XIV CONGRESOde microBIOLOGÍAd e l o s A L I M E N T O SGirona,19-22 septiembre 2004

PROGRAMA FINALLIBRO DE RESÚMENES

M E S A R E D O N DA III

La PCR ¿ Complemento o alternativa a las técnicas clásicas de microbiología?

Teresa Aymerich 1, Belén Martín 1, Anna Jofré 1, Margarita Garriga 1 y Marta Hugas 1,2

1-IRTA.Centro de Tecnología de la Carne.Granja Camps i Armet s/n.17121. Monells.2-Dirección actual. EFSA. Agencia de Seguridad Alimentaria Europea. 10 Rue de Gèneve. B-1140. Bruxelles.

IntroducciónLos métodos rutinarios para la detección de microorganismos en alimentos se basan en técnicas de microbiología básica que implicanel aislamiento y la identificación bioquímica de bacterias de los alimentos a partir de cultivo puro. La metodología utilizada suele serlarga, con una gran carga de trabajo y el coste total del ensayo elevado por la dedicación del personal implicado. En los últimos años,el extraordinario auge de la biología molecular ha conducido al desarrollo de técnicas que permiten la identificación rápida de micro-organismos específicos a partir de cultivos puros, en caldos de enriquecimiento o directamente a partir del alimento, sin necesidad deaislarlos y/o potenciar su crecimiento diferencial. Entre estas técnicas, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una herramien-ta imprescindible, muy sensible, rápida y con un enorme potencial.Mediante un diseño adecuado de cebadores, la PCR nos permite (i) detectar, identificar y cuantificar microorganismos patógenos y estu-diar su origen mediante estudios epidemiológicos (Boyapalle, 2001; Johnson y col, 2001) (ii) detectar y cuantificar cultivos iniciadores,bioprotectores y probióticos, así como determinar sus propiedades de interés higiénico-sanitario y su trazabilidad (Vancanneyt y col,2001; Fujiwara y col, 2001), y (iii) estudiar la biodiversidad microbiana en alimentos (Randazzo y col, 2002; Rantsiou y col, 2004).

Detección de microorganismos patógenosEl enriquecimiento, la selección y la identificación de L.monocytogenes,Salmonella y Campylobacter por microbiología clásica pueden durarmás de una semana, un tiempo excesivo cuando se requieren respuestas rápidas a brotes de toxiinfecciones alimentarias o en el aná-lisis de alimentos de corta vida útil. El número de toxiinfecciones alimentarias se considera infravalorado porque la detección del agen-te etiológico por microbiología clásica no siempre es posible (Bean y col, 1990).En los últimos años se ha llevado a cabo un importante esfuerzo por parte de la comunidad científica para establecer protocolos rápi-dos de PCR para la identificación de patógenos alimentarios (Rahn y col, 1992, Simon y col, 1996; Scheu y col, 1998; Nogva 2000 a yb; Hoofar y col, 2000). Se han realizado diversos estudios epidemiológicos mediante técnicas moleculares de PCR en Campylobacter;Salmonella, E.coli O157:H7, L. monocytogenes (Jersek y col, 1999; Payne y col, 1999; Johnson y col, 2001; Radu y col, 2001).

La eficiencia y rapidez que supone la detección de patógenos y la determinación del foco infeccioso mediante técnicas de PCR encomparación con la microbiología clásica, junto con la preocupación de las autoridades sanitarias para su detección, mejorará conside-rablemente la detección del agente etiológico, permitirá una mejor valoración de los riesgos y una mejora de la seguridad. La imple-mentación de las técnicas de PCR en los sistemas de análisis y control de puntos críticos mejorará cualitativamente la microbiología delos alimentos.No obstante, los bajos recuentos de patógenos alimentarios que se encuentran normalmente en las diferentes matrices alimentariasno permiten desvincular la determinación de la presencia y/o ausencia del mismo de los métodos clásicos de cultivo y enriquecimien-to. En matrices cárnicas, la PCR cuantitativa tiene un límite de cuantificación de 103 ufc/g (Rodríguez y col, 2004). Sin embargo, cuan-do se combina con la técnica del número más probable pueden cuantificarse niveles inferiores a 10 ufc/g y con caldos de enriqueci-miento pueden determinarse, perfectamente, la ausencia o la presencia del mismo. Es evidente que la integración de las técnicas dePCR a los métodos convencionales, aumentará el poder de resolución de las técnicas de diagnóstico microbiológico agilizando el tiem-po dedicado al análisis.

Identificación de microorganismos de interés tecnológico, propiedades de interés higiénico-sanitario y trazabilidad.La identificación de cepas de interés en la industria agroalimentaria considerando sus actividades o propiedades bioquímicas (biotipa-do) es larga y tediosa.La identificación a nivel de especie mediante PCR específica es rápida y eficiente (Berthier y Ehrlich, 1998; Aymerich y col, 2003). Lashuellas dactilares moleculares generadas por la aplicación de los perfiles de amplificación de fragmentos polimórficos al azar (RAPD)son rápidos, sensibles, eficientes para la identificación de las cepas y no necesitan información molecular previa (Berthier y Ehrlich 1999,Andrighetto y col. 2001). La valoración del potencial tecnológico e higiénico-sanitario (producción de bacteriocinas, capacidad de pro-ducción de aminas biógenas) es ágil y eficiente (Vancanneyt y col, 2001; Coton y col, 2004).Acoplada a las técnicas de DGGE,TGGE,secuenciación del 16S rRNA y ribotipado (Randazzo y col 2002; Rantsiou y col., 2004; Massi y col, 2004) es capaz de elucidar la varia-bilidad entre la microbiota presente.

La problemática actual de la aplicación de las técnicas de PCR.En la actualidad, la PCR no es una técnica de uso general en microbiología de los alimentos por varias razones (i) el número de matri-ces alimentarias y de potenciales inhibidores de la reacción es muy variado (ii) en general, el número de patógenos suele ser reduci-do y viene acompañado de un elevado número de microorganismos banales (iii) la validación de los métodos aplicados y (iv) la nor-mativa.

36

Programa Final Micro (F) 6/9/04 12:43 Página 36

A. Inhibidores de la reacción. La composición físico-química del alimento, su estructura, la microbiota endógena y el proceso de extrac-ción del ADN realizado son elementos decisivos y los inhibidores de la reacción de PCR asociados al mismo su mayor obstáculo.Ciertassustancias que interfieran en la lisis celular,ADN inespecífico,ARNasas o ADNasas que degradan ácidos nucleicos y/o cebadores, sus-tancias quelantes de magnesio necesario para la reacción de PCR pueden inhibir total o parcialmente la amplificación (Rossen y col.,1992;Akane y col, 1994). Por tanto, la adición de controles internos de la reacción mediante la adición de un estándar de ADN exó-geno que amplifique simultáneamente en una reacción de PCR a dos bandas (Cave et al., 1994) es un requisito imprescindible paravalorar el efecto de la hipotética presencia de inhibidores en las diferentes matrices alimentarias a estudio, descartando la presencia defalsos negativos. La PCR no puede tener un estatus de técnica de diagnóstico si no incluye, como mínimo, un control interno, un con-trol positivo y uno negativo del proceso y un control de reactivos (blanco).

B.Validación. Para la aplicación estándar de la PCR a nivel de diagnóstico es indispensable la disponibilidad de métodos validados a nivelinterlaboratorial, que aseguren su aplicabilidad con fiabilidad y sin optimización posterior por los laboratorios de análisis de alimentos.Los métodos alternativos estándar no deberían ser kits comerciales, sino fórmulas abiertas, dónde la información de los genes diana ylos reactivos fueran completamente asequibles.En base a estas disposiciones se ha llevado a cabo un proyecto europeo “Validation and standardization of diagnostic polyme-rase chain reaction for detection of foodborne pathogens (FOOD-PCR, http://www.pcr.dk) que actualmente se halla en susegunda edición (FOOD-PCR 2) dentro de la red de excelencia MedVetNet (http://www.medvetnet.org). El objetivo principaldel proyecto fue la transferencia tecnológica y la implementación de los métodos de PCR para la detección rutinaria de pató-genos alimentarios a través de la harmonización, estandarización y validación de los métodos a nivel europeo para los cincomicroorganismos que originan mayores problemas a nivel alimentario (Salmonella spp., Y. enterocolitica, Campylobacter spp., L.monocytogenes y E. coli (EHEC)). Las metodologías validadas se llevaron a cabo en un mínimo de 12 laboratorios distintos (entrelos que ha colaborado el Centro de Tecnología de la Carne (IRTA)) para cada uno de los patógenos a estudio según los estan-dartes de la norma ISO 16140:2002 y se elaboraron propuestas para la estandarización a nivel europeo con la CEN (ComisiónEuropea de Normalización).

Varias organizaciones de validación acreditadas, tales como AOAC (http://www.aoac.org) y Nordval(http://www.nmkl.org/NordVal/NordVal.htm) han certificado en estos últimos años algunos métodos alternativos de detecciónde patógenos alimentarios mediante PCR tales como (i) BAX system de Qualicon validado para Salmonella, E.coli O157:H7 yListeria monocytogenes por l’AOAC, y para Salmonella en todos los alimentos por Nordval. (ii) Lightcycler de Roche validado paraSalmonella por l’AOAC.

C. Normativas. Alemania dispone de las normas DIN 10134 y DIN 10135 para disposiciones generales de la aplicación de laPCR y detección de Salmonella, respectivamente y del método oficial LMBG L07.18-1 para E.coli VTEC. Los países nórdicos handispuesto la norma NMKL 163:1998 para la detección de Yersinia enterocolitica. A nivel internacional (ISO), la normativa seencuentra en fase de elaboración y hasta el momento se han elaborado una serie de borradores para especificaciones genera-les, preparación de la muestra, amplificación y detección de los fragmentos amplificados por PCR convencional (ISO/DIS22174:2002, ISO/DIS 20837:2004 y ISO/DIS 20838:2004, respectivamente).El grupo de trabajo de la CEN en PCR (TC275/WG6/TAG3) opina que la técnica podrá ser usada a nivel de diagnóstico en el2010 con el mismo estatus que los medios de cultivo tradicionales.

Bibliografía1. Andrighetto, C., Zampese L.,y Lombardi A. 2001. Lett. Appl. Microbiol. 33:26-30.2. Akane, A., Matsubara, K., Nakamura, H.,Takahashi, S. y Kimura, K. 1994. J. Forensic Sci. 39: 362-372.3. Aymerich, M.T., B. Martín, M. Garriga, y M. Hugas. 2003. Appl. Environ. Microbiol. 69:4583-45944. Bean, N. H., Griffin, P. M., Goulding, J. S. y Ivey, C. B. 1990. Morb. Mortal.Weekly Rep. 39: 15-57.5. Berthier, F.y Ehrlich S.D. 1998. FEMS Microbiol. Lett. 161: 97-106.6. Berthier, F. y Ehrlich S.D. 1999. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:997-1007.7. Boyapalle S.,Wesley I.V., Hurd H.S. y Reddy P.G. 2001. J. Food Protect. 64(9): 1352-61.8. Cave, H., Mariani, P., Grandchamp, B., Elion, J. y Denamur, E. 1994. BioTechniques 16: 809-810.9. Coton M., Coton E., Lucas P. y Lonvaud A. 2004. Food Microbiol. 21(2):125-130.10. Fleet G. H. 1999. Int. J. Food Microbiol. 50:101-117.11. Fujiwara S., Seto Y., Kimura A., Hashiba H. 2001. J. Appl. Microbiol. 90(3): 343-52.12. Jersek B., Gilot P., Gubina M., Klun N., Mehle J.,Tcher N. y Herman L. 1999. J. Clin. Microbiol. 37(1):103-109.13. Johnson J.R., Clabots C., Azar M., Boxrud D.J. y Besser J.R. 2001. J. Clin. Microbiol. 39(19): 3452-3460.14. Hoofar J., Ahrens P y Radström. 2000. J. Clin. Microbiol.38(9): 3429-3435.15. Massi M.,Vitali B., Federici F., Matteuzzi D. y Brigidi P. 2004. J.Appl. Microbiol. 96(4):777-786.16. Nogva, H. K., Bergh, A., Holck, A. y Rudi, K. 2000a. Appl.Env. Microbiol. 66, 4029-4036.17. Nogva, H. K., Rudi, K., Naterstad, K., Holck, A. y Lillehaug, D. 2000b. Appl. Env. Microbiol. 66, 4266-4271.18. Payne R.E., Lee M.D., Dreesen D.W. y Barnhart H.M. 1999. Appl. Environ. Microbiol. 65(1):260-263.19. Radu S., Ling O.W., Rusul G., Karim M.I., Nishibuchi M. 2001. J.Microbiol. Methods 46(2):131-139.

37

Programa Final Micro (F) 6/9/04 12:43 Página 37

20. Rahn, K., De Grandis S.S., Clarke R.C., Mc Ewen S.A., Galán J.E., Ginocchio C., Curtiss R. y. Gyles C.L. 1992. Mol. Cell. Probes6:271-279.21. Randazzo C.L.,Torriani S., Akkermans A.D.L., de Vos W.M. y Vaughan E.E. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68:1882-1892.22. Rantsiou K., Comi G y Cocolin L.2004. Food Microbiol. 21(2):-481-487.23. Rodríguez-Lázaro D., Jofré A., Aymerich T., Hugas M. y Pla M. 2004. Appl. Environ. Microbiol. Aceptado.24. Rossen, L., Norskov, P., Holmstrom, K. & Rasmussen, O. F. 1992. Int J. Food Microbiol. 17, 37-45.25. Scheu, P. M., Berghof K., and Stahl U. 1998. Food Microbiol. 15:13-31.26. Simon M.C, Gray D.I. y Cook N. 1996. Appl. Environ. Microb. 62:822-824.27.Vancanneyt, M., A. Lombardi, C. Andrighetto, E. Knijff, S.Torriani, K. J. Björkroth, C. M. A. P. Franz, M. R. F. Moreno, H. Revets, L.De Vuyst, J. Swings, K. Kersters, F. Dellaglio, and W. H. Holzapfel. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68:1381-1391.

38

Programa Final Micro (F) 6/9/04 12:43 Página 38

Programa Final Micro (F) 6/9/04 12:43 Página 71

P016 EVALUACIÓN HIGIÉNICO SANITARIA DEL EQUIPAMIENTO Y PRODUCTOS ENFÁBRICAS DE EMBUTIDOS TRADICIONALES EN CATALUÑAMargarita Garriga1, Silvina Fadda1,Teresa Aymerich1, Marta Hugas2

1-Microbiologia y Biotecnologia Alimentarias, Centro de Tecnología de la Carne, IRTA, Monells2-EFSA, Bruselas, Bélgica

La calidad y la seguridad alimentarias son prioridades de los consumidores actuales, que a su vez aprecian cada vez mas aque-llos productos “tradicionales”, ricos en connotaciones sensoriales diversas. Los embutidos, producidos de forma mas o menosartesanal en fábricas pequeñas, poseen una microbiota compleja que proviene tanto de la propia materia prima como de lamanipulación y del ambiente de manufacturación (máquinas, instalaciones, etc.). El objetivo principal del proyecto europeo enque se enmarca este estudio es evaluar y mejorar la seguridad de los embutidos tradicionales, desde el productor hasta el con-sumidor. En este trabajo se determinó la calidad higiénico-sanitaria de diez empresas representativas del sector. Para ello sedeterminó la contaminación superficial de máquinas (picadora, amasadora, embutidora), mesas de trabajo, cuchillos, cámara fría,valorándose microbiota patógena, deteriorante y tecnológica.Asimismo se analizó un producto tipo para cada empresa, duran-te el proceso de maduración.Las superficies que registraron mayor contaminación microbiana fueron, en general, la picadora, la embutidora y las mesas,observándose una gran variabilidad de recuentos entre las 10 fábricas investigadas. En general, hongos/levaduras, bacterias lác-ticas y Staphylococcus/Kocuria estuvieron presentes en todos los obradores investigados. S. aureus registró valores por debajodel límite de detección, en general, en todas las superficies muestreadas. L. monocytogenes fue detectada en 3 puntos distintos(picadora, mesas, cámara fría) únicamente en una de las fábricas. Salmonella no fue detectada en ninguna de las 60 muestrasde superficie analizadas.En cuanto a los embutidos, la microbiota principal estuvo compuesta por hongos/levaduras, bacterias lácticas yStaphylococcus/Kocuria, con recuentos promedio de 5,31, 7,62 y 5,86 (log ufc/g) respectivamente.El recuento de enterobacterias y Pseudomonas disminuyó a lo largo del proceso en, prácticamente, todos los productos estu-diados, mientras que los enterococos se mantuvieron, en general, en los recuentos obtenidos en la mezcla inicial.Aunque L. monocytogenes y Salmonella fueron detectadas por PCR (presencia en 25 g) en las mezclas iniciales, en ningún casose obtuvieron resultados positivos en producto acabado, registrándose para ambos patógenos ausencia en 25 g. E. coli vero-toxigénica no fue detectada en ningún caso.

71

P017 MICROBIOTA DE INTERÉS TECNOLÓGICO Y BIODIVERSIDAD EN EMBUTIDOSPOCO ÁCIDOSTeresa Aymerich1, Belén Martín1, Margarita Garriga1, Marta Hugas2

1-Microbiología y Biotecnología Alimentarias, Centro de Tecnología de la Carne, IRTA, Monells2- EFSA, Bruselas, Bélgica

Los embutidos poco ácidos están compuestos por un amplia variedad de productos regionales muy apreciados por el consu-midor. La microbiota endógena, que confiere al producto sus propiedades organolépticas típicas, así como los procesos de pro-ducción no han sido estudiados en profundidad.En este estudio se ha tipificado la microbiota de interés tecnológico (251 de bacterias lácticas y 238 de cocos gram-positivoscatalasa-positivos (CG+)) de 21 productos comerciales (salchichón, fuet y chorizo poco ácidos). Para tal fin se han diseñadoy/o seleccionado cebadores específicos para la identificación mediante técnicas de PCR de seis especies de bacterias del ácidoláctico y seis de CG+. Aquellas colonias que no pudieron ser identificadas mediante las técnicas propuestas, se identificaronpor secuenciación parcial del 16s rRNA y/o SodA. La biodiversidad a nivel de cepa se determinó mediante perfil plasmídico yRAPD.El 75% de las colonias de bacterias lácticas se identificaron como Lactobacillus sakei, un 20% como Lactobacillus curvatus y un5% como Leuconostoc mesenteroides. A nivel de cepa se pudieron identificar 109 cepas diferentes, 88 pertenecientes a L.sakei,13 a L.curvatus y 4 a Leuconostoc.Entre los CG+, la mayoría de colonias estudiadas pertenecieron a Staphylococcus xylosus (89%), el resto a Staphylococcus war-neri (6,5%) y Staphylococcus carnosus (4,5%). A nivel de cepa se pudieron diferenciar 148 perfiles de RAPD mostrando la bio-diversidad presente en las muestras analizadas.

72

P075 APLICACIÓN DE UNA FICHA DE CONTROL DE BUENAS PRÁCTICAS DE HIGIENE YFABRICACIÓN EN PEQUEÑAS INDUSTRIAS DE EMBUTIDOS TRADICIONALESSilvina Graciela Fadda1,Teresa Aymerich1, Marta Hugas2, Margarita Garriga1

1-Microbiología y Biotecnología Alimentarias, IRTA - Centro de Tecnología de la Carne, Monells2-EFSA, Bruselas, Bélgica

Este trabajo tuvo como objetivo identificar los puntos críticos de control (PCC) y evaluar los pre-requisitos de cada empresapara llevar a cabo un sistema de autocontrol dentro de un plan de APPCC.Un estudio previo permitió analizar la tipología de los productores de embutidos tradicionales y la elaboración de un perfil delos fabricantes catalanes (Fadda y col. 2004). De 50 productores se seleccionaron 10 para ser estudiados en el presente tra-bajo. Estos fueron clasificados de acuerdo a su capacidad para llevar a cabo un sistema de autocontrol y a la eficiencia del pro-grama higiénico aplicado en el equipamiento de su empresa. Para ello, se elaboró un cuestionario que contenía dos partes, unacon preguntas relativas a infraestructura y posibilidad de implementar un sistema de autocontrol y la otra relacionada con PCCy calidad higiénica del equipamiento y productos. Se asignó una puntuación a cada una de las 105 preguntas. Como criterio seestableció que las fábricas que sumaran 30 puntos o más, en cada una de las partes del cuestionario, fueran clasificadas como“Suficientes”.Todas las fábricas evaluadas obtuvieron puntuaciones superiores al mínimo estipulado. En la evaluación del equipamiento, lascámaras frías y las mezcladoras fueron clasificadas como “muy limpias” (criterio: ≤200 ufc Enterobacteriaceae/100cm2) y ausen-cia de patógenos. Las embutidoras registraron altos niveles de contaminación y se las clasificó como “no limpias” detectándo-se L. monocytogenes en el 29% de las mismas.Según la clasificación higiénica de sus productos, todas las fábricas obtuvieron la máxima puntuación, lo que indica la ausenciade patógenos de acuerdo a los criterios acordados (Salmonella: ausencia en 25 g; L. monocytogenes: ≤100 ufc/g; S. aureus: ≤500ufc/g).Las fábricas estudiadas poseían una adecuada infraestructura para la implementación de un sistema de autocontrol y presen-taron un programa de higiene eficiente. Sin embargo ciertos puntos deberían ser corregidos: alta temperatura y baja humedadde zonas de recepción y almacenamiento de materias primas, excesivo tiempo de desalado de tripas y presencia de L. monocy-togenes en algunas máquinas.La aplicación sistemática de esta ficha ayudará a los productores a controlar más eficazmente los PCC mejorando la calidadhigiénica de obradores y productos y en consecuencia la productividad.

Bibliografía:Fadda, S.; Aymerich,T.; Hugas, M. y Garriga, M. Eurocarne, 2004, 123:105-112.

98

Programa Final Micro (F) 6/9/04 12:43 Página 98