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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
RESISTÊNCIA À POLIMIXINA B EM BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS CARBAPENEMOS RESISTENTES ISOLADAS
EM HOSPITAIS DO RIO GRANDE DO NORTE
Fagner James Martins Dantas Costa
Dissertação de Mestrado
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Fagner James Martins Dantas Costa
RESISTÊNCIA À POLIMIXINA B EM BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS
CARBAPENEMOS RESISTENTE ISOLADAS EM HOSPITAIS DO RIO GRANDE
DO NORTE
Natal/RN
2017
Fagner James Martins Dantas Costa
Professor Orientador: Renato Motta Neto
RESISTÊNCIA À POLIMIXINA B EM BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS
CARBAPENEMOS RESISTENTES ISOLADAS EM HOSPITAIS DO RIO GRANDE
DO NORTE
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
como parte dos requisitos necessários para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.
Natal/RN
2017
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências - CB
Costa, Fagner James Martins Dantas. Resitência à polimixina B em bactéria Gram-negativas carbapenemos resistentes isoladas em hospitais do Rio Grande do NOrte CARBAPENEMOS RESISTENTES ISOLADAS EM HOSPITAIS DO RIO GRANDE DO NORTE / Fagner James Martins Dantas Costa. - Natal, 2017. 76 f.: il. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Orientador: Prof. Dr. Renato Motta Neto. 1. Bactérias Gram-negativas - Dissertação. 2. Polimixina B - Dissertação. 3. Resistência a Medicamentos - Dissertação. 4. Carbapenêmicos - Dissertação. I. Motta Neto, Renato. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BSE-CB CDU 579.841
Defesa da dissertação de mestrado do discente Fagner James Martins
Dantas Costa, intitulada “Resistência à polimixina B em bactérias Gram-
negativas carbapenemos resistentes isoladas em hospitais do Rio Grande do
Norte”, orientada pelo professor Dr. Renato Motta Neto, apresentado à banca
examinadora designada pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
da UFRN, em 30 de Março de 2017.
Os membros da Banca Examinadora consideram o candidato _________________.
Banca Examinadora:
___________________________________________________
(Prof. Dr. Renato Motta Neto)
___________________________________________________
(Prof. Dr. Umberto Laino Fulco)
___________________________________________________
(Profª. Dra. Ana Isabela Lopes Sales)
A Deus, por me conceder forças para
tornar possível essa jornada, por ser luz quando
o caminho se fez escuro e por colocar pessoas que
me incentivaram a desafiar percursos desconhecidos.
Aos meus familiares e amigos que acreditaram
quando ninguém mais acreditava.
Com AMOR e GRATIDÃO,
Eu dedico.
RESUMO
A resistência bacteriana figura hoje como um dos maiores problemas de
saúde pública mundial, onde a alta prevalência de infecções por Bacilos Gram-
Negativos (BGNs) e a sua disseminação no ambiente hospitalar, principalmente por
estirpes resistentes aos carbapenemos, sendo uma preocupação recorrente devido
ao sucesso adaptativo e habilidade em adquirir genes de resistência aos
antimicrobianos. Em razão da emergência desse transtorno aliado a dificuldade no
desenvolvimento de novas drogas, muitos autores postulam o retorno à era pré-
antibiótica, porém uma alternativa encontrada foi o retorno de antimicrobianos
abdicados, como as polimixinas. Para uma melhor compreensão da realidade
emergencial frente a fragilidade terapêutica dados epidemiológicos locais são
fundamentais, e pensando nisso optou-se em realizar um estudo no estado do Rio
Grande do Norte, cujo objetivo principal foi avaliar o perfil de resistência à polimixina
B em BGNs resistentes oriundos de amostras clínicas de centros de referência em
saúde. Foram coletadas 174 BGNs de pacientes infectados ou colonizados. Os
isolados foram submetidos a provas bioquímicas manuais para identificação das
espécies, análises fenotípicas confirmatórias (teste de Hodge modificado e
screening de metalo-β-lactamases) e a determinação da Concentração Bactericida
Mínima (CBM) à polimixina B, com isso os valores de CBM50 e CBM90 foram
calculados para cada espécie. Desses estirpes, 105(60,3%) foram confirmados
como produtores de metalo-β-lactamases, das quais mais da metade pertencíam ao
gênero Acinetobacter spp., outras espécies como Pseudomonas aeruginosa e
Klebsiella pneumoniae também expressaram o mesmo fenótipo. Quanto a
susceptibilidade à polimixina B, 53(30,5%) foram resistentes a polimixina B, com
CBMs variando de ≥4μg/mL até ≤64μg/mL. Espera-se que esses resultados possam
ser ampliados e utilizados como referência a nível estadual, prevenindo a dispersão
dessa resistência e que sirva também como mais um dado nacional para a
construção de um perfil mais fidedigno no que diz respeito à epidemiologia dessa
resistência que apesar de rara já aponta sua emergência.
Palavras-chave: Bactérias Gram-negativas; Polimixina B;
Resistência a Medicamentos; Carbapenêmicos;
ABSTRACT
Bacterial resistance is now one of the major public health problems in the
world. High prevalence of Gram-negative bacilli (GNBs) infections and their spread in
the hospital environment, mainly by carbapenem resistant strains is a recurrent
concern due to its adaptive success and the ability to acquire more antimicrobial
resistance genes. In this panoramana, the emergence of resistance to carbapenems
and the difficulty in developing new drugs, many authors postulate a return to the
pre-antibiotic era, Although a more sustainable alternative found was a return of
abdicated antimicrobials, such as polymyxins. For a better understanding of the
emergency reality in the trend of the therapeutic fragility, local epidemiological data
are fundamental. In order to provide data, we carried out an unpublished study in the
state of Rio Grande do Norte, whose main objective was to evaluate the profile of
polymyxin B resistance in bacilli Gram-negative carbapenem resistant from clinical
samples from health reference centers. 174 BGNs were collected from infected or
colonized patients. These isolates were submitted to a manual biochemical tests for
species identification, confirmatory phenotypic analysis (modified Hodge assay and
metallo-β-lactamases selection) and determination of the Minimum Bactericidal
Concentration (MBC) to polymyxin B were performed, values of CBM50 and CBM90
were calculated for each species. Of these strains, 105 (60.3%) were confirmed as
producers of metallo-β-lactamases, more than half among to the genus
Acinetobacter spp. Other species such as Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella
pneumoniae also expressed the same phenotype. Regarding susceptibility to
polymyxin B, 53 (30.5%) were resistant to polymyxin B, with CBMs ranging from
≥4μg / mL to ≤64μg / mL. It is hoped that these results can be extended and used as
a reference at a State level, preventing the dispersion of this resistance and also
serving as a more national data to build a more reliable profile regarding the
epidemiology of this resistance that despite rare already points out its emergency.
Keywords: Gram-negative bacteria; Polymyxin B; Drug resistance;
Carbapenems;
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Linha do Tempo da Introdução de Antimicrobianos e suas Resistências
...................................................................................................................................14
Figura 2 - Parede Celular Gram-negativa..................................................................19
Figura 3 - Estrutura cíclica lipopeptídica da polimixina B. Colistina (polimixina E) uma
(D-Leu) substituí uma (D-Phe)...................................................................................27
Figura 4 - Modo de interação da Polimixina B com as membrana
bacterianas.................................................................................................................29
Figura 5 - Mecanismo de resistência a Polimixinas por modificações no
LPS.............................................................................................................................30
Figura 6 - Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos.............................................38
Figura 7 - Teste de Hodge modificado positivo.........................................................39
Figura 8 - Teste de Metalo-beta-lactamase positivo..................................................40
Figura 9 - Microplaca para determinação da Concentração Bactericida Mínima
(CBM).........................................................................................................................41
Figura 10 - Distribuição de frequência dos isolados por espécime biológico. ..........45
Figura 11 - Frequência percentual dos isolados caracterizados fenotipicamente
como KPC..................................................................................................................47
Figura 12 - Distribuição das cepas do estudo com relação a sensibilidade à
polimixina B................................................................................................................48
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Relação das cepas controles usadas nos testes empregados...............37
Tabela 2 - Distribuição da frequência dos 174 espécimes do estudo.....................46
Tabela 3 - Distribuição das cepas produtoras de MBL de acordo com a espécie
bacteriana.................................................................................................................48
Tabela 4 - Distribuição das frequências cumulativas das CIMs para as 100 cepas
isoladas de pacientes infectados. ...........................................................................49
Tabela 5 - Distribuição das frequências cumulativas das CIMs para as 74 cepas
isoladas de pacientes colonizados. .........................................................................49
LISTA DE ABREVIATURAS AmpC - Ampicilinases (Betalactamases da classe C) ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária ATCC - American Type Culture Collection BHI - Brain Heart Infusion BGN - Bacilo Gram negativo BKC-1 - Brazilian Klebsiella carbapenemase CBM - Concentração Bactericida Mínima CBM50 - Concentração Bactericida Mínima capaz de matar 50% das bactérias CBM90 - Concentração Bactericida Mínima capaz de matar 90% das bactérias CIM - Concentração Inibitória Mínima CIM50 - Concentração Inibitória Mínima capaz de inibir 50% das bactérias CIM90 - Concentração Inibitória Mínima capaz de inibir 90% das bactérias CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute CTX-m - Betalactamase ativa contra Cefotaxima EDTA - Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Ácido Etilenodiamino Tetra-acético) ESBL - Extended Spectrum Beta-Lactamase (Beta-Lactamase de Espectro Ampliado) IMP - Imipenemase IRAS - Infecções Relacionadas à Assistência em Sáude LABMIC - Laboratório de Micobactérias LPS - Lipopolissacarídeo KPC - Klebsiella pneumoniae carbapenemase MBL - Metallo-beta-Lactamase (Metalo-beta-lactamase) MHT - Modified Hodge Test (Teste de Hodge Modificado) NDM - New Dehli metallo-beta-lactamase (Nova Déli metalo-beta-lactamase) OMS - Organização Mundial da Saúde OXA - Oxacilinase (Betalactamases ativas contra Oxacilina) PBP - Penicillin Binding Proteins (Proteínas Ligadoras de Penicilina) SPM - São Paulo metalo-beta-lactamase TSA - Teste de Susceptibilidade aos Antimicrobianos UTI -Unidades de Terapia Intensiva
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................14
2. REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................................18
2.1 OS BACILOS GRAM-NEGATIVOS E AS INFECÇÕES NOSOCOMIAIS .......................19
2.2 CARACTERÍSTICAS GERAIS DA PAREDE CELULAR DAS BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS ..........................................................................................................................19
2.2.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS ENTEROBACTÉRIAS .............................20
2.2.2 CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS Pseudomonas aeruginosa .......................21
2.2.3 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO Acinetobacter spp. .....................................22
2.3 RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS EM BACILOS GRAM-NEGATIVOS ................................................................................................................................................23
2.3.1 AS CEFALOSPORINAS E A RESISTÊNCIA ATRÁVES DA PRODUÇÃO DE β-LACTAMASES .......................................................................................................................24
2.3.2 OS CARBAPENEMOS E A RESISTÊNCIA ATRÁVES DA PRODUÇÃO DE β-LACTAMASES .......................................................................................................................24
2.3.3 METALO-β-LACTAMASES ...............................................................................26
2.4 POLIMIXINAS ..................................................................................................................27
2.4.1 MECANISMO DE AÇÃO DAS POLIMIXINAS ...................................................29
2.4.2 MECANISMO DE RESISTÊNCIA AS POLIMIXINAS .......................................30
3. OBJETIVOS ......................................................................................................................33
3.1 OBJETIVO GERAL ..........................................................................................................34
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...........................................................................................34
4. METODOLOGIA ...............................................................................................................35
4.1 TIPO DE ESTUDO ..........................................................................................................36
4.2 AMOSTRA BACTERIANA - CARACTERIZAÇÃO, LOCAL E PERÍODO DA COLETA .................................................................................................................................... ..........36
4.3 IDENTIFICAÇÃO DOS BACILOS GRAM NEGATIVOS E ESTOCAGEM ..................... 37
4.4 LINHAGENS CONTROLE ..............................................................................................38
4.5 PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS .......................................40
4.5.1 CONFIRMAÇÃO FENOTÍPICA DA PRODUÇÃO DE BETA-LACTAMASES DO TIPO CARBAPENEMASES ...................................................................................................40
4.5.1.1 TESTE DE HODGE MODIFICADO (MHT) .........................................40
4.5.1.2 DETERMINAÇÃO PRESUNTIVA DA PRODUÇÃO DE METALO-BETA-LACTAMASES (MBL) - TESTE DIFUSÃO EM DUPLO DISCO - TESTE FENOTÍPICO DE BLOQUEIO ENZIMÁTICO ...............................................................................................40
4.6 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) DE POLIMIXINA B - REALIZADA ATRÁVES DO MÉTODO DE MICRODILUIÇÃO EM CALDO ................................................................................................................................................41
5. RESULTADOS ..................................................................................................................45
5.1 CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS .........................................................................46
5.2 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA ................................................................................47
5.2.1 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA PARA A PRODUÇÃO DE CARBAPENEMASES DO TIPO KPC ....................................................................................47
5.2.2 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA PARA A PRODUÇÃO DE CARBAPENEMASES DO TIPO METALO-β-LACTAMASES (MBL) .....................................48
5.3 ANÁLISE DA SUSCEPTIBILIDADE À POLIMIXINA B - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CBM) ..............................................................49
6. DISCUSSÃO ......................................................................................................................52
7. CONCLUSÕES...................................................................................................................62
8. ANEXOS ............................................................................................................................64
9. REFERÊNCIAS .................................................................................................................70
14
INTRODUÇÃO
A resistência bacteriana é um problema de saúde pública emergencial em
todo o mundo. A disseminação de clones multirresistentes e de genes de resistência
aos antimicrobianos compreende
últimos relatórios da Organização Mundial da Saúde (OMS) e das agências de
controle sanitário e vigilância epidemiológica no mundo todo demonstra
crescente preocupação a respeito desse problema (ANVISA,
Desde o primeiro uso de cada novo antimicrobiano ou classe de
antimicrobiano, o que tem se seguido é a emergência de resistência a esse
componente. Com o advento da produção em massa dos antimicrobianos desde
1940, o resultado foi sempre sem precede
pressao seletiva. Poucos anos após a introdução da penicilina por volta de 1945, um
hospital em Londres reportou o índice de 38% de resistência à penicilina em
Staphylococcus aureus
antimicrobianos tem sido seguida sucessivamente por uma emergência de
resistência global frequentemente iniciando no ambiente hospitalar, como ilustra a
Figura 1, a seguir.
Figura 1 - Linha do Tempo da Introdução de Antimicrobianos e suas Resistências (Fonte: MOLTON et al., 2013
Adaptada)
As cefalosporinas de espectro ampliado (ceftiaxona e ceftazidima) foram
introduzidas no início de 1980. E já por volta de 1985, houve descrições
de uma betalactamases de especto ampliado (ESBL) em isolados de
A resistência bacteriana é um problema de saúde pública emergencial em
todo o mundo. A disseminação de clones multirresistentes e de genes de resistência
aos antimicrobianos compreende uma ameaça recorrente (ROSSI, et. al, 2011). Os
últimos relatórios da Organização Mundial da Saúde (OMS) e das agências de
controle sanitário e vigilância epidemiológica no mundo todo demonstra
crescente preocupação a respeito desse problema (ANVISA, 2013).
Desde o primeiro uso de cada novo antimicrobiano ou classe de
antimicrobiano, o que tem se seguido é a emergência de resistência a esse
componente. Com o advento da produção em massa dos antimicrobianos desde
1940, o resultado foi sempre sem precedentes a seleção de cepas resistentes por
pressao seletiva. Poucos anos após a introdução da penicilina por volta de 1945, um
hospital em Londres reportou o índice de 38% de resistência à penicilina em
(BARBER et al., 1948). Cada intro
antimicrobianos tem sido seguida sucessivamente por uma emergência de
resistência global frequentemente iniciando no ambiente hospitalar, como ilustra a
Linha do Tempo da Introdução de Antimicrobianos e suas Resistências (Fonte: MOLTON et al., 2013
As cefalosporinas de espectro ampliado (ceftiaxona e ceftazidima) foram
introduzidas no início de 1980. E já por volta de 1985, houve descrições
de uma betalactamases de especto ampliado (ESBL) em isolados de 15
A resistência bacteriana é um problema de saúde pública emergencial em
todo o mundo. A disseminação de clones multirresistentes e de genes de resistência
uma ameaça recorrente (ROSSI, et. al, 2011). Os
últimos relatórios da Organização Mundial da Saúde (OMS) e das agências de
controle sanitário e vigilância epidemiológica no mundo todo demonstra-se a
2013).
Desde o primeiro uso de cada novo antimicrobiano ou classe de
antimicrobiano, o que tem se seguido é a emergência de resistência a esse
componente. Com o advento da produção em massa dos antimicrobianos desde
ntes a seleção de cepas resistentes por
pressao seletiva. Poucos anos após a introdução da penicilina por volta de 1945, um
hospital em Londres reportou o índice de 38% de resistência à penicilina em
(BARBER et al., 1948). Cada introdução de novos
antimicrobianos tem sido seguida sucessivamente por uma emergência de
resistência global frequentemente iniciando no ambiente hospitalar, como ilustra a
Linha do Tempo da Introdução de Antimicrobianos e suas Resistências (Fonte: MOLTON et al., 2013 -
As cefalosporinas de espectro ampliado (ceftiaxona e ceftazidima) foram
introduzidas no início de 1980. E já por volta de 1985, houve descrições pela Europa
de uma betalactamases de especto ampliado (ESBL) em isolados de Klebsiella
16
pneumoniae e Escherichia coli . Durante os anos de 1980 e 1990, K. pneumoniae
portando ESBL do tipo blaTEM, blaSHV se tornaram disseminadas
predominantemente no ambiente hospitalar principalmente em Infecções
Relacionadas a Assistência a Saúde (IRAS). Mais tarde ESBL do tipo blaCTX-m
proliferaram por volta dos anos 2000, inicialmente em infecções comunitárias por E.
coli e nosocomiais por espécies de Klebsiella spp (LIVERMORE, et al., 2012).
Bactérias resistentes aos carbapenemos são um problema crescente em todo
o mundo. Baixos níveis de resistência aos carbapenemos podem ocorrer na
presença de altos índices de betalactamases do tipo AmpC ou ESBL combinado
com a deficiência de porinas. Altos níveis de resistência é primariamente mediado
por carbapenemases. A carbapenemase KPC foi primeiro identificada na Carolina do
Norte em 1996, e pouco tempo depois foi responsável por surtos em Nova Iorque
(NORDMANN, et al., 2011).
No Brasil, de acordo com o Ministério da Saúde, mais de 70% das bactérias
que causam IRAS são resistentes a pelo menos um dos antimicrobianos comumente
utilizados para o tratamento dos pacientes (ANVISA, 2015). Os problemas
relacionados à resistência bacteriana, principalmente em bacilos Gram-negativos
parecem ser mais importantes no Brasil e em outros países da América Latina
quando comparados a outras regiões do mundo como Europa e Estado Unidos, fato
relatado por estudos feito pelo programa de vigilância em resistência epidemiológica
SENTRY (SADER et al., 2001).
Dentro dessa realidade as bactérias Gram-negativas multirresistentes, além
de serem as que mais sofrem modificações no sentido de adquirir resistências, são
também as protagonistas dos quatro tipos mais comuns de infecções: como a
pneumonia, infecções de sítio cirúrgico, infecções do trato urinário e infecções de
corrente sanguínea (ANVISA, 2015). Quando se avalia as opções terapêuticas para
o tratamento dessas infecções por bactérias Gram-negativas produtoras de
carbapenemases o panorama é estarrecedor (NEONAKIS et al., 2011) Nossa mais
importante arma contra a disseminação de patógenos multirresistentes são
intensificar programas de controle da infecção, vigilância epidemiológica e controle
do uso de antimicrobianos (MOLTON et al., 2013).
17
Em razão disso, foi realizado um estudo no munícipio de Natal/RN, cujo
objeto principal foi avaliar a ocorrência fenotípica de resistência à polimixina B em
isolados de bactérias Gram-negativas carbapenemos resistentes, coletadas em
centros de referência em saúde no estado do Rio Grande do Norte, assim como
avaliar a Concentração Bactericida Mínima (CBM) desses microrganismos a esse
composto.
18
REFERENCIAL TEÓRICO
19
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 OS BACILOS GRAM-NEGATIVOS E AS INFECÇÕES NOSOCOMIAIS
Os bacilos Gram-negativos possuem frequências diversas para os seus
quatros tipos mais comuns de Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde
(IRAS), conhecidas como infecções nosocomiais, dentre elas encontram-se:
pneumonia, infecções de sítio cirúrgico, infecções do trato urinário e infecções de
corrente sanguínea (GAYNES et al., 2005; ANVISA, 2015).
Estudos brasileiros tem mostrado que as principais espécies Gram-negativas
relacionadas as IRAS são: Acinetobacter baumannii, Enterobacter spp., Escherichia
coli, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa (GALES et al., 2012; ROSSI
et al., 2011). Esses bacilos Gram-negativos estão comumente associados com
infecções hospitalares em Unidades de Terapia Intensivas (UTIs) (GAYNES et al,
2005).
Pacientes em cuidado crítico apresentam uma maior predisposição a
infecções hospitalares variadas, especialmente por organismos multirresistentes,
devido à complexidade dos cuidados nos centros de terapia intensiva, intervenções
múltiplas (incisões, inserções de cateteres, traqueostomia e outros corpos
estranhos) e fatores relacionados ao próprio paciente (estado imunológico, idade,
diagnóstico clínico) (OLIVEIRA, 2010).
2.2 CARACTERÍSTICAS GERAIS DA PAREDE CELULAR DAS BACTÉRIAS
GRAM-NEGATIVAS
As espécies bacterianas são divididas em dois grandes grupos, denominados
Gram-positivos e Gram-negativos, sendo a distinção laboratorial entre elas feita
atráves da reação de coloração de Gram. As diferenças presentes na estrutura de
parede celular correspondem à essência do processo de coloração. A parede celular
de Gram-negativos é uma estrutura em multicamadas e bastante complexa,
enquanto que a de Gram-positivos é normalmente muito espessa, consistindo quase
que totalmente de um único tipo de molécula
2010).
Em bactérias Gram
cerca de 10% da parede celular é constituído de peptideoglicano. A maior parte da
parede celular é composta de membrana externa, correspondendo a uma segunda
bicamada lipídica, composta por polissacarídeos além de fosfolípideos e proteínas.
Os lipídeos e os polissacarídeos e
complexo importante denominado camada lipopolissacarídica ou simplesmente LPS,
sendo estas estruturas mostradas na figura 2
Figura 2 - Parede Celular Gram
2.2.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS ENTEROBACTÉRIAS
Os membros da família Enterobacteriaceae, es
normal dos seres humanos e são capazes de causar infecções em vários órgãos,
que os tornam potenciais agentes de infecções hospitalares. Principalmente porque
são capazes de adquirir e disseminar plasmídeos com múltiplos genes de
resistência, dificultando tratamento dessas infecções no ambiente hospitalar
(NOGUEIRA, 2011).
que totalmente de um único tipo de molécula - peptideoglicano
Em bactérias Gram-negativas, como por exemplo, Escherichia
ede celular é constituído de peptideoglicano. A maior parte da
parede celular é composta de membrana externa, correspondendo a uma segunda
bicamada lipídica, composta por polissacarídeos além de fosfolípideos e proteínas.
Os lipídeos e os polissacarídeos estão ligados na membrana externa, formando um
complexo importante denominado camada lipopolissacarídica ou simplesmente LPS,
sendo estas estruturas mostradas na figura 2 (MADIGAN, et. al, 2010)
Parede Celular Gram-negativa. (Extraído do Madigan et al., Microbiologia de Brock
CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS ENTEROBACTÉRIAS
a família Enterobacteriaceae, estão presentes na microbiota
normal dos seres humanos e são capazes de causar infecções em vários órgãos,
que os tornam potenciais agentes de infecções hospitalares. Principalmente porque
são capazes de adquirir e disseminar plasmídeos com múltiplos genes de
resistência, dificultando tratamento dessas infecções no ambiente hospitalar
20
peptideoglicano (MADIGAN, et. al,
Escherichia coli, somente
ede celular é constituído de peptideoglicano. A maior parte da
parede celular é composta de membrana externa, correspondendo a uma segunda
bicamada lipídica, composta por polissacarídeos além de fosfolípideos e proteínas.
stão ligados na membrana externa, formando um
complexo importante denominado camada lipopolissacarídica ou simplesmente LPS,
(MADIGAN, et. al, 2010).
biologia de Brock, 2010 - 12ª ed.)
CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS ENTEROBACTÉRIAS
tão presentes na microbiota
normal dos seres humanos e são capazes de causar infecções em vários órgãos, o
que os tornam potenciais agentes de infecções hospitalares. Principalmente porque
são capazes de adquirir e disseminar plasmídeos com múltiplos genes de
resistência, dificultando tratamento dessas infecções no ambiente hospitalar
21
As enterobactérias possuem exigências nutricionais simples, são
fermentadoras da glicose, reduzem o nitrato a nitrito, não formam esporos, podem
ser móveis ou imóveis, crescem em condições aeróbias ou anaeróbias, são
catalase-positivas e oxidase-negativas (ANVISA, 2004).
A maioria das infecções causadas por enterobactérias têm como agentes
infecciosos, um pequeno número de espécies, são elas: E. coli, K. pneumoniae,
Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes e Serratia
marcescens. As espécies anteriormente citadas podem estar associadas a uma
série de doenças humanas extra-intestinais, tais como: infecções urinárias,
pneumonias associadas a ventilação mecânica, pneumonias nosocomiais em
pacientes pediátricos (ZAR, COTTON, 2002), septicemia neonatal (GUPTA, 2003;
FLOKAS, et. al, 2017), infecções de feridas em pé diabético (MOTTA, et al., 2003),
endocardite e meningite pós-cirúrgica (SANDERS; SANDERS, 1997).
2.2.2 CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa é um microrganismo Gram-negativo, aeróbio e
ubíquo, sendo raramente causador de doenças em pessoas saudáveis, porém é
uma das principais espécies bacterianas relacionadas em infecções nosocomiais
(HANCOCK, SPEERT, 2000). Com relação as infecções hospitalares, a espécie P.
aeruginosa evoluiu de um patógeno prioritariamente isolado em feridas e
queimaduras para se tornar uma das principais ameaças no ambiente hospitalar
(ROSSI, et. al, 2016).
Sua importância como patógeno se deve pela expressão de múltiplos
mecanismos de resistência, dificultando a ação de antibacterianos, ocasionando
elevados índices de morbidade e mortalidade (HANCOCK, SPEERT, 2000;
SHAHCHERAGHI et. al, 2009)
Na América Latina espécies de Pseudomonas spp. são responsáveis por
7,5% das infecções de corrente sanguínea, por 31,2% dos casos de pneumonia e
por 13,8% das infecções de pele e dos tecidos moles (GALES et. al, 2012).
22
2.2.3 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO Acinetobacter spp.
O gênero Acinetobacter inclui organismos Gram-negativos estritamente
aeróbicos e não fermentadores de açúcares, atualmente possui 51 nomes válidos de
espécies (EUZÉBY, 2016), sendo que pelo menos 16 dessas já foram descritas
causando infecções em humanos (NEMEC, et. al, 2011).
O complexo A. calcoaceticus-baumannii compreende o grupo que pertencem
as espécies mais frequentemente isoladas em humanos, sendo essas muitas vezes
responsáveis por mais de 75% dos isolados de Acinetobacter spp. em amostras
clínicas (HENWOOD, et. al, 2002). Esse grupo ainda figura como as espécies mais
implicadas em infecções nosocomiais em todo o mundo, apesar desses patógenos
serem considerados oportunistas, eles também estão relacionados com diversas
infecções comunitárias (CARVALHEIRA, et. al, 2016; PELEG, et. al, 2008;
LENHARD, et. al, 2016).
Acinetobacter baumannii é classificada como a quarta espécie bacteriana
mais comumente encontrada em infecções sanguíneas em adultos, decorrência do
uso de cateteres, muito utilizados em pacientes hospitalizados em Unidades de
Terapia Intensica (UTIs) (Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), 2013.
Além disso, este microrganismo está associado com uma variedade de
complicações clínicas, tais como pneumonia, sepse, infecções de pele e meningites,
especialmente em pacientes imunossuprimidos ou com doenças de base grave
(LEE, et. al, 2007).
Devido a sua incrível habilidade em resistir a quase todos os agentes
antimicrobianos atualmente disponíveis na clínica, as infecções por Acinetobacter
spp. são difíceis de serem tratadas. De fato, isolados desse gênero tem
demonstrado altíssimas frequências de multirresistência (ROSSI, et. al, 2016).
Espécies do gênero Acinetobacter spp. expressa de maneira intrínseca, assim como
também de maneira adquirida, muitos genes envolvidos na expressão de sua
patogenicidade (PELEG, et. al, 2008). Recentemente um estudo de sequenciamento
do genoma envolvendo a espécie A. baumannii, demonstrou que alguns derivados
tem pelo menos vinte e oito ilhas genômicas codificando genes de resistência a
23
determinandos antibióticos, o que explica as altas taxas de morbidade e mortalidade
associadas a infecções por esse patógeno (DAVIES, DAVIES, 2010).
2.3 RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS EM BACILOS GRAM-
NEGATIVOS
A descoberta dos antimicrobianos revolucionou a medicina em diversos
aspectos, salvando incontáveis vidas, passando a ser altamente utilizados nos
tratamentos terapêuticos. Diante desse elevado uso, várias melhorias na produção
desses agentes proporcionaram redução nos custos, tornando-os mais acessíveis e
incentivando o uso sem prescrição médica (DAVIES, DAVIES, 2010).
Geralmente o tratamento de infecções sistêmicas causadas por
microrganismos Gram-negativos dispõe de cefalosporinas de 3º e 4º geração,
quinolonas, antimicrobianos associados à inibidores de beta-lactamases,
aminoglicosídeos e carbapenêmicos (ROSSI, ANDREAZZI, 2005).
A correlação entre o uso de antimicrobianos e aparecimento de resistência é
especialmente aparente na classe dos β-lactâmicos, os quais são inativados pelas
enzimas β-lactamases. Como exemplo representante dessa classe temos a
penicilina que, posteriormente a sua descoberta, passou a ser produzida em larga
escala, tornou-se disponível para uso geral e veio a ser amplamente utilizada.
Concomitante ao seu uso, os isolados bacterianos apresentando resistência
tornaram-se mais prevalentes (DAVIES, DAVIES, 2010).
Os primeiros relatos de infecções por bactérias Gram-negativas resistentes,
reportados no Brasil e disponíveis no Pubmed, são restritos a infecção de
comunidade. Esses relatos são de resistência à sulfadiazina em E. coli, Shigella e
Salmonella e são datadas de 1968 (FERNANDES, TRABULSI, 1968). Em 1971 a
resistência a Cloranfenicol foi reportada em Salmonella Typhi detectada em vários
estados brasileiros e Shigella spp. resistente à múltiplos antimicrobianos foi
reportada no Rio de Janeiro (COSTA, HOFER, 1971). Nesse período, resistência
aos β-lactâmicos era somente reportada à ampicilina (SAMPAIO, GALES, 2016).
24
2.3.1 AS CEFALOSPORINAS E A RESISTÊNCIA ATRÁVES DA PRODUÇÃO DE
β-LACTAMASES
A terceira geração das cefalosporinas se tornou disponível para uso clínico no
Brasil no início dos anos 80. Porém na prática médica, a resistência às
cefalosporinas de terceira geração entre as enterobactérias foi observada desde
1985, mas o primeiro relato publicado desse achado em hospitais brasileiros foi
ocorreu somente em 1994, descrevendo já mais de 50% de resistência à cefepime
entre os isolados de Enterobacteriaceae ceftazidima resistentes (JONES,
MARSHALL, 1994). Essa foi a primeira publicação indicando a presença de β-
lactamases de espectro estendido (ESBL) no Brasil. Em 1997, a primeira
confirmação da produção de ESBL em enterobactérias foi descrita (GALES, et. al.,
1997). Os autores documentaram a presença de ESBL em 72 isolados clínicos da
espécie K. pneumoniae, em hospitais públicos e privados nos estados do Rio de
Janeiro e São Paulo, todos os isolados foram sensíveis ao imipenem. (GALES, et.
al., 1997; SAMPAIO, GALES, 2016).
O primeiro estudo molecular com ESBL no Brasil saiu em 2000, evidenciando
predominantemente genes blaCTX-M. (BONNET, et. al., 2000). Subsequentemente
estudos epidemiológicos evidenciaram a crescente frequência na produção de ESBL
entre as enterobactérias isoladas de pacientes. Em 2000, a frequência na produção
de ESBL em K. pneumoniae coletada em unidades de terapia intensiva foi de 59.2%,
enquanto que a frequência da produção para Enterobacter spp. e E. coli foi de
19,5% e 14,6%, respectivamente (MENDES, et. al., 2000; SAMPAIO, GALES, 2016).
2.3.2 OS CARBAPENEMOS E A RESISTÊNCIA ATRÁVES DA PRODUÇÃO DE
β-LACTAMASES
A escolha terapêutica para pacientes com infecções hospitalares graves
utilizando-se antibióticos de amplo espectro de atividade, como os carbapenêmicos,
deve-se a sua ótima permeabilidade atráves da membrana externa bacteriana e
estabilidade frente a muitas β-lactamases (GALES et al., 2003). Entretanto, essa
opção acaba por exercer maior pressão seletiva sobre a microbiota hospitalar,
25
ocasionando seleção natural de bactérias resistentes ao imipenem e disseminação
de clones (DAVIES, DAVIES, 2010).
Pouquíssimos estudos no Brasil descrevem a frequência de ampicilinases,
betalactamases da classe C (AmpCs) plasmidiais na família Enterobacteriaceae,
entretanto AmpCs plasmidiais são de grande importância epidemiológica, visto que
resistência aos carbapenemos pode ocorrer concomitantemente com alterações de
permeabilidade e super expressão de AmpCs (SAMPAIO, GALES, 2016).
De acordo com os últimos relatos dos programas de vigilância sobre a
resistência aos carbapenêmicos entre as espécies de Acinetobacter spp. oriundos
de Unidades de Terapia Intensiva, dados divulgados pela ANVISA afirmam que no
Brasil os índices de resistência à esse composto, nesse gênero, é de 80,7%. Indíces
elevados também foram encontrados em estudos realizados na Europa, pelo Centro
Europeu de Prevenção e Controle de Doenças (European Centers for Disease
Prevention and Control - ECDC) e nos Estados Unidos, pelo Centro de Prevenção e
Controle de Doenças (Centers for Disease Control and Prevention - CDC), onde a
resistência foi de 90,6% e 63,0%, respectivamente. Infelizmente, a alta frequência da
aquisição de mecanismos de resistência aos carbapenêmicos, têm limitado e
impossibilitado o tratamento ideal de infecções por A. baumannii (LENHARD, et. al,
2016).
Recentemente, uma nova classe de carbapenemase, nomeada (Brazilian
Klebsiella carbapenemase - BKC-1) foi descrita no Brasil (NICOLLETI, et. al, 2015).
Ela foi encontrada apenas em K. pneumoniae em baixa frequência, possivelmente
devido ao fato de que o gene blaBKC-1 é localizado numa região de baixa
transferência, em um plasmídeo não conjugativo (NICOLLETI, et. al, 2015;
SAMPAIO, GALES, 2016).
Em razão da emergência de bactérias resistentes aos carbapenêmicos e a
dificuldade no desenvolvimento de novas drogas (TILLOTSON, 2008), muitos
autores têm previsto um retorno à era pré-antibiótica, postulando a volta de
antimicrobianos abdicados até recentemente (DAVIES, DAVIES, 2010). Porém uma
alternativa mais sustentável é o estudo de combinações de antibióticos que
alcançem efeitos sinérgicos (LENHARD, et. al, 2016).
26
Infelizmente, a aquisição de mecanismos de resistência a carbapenemos
obscureceu o tratamento ideal de bactérias Gram-negativas multirresistentes como
infecções causadas pelo A. baumannii. Para combater a crescente prevalência de A.
baumannii resistente a carbapenemos, os clínicos são agora obrigados a utilizar uma
polimixina [colistina ou polimixina B (PMB)] como fármaco de último recurso. No
entanto, o surgimento da heterorresistência de colistina e a crescente frequência de
resistência à polimixina precipitaram a busca de combinações de polimixina que
provocam maior destruição bacteriana do que é possível com uma polimixina isolada
(LENHARD et al., 2016).
2.3.3 METALO-β-LACTAMASES
As metalo-beta-lactamases pertencem a classe molecular B de Ambler de
acordo com a proposta de Ambler (1980) e são classificadas como grupo 3 com
base nas suas propiedades bioquímicas na proposta de Bush-Jacoby-Medeiros
(1995). As metalo-beta-lactamases são caracterizadas por sua habilidade de
hidrolisar os carbapenêmicos, penicilinas, cefalosporinas e apresentarem
resistência aos inibidores de beta-lactamases, sendo sensíveis apenas ao
monobactâmico, aztreonam. Elas necessitam de íons de zinco (Zn+2) ou outros
cátions divalentes como cofator para sua atividade catalítica normal no sítio ativo da
enzima, sendo portanto inibidas por agentes quelantes de íons metálicos, como o
ácido etileno-diamino-tetrácetico (EDTA) (QUEENAN E BUSH, 2007).
A primeira metalo-beta-lactamase foi descrita em 1966 no cromossomo de
bactérias ambientais e patógenos oportunistas como Aeromonas spp., Bacilus
cereus e Stenotrophomonas maltophilia (QUEENAN E BUSH, 2007; ROSSI, 2011).
Mais tarde, no início dos anos 90, houveram diversas detecções de genes de
resistência descritos em patógenos clinicamente importantes que não produzem
naturalmente tais enzimas, como Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. e gêneros
da família Enterobacteriaceae. Estes novos genes foram encontrados em estruturas
genéticas, que fornecem mobilidade aos genes, fazendo com que essas passasem
a ser conhecidas como metalo-beta-lactamases movéis ou adquiridas (MENDES et
al., 2006).
27
O primeiro relato de metalo-beta-lactamase adquirida em um patógeno de
importância clínica é datado de 1991, no Japão, em um isolado de Pseudomonas
aeruginosa, resistente ao imipenem e aos outros antimicrobianos anti-pseudomonas
(WATANABE, 1991). Desde então inúmeras outras metalo-beta-lactamases estão
sendo identificadas e atualmente são conhecidos oito tipos (IMP, GIM, VIM, SPM,
NDM, SIM, AIM, KHM), sendo as mais comum: IMP (imipenemase), VIM (Verona
imipenemase), SPM (São Paulo metalo-beta-lactamase), GIM (German
imipenemase), SIM (Seoul imipenemase), NDM (New Dehli metalo-beta-lactamase)
(QUEENAN E BUSH, 2007).
No Brasil, o primeiro relato da ocorrência de MBL adquirida ocorreu em 2002,
porém o determinante da resistência não foi caracterizado (PELLEGRINO, 2002).
Mais tarde, em 2003, uma variante de IMP foi relatada em cepas de Acinetobacter
baumannii (GALES et al, 2003).
Em razão da disseminação de bactérias produtoras de MBL em diferentes
regiões do mundo, se fez necessário aplicar testes simples e de baixo custo para
identificar cepas produtoras de MBLs, com objetivo de evitar a disseminação desses
clones e também como forma de auxiliar na terapêutica adequada. No Brasil a
ANVISA, preconizou em 2013, a partir da identificação das primeiras NDMs no país,
a realização de testes de bloqueio enzimático, utilizando inibidores de metalo-beta-
lactamases para realização em enterobactérias com resistência ou halo de inibição
intermediário para pelo menos um dos carbapenêmicos testados (GALETTI, 2010).
2.4 POLIMIXINAS
As polimixinas são uma família de lipopeptídeos cíclicos isoladas do Bacillus
polymyxa. Demonstram excelente atividade antimicrobiana contra uma gama de
bactérias Gram-negativas (PARUSSOLO, et. al, 2011). Quanto as suas estruturas
químicas, as polimixinas são lipopeptídeos cíclicos não ribossomais - que estão
ilustradas na figura 3. O núcleo decapeptídico das polimixinas contém um ciclo
intramolecular de heptapéptideos ligado a amido entre o grupo amino da cadeia
lateral do resíduo de ácido diaminobutírico (Dab) na posição 4 e o grupo carboxil no
resíduo de treonina C-terminal. Eles também possuem várias outras características
28
estruturais distintivas, incluindo cinco resíduos não proteogênicos de Dab que são
carregados positivamente à pH fisiológico, resíduos hidrofóbicos conservados nas
posições 6 e 7 e um grupo acil N-terminal (ROBERTS et. al, 2015) O decapeptídeo
presente nas duas polimixinas diferem em apenas um aminoácido; uma D-leucina da
colistina é relocada por um fenilalanina em polimixina B(VARDAKAS, FALAGAS,
2015).
Figura 3 - Estrutura cíclica lipopeptídica da polimixina B. Colistina (polimixina E) uma (D-Leu) substituí uma (D-Phe). (Extraído de Trimble et al., 2016).
Primeiramente descobertas em 1947 e introduzidas na clínica no final da
década de 50, o seu uso na prática clínica foi interrompido na década de 70 devido
ao seus potenciais tóxicos, principalmente nefrotóxico (ROBERTS, et. al, 2015). À
medida que as polimixinas foram incorporadas na prática clínica, rapidamente foi
descoberto que, ao contrário das observações iniciais, esses compostos eram
capazes de causar altas frequências de disfunções renais, especialmente quando
administrado em altas concentrações e dosagens. Por essa razão, a polimixina B e a
colistina foram retiradas para dar lugar a novas drogas, mais seguras. Devido à
inserção dessas novas terapêuticas, as poucas pesquisas que vinham sendo
realizadas com as polimixinas subsequentemente cessaram (POGUE, et. al, 2016).
Polimixina B
29
Ao final do século 20, em uma era de emergência de bactérias
multirresistentes a ausência de novos antimicrobianos, antigos e anteriormente
negligenciados como a polimixina B e a colistina (polimixina E), as duas formas de
polimixinas comercialmente disponíveis, ressurgiram nos últimos vinte anos como
uma classe de antimicrobiano essencial, sendo atualmente as únicas com atividade
contra bacilos Gram-negativos multirresistentes, como Acinetobacter baumannii,
Pseudomonas aeruginosa e Enterobacteriaceae, tendo seu uso feito com sucesso e
frequência variáveis em diversas regiões do mundo (POGUE, et. al, 2016;
ROBERTS, et. al, 2015; VARDAKAS, FALAGAS, 2016). As polimixinas retornaram
menos tóxicas devido ao uso de novas práticas clínicas que possibilitaram o
melhoramento dessa classe de fármaco, tornando-os mais seguros para uso
terapêutico (TRIMBLE, et. al, 2016).
Na verdade, quando o uso de beta-lactâmicos, amiglicosídeos ou
fluoroquinolonas é ineficaz, o uso de polimixinas, especialmente colistina, serve
como tratamento alternativo (NIKOO,et. al, 2017). Porém mesmo após o
melhoramento do fármaco, os problemas de toxicidade envolvendo as polimixinas
ainda continuam um importante limitador do uso terapêutico, pois estudos clínicos
recentes relatam que nefrotoxicidade associada ao uso de polimixinas pode ocorrer
na ordem acima de 60% dos pacientes, quando administradas de maneira
intravenosa; sendo a nefrotoxicidade o principal fator limitante da dose para seu uso
clínico ótimo. Além disso, doses abaixo da dose ótima, podem promover a
emergência de resistência a polimixinas (ROBERTS, et. al, 2015).
2.4.1 MECANISMO DE AÇÃO DAS POLIMIXINAS
As polimixinas se ligam ao lipopolissacarídeo (LPS) e moléculas de
fosfolipídeos na membrana externa das bactérias Gram-negativas, levando a
mudanças de permeabilidade no arcabouço da célula, extravassamento de contéudo
intracelular e consequentemente morte celular (NIKOO, et. al, 2017). O modo de
interação da polimixina B com as membranas bacterianas está ilustrado na figura 4 a
seguir:
30
Figura 4 - Modo de interação da Polimixina B com as membrana bacterianas. Polimixina B interage com a porção do lipídeo A, do LPS, na membrana externa. Os peptídeos cruzam a membrana atráves do mecanismo de auto-captação e interagem com a membrana citoplasmática inibindo a energização celular, e possivelmente levando a inibição da divisão celular e⁄ou permeabilização da membrana citoplasmática com subsequente morte celular (Extraído de Trimble et al., 2016 - com modificações).
Polimixinas não possuem atividade contra bactérias Gram-positivas e
anaeróbicas, mas são efetivos contra a maioria dos bacilos Gram-negativos,
incluindo os mais relevantes clinicamente como os membros da família
Enterobacteriaceae e espécies não fermentadoras de açúcares. Entre os membros
da família Enterobacteriaceae, temos Citrobacter spp., Enterobacter spp, E.coli,
Klebsiella spp., Salmonella spp. e Shigella spp., as quais são frequentemente
susceptíveis. Acinetobacter spp. e P. aeruginosa são ambos naturalmente
susceptíveis à polimixina B e colistina (TRIMBLE, et. al, 2016; NIKOO, et. al, 2017).
2.4.2 MECANISMO DE RESISTÊNCIA ÀS POLIMIXINAS
A resistência dos microrganismos às polimixinas não está completamente
elucidada, podem ocorrer através dos mecanismos de mutação ou adaptação
(SKIADA et al., 2011).
Peptideoglicano
Membrana Citoplasmática
Polimixina B
31
Na maioria das bactérias Gram-negativas, os dois componentes PhoP/Q e
PmrA/B regulam sistemas que medeiam a resistência às polimixinas por regular
mecanismos que causam modificações químicas na estrutura do LPS bacteriano
(Figura 5). Este sistema regula a resistência por alterar a carga catiônica da parede
celular em resposta a baixos valores de peptídeos antimicrobianos, Mg+2 e Ca+2 e
outros indutores como baixo pH,excesso de Fe+3, excesso de Al+3 e fagossomos.
Coletivamente essas modificações reduzem a carga negativa da membrana externa
bacteriana e, portanto, resultam na diminuição da afinidade da polimixina para a
superfície das células bacterianas (TRIMBLE, et. al, 2016).
Figura 5 - Mecanismo de resistência a Polimixinas por modificações no LPS. O sistema de dois componentes PhoQP, ativa a expressão de pmrD. PmrD ativa PmrA, o qual ativa cptA e pmr e o opéron arn. Juntamente com o EptB o CptA provoca alterações no polissacarídeo cerne do LPS. Os produtos pmr e arn promovem susbstituições dos fosfatos do lipídeo A, por Petn e L-ara4N, respectivamente. Coletivamente, essas alterações provocam mudanças na carga da membrana externa, resultando em repulsão da polimixina (Extraído de Trimble et al., 2016).
Pseudomonas aeruginosa possuí um mecanismo de resistência diferente
atuando atráves de sensores quinase cbrA de dois componentes que respondem a
reações de fonte de carbono e repressão catabólica afetando adaptativamente a
resistência à polimixina B por alterar a expressão transcricional dos opérons oprH-
phoPQ, pmrAB e opéron arn, que são responsáveis por modificações na estrutura do
LPS (YEUNG et al., 2011).
32
Até a presente data dois mecanismos de resistência à polimixinas foram
caracterizados em A. baumannii. O primeiro envolve uma modificação na membrana
do LPS através da adição de fosfoetanilamina no motivo do lípideo A, em um
processo mediado por um sistema de dois componentes PmrAB. Mutações
nucleotídicas únicas e/ou a expressão aumentada de pmrA ou pmrB conduzem a
uma regulação positiva da pmrC, a qual, por sua vez, produz fosfetanolamina
transferase, responsável pela modificação no lípido A. Outro mecanismo de
resistência à polimixina descrito em A. baumannii é a perda completa do LPS devido
a mutações nucleotídicas únicas na lpxA, um componente do operon da biossíntese
de LPS. As mutações nos outros genes da via de biossíntese de LPS, tais como
lpxC e lpxD, foram também relatadas em estirpes de laboratório derivadas de A.
baumannii resistentes à polimixina (GIARDELLO, et. al, 2016).
33
OBJETIVOS
34
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Determinar a Concentração Bactericida Mínima (CBM) à polimixina B em
bacilos Gram-negativos, carbapenemos resistentes, obtidos de espécimes clínicos e
de culturas de vigilância de pacientes internos em dois centros de referência em
saúde no estado do Rio Grande do Norte.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterizar fenotipicamente as cepas produtoras de Metalo-β-
lactamase.
Determinar in vitro o valor da CBM50 e CBM90 para polimixina B em
espécies de bacilos Gram-negativos resistentes aos carbapenemos.
35
METODOLOGIA
36
4. METODOLOGIA
4.1 - TIPO DE ESTUDO
Trata-se de um estudo transversal e descritivo, no qual participaram como
sujeitos, espécimes bacterianos de bacilos Gram-negativos, carbapenemos
resistentes, pertencentes a família Enterobacteriaceae e aos gêneros Pseudomonas
spp. e Acinetobacter spp., recrutados de dois centros de saúde referência no
Estado, o Hospital Universitário Onofre Lopes e o Hospital de Doença Infecto-
contagiosas Giselda Trigueiro, ambos localizados no município de Natal-RN.
Protocolo do Comitê de Ética:
Os procedimentos realizados neste trabalho foram concernidos pelo Comitê de Ética
em Pesquisa (CEP Central) da UFRN sob parecer consubstanciado em 20 de Junho
de 2015 sob nº 1.097.658, em anexo.
4.2 - AMOSTRA BACTERIANA - CARACTERIZAÇÃO, LOCAL E PERÍODO DA
COLETA
As cepas bacterianas analisadas nesse estudo foram adquiridas em dois
períodos de tempos diferentes - descritos nos dois parágrafos seguintes. Como
critério de inclusão para o estudo foi avaliado a identificação de resistência a um ou
mais carbapenêmicos dentre os testados (Meropenem e Imipenem). O número
amostral utilizado foi subdividido com relação ao que diz respeito à doença
(infecção) e colonização, sendo aqui caracterizado como primeira e segunda parcela
amostral, respectivamente.
A primeira parcela da amostragem analisada, ou seja aquelas oriundas de
pacientes com infecção bacteriana, foram isoladas de espécimes biológicos
(aspirado traqueal, sangue, feridas, secreções, líquor, urina e diversos outros),
recrutados atráves de demanda espontânea de dois dos centros de saúde referência
no Estado, no período compreendido de Janeiro de 2013 até Outubro de 2014.
Já a segunda parcela da amostragem foi coletada por membros dessa
pesquisa diretamente de paciente internados em UTIs há mais de 7 dias, nos
37
mesmos centros de saúde especificados acima, no período de Maio de 2015 até
Agosto de 2016, sendo essa amostragem obtida a partir de culturas de vigilância, ou
seja semeios de swabs das regiões (axilar, retal e nasal).
Portanto, participaram do estudo 174 cepas bacterianas de origem hospitalar e
culturas de vigilância, sendo:
Cem cepas provenientes do primeiro recrutamento de amostragem (2013-2014),
em pacientes de todas as alas hospitalares e de diferentes espécimes biológicos.
Setenta e quatro cepas provenientes do segundo recrutamento de amostragem
(2015-2016), exclusivamente de pacientes internados há mais de 7 dias em UTIs.
4.3 - IDENTIFICAÇÃO DOS BACILOS GRAM NEGATIVOS E ESTOCAGEM
Para o isolamento e identificação de bacilos Gram-negativas anaeróbias
facultativas e aeróbias estritas no LABMIC, foram utilizados meios e procedimentos
recomendados por Koneman et al.(2008).
Após a confirmação das características coloniais e morfotintoriais (coloração
de Gram), e afinidade de crescimento em meios de cultura, foram realizadas as
seguintes provas: produção de pigmento e atividade de citocromo-oxidase (para
identificação de bactérias não fermentadoras), crescimento em ágar tríplice açúcar-
ferro (TSI), produção de Sulfeto de hidrogênio, prova do Indol e Motilidade (SIM),
prova da utilização de citrato, prova da descarboxilação dos aminoácidos arginina,
ornitina e lisina, produção de urease, prova do Vermelho de Metila (VM) e produção
de fenilalanina desaminase (para a identificação de enterobactérias) (KONEMAN et
al., 2008).
Imediatamente após o isolamento e identificações, as cepas isoladas que
atenderam o critério de inclusão do estudo, foram todas estocadas em duplicata.
Para a estocagem bacteriana, alçadas pesadas de colônias isoladas do
microrganismo previamente identificado foram resuspendidas em dois eppendorf
contendo 1ml de BHI (Brain Heart Infusion Broth) (HIMEDIA) acrescido de 10% de
glicerol e 0,01ml de amoxicilina (1x10-4µg/ml) cada, para conservação da estrutura
bacteriana e promover uma pressão seletiva positiva para que haja conservação dos
genes de resistência plasmidiais. Posteriormente esses
armazenados no freezer
4.4 - LINHAGENS CONTROLE
A relação das cepas controles usadas nos nossos experimentos estão
descritas na Tabela 1 a seguir:
Tabela 1 . Relação das cepas controles usadas nos testes empregados
Nota: Procedência das cepas controle: (Laboratório de Pesquisa em Infecção Hospitalar/LAPIH
4.5 - TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
Para cada cepa bacteriana do estudo, provenientes do primeiro recrutamento,
foi realizado um antibiograma pelo método de disco
conforme ilustrado na figura 6,
conforme recomendado pelo CLSI 2016.
genes de resistência plasmidiais. Posteriormente esses
armazenados no freezer sob temperatura de (-20 ⁰C).
ENS CONTROLE
relação das cepas controles usadas nos nossos experimentos estão
descritas na Tabela 1 a seguir:
. Relação das cepas controles usadas nos testes empregados
Nota: Procedência das cepas controle: a Adquirida comercialmente;
b Doadas por Marise Dutra Asensi
(Laboratório de Pesquisa em Infecção Hospitalar/LAPIH-Fiocruz-RJ)
TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
Para cada cepa bacteriana do estudo, provenientes do primeiro recrutamento,
foi realizado um antibiograma pelo método de disco-difusão em Ágar (Kirby
na figura 6, a seguir, utilizando Ágar Mueller
endado pelo CLSI 2016.
38
genes de resistência plasmidiais. Posteriormente esses eppendorfs eram
relação das cepas controles usadas nos nossos experimentos estão
. Relação das cepas controles usadas nos testes empregados
Doadas por Marise Dutra Asensi
TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
Para cada cepa bacteriana do estudo, provenientes do primeiro recrutamento,
difusão em Ágar (Kirby-Bauer),
a seguir, utilizando Ágar Mueller-Hinton (HIMEDIA),
Figura 6 - Teste de Susceptibilidade aos Antimicrobianos (TSA). (FONTE: ANVISA)
Os espécimes cujos pontes de corte para os carbapenemos testados,
Meropenem 10µg, Imipenem 10µg e Ertapenem 10µg
resistência, foram triados em testes fenotípicos específicos para detecção da
produção de carbapenemases, foram eles: o teste de Hodge modificado e do teste
de bloqueio enzimático para avaliação da produção de metalo
conformidade com o CLSI 2015 e a
respectivamente. Para garantir o controle de qualidade do teste foi utilizado a cepa
E.coli ATCC 25922.
Com relação às cepas bacterianas, provenientes do segundo recrutamento,
realizado pelo método de disco difusão a análise da susceptibilidade frente aos
carbapenemos. Os espécimes cujos pontes de corte para os carbapenemos
testados, Meropenem 10µg, Imipenem 10µg e Ertapenem 10µg
qualidade de resistência, foram
detecção da produção de carbapenemases, foram eles: o teste de Hodge modificado
e do teste de bloqueio enzimático para avaliação da produção de metalo
lactamases, em conformidade com o CLSI 2015 e a Nota té
ANVISA, respectivamente. Para garantir o controle de qualidade do teste foi utilizado
a cepa E.coli ATCC 25922.
Teste de Susceptibilidade aos Antimicrobianos (TSA). (FONTE: ANVISA)
Os espécimes cujos pontes de corte para os carbapenemos testados,
Meropenem 10µg, Imipenem 10µg e Ertapenem 10µg, indicaram a qualidade de
, foram triados em testes fenotípicos específicos para detecção da
produção de carbapenemases, foram eles: o teste de Hodge modificado e do teste
de bloqueio enzimático para avaliação da produção de metalo
conformidade com o CLSI 2015 e a Nota técnica nº01/2013
respectivamente. Para garantir o controle de qualidade do teste foi utilizado a cepa
Com relação às cepas bacterianas, provenientes do segundo recrutamento,
realizado pelo método de disco difusão a análise da susceptibilidade frente aos
carbapenemos. Os espécimes cujos pontes de corte para os carbapenemos
Meropenem 10µg, Imipenem 10µg e Ertapenem 10µg
qualidade de resistência, foram triados em testes fenotípicos específicos para
detecção da produção de carbapenemases, foram eles: o teste de Hodge modificado
e do teste de bloqueio enzimático para avaliação da produção de metalo
lactamases, em conformidade com o CLSI 2015 e a Nota té
ANVISA, respectivamente. Para garantir o controle de qualidade do teste foi utilizado
ATCC 25922.
39
Teste de Susceptibilidade aos Antimicrobianos (TSA). (FONTE: ANVISA)
Os espécimes cujos pontes de corte para os carbapenemos testados,
, indicaram a qualidade de
, foram triados em testes fenotípicos específicos para detecção da
produção de carbapenemases, foram eles: o teste de Hodge modificado e do teste
de bloqueio enzimático para avaliação da produção de metalo-β-lactamases, em
/2013 da ANVISA,
respectivamente. Para garantir o controle de qualidade do teste foi utilizado a cepa
Com relação às cepas bacterianas, provenientes do segundo recrutamento, foi
realizado pelo método de disco difusão a análise da susceptibilidade frente aos
carbapenemos. Os espécimes cujos pontes de corte para os carbapenemos
Meropenem 10µg, Imipenem 10µg e Ertapenem 10µg, indicaram a
triados em testes fenotípicos específicos para
detecção da produção de carbapenemases, foram eles: o teste de Hodge modificado
e do teste de bloqueio enzimático para avaliação da produção de metalo-β-
lactamases, em conformidade com o CLSI 2015 e a Nota técnica nº01/2013 da
ANVISA, respectivamente. Para garantir o controle de qualidade do teste foi utilizado
4.5.1 - CONFIRMAÇÃO FENOTÍPICA DA PRODUÇÃO DE BETA
LACTAMASES DO TIPO CARBAPENEMASES
4.5.1.1- TESTE DE HODGE MODIFICADO (MHT)
As cepas da família Enterobacteriaceae previamente caracterizadas como não
susceptíveis a pelo menos um carbapenêmico (Ertapenem, Meropenem ou
Imipenem) foram submetidas ao teste de Hodge modificado (MHT) seguindo as
diretrizes do CLSI 2015, a fim de identificar potenciais produtores de
carbapenemase. Foram consideradas potenciais produtoras de carbapenemase
amostras que favoreceram o crescimento da cepa
disco do carbapenêmico, como pode ser ob
qualidade do teste foram utilizadas as cepas de
controle positivo Klebsiella pneumoniae
4.5.1.2- DETERMINAÇÃO PRESUNTIVA DA PRODUÇÃO DE METALO
Figura 7 - Teste de Hodge modificado positivo
CONFIRMAÇÃO FENOTÍPICA DA PRODUÇÃO DE BETA
LACTAMASES DO TIPO CARBAPENEMASES
TESTE DE HODGE MODIFICADO (MHT)
As cepas da família Enterobacteriaceae previamente caracterizadas como não
susceptíveis a pelo menos um carbapenêmico (Ertapenem, Meropenem ou
Imipenem) foram submetidas ao teste de Hodge modificado (MHT) seguindo as
rizes do CLSI 2015, a fim de identificar potenciais produtores de
carbapenemase. Foram consideradas potenciais produtoras de carbapenemase
amostras que favoreceram o crescimento da cepa E. coli ATCC 25922 próximo ao
disco do carbapenêmico, como pode ser observado na figura 7.
qualidade do teste foram utilizadas as cepas de E. coli ATCC 25922 e a cepa
Klebsiella pneumoniae CCBH 4955.
DETERMINAÇÃO PRESUNTIVA DA PRODUÇÃO DE METALO
Teste de Hodge modificado positivo. (Fonte: Acervo do Autor - LABMIC
40
CONFIRMAÇÃO FENOTÍPICA DA PRODUÇÃO DE BETA-
As cepas da família Enterobacteriaceae previamente caracterizadas como não
susceptíveis a pelo menos um carbapenêmico (Ertapenem, Meropenem ou
Imipenem) foram submetidas ao teste de Hodge modificado (MHT) seguindo as
rizes do CLSI 2015, a fim de identificar potenciais produtores de
carbapenemase. Foram consideradas potenciais produtoras de carbapenemase
ATCC 25922 próximo ao
servado na figura 7. Para controle de
ATCC 25922 e a cepa
DETERMINAÇÃO PRESUNTIVA DA PRODUÇÃO DE METALO-
LABMIC-DMP/UFRN)
BETA-LACTAMASES (MBL)
FENOTÍPICO DE BLOQUEIO ENZIMÁTICO
As cepas de bacilos Gram
susceptíveis a pelo menos um carbapenêmico
analisadas por teste de disco difusão em ágar
submetidas ao teste de bloqueio enzimáti
lactamases, seguindo as normativas da nota técnica nº1 de 2013 da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), a fim de identificar possíveis produtores
de metalo-beta-lactamases.
(10µg) e outro de meropenem (10µg), posicionados paralelos a dois outros discos de
imipenem e meropenem acrescidos com 10µL de EDTA. Foram consideradas como
possíveis produtores de metalo
diferença de diâmetro ≥ 5 mm para o carbapen
ao carbapenêmico sem EDTA, como pode ser observado na figura 8
4.6 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CBM)
PARA A POLIMIXINA B
MICRODILUIÇÃO EM CALDO
Figura 8 - Teste de Metalo-beta
LACTAMASES (MBL) - TESTE DIFUSÃO EM DUPLO DISCO
FENOTÍPICO DE BLOQUEIO ENZIMÁTICO
As cepas de bacilos Gram-negativos previamente caracterizadas como não
susceptíveis a pelo menos um carbapenêmico (Meropenem ou Imipenem),
analisadas por teste de disco difusão em ágar - método de Kirby Bauer, foram
teste de bloqueio enzimático - inibição da produção de metalo
lactamases, seguindo as normativas da nota técnica nº1 de 2013 da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), a fim de identificar possíveis produtores
lactamases. O teste consiste na utilização de um disco de imipenem
(10µg) e outro de meropenem (10µg), posicionados paralelos a dois outros discos de
imipenem e meropenem acrescidos com 10µL de EDTA. Foram consideradas como
possíveis produtores de metalo-beta-lactamases os isolados que apresentar
≥ 5 mm para o carbapenêmico acrescido do EDTA em relação
ao carbapenêmico sem EDTA, como pode ser observado na figura 8
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CBM)
PARA A POLIMIXINA B - REALIZADA ATRÁVES DO MÉTODO DE
MICRODILUIÇÃO EM CALDO
beta-lactamase positivo.(Fonte: Acervo do Autor -
41
TESTE DIFUSÃO EM DUPLO DISCO - TESTE
negativos previamente caracterizadas como não
(Meropenem ou Imipenem),
método de Kirby Bauer, foram
inibição da produção de metalo-beta-
lactamases, seguindo as normativas da nota técnica nº1 de 2013 da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), a fim de identificar possíveis produtores
o de um disco de imipenem
(10µg) e outro de meropenem (10µg), posicionados paralelos a dois outros discos de
imipenem e meropenem acrescidos com 10µL de EDTA. Foram consideradas como
lactamases os isolados que apresentaram uma
êmico acrescido do EDTA em relação
ao carbapenêmico sem EDTA, como pode ser observado na figura 8 a seguir.
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CBM)
REALIZADA ATRÁVES DO MÉTODO DE
- LABMIC-DMP/UFRN)
As cepas bacterianas de bacilos Gram
como não susceptíveis a pelo menos um carb
foram submetidas à avaliação da susceptibilidade à polimixina B pelo método de
microdiluição em caldo realizado segundo critérios estabelecidos pelo CLSI 2015
ISO 20776-1:2006. A microdiluição em caldo recebe esse nome,
de pequenos volumes de caldo dispensados sobre placa de microdiluição de 96
poços estéril.
Para realização do procedimento as amostras foram recuperadas em caldo BHI
a 36ºC por 18h antes do teste. Foram distribuídas em placa de microtitulação de 96
poços, 0,1 mL de caldo BHI (HIMEDIA™) concentração dupla, segundo metodologia
adaptada de acordo com técnica descrita
aos quais foram acrescentadas 0,1mL de diversas concentrações de diluições
logarítmicas (0,5 μg/mL, 1,0 μg/mL, 2,0 μg/mL, 4,0 μg/mL, 8,0 μg/mL, 16,0 μg/mL,
32,0 μg/mL e 64,0 μg/mL
seguida foi dispensado 10
turvação equivalente a 0,5 da escala de M
Gram-negativos testados
amostra. A microplaca conforme
± 2ºC por 24h.
Figura 9 - Microplaca para determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM)
As cepas bacterianas de bacilos Gram-negativos, previamente caracterizadas
como não susceptíveis a pelo menos um carbapenêmico (Meropenem ou Imipenem)
avaliação da susceptibilidade à polimixina B pelo método de
microdiluição em caldo realizado segundo critérios estabelecidos pelo CLSI 2015
. A microdiluição em caldo recebe esse nome,
de pequenos volumes de caldo dispensados sobre placa de microdiluição de 96
Para realização do procedimento as amostras foram recuperadas em caldo BHI
a 36ºC por 18h antes do teste. Foram distribuídas em placa de microtitulação de 96
poços, 0,1 mL de caldo BHI (HIMEDIA™) concentração dupla, segundo metodologia
om técnica descrita por Koo et al. (2000) e Duarte et al. (2003)
aos quais foram acrescentadas 0,1mL de diversas concentrações de diluições
0,5 μg/mL, 1,0 μg/mL, 2,0 μg/mL, 4,0 μg/mL, 8,0 μg/mL, 16,0 μg/mL,
32,0 μg/mL e 64,0 μg/mL) do antimicrobiano Polimixina B (SIGMA ALDRICH™).
seguida foi dispensado 10μL nos poços de suspensão bacteriana,
urvação equivalente a 0,5 da escala de Mac Farland (PROBAC™)
negativos testados, tendo o teste sido realizado em dupl
conforme ilustrada na figura 9, a seguir, foi incubada em 35ºC
Microplaca para determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM)
42
negativos, previamente caracterizadas
(Meropenem ou Imipenem)
avaliação da susceptibilidade à polimixina B pelo método de
microdiluição em caldo realizado segundo critérios estabelecidos pelo CLSI 2015 -
. A microdiluição em caldo recebe esse nome, pois envolve o uso
de pequenos volumes de caldo dispensados sobre placa de microdiluição de 96
Para realização do procedimento as amostras foram recuperadas em caldo BHI
a 36ºC por 18h antes do teste. Foram distribuídas em placa de microtitulação de 96
poços, 0,1 mL de caldo BHI (HIMEDIA™) concentração dupla, segundo metodologia
por Koo et al. (2000) e Duarte et al. (2003),
aos quais foram acrescentadas 0,1mL de diversas concentrações de diluições
0,5 μg/mL, 1,0 μg/mL, 2,0 μg/mL, 4,0 μg/mL, 8,0 μg/mL, 16,0 μg/mL,
crobiano Polimixina B (SIGMA ALDRICH™). Em
bacteriana, ajustando-se à
d (PROBAC™) dos bacilos
zado em duplicata para cada
foi incubada em 35ºC
Microplaca para determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM)
43
Decorrido o tempo foram realizados os semeios de cada um dos poços com as
concentrações do antimicrobiano em meio ágar Muller-Hinton (HIMEDIA™) e
novamente os semeios foram incubados em estufa por 24h em temperatura média
de em 35ºC ± 2ºC. Seguidamente os testes foram verificados a nível de crescimento
bacteriano, relacionando cada resultado com a concentração do antibiótico a qual a
cepa bacteriana foi submetida, determinando-se assim, a concentração bactericida
mínima (CBM). A CBM é definida como a menor concentração do agente
antimicrobiano em μg/mL que completamente causa a morte do inóculo (ação
bactericida).
Toda a metodologia foi controloda para obtenção de resultados confiáveis e
reprodutíveis. Pra cada placa de 96 poços uma coluna incluiu uma amostra de
controle positivo, Klebsiella pneumoniae cedida pela FIOCRUZ, com susceptibilidade
determinada de 8 μg/mL e uma outra coluna sem adição da suspensão bacteriana,
funcionando como um controle negativo e de qualidade para o teste. Para prevenir
que as suspensões dispensadas nas placas de microdiluição ressecassem, cada
placa foi cuidadosamente coberta com tampa de plástico antes da incubação.
Como ainda não existem categorias interpretativas recomendadas pelo CLSI
para avaliar a CBM assim como por nenhum órgão de vigilância epidemiológica. As
categorias interpretativas aqui utilizadas foram as de concentração inibitória mínima
(CIM). Elas estão incluídas nas tabelas relativas a cada grupo de organismos e
baseiam-se nos dados de avaliação descritos pelo CLSI. As categorias
classificatórias para polimixina B, extraídas do CLSI 2016, são aqui mostradas e
definidas:
Sensível - Significa que uma infecção por uma determinada cepa pode
ser tratada adequadamente com a dose habitual do antimicrobiano para
o tipo de infecção e organismo infectante, exceto quando contraindicado.
O CLSI emprega valores de CIM ≤ 2,0 μg/mL, para os bacilos Gram-
negativos testados no estudo;
Resistente - As cepas tidas como resistentes não são inibidas pelas
concentrações sistêmicas dos agentes antimicrobianos, geralmente
antingíveis nos regimes terapêuticos normais e podem ter CIMs dentro
44
da faixa de maior probabilidade de ocorrência de mecanismos
específicos de resistência bacteriana. Além disso, sua eficácia clínica
não é confiável em regimes terapêuticos normais, sendo necessário
fazer terapias combinadas. O CLSI emprega valores de CIM ≥ 4,0
μg/mL, para os bacilos Gram-negativos testados no estudo;
45
RESULTADOS
5. RESULTADOS
5.1 - CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS BACTERIANAS
Esse estudo analisou 174 isolados de bacilos
multirresistentes, no município de Natal
identificados em amostras de aspirado traqueal. Dos 100 isolados estudados 28
(28%) eram provenientes de aspirado traqueal, seguidos de 17 (17%) de urina e 15
(15%) de ferida, e outros espécimes com menores frequências são demonstrados n
figura 10, abaixo. Os demais isolados 74, relativos ao segundo período de
recrutamento, foram espécimes provenientes exclusivamente de swabs de cultura de
vigilância - nasal, retal e axilar, portanto suas distribuições de frequência não foram
incluídos na figura 10.
Figura 10 - Distribuição de frequência dos isolados por espécime biológico.
A partir desses sítios seis espécies da família Enterobacteriaceae foram
isoladas, das quais as mais frequentes foram:
Escherichia coli 09 (
fermentadores de açúcares, como
sendo as suas frequências bastante s
CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS BACTERIANAS
Esse estudo analisou 174 isolados de bacilos
multirresistentes, no município de Natal/RN. A maior parte dos isolados foram
identificados em amostras de aspirado traqueal. Dos 100 isolados estudados 28
(28%) eram provenientes de aspirado traqueal, seguidos de 17 (17%) de urina e 15
) de ferida, e outros espécimes com menores frequências são demonstrados n
10, abaixo. Os demais isolados 74, relativos ao segundo período de
recrutamento, foram espécimes provenientes exclusivamente de swabs de cultura de
e axilar, portanto suas distribuições de frequência não foram
Distribuição de frequência dos isolados por espécime biológico.
A partir desses sítios seis espécies da família Enterobacteriaceae foram
das quais as mais frequentes foram: Klebsiella pneumoniae
(5,17%), além de outros bacilos Gram
fermentadores de açúcares, como Pseudomonas aeruginosa e
sendo as suas frequências bastante superiores, 66 (37,94%) e 62 (35,63%), 46
Esse estudo analisou 174 isolados de bacilos Gram-negativas
N. A maior parte dos isolados foram
identificados em amostras de aspirado traqueal. Dos 100 isolados estudados 28
(28%) eram provenientes de aspirado traqueal, seguidos de 17 (17%) de urina e 15
) de ferida, e outros espécimes com menores frequências são demonstrados na
10, abaixo. Os demais isolados 74, relativos ao segundo período de
recrutamento, foram espécimes provenientes exclusivamente de swabs de cultura de
e axilar, portanto suas distribuições de frequência não foram
A partir desses sítios seis espécies da família Enterobacteriaceae foram
Klebsiella pneumoniae 31 (17,82%) e
, além de outros bacilos Gram-negativos não
e Acinetobacter spp.,
uperiores, 66 (37,94%) e 62 (35,63%),
47
respectivamente. A distribuição da frequência relativa por espécies observada na
tabela 2.
Tabela 2 - Distribuição da frequência das espécies detectadas nesse estudo
5.2 - CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA
5.2.1 - CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA PARA A PRODUÇÃO DE
CARBAPENEMASES DO TIPO KPC
Para os isolados membros da família Enterobacteriaceae, conforme
determina o CLSI (2015) com a implementação dos novos critérios de interpretação
da susceptibilidade, preconiza que o teste de Hodge modificado (MHT) só é
necessário em casos de controle epidemiológico e de infecção, não sendo prática da
rotina de laboratório clínico.
Das seis espécies de enterobactérias isoladas no estudo, três espécies foram
responsáveis pelos 25 (54,4%) isolados com perfil fenotípico característico para
produção de KPC, sendo todos positivos para o MHT. As espécies K. pneumoniae
17 (68%) e E. coli 6 (24%) foram as mais frequentes para esse fenótipo, sendo E.
cloacae a espécie menos frequente que também apresentou esse perfil de
resistência 2 (8%). As demais espécies E. aerogenes, E. sakazaki e C. freundii não
apresentaram esse perfil fenotípico, como demonstrado na figura 11.
Bactérias Isoladas Nº de Isolados Frequência (%)Enterobacteriaceae 46 26,43%
Klebsiella pneumoniae 31 17,82%Escherichia coli 9 5,17%Enterobacter aerogenes 2 1,15%Enterobacter cloacae 2 1,15%Enterobacter sakazaki 1 0,57%Citrobacter freundii 1 0,57%
Bacilos Gram-Negativos não Fermentadores 128 73,56%Pseudomonas aeruginosa 66 37,94%Acinetobacter spp. 62 35,63%
Total 174 100%
48
Figura 11 - Percentual dos isolados caracterizados fenotipicamente como produtores de carbapenemases.
5.2.2 - CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA PARA A PRODUÇÃO DE
CARBAPENEMASES DO TIPO METALO-β-LACTAMASES (MBL)
No cômputo geral, todos os 174 isolados por se tratarem de isolados Gram-
negativos, previamente caracterizados como resistentes aos carbapenêmicos no
teste de sensibilidade aos antimicrobianos, foram selecionadas para a realização do
teste fenótipico para a produção de metalo-β-lactamases, atráves do bloqueio
enzimático com uso de EDTA.
Entre as cepas testadas, 105 (60,3%) foram positivas para o teste. Analisando
a produção de MBL por espécie produtora entre os membros da mesma espécie ou
gênero, já que não foi possível chegar a nível de espécie para Acinetobacter spp.,
conforme mostra a tabela 3, a maior frequência de presuntivos produtores de MBL
foi Acinetobacter spp. 55 (88,7%), seguida por P. aeruginosa 40 (60,6%), K.
pneumoniae 8 (25,8%) dos isolados dessa espécie e por fim E. coli 2 (22,2%). As
demais espécies de enterobactérias não demonstraram positividade no teste.
68%
24%
8%
Klebsiella pneumoniae
Escherichia coli
Enterobacter cloacae
Enterobacter aerogenes
Enterobacter sakazaki
Citrobacter freundii
49
Tabela 3 - Distribuição das cepas produtoras de MBL de acordo com a espécie bacteriana
5.3 - ANÁLISE DA SUSCEPTIBILIDADE À POLIMIXINA B - DETERMINAÇÃO DA
CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CBM)
Particularizando os resultados encontrados nessa análise observou-se que 53
(30,5%) isolados dos 174 testados foram resistentes a polimixina B, frente a
determinação da CBM atráves do método de microdiluição em caldo. Dentre as
cepas resistentes a polimixina B a família Enterobacteriaceae foi a que obteve o
maior número percentual de observados 26 (49%), seguido por espécies do gênero
Acinetobacter spp. (18/34%) e por fim Pseudomonas aeruginosa 9 (17%), conforme
demonstrado na figura 12.
Figura 12 - Distribuição das cepas do estudo com relação a sensibilidade à polimixina B
Espécie Bacteriana Nº de Cepas Testadas Nº % entre as testadasAcinetobacter spp. 62 55 88,7%Pseudomonas aeruginosa 66 40 60,6%Klebsiella pneumoniae 31 8 25,8%Escherichia coli 9 2 22,2%Enterobacter cloacae 2 0 0%Enterobacter aerogenes 2 0 0%Enterobacter sakazaki 1 0 0%Citrobacter freundii 1 0 0%TOTAL 174 105 60,30%
Cepas Positivas ao Teste de MBL
5744
209
1826
6662
46
010203040506070
Pseudomonas aeruginosa
Acinetobacter spp. Enterobacteriaceae
Sensíveis Resistentes TOTAL
Nº
de C
epas
50
A determinação da CBM permitiu uma análise mais detalhada dos valores
relativos encontrados para cada organismo testado, sendo esta análise demonstrada
nas tabelas 4 e 5; sendo a tabela 4 relativa aos isolados do primeiro recrutamento
amostral, e a tabela 5 relativa aos isolados do segundo período de recrutamento.
Tabela 4 - Distribuição das frequências cumulativas das CBMs para as 100 cepas isoladas de pacientes infectados.
Entre as 100 cepas isoladas de pacientes infectados, as espécies de
Acinetobacter spp. e K. pneumoniae foram as que mais apresentaram estirpes
resistentes, sendo seus valores de CBM50 iguais a 2μg/mL e os valores de CBM90
iguais a 4μg/mL e 16μg/mL, respectivamente. As cepas de P. aeruginosa nesse
primeiro recrutamento foram todas sensíveis à polimixina B com valores de CBM50
0,5 μg/mL e 1μg/mL e de CBM90 ambos iguais a 2μg/mL, respectivamente. As
demais espécies apesar de terem demonstrado perfil de resistência com valores de
CBM elevados, o número de isolados dessas espécies, como E. cloacae e C.
freundii, além de E. coli foi pequeno para se ter uma clareza nos seus perfis. Todos
os valores mencionados podem ser observados na tabela 4, acima.
Tabela 5 - Distribuição das frequências cumulativas das CBMs para as 74 cepas isoladas de pacientes colonizados.
No. (Cum. %) inibida em CBM em μg/mLOrganismo (N Testados) ≤ 0,5 1 2 4 8 16 32 ≥ 64Acinetobacter spp. (31) 8 (25,8%) 5 (42%) 11 (77,4%) 7 (100%) - - - -Pseudomonas aeruginosa (48) 21 (43,8%) 16 (77,1%) 11 (100%) - - - - -Klebsiella pneumoniae (16) 2 (12,5%) 1 (18,8%) 9 (75%) 1 (81,3%) 1 (87,5%) 2 (100%) - -Escherichia coli (2) 1 (50%) - 1 (100%) - - - - -Enterobacter cloacae (2) - - - - 1 (50%) 1 (100%) - -Citrobacter freundii (1) - - - - 1 (100%) - - -
No. (Cum. %) inibida em CBM em μg/mLOrganismo (No. Testado) ≤ 0,5 1 2 4 8 16 32 ≥ 64Acinetobacter spp. (31) 12 (38,7%) 5 (54,8%) 3 (64,5%) 4 (77,4%) 5 (93,5%) 2 (100%) - -Pseudomonas aeruginosa (18) 3 (16,7%) 4 (38,9%) 2 (50%) 2 (61,1%) 5 (88,9%) 2 (100%) - - Klebsiella pneumoniae (15) 1 (6,7%) - 1 (13,3%) 3 (31,3%) 1 (37,5%) 5 (68,8%) 1 (75%) 3 (100%)Escherichia coli (7) - 2 (28,6%) - 1 (42,9%) 1 (57,1%) 1 (71,4%) 1 (85,7%) 1 (100%)Enterobacter aerogenes (2) 1 (50%) - 1 (100%) - - - - -Enterobacter sakazaki (1) - - - - 1 (100%) - - -
51
Entre as 74 cepas isoladas de pacientes colonizados, as espécies da família
Enterobacteriaceae foram as que mais apresentaram estirpes resistentes, assim
como os maiores valores de CBM50 e CBM90, sendo as espécies K. pneumoniae e
E. coli em maior número percentil quando comparados com o total de isolados da
mesma espécie. Elas apresentaram valores de CBM50 iguais a 16μg/mL e 8μg/mL,
e valores de CBM90 iguais a 64μg/mL, ambos respectivamente. Para as estirpes de
Acinetobacter spp., os valores de CBM50 e CBM90 encontrados diferiram em uma
diluição a mais no caso de CBM50 e uma diluição a menos para o valor de CBM90,
quando comparados com os isolados de pacientes infectados do mesmo grupo
Acinetobacter spp., ou seja: a CBM50 e a CBM90 foi de 1μg/mL e 8μg/mL,
respectivamente, para os pacientes colonizados. Diferentemente do resultado
encontrado para pacientes infectados, as cepas de P. aeruginosa desse segundo
recrutamento apresentaram valores de CBM consideravelmente maiores, tendo
como valor de CBM50 2μg/mL e CBM90 de 16μg/mL. A espécie E. sakazaki apesar
de ter demonstrado valor de CBM elevado, houve apenas um isolado dessa espécie,
impossibilitando assim ter clareza no seu perfil de resistência. Todos os valores
mencionados podem ser observados na tabela 5.
52
DISCUSSÃO
53
6. DISCUSSÃO
O elevado percentual de bacilos Gram-negativos (BGNs) multirresistentes,
sobretudo entre os bacilos entéricos da família Enterobacteriaceae e os não
fermentadores de açúcares, como os da espécie Pseudomonas aeruginosa e os do
gênero Acinetobacter spp., principalmente isolados em Unidades de Terapia
Intensiva (UTIs), certamente têm se tornado uma ameaça mundial, preocupante
tanto para clínicos quanto para a comunidade científica (ROSSI, et. al., 2016). Nesse
aspecto, a maioria dos países em desenvolvimento como o Brasil, apresentam um
número elevado desses isolados no ambiente hospitalar, sendo eles resistentes a
grande maioria dos antimicrobianos disponíveis à terapêutica (ROSSI et al, 2010;
SADER et al, 2001). Principalmente uma alta resistência aos carbapenêmicos, onde
a produção de beta-lactamases de amplo espectro bem a produção de
carbapenemases figuram como protagonistas desse panorama preocupante
(NORDMAN; NASS; POIREL, 2011).
Com base na literatura, observou-se que apesar do desenvolvimento de
diferentes classes de antimicrobianos nas últimas décadas, as bactérias estão
constantemente criando mecanismos que lhes permitam sobreviver inclusive quando
expostas a essas drogas. O que se tem evidenciado, é que a velocidade das
bactérias em adquirir resistência aos novos fármacos é maior que a capacidade de
se desenvolver novos medicamentos (DAVIES, DAVIES, 2010).
Sabe-se atualmente que a detecção crescente de cepas resistentes aos
antimicrobianos é fator crucial na epidemiologia de cepas hospitalares. Agentes de
infecções hospitalares resistentes a múltiplos antimicrobianos são responsáveis por
muitos surtos (MOOLENAAR et al., 2000). A detecção desses mecanismos de
resistências por configurarem um problema emergente, faz com que seja necessário
determinar esses possíveis mecanismos atráves da realização de testes como o
screening por cepas produtoras de carbapenemases, como as KPCs e as MBLs,
podendo servir de valiosa referência para tomada de decisões mais racionais quanto
ao uso de antimicrobianos na prática clínica.
Da população de achados bacterianos membros da família
Enterobacteriaceae, 25 (54,4%) apresentaram testes de triagem para produção de
54
carbapenemases positivos atráves do Teste de Hodge Modificado (MHT). Porém,
apesar de ser um teste preconizado pelo CLSI, diversos estudos têm discutido as
limitações do MHT para a pesquisa fenotípica da produção de carbapenemases,
inclusive as do tipo KPC. Por este motivo a detecção molecular do gene blaKPC é
padrão ouro no diagnóstico desse mecanismo de resistência (CURY et al, 2012).
Nesse trabalho publicado por Cury et al. (2012), verificou-se uma baixa
especificidade do teste. Sendo essa baixa especificidade atribuída a possível
presença simultânea de outras beta-lactamases não carbapenemases, como AmpC
e/ou ESBLs combinadas a perda de porinas de membrana, ou até mesmo de outras
carbapenemases, como as metalo-β-lactamases.
No Brasil, nos últimos anos, a presença da resistência aos carbapenemos
associada à presença da carbapenemase KPC tem aumentado significativamente. A
primeira descrição ocorreu em cepas de K. pneumoniae isoladas em Recife/PE em
2006 (MONTEIRO et al., 2009) vários trabalhos já relataram a presença dessa
carbapenemase, tanto em cepas de K. pneumoniae como em outros representantes
da família Enterobacteriaceae, principalmente nas espécies E. coli e E. cloacae, nos
estados do Rio de Janeiro (ANDRADE et al., 2011, PEIRANO et al., 2009) São
Paulo (BEIRÃO et al., 2011) e Rio Grande do sul (ZAVASCKI et al., 2009). Um
estudo mais recente realizado com isolados de nove hospitais da cidade de São
Paulo trouxe um panorama mais assustador ao revelar que mais de 80% das cepas
de K. pneumoniae carbapenemos resistentes eram portadoras de genes blaKPC
(ROSSI et al., 2016). O MHT apresenta boa sensibilidade para detecção de KPC,
porém para a enzima NDM a sensibilidade é menor que 50%. Portanto, a Anvisa
(2013) também preconiza que este teste não deve ser utilizado para confirmar a
detecção de carbapenemases, especialmente NDM, para o qual é preconizado o
teste de duplo disco com bloqueio enzimático feito com EDTA.
Observou-se neste estudo um elevado nível 105 (60,3%) de bacilos Gram-
negativos MBL positivos, atráves do teste de bloqueio enzimático com o uso de
EDTA. Sendo o gênero Acinetobacter spp. o que demonstrou o maior percentual de
isolados produtores de MBL 88,7%, resultado esse que corrobora com os dados
levantados por artigos relatando o crescimento desse fenótipo de resistência aos
carbapenêmicos no Brasil. Em um estudo realizado por Rossi et al (2016), o número
55
de isolados de Acinetobacter spp., carbapenemos resistentes, elevaram-se de 30%
no ano de 2010 para mais de 70% no ano de 2014. Outros estudos também
brasileiros, fortificam esse dado, como o de Gales et al (2012), que relataram no
Programa SENTRY a preocupante taxa de 73% de resistência aos carbapenemos
entre amostras do gênero Acinetobacter spp., isoladas já nos anos de 2008 a 2010.
Isolados da espécie Pseudomonas aeruginosa produtoras de MBL têm sido
relatadas como importante causa de infecções hospitalares onde o aparecimento
das MBLs e sua disseminação entre bactérias patogênicas são questões de grande
importância principalmente no que tange a terapêutica antimicrobiana (MARRA et al,
2006). Os resultados deste estudo encontraram um percentual elevado de P.
aeruginosa produtoras de MBL 60,6%, número esse que está de acordo com o
esperado para estudos envolvendo isolados carbapenemos resistentes. Altos níveis
de resistência aos carbapenemas não eram comuns em P. aeruginosa, mas
atualmente são bastante observados devido ao surgimento de clones portando MBL
e sua capacidade de hidrolisar os carbapenemos (BUSH et. al, 1998). Porém desde
o início do século XXI estudos tem demonstrado a emergência de surgimento de
cepas resistentes entre essa espécie. No Brasil é amplamente conhecida a
disseminação do clone endêmico em P. aeruginosa portando o gene blaSPM e esse
clone vem sofrendo adaptações evolutivas nos ambientes em que estão presente
(GALES et. al, 2003). Em um estudo europeu, realizado por Lagatolla et al (2004),
evidenciou em seu estudo que cepas MBL positivas podem rapidamente emergir e
tornar-se a maior causa de resistência aos β-lactâmicos de amplo espectro entre os
patógenos nosocomiais. Nas cepas isoladas no ano de 1999, o gene blaIMP-1 foi
raramente detectado, entretanto já no ano 2000 foi detectado em 20% das cepas
analisadas e em 70% dessas cepas que foram resistentes ao imipenem.
Para os membros da família Enterobacteriaceae em 2013, a ANVISA orientou
a partir da Nota Técnica nº01/2013, a realização de testes fenotípicos para a
identificação de carbapenemases em enterobactérias, não levando em consideração
bactérias Gram-negativas não fermentadoras de açúcares, onde a produção de
metalo-beta-lactamases é amplamente descrita em todo o mundo. A produção de
carbapenemases do tipo KPC e MBLs, principalmente o gene blaNDM, são de
extrema relevância para os membros dessa família, pois ambas apresentaram
56
rápida e ampla disseminação mundial após suas primeiras descrições. Neste estudo
as espécies que se mostraram positivas para o teste de MBLs foram K. pneumoniae
e E.coli, com percentuais de 25,8% e 22,2%, respectivamente. Índices que estão de
acordo com a literatura, uma vez que isolados dessa família apresentam maiores
frequências de disseminação de carbapenemases do tipo KPC, sendo necessária
para a confirmação das MBLs a realização de técnicas moleculares (ANVISA, 2013).
Entretanto a utilização do EDTA como inibidor de MBL no teste fenotípico de
bloqueio enzimático apresenta controvérsias, pois, mesmo apresentando alta
sensibilidade quando corroborado com testes genotípicos, sua especificidade é
relativamente baixa. Em um estudo realizado com cepas isoladas de vários países,
a técnica demonstrou uma elevada sensibilidade para as cepas produtoras de MBL,
porém isolados produtores de OXA-23 e OXA-40 também foram positivos para o
teste (BONNIN, 2011). Resultados semelhantes foram encontrados em São Paulo,
onde, das 24 amostras positivas para o teste fenotípico, apenas 5 foram confirmadas
por técnicas moleculares como produtoras de MBL (GALETTI, 2010).
Bartolini et al (2014), analisaram a eficiência de seis testes fenotípicos,
dentre eles o teste de disco duplo bloqueio enzimático com EDTA, em
enterobactérias com sensibilidade reduzida aos carbapenêmicos e compararam com
os resultados de testes genotípicos. O teste de disco duplo com EDTA reconheceu
100% das amostras portadoras dos genes VIM e NDM e não registrou nenhum caso
de falso positivo. Entretanto, apesar do baixo custo e da facilidade de interpretação,
o EDTA pode superestimar a presença da enzima MBL, por aumentar a
permeabilidade da parede celular bacteriana, aumentando assim a sensibilidade a
vários antimicrobianos (PICÃO, 2008). Os testes genotípicos continuam sendo os
mais seguros e eficazes na detecção destas enzimas, porém requerem profissionais
treinados, reagentes e equipamentos de custos elevados, tornando-se inviáveis na
rotina de um laboratório clínico-hospitalar (BERTONCHELI, HÖRNER, 2008).
A disseminação destes fenótipos apresentando altos níveis de resistência,
sugere a não conformidade com as práticas para controle de infecção hospitalar e a
capacidade destas cepas de adquirir resistência quando submetidas a altas
pressões seletivas de antimicrobianos. Aos carbapenemos reflete o uso
57
indiscriminado e abusivo deste e de outros antimicrobianos, promovendo a
aquisição de mecanismo de resistência contra os antimicrobianos.
Infelizmente quando se avalia as opções terapêuticas para o tratamento das
infecções causadas por cepas de bactérias Gram-negativas resistentes aos
carbapenemos, o panorama é estarrecedor (NEONAKIS et al., 2011). Como forma
de combater a prevalência desses isolados resistentes aos carbapenemos as
polimixinas (B e E) geralmente constituem um dos únicos antimicrobianos de último
recurso e clinicamente eficazes. Entretanto, os seus efeitos colaterais,
principalmente nefrotóxicos, aliados aos escassos dados da sua farmacocinética e
farmacodinâmica tem limitado o uso clínico ótimo das polimixinas (VARDAKAS,
FALAGAS, 2016).
Estudos recentes confirmam que a polimixina B e a colistina são
significativamente reabsorvidas pelas células dos túbulos renais, após a filtração
glomerular. O acúmulo significativo de polimixinas nos túbulos renais tanto em
humanos quanto em ratos foi confirmado usando um modelo de sonda de polimixina
marcada com iodo, confirmando assim o seu potencial nefrotóxico. Além disso, foi
demonstrado que as polimixinas podem causar apoptose das células do túbulo
renal. Com exceção de um estudo preliminar da atividade antimicrobiana in vitro
sobre os componentes da polimixina B, até à presente data não foram realizados
estudos extensivos para examinar a eficácia antimicrobiana e a toxicidade dos
componentes individuais da polimixina B e da colistina in vitro e in vivo. Este é um
reflexo do fato de que elas foram aprovadas para uso clínico muito antes dos
requisitos rigorosos para a aprovação de medicamentos modernos fossem
colocados em prática (ROBERTS et al., 2015). Estudos clínicos retrospectivos
demonstram que a nefrotoxicidade associada a polimixina foi reversível na grande
maioria de pacientes (contabilizando 98% de todos os episódios). Entretanto,
quando a falha renal ocorreu irreversivelmente, isso foi principalmente observado em
pacientes tratados com colistina (VARDAKAS, FALAGAS, 2015). Outra
característica de grande importância avaliada foi que para os isolados
extensivamente resistentes mesmo nos casos em que a terapia foi considerada
adequada (geralmente polimixina B associada a outros fármacos, como os
carbapenêmicos), a taxa de mortalidade permaneceu bastante elevada
58
(VARDAKAS, FALAGAS, 2016). Para esse dado Nikoo et al (2017), sugerem que a
taxa de mortalidade é elevada devido ao fato dos isolados serem resistentes a todas
as classes de antimicrobianos utilizados atualmente na clínica, incluindo as
polimixinas.
Dados do Programa de Vigilância SENTRY mostram elevadas taxas de
susceptibilidade à colistina em todo o mundo até 2010 (Pseudomonas spp., 99,4%,
Acinetobacter spp., 98,3% e K. pneumoniae, 96,8%). A diminuição da
susceptibilidade à colistina entre estes isolados é um desafio terapêutico devido as
opções antimicrobianas restritas (ROSSI, et al., 2016). Embora as polimixinas
apresentem uma atividade bactericida adequada, contra BGNs, e as taxas de
resistência em estudos brasileiros tem se mantido relativamente baixa, variando, em
média, de 1,7% a 4% (GALES et al., 2006; 2006; GALES et al., 2011; ROSSI et al.,
2016).
Apesar disso, autores como Ko et al (2007). relataram uma taxa de 27,9% de
resistência entre os 214 isolados de A. baumannii avaliados de dois hospitais sul-
coreanos. Neste estudo realizado apenas com isolados carbapenemos resistentes
observou-se um número de 53 (30,5%) isolados de BGNs apresentando altos
valores de CBMs indicando a resistência à polimixina B, resultado esse que apesar
de ser bastante elevado está de acordo com os últimos achados publicados onde
autores demonstram o grande crescimento da resistência desses patógenos a essa
classe específica de antimicrobiano.
Esses números quando comparados com estudos mais abrangentes se
tornam bastante distoantes, isso se deve principalmente por diferenças nos critérios
de inclusão amostral aplicada nesses estudos. Quando as amostras foram de todos
os isolados de BGNs oriundos de hospitais não importando a sensibilidade aos
antimicrobianos e a gravidade da comorbidade dos pacientes os índices de
susceptibilidade são muito maiores, já no estudo sul-coreano realizado por Ko et al
(2007) onde os isolados foram do gênero Acinetobacter spp. e foram identificados
previamente como multirresistentes, além disso a grande maioria provenientes de
pacientes em UTIs e que apresentavam septicemia o índice de resistência se tornou
bem mais prevalente. Neste estudo o gênero Acinetobacter spp. corroborando com a
maioria da literatura demonstrou 29% de resistência entre os isolados desse mesmo
59
gênero, e apresentou valores de CBM variando de 0,5μg/mL até 16μg/mL, com as
CBM50 e CBM90 variando em apenas uma diluição entre os seu isolados oriundos de
colonização (segundo período de recrutamento do estudo) e infecção (primeiro
período de recrutamento do estudo). Outro estudo brasileiro, realizado por Martins et
al (2014), apenas com isolados da espécie Acinetobacter baumannii caracterizados
como multirresistentes obteve-se o índice de 39,06% de resistência à polimixina B.
Portanto, os valores de resistência encontrados neste trabalho estão de acordo com
a literatura quando aplicados algum critério de inclusão amostral, como a resistência
aos carbapenêmicos.
Os membros da família Enterobacteriaceae, principalmente os isolados da
espécie K. pneumoniae foram os que mais demonstraram resistência à polimixina B
nesse estudo, como pode ser observado nas tabelas 4 e 5. Tendo os seus valores
de CBM variando de 0,5μg/mL até 64μg/mL, com as CBM50 e CBM90 sendo as
maiores descritas em relação as demais espécies trabalhadas dessa família, muito
devido a pouca expressividade amostral ao qual as outras espécies foram isoladas.
É sábido que desde a primeira descrição de K. pneumoniae produzindo KPC-2 no
Brasil (PEIRANO, et al, 2009), nos anos seguintes foram publicados estudos que
mostraram a propagação desta carbapanemase, incluindo a outras espécies
bacterianas, em todas as regiões. Em um estudo brasileiro realizado na cidade de
São Paulo, por Bartoletti et al. (2016), a resistência à polimixina B foi avaliada entre
isolados da espécie K. pneumoniae produtores de KPC e o resultado foi o alarmante
índice de crescimento de 0% de resistência em 2011 para 27,1% em 2015. A
disseminação desses fenótipos e consequente o aumento do uso de colistina pode
ter contribuído para o aumento das taxas de resistência à colistina observadas neste
estudo (ROSSI, et al., 2016; SAMPAIO, GALES, 2016).
Em relação aos isolados bacterianos apresentados; Pseudomonas
aeruginosa foi a espécie que demonstrou o menor perfil de resistência à polimixina
B, não apresentando nenhum isolado oriundo de pacientes infectados com perfil de
resistência. Porém metade dos isolados de pacientes colonizados foram resistentes,
o que demonstra de fato a fragilidade das práticas para controle de infecções
hospitalares, principalmente pelo fato desses pacientes estarem em uma UTI. Com
relação aos valores de CBM a espécie apresentou índices variando de 0,5μg/mL até
60
16μg/mL, sendo que apenas 09 (13,6%) isolados dentro dessa espécie tiveram
valores de CBM entre 4μg/mL até 16μg/mL, o que indica que a terapêutica com
polimixina B continua sendo eficiente para essa espécie.
É particularmente preocupante que a exposição prolongada às polimixinas
tenha levado ao aumento de desenvolvimento de cepas resistentes e,
consequentemente, à ausência de atividade ótima do fármaco nas práticas clínicas.
Como foi demonstrado no estudo de Bahador et al (2013), os valores de CIM, CIM50
e CIM90 aumentaram 32 vezes, 10 vezes e 2 vezes para colistina nos 5 anos,
respectivamente. Recentemente, o gene mcr-1 (resistência à colistina móvel) foi
detectado em uma cepa clínica de E. coli ST101, mais precisamente de uma
amostra isolada em Natal-RN. Fernandes et al (2016), encontraram o gene mcr-1
localizado em um plasmídeo e, consequentemente, a pressão seletiva representada
pelo uso excessivo das polimixinas poderia ter contribuído para a disseminação
deste mecanismo de resistência. Esse aumento coincidiu com o aumento do uso de
polimixinas como terapia empírica para tratar infecções graves causadas por BGNs
em unidades de terapia intensiva. O fato mais preocupante no estudo de Gales et al
(2016), foi encontrar a disseminação clonal interhospitalar e intrahospitalar e o fato
de que a maioria dos isolados incluídos no estudo foram detectados a partir de
hemoculturas. Este é um pesadelo terapêutico, já que a fosfomicina endovenosa e a
ceftazidima-avibactam ainda não estão liberadas para utilização no Brasil (GALES,
et al., 2006; SAMPAIO, GALES, 2016).
Conforme a grande elevação do surgimento da resistência à colistina e a
crescente frequência de resistência à polimixina B demonstrada por esse estudo e
atráves da literatura explicitada, muito têm se procurado em relação a pesquisa de
combinações de polimixina com outros antimicrobianos que associados provocam
maior destruição bacteriana do que é possível com uma polimixina isolada
(LENHARD et al., 2016) Já existem tanto relatos clínicos do sucesso da terapia
combinada como o realizado por Pankey et al (2009), onde foi observada que
quando uma polimixina está emparelhada com um carbapenemo o sucesso
terapêutico tanto in vitro quanto in vivo é alcançado quando realizado tratamento
com polimixina em monoterapia foi incapaz de alcançar a morte sustentada da
estirpe; quanto relatos experimentais da análise farmacodinâmica de diferentes
61
associações terapêuticas, como o estudo realizado por Lenhard et al., o qual
analisou o uso de carbapenemos (Ertapenem, Doripenem, Meropenem e Imipenem)
em diferentes concentrações de forma isolada e associada com a polimixina B, e
como resultado evidenciou-se que o uso de carbapenemos sem a polimixina B
resultava em recrescimento drástico.
Como os médicos já enfrentam taxas crescentes de resistência à polimixina, é
imperativo que a relação dose-eficácia destes agentes seja compreendida de modo
a minimizar o desenvolvimento de resistência e maximizar a morte bacteriana
enquanto permanece consciente dos limites impostos nestes resultados por dose-
nefrotoxicidade-dependente, assim como o uso consciente, pautado em
experimentação de terapias combinadas (ROSSI, et al., 2016).
Os dados obtidos aqui, apesar de preliminares são capazes de guiar uma
melhor compreensão da realidade emergencial em que a resistência bacteriana
figura, demonstrando a fragilidade da terapêutica, como também apontam à
necessidade do desenvolvimento de estudos epidemiológicos continuados. Dessa
forma, os resultados poderiam ser verificados, além disso a realização de uma
análise temporal (de curto e longo prazo) das frequências dessa resistência à
polimixina B auxiliariam os clínicos e outros profissionais de saúde, para que
designem a melhor abordagem terapêutica e cada vez mais de forma consciente.
62
CONCLUSÕES
63
7. CONCLUSÕES
Cerca de 60% dos isolados foram caracterizados como produtores de
metalo-β-lactamases atráves do teste fenotípico de bloqueio
enzimático.
Cerca de 30% dos isolados apresentaram valores de concentração
bactericida mínima à polimixina B elevados, sendo considerados assim
resistentes.
Este estudo trouxe ao conhecimento científico a primeira descrição da
diminuição da susceptibilidade à polimixina B no estado do Rio Grande
do Norte, Brasil, tendo assim grande valor clínico, já que as polimixinas
são uma importante classe de antimicrobianos utilizada no tratamento
de infecções por bacilos Gram-negativos multirresistentes.
Uma melhor análise incluindo testes genotípicos e moleculares se faz
necessária, já que existem poucos dados na literatura relatando alta
frequência de resistência de polimixina B, e um número menor ainda de
dados de caracterização molecular das cepas.
64
8. ANEXOS
ANEXOS
Aprovaçao do Comitê de ÉticaAprovaçao do Comitê de Ética
Short Communication
65
66
Submetido na Revista (International Journal of Infectious Diseases - IJID)
High Prevalence of Polymyxin B-resistant Acinetobacter spp. in a Hospital in Natal, Brazil
Fagner James Martins Dantas Costa*, Camila Avelino de Macedo, Tamires Leite Costa, Renato Motta Neto
Department of Microbiology and Parasitology, Bioscience Center, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil
Address correspondence to Fagner J. Martins, [email protected], or Renato Motta, [email protected]
SUMMARY
Polymyxin B resistance involving Gram-negative bacilli infections is a threat for the health care system around the world. Higher prevalence of carbapenem-resistance among these isolates, especially Acinetobacter spp., makes polymyxins the last therapeutic source for clinical therapy. This study aimed to determine the susceptibility profile against polymyxin B of 62 Acinetobacter spp., 31 isolates were obtained from infected patients and also 31 were isolated from colonized patients. All samples collected from a hospital in Natal, city located at Northeast of Brazil. Among the 62 isolates tested, 19 (29%) showed high MBC of polymyxin B (MBC≥4μg/mL) and were considered resistant, the other 43 (71%) were sensible to polymyxin B (MBC≤2μg/mL), MBC50 and MBC90 showed almost similar profiles between colonized and infected isolates with just one-fold variation. The samples were also screened for the phenotypic producing metallo-β-lactamases (MBLs), but in this study we were not able to establish a relationship between the producing of MBLs and polymyxin B resistance. Despite the resistance to polymyxin B is still rare, the situation found might indicate a propensity to dissemination within hospitals and a need for continuous warrant surveillance.
Keywords: carbapenem; Acinetobacter spp.; polymyxin B; drug resistance
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1. INTRODUCTION
In the past few years the growing epidemic infections caused by multi-drug resistant Gram-negative bacteria isolated worldwide has become a treath to the public health system6. According to the last report of the Brazilian Health Surveillance Agency (ANVISA), Acinetobacter spp. is the fourth pathogen isolated from patients admitted to Intensive Care Units - ICU (11.8%). This bacteria is known to be involved in various nosocomial infections, particularly skin and soft tissues infections, meningitis, endocarditis, respiratory tract infections and urinary tract infections2.
This organism also has a remarkable ability to resist almost all available antimicrobial agents being responsible for showing high rates of morbidity and mortality. Acinetobacter spp. exhibited elevated rates of resistance to carbapenems and also has increasingly been worldwide recognized as a hospital-acquired pathogens and an opportunistic nosocomial infection, mainly at intensive care units (ICUs)1. Indeed, according to reports of the surveillance agencies around the world, Acinetobacter spp. has been implicated with high rates of carbapenems resistance, the ANVISA reported 80.7% of carbapenem resistance for this genus. Increasingly rates have been observed in Europe and in USA, where 90.6% and 63% of Acinetobacter spp. were reported as resistant to these compounds, respectively7.
Although novel antimicrobials have been recently approved by the Food and Drug
Administration (FDA), none of them are active against carbapenem-resistant Acinetobacter spp. In this manner, treatment of carbapenemase-producing Acinetobacter spp. has become a serious threat to clinicians because of the increasing dissemination of extensively drug resistant strains and a lack of viable treatment options2.
In this panorama, the use of intravenous polymyxins has resumed in all of the world as the last-source therapeutic options. However, polymyxins resistance has already been observed around the world and are increasing over time6,7. The aim of this study was to evaluate the presence of polymyxin B resistance among carbapenem resistant Acinetobacter spp. isolated from patients in a hospital in Natal, Brazil.
2. METHODS
In this study during 2015, polymyxin B resistance among sixty two critically ill patients, thirty one colonized and also thirty one infected by carbapenemase-producing Acinetobacter spp. isolates were evaluated. The samples were received from a Microbiology Laboratory Hospital of Natal, Brazil.
2.1. Confirmation of genre
One typical colony was further subcultured and characterized based on phenotypic tests: Gram-stain, catalase and oxidase tests9, at Microbiology Laboratory at Federal University of Rio Grande do Norte. Gram-negative coccobacilli, oxidase-negative, and catalase-positive isolates were presumptively identified to the genus Acinetobacter. 2.2. Antimicrobial resistance Antimicrobial resistance of each isolate was investigated according to the standard recommendations of Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2015). Susceptibility to polymyxin B was evaluated by the broth microdilution method, according CLSI. The minimum bactericidal concentration (MBC) were carried out containing increasing concentrations of polymyxin B (0.5 to 64mg/L) (Sigma Aldrich) in duplicates with the MBC defined as the lowest concentration at visible growth was inhibited after 18-20h incubation at Mueller-Hinton agar (MHA) plate.
68
2.3. Phenotypic screening for metallo-beta-lactamases (MBLs)
Phenotypic detection of MBLs was realized using inhibitors of MBLs according to ANVISA guideline in a technical note published in 2013. The test were performed in a Mueller-Hinton agar (MHA) plate. 3.RESULTS
Throughout this study sixty two carbapenem-resistant Acinetobacter spp. isolates from patients colonized and infected were analyzed, and 18 (29%) were found to be resistant to polymyxin B; thus 18 samples (seven from infected and eleven from colonized patients) showed MBC ranging from 4μg/mL to 16μg/mL. Phenotypic screening for MBL test showed 55 positivity isolates (88.8%) among the 62 strains performed, but no relationship between the MBL screening and the polymyxin B resistance could be observed in this study. Table 1 summarize the activities of the polymyxin B against the 62 samples carbapenem-resistant Acinetobacter spp., resistance rates MBC50 and MBC90 are also shown.
Table 1 - Antimicrobial activity of polymyxin B against 62 carbapenem-resistant Acinetobacter spp.
More than three-quarters of the Acinetobacter spp. isolated from colonized patients were inhibited at 4μg/mL and all of the isolates from infected patients at the same concentration were fully inhibited. Despite the higher sensibility of the isolates from infected patients found in our study, the rate for MBC50 was one fold higher than the MBC50 from colonized patient, while the opposite was found for the MBC90. Table 2 summarize the cumulative frequence of all 62 isolates in all polymyxin B concentrations tested.
Table 2 - Cumulative MBC frequence of all 62 isolates carbapenem-resistant Acinetobacter spp.
4.DISCUSSION
The current reports on the clinical outcome of the arising intrinsic and acquired of carbapenem resistance mechanisms among Acinetobacter spp. as well as its association with the hospital environment and antimicrobial exposure of severe ill patients, mainly in intensive unit cares, makes the ideal treatment unfortunately simultaneously more difficult and more important2.
Phenotypic test for MBL have not been nationally or internationally standardized. A consensus methodology for this routine laboratory method remains to be defined, and questions regarding the timing and method of MBL detection remain to be answered. Ultimately, guidelines for
Acinetobacter spp.
Antimicrobial %S %R MBC50(μg/mL) MBC90(μg/mL) %S %R MBC50(μg/mL) MBC90(μg/mL)Polymyxin B 77.4 22.6 >2 >4 64.5 35.5 >1 >8
%S: sensitivity percentage; %R: resistance percentage
Overall (n= 62)Infection (n= 31) Colonization (n= 31)
≤ 0,5 1 2 4 8 16 32 ≥6412 (38,7%) 5 (54,8%) 3 (64,5%) 4 (77,4%) 5 (93,5%) 2 (100%) - -8 (25,8%) 5 (42%) 11 (77,4%) 7 (100%) - - - -
No. (Cumulative %) MBC μg/mLOrganism (No. of isolates test)
Acinetobacter spp. (31) - Colonized PatientsAcinetobacter spp. (31) - Infected Patients
69
the reporting of such results are needed. The screening using EDTA show high sensitivity but low specificity for detecting MBL, due to this poor specificity in this study we were not able to evaluate the relationship between the presence of a positive test and a polymyxin resistance, this particularly would be better answered with molecular genotypic tests.
According to the results of this study there is an alarming trend of increase in Acinetobacter
spp. carbapenem-resistant active against polymyxin B in Natal, Brazil. Despite being yet considered to be rare3,6, the situation might indicates a propensity to dissemination within hospitals, also gives emphasis to continuous regional evaluation and monitoring the susceptibility of this compound. Determining the change trend in Acinetobacter spp. populations provides helpful informations to clinicians for better decisions in the use of polymyxin B, which is now considered to be the last therapeutic option for carbapenem-resistant Acinetobacter spp. infections. In regard of that, this concern needs continuous surveillance.
Competing interests: None declared.
Ethical approval: This study was approved by the Human Ethics Committee of Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Natal, Brazil) [CEP, nº1.097.658].
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