, M.M., Galvez, A. 2011. Annotated genome

sequence of Lactobacillus pentosus MP-10 with probiotic potential from naturally-

fermented Alorena green table olives. J Bacteriol, 05171-05111.

6. Acourene S., M.Tama., 1997. Caractérisation physico-chimique des principaux cultivars de dattes de

la région de Zibans. Recherche agronomique (INRAA), 1, 59-66 .

7. Adams, M.R., Nicolaides, L. 2008. Review of the sensitivity of different foodborne pathogens to

fermentation. Food Control 8, 227-239.

8. Agbobatinkpo, P.B., Thorsen, L., Nielsen, D.S., Azokpota, P., Akissoe, N., Hounhouigan, J.D.,

2013. Biodiversity of aerobic endospore-forming bacterial species occurring in Yanyanku

and Ikpiru, fermented seeds of Hibiscus sabdariffa used to produce food condiments in

Benin. International Journal of Food Microbiology 163(2–3), 231 -8.

9. Ahaotu, I., Anyogu, A., Njoku, O.H., Odu, N.N., Sutherland, J.P., Ouoba, L., 2013. Molecular

identification and safety of Bacillus species involved in the fermentation of African oil

beans (Pentaclethra macrophylla Benth) for production of Ugba. International Journal of

Food Microbiology 162(1), 95-104.

10. Aidoo, K. E., Tester, R.F., Morrison, J.E., MacFarlane, D. 1996. The comp osition and microbial

quality of prepacked dates purchased in Greater Glasgow. Int J Food Sci Technol 31,

433-438.

11. Al Jasser, M.S. 2010. Effect of storage temperatures on microbial load of some dates palm fruit

sold in Saudi Arabia market. Afr J Food Sci 4, 359-363.

12. Al Hazzani, A. A., Shehata, A.I., Rizwana, H., Moubayed, N.M. S., Alshatwi, A. A., Munshi, A.,

Elgaaly, G. 2014. Postharvest fruit spoilage bacteria and fungi associated with date palm

(Phoenix dactylifera L) from Saudi Arabia. A J Microbiol Res 8(11), 1228-1236.

13. Al-Humaid, A.I., Mousa, H.M., El-Mergawi, R.A., Abdel-Salam, A.M. 2010. Chemical composition

and antioxidant activity ofdates and dates-camel-milk mixtures as a protective meal

against lipid peroxidation in rats. Am J Food Technol 5, 22-30.

14. Aljanabi S.M., Forget, L., Dookun, A. 1999. An improved rapid protocol for the isolation of

polysaccharide and polyphenolfree sugarcane DNA. Plant Mol Biol Rep 17, 1-8.

15. Allane, T., Benamara, S. 2010. Activités antioxydantes de quelques fruits communs et

sauvages d‘Algérie. Phytothérapie 3 (8), 171-175.

16. Al-Shahib, W., Marshal, R. J. 2003. The fruit of the date palm: its possible use as the best food for

the future. Int J Food Sci Nut 54, 247.

17. Al-Shahib, W., Marshall, R.J., 2002. Dietary fiber content of 13 varieties of date palm (Phoenix

dactylifera L). J Food Sci Technol 37, 719-721

- 184 -

18. AL-Shaickly, M.A.S., Al-Rubaie, I..A., Al-Dulami, A.A. 1980. Microbial pollution of date during

stages of maturation. Paper presented at the first arab conference of biological sciences,

21-24, April, Baghdd, P. 118.

19. Amann, R.I., Ludwig, W., Schleifer, K.H. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of

individual microbial cells without cultivation. Microbiol Rev 59(1), 143-169.

20. Amend, A.S., Seifert, K.A., Bruns, T.D., 2010b. Quantifying microbial communities with 454

pyrosequencing: does read abundance count? Molecular Ecology 19, 5555–5565

21. Ampe, F., Ben Omar, N., Moizan, C., Wacher, C. Guyot, J. P. 1999. Polyphasic study of the spatial

distribution of microorganisms in Mexican pozol, a fermented maize dough, demonstrates

the need for cultivation-independent methods to investigate traditional fermentations.

Appl Environ Microbiol 65, 5464-5473.

22. An, S.Y., Asahara, M., Goto, K., Kasai, H., Yokota, A., 2007. Terribacillus saccharophilus gen. nov.,

sp. nov. and Terribacillus halophilus sp. nov., spore-forming bacteria isolated from field

soil in Japan. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 57, 51–

55.

23. Anonyme. (2002). Statistiques agricoles : Superficies et productions. Ministère de l‘agriculture et du

développement rural. Série A, 5-6 p.

24. Arditi, C. 1995. Le commerce des dattes du Borkou (Tchad). Cah. Sci. Hum 31 (4), 849-882.

25. Arif IA, Bakir AM, Khan HA et al (2010) A simple method for DNA extraction from mature date

palm leaves: impact of sand grinding and composition of lysis buffer. Int J Mol Sci 11:

3149–3157

26. Arrizon, J., Mateos, J.C., Sandoval, G., Aguilar, B., Solis, J., Aguilar, M.G., 2011. Bioethanol and

xylitol production from different lignocellulosic hydrolysates by sequencial fermentation.

Journal of Food Process Engineering 34, 437-454.

27. Arroyo-López F.N., Romero-Gil, V.J., Bautista-Gallego, F., Rodríguez-Gómez, R., Jiménez-Díaz,

P., García-García, A., Querol, A., Garrido-Fernández. 2012. Yeasts in table olive

processing: Desirable or spoilage microorganisms?. Int J Food Microbiol 160, 42–49.

28. Arroyo-López, F.N., Bautista-Gallego, J., Rodríguez-Gómez, F., Romero-Gil, V., López-López,A.,

García-García, P., Jiménez-Díaz, R., Garrido-Fernández, A., 2011. Probiolives: table

olive fermentation with selected strains of probiotic lactic acid bacteria. Towards a new

functional food. Proceeding book from BioMicroworld 2011 Congress. Torremolinos,

Spain, p. 259.

29. Ash, C., Priest, F. G., Collins, M.D., (1993). Molecular identification of rRNA group 3 bacilli (Ash,

Farrow, Wallbanks and Collins) using a PCR probe test. Proposal for the creation of a

new genus Paenibacillus. Antonie van Leeuwenhoek 64, 253–260.

30. Atia M.M.M., 2011. Efficiency of Physical Treatments and Essential Oils in Controlling Fungi

Associated with Some Stored Date Palm Fruits. Aust J Basic Appl Sci 5, 1572-1580.

31. Atienzar, F.A., Jha, A.N. 2006. The random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay and related

techniques applied to genotoxicity and carcinogenesis studies: a critical review. Mutation

Res 613, 76-102.

32. Barnett, J.A., Payne, R.W., Yarrow, D. 2000. Yeasts: Characteristics and Identification. Cambridge

University Press, Cambridge.

33. Barreveld, W. H. 1993. Date palm products. Food and Agriculture Organization of the United

Nations, Agricultural Services Bulletin No. 101; FAO: Rome, Italy.

34. Battcock, M., Azam-Ali, S. 2001. Fermented Fruits and Vegetables: A Global Perspective. FAO

Agricultural Services Bulletin. No. 134. 96 pp. Rome.

- 185 -

35. Behme, R,J., Shuttleworth, R., McNabb, A., Colby, W.D., 1996. Identification of staphylococci with

a self-educating system using fatty acid analysis and biochemical tests. Journal of Clinical

Microbiology 34, 3075-3084

36. Belguedj, M. 2001. Caractéristiques des cultivars de dattes dans les palmeraies du Sud -Est

Algérien, N° 11, INRAA. El-Harrach , Alger. 289 p

37. Belguedj, M., Tirichine, A., Guerradi, M. 2008. La culture du palmier dattier dans les oasis de

Ghardaïa. Revue INRA Algérie. 94 p.

38. Ben Abbes F. 2011 Etude de quelques propriétés chimiques et biologiques d‘extraits de dattes «

Phoenix dactylifera L. ». mémoire de magistère. Université d‘Ouargla. Algérie.

39. Benbouza, H., Baudoin, J.P., Mergeai, G. 2006. Amélioration de la méthode d‘extraction d‘ADN

au CTAB appliquée aux feuilles de cotonnier. Biotechnol Agron Soc Environ, 10,

73-76

40. Benchabane, A., Abbeddou, S., Bellal, M.M., Thibault, J.F. 2006. Evolution of pectins and

polygalacturonase activities during maturation of date Deglet-nour. Sci Alim 26 (3), 233-

246.

41. Benjamin, N.D., Shabana, H.R., Hasan, A.A., Hussain, A.M., Bader, S.M. 1976. Effect of different

temperatures and types of containers on storage of commercial variety of date in Iraq.

Technical Bulletin 13l76. Palm Research Center Baghdad –Iraq.

42. Benmeddour Z, Mehinagic E, Meurlay D L, Louaileche H 2012 Phenolic composition and

antioxidant capacities of ten Algerian date (Phoenix dactylifera L.) cultivars: A

comparative study. J Funct Foods 5:346–354

43. Bent, S.J., and Forney, L.J. 2008. The tragedy of the uncommon: understanding limitations in the

analysis of microbial diversity. Isme J 2, 689-695.

44. Bergeron, M., Dauwalder, O., Gouy, M., Freydiere, A.-M., Bes, M., Meugnier, H., Benito, Y.,

Etienne, J., Lina, G., Vandenesch, F., 2011. Species identification of staphylococci by

amplification and sequencing of the tuf gene compared to the gap gene and by matrix-

assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. European journal of

clinical microbiology and infectious diseases 30, 343-354.

45. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Volume 3: The Firmicutes. Editors: Paul De Vos,

George Garrity, Dorothy Jones, Noel R. Krieg, Wolfgang Ludwig, Fred A. Rainey, Karl-

Heinz Schleifer and William B. Whitman.

46. Berthels, N.J., Cordero-Otero R.R., Bauer, F.F., Thevelein, J.M., Pretorius, I.S., 2004. Discrepancy

in glucose and fructose utilization during fermentation by Saccharomyces cerevisiae wine

yeast strains. FEMS Yeast Research 4, 683-689.

47. Biegala, I., Not, F., Vaulot, D., Simon, N. 2003. Quantitative assessment of picoeukaryotes in the

natural environment by using taxon-specific oligonucleotide probes in association with

tyramide signal amplification-fluorescence in situ hybridization and flow cytometry. Appl

Environ Microbiol 69, 5519–552.

48. Blandino, A., Al-Aseeri, M.E., Pandiella, S.S., Cantero, D., Webb, C. 2003. Cereal-based fermented

foods and beverages. Food Res Int 36, 527-543.

49. Bokulich, N.A., Mills, D.A., 2012. Next-generation approaches to the microbial ecology of food

fermentations. BMB 45, 377-389.

50. Bonomo, M.G., Salzano, G., Ricciardi, A., 2010. Influence of autochthonous starter cultures

on microbial dynamics and chemical-physical features of traditional fermented

sausages of Basilicata region. World Journal of Microbiology and. Biotechnology 27 (1),

137-146.

51. Boudries H, Panagiotis K, Damaso HM (2007) Carotenoid composition of Algerian date varieties at

different edible maturation stages. Food Chem 101:1372–1377

- 186 -

52. Boulal, A., Benali, B., Moulai, M., Touzi, A., 2010. Transformation des déchets de dattes de la

région d‘Adrar en bioéthanol.Revue des Energies Renouvelables 13 (3), 455 – 463.

53. Bourdichon, F., Casaregola, S., Farrokh, C., Frisvad, J.C., Gerds, M.L., Hammes, W.P., Harnett, J.,

Huys, G., Laulund, S., Ouwehand, A., Powell, I.B., Prajapati, J.B., Seto, Y., Ter Schure,

E., Van Boven, A., Vankerckhoven, V., Zgoda, A., Tuijtelaars, S., Hansen, E.B., 2012.

Food fermentations: microorganisms with technological beneficial use. Int J Food

Microbiol 154, 87–97.

54. Cadez, N., Rasper, P., Smith, M.T., 2006. Phylogenetic placement of Hanseniaspora–Kloeckera

species using multigene sequence analysis with taxonomic implications: descriptions of

Hanseniaspora pseudoguilliermondii sp. nov. and Hanseniaspora occidentalis var. citrica

var. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Miccrobiology 56, 1157-

1165.

55. Cagno, R., De Pasquale, I., De Angelis, M., Gobbetti, M. 2012. Accelerated ripening of

CaciocavalloPugliese cheese with attenuated adjuncts of selected nonstarter

lactobacilli. J Dairy Sci 95, 4784-4795.

56. Campbell Platt, G., 1994. Fermented foods – a world perspective. Food research International 27,

253-257.

57. Cankar K, Stebih D, Dreo T, et al 2006. Two mini–preparation protocols to DNA extraction from

plants with high polysaccharide and secondary metabolites. Afr J Biotechnol 5(20):1864–

1867

58. Cauvet S. 1914. la culture du palmier au Souf . Revue africaine N° 58.

59. Chang, Y.C., Wang, J.Y., Selvam, A., Kao, S.C., Yang, S.S., Shih, D.Y.C., 2008. Multiplex PCR

detection of enterotoxin genes in Aeromonas spp. from suspect food samples in Northern

Taiwan. Journal of Food Protection 71, 2094–2099

60. Chao, A., Bunge, J., 2002. Estimating the Number of Species in a Stochastic Abundance Model.

Biometrics 58, 531-539.

61. Chao, A., Colwell, R.K., Lin, C.W., Gotelli, N.J., 2009. Sufficient sampling for asymptotic minimum

species richness estimators. Ecology 90, 1125–1133.

62. Chao, C. C. T., Krueger, R. R. 2007. The date palm: Overview of biology, uses and cultivation.

Hort Sci 42(5),1077-1082.

63. Charlery De La Masseliere, Bernard., 2004. Fruits des terroirs fruits défendus » Identités, Mémoires

et Territoires, Presses universitaires du Mirail.

64. Chen, J.L., Chiang, M.L., Chou, C.C., 2009. Survival of the acid-adapted Bacillus cereus in

65. Cocolin L., Alessandria V., Dolci P., Gorra R. and Rantsiou K., 2013 - Culture independent methods

to assess the diversity and dynamics of microbiota during food fermentation. International

Journal of Food Microbiology, 167 (1): 29-43.

66. Cocolin, L., Dolci, P., Rantsiou, K., 2011. Biodiversity and dynamics of meat fermentations: the

contribution of molecular methods for a better comprehension of a complex ecosystem.

Meat Science 89, 296–302.

67. Cocolin, L., Ercolini, D. 2008. Molecular Techniques in the Microbial Ecology of

Fermented Foods. Springer, New York, USA.

68. Collins, M.D., Farrow, J.A.E., Jones, D., 1986. Enterococcus mundtii sp. nov. International Journal

of Systematic Bacteriology 36, 8-12.

69. Colwell, R.K., Coddington, J.A., 1994. Estimating terrestrial biodiversity through extrapolation.

Philosophical Transactions of the Royal Society of London 345, 101-118.

70. Combina, M., Pérez-Torrado, R., Tronchoni, J., Belloch, C., Querol, A., 2012. Genome-wide gene

expression of natural hybrid between Saccharomyces cerevisiae and S. kudriavzevii under

enological conditions. Int J Food Microbiol 157: 340–345

- 187 -

71. Compaoré CS, Nielsen DS, Sawadogo-Lingani H, Berner TS, Nielsen KF, Adimpong DB, Diawara

B, Ouédraogo GA, Jakobsen M, Thorsen L. 2013b. Bacillus amyloliquefaciens ssp.

plantarum strains as potential protective starter cultures for the production of Bikalga, an

alkaline fermented food. J Appl Microbiol 115, 133-146.

72. Connon, S.A., Giovannoni, S. J. 2002.Highthroughput methods for culturing microorganisms in

very-low-nutrient media yield diverse new marine isolates. Appl Environ Microbiol 68,

3878-3885

73. Cunha, M.L.R.S., Rugolo, L. M. S. S., Lopes, C. A. M., 2006. Study of virulence factors in

coagulase-negative staphylococci isolated from newborns. Mem Inst Oswaldo Cruz Rio

de Janeiro 101(6), 661-668.

74. Curtis,T.P.,Andw. T. Sloan. 2004. Prokaryotic diversity and its limits: Microbial community

structure in nature and implications for microbial ecology. Curr Opin Microbiol 7, 221-

226.

75. Dahllof, I., Kjelleberg, S. 2002.Multivariate optimization of polymerase chain reaction for microbial

community analysis. Mar Biotechnol 4, 423-430.

76. Dirar, H.A. 1993. The Indigenous Fermented Foods of Sudan. CAB International, Wallingford, UK.

77. Djerbi, M. 1983. Report on Consultancy Mission on Date Palm Pests and Diseases. FAO Rome;

October 1983. 28 pp.

78. Dodor, D.E., Tabatabai, M.A., 2007. Arylamidase activity as an index of nitrogen mineralization in

soils. Communications in Soil Science and Plant Analysis 8, 2197-2207.

79. Dorigo, U., Volatier, L., Humbert, J.F. 2005. Molecular approaches to the assessment of

biodiversity in aquatic microbial communities. Water Res 39(11), 2207-2218.

80. Doyle JJ, Doyle JL 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13–15

81. Elleuch, M., Besbes, S., Roiseux, O., Blecker, C., Deroanne, C., Drira, N.E., Attia, H. 2008. Date

flesh: Chemical composition and characteristics of the dietary fibre. Food Chem, 111(3),

676-682.

82. El-Sohaimy, S.A., Hafez, E.E., 2010. Biochemical and nutritional characterizations of date palm

fruits (Phoenix dactylifera L.). Journal of Applied Sciences Research 8, 1060-1067.

83. El–Zayat M, Abdusalm K, Shamlool A, Djerbi M, Hadidi A 2002. Phytoplasma detected in date

palm trees infected by Al–Wijam in Kingdom of Saudi Arabia. In: Proceedings of the

Date Palm International Symposium, Windhoek: Namibia, 230– 6

84. Ercolini, D., De Filippis, F., La Storia, A., Iacono, M., 2012.A―remake‖of the microbiota involved in

the production of water buffalo mozzarella cheese by high throughput sequencing.

Applied and Environmental Microbiology 78, 8142–8145.

85. Euzéby, J.P., 2003. List of bacterial names with standing in nomenclature. Available online on 04

May 201 1 at:

http://www.bacterio.cict.fr/s/staphylococcus.html.

86. Favier, J.C., Ireland, R.J., Laussucq, C., Feinberg, M., 1993. Répertoire général des aliments. Table

de composition des fruits exotiques, fruits de cueillette d‘Afrique. Tome III, Ed.

ORSTOM, Lavoisier, INRA.

87. Ferrari, B.C., Binnerup, S.J. Gillings, M. 2005. Microcolony cultivation on a soil substrate

membrane system selects for previously uncultured soil bacteria, Appl Environ Microbiol

71, 8714-8720.

88. Ferry M., 1995 : la crise du secteur phœnicicole dans les pays Méditerranéens. Quelles recherches

pour y répondre ? CIHEAM, Options Méditerranéennes, 1995, pp 129-156.

89. Filion, G. 2008.Détection rapide de spores de Bacillus par hybridation in situ en

fluorescence, pp. 106. Québec Département de Biochimie et de Microbiologie, Faculté

des Sciences et de Génie, Université Laval.

- 188 -

90. Fleet, G.H., 2003. Yeasts in fruit and fruit products. In: Boekhout, T., Robert, R. (Eds.), Yeasts and

Food. Beneficial and Detrimental Aspects. Behrs Verlag, Hamburg, pp. 267–288.

91. Florence, M. 2011. Bacterial diversity exploration in hydro carb on p olluted soil : metab olic

potential and degrader community evolution revealed by isotope labeling. These de

doctorat. Life Sciences. Université de Grenoble,. French.

92. Franz MJ, Boucher JL, Evert AB. 2014. Evidence-based diabetes nutrition therapy recommendations

are effective: The key is individualization. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity:

Targets and Therapy 7: 65–72.

93. Fritze, D. 2004. Taxonomy and systematics of the aerobic endospore forming bacteria: Bacillus and

related genera. In

Bacterial Spore Formers ed. Ricca, E., Henriques, A.O. and Cutting, S.M. pp. 17–34.

Norfolk, UK: Horizon Bioscience.

94. Fröhlich, J., Hyde, K.D. and Petrini, O. (2000). Endophytic fungi associated with palms.

Mycological Research 104: 1202-1212.

95. Frohlich, J., Konig, H. 2000. New techniques for isolation of single prokaryotic cells, FEMS

microbiol rev 24, 567-572.

96. Gadaga, T.H., A.N. Mutukumira, J.A. Narvhus Feresu, S.B.1999. A review of traditional fermented

foods and beverages of Zimbabwe. Int J Food Microbiol 53(1), 1–11.

97. Gaggia, F., Di Gioia, D., Baffoni, L., Biavati, B. 2011. The role of protective and probiotics cultures

in food and feed and their impact on food safety. Tren Food Sci Technol 22, 58-66.

98. Gaüzere, C. 2012. Caractérisation de la diversité microbienne de l‘air des espaces clos. Thèse de

docorat. Université Montpellier ii..

99. Ghosh, R., Paul, S., Ghosh, S.K., Roy, A. 2009. An improved method of DNA isolation

suitable for PCR–based detection of begomoviruses from jute and other mucilaginous

plants. J Viral Methods 159:34–39

100. Good, I.J., 1953. The population frequencies of species and the estimation of population

parameters. Biometrika 40 (3-4), 237-264

101. Götz, F., T. Bannerman, and K.-H. Schleifer. 2006. The genera Staphylococcus and Macrococcus,

p. 5-75. In M. Dworkin (ed.), Procaryotes, vol. 4. Springer, New York, NY.

102. Grant W.D. 2004. Life at low water activity. Philosophical transactions of the royal society of

London 359, 1249-1266.

103. Greppi A, Rantisou K, Padonou W, Hounhouigan J, Jespersen L, Jakobsen M, Cocolin L (2013).

Yeast dynamics during spontaneous fermentation of mawe and tchoukoutou, two

traditional products from Benin. Int J Food Microbiol 165:200–207

104. Greppi, A., Rantsiou, K., Padonou, W., Hounhouigan, J., Jespersen, L., Jakobsen, M., Cocolin, L.,

2013. Determination of yeast diversity in ogi, mawè, gowé and tchoukoutou by using

culture-dependent and -independent methods. International Journal of Food microbiology

165, 84–88.

105. Guan, L., Cho, K.H., Lee, J.H., 2011. Analysis of the cultivable bacterial community in Jeotgal, a

Korean salted and fermented seafood, and identification of its dominant bacteria. Journal

of Food Microbiology 28, 101-113.

106. Gudenschwager O, González–Agüero M, Defilippi BG (2012). A general method for high–quality

RNA isolation from metabolite–rich fruits. S Afr J Bot 83:186–192

107. Gudenschwager O, González–Agüero M, Defilippi BG (2012). A general method for high–quality

RNA isolation from metabolite–rich fruits. S Afr J Bot 83:186–192

108. Guedegbe, H.J., Houngnandan, P., Roman, J., Rouland-Lefèvre, C. 2008. Patterns of substrate

degradation by some microfungi from fungus-growing termite combs (Isoptera,

Termitidae : Macrotermitinae). Sociobiology 52 (3), 1-17.

- 189 -

109. Guerrero, L., Gua`rdia, M. D., Xicola, J., Verbeke, W., Vanhonacker, F., Zakowska, S., 2009.

Consumer-driven definition of traditional food products and innovation in traditional

foods. A qualitative cross-cultural study. Appetite 52, 345–354.

110. Guiraud, J.P., 1998. Microbiologie Alimentaire. Technique et Ingénierie, Série Agroalimentaire.

Dunod, Paris.

111. Guyot, J.P. 2010. Fermented Cereal Products. In Fermented Foods and Beverages of the

World, pp. 247-261: CRC Press.

112. Haas, B.J., Gevers, D., Earl, A.M., Feldgarden, M., Ward, D.V., Giannoukos, G., Ciulla, D.,

Tabbaa, D., Highlander, S.K., Sodergren, E., Methé, B., DeSantis, T.Z., and Human

Microbiome Consortium., 2011. Chimeric 16S rRNA sequence formation and detection

in Sanger and 454-pyrosequenced PCR amplicons. Genome Research 21, 494-504.

113. Hamad S.H . 2012. The microbial quality of processed date fruits collected from a factory

in al Hofuf city, Kingdom of Saudi Arabia. Emir J Food Agric 24, 105-112.

114. Hamad, S. H., 2008. Microbial spoilage of date Rutab collected from the markets of Al-Hofuf City

in the Kingdom of Saudi Arabia. J Food Prot 71(7), 1406-1411.

115. Hannachi, S., khitri, D., Benkhalifa, A., Brac de la perrière, R.A. 1998. Inventaire variétal de la

palmeraie algérienne.

116. Hashem, M., Hesham, A.E.L., Alrumman, S.A., Alamri, S.A., Moustafa, M.F.M. 2014. Indigenous

yeasts of the rotten date fruits and their potentiality in bioethanol and single-cell protein

production. Int J Agr Biol 16, 752-758.

117. Hasnaoui, A., Elhoumaizi, M.A., Asehraou, A., Hakkou, A. 2010. Chemical composition and

microbial quality of main varieties of dates grown in figuig oasis of Morocco. Int J Agric

Bio 12, 311-314.

118. Hassan, H,K, 1979. Technical Bulletin for preservation of high moisture date. Palm and Dates

Research Center.

119. Hein, I., Schneeweiss, W., Stanek, C., Wagner, M. 2007. Ethidium monoazide and propidium

monoazide for elimination of unspecific DNA background in quantitative universal

real-time PCR. J Microbiologl Methods 71, 336-339.

120. Hesham, A., Wang, Z., Zhang, Y., Zhang, J., Lv, W., Yang, M., 2006. Isolation and identification

of a yeast strain capable of degrading four and five ring aromatic hydrocarbons. Annals of

Microbiology 56, 109-112.

121. Holdsworth, S.D. 2004. Optimising the safety and quality of thermally processed packaged foods.

In: Richardson P (ed) Improving the thermal processing of foods. CRC Press, New York,

pp 3–31.

122. Holzapfel, W.H. 1997. Use of starter cultures in fermentation on a household scale. Food Control

8, 241–258

123. Homayouni, A., Azizi, A., Khodavirdivand, K.A., Amini. A., Eslam. A. 2014. Date canning: a new

approach for the long time preservation of date. J Food Sci Technol.

124. Hounhouigan, D.J., Nout, M.J.R., Nago, C.M., Houben, J.H., Rombouts, F.M. 1993. Changes in

physico-chemical properties of maize during natural fermentation of mawe. J Cereal Sci

17, 291–300.

125. Hsieh, Y.H. P., Pao, S., Li, J., 2008. Traditional Chinese fermented foods. In: Farnworth ER,

editor. Handbook of fermented functional foods, 2nd ed. Boca Raton: CRC Press. p 433-

73.

126. Huber, R., Sacher, M., Vollmann, A., Huber, H., Rose, D. 2000. Respiration of arsenate and

selenate by hyperthermophilic archaea. Syst Appl Microbiol 23(3), 305-314.

- 190 -

127. Hughes, J.B., Hellmann, J.J., Ricketts, T.H., Bohannan, B.J.M. 2001. Counting the

Uncountable: Statistical Approaches to Estimating Microbial Diversity. App Environ

Microbiol 67(10), 4399-4406.

128. Huse. S., M., Welch D.M.M., Morrison, H., G., Sogin, M.L. 2010. Ironing out the wrinkles in the

rare biosphere through improved otu clustering. Environ microbiol 12(7), 1889–1898.

129. Ibiso, O. 1980. A black rot of date fruit, a new post-harvesting decay caused by

Botryodiplodiatheobromae. Date palm.

130. Ibrahim, S., Rahma, M.A. 2009. Isolation and identification of fungi associated with date palm

fruits (Phoenix dactylifera) sold at Bayaro University Bayero, J Pure Appl Sci 2, 30-127.

131. Ilbert H. et al. 2005. Produits du terroir méditerranéen: Conditions d‘émergence, d‘efficacité et

modes de gouvernance (PTM: CEE et MG) .Rapport final juin 2005

132. Irlinger, F., 2008. Safety assessment of dairy micoorganisms: Coagulase negative Staphylococci.

International Journal of Food Microbiology 126, 302-310.

133. Iwuoha, C.I., Eke, O.S. 1996. Nigerian indigenous fermented foods, their traditional process

operation, inherent problems, improvements and current status. Food Res. Int.,

134. Jany, J.L., Barbier, G. 2008.Culture-independent methods for identifying microbial communities in

cheese. Food Microbiol 25, 839-848.

135. Jara C, Mateo E, Guillamón J.M, Torija M.J, Mas A (2008) Analysis of several methods for the

extraction of high quality DNA from acetic acid bacteria in wine and vinegar for

characterization by PCR–based methods. Int J Food Microbiol 128, 336–341

136. Jaradat, A.A. A. Zaid. 2004. Quality traits of date palm fruits in a center of origin and center of

diversity. Food Agr Environ 2, 208–217.

137. Jashbhai, B. Prajapati, Baboo, M. N. 2008. The History of Fermented Foods. In ‗Handbook of

Fermented Functional Foods‗, (ed. Edward R. Farnworth,), 2nd Ed.CRC Press, Boca

Raton London New York Washington, D.C. pp1-21.

138. Jemni, M., Oton, M., Ramirez, J. G., Art e-ern andez, F., Chaira, N., Ferchichi, A. 2014.

Conventional and emergent sanitizers decreased Ectomyelois ceratoniae infestation and

maintained quality of date palm after shelf-life. Post Biol Technol 87, 33-41.

139. Jeyaram, K., Mohendro, W., Singh, T., Premarani, A., Ranjita Devi, K., Selina Chanu, N.,

Talukdar, C., Rohinikumar Singh, M., 2008a. Molecular identification of dominant

microflora associated with Hawaijar: A traditional fermented soybean food of Manipur,

India. International Journal of Food Microbiology 122, 259–268.

140. Jeyaram, K., Romi, W., Singh, T.A., Devi, A.R., Devi, S.S. 2010. Bacterial species associated with

traditional starter cultures used for fermented bamboo shoot production in Manipur

state of India. Int J Food Microbiol 143, 1-8.

141. Jolly, N., Augustyn, O., Pretorius, I., 2006. The role and use of non-Saccharomyces yeasts

inwineproduction. South African Journal of Enology and Viticulture 27,15-39.

142. Joseph, S.J., Hugenholtz, P., Sangwan, P., Osborne, C.A. Janssen, P.H. 2003. Laboratory

cultivation of widespread and previously uncultured soil bacteria. Appl Environ

Microbiol 69, 7210-7215.

143. Joshi, V.K. and S. Sharma. 2010. Cider Vinegar: Microbiology, technology and quality. pp. 197–

207. In Solieri, L. and P. Gludiet (eds.). Vinegars of the World, Springer-Verlag, Italy

144. Joshi, V.K., Parmar, M., Rana, N. 2006. Pectin esterase production from apple pomace in solid

state and submerged fermentations. Food Technol Biotechnol 44(2), 253-256.

145. Jung, J., Choi, S., Jeon, C.O., and Park, W. 2013. Pyrosequencing-based analysis of the bacterial

community in Korean traditional seafood, ojingeo jeotgal. J Microbiol Biotechnol 23,

1428–1433.

- 191 -

146. Justé, A., Lievens, B., Frans, I., Klingeberg, M., Michiels, C.W., Willems, K.A., 2008. Present

knowledge of the bacterial microflora in the extreme environment of sugar thick juice.

Food Microbiology 25, 831–836.

147. Kacem, C., Meraihi, Z., Destain, J., Thonart, P. 2005. Study of catalase production by an

Aspergillus phoenicis mutant strain in date flour extract submerged cultures. Biotechnol

Agr Soc Environ 9 (3), 173-178

148. Kchaou, W., Abbès, F., Blecker, C., Attia, H., Besbes, S., 2013. Effects of extraction solvents

on phenolic contents and antioxidant activities of Tunisian date varieties (Phoenix

dactylifera L.). Industrial Crops and Products 45, 262-269.

149. Kingamkono, R., Sjogren, E., Svanberg, U., Kaijser, B. 1994. pH and acidity in lactic fermenting

cereal gruels: effects on viability of enteropathogenic micro organisms. W J. Microbiol

Biotechnol 10, 664-669.

150. Kloos, W. E., Schleifer, K.H., 1975b. Isolation and characterization of staphylococci from human

skin. II: Description of four new species: Staphylococcus warneri, Staphylococccus

capitis, Staphylococcus hominis, and Staphylococcus simulans. International Journal of

Systetatic Bacteriology 25, 62-79.

151. Kpikpi, E.N., Glover, R., Dzogbefia, V., Nielsen, D.S., Jakobsen, M. 2010. Isolation of lactic acid

bacteria from Kantong a condiment produced from the fermentation of kapok (Ceiba

pentandra) seeds and cassava (Manihot esculentum)flour. Rep Opin 2, 1-7.

152. Kuhnlein, H.V., Erasmus, B., Spigelski, D. (2009) Indigenous peoples‘ Food Systems: the Many

Dimensions of Culture, Diversity and Environment for Nutrition and Health. United

Nations Food and Agriculture Organization, Rome.

153. Leadbetter, J.R. 2003. Cultivation of recalcitrant microbes: cells are alive, well and revealing their

secrets in the 21st century laboratory. Curr Opin Microbiol 6, 274-281.

154. Leandro, M.J, Cabral, S., Prista, C., Loureiro-Dias, M.C., Sychrová., H. 2014. The High Capacity

Specific Fructose Facilitator ZrFfz1 is Essential for the Fructophilic Behavior of

Zygosaccharomyces rouxii CBS 732T. Eukaryotic Cell November 13 (11), 1371-1379.

155. Leandro, M.J., Sychrová, H., Prista, C., Loureiro-Dias, M.C., 2013. ZrFsy1, a High-Affinity

Fructose/H+ Symporter from Fructophilic Yeast Zygosaccharomyces rouxii. PLoS ONE

8(7): e68165. doi:10.1371/journal.pone.0068165.

156. Lei, V., Friis, H., Michaelsen, K.F. 2006. Spontaneously fermented millet product as a natural

probiotic treatment for diarrhoea in young children: an intervention study in Northern

Ghana. Int J Food Microbiol 110, 246-253.

157. Line, T., Paulin, A., Bjarne, M.H., Rønsbo, M.H., Nielsen, K.F., Joseph, H.D., Mogens, J. 2011.

Formation of cereulide and enterotoxins by Bacillus cereus in fermented African locust

beans Full length paper. Food Microbiol 28, 1441-1447.

158. Liu, W.T., Marsh, T.L., Cheng, H., Forney, L.J. 1997. Characterisation of microbial diversity by

determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S

rRNA. App Environ Microbiol 63, 4516-4522.

159. Łukaszuk C., Krajewska-Kułak E., Niczyporuk W., Theodosopoulou E., Hatzopulu A., Krawczuk-

Rybak M., Wojtukiewicz M., 2005. Variations of enzymatic activity and biotypes of the

yeast like fungi strains isolated from cancer patients. Annales Academiae Medicae

Bialostoc 50 (supl), 16-19

160. Mahma, S.A. 2013. Effet de quelques bio-agresseurs du dattier et impact des méthodes de lutte sur

la qualité de datte. -Cas de la région de Ghardaïa. mémoire de magistère. Université

d‘Ouargla. Algérie.

- 192 -

161. Mamlouk D, Hidalgo C, Torija MJ, Gullo M 2011. Evaluation and optimisation of bacterial

genomic DNA extraction for no–culture techniques applied to vinegars. Food

Microbiol 28:1374–1379

162. Martorell, P., Stratford, M., Steels, H., Fernández-Espinar, M.T., Querol, A. 2007. Physiological

characterization of spoilage strains of Zygosaccharomyces bailii and Zygosaccharomyces

rouxii isolated from high sugar environments. Int J Food Microbiol 114, 234-242.

163. Masset, J., Hiligsmann, S., Hamilton, C., Beckers, L., Franck, F. Thonart, P., 2010. Effect of pH on

glucose and starch fermentation in batch and sequenced-batch mode with a recently

isolated strain of hydrogen-producing Clostridium butyricum CWBI1009. International

Journal of Hydrogen Energy 35, 3371-3378.

164. Michiels A, Van den EW, Tucker M, Van Riet L, Van Laere A (2003) Extraction of highquality

genomic DNA from latex–containing plants. Anal Biochem 315: 85–89

165. Michiels A, Van den EW, Tucker M, Van Riet L, Van Laere A (2003) Extraction of highquality

genomic DNA from latex–containing plants. Anal Biochem 315: 85–89

166. Miriam, O., Iurlina, R.F., 2005. Characterization of microorganisms in Argentinean honeys from

different sources. International Journal of Food Microbiology 105, 297-304.

167. Mogensen, G., Salminen, S., O'Brien, J., Ouwehand, A., Holzapfel, W., Shortt, C., Fonden, R.,

Miller, G.D., Donohue, D., Playne, M., Crittenden, R., Salvadori, B., Zink, R., 2002b.

Inventory of microorganisms with a documented history of use in food. Bulletin of IDF

377, 10-19.

168. Moore, J.E., Cherie, M., Xu, B., El Shilbly, S. 2002. Edible dates (Phoenix dactylifera L.), a

potential source of Cladosporium cladosporioides and Sporobolomyces roseus:

implication for public health. Mycopathologica 54, 25-28

169. Mossell, D.A.A., 1975. Water and micro-organisms in foods, a synthesis. In R. B. Duckworth

(ed.) "Water Relations of Foods", Academic Press, London.

170. Moyo M, Amoo S O, Bairu M W, Finnie J F, Van Staden J 2008. Optimising DNA isolation for

medicinal plants. S Afr J Bot 74:771–775

171. Mrabet, A., Rejili, M., Lachiheb, B., Toivonen, P., Chaira, N., Ferchichi, A. 2008.

Microbiological and chemical characterisations of organic and conventional date

pastes (Phoenix dactylifera L.) from Tunisia. Ann Microbiol 58 (3), 453-459.

172. Mrak, E.M., Phaff, H.J., Vaughn, R.H., 1942. Yeasts Occurring on Dates. Journal of Bacteriology

43 (6), 689-700.

173. Mukisa IM, Porcellato D, Byaruhanga YB, Muyanja CM, Rudi K, Langsrud T, Narvhus JA 2012.

The dominant microbial community associated with fermentation of Obushera (sorghum

and millet beverages) determined by culture–dependent and culture–independent

methods. Int J Food Microbiol 160:1–10

174. Mukisa, I.M., Muyanja, C.M.B.K., Byaruhanga, Y.B., Schüller, R.B., Langsrud, T., Narvhus,J.A.,

2012. Gamma irradiation of sorghum flour: effects on microbial inactivation, amylase

activity, fermentability, viscosity and starch granule structure. Radiation Physics and

Chemistry 81, 345-351.

175. Munier, P. 1973. Le palmier dattier. Paris: Maisson neuve et Larose. pp 141–221.

176. Muyzer, G., De Waal, E.C., Uitterlinden, A.G. 1993. Profiling of complex microbial populations

by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-

amplified genes coding for 16S rRNA. App Environ Microbiol 59(3), 695-700.

177. Muyzer, G., Smalla, K. 1998. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and

temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Ant Van

Leeu 73(1), 127-141.

- 193 -

178. Nam YD, Yi SH, Lim SI 2012. Bacterial diversity of cheonggukjang, a traditional Korean

fermented food, analyzed by barcoded pyrosequencing. Food Control 28:135–142

179. Naser, S.M., Thompson, F.L., Hoste, B., Gevers, D., Dawyndt, P., Vancanneyt, M. Swings, J.,

2005. Application of multilocus sequence analysis (MLSA) for rapid identification of

Enterococcus species based on rpoA and pheS genes. Microbiology 151, 2141-2150

180. Nataraj, A.J., Olivos-Glander, I., Kusukawa, N., Highsmith, W.E., J.R. 1999. Single-strand

conformation polymorphism and heteroduplex analysis for gel-based mutation

detection. Electrophoresis 20, 1177-1185.

181. Newcombe, R.G. 1998. Two-sided confidence intervals for the single proportion: comparison of

seven methods. Stat Med 17, 857–872.

182. Nguyen, H., Elegado, F., Librojo-Basilio, N., Mabesa, R., Dizon, E. 2010. Isolation and

characterisation of selected lactic acid bacteria for improved processing of Nem chua, a

traditional fermented meat from Vietnam. Beneficial Microbes1, 67–74.

183. Northolt, M.D., Frisvad, J.C., Samson, R.A., 1995. Occurrence of food-borne fungi and factors for

growth. In: Samson, R.A., Hoekstra, E.S., Frisvad, J.C., Filtenborg, O. (Eds.),

Introduction to food-borne fungi. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, 322 pp

184. Nout, M.J.R., Tuncel, G., Brimer, L. 1995. Microbial degradation of amygdalin of bitter apricot

seeds (Prunus armeniaca). Int J Food Microbiol 24, 407-412.

185. Nyanga, L.K., Nout, M.J., Smid, E.J., Boekhout, T., Zwietering, M.H., 2013. Fermentation

characteristics of yeasts isolated from traditionally fermented masau (Ziziphus

mauritiana) fruits. International Journal of Food Microbiology 166, 426-432.

186. Nyanga, L.K., Nout, M.J.R., Gadaga, T.H., Theelen, B., Boekhout, T., Zwietering, M.H. 2007.

Yeasts and lactic acid bacteria microbiota from masau (Ziziphus mauritiana) fruits and

their fermented fruit pulp in Zimbabwe. Int J Food Microbiol 120, 159-166.

187. Obadina, A.O., Oyewole, O.B. and Odusami, A.O. 2009. Microbiological safety and quality

assessment of some fermented cassava products lafun, fufu, gari. Scientific Research and

Essays 4(5), 432-435.

188. Oguntoyinbo F.A., Narbad, A.,2012. Molecular characterization of lactic acid bacteria and in situ

amylase expression during traditional fermentation of cereal foods. Food Microbiology

31, 254–262.

189. Oguntoyinbo, F.A., Sanni, A.I., Franz, C.M.A.P., Holzapfel, W.H., 2007. Phenotypic diversity and

technological properties of Bacillus subtilis species isolated from Okpehe, a traditional

fermented condiment. World Journal of Microbiology and Biotechnology 23, 401-410.

190. Oguntoyinbo, F.A., Tourlomousis, P., Gasson, M., Narbad, A. 2011. Analysis of bacterial

communities of traditional fermented West African cereal foods using culture

independent methods. Int J Food Microbiol 145, 205-210.

191. Ongol, M.P., Asano, K. 2009.Main microorganisms involved in the fermentation of Ugandan ghee.

Int J Food Microbiol 133, 286–291.

192. Ould El Hadj M. D., Sebihi, A.H., Siboukeur, O., 2001. Qualité hygiénique et caractéristiques

physico-chimiques du vinaigre traditionnel de quelques variétés de dattes de la cuvette de

Ouargla. Revue des Energie Renouvelables, Production et valorisation-biomasse (NS),

87-92.

193. Padonou, S.W., Hounhouigan, J.D.and Nago, M. C. (2009 Physical, chemical and microbiological

characteristics of lafun produced in Benin. African Journal of Biotechnology 8(14): 3320-

3325.

194. Palmeri, R., Spagna, G., 2007. β-Glucosidase in cellular and acellular form for winemaking

application. Enzyme and Microbial Technology 40(3), 382-389.

- 194 -

195. Panagou, E.Z., Nychas, G. J.E., Sofos, J.N. 2013. Types of traditional Greek foods and their

safety. Food Control 29, 32-41.

196. Papalexandratou, Z., Lefeber, Z., Bahrim, B., Lee, O., Daniel, M., De Vuyst, L. 2013.

Hanseniaspora opuntiae, Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus fermentum, and

Acetobacter pasteurianus predominate during well-performed Malaysian cocoa bean box

fermentations, underlining the importance of these microbial species for a successful

cocoa bean fermentation process. Food Microbiol 35, 73-85

197. Park, E.J., Chun, J., Cha, C.J., Park,W.S., Jeon, C.O., Bae, J.W., 2012. Bacterial community

analysis during fermentation of ten representative kinds of kimchi with barcoded

pyrosequencing. Food Microbiology 30, 197-204.

198. Parkouda, C., Thorsen, L., Compaoré, C.S., Nielsen, D.S., Tano-Debrah, K., Jensen, J.S., Diawara,

B., Jakobsen, M., 2010. Microorganisms associated with Maari, a Baobab seed

fermented product. International Journal of Food Microbiology 142, 292-30.

199. Parks, D.H., Beiko, R.G. 2010. Identifying biologically relevant differences between metagenomic

communities. Bioinformatics 26, 715–721.

200. Pelczar, M.J., Chan, E.C.S., Krieg, N.R. 1993. Prologue: discovering the microbial world. In

Prancan, K.M. and Gordon, H. (eds), Microbiology: concepts and applications. McGraw-

Hill, New-York, 2-20

201. Pernthaler, A., Pernthaler, J., Amann, R.I. 2002a. Fluorescence in situ hybridization and catalyzed

reporter deposition for the identification of marine bacteria. Appl Environ Microbiol 68,

3094–3101

202. Pinto AD, Forte V, Guastadisegni MC, Martino C, Schena FP, Tantillo G 2007. A comparison of

DNA extraction methods for food analysis. Food Control 18:76–80

203. Pirone, G., Manganelli, E., Diaferia, C., 1990. Caratterizzazione di batteri lattici isolati da salami

tipo Napoli. Industria Conserve 65, 33-35.

204. Postollec, F., Bonilla, S., Baron, F., Jan, S., Gautier, M., Mathot, A.G., et al., 2010. A

multiparametric PCR-based tool for fast detection and identification of sporeforming

bacteria in food. International Journal of Food Microbiology 2010, 18

205. Prajapati, J.B., Nair, B.M., 2003. The history of fermented foods. In: Farnworth, E.R. (Ed.),

Fermented Functional Foods. CRC Press, Boca Raton, New York, London, Washington

DC, pp. 1–25.

206. Probeski, S., Bailey, L.G., Baum, B.R., 1997. Modification of a CTAB DNA extraction protocol

for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Molecular

Biology 15, 8-15.

207. Pruesse, E., Quast, C., Knittel, K., Fuchs, B.M., Ludwig, W., et al., 2007. SILVA: A

comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence

data compatible with ARB. Nucleic Acids Research 35, 7188-7196.

208. Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T.P, 2009. Accurate determination of microbial diversity from 454

pyrosequencing data. Nature Methods 6, 639-641.

209. Ragab, W.S., Ramadan, B.R., Abdel-Sater, M.A., 2001. Mycoflora and aflatoxins associated with

saidy date as affected by technological processes. III International Date Palm Conference,

UAE University, Abu Dhabi, AUE, 19-21: 409-421.

210. Ramesh, C., Montet, D. 2014. Microorganisms and Fermentation of Traditional Foods CRC Press.

New York.

211. Randazzo, C. L., Torriani, S., Akkermans, A. D. L., de Vos, W. M. Vaughan, E. E. 2002. Diversity,

dynamics, and activity of bacterial communities during production of an artisanal sicilian

cheese as evaluated by 16S rRNA analysis. App Environ Microbiol 68, 1882-1892.

- 195 -

212. Ranjard, L., Richaume, A. 2001. Quantitativeand qualitative microscale distribution of bacteria in

soil. Res Microbiol 152, 707-716.

213. Ray, R.C., Panda, S.H., 2007. Lactic acid fermented fruits and vegetables: an overview. pp. 155-

188. In: M.V. Palino (ed.). Food Microbiology Research Trends. Nova Science Publishers

Inc., Hauppauge, New York, USA.

214. Ripka, K., Denner, E.B.M., Michaelsen, A., Lubitz, W., Piñar, G. 2005. Molecular

characterisation of Halobacilluspopulations isolated from different medieval wall

paintings and building materials. Submitted July 2005 to Int.Biodet.Biodeg.

215. Ripoll, J., Bon, M.C., Jones, W. 2011. Optimalisation de l‘extraction d‘ADN génomique de la

morelle jaune (Solanum elaeagnifolium Cav.), une plante invasive des milieux cultivés en

région méditerranéenne. Biotechnol Agron Soc Environ 15(1), 95-100.

216. Risiquat, R.O. 2013. Microbiological assessment of date fruits purchased from Owode market, in

Offa Kwara state, Nigeria. J Environ Sci Toxicol Food Technol 4 (3), 23-26.

217. Rivals, I., Personnaz, L., Taing, L., Potier, M.C. 2007. Enrichment or depletion of a GO category

within a class of genes: which test? Bioinformatics 23, 401-407.

218. Robert, R., Le Marrec, C., Blanco, C., Jebbar, M., 2000. Glycine betaine, carnitine and choline

enhance salinity tolerance and prevent the accumulation of sodium to a level inhibiting

growth of Tetragenococcus halophila. Applied and Environmental Microbiology 66, 509-

517.

219. Romo-Sánchez, S., Alves-Baffi, M., Arévalo-Villena, M., Úbeda-Iranzo, J., Briones-Pérez, A.,

2010. Yeast biodiversity from oleic ecosystems: Study of their biotechnological

properties. Food Microbiology 27, 487-492.

220. Ronaghi, M., Uhlén, M., Nyrén, P. 1998. A sequencing method based on real-time pyrophosphate.

Science 281, 363-365.

221. Ross, R. P., Morgan, S. Hill, C. 2002. Preservation and fermentation: past, present and future.

Int J Food Microbiol 79 (1-2), 3-16.

222. Rygg, G.L. 1956. Effect temperature and moisture content on the rate of deterioration in Deglet

Noor dates. Date Grower Inst 33, 8-11.

223. Salik, H., Rosen, B., Kipelman, I.J. 1979. Role of Microbes in degradation of soft dates. Food Sci

Technol 12(2), 85-87.

224. Sallal, A.K., Mohsen, J. S., Al-Mahmoud, W. Khamas, A., Randa A. A.S.. 1998. Comparative

study of wound healing after treatment with crude date extract and silver sulphadiazine.

Int Ara J antimicrob Age 3, 1-5.

225. Sallal, A-K., Ashkenani, A. 1989. Effect of date extract on growth and spore germination of

Bacillus subtilis. Microbios 59, 203-210.

226. Samelis, J., Metaxopoulos, J., Vlassi, M., Pappa, A., 1998. Stability and safety of traditional Greek

salami Ð a microbiological ecology study. International Journal of Food Microbiology

44, 69-82.

227. Sánchez-Hernández, C., Gaytán-Oyarzún, J.C., 2006. Two mini–preparation protocols to DNA

extraction from plants with high polysaccharide and secondary metabolites. African

Journal of Biotechnology 5(20), 1864–1867.

228. Savelkoul P.H.M., Aarts, H.J.M., De Haas, J., Dijkshoorn, L., Duim, B., Otsen, M.,

Rademaker J.L.W., Schouls, L., Lenstra, J.A. 1999. Amplified-fragment length

polymorphism analysis: the state of an art. J Clin Microbiol 37, 3083-3091.

229. Schloss, P.D., Handelsman, J., 2005. Introducing DOTUR, a computer program for defining

operational taxonomic units and estimating species richness. Appl Environ Microbiol 71,

1501–1506

- 196 -

230. Schloss, P.D., S.L. Westcott, T. Ryabin, J.R. Hall, M. Hartmann, E.B. Hollister, R.A. Lesniewski,

B.B. Oakley, D.H. Parks, C.J. Robinson, J.W. Sahl, B. Stres, G.G. Thallinger, D.J. Van

Horn and C.F. Weber, 2009. Introducing mothur: Open-Source, Platform-Independent,

Community-Supported Software for Describing and Comparing Microbial

Communities. Applied and Environmental Microbiology 75(23), 7537-7541.

231. Schoustra, S.E., Kasase, C., Toarta, C., Kassen, R., Poulain, A.J., 2013. Microbial Community

Structure of Three Traditional Zambian Fermented Products: Mabisi, Chibwantu and

Munkoyo. PLoS ONE 8(5): e63948. doi:10.1371/journal.pone.0063948.

232. Settanni, L., Corsetti A., 2008. Application of bacteriocins in vegetable food biopreservation. Int.

Journal of Food Microbiology 121, 123–138.

233. Shannon, C.E., Weaver, W., 1963. The mathematical theory of communication. University of

Illinois, Urbana.

234. Sharma KK, Sharma S, Karp M, Kuhad RC 2012. Ligninolytic enzymes improve soil DNA purity:

Solution to methodological challenges of soil metagenomics. J Mol Catal B: Enzym

83:73–79

235. Shenasi, M., Aidoo, K.E., Candlish, AA., 2002. Microflora of date fruits and production of

aflatoxins at various stages of maturation.Int J Food Microbiol 15,79(1-2), 113-9.

236. Shraideh, Z., Abu-Elteen, K., Sallal, A.K. 1998. Ultrastructural effects of date extract on Candida

albicans. Mycopathologia 142(3), 119-123.

237. Simango, C. 1997. Potential use of traditional fermented foods for weaning in Zimbabwe. J Soc Sci

Med 44, 1065–1068.

238. Simon, O., Verdauung und Resorption. In: Jeroch H, Drochner W, Simon O, eds. Ernährung

landwirtschaftlicher Nutztiere. 2nd ed. Stuttgart: Eugen Ulmer; 2008:109-133 (in

German).

239. Sohrabvandi, S., Razavi, S.H., Mousavi, Mortazavian, S.M., Rezaei, A.M., (2009c). Application of

Saccharomyces rouxii for the production of non-alcoholic beer. Food Science and

Biotechnology 18, 1-6.

240. Sohrabvandi, S., Razavi, S.H., Mousavi, Mortazavian, S.M., Rezaei, A.M., (2009c). Application of

Saccharomyces rouxii for the production of non-alcoholic beer. Food Science and

Biotechnology 18, 1-6.

241. Staley, J. T. Konopka, A. 1985. Measurements of in situ activities of nonphotosynthetic

microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu Rev Microbiol 39, 321-346.

242. Stankiewicz, M., Gadamski, G., Gawronski, S.W. 2000. Genetic variation and phylogenetic

relationships of triazine-resistant and triazine susceptible biotypes of Solanum nigrum –

analysis using RAPD markers. Weed Res 41, 287-300.

243. Steinkraus, K.H. 1997. Classification of fermented foods: worldwide review of house hold

fermentation techniques. Food Control 8, 311–317.

244. Stevenson, B. S., Eichorst, S. A., Wertz, J. T., Schmidt, T. M. Breznak, J. A. 2004. New strategies

for cultivation and detectionofpreviously uncultured microbes. Appl. Environ. Microbiol

70(8), 4748-4755.

245. Taha, M. P. M., Drew, G. H., Vestlund, A. T., Aldred, D., Longhurst, P. J., Pollard, S. J. T. 2007b.

Enumerating actinomycetes in compost bioaerosols at source—Use of soil compost agar

to address plate ‗masking‘. Atm environ 41, 4759-4765.

246. Tantaoui, A., Boisson, C. 1991. Compatibilite végétative d'isolats du Fusarium oxysporum F. sp.

albedinis et des Fusarium oxysporum de larhizosphère du Palmier dattier et des sols de

palmeraies. Phytopath. medit 30, 155-163.

247. Taouda H., Errachidi, F., Aarab, L., Chabir R. 2013. Microbiological Quality of Dates in the North

Center Region of Morocco. J Life Sci 7 (12), 1278-1283.

- 197 -

248. Tel-Zur, N., Abbo, S., Myslabodski, D., Mizrahi, Y. 1999. Modified CTAB procedure for

DNA isolation from epiphytic cacti of the Genera Hylocereus and Selenicereus

(Cactaceae). Plant Mol Biol. Rep 17, 249-254.

249. Terzieva, S., Donnelly, J., Ulevicius, V., Grinshpun, S.A., Willeke, K., Stelma, G.N., Brenner,

K.P, 1996. Comparison of methods for detection and enumeration of airborne

microorganisms collected by liquid impingement. App Environ Microbiol 62(7), 2264-

2272.

250. Thakuria, D., Schmidt, O., Mac Siúrtáin, M., Egan, D., Doohan, F.M., 2008. Importance of DNA

quality in comparative soil microbial community structure analyses. Soil Biology and

Biochemistry 40, 1390–1403.

251. Thorsen, L., Abdelgadir, W.S., Rønsbo, M.H., Abban, S., Hamad, S.H., Nielsen, D.S., Jakobsen,

M., 2011. Identification and safety evaluation ofBacillus species occurring in high

numbers during spontaneous fermentations to produce Gergoush, a traditional Sudanese

bread snack. International Journal of Food Microbiology 146(3), 244–252.

252. Tokuoka, K., 1993. Sugar and salt-tolerant yeasts. Journal of Applied Bacteriology 74, 101-110.

253. Tou, E.H., Mouquet-Rivier, C., Picq, C., Traore, A.S., Treche, S., Guyot, J.P. 2007. Improving the

nutritional quality of ben-saalga, a traditional fermented milletbased gruel, by co-

fermenting millet with groundnut and modifying the processing method. LWT Food Sci

Technol 40, 1561–1569.

254. TRUEFOOD Traditional United Europe Food (2009).Guideline on effective knowledge and

technology transfer activities to SMEs in the food sector with particular focus on

traditional food manufacturers. Campden BRI, et al., TRUEFOOD.

http://www.truefood.eu.

255. UNIDO, 2010. Adding value to traditional products of regional origin- A guide to creating a

quality consortium", Vienna.

256. Van Boekel, M., Fogliano, V., Pellegrini, N., et al. 2010 . A review on the beneficial aspects of

food processing. Mol Nutr Food Res 54, 1215-47.

257. Van Burik, J.-A.H., Schreckhise, R.W., White, T.C., Bowden, R.A., Myerson, D. 1998.

Comparison of six extraction techniques for isolation of DNA fromfilamentous fungi.

Medical Mycol 36, 299-303.

258. Vanhonacker, F., Pieniak, Z., Verbeke, W., 2013. ―European consumer perceptions and barriers for

fresh, frozen, preserved and ready-meal fish products‖, British Food Journal 115 (4), 508-

525.

259. Varma, A., Padh, H., Shrivastava, N. 2007. Plant genomic DNA isolation: An art or a

science. Biotechnol 2, 386-392.

260. Vayalil, P.K., 2012. Date fruits (Phoenix dactylifera Linn): an emerging medicinal food. Critical

Reviews in Food Science and Nutrition, 52: 249-271.

261. Vera, J., Castro, J., Contreras, R., González, A., Moenne, A., 2012. Oligo-carrageenans induce a

long-term and broad-range protection against pathogens in tobacco plants (var. Xanthi).

Physiology Molecular Plant Pathology 79, 31–39.

262. Viana, F., Gil, J., Genovés, S., Vallés, S., Manzanares, P., 2008. Rational selection of non-

Saccharomyces yeasts for mixed starters based on ester formation and enological traits.

Food Microbiology 25, 778-785.

263. Vilhelmson, O., Miller, K., 2002. Humectant Permeability Influences Growth and Compatible

Solute Uptake by Staphylococcis aureus Subjected to Osmotic Stress. Journal Food

Protection 65(6), 1008–15.

264. Volant. A. 2012. Étude des communautés microbiennes (bactéries, archaea et eucaryotes) et de

leurs variations spatiotemporelles dans la mine de Carnoulès fortement contaminée en

- 198 -

arsenic. Thèse de doctorat, Sciences et techniques du languedoc. Université Montpellier

II.

265. Wang, L., Stegemann, J.P., 2010. Extraction of high quality RNA from polysaccharide matrices

using cetyltrimethylammonium bromide. Biomaterials 31, 16121618.

266. Wawron, W., M, Bochniarz., Szczubial, M., 2011. Enzymatic activity of yeasts isolated from the

inflamed mammary secretion in dairy cows.

Polish Journal of Veterinary Science 14, 65-68.

267. Weisburg, W.G., Barns, S.M., Pelletier, D.A., Lane, DJ 1991. 16S ribosomal DNA amplification

for phylogenetic study. J Bacteriol 173, 697-703.

268. Williams, J.P., Hallsworth, J.E., 2009. Limits of life in hostile environments: no barriers to

biosphere function?. Environmental Microbiology 11, 3292-3308.

269. Wrigley, G. 1995. Date palm, p. 399–403. In: J. Smartt and N.W. Simmonds (eds.). Evolution of

crop plants. 2nd ed. Longman Group, Essex, UK.

270. Wu, L., X. Liu., Schadt, C. W., Zhou J. 2006. Microarray-based analysis of subnanogramquantities

of microbial community DNAs by using whole-community genome amplification. Appl

Environ Microbiol 72, 4931-4941.

271. Yang, Z.H., Xiao, Y., Zeng, G.M., Xu, Z.Y., Liu, Y.S., 2007. Comparison of methods for total

community DNA extraction and purification from compost. Applied Microbiology and

Biotechnology 74, 918–925.

272. Yoon, J.H., Kang, S.S., Lee, K.C., Kho, Y.H., Kang, K.H. Park,Y.H., 2001. Planomicrobium

koreensegen. nov., sp. nov., a bacterium isolated from the Korean traditional fermented

seafood Jeotgal, and transfer of Planococcus okeanokoites (Nakagawa et al. 1996) and

Planococcus mcmeekinii (Junge et al. 1998) to the genus Planomicrobium. International

Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51, 1511–1520.

273. Zaid, A., P.F. de Wet, M. Djerbi, and A. Oihabi. 2002. Diseases and pests of date palm, p. 227–

281. In: A. Zaid (ed.). Date palm cultivation. Food and Agriculture Organization Plant

Production and Protection Paper no. 156. Food and Agriculture Organization of the

United Nations, Rome, Italy.

274. Zengler, K., Toledo, G., Rappe, M., Elkins, J., Mathur, E.J., Short,J.M. and Keller, M. 2002.

Cultivating the uncultured, Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, 99, 15681-15686.

275. Zinger L. 2009 . Variations spatio-temporelles de la microflore des sols alpins. These de doctorat.

Universite Joseph Fourier – Grenoble I.

- 199 -

ANNEXES

- 200 -

1- Composition des milieux de culture (pour 1 litre)

Milieu PCA (plate count Agar):

Tryptone 5,0 g

Extrait autolytique de levure 2,5 g

Glucose 1,0 g

Agar agar bactériologique 12,0 g

pH du milieu prêt-à-l‘emploi à 25°C : 7,0 ± 0,2

Milieu YGC (yeast glucose chlorampenicol)

Extrait de levure 5.0g

D(+)-Glucose 20.0g

Chloramphenicol 0.1 g

Agar 14.9 g

pH final à 25°C 6.6 +/- 0.2

Milieu MRS

Polypeptone 10,00 g

Extrait de viande 10,00 g

Extrait de levure 5,00 g

Glucose 20,00 g

Tween 80 1,08 g

Phosphate dipotassique 2,00 g

Acétate de sodium 5,00 g

Citrate d‘ammonium 2,00 g

Sulfate de magnésium 0,20 g

Sulfate de manganèse 0,05 g

Agar agar 15,00 g

pH du milieu prêt-à-l‘emploi à 25°C 5,7 ± 0,1

Composition du milieu BHI :

Infusion de cervelle de veau 12,5 g

Infusion de cœur de bœuf 5g

Peptone 10g

Glucose 2g

Chlorure de sodium 5g

Phosphate disodique 2,5g

pH du milieu prêt-à-l‘emploi à 25°C 7,1 ± 0,1

- 201 -

2- Protocole de purification d’ADN par le kit

- 202 -

3- Électrophorèse

Composition de tampon TAE 10x

TRIS base……………….. 0,4 M Microfiltré.

Acide acétique……….….. 0,2 M

EDTA …………………….0,01 M

pH (25 °C) ………………..8,3 ± 0,1.

Le volume souhaité est dilué 10x pour en faire usage.

- Procédure d’électrophorèse

- Diluez le tampon TAE 10x afin de préparer la quantité adéquate de tampon

- -Pesez l‘agarose en poudre (0.8g) puis ajoutez-y un volume adéquate de tampon TAE 1x ( 100

ml)dans un Erlenmeyer .

- Chauffez la masse dans un four à micro-ondes ou dans un bain-marie jusqu‘à

dissolution de l‘agarose

- Laissez refroidir le mélange jusqu‘à une température de 50-60 °C et y ajouté du colorant

fluoresçant (Gel green ™) à raison de 2µl/100ml du gel et mélanger

- Positionnez le peigne adéquat de façon à former des puits puis transvasé le volume du gel dans

un cuve d‘électrophorèse adéquat.

- Lorsque le gel est complètement figé, retirez soigneusement le peigne et placez le gel dans un

réservoir d‘électrophorèse.

- recouvrir le gel avec le tampon TAE.

- Sur une adhésive collé à la paillasse du travail pipeter 2 µl de tampon de chargement au nombre

des échantillons à analyser, puis de 5 à 8 µl de l‘échantillon.

- Bien mélangé par pipetage, puis charger le volume total dans les puits du gel.

- Charger le marqueur de taille d‘ADN adéquat le dernier puits.

- Fermez le couvercle du réservoir à gel et raccordez les fils électriques jusqu‘au

moment où l‘ADN migre vers l‘anode, puis appliquez la tension desirée.

- Faites migrer le gel puis coupez le courant, retirez les fils et ôtez le couvercle du réservoir à gel.

placé le gel dans le système d‘observation sous UV comme ; Gel Doc ™

EZ imager (Bio-Rad) et

voire le gel.

4- Amorces de PCR et de séquençage du gène ARN 16s :

16S-1500 F: 5‘-GAG-TTT-GAT-CMT-GGC-TCA-G-3‘ (Eurogentec, 3968107, Tm=60°C).

- 203 -

16S-1500 REV: 5‘-TAC-GGT-TAC-CTTGTTACGAC-3‘ (Eurogentec, 3968108 Tm=58 °C.)

5- Amorces de PCR et de séquençage du gène ARN 26S :

NL1 :(5‘-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3‘)

NL4 :(5‘-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3‘)

6- Les barcod (MIDs) utilisés pour le pyroséquençage de la communauté

bactérienne dans les échantillons de Btana

Les barcod (MIDs) utilisés pour le pyroséquençage de la

communauté fongique dans les échantillons de Btana

TCTCTATGCG BT1

AGACGCACTC BT2

ATATCGCGAG BT3

CGTGTCTCTA BT4

CTCGCGTGTC BT5

ACGCTCGACA BT6

CATAGTAGTG BT7

TGATACGTCT BT8

AGCACTGTAG BT9

ATCAGACACG BT10

ACGAGTGCGT BT11

7- Class distribution in the Btana samples as determined by metagenomic analysis

ATACGACG BT1

CTCGCGTG BT2

TGATA BT3

CATAGTAG BT4

CGAGAGAT BT5

CGTGTCTC BT6

CGTCTAGT BT7

TCACGTAC BT8

TAGTAT BT9

TCTCTA BT10

ATATCGCGA BT11

- 204 -

8- Family distribution in all Btana samples as determined by metagenomic analysis

9- Galerie API ZYM (Biomérieux)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

BT1 BT2 BT3 BT4 BT5 BT6 BT7 BT8 BT9 BT10 BT11

Zygomycetes

Ustilaginomycetes

Tremellomycetes

Sordariomycetes

Schizosaccharomycetes

Saccharomycetes

Lecanoromycetes

Incertae sedis

Leotiomycetes

Fungi_unclassified

Exobasidiomycetes

Eurotiomycetes

Dothideomycetes

Cystobasidiomycetes

Agaricomycetes

- 205 -

10- Utilisation d’éthanol

11- Utilisation de methanol

12- Aspect de développement des souches de levure sur milieu à base de datte

13- Aspect macroscopique et microscopique de quelques souches isolées de Btana

- 206 -

Staphylococcus warneri Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus capitis Staphylococcus pasteuri

Paenibacillus

xylanexedens

Enterococcus mundtii

Enterococcus lactis Enterococcus faecium

B. pumilus B. pumilus

Paenibacillus macerans Bacillus pumilus

- 207 -

Levures

Bacillus nelsonii/circulans

Bacillus cereus

Paenibacillus xylanexedens

Zygosaccharomyces rouxii Lachancea thermotolerans

Bacillus amyloliquefaciens

B. pumilus Bacillus endophyticus

Kluyveromyces delphensis

Pichia subpelliculosa Hanseniaspora opuntiae