základné metódy práce s ľudskou dna
DESCRIPTION
Základné metódy práce s ľudskou DNA. Izolácia DNA. DNA - v jadre bunky - v komplexe s bielkovinami Postup: lýza bunkových membrán (SDS) štiepenie proteínov (proteináza K) odstránenie proteínov (fenol/chloroform) vyzrážanie DNA (etanol). Izolácia DNA kitom. Postup: - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
2005 Katedra molekulárnej biológie
Základné metódy práceZákladné metódy práce s ľudskou DNA s ľudskou DNA
Izolácia DNA
DNA - v jadre bunky - v komplexe s bielkovinami
Postup:1. lýza bunkových membrán (SDS)2. štiepenie proteínov (proteináza K)3. odstránenie proteínov
(fenol/chloroform)4. vyzrážanie DNA (etanol)
Postup:Postup:
1.1. lýza bunkových membrán a lýza bunkových membrán a štiepenie proteínovštiepenie proteínov
2.2. naviazanie DNA na kolónunaviazanie DNA na kolónu
3.3. premytie kolónypremytie kolóny
4.4. elúcia DNAelúcia DNA
5.5. precipitácia DNAprecipitácia DNA
Izolácia DNA kitom
Určovanie kvantity a kvality DNA
Spektrofotometricky 1. kvantita – OD pri 260 nm (1 OD ~ koncentrácia 50 μg/ml)2. kvalita – pomer OD pri 260/28nm (ideálne ~ 1,8)Elektroforézou1. kvantita – porovnaním so štandardom2. kvalita – určenie degradácie DNA
Elektroforéza DNA
Separačné média pre analýzu DNA
Agaróza separácia dvojvláknovej DNArozdiel vo veľkosti fragmentov od 10nt
Koncentrácia agarózy
[%]
Oblasťť efektívneho rozdelenia
molekúl DNA [kb]
0,3 60 - 5
0,6 20 - 1
0,7 10 - 0,8
0,9 7 - 0,5
1,2 6 - 0,4
2,0 3 - 0,1
Koncentrácia polyakrylamid
u [%]
Veľkosť DNA fragmentov v
nt
3,5 1000 - 2000
5 80 – 500
8 60 – 400
12 40 – 200
15 25 – 150
20 6 - 100
Polyakrylamid Separácia jednovláknovej a dvojvláknovej DNArozdiel vo veľkosti fragmentov od 1 nt
Vizualizácia DNA v géli
EtBr, SYBR Green (agarózový gél, polyakrylamnidový gél)
– interkalačné činidlo– dsDNA– UV lampa
AgNO3 (polyakrlylamidový gél)
– ssDNA a dsDNA– denné svetlo
Fluorescenčné farbičky (genetický analyzátor)
– kovalentná väzba farbičky na primer– ssDNA– laser a CCD kamera
Štiepenie DNA restrikčnými endonukleázami
enzýmy súčasťou RM systému baktériínázvy podľa pôvodu5´prečnievajúce konce, 3´prečnievajúce konce, tupé konce
Elektroforéza DNA po štiepení RE
Príprava rekombinantných DNA
Hybridizácia DNA
komplementarita bázTm (GC content)
Southernov blottinggenomická DNAštiepenie REelektroforézaoligonukleotidová sonda k unikátnej sekvencii
FISH technológiadetekcia numerických a štrukturálnych chromozómových aberáciífluorescenčne značené oligonukleotidové sondyfluorescenčný mikroskop
Microarray/ DNA chip
Hybridizácia fluorescenčne značenej, testovanej DNA s DNA sondou viazanou na detekčnom sklíčku
DNA microarray a DNA chip
možnosti aplikácie možnosti aplikácie technológiítechnológií DNA microarray a DNA microarray a DNA chipDNA chip
Polymerázová reťazová reakcia (PCR)
Kary B. Mullis - 1993 Nobelova cena
Princíp PCR
Verifikácia PCR amplifikácie
PCR odporúčané nastavenie
DNA – 50 – 500 ng
primery– 16 – 24 nt dlhé– Tm 48 – 65 ºC– GC content 40 – 60 %– 1 – 10 pmol/na
reakciu
dNTP– 50 - 500 μM
MgCl2– 1 – 5 mM
DNA polymeráza
– 0,5 – 2,5 U
úvodná denaturácia DNA
94 – 95 ºC 2 – 5 min
cyklické opakovanie – 25 - 35 x
denaturácia 94 – 95 ºC 30 – 40s
hybridizácia T = Tm – 3 ºC polymerizácia 72ºC 45s (do 1
kb)
záverečná polymerizácia
72 ºC 7 min
Chladenie/inaktivácia reakcie
4 – 10 ºC
Sekvenovanie (Sanger) 1
Sekvenovanie (Cycle sequencing)
Pyrosequencing