wstęp do radiobiologii wykład 2 – radiobiologia komórkowa radiobiologia kielce fizmed...
TRANSCRIPT
Wstęp do radiobiologiiWykład 2 – radiobiologia komórkowa
DNA jest komórkową tarcządla promieniowania jonizującego
jądro6%
aparatGolgiego
6%
siateczkaśródplazmatyczna
9%
mitochondrium22%
błona komórkowa
lizosom1%
endosom1%
rybosom
cytoplasma54%
Częstości popromiennych i spontanicznych uszkodzeń DNA
rodzaj uszkodzenia
pęknięcie podwójnoniciowe
pęknięcie pojedynczoniciowe
utrata zasady
uszkodzenie zasady
uszkodzenia spontanicznew komórce na godzinę
< 1
5000
1500
1250
uszkodzenia w komórce na 1 Gy
40
1000
950
950
Dawka 1 Gy wywołuje ~100,000 jonizacji w komórce
OH .O
H
H O2
(OH Radikal)
Radiolyse
Basenschaden
Einzelstrangbruch
Einzelstrangbruch
Doppelstrangbruch
Indirekte Wirkung
H.
(hydratisierter Wasserstoff)
promienie X, gamma, beta
pojedynczoniciowepęknięcie DNA
pojedynczoniciowepęknięcie DNA
uszkodzeniezasady DNA
podwójnoniciowepęknięcie DNA
radioliza
rodnik
rodnik
popromienne uszkodzenia DNA
neutrony, protony, ciężkie jony
tlen potęguje efekt pośredni:
H. + O2 HO2.
2 HO2. H2O2 + O2
2 HO2. + H. H2O2
Ciąg zdarzeń w napromienionej komórce
• Uszkodzenia pośrednie i bezpośrednie
• Wychwyt wolnych rodników przez zmiatacze
• Rozpoznanie uszkodzeń DNA
• Zatrzymanie cyklu i naprawa uszkodzeń DNAlub skierowanie komórki na drogę apoptozy
Radioochraniacze, czyli zmiatacze wolnych rodników
glutationCys GlyGlu
SH
GSH + .OH H2O + GS. GS. + GS. GSSG
powstaje disulfid glutationuatak przez rodnik .OH
grupa tiolowa
GSH
GSSG
GS.RH
R.GSOH
NADPH
NADP+ + H+reduktaza
glutationowa
H2O2H2O
peroksydazaglutationowa
ATP ADP + P
GS-Q
Q-XHX
transferazaglutationowa
elektrofiloweksenobiotyki
Pierwszy krok w naprawie DNA: rozpoznanie uszkodzenia(mocno uproszczone!)
Atm
Waf1
naprawa DNAnaprawa DNA
zatrzymanie w cykluzatrzymanie w cyklu
Rb
p53 Mdm2
BaxPuma Noxa
Bcl2
śmierć apoptotycznaśmierć apoptotyczna
białka genów supresorowych
białka onkogenówaktywacjasupresja
ale najpierw trochę o cyklu komórkowym...
G1 S G2 M
Chromatyna ulega dekondensacji
Chromatyna rozluźniona
Chromatyna ulega kondensacji
Chromatyna spakowana
+
Drugi krok w naprawie DNA: mechanizmy naprawy
Naprawa DNA: schemat głównych szlaków
dsb
rodzaje uszkodzeń DNA:
uszkodzenie w S / G2
naprawa rekombinacyjna przy użyciu chromatydy siostrzanej jako matrycy
naprawa stosunkowo powolna ale wierna
HRR - homologousrecombination repair
uszkodzenie w G1
naprawa przez sklejeniewolnych końców DNApo ich nadtrawieniu
naprawa stosunkowopowolna i błędna
NHEJ - non homologousend joining
ssb - single strand breakbd - base damagedsb - double strand break
ssb bd
naprawa z wycięciemprzy użyciukomplementarnejnici DNA jako matrycy
naprawa szybka i wierna
BER - base excision repairNER - nucleotide excision repairNMR - nucleotide mismatch repair
ssb i bd powstają w komórkachspontanicznie z częstościąokoło 8000 / komórkę / godzinę
uszkodzenia letalne – subletalne – potencjalnie letalne
pojęcia operacyjne wprowadzone do wytłumaczenia zjawiskawzrostu odporności na promieniowanie przez:
1. rozbicie dawki na frakcje (Elkind repair)2. przez trzymanie komórek po napromienieniu w warunkach
suboptymalnych (liquid holding) powodujących zatrzymanie komórek w cyklu.
W obu przypadkach komórka zyskuje czas na naprawę uszkodzeń!
ssb bd
głowa ogon
0 min
15 min
30 min
180 min
czas naprawy (min)
20
0
dług
ość
ogon
a
0 180
Pomiar naprawy DNA - test kometowy(elektroforeza pojedynczych komórek)
kinetyka naprawy w czasie
10
Naprawa DNA jest przestrzennie uporządkowana"ogniska" z udziałem białka Rad51 (białko naprawy HRR)
B.C. Godthelp, M. Zdzienicka i wsp., Nucleic Acid Research 30, 2002
traktowanemitomycyną C
traktowanepromieniami X
beztraktowania
komórki V79B(dzikie - wt)
komórki CL-V4Bmutanty rad51c
komórki CL-V4B z skomplementowanym
genem rad51c
ogniska
ogniska
brakognisk
Poziom podwójnoniciowych pęknięć DNA można mierzyćbadając ogniska gamma-H2AX
M. Löbrich et al.
Kinetyka powstawania ognisk w jądrze komórkinapromienionej światłem laserowym
dicentrykfragmenty
acentrycznetranslokacja
Naprawa DNA nie zawsze przebiega w sposób bezbłędny...
schemat powstawania popromiennych aberracji chromosomowych
prowadzi do śmiercikomórki
może prowadzićdo procesunowotworzenia
dic
ace
Komórka z chromosomem dicentrycznym
podział chromosomuna dwie chromatydy
wrzecionamitotyczne
Jeszcze trochę o cyklu i podziale mitotycznym...
Podział chromosomu podczas mitozy
cytoplazma
G0
G2 G1
S
M
jądro
wrzeciono mitotyczne
fragment acentryczny
mikrojądro
Schemat powstawania mikrojąder popromiennych
mikrojądra są przyczyną śmierci mitotycznej komórki
Komórki dwujądrzaste z mikrojądrami
Mn Mn
Rzut oka na całość: los komórki napromienionej
naprawa DNAbłędna
komórka z uszkodzonym DNA
śmierćnekrotyczna
po wysokiej dawce
efektsomatyczny
naprawa DNA
bezbłędna
komórka zdrowa
brak efektu
niestabilneaberracje
chromosomowe
mikrojądra
śmierć mitotyczna
efektsomatyczny
brak efektu
stabilneaberracje
chromosomowe,mutacje
tormutacyjny
nowotwór
śmierć apoptotyczna
efektsomatyczny
efektkancerogenny
efektgenetyczny
w komórkachrozrodczych
Gy
Dlaczego i w jaki sposób umierająkomórki z uszkodzonym DNA?
śmierć apoptotyczna komórka umiera ponieważ włączaprogram autodestrukcji
śmierć nekrotyczna komórka umiera ponieważ traci zdolnośćdo zachowania równowagi wodno-elektrolitowej
śmierć interfazalnakomórka umiera zanim zdoła
się podzielić
śmierć mitotycznaśmierć jest konsekwencją błędówpodczas podziału komórkowego
Alexis Carrel (1873 – 1944) chirurg francuskiLaureat nagrody Nobla
1912 – hodowla tkanki sercowej wyizolowanej z 18-dniowego zarodka kurczaka – do 1946.Hodowla w osoczu krwi zwierzęcej
Scientific Amercian January 1942
Historia hodowli tkankowej
1951: pierwsza stała linia komórkowa HeLaZałożona przez George’a i Margaretę Gey
Wyizolowana z wycinka nowotworu szyjki macicyHenrietty Lacks
Komórki HeLa
Test prze ywalnoż ści - schemat eksperymentu
komórki w hodowli
trypsyna
zawiesinakomórek
inkubacja: 1 - 2 tygodnie
rozsianie
100 200 300 400
0 Gy 1 Gy 2 Gy 3 Gy
liczba kolonii:wydajność klonowania:frakcja przeżywalności:
70 70%
1
60 -
0,42
50 -
0,23
40 -
0,14
frakcja prze ywalnoż ści (SF)
SF =liczba kolonii
liczba komórek x PE/100
PE = wydajność klonowania
Ważny punkt końcowy w radiobiologii: ocena przeżywalności komórek
Pierwsza krzywa przeżywalnościPuck i Markus, 1956
ramię krzywej (shoulder)
eksponencjalnaczęść krzywejsk
ala
log
2,00 4,03,01,0 5,0
0,1
DQ
D0 D0
D0
D0
0,037
1
Dawka (Gy)
Przeży
wal
ność
krzywa 1
krzywa 2= 1,5 Gy
= 0,6 Gy
DQ = miara szerokości ramienia
D0 = miara promieniowrażliwości= dawka, która powoduje obniżenie
przeżywalności do e-1
= do 37% mierzonej na prostej
krzywa przeżywalności
duże D0
małe D0
Jak wytłumaczyć eksponencjalnączęść krzywej?Prawdopodobieństwo przeżycia komórek nie trafionych jako funkcja średniej liczby trafieńna komórkę
Według równania Poissona:P(0) = e-λ
(λ = średnia trafień na komórkę)
zależność dawka-efekt
liczba trafień w komórkę
liczba trafień w komórkę
liczba trafień w komórkę
Modele wyjaśniające przebieg krzywej
Model wysyconej naprawy (repair saturation model)
naprawa
naprawa
naprawa sprawnaale nie w 100%=> część komórek ginie
naprawa wysycona=> przeżywalność zależy od liczby trafień
DQ = miarą zdolności naprawy uszkodzeń subletalnych
Modele wyjaśniające przebieg krzywejModel liniowo-kwadratowy (LQ model, Douglas and Fowler 1976)
P(0) = e(-αD - βD2)
Dose (Gy)
uszkodzenia typu one-hit (zależność liniowa)– prawdopodobieństwo wystąpienia zależy od D
uszkodzenia typu two-hit (zależność liniowo-kwadratowa)– prawdopodobieństwo wystąpienia zależy od D2