zur chemie des ecdysons

JUSTUS LIEBIGS

1. 2. 3. 4. 5. 6. I . 8. 9.

10. 1 1 .

ANNALEN DER CHEMIE BAND 6 6 2

ZUR CHEMIE DES ECDYSONS von PETER KARLSON und HANS HOFFMEISTER *

gemeinsam mit WALTER HOPPE und ROBERT HUBER Herrn Professor A . Butenandt zum 60. Geburtstag

Aus dem Physiologisch-Chemischen Institut der Universitat Miinchen und der

Abteilung fur Rontgenstrukturforschung am Max-Planck-Institut fur EiweiD- und Lederforschung, Miinchen

Eingegangen am 30. Oktober 1962

Fur das Ecdyson, das Hautungshormon der Insekten, wurde eine verbesserte Isolierungsmethode ausgearbeitet. Rontgenmessungen an Ecdysonkristallen und massenspektroskopische Untersuchungen fiihren iibereinstimmend zu einem Molekulargewicht von 464 und damit zu der revidierten Sumrnen- forrnel C27H4406. Durch Messung der diffusen Kontgenstreuung und durch Dehydrierung zu Cyclopentenophenanthren-Derivaten wird bewiesen, daD das Edcyson zu den Steroiden gehort. Die Sauerstoffatome liegen in Form einer Oxogruppe und von fiinf Hydroxylgruppen vor. Die Position dieser Gruppen

wird diskutiert.

Inhalt - .-. Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Isdierung des Ecdysons aus Trockenpuppen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Eigenschaften und analytische Zusammensetzung . . . . . . Elementarzelle und Raumgruppe des kristallisierten Ecdysons MolekiilgroDe und Summenformel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Derivate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Molekiilform . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Spektroskopische Befunde . . . . . . . . . . . . . . Dehydrierung zu Phenanthrender . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Abbauversuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diskussion der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Beschreibung der Versuche . .

X I U

2 2 3 4 5 7 8

10 12 13 13 16

*) Teil der Dissertation H. HOFFMEISTER, Univ. Miinchen 1963.

Licbigs Ann. Chcm. Ed. 662 1

2 P. KARLSON und H. HOFFMEISTER Bd. 662

1. EINLEITUNG

Mit dem Narnen Ecdyson ist das Hautungs- und Metamorphosehormon der In- sekten bezeichnet worden *).

Bekanntlichz-4) wird die Postembryonalentwicklung der Insekten hauptsachlich durch zwei Hormone gesteuert: durch das Hormon der Corpora allata (Juvenilhormon) und das Hormon der Prothorakaldriisen (Ecdyson). Die Sekretionstatigkeit der Prothorakaldriisen wird auf neurosekretorischem Wege vom Gehirn kontrolliert. Eine Larvenhautung kommt durch ein Zusammenwirken von Juvenilhormon und Ecdyson zustande; wirkt nur das Ecdy- son, so resultiert eine Puppen- oder Imaginalhiutung.

Ecdyson wurde 1954 in reiner Form isolierts); es ist das erste und bisher einzige Insektenhormon, das kristallisiert erhalten wurde. Als Ausgangsmaterial dienten Puppen des Seidenspinners Bombyx mori, die in Methanol konserviert waren. Aus 500 kg dieses Materials konnten nur 25 rng kristallisiertes Ecdyson isoliert werden.

Verschiedene seither durchgefuhrte Aufarbeitungen haben wechselnde Ausbeuten ergeben. Wahrscheinlich ist der Grund im unterschiedlichen Alter der Puppen zu suchen, die fur die Aufarbeitung verwendet wurden. Bei systematischen Untersuchungen uber den Hormon- gehalt verschieden alter Bombyx-Puppen fand BURDETTE~) eine starke Altersabhangigkeit. Wir haben in giinstigen Fallen erheblich bessere Ausbeuten erzielt als BURDETTE; bei einigen unserer Aufarbeitungen war die erhaltene Aktivitat gering.

Im Herbst 1960 haben wir durch verbesserte Methoden genugend Ecdyson in die Hand bekommen, um erste Abbauversuche durchfuhren zu konnen. Zusarnrnen mit physikalisch-chemischen Messungen lassen sich daraus Ruckschlusse auf die chemische Natur des Ecdysons ziehen; dariiber wird hier berichtet.

2. ISOLIERUNG DES ECDYSONS AUS TROCKENPUPPEN Als gunstiges Ausgangsmaterial haben sich getrocknete Seidenspinnerpuppen er-

wiesen, die als Riickstande bei der Seidengewinnung anfallen. Wir hatten bereits friiher7) aus diesem Material wirksame Extrakte erhalten, die aber schwer zu reinigen waren. Durch Anwendung eines Extraktionsverfahrens, das der Extraktion von Frisch- puppen nachgebildet war, gelang es, einen leichter zu reinigenden Extrakt zu erhalten. Er lieferte nach einer neuen Anreicherungsrnethode, die wegen des hoheren Lipoid- gehalts ausgearbeitet werden munte, aus lo00 kg Trockenpuppen 250 mg kristalli-

1) P. KARLSON, Ann. Sci. natur., Zool. Biol. animale [ I I ] 18, 125 (1956) [C. 1957, 56151. 2) P. KARLSON, Vitamins and Hormones 14, 227 (1956). 3 ) V. B. WIGGLESWORTH, ,,The Physiology of Insect Metamorphosis", Cambridge Mono-

4) P. KARLSON, ,,Insektenhormone und ihre Wirkungsweise", 8. Sympos. Ges. Endokrino-

5 ) A. BUTENANDT und P. KARLSON, Z. Naturforsch. 9b, 389 (1954). 6 ) W. J. BURDETTE, Science [Washington] 135, 432 (1962). 7) A. BUTENANDT, P. KARLSON und W. ZILLIG, Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 288, 125

graphes in Experimental Biology, Bd. I , Cambridge Univ. Press, London 1954.

logie, Springer-Verlag, Berlin 1962, S. 90.

(1951).

1963 Chemie des Ecdysons 3

siertes Ecdyson zur chemischen Bearbeitung. Den Gang der Isolierung zeigt das folgende Schema (Einzelheiten vgl. S. 16):

lo00 kg Bombyx mori-Trockenpuppen

Methanolextraktion 1- Trockenpuppenmehl 4

Methanolfiltrat, konzentriert auf 600 I

Butanolextraktion /+ 4.5 I abgeschiedenes 61 .$

4.1 kg Butanolkonzentrat

Verteilung zwischen Petrolrther,Wasser 1- 3.85 kg unwirksamer Ruckstand 4 aus Petrolither-Fraktion

232 g waBriges Konzentrat (spezif. Aktivitat 50 CEjmg)

Chromatographie an A1203 - 190 g schwach aktive Fraktionen I I

I

36 g hormonhaltige Fraktionen (spezif. Aktivitat 500 CE/mg)

Gegenstromverteilung - 20 g wenig aktive Fraktionen

14.6 g hormonhaltige Fraktionen (spezif. Aktivitat 2500 CE/mg)

Chromatographie an A1201 1- 10 g inaktive Fraktionen 4

2.90 g aktive Fraktionen

Gegcnstromverteilung ----f 2.65 g schwach aktive Fraktionen

250 mg krist. rohes Ecdyson (spezif. Aktivitat 1OOOOO CE/mg)

3. EIGENSCHAFTEN U N D ANALYTISCHE ZUSAMMENSETZUNG

Ecdyson kristallisiert aus Wasser in feinen Nadeln, die bei 160-165° unter Verlust von Kristallwasser teilweise schmelzen. Die Schmelze erstarrt wieder und die kristall- wasserfreie Substanz zeigt den Schmp. 239 -242". Aus Essigester wird das Ecdyson in derben, wasserfreien Platten erhalten, die beim Erhitzen keine Umwandlung zeigen, sondern bei 239" schrnelzen. Auch aus Tetrahydrofuran lal3t es sich gut kristallisieren.

Die Loslichkeit in Wasser ist gering. Nach der UV-Messung enthalt die beim Umkristallisieren zuriickbleibende Mutterlauge noch 0.45 mg pro ccm.

1'


Die Verteilungskoefkienten wurden aus den Gegenstrornverteilungskurven errnit- telt, sie sind als Naherungswerte zu betrachten. Wir fanden folgende Werte:

Butanol/ Wasser ca. 10 Cyclohexan/n-Butanol/Wasser (6 : 4 : 10) Ameisensaureathylester/n-Butanol/Wasser (9 : 1 : 10)

1.3 0.75

Die optische Drehung wurde zu [a]Lo = $64.7 5 2" bestimmt. Der Wert liegt etwas hoher als der fruhers) angegebene.

Die elernentare Zusammensetzung des Ecdysons war von unss) bereits zu C4.4H7.30 angegeben worden. Wir haben das neu isolierte Ecdyson wieder analysieren lassen und auch selbst CH-Bestimmungen nach der Subrnikrornethode von SIMON 8)

durchgefiihrt (Werte in Tab. 1). Als Mittelwert ergibt sich daraus ein Atomverhaltnis, das rnit dern obigen befriedigend iibereinstirnmt, wenn man beriicksichtigt, da& das Ecdyson hartnackig Kristallosungsrnittel (vor allern Kristallwasser) festhalt, bei scharfern Trocknen aber leicht Wasser abspaltet.

Tabelle 1 . Elementaranalysen verschiedener Ecdyson-Praparate _____ _-

C H 0 Praparat

69.48 9.50 21.17 vom Jahre 1957') ____ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - .

69.44 69.33 21!8 1 vorn Jahre 1961 **)

9.60 9.40

I 70.34 10.06 -

aus den Iahren 1961/62 (eigene Submikroanalysen)

9.57 69.74 69.91 9.63 69.89 9.71 69.73 9.64 21.12 J

*) Analysiert von A. SCHOELLER, KronachiOberfranken ** ) Analysiert von A. BERNHARD, MiilheimlRuhr.

4. ELEMENTARZELLE UND RAUMGRUPPE DES KRISTALLISIERTEN ECDYSONS Das Molekulargewicht des Ecdysons haben wir aus den in Prazessions- und WEtssEN-

BERG-Kameras rontgenographisch errnittelten Daten der Elernentarzelle sowie der Dichtebestimrnung kristallwasserfreier Praparate berechnets). Mit der kristallwasserhaltigen Modifikation wurden orientierende Messungen vorgenommen.

a) Wasserhaltige Modifikation: Sehr kleine Nadeln von ca. 10 p Durchrnesser. Die Verrnessung in einer quarzgeeichten Prazessionskarnera (Beriicksichtigung der Filrn- schrurnpfung; Fehler 2 -3%") ergab:

Kristallsystem rhombisch, Raumgruppe P 2,2121 a = 34.39 A; b = 12.99 A ; c = 6.28 A Volumen der Zelle 2807.2 A3

8) H. SIMON und G . MULLHOFER, Z. analyt. Chem. 181, 85 (1961). 9 ) Vgl. hierzu W. HOPPE, Angew. Chem. 69, 659 (1957).


Dichtemessungen, die nur an Kristallaggregaten vorgenomrnen werden konnten, lieferten wenig zuverlassige Werte. Durch Vergleich rnit den d-Werten der wasserfreien Modifikation l a D t sich die Zahl der Ecdysonmolekiileje Elementarzelle zu n = 4 angeben; wahrscheinlich sind 2 Molekiile Kristallwasser je Zelle enthalten.

b) Wasserfreie Modifikation: Einkristalle von 0.2 -0.4 mm Langsdurchmesser rnit gut ausgebildeten Flachen wurden durch Umkristallisieren aus Essigester erhalten. Die optische Messung mittels Reflexionsgoniometers ergab:

Kristallsystem rhombisch Achsenverhaltnis a : b = 3.55,

Die Rontgenvermessung 10) lieferte folgende Daten :

b : c = 1.27

Raumgruppe P 212121 a = 35.56A; b = 9.92A; c = 1.73 A Volumen der Zelle 2725.32 A3

Die Bestimmung der Dichte an Einkristallen nach der Schwebemethode in waRriger KJ- und waBriger CdClz-Losung bzw. unabhangig in Toluol/Bromoform als Schwere- fliissigkeit fiihrte zu :

d = 1.127 und d = 1.128 bzw. d = 1.126

Das Molekulargewicht des Ecdysons ist nach der folgenden Formel berechnet worden :

d . N ~ . v n

d = Dichte, V = Elementarvohnen n = Zahl der Molekiile pro Elementarzelle M -

NL = LOSCHMIDTsChe Zahl

Aus den voranstehenden Messungen waren alle Daten bis auf n (Zahl der Molekiile pro Elementarzelle) bekannt. Die Raumgruppe P 212121 1aRt nur game Vielfache von 4 zu (4, 8, 12 usw.). Die zugehorigen Molekulargewichte sind:

n = 4 : M = 462.6 n = 8 : M =231.3 n = 12: M = 154.2

5. MOLEKULGROSSE UND SUMMENFORMEL

Das aus den Rontgendaten mit n = 12 errechnete Molekulargewicht von 154, entsprechend der Bruttoformel CgH~602 (Mo1.-Gew. 156), war nach dem Verhalten des Ecdysons auszuschlieflen ; ein Hydroxyketon dieser Zusammensetzung miiBte andere Eigenschaften zeigen. C13H2403 oder C14H2603 (n = 8) IieRen sich mit den Ana- lysendaten und den kryoskopisch bestimmten Molekulargewichten nicht gut vereinbaren. So blieb als einzige Moglichkeit das sich aus n = 4 ergebende Mo1.-Gew. 462. Es hatte von vornherein die groBte Wahrscheinlichkeit, da bei vierzahliger Symmetrie die kristallographisch aquivalenten Lagen nur selten mit Doppelmolekiilen besetzt

10) Diplomarbeit R. HUBER, Techn. Hochschule Munchen 1960.


sind. Kryoskopische und rnassenspektroskopische Messungen stutzten die sich hieraus ableitende Summenformel C27H4406.

Aus kryoskopischen Messungen hatte sich fur das 1954 erhaltene Ecdyson-Praparat ein Molekulargewicht von ca. 300 ergeben (gef. MoLGew. 296 und 305). Es stimmte mit der Summenformel C1aH30O4 (ber. Mo1.-Gew. 310) befriedigend iiberein z), ist jedoch mit dem Ergebnis aus den Rbntgenmessungen nicht zu vereinbaren.

Erneut durchgefihrte kryoskopische Messungen in p-Amino-hexahydrobenoesaurelac- tamll) ergaben zwar hohere Werte (gef. Mo1.-Gew. 434, 424, 361, 385, 338, 359, doch ist die Streuung weit groBer, als nach der Fehlerbreite der Methode zu erwarten war. Der Grund diirfte darin liegen, daB Ecdyson hartnackig Losungsmittel festhalt und zudem bei der Molekulargewichtsbestimmung in p-Amino-hexahydrobenzoesaurelactam auf nahezu 200" erhitzt werden muB, wobei eine teilweise Zersetzung nicht auszuschlieBen ist. Es ist deshalb anzunehmen, daB von den kryoskopisch gefundenen Molekulargewichten die hohen Werte noch am ehesten zutreffen.

Die massenspektroskopische Untersuchung des Ecdysons bestatigte das aus den Rontgendaten errnittelte Molekulargewicht. Wird das Ecdyson schonend in die Ionenquelle eingebracht, so findet man eine hohe Massenspitze bei 464 Massen- einheiten (Abb. 1). - Das S. 17 beschriebene Diacetat zeigt eine Massenspitze bei M = 546 (ber. MoLGew. 548) neben einigen weiteren Banden, die von Spaltstucken herriihren.

300 400 Massenidlil 500 Abbildung 1

Massenspektrum des Ecdysons (ATLAS CH 4-Massenspektrometer ; Messungen bei 70 eV) Die Substanz wurde durch eine Tieftemperaturschleuse in die Ionenquelle eingebrach t.

Das ubereinstirnrnend aus Rontgen- und rnassenspektroskopischen Daten erhaltene Molekulargewicht ist nur mit der Summenformel C27H4406 zu vereinbaren, womit auch die analytischen Daten ubereinstirnmen :

C27H4406 (464.6) Ber. C 69.81 H 9.55 0 20.67 Mittelwert Gef. 69.73 9.64 21.12

Diese Summenformel ist auch auf chemischem Wege durch analytische Untersuchungen am 5-Jod-2.4-dinitro-phenylhydrazon (S. 17) gesichert worden. Danach ist nur eine Keto- gruppe im Ecdyson vorhanden. Der Wasserstoffwert'wird fur C33H47JN409 zwar etwas zu niedrig gefunden (5.73 und 5.51 % anstelle von ber. 6.14%), der C-Wert ist jedoch nur mit einer 06-Formel in Einklang zu bringen.

11) G. WENDT, Ber. dtsch. chem. Ges. 75, 425 (1942).

I963 Chemie des Ecdysons 7

Die Summenformel C27HuO6 verlangt ein Vierring-System, wenn nur eine Doppel- bindung (in Nachbarschaft zur Oxogruppe) vorliegt. Fur solche Vierring-Systeme sind die Steroide - Cholestenon hat die Bruttofornel - die gegebenen Modell- substanzen.

6 . DERIVATE

Bereits in der ersten Mitteilungs) war aus spektroskopischen Daten auf das Vorliegen einer a$-ungesattigten Ketongruppierung und rnehrerer Hydroxylgruppen geschlossen worden.

Wir haben versucht, insbesondere Brom oder Jod enthaltende Derivate durch Umsetzungen an diesen funktionellen Gruppen darzustellen, urn darauf die Schwer- atomtechnik der Rontgenstrukturanalyse anwenden zu konnen. Da das kostbare Ecdyson in beschrankter Menge zur Verfiigung stand, konnten stets nur wenige Milligramme zur Herstellung eines Derivates eingesetzt werden.

Mit Ketonreagentien wurden nur das 2.4-Dinitro-phenylhydrazon (Schmp. 170 bis 175") und das 5-Jod-2.4-dinitro-phenylhydrazon (Schrnp. 168") rein erhalten. Dem UV-Spektrum des papierchrornatographisch einheitlichen 2.4-Dinitro-phenylhydrazons nach muB es sich beim Ecdyson um ein a.P-ungesattigtes Keton handeln. Die Analyse des entsprechenden 5-Jod-Derivats weist dieses als Monoderivat aus.

Das zur Darstellung dieses Derivats benotigte, bisher unbekannte 5-Jod-2.4-dinirro-phenylhydrarin wurde a m 5-Chlor-2.4-dinitro-anilin 12) iiber das nach SANDMEYER gewonnene 1 -,Chlor-5-jod-2.4-dinitro-benzol und dessen Umsetzung mit Hydrazin gewonnen. Modell- versuche rnit verschiedenen Steroidketonen ergaben gut kristallisierende Kondensationspro- dukte (Androsteron-5-jod-2.4-dinitro-phenylhydrazon, orangefarbene Nadeln vom Schmp. 280 - 282"; Testosteron-5-jod-2.4-dinitro-phenylhydrazon, rote Schuppen vom Schmp. 260"). Das Derivat des Ecdysons blieb jedoch kleinkristallin.

Acetylierungen rnit Acetanhydrid in Pyridin ergaben rnehrere papierchromatographisch unterscheidbare Substanzen. In geringer Ausbeute wurde ein Kristallisat vom Schmp. 213 -216" erhalten, das wahrscheinlich ein Monoacetat ist. Eine daneben gebildete Substanz vom Schmp. 138-140" halten wir fur ein Diacetat. Sein IR- Spektrum zeigt noch unveresterte Hydroxylgruppen an.

Das rnit p-Jod-benzoylchlorid/Pyridin in geringer Ausbeute erhaltene p-Jod-benroar des Ecdysons kristallisierte (Schmp. 310") und verhielt sich in seiner Loslichkeit wie ein Mono- derivat.

Nach entsprechender Umsetzung des Ecdysons mit p-Brom-benzoylchlorid waren chroma- tographisch (an AlzO,) zwei Derivate trennbar: eine olige Substanz und ein Kristallisat vom Schmp. 242", das nach dem 1R-Spektrum ein Mono-p-brom-betrzoar sein diirfte.

Bemerkenswert ist, daB sich die Doppelbindung im Ecdyson weder rnit Pt- noch rnit Pd-Katalysatoren hydrieren laBt.

12) R. NIETZKI und A. SCHEDLER, Ber. dtsch. chem. Ges. 30, 1666 (1897).


7. MOLEKULFORM Da uns zur iiblichen Kristallstrukturanalyse geeignete, kristallisierte Schweratom-

derivate des Ecdysons vorlaufig nicht zur Verfugung standen, haben wir kristall- wasserfreie Praparate des Hormons mit einer neueren Beugungsmethode 13) untersucht. Dieses Verfahren war bereits bei mehreren organischen Molekeln, darunter auch auf zwei Naturstoffe 14.15), angewendet worden.

Prinzip dieses Verfuhrens: Die thermische Bewegung in einem Kristall bringt das Gitter in schwache Unordnung. Diese bewirkt, daD Rontgenstreuung nicht nur in den bekannten Kristallreflexen auftritt, sondern auch den ,,Untergrund" zwischen den Reflexen belegt. Sind die Bausteine des Gitters relativ starre Gebilde (z. B. Molekiile mit Ringsystemen), so laDt sich theoretisch und experimentell zeigen 13). daD dieser Rontgenuntergrund die Streu- figur der Molekiile (ihre FOURIER-tranSfOrmierte) abbildet.

Wir haben die Projektion in Richtung der c-Achse untersucht, da in ihr, entsprechend der kurzen Projektionslange, die beste Auflosung zu erwarten war. Die Auf- nahme der diffusen Streuung ergab ein System von diffusen elliptischen Streuflecken, deren Umrandungen - eingezeichnet in die ,,reziproke Ebene" - Abbildung 2a wiedergibt. Es fallt die Ahnlichkeit der Ellipsen (bis auf ihre GroBe) und die Orientie- rung ihrer Achsen auf. Diese Orientierungen sind entweder gleich oder spiegelbildlich gleich, was aus der Symmetrie der Projektion verstandlich wird, welche ebenfalls Spiegelbildsymmetrie der Molekiile erfordert. Bei Ianglichen Objekten sind langlich verzogene Streufiguren zu erwarten. Die ,,starre Gruppe", das Ringsystem des Ecdy- sons, mu13 also Iangliche Gestalt besitzen. Die Streufigur einer einzelnen Molekel erhalt man dadurch, daB die Flecken gleicher Orientierung zusammengefaBt werden. Diese experimentelle ,,molekulare" Streufigur ist in den Abbildungen 2b und 2c eingezeichnet. Die Anordnung der Schwarzungsflecke deutet auf eine verzerrt hexagonale Anordnung der Atome in der Projektion hin und beweist damit die cyclische Struktur.

Aus der langlichen Struktur der diffusen Flecken laBt sich ferner - nach einer erstmals von H O P P E ~ ~ ) vorgenommenen Abschatzung - die Dimension des ,,stwren Ringgeriists" in der Projektion bestimmen. Sie kann zu ungefahr 2.8 A Breite und 11 8, Lange angegeben werden. Die Projektionslange von 11 A befurwortet eine lineare Anellierung der Ringe.

Vergleiche der experimentellen Fleckenverteilung mit Modellstrukturen lassen lediglich erkennen, daB eine vom hydrierten Phenanthren oder vom hydrierten Anthra- cen abgeleitete Verbindung vorliegen kann. Immerhin wird damit die Sterinhypothese,

13) W. HOPPE, Z . Kristallogr., Kristallometr., Kristallphysik, Kristallchem. 107, 406 (1956) [C. 1957, 69661; vgl. auch W. HOPPE, Fortschritte der Strukturforschrrng, Bd. 1, Vieweg- Verlag, Braunschweig, im Druck.

14) W. HOPPE und G. WILL, Z. Kristallogr., Kristallometr., Kristallphysik, Kristallchem. 113, 104 (1960) [C. A. 54, 16095 (1960)l.

15) W. HOPPE, Z. Kristallogr., Kristallometr., Kristallphysik, Kristallchem. 114, 393 (1960) [C. A. 55, 1001 I (1961)].


ubereinstimmend mit spateren chemischen Untersuchungsergebnissen und mit den bisherigen Rontgendaten, gestutzt.

a - 0.2 R-'

Abbildung 2. Rontgenstreuung des Ecdysons nach der Beugungsrnethode von HOPPE 13) (Projektion in Richtung der c-Achse)

a : Diffuse Streuung in der reziproken Ebene b: - Experirnentelle molekulare Streufigur des Ecdysons, - . - - ~ - theoret. Streu-

figur yon 10.13.17-Trimethyl-steran c: - wie Abb. 2b, .----- theoret. Streufigur des Anthracens

Aus der diffusen Streuung haben sich auch die Winkel bestimmen lassen, welche das Sterin- oder das Perhydroanthracengeriist mit den Kristallachsen bilden. Die Langsachsen der Molekeln liegen nicht ganz parallel zur langen Achse des Kristalls. Der wegen der Klein- heit der Kristalle noch nicht mogliche Vergleich mit der kristallwasserhaltigen Modifikation,


deren Elementarzelle bei groBerem Querschnitt kurzer ist, sollte eine starkere Neigung der langen Molekelachse zur Kristallachse und -- bei der kiirzeren c-Achse - eine flachere Lage der Molekule in der c-Projektion ergeben.

In einem Falle ist es gelungen, auch die Elementarzelle eines Schweratomderivates des Ecdysons, der p-Brom-benzoyl-Verbindung ( S . 18) zu vermessen16). Der winzige Kristall (etwa 3 x 10 x 15 p) ergab folgende Elementarzelle:

a = 49.0A; b = 12.49A; c = 6.66A Raumgruppe wahrscheinlich P 212121

Es ist auffallend, daB das Bromderivat das gleiche Gitter wie das Ecdyson aufweist und nur eine Gitterachse aufgeweitet ist. Dies IaBt sich verstehen, wenn das Molekiil in Richtung der langen Achse durch den p-Brom-benzoyl-Rest verlangert erscheint.

8. SPEKTROSKOPISCHE BEFUNDE Das U V-Spektrurn des Ecdysons zeigt ein ausgepragtes Absorptionsmaximum bei

241 -242 mp (a.P-ungesattigte Ketongruppierung)5). Bei hoheren Konzentrationen 1aBt sich auch das flache Maximum bei 310 rnp erkennen, das der Ketogruppe zu- kommt. Mit dem neuen Molekulargewicht (464.6) errechnet sich die molare Extink- tion des Ecdysons zu E = 12400. Dieser Wert ist zwar geringer als derjenige von A4-3- Oxosteroiden (Testosteron, Progesteron usw.), fallt aber in die gleiche Groknord- nung wie bei anderen ungesattigten Steroidketonen [z. B. As-Ketonen-(7), A9(1*)- Ketonen-( 12) oder Al*-Ketonen-( 1 l)]. Andere ungesattigte Ketone zeigen niedrigere Extinktionen 17).

Auch das 2.4-Dinitro-phenylhydrazon und das 5-Jod-2.4-dinitro-phenylhydrazon zeigen irn UV-Spektrum Maxima und Extinktionen, die auf ein a.P-ungesattigtes Keton schlieBen lassln (vgl. S. 17).

Das ZR-Spek/rurn des Ecdysons *) (Abb. 3) zeigt C-H- und 0-H-Schwingungen (starke Absorptionen bei 3333 und 2942 cm-1) und laRt damit alkoholische Gruppen erkennen. In den Spektren der aus Wasser kristallisierten Praparate tritt eine starkere OH-Bande auf (Gehalt an Kristallwasser) als in den aus Essigester kristallisierten oder scharf getrockneten Proben. Die Carbonylschwingung liegt sehr langwellig (bei 1657 cm-1). Dies diirfte einerseits durch die Nachbarschaft der Doppelbindung bedingt sein 18), andererseits wahrscheinlich durch eine Wasserstoffbindung zwischen einer OH- und der CO-Gruppe. Eine solche Wasserstoffbriicke kann sich im Kristall auch zwischen den Molekulen ausbilden. Die Absorptionsbanden zwischen 1400 und 800cm-1 sind nicht eindeutig zuzuordnen. Ihre Lage steht jedoch nicht im Wider-

* ) Messung in KBr, da die Loslichkeitseigenschaften des Ecdysons IR-Aufnahmen in Losung

16) Diplomarbeiten H. WEICHSELGARTNER und R. EDER, Techn. Hochschule Munchen 1963. '7) L. DORFMAN, Chem. Reviews 53, 47 (1955). 18) L. J. BELLAMY, The It!fra-red Spectra of Complex Molecules, Methuen & Co., Ltd., Lon-

nicht zulassen.

don 1958.

1963 Chemie des Ecdysons 1 1

spruch mit der Annahme, daB es sich beim Ecdyson um ein Steroid handelt. Die Absorption bei 1380 cm-1 ware d a m den angularen Methylgruppen zuzuordnen.

4WO36003200280024002WO 1800 lhoo 1400 lz00 loo0 800 650m-’

Abbildung 3. IR-Spektrum des Ecdysons (in KBr)

Tabelle 2. Signale des Protonenresonanzspektrurns von Ecdyson in perdeuteriertem Pyridin (Aufnahme mittels Protonenresonanzspektrographen VARIAN 60)

Bezugssubstanz : Tetramethylsilan

Funktion Verschiebung Anzahl der (Hz) ppm Protonen

42 0.70

63 I .05

71 1.19 78 1.30

83 1.38

I15 1.92

25 1 4.18

345 5.75

379 6.3 I

Summe

3

3

3

6

21

1 + 2

4

1

44

-C-CH3 (angular)

-C-CH3 (angular)

R i

‘CH-CH3 (Dublett)

R R/

HO/ \C(CH&

\CH- und -CH2- /

HO- und ‘HC- /

HO- R

/R R’ ‘R

‘C-CH=C

Das Protonenresonanzspekfrurn (Tab. 2) bestatigt die angenommene Steroidstruktur. Neben CH- und CH2-Banden finden sich die charakteristischen Signale verschiedener Methylgruppen. Die quantitative Auswertung ergibt, daR zwei angufare Methyfgruppen vorliegen. Sie geben sich durch die an vielen Steroiden aufgefundenen Signale 19) bei 19) R. F. ZURCHER, Helv. chim. Acta 44, 1.180 (1961).


0.70 und 1.05 pprn zu erkennen. Ferner ist eine )CH -CH,-Gruppe vorhanden, deren Resonanzspitze zu einern Dublett bei 1.19 und 1.30 pprn aufspaltet. Ein weiteres Signal bei 1.38 ppni rnuB durch zwei gleichartig gebundene, quarture Methylgruppm

bedingt sein. Wir fiihren es auf die Gruppierung HO -C(CH& zuruck, die verrnutlich in der Seitenkette lokalisiert ist. Die Gruppe =C(CH3)2 rniiBte bei hoheren pprn- Werten in Erscheinung treten; allenfalls sind noch zwei vicinale Methylgruppen am Ring (wie beirn Lanosterin) zu diskutieren.

Fur die Konstitutionsermittlung sind ferner von Bedeutung: ein Signal bei 5.75 pprn (Hydroxylprotanen), dessen Intensitat auf 4 Hydroxylgruppen hinweist ; ein Signal bei 4.18 pprn, das wir einern besonders ausgezeichneten Hydroxylproton zuordnen rnochten; das nicht aufgespaltene Signal bei 6.31 pprn zeigt ein Proton an der bereits spektroskopisch nachgewiesenen Doppelbindung an. Damit ist der Charakter der ungesattigten Ketongruppierung weitgehend festgelegt.

I

9. DEHYDRIERUNG z u PHENANTHRENDERIVATEN Bei der Zuordnung neu isolierter Naturstoffe zur Klasse der Steroide wird der

Dehydrierung zu Cyclopentenophenanthren-Derivaten besondere Bedeutung bei- gernessen. Obwohl diese Dehydrierungen meist uniibersichtlich und mit geringer Aus- beute verlaufen, haben wir an Mengen von 15-20 rng versucht, auf diese Weise den Grundkorper des Ecdysons zu errnitteln.

Wahrend wir rnit Selen und Chloranil keinen Erfolg hatten, gelang eine Dehydrie- rung mit frisch gefalltem Palladium auf Tierkohle. Irn rohen Dehydrierungsgemisch wurden durch Dunnschichtchrornatographie in verschiedenen Losungsrnitteln rnehr als 20 Substanzen nachgewiesen. Durch praparative Diinnschichtchrornatographie an Kieselgel rnit Benzol, dann mit Benzol/Petrolather, l i ekn sich zwei Hauptfraktionen (D 1 und D 2, vgl. S. 18) abtrennen. Fraktion D 1, die in einer Menge von 30 pg erhalten wurde, wies irn UV-Spektrurn grol3e Ahnlichkeit rnit dem DrELsschen Kohlenwasserstoff auf. Das IR-Spektrurn (mit einer Mikromethode aufgenommen) zeigte die fur diese Stoffklasse typischen Maxirna20) bei 810 und 747 cm-1. Papier- chrornatographisch lieR sich die Fraktion D 1 weiter auftrennen. Der Hauptanteil fand sich in zwei Flecken, die die gleiche Position aufwiesen wie 3’-Methyl-cyclopentenophenanthren und 3’.3’-Dimethyl-~yclopentadienophenanthren. Eine Kristal- lisation dieser Kohlenwasserstoffe war angesichts der geringen vorliegenden Mengen nicht moglich.

Mit Sicherheit laRt sich sagen, daB nach dern chrornatographischen Verhalten und den Spektren substituierte Phenanthrene als Dehydrierungsprodukte des Ecdysons entstanden sind. Mit diesern Befund ist dessen Zugehorigkeit zu den Steroiden oder steroidahnlichen Triterpenen auch chernisch sichergestellt.

2 0 ) H. DANNENBERG, u. SCHIEDT und W. STEIDLE, z. Naturforsch. Sb, 269 (1953).


10. ABBAUVERSUCHE

Ecdyson ist sowohl gegen Sauren wie gegen Alkalien empfindlich. Mit 0.1 n KOH beobachtet man eine rasche h d e r u n g des Spektrums unter Gelbfarbung der Losung. Beim Erwarmen mit 0.1 n HC1 ist schon nach 10 Min. die biologische Aktivitat ver- schwunden. Aus wajriger Salzsaure schied sich ein Umwandlungsprodukt vorn Schmp. 155-158" kristallisiert in etwa 50-proz. Ausbeute ab. Das UV-Spektrum weist ein ausgepragtes Maximum bei 248 mt/. auf; im IR-Spektrum (Abb. 4a) erkennt man eine Carbonylbande bei 1710 cm-1, die also nicht mehr die fur Ecdyson charakteristische Rotverschiebung zeigt. Die neu entstandene Substanz ist danach offenbar ein durch Wasserabspaltung entstandenes Dienon, bei dem die bereits vorhanden gewesene Doppelbindung nicht mehr in Konjugation rnit der Oxogruppe steht.

400036CO3200280024002000 1800 1600 1400 I200 loo0 800 6Mcm-1

Abbildung 4. IR-Spektren der Siiureumwandlungsprodukte des Ecdysons b : Dienon vom Schmp. 238-240" a: Dienon vorn Schmp. 155-158"

Neben diesem Hauptprodukt der Salzsaurebehandlung wurde ein weiterer Stoff (Schrnp. 238 -240") kristallin erhalten. Im IR-Spektrum (Abb. 4 b) lag die Carbonyl- bande wie beim Ecdyson bei 1666 cm-1. Das langwellig (nach 293 mp) verschobene UV-Maximum deutet auf ein Dienon mit Konjugation von Oxogruppe und beiden Doppelbindungen hin.

1 1. DISKUSSION DER ERGEBNISSE Aus den experimentellen Ergebnissen laBt sich noch keine bestimmte chemische

Strukturformel fur das Ecdyson ableiten. Dennoch erscheint es gerechtfertigt, einige gesicherte Strukturelernente herauszustellen:

1) Die Summenformel des Ecdysonss) ist zu revidieren; sie muO C2,H406 lauten. Zu diesem SchluD fiihrten ubereinstimmend Rontgenstrukturanalyse, Molekular-


gewichtsbestimmung auf massenspektroskopischem Wege und Analyse des 5-Jod- 2.4-dini tro-phenylhydrazons.

2) Spektren und Salzsaureabbau sprechen fur dasvorliegen nur einer Doppelbindung und einer dazu konjugiert stehenden Oxogruppe. Nach dern Protonenresonanzspek- trum sind die Sauerstoffatome des Ecdysons vollstandig einer Oxogruppe und funf Hydroxylgruppen zuzuordnen.

3) Aus der Summenformel und der Art der funktionellen Gruppen ergibt sich fur den hypothetischen Grundkohlenwasserstoff die Formel ; sie enthalt 8 H-Ato- me weniger als einem gesattigten, aliphatischen Kohlenwasserstoff entspricht. Demnach liegt im Ecdyson ein System von vier gesattigten Ringen vor.

4) Als beweisend fur die Annahme, daD dieses Vierring-System das Steramystem ist, halten wir das Auftreten von Cyclopentenophenanthren-Derivaten bei der Dehydrie- rung, die Ergebnisse der diffusen Rontgenstreuung und die Identifizierung der fur Steroide charakteristischen angularen Methylgruppen im kernmagnet ischen Resonanz- spektrum.

Es liegt aus biologischen Griinden nahe, das Cholestan als Grundkorper des Ecdysons an- zusehen, obwohl die bisher untersuchten Insektenarten nicht in der Lage sind, Cholesterin oder iiberhaupt Steroide aufiubauenz*), sondern diese als essentielle Nahrungsfaktoren benotigen. Es ist indessen die Vermutung geauRert worden 22), daR Cholesterin (oder ein ande- res Nahrungssterin) in Hormone umgewandelt zu werden vermag.

5) Entsprechend der Summenformel wird das Vorkommen einer Seitenkette rnit 8 C-Atomen wahrscheinlich. Als Beweis dafiir, daD diese wie im Cholesterin angeordnet ist, konnen wir nur das kernmagnetische Resonanzspektrurn anfuhren, das eine Methylgruppe an einer CH-Verzweigung (C-20 und C-21 entsprechend) sowie zwei gleichartige Methylgruppen am Ende einer Seitenkette (C-26 und C-27 entsprechend) erkennen IaDt. Der experimentellen Forderung, daD an C-25 kein Proton mehr vorhanden ist, kann dadurch Rechnung getragen werden, daD man hier eine tertiare Hydroxylgruppe annimmt. Damit wurde die Seitenkette folgendes Aussehen bekommen :

CII, CII, I I

I I c - c l l p C l I , - C l l p c ~ c I I , I

0 1 1

Wir haben, ein Steroid mit einer entsprechenden, aber um 1 CHz-Gruppe verkiirzten Seitenkette, das 3a.7a.12a.24-Tetrahydroxy-24-methyl-26.27-bisnor-koprostan (Cholsaure-

21) Z. H. LEVINSON, Proc. XI. Internat. Kongr. Entomol., Bd. 111, Wien 1960; vgl. auch

22) A. J. CLARK und K. BLOCH, J. biol. Chemistry 234, 2583 (1959); R. B. CLAYTON, ebenda D. GILMOUR, The Biochemisfry of Insecfs, Academic Press, Inc., New York 1961.

235, 3421 (1960).


dimethylcnrbinol) teilsynthetisch aus Cholsauremethylester und Methylmagnesiumjodid her- gestellt :

0 1 1

Dieses Modell zeigt ein ahnliches Protonenresonanzspektrum wie Ecdyson. Insbesondere finden sich die Signale der beiden quartaren Methylgruppen und der besonders ausgezeichneten Hydroxylgruppe (bei 5.38 ppm).

6) Fur die Lage dei Oxogriippe ist auf Grund der Spektren und der Art der Saure- umwandlungsprodukte zu fordern, daR an der benachbarten Doppelbindung nur noch 1 H-Atom steht, und daB Ketogruppe und Doppelbindung dem gleichen Ring (oder der Seitenkette) angehoren.

Das Verhalten des Ecdysons wiirde die Struktur I eines Ag(l*)-Ketons-(I2) gut ausdriicken. Fur eine solche Struktur wurden molare Extinktionen von 12300 bei A,,, = 240-242 mp angegeben 17). AuBerdem ist bekannt, daB die AP(ll)-Doppelbindung sehr wenig reaktions- fahig ist, was damit iibereinstimmen wiirde, daB sich das Ecdyson nur schwer hydrieren laBt. Dies lieae sich nicht verstehen, wenn Ketogruppe und Doppelbindung in der Seitenkette lagen. Zudem spricht das Protonenresonanzspektrum gegen eine Lokalisierung der beiden (gleichartigen) Methylgruppen an einer Doppelbindung.

Die Lage der weiteren Hydroxylgruppen konnen wir noch nicht angeben.

Herrn Prof. A. BUTENANDT danken wir fir das rege Interesse, das er unseren Untersuchun- gen entgegengebracht hat. AuBerdem mochten wir an dieser Stelle der Deutschen Hoffmann- LaRoche AG, insbesondere den Herren Direktoren Dr. H. H. SAENCER und Dr. H. MOLLE- RING sowie dern Betriebsleiter Herrn Dr. W. MULLER-MULOT fur die GroBaufarbeitung der Puppen danken, woran Herr H. LACHER als Laborant mit besonderem Eifer beteiligt war. - Die UV- und 1R-Spektren wurden in der Spektroskopischen Abteilung des Max-Planck- Instituts fur Biochemie aufgenommen; wertvolle Anregungen zur Diskussion der Spektren gaben die Herren Prof. H. DANNENBERG, Dr. E. BIEKERT und Dr. H. SONNENBICHLER. Das Protonenresonanzspektrum wurde freundlicherweise in der Physikalischen Abteilung der Farbenfabriken Bayer, Leverkusen (Leiter Dr. H. WALTZ), aufgenommen. - Herrn Prof. H. DANNENBERG haben wir fur die Uberlassung von Steroiddehydrierungsprodukten als Ver- gleichspraparaten zu danken. - Die massenspektroskopischen Untersuchungen verdanken


wir Herrn Dr. G. SPITELLER sowie den ATLAS-Werken, Bremen, die das Gerat zurverfigung stellten. - Frau U. NEUMANN fuhrte die biologischen Teste durch und half mitUmsicht und Tatkraft bei den Aufarbeitungen. - Die DEUTSCHE FORSCHUNGSGEMEINSCHAFT, der FONDS DER CHEMISCHEN INDUSTRIE sowie die Firmen DEUTSCHE HOFFMANN-LAROCHE AG, FARBEN- FABRIKEN BAYER und SCHERING AG haben die vorliegende Arbeit finanziell unterstutzt; die Rontgenuntersuchungen wurden durch eine finanzielle Beihilfe der BADISCHEN ANILIN- & SODA-FABRIK gefordert.

BESCHREIBUNG D E R V E R S U C H E

Ecdyson

Isolierung: 1000 kg japanische Seidenspinner-Puppen wurden 1 Woche mit 75-proz. Me- thanol zum Quellen gebracht und dann in einem Fleischwolf gemahlen. Der anfallende Brei wurde mit 3000 I, dann 2mal mit je 2400 175-proz. Methanol extrahiert. Die Filtration dieses Materials gelang am besten mit einem groben Leinensack auf der Zentrifuge. Die vereinigten Methanolauszuge wurden nochmals mittels eines Leinenfilters geklart und bei 45 - 55"/15 Torr auf 600 I eingeengt. Aus dem wahigen Komentrat schieden sich bei 12stdg. Stehen- lassen 45 I d l ab, die abgetrennt wurden. Die waDrige Unterschicht wurde 4mal mit je 120 I n-Bufanol extrahiert. Die vereinigten Butanolphasen wurden der Reihe nach rnit 60 I Eis- wasser, 60 I 1-proz. Schwefelsaure, 3mal mit je 60 I 10-proz. NazCO3-Losung, 60 I Eis- wasser, 60 I 5-proz. Essigsaure und 100 I Eiswasser gewaschen. Die dann hellgelbe Butanol- losung wurde bei 25"/2 Torr auf 4.1 kg konzentriert.

Zur Anreicherung des Hormons haben wir den Butanolextrakt in 30 I Wasser gelost und 3mal mit je 6 I Petrolather ausgeschuttelt. Der Ruckstand der Petrolather-Phase war im Calliphora-Test inaktiv. Nach Einengen der Wasserphase im Rotationsverdampfer blieben 232 g gelber Sirup zuriick. Dieser wurde in 1 I Essigester/n-Butanol (5 : 1) an 3 kg A1203

(WOELM, Aktivitatsstufe V) chromatographiert (Frakt. 1). Eluiert wurde 3mal rnit je 9 I Essigester/n-Butanol = 5 : 1 (Fraktt. 2-4), 2mal mit je 9 I und 1 ma1 mit 18 I Essigester/Me- thanol = 3 : 1 (Fraktt. 5-7) und je 1 ma1 rnit 9 bzw. 12 I Methanol (Fraktt. 8 und 9). Die Fraktionen 2 - 7 (zusammen 36 g Ruckstand) enthielten die Hauptmenge der Hormonaktivi- tat. Das Substamgemisch wurde in einer Craig- Verteilung mit 24 Elementen aufgetrennt (je 20 ccm Ober- und Unterphase; System Essigester/Methanol/Wasser = 2: 1 :2). Die Frak- tionen 4- 12 enthielten 14.6 g Substanz rnit etwa 2500 CE/mg. Diese wurden in 1 I Essig- ester/n-Butanol (4 : 1) an 500 g A1203 (WOELM, Aktivitatsstufe V) chromatographiert. Die Fraktionen 3-5 (Elution rnit 21 Essigester/Methanol = 4 : 1 und 2mal je 2 I Methanol) wurden in einer Gegensfromverfeilung mit 24 Elementen (je 20 ccm Ober- und Unterphase; System Essigester/Methanol/Wasser = 2 : 1 : 2) getrennt. Aus den vereinigten Fraktionen 7- 11 kristallisierten 250 mg rohes Ecdyson aus.

Eigenschaffen: Das durch mehrfaches Umkristallisieren aus Wasser und dann aus Tetra- hydrofuran/Petrolather erhaltene reine, krisfallwasserfreie Ecdyson zeigte die folgenden Kon- stanten: Schmp. 242", Amax = 242 mp ( E = 12400), [a]F = 64.7 i 2" (c = 1.0, Athanol); Analysendaten vgl. Tab. 1 (S. 4). RF = 0.80 (wassergesattigtes n-Butanol auf Papier MACHEREY & NAGEL Nr. 2214ff, aufsteigend), im UV-Licht blaurot.


Dem aus Wasser abgeschiedenen krisrallwnsserlralfigert Ecdyson wird das Kristallwasser auch durch mehrtagiges Stehenlassen uber P205 i. Vak. bei -20" nicht vollig entzogen. Beim Erhitzen auf 1 S o i l 2 Torr wird das Kristallwasser abgegeben: Verlust bei 3 Bestimmungen 0.5- 1.5 Moll. H20/Mol. Ecdyson.

Reines Ecdyson reduziert ammoniakalische AgNO3-Losung, Triphenyltetrazoliumchlorid und ahnliche Reagentien nicht. Nachweise auf Zucker und Desoxyzucker fielen negativ aus. Das Hormon enthllt demnach keine Aldehyd-, a-Ketol- oder Glykosid-Gruppierungen. Doppelbindungen waren mit Tetranitromethan nicht nachzuweisen; bekanntlich reagieren aber a.?-ungesattigte Ketone gar nicht oder nur schwach mit diesem Reagens23). Ecdyson bildet kein Digitonid.

Derivate Ecdyson-2.4-dinitro-phenylhydrazon: 10 mg Ecdyson und 4.3 mg 2.4-Diniiro-phenylhydrarin

wurden in 0.4 ccm 0. In HCI + 2 ccm Methanol gelost. Nach einer Woche wurde mit Wasser verdunnt und das ausgefallene amorphe Produkt mit Essigester/Benzol an 5 g A1203 (WOELM, Aktivitatsstufe 1) chromatographiert. Die Elution mit Essigester lieferte 8.5 mg dunkelrote Substanz vom Schmp. 170-175" (Zen.), die leicht loslich in Essigester und Methanol war. Sie erwies sich papierchromatographisch (Papier: MACHEREY & NAGEL Nr. 2214ff, mit Di- methylformamid impragniert; System Benzol/Petrolather = 1 : 1) als einheitlich (RF = 0.63); Amax = 308.5 mp (a = 13.3) und 388 m p (a -= 39.3).

Ecdyson-5-jod-2.1-diniiru-phenylhydrazo1i: Je einige mg Ecdyson wurden mit dem nach- stehend beschriebenen 5-Jod-Z.4-dittirr~-phenylhydruzin einmal in 0.1 n HCI und bei einem zweiten Ansatz in Methanol/SO-proz. Essigsaure umgesetzt. Beide Ansatze lieferten nach der beim Ecdyson-2.4-dinitro-phenylhydrazon beschriebenen Aufarbeitung die gleiche amorphe, dunkelrote Substanz vom Schmp. 168".

C33H47JN409 (770.7) Ber. C 51.42 H 6.14 Gef. C 51.23, 51.41 H 5.73, 5.51

5-Jod-2.4-diniiro-phenylhydrazin: 2.5 g I-Chlor-5-jud-2.4-dinitro-benzol wurden mit 0.16 g wasserfreiem Phenylhydrazin in 50 ccm Athanol 3 Stdn. unter Ruckflue erhitzt. Nach Erkal- ten wurde das Kristallisat abgesaugt und aus Xthanol/Tetrahydrofuran umkristallisiert. Dunkelrote Prismen vom Schmp. 248". Die Substanz beginnt ab 200" zu sublimieren.

CsH5JN404 (324.0) Ber. C22.23 H 1.56 N 17.29 Gef. C22.94 H 1.51 N 17.29 Acefylierungg: 18 mg Ecdyson wurden in einem Gemisch aus 0.4 ccm Dioxan, 0.2 ccm

Pyridin und 0.1 ccm Acetanhjdrid 48 Stdn. bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach EingieRen in Wasser und Abdampfen der Losungsrnittel bei 30-40' verblieb ein weiDer Ruckstand. Wir erhielten durch Umkristallisieren aus Essigester/Petrolather 250 pg farblose groDe Platten vom Schmp. 214-216"; RF = 0.13 (in Hexan/Xylol == 3 : 1 , Papier: MACHEREY & NAGEL Nr. 2212& mit Dimethylformamid impragniert). Das IR-Spektrum zeigt einen Ester an, enthalt aber auBerdem noch eine starke Hydroxylbande.

Beim Eindampfen der Mutterlauge fielen 16 mg Mikrokristalle vom Schmp. 138-140" an. Die Acetylgruppen-Bestimmung ergab 17.77; CH3CO (ber. fur ein Diacetat: 15.3 % CH3C0, fur ein Triacetat : 21.3 2 CHjCO). Das uneinheitliche Produkt konnte papierchromatographisch (s. oben) in drei Acetate (RF = 0.30 bzw. 0.56 bzw. 0.13) getrennt werden.

23) I. OSTROMISSLENSKY, Ber. dtsch. chem. Ges. 43, 197 (1910).

Liebigs Ann. Chcm. Bd. 662 2


Ecdyson-p-jod-benzoat: 23 mg Ecdyson wurden mit 42 mg p-Jod-benzoylchlorid in I ccm absol. Pyridin 2 Stdn. lang auf 80" erhitzt und dann in 5 ccrn Wasser gegossen. Es wurde mit Ather extrahiert, die Atherphase rnit NaHCO3-Losung und Wasser gewaschen und einge- dampft. Der feste gelbe Riickstand (12 mg) hinterlieR beim Auswaschen mit Essigester 2 mg einer farblosen. krist. Substanz. Aus Tetrahydrofuran kristallisierten kleine verwachsene Prismen vom Schmp. 310". Das IR-Spektrum l in t einen aromatischen Ester erkennen. Die Substanz ist nach ihren Losungseigenschaften ein Mono-p-jod-benzoat. In dem lipophileren, nicht kristallisierten Riickstand diirfte ein Gemisch aus Di- und Triestern vorliegen.

Ecdyson-p-brom-benzoat: 17 mg wasserfreies Ecdyson wurden rnit 75 mg p-Brom-benzoylchlorid, 3.5 ccm Benzol und 3.5 ccm Pyridin 2 Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt. Dann wurde in Wasser gegossen und mit 2n H2S04 auf pH 2 gebracht. Der Essigesterextrakt dieser Losung lieferte 87 mg gelblichen Riickstand, der an 5 g ,41203 (WOELM, AktivitltsstufeV) chromatographiert wurde. Mit 85 ccm Benzol wurden 23.9 mg p-Brom-benzoesaureanhydrid (Schmp. 217-218") eluiert. Mit 85 ccm Benzol/Methanol (19: 1) wurden dann 29 mg Ecdy- son-p-brom-benzoat vom Schmp. 242" erhalten; RF = 0.90 (in wassergesattigtem n-Butanol). Das IR-Spektrum zeigt einen aromatischen Ester an.

Abbauprodukte Umwandlung mir Salzsaure: 20 mg Ecdyson wurden in 4 ccm Wasser t 4 ccm konz. Salz-

saure schnell iiber freier Flamme gelost. Nach wenigen Sekunden triibte sich das Gemisch, und beim Erkalten fielen 12 mg farbloses Rohkristallisat aus. Es wurde sofort abgesaugt und mit Wasser saurefrei gewaschen. Umkristallisieren aus waBrigem Methanol lieferte nach zwei Wochen 0.8 mg Prismen (Abbauprodukr A), die mechanisch von einigen angewachsenen Platten getrennt wurden: Schmp. 238-240" (nach Sintern bei 190-192"), A,,, = 293 m p (a = 33.2); IR-Spektrum vgl. Abb. 4a.

Ein Abbauprodukr B wurde durch vorsichtiges Eindampfen der wanrig-methanol. Mutter- lauge und Umkristallisieren aus Essigester/Petrollther erhalten : 3.5 mg farblose Platten vom Schmp. I55", A,,, = 244 und 248 m p (a = 36); IR-Spektrum vgl. Abb. 4 b.

Dehydrierung: In einem Rohrchen aus Jenaer Glas wurden 20 mg wasserfreies Ecdyson mit 20 mg frisch hergestellter Pd-Tierkohle innig vermischt und dann bei 0.05 Torr abgeschmol- Zen. Die Ampulle wurde im Metallbad 12 Stdn. auf 310" erhitzt. Beim Offnen war ein inten- siver Hexylalkohol-ahnlicher Geruch zu bemerken (Bruchstiick der Seitenkette!). Das Dehy- drierungsprodukt wurde mit Chloroform/Athanol extrahiert und dann auf Diinnschicht- Platten mit Kieselgel G (MERCK) chromatographiert. Nach Anwendung von Benzol als Lauf- mittel waren im UV-Licht etwa 20 einzelne Flecke zu unterscheiden. Die Hauptfraktion (RF = 0.74) zeigte eine starke, blaue Fluoreszenz (Vergleichssubstanzen : Phenanthren RF =

0.65; 3'.3'-Dimethyl-~yclopentadienophenanthren RF = 0.72).

Das gesamte Dehydrierungsprodukt wurde pruparativ auf 6 Diinnschichr-Platten getrennt und die Kieselgelschicht beim RF-Wert 0.74 im SOXHLET 48 Stdn. rnit Chloroform extrahiert. Wir erhielten aus der Chloroformlosung 2 mg Riickstand, der erneut einer Diinnschicht- chromatographie mit Benzol/Petrolather (1 : 9) an Kieselgel G unterworfen wurde. Im UV- Licht waren 4 fluoreszierende Flecke zu sehen (Abb. 5): RF = 0.45 (D I), 0.40 (D 2), 0.30


(D 3) und 0.10 (D 4); Rp-Werte von Vergleichssubstanzen s. Abb. 5 . Mit Chloroform 1ieDen sich etwa je 100 pg D 1 und D 2 extrahieren.

m i o l

D I D2

Abb. 5

1 2 3 4 5 6 7 F

L Abb. 6

Abbildung 5 . Diinnschichtchromatogramm der Hauptfraktion des Dehydrierungsprodukts von Ecdyson

Trager: Kieselgel G ; Laufrnittel: Benzol/Petrolather ( I : 9) 3 : Dehydrierungsgemisch (RF = 0.74) aus erster Dunnschichtchromatographie

Vergleichssubstanzen: 1 = Phenanthren, 2 = Cyclopentenophenanthren, 4 = 3-3’-Dimethyl- cyclopentadienophenanthren, 5 = 3’-Methyl-3‘-athyl-cyclopentenophenanthren.

Abbildung 6 . Papierchromatographische Auflosung und Identifizierung der Dehydrierungs- fraktion D I des Ecdysons

Papier: MACHEREY & NAGEL Nr. 221 2ff, mit Olivenol impragniert; FlieDmittel: Methanol/ Wasser (9 : I ) ; Laufzeit 132 Stdn.

4: Dehydrierungsfraktion D 1

Vergleichsubstanzen: 1 = 3.6-Dimethyl-cyclopentenophenanthren, 2 = 1.2.4-Trimethyt- phenanthren, 3 = 3’.3’-Dimethyl-~yclopentadienophenanthren, 5 = 3’-Methyl-cyclopentenophenanthren (Dnssche r Kohlenwasserstoff). 6 = 3’-Methyl-3‘-lthyl-cyclopentenophenan-

thren, 7 = Cyclopentenophenanthren.

Die auch nach der zweiten Dunnschichtchromatographie noch nicht vollig reine Sub- s imz D I lien sich selbst bci Verwendung anderer Losungsmittelsysteme auf Kieselgel G nicht weiter auftrennen. Ihr UV-Spektrum (Abb. 7) ist das einer substituierten Phenanthrens. Irn IR-Spektrum zeigen sich die zu erwartenden y-Schwingungen bei 747 und 810cm-1. - Im P~rpierchrotnnrugrtrrnm (Abb. 6) auf Olivenol-getrinktern Papier MACHEREY & NAGEL Nr. 22128 wurden mittels Methanol/Wasser (9 : I ) 4 Flecke erkennbar, deren einer in der Wanderungsstrecke mit 3’-Mef/zyl-cyclupe,trefiophe,inftr/zreft (DIELsscher Kohlenwasserstoff) iibereinstimmte, wlhrend ein zweiter dem Cyclopentenophenanthren entsprach.

Die Sirbsrnrrz D 2 (UV-Spektrum in Abb. 7) ist ein substituiertes Naphthalin, verunreinigt mit Substanz D 1 . Sie entsteht wahrscheinlich bei unvollstlndiger Dehydrierung des Ecdy- sons. - WeitereProdukte der Dehydrierungsreaktion konnten bisher nicht identifiziert werden.

2.


190 230 270 310 n i ! ~ 350

Abbildung 7. UV-Spektren der Fraktionen D 1 und D 2 aus dem Dehydrierungsprodukt des Ecdysons in Athanol

Vergleichssubstanz: - - - DrELsscher Kohlenwasserstoff

Vergleichssubstanzen 3a.7a.12a.24-Tetrahydroxy-24-merhyl-26.27-bisnor-koprostan. - 0.1 Mol Cholsaureme-

thylester. I C ~ H S O H ' ) lieD man in 200 ccm trockeneni Ather schnell zu einer Atherlosung von 0.8 Mol Methylmagnesiumjodid tropfen. Nach 1 Stde. wurde das Gemisch in verd. Salz- saure + Eis gegossen. Die Atherphase hinterlieB nach dem Abdampfen des Losungsmittels einen farblosen Sirup, der nach einigen Tagen kristallin wurde. Schmp. I 15' (aus waBrigem Methanol); [alk" = 28 5 2" (c = 1.0, Athanol). Das IR-Spektrum enthielt keine Carbonyl- bande mehr; das in perdeuteriertem Pyridin mit 60 Hz aufgenommene Protonenresonanz- spektrumzeigte diegefordertensignale fur dieEndgruppe derseitenkette bei 1.38 und 5.38ppm.

*) Cholsauremethylester ohne Kristall6sungsmittel lieB sich fur diese Reaktion nicht ver- wenden, da er sofort ein unlosliches, gut kristallisierendes Ather-Additionsprodukt bildete.

zur chemie des ecdysons

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