Mendelova univerzita v Brně

Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie

Význam metalothioneinu

v maligním potenciálu nádorových buněk Diplomová práce

Vedoucí práce: Vypracoval:

doc. RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D. Bc. Markéta Sztalmachová

Brno 2013

ZADÁNÍ

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma „Význam metalothioneinu

v maligním potenciálu nádorových buněk“ vypracovala samostatně a použila jen

pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury.

Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy univerzity v Brně a byla

zpřístupněna ke studijním účelům.

V Brně dne ......................................................

Podpis diplomanta ...........................................

Experimentální část této diplomové práce byla realizována na výzkumné infrastruk-

tuře

vybudované v rámci projektu CZ.1.05/2.1.00/03.0072

Centrum senzorických, informačních a komunikačních systémů (SIX) operačního programu Výzkum a vývoj pro inovace.

Finanční podpora byla poskytnuta Evropským fondem pro regionální rozvoj

a státním rozpočtem České republiky.

Poděkování

Chtěla bych poděkovat doc. RNDr. Vojtěchu Adamovi, Ph.D., vedoucímu své di-

plomové práce. Velké díky patří především RNDr. Michalovi Masaříkovi, Ph.D, za od-

borné vedení a pomoc při vypracování této práce, dále MUDr. Jaromíru Gumulcovi,

Mgr. Martině Raudenské, Ph.D. a všem dalším kolegům z ústavu patologické fyziologie

LF MU, kde tato práce vznikla. Díky patří také Dr. Vladimíru Pekaříkovi, Ph.D., za

přípravu plazmidu.

Obrovské díky patří mému příteli Tomášovi za obrovskou trpělivost a podporu. Ta-

ké bych ráda poděkovala své mamince a celé rodině, za to že mě vedli správným smě-

rem.

Tato práce byla podpořena projekty NanoBioMetalNet CZ.1.07/2.4.00/31.0023 a

CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068.

Abstrakt

Cílem této práce byla především analýza MT a ověření jeho vlivu v patogenezi

nádorových onemocnění. Práce je zaměřena na nádorová onemocnění prsu a prostaty a

roli metalothioneinu (MT) v jejich patogenezi. Experimenty byly prováděny na

buněčných liniích (PNT1A, PC-3, 4T1, 4T1 se zvýšenou expresí MT), ale také na zvíře-

cím experimentálním modelu (myši kmene Balb/c). Analýza byla provedena jak na

úrovni expresí genů MT1 a MT2, tak na proteinové úrovni. U zvířecích modelů byla

navíc provedena analýza exprese genů p53 a MTF-1. Bylo využito MTT testů, systému

xCELLigence RTCA DP a real-time PCR. Z výsledků vyplývá, že exprese genů MT1,

MT2, p53 a MTF-1 i hladina MT1 a MT2 na proteinové úrovni je ovlivněna typem

tkáně. V jaterní tkáni u zvířat s indukovaným nádorem a suplementovaných zinkem je

zvýšená exprese MT1 a MT2 genů. Byl prokázán vliv suplementace zinku na velikost

nádorů.

Klíčová slova

Metalothionein, buněčné kultury, Balb/c myši, zinek, karcinomy prsu, metastázy

Abstract

The aim of this work was mainly MT analysis and verification of its influence in the

pathogenesis of cancer. I focused on breast cancer and prostate cancer and the role of

metallothionein (MT) in their pathogenesis. Experiments were performed on cell lines

(PNT1A, PC-3, 4T1, 4T1 overexpressing MT), but also in an animal experimental

model (mice Balb / c). Analysis was performed at the level of gene expression of MT1

and MT2, and at the protein level. In animal models were also analyzed gene expression

of p53 and MTF-first We used MTT assays, the xCELLigence RTCA DP and real-time

PCR. The results show that the expression of genes MT1, MT2, p53 and MTF-1 and the

level of MT1 and MT2 at the protein level is affected by the type of tissue. In liver

tissue in animals with induced tumors and supplemented with zinc is overexpression

MT1 and MT2 gene. The effect of the supplementation of zinc on tumor size has been

shown.

Keywords

Metallothionein, Cell lines, Balb/c mouse, zinc, breast cancer, metastasis

Obsah

1 Úvod .......................................................................................................................... 9

2 Literární přehled ...................................................................................................... 10

2.1 Metalothionein (MT) ........................................................................................ 10

2.1.1 Struktura metalothioneinu ......................................................................... 10

2.1.2 Izoformy metalothioneinu ......................................................................... 11

2.1.3 Biologické funkce metalothioneinu .......................................................... 13

2.1.4 Genová exprese a syntéza metalothioneinu .............................................. 16

2.1.5 Metabolizmus těžkých kovů a MT ........................................................... 18

2.1.6 Role metalothioneinů v karcinogenezi ..................................................... 19

2.2 Nádorová onemocnění prsu .............................................................................. 20

2.2.1 Biomarkery používané v diagnostice karcinomu prsu .............................. 20

2.2.2 Mutace supresorových genů BRCA1, BRCA2 a p53 ............................... 21

2.2.3 Prediktivní faktory léčebné odpovědi ....................................................... 21

2.2.4 Metalothionein jako nový biomarker v diagnostice karcinomu prsu? ..... 23

3 Cíle práce ................................................................................................................. 24

4 Materiál a metodika ................................................................................................. 25

4.1 Materiál ............................................................................................................ 25

4.1.1 Chemikálie ................................................................................................ 25

4.1.2 Přístrojové vybavení ................................................................................. 25

4.1.3 Plazmid ..................................................................................................... 25

4.2 Metody ............................................................................................................. 26

4.2.1 Buněčné kultivace ..................................................................................... 26

4.2.2 MTT .......................................................................................................... 27

4.2.3 Real-time monitoring pomocí systému xCELLigence RTCA DP ............ 27

4.2.4 Transfekce prsní linie 4T1 ........................................................................ 27

4.2.5 Buněčná invazivita a migrace s použitím systému xCELLigence RTCA

DP ............................................................................................................. 28

4.2.6 Izolace RNA z buněk a reverzní transkripce ............................................ 29

4.2.7 Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (q-PCR)- cDNA z buněk ... 29

4.2.8 Pokusná zvířata ......................................................................................... 29

4.2.9 Aplikace nádorových buněk 4T1 zvířatům ............................................... 30

4.2.10 Sledování růstu nádoru a ukončení experimentu ...................................... 31

4.2.11 Izolace RNA z tkání a reverzní transkripce .............................................. 32

4.2.12 Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (q-PCR)- cDNA z tkání ..... 32

4.2.13 Příprava buněčných lyzátů ........................................................................ 32

4.2.14 Stanovení proteinů .................................................................................... 33

4.2.15 Stanovení MT pomocí Dot Blotu .............................................................. 33

4.2.16 Statistická analýza ..................................................................................... 34

5 Výsledky .................................................................................................................. 35

5.1 Výsledky MTT testů ........................................................................................ 35

5.2 Real-time monitoring pomocí xCELLigence systému ..................................... 35

5.3 Invazivita a migrace buněčných linií ............................................................... 37

5.4 Stanovení exprese MT1 aMT2 z buněčných lyzátů ......................................... 41

5.5 Stanovení exprese MT1, MT2, MTF-1, p53 z tkáňových lyzátů ..................... 43

5.6 Stanovení MT z tkáňových lyzátů na proteinové úrovni ................................. 44

5.7 Zobecnění efektu suplementace zinkem a indukce tumoru na všechny tkáně . 45

5.8 Vliv suplementace zinkem, typu tkáně a indukce nádoru ................................ 46

6 Diskuze .................................................................................................................... 53

7 Závěr ........................................................................................................................ 56

8 Přehled použité literatury ........................................................................................ 57

9 Seznam obrázků ....................................................................................................... 66

10 Seznam tabulek .................................................................................................... 67

11 Přílohy .................................................................................................................. 68

Seznam zkratek

MT metalothionein

AMK aminokyselina

GSH redukovaný glutathion

GSSG oxidovaný glutathion

ATP adenozintrifosfát

GTP guanozintrifosfát

ROS reaktivní formy kyslíku (reactive oxygen species)

DNA/RNA deoxyribonukleová/ribonukleová kyselina

mRNA mediátorová ribonukleová kyselina

MTF-1 metal regulační transkripční faktor

MRE metal responzivní element

GIF růstový inhibiční faktor (growth-inhibitory factor)

CA 15-3 nádorový antigen (cancer antigen 15-3)

CEA karcinoemryonální antigen (carcinoembryonic antigen)

ER estrogenový receptor

PR progesteronový receptor

HER2 lidský receptor epidermálního růstového faktoru 2 (human epidermal

growth factor receptor 2)

9

1 ÚVOD

Co stojí za vznikem nádorového onemocnění? Dá se mu účinně předcházet? Pokud už

se tato nemoc objeví, jakou léčbu zvolit a jakou má člověk šanci, že léčba u něj bude

účinná? Existuje mnoho nezodpovězených otázek na toto téma. Je jasné, že se ve větši-

ně případů nejedná o onemocnění vyvolané jediným faktorem, ale jedná se o multifak-

toriální onemocnění. Není proto divu, že se dnes výzkumem na toto téma zabývá mnoho

pracovišť. Těžko říci, zda se této chorobě dá předcházet, ale je důležité najít účinnou

léčbu. V případě, že již u člověka rakovina propuknula, je velice důležité diagnostikovat

tuto nemoc včas. Tímto problémem se dnes zabývá velké množství vědeckých pracovišť

a mnoho z nich se zaměřilo na hledání markerů, které na nemoc upozorní. V praxi se již

některé z těchto markerů používají, ale i přesto se stále nedaří boj s touto nemocí vyhrát.

Z markerů, které se již zavedly do praxe, bych mohla zmínit prostatický specifický anti-

gen (PSA), který se využívá v diagnostice karcinomu prostaty. U karcinomů prsu se

jako prognostické markery používají estrogenový receptor, progesteronový receptor či

HER2 receptor. U karcinomu prsu hraje ve vzniku tohoto onemocnění velkou roli také

genetika, a proto se do praxe zavedlo genetické testování genů BRCA1 a BRCA2. Ženy

s mutací v tomto genu mají zvýšené riziko vzniku této nemoci. Toto testování je také

jednou z možností jak preventivně předcházet vzniku karcinomu prsu. V této diplomové

práci se zabývám metalothioneinem, jakožto potenciálním markerem v karcinogenezi.

10

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED

2.1 Metalothionein (MT)

Metalothioneiny (MT) jsou nízkomolekulární intracelulární proteiny bohaté na cystein,

jejichž hmotnost se pohybuje v rozmezí 6-10 kDa. [28, 31, 59, 80, 101] Cystein zaujímá

až 30 % hmotnosti molekuly. [59, 91, 96, 97] Díky thiolovým skupinám cysteinu tvoří

metalothionein vazby s atomy kovů, proto má důležitou roli v přenosu těžkých kovů a

jejich detoxikaci. [2, 24, 28, 58, 60, 64, 91] MTs jsou termostabilní proteiny [16, 94] a

obvykle se nachází v intracelulárním prostředí, ale můžeme je nalézt také v krvi, plazmě

či mozkomíšním moku. [13] Nejvyšší koncentrace MT v těle jsou v játrech, ledvinách,

střevech a slinivce břišní. [22] MT byl poprvé popsán v roce 1957, kdy ho při hledání

látek zodpovědných za akumulaci dvojmocných kovů v buňkách ledvin izolovali M.

Margoshes a B. L. Vallee. [65] Následně byl identifikován téměř ve všech organizmech,

a to jak u bakterií, rostlin, bezobratlých, tak i u obratlovců. [63, 80, 91] Díky zvýšené

akumulaci MT v organizmu, který byl vystaven působení těžkých kovů, je MT použí-

ván jako biomarker při sledování znečištění životního prostředí. [76, 81, 103]

2.1.1 Struktura metalothioneinu

Molekula MT je složena ze dvou domén, značených jako α a β domény. [30, 32, 59, 60,

95] β-doména obsahuje devět cysteinových zbytků a má tři vazebná místa. α-doména

má 11 cysteinových zbytků a je schopna vázat 4 dvojmocné ionty (Obrázek č. 1). [33,

91, 95] Jedna molekula MT může navázat až 12 monovalentních iontů nebo 7 dvojmoc-

ných iontů kovů. Afinita k jednotlivým kovům klesá v pořadí Hg-Ag-Cu-Cd-Zn. [22,

59, 60] MT se obvykle vyskytuje v komplexu se zinkem či mědi (ZnMT a CuMT) nebo

jako smíšená forma několika kovů (např. Zn, CuMT). U savců je dominantní především

ZnMT forma. [91] Tento termostabilní protein je složen z 61–68 aminokyselin (AMK),

20 z nich jsou cysteiny a nenajdeme zde žádnou aromatickou aminokyselinu či histidin.

[22, 33, 82, 95] Koordinace kovových iontů pak určuje trojrozměrnou strukturu. [16]

Jako apo-MT je označována molekula, která neobsahuje kovy. [16] Je charakteristická

šestkrát opakující se repeticí C-X-C (C značí cystein, X může být libovolná AMK) a

jednou odlišnou sekvencí K-X(1,2)-C-C-X-C-C-P-X(2)-C. [28, 82]

11

Obrázek 1: Struktura metalothioneinu MT složený ze dvou domén (α-doména a β-doména).

Tečkovaně jsou naznačeny vazby mezi cysteiny obsahující –SH skupiny (žlutě) a kovem (ze-

leně). Převzato z http://www.protein.pl [cit. 2012-03-28].

2.1.2 Izoformy metalothioneinu

Metalothionein má čtyři izoformy: MT1 až MT4 (Obrázek č. 2). Zatímco izoformy 1 a

2 se vyskytují v řadě tkání a dominantně vážou kovy, izoformy 3 a 4 se vyznačují bu-

něčnou specifičností. [25, 38, 91, 95] Izoformy MT1 a MT2 se nachází především

v játrech, slinivce, střevech a ledvinách. [6] Izoforma MT3, též nazývaná jako neurono-

vý růstový inhibiční faktor (GIF- growth-inhibitory factor), se vyskytuje především

v mozkové tkáni [69] a byla pozorována i v glomerulech ledvin. [25] Podílí se na vzni-

ku, ale také na průběhu apoptózy mozkových buněk. [94] MT4 se nachází v epitelech a

to hlavně v ústní dutině, horní části gastrointestinálního traktu a v kůži. [57, 82, 91, 99]

Zapojuje se do regulace žaludečního pH a také chrání kůži před spálením a jinými kož-

ními traumaty. [94]

12

Obrázek 2: Izoformy metalothioneinu a jejich lokalizace v savčím organismu. Upraveno dle

[24]

Exprese MT1 a MT2 může být vyvolána mnoha faktory, jako jsou kovy, glukokorti-

koidy, cytokiny či oxidační stres. Exprese MT3 a MT4 je přísně tkáňově specificky re-

gulována. [91] I přes různorodost výskytu jednotlivých izoforem v tkáních jsou mezi

nimi patrné sekvenční shody, jako například vysoký podíl cysteinu (obrázek č. 3). [80]

Izoformy MT1 a MT2 mají roli převážně v detoxikaci kovů, zatímco MT3 se podílí na

udržování homeostázy zinku v neuronech. [28, 70, 82] Exprese genů MT1 a MT2

v orgánech může být mimo jiné ovlivněna pohlavím a věkem. [82] U dospělých savců

byly MT1 a MT2 lokalizovány převážně v cytoplazmě, ale i v lysozomech, mitochon-

driích a v jádrech. Tyto dvě izoformy se vyskytují nejčastěji a byly rozsáhle studovány

zejména ve vztahu k jejich roli v homeostáze kovů a detoxikaci. [38, 82] U lidí bylo

detekováno osm funkčních (MT1A, MT1B, MT1E, MT1F, MT1G, MT1H, MT1X a

MT2A) a sedm nefunkčních (MT1C, MT1D, MT1I, MT1J, MT1K, MT1L a MT2B)

izoforem MT1 a MT2. [36, 62] .

13

Obrázek 3: Porovnání sekvencí AMK izoforem MT1 až MT4 u myši. Na konci sekvence je

uveden počet AMK v daném proteinu. Červeně je vyznačen cystein. Upraveno dle [34]

2.1.3 Biologické funkce metalothioneinu

Metalothionein je považován za „víceúčelový protein“. [13, 16] Jedna z nejdůležitějších

funkcí MT je detoxikace kovů, udržování jejich hladiny v buňkách (zachycení, sklado-

vání, distribuce a vyloučení kovu) a také ochrana před buněčným stresem. [9, 40, 76,

80, 83, 91, 99] MT má vysokou afinitu k zinku a je tedy silným akceptorem zinečnatých

iontů, které do buňky vstupují z extracelulárního prostředí přes cytoplazmatickou mem-

bránu, z lysozomů po degradaci molekul obsahujících zinek nebo po vyloučení Zn2+

z jiných vnitrobuněčných struktur. Zinek má zásadní význam pro zachování zdraví a je

nezbytný pro fungování řady enzymů a transkripčních faktorů. [15, 38, 55, 99] Pět až

dvacet procent zinku nacházejícího se v buňce je asociováno s MT. Díky tomuto „vy-

chytávání“ je intracelulární koncentrace volného zinku nízká. [90, 91] Význam MT je

stále zřetelnější především ve schopnosti udržovat homeostázu. [9, 69]

Mnoho studií poukazuje na to, že MT je jeden z hlavních proteinů vázajících zinek.

[99] I přes vysokou stabilitu komplexu ZnMT mohou být zinečnaté ionty uvolněny

z molekuly a vznikne apo-MT a naopak, kdy se zinek naváže na apo-MT za vzniku mo-

lekuly ZnMT. Toto je možno sledovat u redoxních reakcí prostřednictvím redukované-

ho (GSH) a oxidovaného glutathionu (GSSG), které jsou katalyzovány proteiny obsahu-

jícími selen. GSSG oxiduje ZnMT, dochází ke zvýšenému uvolňování Zn2+

z molekuly

a ke vzniku apo-MT. Tato forma MT může být degradována nebo použita v prostředí

s vysokým obsahem GSH s pomocí selenu jako katalyzátoru. Pokud převládá GSH,

váže se s MT a snižuje uvolňování zinečnatých iontů z molekuly. MT může být rychle

regenerován s rostoucí koncentrací zinečnatých iontů (obrázek č. 4). [16, 23] Zatímco

zvýšená koncentrace GSH snižuje koncentraci volného Zn2+

, ROS a GSSG zvyšují

uvolňování zinku ze ZnMT a jeho přenos do různých jaderných proteinů, které mají

antioxidační působení. [82] Ve výše uvedených mechanizmech je redoxní stav jedním

z hlavních regulátorů výměny Zn2+

mezi MT a dalšími intracelulárními molekulami.

MT1 MDPN-CSCSTGGSCTCTSSCACKNCKCTSCKKSCCSCCPVGCSKCAQGCVCKG…....AADKCTCCA 61

MT2 MDPN-CSCASDGSCSCAGACKCKQCKCTSCKKSCCSCCPVGCAKCSQGCICKE…….ASDKCSCCA 61

MT3 MDPETCPCPTGGSCTCSDKCKCKGCKCTNCKKSCCSCCPAGCEKCAKDCVCKGEEGAKAEAEKCSCCQ 68

MT4 MDPGECTCMSGGICICGDNCKCTTCSCKTCRKSCCPCCPPGCAKCARGCICKG…….GSDKCSCCP 62

14

[97] Extracelulární MT s navázaným kovem může být internalizován endocytózou ná-

sledně vstupuje do lysozomů. V lysozomech je kov uvolněn a apo-MT je hydrolyzován.

[82]

Obrázek 4: Zapojení MT v redoxním cyklu. Při zvýšené koncentraci Zn2+ dochází k jejich

navázání na molekulu apo-MT. V oxidačním prostředí jsou zinečnaté ionty uvolňovány z

molekuly MT a využity proteiny, jako jsou transkripční faktory či metaloenzymy. Oxidovaná

forma apo-MTox může podlehnout degradaci nebo může být využita v redukčním prostředí

s pomocí selenu jako katalyzátoru. MT se následně regeneruje při zvýšení koncentrace

Zn2+

. Upraveno dle [23]

Metalothionein, který váže zinek či měď je důležitým úložištěm těchto kovů, které

jsou kofaktory enzymů a jsou nezbytně důležité pro růst buněk. [74, 93] V případě po-

třeby jsou z MT uvolněny a použity pro syntézu apoenzymů [1, 28, 91]. Poskytování

zinku a mědi je zásadní pro buněčnou proliferaci, diferenciaci a vývoj v prenatálním i

perinatálním období. [54, 71] Zinek se významně podílí na imunitních reakcích, v sig-

nalizačních drahách, rakovině a stárnutí, a změny v jeho hladinách byly pozorovány

také při nervových onemocněních. [44] Díky vlivům na hospodaření s kovy může tedy

MT působit jako významné neuroprotektivum. [13] Uvádí se, že MT se podílí i na rege-

neraci po částečném odstranění orgánu, ochraně před neurodegenerativními onemocně-

ními, ale v některých případech byly pozorovány též genotoxické a karcinogenní účinky

MT. [28, 55, 82].

Kromě funkce uvolňování zinku z molekuly má MT i silné antioxidační vlastnosti, a

to díky vysokému obsahu thiolových skupin, které z něj činí molekulu ideální pro in-

terakci s reaktivními formami kyslíku (ROS). [51, 91] MT odstraňuje volné radikály

vzniklé při běžném metabolizmu či oxidačním stresem, snižuje jejich účinek

15

v cytoplazmě a je považován za stresový biomarker. [76] Dále se váže s GSH, který

bojuje proti produkci volných radikálů v cytoplazmě. [60, 93]

Metalothionein se též podílí na translokaci zinku do mitochondrií a jádra. [2, 58, 60,

70, 82] V mitochondriích byl MT detekován v mezimembránovém prostoru a předpo-

kládá se, že sem vstupuje z cytoplazmy ve formě ZnMT přes vnější mitochondriální

membránu. Mechanizmus zůstává prozatím neznámý. V závislosti na přítomnosti zinku

v mitochondriích reguluje ZnMT aktivitu zinek-dependentních metaloenzymů a regulu-

je rychlost dýchání. [20] Rychlost uvolňování zinku z ZnMT může být podpořena a

posílena vazbou ATP či GTP k metaloproteinu. Kovy rychle se hromadící

v mitochondrii, případně i přes Ca2+

uniport ve vnitřní mitochondriální membráně, se

váží na proteiny přenášející elektrony a zablokují oxidační fosforylaci, což má za násle-

dek nadprodukci ROS. Velká produkce ROS snižuje vazbu kovů na MT, jeho redoxní

funkce a narušuje tvorbu ATP. Nadprodukce ROS může aktivovat mitochondriální pro-

teiny zprostředkovávající signalizační kaskádu vedoucí buňky k apoptóze nebo nekróze.

[82] V jádře je zinek potřebný pro normální funkci histonů a nehistonových proteinů,

metaloenzymů (RNA a DNA polymerázy), transkripčních faktorů, zvláště pak pro

„zink-finger“ proteiny, které regulují aktivitu jednotlivých genů. MT zde představuje

hlavní donor zinku. Bylo zjištěno, že v játrech dospělých zvířat a lidí je na rozdíl od

plodu či novorozence velmi nízký obsah jaderného MT. U rostoucích zvířat byl rovněž

nalezen vysoký obsah MT v jádrech, což odráží zvýšenou potřebu zinku v rychle ros-

toucích buňkách či v reparačních procesech. [47] Jaderný MT pochází z cytozolu, ale

přesný mechanizmus jeho přesunu do jádra není zatím znám. Díky své malé velikost

může MT procházet jadernými póry, ale molekula nacházející se v cytoplazmě musí být

aktivována zatím neidentifikovaným cytozolovým faktorem. V aktivaci by mohly hrát

roli malé G-proteiny a perinukleární cytoskelet. [20] Následně může být molekula MT

přepravována a uchovávána v jádře. Podnětem pro translokaci MT může být obecně

redoxní stav v buňce. Transport do jádra je posílen při oxidačním stresu souvisejícím se

zvýšenou produkcí ROS. [82]

V poslední době se ukazuje, že zvýšená exprese MT v buňkách indukuje antiapopto-

tické účinky. [16, 86, 99] S antiapoptotickým účinkem souvisí aktivace transkripčního

jaderného faktoru (NF-kB), který může být aktivován různými podněty (tumor nekroti-

zující faktor, interleukin 1, hypoxie či ROS). Molekula NF-kB vyskytující se

v cytoplazmě se skládá z podjednotek p50 a p65 a dále z inhibiční podjednotky. Pouze

16

doména p65 obsahuje transaktivační doménu, která aktivuje transkripci genů. [96, 97]

Aktivace NF-kB je uskutečněna disociací její molekuly, degradací inhibiční podjednot-

ky a následně translokaci NF-kB z cytoplazmy do jádra, kde se váže na DNA a indukuje

transkripci řady genů zapojených do buněčné transformace, proliferace a angiogeneze.

Zajímavé je, že tyto podněty aktivují zároveň MT, který zajišťuje stabilizaci NF-kB na

DNA (obrázek č. 5). [52, 99] V souvislosti s aktivací NF-kB v procesu karcinogeneze se

jako karcinogeny a nádorové promotery uvádějí toxické kovy, UV záření, azbest, ben-

zopyren, ROS a další. V některých studiích byla zdokumentována aktivace NF-kB

v nádorových buňkách. Aktivace NF-kB byla následována proliferací těchto buněk.

[96, 97]

Obrázek 5: Antiapoptotická role MT zprostředkovaná interakcí s NF-kB: NF-kB je složena

ze dvou podjednotek P50 a P65, které jsou v cytoplazmě asociovány s inhibiční podjednot-

kou I-kB. Oxidací jsou aktivovány proteinkinázy a dochází k odštěpení inhibiční podjednot-

ky I-kB od NF-kB. Inhibiční podjednotka je následně fosforylována a degradována. Disoci-

ační komplex NF-kB nyní může být translokován do jádra, kde se váže na DNA a aktivuje

transkripci řady genů. MT zde působí jako stabilizátor vazby NF-kB na DNA. Upraveno dle

[99]

2.1.4 Genová exprese a syntéza metalothioneinu

V savčím genomu se nachází více genů pro MT, které ho kódují. U hlodavců je MT

řízen čtyřmi geny nacházející se na chromozomu 8 (MT1 až MT4). Lidský MT je kódo-

ván 17 geny, které se nachází na chromozomu 16. [9, 22, 29, 56] Z nichž 13 genů kódu-

je izoformu MT1, 2 geny izoformu MT2, jeden gen je určen pro izoformu MT3 a jeden

17

pro MT4. [69] U těchto genů byl zjištěn výrazný polymorfizmus a každá forma má také

více izoforem, které se mohou vyskytovat v různých částech tkání. [16, 82, 95] Jejich

přesné fyziologické role a funkční charakteristiky jsou zatím nejasné. V regulaci genové

exprese MT má klíčovou roli metal regulační transkripční faktor (MTF-1), který aktivu-

je transkripci MT v reakci na přítomnost kovů či oxidační stres (obrázek č. 6). [92, 97,

99, 101] Za normálních okolností se MTF-1 v buňce nachází v inaktivním stavu s navá-

zaným MTI, což je inhibitor bránící navázání MTF-1 na MRE. [42, 91] MRE je sek-

vence DNA nutná pro navázání MTF-1 a následné spuštění transkripce a nachází se

v několika kopiích v promotoru všech genů pro MT. [38, 54, 62, 101] Po vstupu iontu

kovu do buňky se tento iont naváže na MTI a uvolní se tím MTF-1, který může zahájit

transkripci MT. Vzrůstající koncentrace těžkých kovů tak může indukovat syntézu MT.

[39, 42] MTF-1 je kovy vázající protein složený z šesti zinkových prstů a vyskytuje se u

mnoha živočišných druhů od hmyzu až po savce. [29, 74] Transkripční faktory, které

jsou ovlivňovány kovovými ionty a regulují expresi genů, patří mezi metal-regulační

proteiny. Metal-regulační proteiny mohou regulovat transkripci nebo stabilitu mRNA a

následnou translaci. [38]

Obrázek 6: Schéma regulace genové exprese MT. Vstup zinečnatých iontů do buňky je za-

jištěn pomocí zinkového transportéru ZIP-1. MTF-1 aktivován zinečnatými ionty se váže na

MRE v promotoru a spouští transkripci apo-MT. Volné zinečnaté ionty se poté vážou na

molekulu apo-MT za vzniku komplexu ZnMT. Upraveno dle [22]

18

Biosyntéza MT je řízená několika faktory. Zvýšená syntéza MT je pozorována v re-

akci na poranění tkání, při infekci, zánětech či nádorových onemocněních. [22] Jedním

z hlavních faktorů je indukce syntézy kovy. [81, 92, 95] Při zvýšeném příjmu zinku či

mědi se zvýší syntéza MT, především v játrech a ve střevech, což je jeden z přímých

mechanismů detoxikace těžkých kovů. Carey a kol. [17] zjistili, že syntéza MT je indu-

kována také při reakci na lipopolysacharidy, které jsou uvolněny při potratech a také při

působení teratogenních faktorů. Metabolizmus MT je velice citlivý na hormonální regu-

laci realizovanou prostřednictvím glukokortikoidů, katecholaminů, glukagonu, steroidů,

interleukinu-6, angiotensinu-2 a různých stresových faktorů. [37, 92, 95] Syntéza MT je

zvýšená u rychle proliferující tkáně, což má důležitou roli u normálních, ale i u nádoro-

vých buněk. Zvýšená koncentrace MT u proliferujících buněk je přičítána vyšší hladině

zinku a mědi a byla zaznamenána u různých nádorových onemocnění. [28, 71] Některé

studie ukazují zvýšenou syntézu MT1 a MT2 u proliferujících a diferencujících se bu-

něk oproti buňkám nedělícím se. Za těchto podmínek byla zvýšená hladina MT jak na

úrovni mRNA, tak na proteinové úrovni. [71, 87, 89, 99] Z těchto výsledků bylo navr-

ženo, že MT buňku chrání před vysokou dávkou zinku vznikem ZnMT. [90]

Metalothionein může být poměrně rychle degradován, přičemž hlavním místem od-

bouráváním jsou lysozomy. [95] Absence MT není smrtelná ani nijak škodlivá

v případech, kdy není organizmus vystaven nadměrnému působení kovů. V případě

absence MT je pozorována snížená tolerance ke kovům, vyšší citlivost k oxidačnímu

stresu, náchylnost k zánětlivým procesům či infekcím. [16]

2.1.5 Metabolizmus těžkých kovů a MT

Těžké kovy se do organizmu dostávají absorpcí kůží, inhalací či ingescí. Vdechnutá

látka, která se nerozpustí v mukózních hlenech přechází do alveol a následně se dostává

do krve. Při ingesci toxicitu kovu ovlivňuje jeho forma, rychlost průchodu trávicím

traktem a množství proteinů, jako jsou právě metalothioneiny. V obou těchto případech

se uplatňují mechanizmy difúze či aktivního transportu vazbou na specifické bílkoviny.

[1] Detoxikace kovů probíhá převážně v játrech a ledvinách, ovšem ke kumulaci kovů

dochází i v mozku a kostech. Těžké kovy navázané na MT jsou tedy transportovány do

ledvin a jater a následně vyloučeny močí a stolicí. [46, 84, 92, 100] Schéma metaboli-

zmu těžkých kovů a zapojení MT v něm je uvedeno na obrázku č. 7.

19

Obrázek 7: Metabolizmus těžkých kovů. Těžké kovy se do organizmu dostávají inhalací, ab-

sorpcí nebo ingescí a dále se dostávají do krevního oběhu. Krví se šíří do jater či ledvin a

následně jsou vyloučeny v komplexu s MT. Upraveno dle [67]

2.1.6 Role metalothioneinů v karcinogenezi

V posledních letech je MT zkoumán jako možný diagnostický marker progrese nádorů.

Některé studie ukazují na zvýšenou hladinu MT v séru pacientů s karcinomem prsu,

plic, trávícího systému, melanomu či urogenitálního traktu. [37, 40] Mezi expresí MT u

jednotlivých typů nádorů existují rozdíly, což je projevem fenotypové rozmanitosti MT.

[37] Obecně je zvýšená hladina MT spojena s horší prognózou. [6, 47] Zdá se, že MT

může chránit nádorové buňky před apoptózou a zvyšovat tak odolnost nádorových bu-

něk vůči radioterapii a chemoterapii. [13, 37, 86] Předpokládá se, že léky používané při

nádorové terapii či jejich metabolity interagují s MT, čímž je inhibována přímá interak-

ce léků s jejich cílem a snížená účinnost terapie. [47, 93, 98] MT také slouží jako dárce

zinku pro transkripční faktory a může tak podporovat nádorovou buněčnou proliferaci či

metastázování. [47] Na druhé straně některé studie zabývající se například karcinomem

tlustého střeva nebo močového měchýře nepotvrdily významnou korelaci mezi expresí

MT a karcinomy. [48, 73] Použití MT jako potenciálního markeru nádorové diferencia-

ce a proliferace je ve stádium intenzivního výzkumu. [28]

Biomedicínské aspekty MT byly zkoumány v onkologických studiích v souvislosti

s cisplatinou, jakožto chemoterapeutikem. [27] Cisplatina je jedním z nejsilnějších pro-

tinádorových léků a je účinná u velké škály nádorů. Používá se také v kombinaci

s radioterapií nebo spolu s chirurgickou léčbou. [53] Cytotoxické účinky cisplatiny jsou

dány její vazbou na jadernou DNA. Narušením struktury DNA způsobí inhibici tran-

20

skripce a oprav jejího poškození [53] a také způsobuje okamžitou indukci syntézy MT.

[16]

2.2 Nádorová onemocnění prsu

Karcinom prsu je nejčastějším nádorovým onemocněním vyskytujícím se u žen a před-

stavuje 23 % z celkového počtu výskytu nádorových onemocnění. [49] I přes zvýšený

výskyt se díky lepší terapii povedlo za posledních dvacet let snížit úmrtnost. [43] Karci-

nom prsu je komplexní genetické onemocnění charakterizované nahromaděním několi-

ka molekulárních změn. [79] Mezi faktory, které přispívají k rozvoji karcinomu prsu,

patří postmenopauzální hormonální terapie, užívání perorální antikoncepce, pozdní věk

při prvním porodu, konzumace alkoholu či obezita, ale také genetické či vrozené fakto-

ry. [3, 49, 75] Riziko vzniku karcinomu prsu roste v případě, pokud má žena blízkou

příbuznou s tímto onemocněním nebo také pokud má více než jednoho vzdáleného pří-

buzného s tímto onemocněním. [68] K základním vyšetřovacím technikám patří mamo-

grafické vyšetření prsu, které se používá jako screeningová metoda. [14] V České re-

publice se dle vyhlášky Ministerstva zdravotnictví ČR č. 3/2010 Sb. o stanovení obsahu

a časového rozmezí preventivních prohlídek provádí mamografické vyšetření u žen od

45 let věku ve dvouletých intervalech. Nicméně senzitivita mamografie se pohybuje

v rozmezí 63 až 87 % a dochází k falešným negativitám. Je tedy na místě doplnit ma-

mografické vyšetření například stanovením biomarkerů pro daný typ karcinomu. Kaž-

dopádně je v dnešní době mamografie stále nejúčinnějším nástrojem pro časnou detekci

karcinomu prsu. [61]

2.2.1 Biomarkery používané v diagnostice karcinomu prsu

Vyšetření biomarkerů je neinvazivní metoda a může omezit množství žen, které musejí

podstoupit zbytečné bioptické vyšetření. Vyšetření nádorových markerů se v hojné míře

používá při kontrole pacientů po léčbě, a tímto způsobem je možno včas rozeznat více

než 50 % případů recidiv. [4] K rutinnímu vyšetření na přítomnost karcinomu prsu se

dnes ve většině diagnostických center používá několik biomarkerů. Prvním markerem

používaným v diagnostice karcinomu prsu byl Cancer antigen 15-3 (CA 15-3). Jedná se

o cirkulující mucinový glykoprotein, jehož hladina v krvi se u zdravých jedinců pohy-

buje pod 30 U/ml. Senzitivita tohoto markeru dosahuje 50–80 %. [4] Dalším používa-

ným markerem je karcinoembryonální antigen (CEA). Tento marker se používá i u ji-

21

ných typů nádorových onemocnění, přičemž u karcinomu prsu se jeho senzitivita pohy-

buje kolem 54 %. Používá se tedy společně s CA 15-3 jako marker druhé řady. U zdra-

vých lidí se jeho hodnota v krvi pohybuje v koncentraci do 3 ng/ml. [4] CEA se vysky-

tuje ve 40–50 % případů s přítomností vzdálených metastáz, zatímco CA 15-3 je zvýšen

především v případě lokálních karcinomů. [3]

2.2.2 Mutace supresorových genů BRCA1, BRCA2 a p53

U žen s významnou rodinnou anamnézou nádorového onemocnění prsu se používá ge-

netické testování pro mutace v tumor supresorovém genu BRCA1 (breast cancer 1) nebo

BRCA2 (breast cancer 2). [68] Gen BRCA1 je lokalizován na 17. chromozomu a je za-

pojen do řízení a kontroly buněčného cyklu a reparace poškozené DNA. Gen BRCA2 se

nachází na 13. chromozomu a je zapojen do procesu homologní rekombinace. [72] Pa-

cientky, u kterých byla zjištěna některá z těchto mutací, mají až devadesátinásobně zvý-

šené riziko vzniku karcinomu prsu. [3] Nositelem BRCA mutace je přibližně 25 % pa-

cientek a i přes negativní výsledek mutačního testu může toto onemocnění propuknout.

U nositelek těchto mutací se doporučuje běžné mamografické vyšetření, ale také pre-

ventivní odstranění prsu a chemoprevence. [85]

Gen p53 je klíčový faktor v buněčné odezvě na poškození DNA a jeho mutací může

dojít k rozvoji nádorových onemocnění. [45] Mutace genu p53 způsobuje zvýšené rizi-

ko onemocnění různými nádorovými onemocněními, včetně karcinomu prsu. [3, 93]

Mutace genu p53 byla nejčastěji identifikována právě u tohoto onemocnění a je spojena

s horší prognózou. Bylo prokázáno, že mutace v tomto genu je spojena s rezistencí

k endokrinní terapii, radioterapii i k chemoterapii. [11] Dále byla také prokázaná pozi-

tivní korelace mezi mutací genu p53 a zvýšenou hladinou MT1 a MT2 u nádorových

onemocnění. [78]

2.2.3 Prediktivní faktory léčebné odpovědi

K hodnocení prognostických a prediktivních informací o reakci na léčbu pacientky se

používají následující faktory: estrogenový receptor (ER), progesteronový receptor (PR)

a HER2 (human epidermal growth factor receptor 2). [79]. V současně době se uznává

především kombinace těchto faktorů pospolu. V tomto případě se nejedná o cirkulující

markery, ale stanovují se přímo z izolované tkáně. [77]

22

a) Estrogenový receptor (ER) byl poprvé identifikován v roce 1960 a následné

studie prokázaly jeho významný vliv v karcinogenezi. Jeho inhibice pro-

střednictvím antagonistů estrogenu nebo blokací konverze androgenů na es-

trogen tvoří základ endokrinní terapie karcinomu prsu. Od roku 1970 se ER

používá jako ukazatel endokrinní odpovědi na léčbu a také jako prognostický

faktor pro předčasný návrat onemocnění [79] Až 65 % nádorů u žen mlad-

ších 50 let jsou ER+ a toto číslo se zvyšuje až na 80 % u žen starších 50 let.

[7] ER+ nádory jsou dobře diferencované a vyznačují se nízkou agresivitou

primárního nádoru a jsou spojeny s lepšími klinickými výsledky po chirur-

gickém odstranění. [19] U estrogen-negativních nádorů (ER-) je nepravdě-

podobné, že pacientka zareaguje na hormonální léčbu. [11, 79] Karcinom

prsu je však poměrně heterogenní skupina nádorů a léčbu mohou ovlivňovat

různé rizikové faktory, klinické chování a také biologie pacientů. Nádory

jsou značně odlišné a bylo prokázáno, že na rozdíl od očekávaného, reagova-

lo na hormonální léčbu pouze cca 50 % pacientek s ER+ nádory. [18] Stejně

tak je doloženo, že malá část pacientek s ER- nádory na hormonální léčbu

reaguje. [8]

b) Nádory pozitivní na progesteronový receptor (PR) tvoří další podstatnou část

karcinomů prsu. PR+ nádory mají lepší prognózu než PR- karcinomy. Studie

ukazují, že podobně jako ER status, může PR status předpovědět reakci na

hormonální léčbu. Nicméně byly hlášeny i falešné PR pozitivity či falešně

negativní výsledky. [5]

c) Kombinace expresí obou výše uvedených hormonálních receptorů lze dosáh-

nout lepší předpovědi reakce na léčbu. Jsou uznány čtyři expresní kombinač-

ní skupiny: dvojitě pozitivní (ER+/PR+), jedna pozitivita (ER+/PR- nebo

ER-/PR+) a dvojitě negativní (ER-/PR-). Nejčastěji se vyskytuje skupina

dvojitě pozitivní (55–65 %) a vyznačuje se nejlepší prognózou a dobrou ode-

zvou na hormonální léčbu. Uvádí se, že 75–85 % pacientek s nádory

ER+/PR+ reagují na hormonální terapii, zatímco pacientky s nádory ER-/PR-

reagují pouze v 10 %. [26] Dvojitě negativní skupina nádorů (18–25 %) je

spojena s absencí reakce na hormonální léčbu, vyšší recidivou karcinomu a

s nižším celkovým přežitím. [10] Třetí nejvíce se vyskytující skupinou jsou

ER+/PR- nádory (12–17 %) a zbytek tvoří skupina ER-/PR+. Hormonální te-

23

rapie je v těchto případech méně účinná než v případě dvojitě pozitivních

karcinomů, úspěšnost se udává kolem 40 %. [26]

d) Klinický význam exprese HER2 v roli karcinomu prsu byl uznán roku 1987.

[88] Jeho zvýšená exprese je prokazatelná u 25–30 % invazivních karcinomů

prsu a hraje důležitou roli v nádorové transformaci, proliferaci a procesu me-

tastázování. [3] Některé studie naznačují, že zvýšená exprese HER2 zvyšuje

rezistenci k hormonální léčbě u ER+/PR+ nádorů. [88]

e) Analýzou kombinací výše uvedených tří markerů karcinomu prsu se zabývá

mnoho studií. Většina z nich klasifikuje karcinomy ER+/PR+/HER2+ jako

nádory luminálního typu, zatímco ER-/PR-/HER2- (tzv. tripl negativní kar-

cinom) jako karcinomy bazálního typu. Luminální nádory zahrnují největší

podíl karcinomů prsu a použití dalších markerů by mohlo mít důležitý kli-

nický význam. U karcinomu ER+/PR+/HER2- byla pozorována nejlepší re-

akce na hormonální léčbu. [79]

2.2.4 Metalothionein jako nový biomarker v diagnostice karcinomu prsu?

Je známo, že estrogeny hrají významnou roli v tumorgenezi rakoviny prsu. U některých

izoforem MT se předpokládá funkce podobná estrogenům a mohou mít vliv na diferen-

ciaci nádoru prsu. [47, 78, 94] Zvýšená exprese MT u karcinomu prsu je spojována

s horší prognózou onemocnění a větší pravděpodobností relapsu. [12, 37, 86] Vazques-

Ramirez a spol. udávají, že zvýšená exprese MT u karcinomu prsu je asociovaná

s metastatickým potenciálem, nikoli s přežíváním pacientů nebo recidivou. Studie uka-

zují, že u nádorových onemocnění prsu jsou zvýšené exprese MT2A, MT1E a MT1F

izoforem [78, 93], přičemž nejvíce zvýšená je exprese MT2A. [47, 50, 102] Hladina

MT stoupá s ohledem na klinické stadium nemoci. [11] Nejvyšší hladina MT2A je za-

znamenávána u histologického gradingu 3, a to jak na úrovni mRNA, tak na úrovni pro-

teinu. [50, 78, 93] U karcinomu prsu byla v mnoha případech pozorována signifikantně

vyšší hladina MT v ledvinách a v játrech. [34] Jak víme MT je silně asociován

s buněčnou proliferací, a proto je zkoumán jako potenciální prognostický biomarker

nejen u nádorových onemocnění prsu.

24

3 CÍLE PRÁCE

Cílem této práce byla analýza MT u prostatických a prsních buněčných linií vystave-

ných působení různých koncentrací zinečnatých iontů. Zaměřili jsme se na cytotoxicitu

zinku pro jednotlivé linie a také na jejich invazivní a migrační schopnosti. Dalším kro-

kem byla aplikace nádorových buněk pokusným zvířatům a následná charakterizace

nádorové masy. Dalším cílem byla změna exprese genu pro metalothionein u prsní linie

4T1 pomocí transfekce expresního plazmidu a porovnání s netransfekovanou prsní linií.

Dílčí cíle diplomové práce jsou tyto:

Kultivace zdravých a nádorových buněčných linií odvozených z karcinomu

prostaty a prsu

Charakterizace buněčných linií a studium jejich invazivity, studium cytotoxicity

zinku

Změna exprese genu pro metalothionein v nádorové prsní linii a porovnání

invazivity s netransfekovanou linií

Aplikace nádorových prsních buněk pokusným zvířatům, sledování růstu nádorů

a následná charakterizace nádorové masy

25

4 MATERIÁL A METODIKA

4.1 Materiál

4.1.1 Chemikálie

Médium RPMI 1640 (PAA, Rakousko), FBS- fetální bovinní sérum (PAA, Rakousko),

ATB- penicillin/ streptomycin (PAA, Rakousko), 1 mM pyruvát sodný (PAA, Ra-

kousko), glukóza (PAA, Rakousko), EDTA- kyselina ethylendiamintetraoctová (PAA,

Rakousko), trypsin (PAA, Rakousko), PBS (Invitrogen, USA), matrigel (Sigma- Ald-

rich, Německo), ZnSO4 (Sigma-Aldrich, Německo), RNA TriPure Isolation Reagent

(Roche, Švýcarsko), Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, USA), RIPA

Buffer (Thermo Scientific, USA), RNA LATER (Applied, Biosystems, USA)

4.1.2 Přístrojové vybavení

Inverzní mikroskop NICON ECLIPSE TS100 (Nicon, Japonsko), centrifuga 5810 R

(Eppendorf, Německo), CO2 termobox (Sanyo, Schoeller), přístroj na počítání buněk

Casy Model TT System (Roche, Švýcarsko), laminární box Clean Air pro práci ve ste-

rilním prostředí (Sanyo, Scholeller), Versa Max tunable microplate reader (Molecular

Devices, USA), NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, USA), real-time PCR systém 7500

(Applied, Biosystems, USA), mixing block MB-102 (Alpha Laboratories, Hampshire),

xCELLigence „Real-Time Cell Analyzer“ (Roche, Švýcarsko), homogenizátor ultra

turrax T8 (IKA, Německo)

4.1.3 Plazmid

K transfekci buněčné linie 4T1byl využit expresní plazmid pMT10 vytvořený na

pracovišti Středoevropského technologického institutu Masarykovy Univerzity. Plazmid

byl pomnožen v DH5α kmeni E.coli.

Plazmid pMT10 obsahuje:

1. inzert: kódující sekvence (ORF = open reading frame) lidského genu MT1A fú-

zovaná s HA štítkem (HA Tag sekvencí). HA Tag sekvence je úsek DNA kódu-

jící hemaglutininovou kotvu užitečnou pro detekci a purifikaci proteinu.

2. reportérový gen: oranžový fluorescenční protein mOrange (excitační a emisní

maxima 548nm respektive 562 nm).

26

3. sekvenci zajišťující rezistenci k Ampicilinu

4. počátek replikace: pUC

5. eukaryotický promotor: CAG promotor (kombinace enhancerových sekvencí

cytomegaloviru a promotoru pro kuřecí beta-aktin)

6. poly A signál (pA): králičí beta-globinový poly A signál

7. T2A peptid: pokud je klonován mezi geny, umožňuje efektivní výrobu a oddě-

lování proteinů, v tomto případě MT1A a mOrange

Struktura transkriptu byla následující:

3´-UTR - mOrange – T2A – MT1A – HA – pA

Struktura exprimovaných proteinů byla následující:

mOrange-T2A + MT1A-HA

4.2 Metody

4.2.1 Buněčné kultivace

Prsní nádorové buňky 4T1 byly izolovány ze spontánního prsního karcinomu myši

BALB/c. Tyto buňky jsou vysoce náchylné k metastázování především do kostí, plic,

jater a mozku. Buňky byly získány z Ústavu experimentální biologie Přírodovědecké

fakulty Masarykovy univerzity. Dále byly použity dvě prostatické linie: PNT1A a PC-3.

Linie PNT1A je odvozena ze zdravé prostatické tkáně a byla získaná od 35letého muže

post mortem. Linie PC-3 je odvozena z adenokarcinomu prostaty 62letého může a byla

získaná z metastází bederních obratlů. Prostatické linie byly zakoupeny od HPA Culture

Collections (Salisbury, UK).

Buňky linie 4T1 byly kultivovány v médiu RPMI 1640 doplněným 10 % FBS, 100

U/ml penicillinu a 100 µg/ml streptomycinu, 1 mM pyruvátem sodným a 4,5 g/l glukó-

zy. Buňky linie PNT1A byly kultivovány v médiu RPMI 1640 doplněným 10 % FBS,

100 U/ml penicillinu a 100 µg/ml streptomycinu. Linie PC-3 byla kultivována v médiu

HAM´S F12 doplněným 10 % FBS, 100 U/ml penicillinu a 100 µg/ml streptomycinu.

Buňky byly uchovávány v CO2 termoboxu (Sanyo, Schoeller) při 37 °C a 5% koncent-

raci CO2. Při kultivaci byla dále použita EDTA, která na sebe váže Ca2+

a Mg2+

, jež se

přirozeně vyskytují v kultivačním prostředí. Vyvázáním těchto iontů je ulehčena ná-

sledná manipulace s buňkami. Trypsin používaný při pasážování buněk byl zakoupen

27

od PAA, Rakousko. Buňky byly kultivovány v plastových kultivačních láhvích o obje-

mu 25 ml nebo na petriho miskách a průměru 10 mm (TPP, Švýcarsko).

4.2.2 MTT

MTT test se používá k určení toxicity látek vůči buněčným liniím. Princip testu je zalo-

žen na redukci MTT na formazan a hodnotí viabilitu buněk v daném prostředí. MTT

látka je žluté vodorozpustné tetrazolium barvivo, které živé buňky metabolizují na fia-

lový formazan. Do 96 jamkové mikrotitrační destičky byla napipetována suspenze bu-

něk, přičemž jamky ve sloupci 1 a 12 obsahovaly pouze čisté médium bez buněk. Na

jednu jamku je počítáno s 10 000 buňkami. Takto naplněná destička byla vložena do

CO2 termoboxu a buňky se nechali narůst na 70% konfluenci. Po této době byla

k buňkám přidána koncentrační řada testované látky. V této fázi byla destička opět ulo-

žena na 48 hodin do CO2 termoboxu. Po této inkubační fázi byl odstraněn obsah jamek

1–12 a do jamek bylo napipetováno 200 µl čistého média a 50 µl MTT (5mg/ml desti-

lované vody). Destička byla zabalena do alobalu, jelikož MTT látka se na světle rozklá-

dá, a vložena do CO2 termoboxu na 4 hodiny. Poté byl obsah jamek opět odstraněn a do

jamek bylo přidáno 200 µl DMSO a 25 µl glycinového pufru. V takto zhotovené destič-

ce byla změřena absorbance při 570 nm (Versa Max tunable microplate reader).

4.2.3 Real-time monitoring pomocí systému xCELLigence RTCA DP

Real-time monitoring je metoda, která umožňuje nepřetržité sledování buněčné adheze a

proliferace, životaschopnosti a cytotoxicity testovaných látek. Informace o růstu buněk,

změnách a buněčné smrti jsou získávány během celého experimentu pomocí zlatých

elektrod na dně jamek E-plate destičky. Do každé jamky byla na začátku experimentu

napipetována buněčná suspenze, přičemž na každou jamku bylo použito 10 000 buněk.

Takto připravená destička byla vložena do stanice, která je umístěná v CO2 termoboxu.

V růstové fázi buněk byla poté přidána testovaná látka v koncentrační řadě a destička

byla opět vložena do stanice. Systém zaznamenává data v námi zvolených intervalech a

výstupem tohoto přístroje jsou růstové křivky.

4.2.4 Transfekce prsní linie 4T1

Buňky byly kultivovány v 75 ml kultivačních lahvích (TPP, Švýcarsko) na 70% kon-

fluenci. Médium bylo odsáto a buňky byly dvakrát promyty fosfátovým pufrem. Ná-

28

sledně bylo k buňkám přidáno 10 ml čerstvého média. Plazmid pMT10 (22,5 µl o kon-

centraci 3500 ng/µl) byl rozsuspendován v 900 µl 150mM NaCl a bylo přidáno 67,5 µl

PEI (polyethylenimin 1 mg/ml). Vše bylo promícháno a směs se nechala inkubovat 10

minut při laboratorní teplotě. Následně byla směs s plazmidem přidána k buňkám do

média. V CO2 termoboxu byly buňky inkubovány po dobu 24 hodin. Následně byla

hodnocena úspěšnost transfekce pomocí fluorescenčního mikroskopu. Transfekované

buňky budou dále označovány jako buňky 4T1t.

4.2.5 Buněčná invazivita a migrace s použitím systému xCELLigence RTCA DP

K analýze byl použit systém xCELLigence RTCA DP v kombinaci s CIM (Cell Invasi-

on and Migration) destičkami. Tento systém umožňuje nepřetržitě monitorovat postup

buněk z horní části destičky přes porézní membránu směrem do spodní části destičky.

Na spodní straně membrány jsou mikroelektrody, které zaznamenávají postup buněk.

Z petriho misky, na které byly buňky narostlé na 60–80% konfluenci bylo odsáto médi-

um a miska byla propláchnuta 2 ml média bez séra, které bylo nahřáté na 37 ºC.

K buňkám bylo přidáno 10 ml média bez séra a buňky byly vloženy zpět do CO2 termo-

boxu k vyhladovění. 16 jamková destička byla pomyslně rozdělena na dvě části, jedna

část byla použita na studium migrace a druhá na studium invazivity buněk. K analýze

buněčné invazivity byl použit matrigel (Sigma- Aldrich, Německo), který byl naředěn

v poměru 1:40 s vychlazeným kultivačním médiem bez séra. Do osmi jamek horní části

destičky bylo napipetováno 50 µl naředěného matrigelu a následně bylo 30 µl odpipeto-

váno, tak aby v jamce zbylo jen 20 µl matrigelu. Pro migrační analýzu byla horní část

destičky ponechána bez matrigelu. Destička byla poté vložena do CO2 termoboxu a mat-

rigel se nechal 4 hodiny polymerovat. Do spodní destičky bylo napipetováno 178 µl

média se sérem či bez něj dle příslušné buněčné linie. Sérum zde působí jako chemoa-

traktant. Horní část destičky byla spojena se spodní části a do každé jamky horní části

destičky bylo napipetováno 30 µl média bez séra. Takto připravená destička byla vlože-

na do CO2 termoboxu a hodinu se nechala temperovat. Z petriho misek s buňkami bylo

odsáto bezsérové médium a buňky byly propláchnuty 2 ml EDTA. Následně byla

k buňkám opět přidána EDTA a misky byly vloženy na tři minuty do termoboxu. Po

této inkubaci byly buňky spláchnuty z povrchu misky pomocí pipety a buněčná suspen-

ze byla přenesena do centrifugační zkumavky. Suspenze byla následně centrifugována

při 300 g a 22 ºC po dobu 5 minut. Supernatant byl odstraněn a buňky byly rozsuspen-

29

dovány v adekvátním objemu bezsérového média. Byla spočítána koncentrace buněk a

buňky byly naředěny na koncentraci 7,5 × 105

buněk na 1 ml média. Do všech jamek

destičky bylo nakonec napipetováno 100 µl naředěné buněčné suspenze a destička byla

vložena do stanice a bylo spuštěno vlastní měření. Relativní změna impedance (buněčný

index) byla měřena v intervalu 15 minut po dobu několika hodin.

4.2.6 Izolace RNA z buněk a reverzní transkripce

Pro izolaci RNA z buněčných kultur byl použit High pure total RNA izolační kit

(Roche, Švýcarsko). Médium bylo odsáto z krabiček a buňky byly propláchnuty ledo-

vým PBS. Poté byly buňky seškrábnuty a ve zkumavkách centrifugovány při 20 800 g,

5 minut při teplotě 4 °C. Následně byla provedena vlastní izolace dle pokynů výrobce.

Vyizolovaná DNA byla následně použita pro syntézu cDNA. Celková RNA (600 ng)

byla přepsána pomocí Transcriptor first strand cDNA synthesis kit (Roche, Švýcarsko)

dle návodu výrobce.

4.2.7 Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (q-PCR)- cDNA z buněk

Připravená cDNA (20 µl) byla zředěna destilovanou vodou prostou RNáz na objem

100 µl a 5 µl bylo analyzováno pomocí 7500 real-time PCR systém (Applied Biosys-

tems). Q-PCR byla provedena v triplikátech s využitím TaqMan genové expresní eseje.

Amplifikovaná DNA byla analyzována srovnávací metodou Ct pomocí β-aktinu (Hs

00185826_m1 Actb, Mm 00607939_s1 Actb) jako endogenní kontroly pro geny MT1

(Hs 00185826_m1 Mt1, Mm 00496660_g1 Mt1) a MT2 (Hs 00794796_m1 Mt2, Mm

04207591_g1 Mt2). Q-PCR byla provedena za následujících podmínek: celkový objem

20 µl, počáteční inkubace 50 °C/2 min, následující denaturace 95 °C/10 min- celkem 45

cyklů 95 °C/15 sec, 60 °C/1 min.

4.2.8 Pokusná zvířata

Šest až osm týdnů staré myši (Mus musculus), samice BALB/c (hmotnost 21–27 g),

byly chovány v prostředí s řízeným světelným a ventilačním režimem. Voda i krmivo

bylo zvířatům přístupné ad libitum. Při pokusech byly dodržovány veškeré zásady pro

práci s pokusnými zvířaty dle pokynů Evropského společenství. Pokusy byly prováděny

na základě schváleného projektu pokusu č. 23473/2010-30. Zvířata byla rozdělena do

čtyř skupin po osmi samicích. První skupina sloužila jako kontrola. Zvířatům ve druhé

30

skupině byl průběžně intraperitoneálně (i.p.) aplikován zinek v celkové dávce 150

mg/kg ZnSO4, která byla rozdělena do čtyř dávek ve schématu: 1. týden dávka 25

mg/kg, 2. týden dávka 50 mg/kg, 3. týden dávka 50 mg/kg a 4. týden dávka 25 mg/kg

ZnSO4. Třetí a čtvrté skupině myší byla v den zahájení experimentu aplikována suspen-

ze prsních nádorových buněk linie 4T1, přičemž čtvrtá skupina byla poté také suple-

mentována zinkem v celkové dávce 150 mg/kg ZnSO4.

4.2.9 Aplikace nádorových buněk 4T1 zvířatům

Buňky byly kultivovány na 70% konfluenci v 25 ml plastových kultivačních láhvích. Po

odsátí média a následném promytí EDTA a trypsinem byly buňky spláchnuty do kulti-

vačního média a suspenze centrifugována při 800 g, 4 °C, 7 minut (Eppendorf, Němec-

ko). Supernatant byl odsát a peleta buněk byla rozsuspendována v PBS. Buňky byly

spočítány pomocí Casy Model TT Systému (Roche, Švýcarsko) a následně bylo ode-

bráno množství potřebné k aplikaci myším. Nádorové buňky byly myším aplikovány

v celkové anestezii (1% narkamon + 2% rometar v dávce 0,5 ml na 100 g váhy)

v množství 1 × 105

v 20 µl PBS a Matrigelu v poměru 1:1 do čtvrtého struku mléčné

žlázy (pars abdominalis) viz obrázek č. 8.

31

Obrázek 8: Místo aplikace nádorových buněk. Nádorové buňky 4T1 byly aplikovány do

čtvrtého mléčného struku (pars abdominalis). Upraveno dle

http://www.informatics.jax.org/cookbook/

4.2.10 Sledování růstu nádoru a ukončení experimentu

V průběhu experimentu byly všechny čtyři skupiny dvakrát týdně kontrolovány a byl

sledován růst nádoru. V místě aplikace byla pomocí posuvného měřítka měřena délka a

šířka nádoru a bylo prováděno také kontrolní vážení (viz. Přílohy, tabulka A). Experi-

ment byl ukončen po měsíčním sledování. Myši byly uvedeny do celkové anestezie (1%

narkamon+ 2% rometar v dávce 0,5 ml na 100 g váhy) a byla jim do eppendorfových

zkumavek s 60 µl 0,5 M EDTA odebrána veškerá krev, která byla poté zamražena na -

80 °C. Následně byla přestřižena páteř a mícha a odebrány orgány (plíce, játra, slezina,

ledviny, mozek.) U nádorových skupin byl odebrán také primární nádor. Všechny tkáně

byly rozděleny na dvě skupiny. Tkáně z první skupiny na analýzu proteinů byly vloženy

do odběrových zkumavek a zamraženy na -80 °C. Tkáně z druhé skupiny byly vloženy

do odběrových zkumavek obsahující RNA later a uloženy do lednice pro pozdější izola-

ci RNA.

32

4.2.11 Izolace RNA z tkání a reverzní transkripce

Pro izolaci RNA ze tkání byl použit TriPure Isolation Reagent kit. Vzorky tkáně byly

před homogenizací nakrájeny na malé kousky o hmotnosti 20 mg a byly doplněny 200

µl TriPure Isolation reagencie. Následně byla provedena důsledná homogenizace vzor-

ku. Poté byl vzorek inkubován 5 minut při laboratorní teplotě (23 °C). V této fázi do-

chází k disociaci nukleoproteinových komplexů, což je důležité pro následnou čistotu

vzorku. Po inkubaci bylo k vzorku přidáno 40 µl čistého chloroformu, vzorek byl 15

sekund vortexován a inkubován 15 minut při laboratorní teplotě. Dalším krokem byla

centrifugace vzorku při 10 600 g, 15 min, 2 °C. Horní vrstva byla odebrána do čisté

mikrozkumavky a bylo přidáno 100 µl izopropanolu. Vzorek byl promíchán, nechal se

inkubovat 10 minut při laboratorní teplotě a následně byl centrifugován při 10 600 g, 10

min, 2 °C. Supernatant byl odstraněn a pelet byl promyt 200 µl 75% etanolem. Po ná-

sledné centrifugaci při 8 400 g, 5 min, 2 °C byl odstraněn supernatant, pelet se nechal

vyschnout a poté byl rozsuspendován v 50 µl vody prosté RNázy. Následovala 15 minu-

tová inkubace vzorku při 58 °C, promíchání a stanovení koncentrace RNA pomocí pří-

stroje nanodrop. Izolovaná RNA byla použita pro syntézu cDNA pomocí first strand

cDNA synthesis kit (Roche, Switzerland).

4.2.12 Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (q-PCR)- cDNA z tkání

Připravená cDNA (20 µl) byla zředěna destilovanou vodou prostou RNáz na objem 100

µl a 5 µl bylo analyzováno pomocí 7500 real-time PCR systém (Applied Biosystems).

Q-PCR byla provedena v triplikátech s využitím TaqMan genové expresní eseje. Ampli-

fikovaná DNA byla analyzována srovnávací metodou Ct pomocí β-aktinu (Mm

00607939_s1 Actb) jako endogenní kontroly pro geny MTF-1 (Mm 00485274_m1

Mtf1), p53 (Mm 01731290_g1 Trp53), MT1 (Mm 00496660_g1 Mt1) a MT2 (Mm

04207591_g1 Mt2). Q-PCR byla provedena za následujících podmínek: celkový objem

20 µl, počáteční inkubace 50 °C/2 min, následující denaturace 95 °C/10 min- celkem 45

cyklů 95 °C/15 sec, 60 °C/1 min.

4.2.13 Příprava buněčných lyzátů

Pro přípravu buněčných lyzátů bylo použito 20 mg vzorku nakrájeného na malé kousky.

Pro analýzy byly připraveny dva druhy lyzátů: tepelné lyzát a RIPA lyzát. V případě

RIPA lyzátu bylo ke vzorku tkáně přidáno 200 µl RIPA lyzačního pufru s přídavkem

33

inhibitoru proteináz a vzorek byl důkladně homogenizován. Následně byl vzorek centri-

fugován při 20 800 g, 30 minut, 4 °C. Supernatant byl odebrán do čisté zkumavky a

zamražen na -80 °C pro následné stanovení proteinů.

V případě tepelného lyzátu bylo ke vzorku přidáno 200 µl fosfátového pufru a vzorek

byl homogenizován. Následně byl vzorek zahřán na 99 °C po dobu 15 minut, aby došlo

k denaturaci proteinů. Po této denaturaci ve vzorku zůstanou pouze termostabilní pro-

teiny, mezi které patří i MT. Po denaturaci vzorku byla provedena centrifugace při 20

800 g, 30 minut, 4 °C a supernatant byl uložen při teplotě -80 °C pro další analýzy.

4.2.14 Stanovení proteinů

Celkové množství proteinů v lyzátech bylo stanoveno pomocí Pierce BCA Protein

Assay Kit. Standard přiložený výrobcem (roztok BSA o koncentraci 2000 µg/ml) byl

naředěn dle návodu výrobce na koncentrace: 2000 µg/ml, 1500 µg/ml, 1000 µg/ml,

750 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml , 125 µg/ml a 25 µg/ml. Dále byl připraven BCA pra-

covní roztok smícháním roztoků BCA reagent A a BCA reagent B v poměru 50:1

v množství potřebném pro analýzu. Do 96 jamkové mikrotitrační destičky bylo napipe-

továno 10 µl standardu či vzorku a přidáno 200 µl BCA pracovního roztoku. Destička

se nechala inkubovat 30 minut při teplotě 37 °C a poté byla zchlazena na pokojovou

teplotu. Následně byla změřena absorbance při 562 nm na přístroji Versa Max tunable

microplate reader od firmy Molecular Devices, jako blank byla použita voda. Koncent-

race vzorků byla následně vypočítána z rovnice regrese získané z kalibrační křivky po

proměření absorbancí koncentrační řady standardu.

4.2.15 Stanovení MT pomocí Dot Blotu

Na nitrocelulózovou membránu bylo naneseno 1,5 µl jednotlivých vzorků tepelných

lyzátů a membrána se nechala 15 minut zaschnout. Následně byla membrána hodinu

blokována v 5% mléce s Tween 20 (5 g nízkotučného sušeného mléka na 100 ml vody s

20 µl Tween 20). Membrána byla poté opláchnuta PBS s Tween 20. Membrána byla

následně zalita 10 ml mléka s 10 µl primární protilátky proti myšímu MT (králičí poly-

klonální IgG, Santa Cruz Biotechnology, USA). Membrána byla přes noc inkubována

při 4 °C. Druhý den byla membrána 20 minut inkubována při laboratorní teplotě a ná-

sledně čtyřikrát opláchnuta PBS. Následně byla membrána zalita 10 ml mléka s 10 µl

sekundární protilátky konjugovanou s křenovou peroxidázou (prasečí protilátka proti

34

králičímu IgG+HRP, DakoCytomation, Dánsko). Při laboratorní teplotě byla poté mem-

brána hodinu inkubována na třepačce. Následně byla membrána čtyřikrát po 15 minu-

tách oplachována v PBS a jednou 10 minut v destilované vodě. Membrána byla poté

položena na potravinovou fólii a inkubována ve tmě s 2 ml luminol reagentu (Western

Blotting Luminol Reagent, Santa Cruz Biotechnology, USA) po dobu 5 minut. Mem-

brána byla překryta filmem s fotoreaktivní vrstvou (Medical X-ray CP-BU Film, Agfa,

Belgie) a ponechána 4 minuty. Nakonec byl film vyvolán (Manual fixing bath G354,

manual developer G150, Agfa, Belgie). Membrány byly posléze digitalizovány na pří-

stroji Genius Classic BIO (Syngene, MD, USA), z kalibrační křivky standardu MT o

koncentraci 5 µg/µl byla odečtena fluorescence vzorků v softwaru GeneTools 4 (Syn-

gene, MD, USA).

4.2.16 Statistická analýza

Všechna data byla testována na normalitu pomocí vizuální aspekce histogramů a

pomocí Kolmogorov-Smirnov testu adaptovaného dle Lillieforse, data s log-normálním

rozložením dat byla zlogaritmována. Pro porovnání proměnných byla použita faktoriál-

ní analýza rozptylu, pro porovnání více proměnných také Bonferroniho post-hoc test.

Pro analýzy závislostí byla použita korelace podle Pearlsona. Pokud není zmíněno jinak,

rozdíl na hladině alfa < 0.05 byl považován za statisticky signifikantní. Pro testování byl

použit software Statistica 10 (StatSoft, CA, USA).

35

5 VÝSLEDKY

5.1 Výsledky MTT testů

Pro stanovení cytotoxicity zinku na buněčné linie byl použit MTT test. Aplikace

zinku byla provedena po 48 hodinách od nasazení buněk do mikrotitrační destičky. Byly

použity následující koncentrace zinku: 0, 25, 50, 75 a 100 µM. Z obrázku 9 je patrné, že

u prostatické buněčné linie PNT1A (kontrolní linie) nedocházelo ke změnám absorban-

ce, efekt přidaného zinku neměl tedy žádný vliv na životaschopnost buněk. Naopak u

nádorových buněk PC-3 a 4T1 dochází po přidání zinečnatých iontů ke snížení viability

buněk. U linie PC-3 docházelo k výraznému snížení viability u koncentrace 75 µM. U

linie 4T1 můžeme pozorovat snížení životaschopnosti buněk již u koncentrace 50 µM.

Dle výsledků MTT testu byly stanoveny následující hodnoty IC50: u linie PNT1A byla

stanovena hodnota 199,5 µM, u linie PC-3 hodnota 86 µM a u prsní linie 4T1 byla sta-

novena hodnota 83,7 µM.

Obrázek 9: Výsledky MTT testu prostatických linií PNT1A a PC-3 a prsní nádorové linie

4T1. Z grafu je patrné, že prostatická linie PNT1A na aplikaci zinku nereagovala. U nádo-

rových linií došlo ke snížení viability.

5.2 Real-time monitoring pomocí xCELLigence systému

Real-time monitoring byl obdobně jako MTT test použit ke stanovení cytotoxicity zinku

na jednotlivé buněčné linie. V čase 24 hodin po nasazení buněk do destičky byla u

všech linií provedena aplikace zinku v koncentracích 0, 25, 50, 75 a 100 µM. V době

36

aplikace byla relativní impedance u prostatických linií poloviční, než tomu bylo u prsní

nádorové linie. Impedance byla měřena po dobu 180 hodin a poté byl experiment ukon-

čen. Z obrázku 10 je patrné, že u kontrolní prostatické linie PNT1A neměl zinek žádný

vliv na viabilitu buněk ani v nejvyšší koncentraci (100 µM). Na obrázku 11 vidíme

růstové křivky nádorové prostatické linie PC-3. U této linie dochází po přidání zinku ke

smrti buněk již v koncentraci 50 µM. U prsní nádorové linie dochází ke snížení viability

a zastavení růstu buněk taktéž při koncentraci 50 µM (obrázek 12). U jednotlivých linií

byly opět stanoveny hodnoty IC50. U linie PNT1A byla stanovena hodnota 150,8 µM, u

linie PC-3 byla stanovena hodnota 55,5 µM a linie 4T1, kde je hodnota IC50 52,8 µM.

Obrázek 10: Růstové křivky „zdravé“ prostatické linie PNT1A po přidání zinečnatých iontů

v koncentracích 0–100 µM. Můžeme vidět, že tato linie nebyla přídavkem zinku nijak ovliv-

něna. Byla stanovena hodnota IC50 150,8 µM.

37

Obrázek 11: Růstové křivky nádorové prostatické linie PC-3 po přidání zinečnatých iontů v

koncentracích 0–100 µM. Zde je patrné, že již při koncentraci 50 µM dochází k usmrcení

buněk. Byla stanovena hodnota IC50 55,5 µM.

Obrázek 12: Růstové křivky nádorové prsní linie 4T1 po přidání zinečnatých iontů v kon-

centracích 0–100 µM. U této linie dochází ke snížení viability u koncentrace 50 µM. Byla

stanovena hodnota IC50 52,8 µM.

5.3 Invazivita a migrace buněčných linií

Pro analýzu migrace buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A byl použit přístroj xCELLigence

RTCA (Real Time Cell Analyser) DP v kombinaci s destičkami CIM 16 (Cell Invasion

and Migration). Migrující buňky, které jsou v kontaktu s membránou, zvyšují relativní

impedanci. Pro studium chemotaktické migrace bylo do spodní části destičky přidáno

10% FBS jako chemoatraktant (obrázek 13), v případě chemokinetické migrace bylo

38

médium ponecháno bez séra (obrázek 14). Chemokineze je náhodný pohyb buněk

v přítomnosti rovnoměrně distribuovaných rozpustných faktorů. Chemotaxí je myšlena

směrovaná migrace buněk, jejíž směr je dán koncentračním gradientem rozpustných

faktorů. Z naměřených dat jsme zjistili, že buněčná linie PC-3 dosahuje vyšších hodnot

relativní impedance ve srovnání s ostatními analyzovanými liniemi, a to zejména při

použití chemoatraktantu, což ukazuje na zvýšenou migrační aktivitu těchto buněk.

Obrázek 13: Analýza chemotaktické migrace buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A. Buňky byly

nasazeny v hustotě 75 000 buněk na jamku do destiček CIM 16 v médiu bez séra a analyzo-

vány v xCELLigence RTCA DP v intervalu 15 min po dobu 8 hod. Pro monitorování che-

motaktické migrace bylo do spodní části destiček přidáno 10% FBS.

Obrázek 14: Analýza chemokinetické migrace buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A. Buňky byly

nasazeny v hustotě 75 000 buněk na jamku do destiček CIM 16 v médiu bez séra a analyzo-

vány v xCELLigence RTCA DP v intervalu 15 min po dobu 8 hod.

39

Pro analýzu invazivity buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A byl použit přístroj xCELLi-

gence RTCA DP v kombinaci s destičkami CIM 16, ve kterých bylo dno horní části

destiček pokryto Matrigelem, který simuloval bazální membránu (obrázek 15 a 16). Pro

studium chemotaktické invazivity bylo do spodní části destičky přidáno 10% FBS jako

chemoatraktant. Relativní impedance buněk PC-3 byla oproti ostatním testovaným bu-

něčným liniím (u kterých nedocházelo k nárůstu impedance) mírně zvýšena až po 20

hod pouze v případě chemotaktické invazivity.

Obrázek 15: Analýza chemotaktické invazivity buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A. Buňky byly

nasazeny v hustotě 75 000 buněk na jamku do destiček CIM 16 v médiu bez séra a analyzo-

vány v xCELLigence RTCA DP v intervalu 15 min po dobu 24 hod. Membrány v jamkách

horní destičky byly pokryty vrstvou Matrigelu. Pro monitorování chemotaktické invazivity

bylo do spodní části destiček přidáno 10% FBS.

40

Obrázek 16: Analýza chemotaktické invazivity buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A. Buňky byly

nasazeny v hustotě 75 000 buněk na jamku do destiček CIM 16 v médiu bez séra a analyzo-

vány v xCELLigence RTCA DP v intervalu 15 min po dobu 24 hod. Membrány v jamkách

horní destičky byly pokryty vrstvou Matrigelu.

Kromě buněčné migrace a proliferace může přispívat k nárůstu relativní impedance

také zvýšená adheze buněk k povrchu detektoru. Abychom otestovali také míru adheze

buněk na elektrody destičky, byly všechny buněčné linie nasazeny v koncentraci 10 000

buněk na jamku do destiček E- plate, která se vyznačuje stejným povrchem elektrod

jako destičky CIM 16. Buňky byly monitorovány po dobu 6 hodin v 15ti min interva-

lech. Z grafu je patrné, že adheze linií PC-3, 4T1 a 4T1t se mezi sebou výrazně neliší. U

linie PNT1A je patrné, že k adhezi dochází značně pomaleji (obrázek 17).

Obrázek 17: Analýza kinetiky adheze buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A. Buňky byly nasaze-

ny v hustotě 10 000 buněk na jamku do destiček E-plate a analyzovány v xCELLigence RT-

CA DP v intervalu 15 min po dobu 6 hod.

41

5.4 Stanovení exprese MT1 aMT2 z buněčných lyzátů

Na obrázku 18 je znázorněna exprese izoforem MT1 a MT2 v buněčných liniích

PNT1A, PC-3 a 4T1. U izoformy MT1 můžeme vidět snížení exprese u linie PC-3, u

linie 4T1 nebyla pozorována významná změna. Exprese izoformy MT2 byla výrazně

vyšší u obou nádorových linií (PC-3 a 4T1).

Obrázek 18: Exprese izoforem MT1 a MT2 v buněčných liniích

U všech buněčných linií byly stanoveny exprese MT1 a MT2 po aplikaci zinku

v následující koncentrační řadě: 0, 25, 50, 75 a 100 µM. Na obrázku 19 jsou znázorněny

exprese genu MT1. Nebyly pozorovány žádné signifikantní změny. U linie PNT1A mů-

žeme s rostoucí koncentrací zinku pozorovat jen nepatrné změny v expresi. U linie PC-3

je pozorován trojnásobný nárůst exprese v koncentraci 25 µM a její následné výrazné

snížení. U linie 4T1 byl pozorován obdobný trend ve změně exprese (sedminásobné

zvýšení) u koncentrace 75 µM.

42

Obrázek 19: Stanovení exprese izoformy MT1 u buněčných linií PNT1A, PC-3 a 4T1.

Na obrázku 20 jsou znázorněny změny exprese MT2 po aplikaci zinku. Můžeme vi-

dět, že u prostatické nádorové linie PC-3 byla v nejvyšší koncentraci zinku (100 µM)

80krát vyšší exprese v porovnání s nulovou koncentrací (p= 0,001). U linie PNT1A bylo

pozorováno pouze 9,5násobné zvýšeni exprese MT2 (p= 0,0127) a u linie 4T1 nedochá-

zelo k signifikantním změnám v expresi (p= 0,2047).

43

Obrázek 20: Stanovení exprese izoformy MT2 u buněčných linií PNT1A, PC-3 a 4T1.

5.5 Stanovení exprese MT1, MT2, MTF-1, p53 z tkáňových lyzátů

Nejdříve byla analyzována exprese jednotlivých genů (obrázek 21). Exprese sledo-

vaných genů se statisticky významně liší v závislosti na sledované tkáni (p < 0.001). Pro

detailní porovnání byl použit Bonferroniho post-hoc test. Z důvodů velkého množství

dat budu v následujících kapitolách uvádět pouze statisticky významné výsledky. Vyso-

ká míra exprese byla u všech sledovaných genů pozorována v játrech a ledvinách.

Všechny geny vykazovaly obdobné trendy exprese ve všech sledovaných tkáních, kro-

mě mozku. Zatímco exprese MTF-1 a MT1 byla v mozku relativně vysoká, exprese p53

a MT2 byla v porovnání s ostatními tkáněmi na nízké úrovni.

44

Obrázek 21: Exprese genů MTF-1, p53, MT1 a MT2 v jednotlivých tkáních.

5.6 Stanovení MT z tkáňových lyzátů na proteinové úrovni

Následně byla analyzována obdobným způsobem hladina MT proteinu (obrázek 22).

Byl pozorován rozdíl MT mezi různými tkáněmi, avšak tento rozdíl byl pod hranicí sta-

tistické významnosti. Nejnižší hladina byla pozorována u jater a ledvin. U všech tkání

ovšem byla pozorována velká variabilita v hodnotách. Co se týče závislostí mezi hladi-

nou MT proteinu a expresemi sledovaných genů, byla prokázána pouze jediná slabá

negativní korelace s MT1 (tabulka 1). Závislost mezi hladinou MT a expresí genu MT2

nebyla prokázána.

45

Obrázek 22: Hladina MT na proteinové úrovni v jednotlivých tkáních. Nejnižší hladina MT

byla pozorována u jater a ledvin, naopak nejvyšší hladina MT byla u primárního nádoru,

plic a mozku.

Tabulka 1: Korelace mRNA - MT protein

MTF-1 [2-ddCt

] p53 [2-ddCt

] MT1 [2-ddCt

] MT2 [2-ddCt

]

MT (µg/g) -0,2157 -0,1618 -0,2845 -0,1962

p=0,056 p=0,154 p=0,011 p=0,083

5.7 Zobecnění efektu suplementace zinkem a indukce tumoru na

všechny tkáně

Následně bylo předmětem studie zhodnotit, které faktory ovlivňují expresi sledova-

ných genů. Je-li suplementace zinkem brána jako samostatný efekt, ovlivňuje signifi-

kantně pouze expresi p53. Signifikantně vyšší hladiny genu p53 byly zjištěny u zvířat

nesuplementovaných zinkem (p < 0,009). Naproti tomu, indukce nádoru v organismu

způsobila signifikantní změny hladin všech sledovaných genů; myši bez nádoru měly

signifikantně vyšší hladinu sledovaných genů (p < 0,003). Při zohlednění obou proměn-

ných společně bylo zjištěno, že u všech sledovaných genů dochází k signifikantnímu

zvýšení exprese u těch zvířat, která nebyla suplementována zinkem a zároveň jim nebyl

46

indukován nádor (p < 0,05). Naopak zvířata suplementována zinkem a s indukovaným

nádorem měla signifikantně nižší expresi sledovaných genů (p < 0,05).

5.8 Vliv suplementace zinkem, typu tkáně a indukce nádoru

Předchozí přístupy přinesly kontroverzní výsledky, proto byly zohledněny všechny

efekty dohromady. Z následujících grafů je patrné, že různé tkáně reagují na suplemen-

taci zinkem rozdílně. Obecně lze říci, že u všech tkání, s výjimkou mozkové tkáně, do-

chází k podobnému fenoménu. V předchozí kapitole byla prokázána nižší hladina ex-

prese u zvířat s indukovaným nádorem. Nicméně, u kombinace suplementace zinkem a

indukce tumoru můžeme pozorovat různé hladiny expresí u různých tkání. To, jak se

mění exprese, je výrazně závislé právě na typu tkáně.

V jaterní tkáni dochází ke statisticky významnému zvýšení exprese obou izoforem

MT pouze, mají-li zvířata indukován nádor a jsou suplementována zinkem (obrázek 23).

Naopak v ledvinné tkáni zvířat, která jsou suplementována zinkem je hladina MT1 a

MT2 genů vyšší bez závislosti na přítomnosti nádoru (obrázek 24). Obě tyto tkáně, u

kterých byla prokázána nejvyšší míra exprese všech genů, se tedy výrazně liší ve své

reakci na suplementaci zinkem a indukci nádoru.

Obrázek 23: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů v jaterní tkáni.

47

Obrázek 24: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů v ledvinné tkáni.

U plic nebyla zjištěna žádná nová skutečnost, pouze to co již bylo zmíněno výše: u

plic je pozorována nižší exprese genů u zvířat, která byla suplementována zinkem a byl

u nich indukován nádor (obrázek 25). Podobný výsledek byl pozorován u tkáně sleziny

(obrázek 26).

48

Obrázek 25: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů v plicní tkáni.

Obrázek 26: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů ve tkáni sleziny.

49

U mozkové tkáně můžeme vidět zajímavý fenomén: exprese MT2 je vyšší bez závis-

losti na suplementaci zinkem či indukci nádoru. Exprese genů MTF-1 a p53 klesají

oproti ostatním variantám, pouze u zvířat suplementovaných zinkem a bez nádoru (ob-

rázek 27).

Obrázek 27: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů v mozkové tkáni.

Dále byla vyhodnocena zvlášť tkáň primárního nádoru, kde nebyly prokázány signi-

fikantní rozdíly v hladinách sledovaných genů mezi zvířaty suplementovanými zinkem

a zvířaty nesuplementovanými (obrázek 28).

50

Obrázek 28: Efekt suplementace zinkem na expresi genů ve tkáni primárního nádoru.

Na obrázku 29 je znázorněn efekt suplementace zinku na velikost nádoru. Velikost

nádorů u zvířat bez suplementace zinkem byla při kontrolním měření ve 28. dni signifi-

kantně větší (p= 0,04). Po ukončení experimentu byly rovněž nalezeny metastázy, pře-

devším na slezině, plicích a orgánech GIT.

51

Obrázek 29: Efekt suplementace zinkem na velikost nádoru.

Dále byla analyzována hladina MT v závislosti na všech předchozích parametrech.

Nebyly prokázány žádné signifikantní rozdíly v závislosti na uvedených skupinách.

Hladina MT na proteinové úrovni se mění pouze v závislosti na typu tkáně, což bylo

zmíněno výše. Z uvedeného vyplývá, že sledované tkáně se chovají několika způsoby a

lze je rozdělit na několik modelů: model nádor, model nereflektující změny, model ját-

ra, model ledviny a obecný model, kam patří mozek, plíce a slezina. Můžeme tedy říci,

že na základě změn sledovaných genů jsme schopni na základě genové exprese predi-

kovat, o jakou tkáň jde, resp. obráceně, jsme schopni predikovat, zda dochází v určitém

orgánu k reakci na suplementaci zinečnatými ionty či indukci tumorgeneze. Změny ex-

prese genů u jednotlivých modelů jsou zaznamenány v tabulce 2.

52

Tabulka 2: Změny exprese genů u jednotlivých modelů. Žádná změna v expresi je označena

—, Ø nestanoveno.

Modelová

tkáň

Celková úro-

veň expresí

všech genů

Exprese MT

při suplemen-

taci zinkem

Exprese MT

za přítomnosti

tumoru

Exprese MT

za přítomnosti

tumoru +

suplementace

Obecný model ↓ ↓ ↓ ↓↓

Model nádor — — Ø Ø

Model ledviny ↑ — ↑ —

Model játra ↑ — — ↑

53

6 DISKUZE

Před začátkem experimentů byly u všech linií udělány testy viability buněk po přidání

zinečnatých iontů. Byly použity dvě metody: MTT testy a real-time monitoring pomocí

systému xCELLigence RTCA DP, díky němuž je možné nepřetržité sledování buněk.

V době aplikace zinku byl pozorován pomocí xCELLigence systému rozdíl v impedanci

mezi prostatickými liniemi a prsní linií. Vzhledem k tomu, že počet buněk v jamce byl

na začátku experimentu shodný u všech linií, je tento rozdíl nejspíš způsoben rychlostí

dělení buněk nebo velikostí buněk. Z výsledků MTT testu i real-time monitoringu je

zřejmé, že prostatická linie PNT1A, na rozdíl od nádorových linií, nereagovala na apli-

kaci zinku změnami viability. Je známo, že „zdravá“ prostatická tkáň je schopna ve vel-

ké míře akumulovat zinečnaté ionty. [21] S nádorovým onemocněním prostata tuto

schopnost ztrácí a buňka není schopna vyrovnat se s rostoucí koncentrací zinku, což je

potvrzeno i našimi výsledky. Hodnoty IC50 byly stanoveny pro každou metodu zvlášť,

přičemž výsledky z real-time monitoringu ukazují nižší hodnoty IC50 než je tomu u

MTT testu. Tento nesoulad, jak píše Masařík a kol., může být způsoben změnou morfo-

logie buněk, které jsou adherovány na dně destičky. [66] Buňky tedy nemusí být zinkem

usmrceny, ale došlo pouze ke snížení velikosti buněk a tudíž k poklesu impedance.

Migraci nádorových buněk lze charakterizovat jako schopnost buněk procházet me-

zibuněčnou hmotou do tkání sousedících s nádorem. Kdežto invazivita je charakterizo-

vána jako průnik nádoru do tkání s ním sousedících, předpokládá uvolnění buňky z me-

zibuněčných vazeb, motilitu a schopnost degradovat komponenty extracelulární matrix.

Také se podílí na schopnosti nádorů metastázovat. Pro posouzení migrace buněk byly

použity data naměřená do 8 hod od začátku měření, aby bylo zabráněno falešně pozitiv-

nímu nárůstu relativní impedance v důsledku buněčné proliferace. V případě invazivity

jsou buňky nuceny penetrovat přes vrstvu matrigelu, dochází tedy k pozdějšímu nárůstu

relativní impedance, proto byla pro posouzení invazivity buněk použita data naměřená

do 24 hod od začátku měření. Vazques-Ramirez a spol. udávají, že zvýšená exprese MT

u karcinomu prsu je asociovaná s metastatickým potenciálem. [98] Toto tvrzení jsme

chtěli ověřit experimentem na nádorových buněčných liniích 4T1 a 4T1t. Linie 4T1t

byla transfekována expresním plazmidem, aby bylo dosaženo vyšší exprese MT. Naše

výsledky plynoucí ze studia invazivity 4T1 a 4T1t linie tuto skutečnost bohužel nepo-

tvrdily. Měření ukázalo, že míra adheze linií PC-3, 4T1 a 4T1t se mezi sebou výrazně

54

neliší a je tedy velmi pravděpodobné, že zvýšená relativní impedance linie PC-3

v migrační a invazivní analýze v destičkách CIM 16 je skutečně důsledkem vyšší mi-

grační a invazivní aktivity těchto buněk. Naproti tomu adheze buněčné linie PNT1A je

výrazně nižší než u ostatních testovaných linií, a proto migrační a invazivní aktivitu

PNT1A nemůžeme srovnávat s migrační a invazivní aktivitou linií PC-3, 4T1 a 4T1t.

U buněčných linií byly stanoveny exprese genů MT1 a MT2 po aplikaci zinku. Tak

jak bylo uvedeno v publikaci Masařík a kol., u linie PC-3 došlo k výraznému zvýšení

exprese především genu MT2. [66] U prostatických nádorových buněk je narušena regu-

lace transportu zinku do buněk (zvýšený příjem zinku z extracelulárního prostředí) a

tudíž se zvyšuje syntéza MT, aby došlo k vyrovnání hladiny volného zinku

v intracelulárním prostředí. U exprese genu MT1 bylo u nádorových linií pozorováno se

stoupající koncentrací výrazné zvýšení a následné snížení exprese. Tento jev lze vysvět-

lit jako obrannou reakci buněk na rostoucí koncentraci zinku, v důsledku vysoké expre-

se genu však dojde k vyčerpání buněk a jejich smrti.

Bylo zjištěno, že jaterní tkáň obsahuje nejvyšší exprese všech sledovaných genů.

Vzhledem k významnosti jaterních funkcí to není překvapující zjištění. Zajímavé zjiště-

ní však přináší hladina v nádorové tkáni, ta byla u všech sledovaných genů nízká. Ne-

obvykle se chová mozková tkáň, jako jediná vykazuje rozdílné trendy pro různé geny:

Zatímco exprese MTF-1 a MT2 je v této tkání vysoká, MT1 a p53 se exprimuje velmi

málo. V případě primárního nádoru, sleziny a plic byly pozorovány nízké exprese sle-

dovaných genů, naopak hladina MT proteinu byla u těchto tkání vysoká. Gumulec a kol.

(in m.s.) prokázali minimální závislost mezi hladinou mRNA a hladinou výsledného

proteinu. Při experimentech s buněčnými liniemi docházelo k přechodnému zvýšení

exprese genů mezi různými časovými intervaly. Následně byl pozorován pokles expre-

se, zatímco hladina proteinu zůstala vysoká. [41] V případě, že exprese genů je snížená

a hladina proteinu zvýšená, lze se domnívat, že hladina proteinu dosáhla optimální

úrovně a další syntéza mRNA již není potřebná. Tato práce tento fenomén pouze potvr-

zuje. V rozporu s naším očekáváním byla pozorována signifikantně vyšší hladina expre-

se všech sledovaných genů u zvířat bez indukce nádoru. Jsou-li zohledněny faktory

suplementace zinkem a přítomnost nádoru zároveň, je exprese genů nejvyšší u zvířat

nesuplementovaných a bez nádoru. Jelikož však exprese genů byla měřena až na konci

celého experimentu je možné, že jsme počáteční zvýšení exprese genů po suplementaci

zinkem nezaznamenali.

55

Na úrovni proteinu byl sledován pouze MT a mezi jednotlivými skupinami zvířat

nebyl pozorován žádný signifikantní rozdíl. Na proteinové úrovni v závislosti na typu

tkáně byly nejvyšší hladiny MT zjištěny v plicní, mozkové a nádorové tkáni. Dle Coyle

a kol. je nejvyšší hladina MT proteinu v játrech a ledvinách. [22] V našem experimentu

však výsledky nekorelují s tímto tvrzením a tyto tkáně měly naopak signifikantně nej-

nižší obsah tohoto proteinu. Tento jev lze vysvětlit tím, že k detekci MT byla použita

polyklonální protilátka proti všem myším izoformám MT. Nebyl tedy detekován pouze

MT1 a MT2, jejichž hladiny jsou nejvyšší v játrech a ledvinách, ale všechny MT izo-

formy. Jak píše Eckschlager a kol., izoforma MT3 se podílí na udržování homeostázy

zinku v neuronech. [28] Aplikací zinku myším jsme narušili rovnováhu zinku

v mozkové tkáni, a tudíž došlo ke zvýšení syntézy MT3, což by mohlo mít za následek

zvýšení hladiny celkového MT proteinu v mozkové tkáni oproti tkáním ostatním.

Výsledky této práce ukazují signifikantní rozdíl mezi velikostí nádoru mezi jednotli-

vými skupinami. Zvířata, která byla suplementována zinkem, měla nádory menší

v porovnání se skupinou, které nebyl zinek podáván. Můžeme tedy říci, že aplikace zin-

ku by mohla mít vliv na zpomalení růstu nádoru. Tyto výsledky potvrzuje i studie Fong

a kol. [35] Studie McQuitty a kol., rovněž potvrzuje, že růst nádorů byl omezen

v prostředí při zinkové suplementaci, ovšem ještě větší snížení růstu nádorů, oproti kon-

trolám, pozorovali při zinkové deficienci. [67]

56

7 ZÁVĚR

O metalothioneinu se již delší dobu diskutuje jako o možném nádorovém markeru. Cí-

lem této práce byla především analýza MT a ověření jeho vlivu v patogenezi nádoro-

vých onemocnění. Experimenty byly prováděny na buněčných liniích, ale také na expe-

rimentálních zvířatech. Analýza byla provedena jak na úrovni expresí genů MT1 a MT2,

tak na proteinové úrovni. U zvířecích modelů byla navíc provedena analýza exprese

genů p53 a MTF-1.

V experimentech na buněčných liniích byla prokázána zvýšená exprese genu MT2 u

prostatické nádorové linie PC-3. Tento fakt by mohl sloužit při diagnostice karcinomu

prostaty. V experimentech na zvířatech byly pozorovány změny v expresích sledova-

ných genů v závislosti na druhu tkáně, přičemž nejvyšší exprese byla pozorována

v jaterní a ledvinné tkání. V nádorové tkáni se všechny geny exprimovaly nejméně. V

jaterní tkáni zvířat s indukovaným nádorem dochází ke zvýšení exprese genů MT1 a

MT2 pouze v případě, jsou-li zvířata suplementována zinkem. Hladina MT na proteino-

vé úrovni se rovněž, jako exprese genů, mění v závislosti na druhu tkáně. Velikost ná-

doru je ovlivněna suplementací zinkem. U zvířat, kterým byl podáván zinek, bylo dosa-

ženo snížení velikosti nádorů.

57

8 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY

1. ADAM, V.; FABRIK, I.; ECKSCHLAGER, T.; STIBOROVA, M.;

TRNKOVA, L.; KIZEK, R. Vertebrate metallothioneins as target molecules for

analytical techniques. Trac-Trends in Analytical Chemistry, 2010, roč. 29. č. 5, s. 409-

418.

2. ADAM, V., PETRLOVÁ, J., WANG, J., ECKSCHLAGER, T., TRNKOVÁ, L.,

KIZEK, R. Zeptomole Electrochemical Detection of MetallothioneinsDepartment of

Chemistry and Biochemistry Brno: Mendel University in Brno, 2010.

3. ADAM, Z., VORLÍČEK, J.,. Speciální onkologie. Brno: Vydavatelství

Masarykovy univerzity, 2002.

4. ADAM, Z., VORLÍČEK, J., . Obecná onkologie. Brno: Vydavatelství

Masarykovy univerzity, 2004.

5. ALLRED, D. C. Commentary: Hormone Receptor Testing in Breast Cancer: A

Distress Signal from Canada. Oncologist, 2008, roč. 13. č. 11, s. 1134-1136.

6. ALONSO-GONZALEZ, C.; MEDIAVILLA, D.; MARTINEZ-CAMPA, C.;

GONZALEZ, A.; COS, S.; SANCHEZ-BARCELO, E. J. Melatonin modulates the

cadmium-induced expression of MT-2 and MT-1 metallothioneins in three lines of

human tumor cells (MCF-7, MDA-MB-231 and HeLa). Toxicology Letters, 2008, roč.

181. č. 3, s. 190-195.

7. ANDERSON, W. F.; CHATTERJEE, N.; ERSHLER, W. B.; BRAWLEY, O.

W. Estrogen receptor breast cancer phenotypes in the surveillance, epidemiology, and

end results database. Breast Cancer Research and Treatment, 2002, roč. 76. č. 1, s. 27-

36.

8. BADVE, S.; NAKSHATRI, H. Oestrogen-receptor-positive breast cancer:

towards bridging histopathological and molecular classifications. Journal of Clinical

Pathology, 2009, roč. 62. č. 1, s. 6-12.

9. BAGHERI, P. M.; GOVAERTS, I.; DE LEY, M. Role of metallothionein in

differentiation of leukemia cells. Molecular Biology Reports, 2011, roč. 38. č. 5, s.

3017-3022.

10. BARDOU, V. J.; ARPINO, G.; ELLEDGE, R. M.; OSBORNE, C. K.; CLARK,

G. M. Progesterone receptor status significantly improves outcome prediction over

estrogen receptor status alone for adjuvant endocrine therapy in two large breast cancer

databases. Journal of Clinical Oncology, 2003, roč. 21. č. 10, s. 1973-1979.

11. BAY, B. H.; JIN, R. X.; HUANG, J. X.; TAN, P. H. Metallothionein as a

prognostic biomarker in breast cancer. Experimental Biology and Medicine, 2006, roč.

231. č. 9, s. 1516-1521.

58

12. BAY, B. H.; JIN, R. X.; JAYASURYA, A. Analysis of metallothionein

expression in human cancers. Acta Histochemica Et Cytochemica, 2001, roč. 34. č. 3, s.

171-176.

13. BLINDAUER, C. A.; LESZCZYSZYN, O. I. Metallothioneins: unparalleled

diversity in structures and functions for metal ion homeostasis and more. Natural

Product Reports, 2010, roč. 27. č. 5, s. 720-741.

14. CALDARELLA, A.; PULITI, D.; CROCETTI, E.; BIANCHI, S.; VEZZOSI,

V.; APICELLA, P.; BIANCALANI, M.; GIANNINI, A.; URSO, C.; ZOLFANELLI,

F.; PACI, E. Biological characteristics of interval cancers: a role for biomarkers in the

breast cancer screening. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 2013, roč.

139. č. 2, s. 181-185.

15. CAPASSO, C.; CARGINALE, V.; CRESCENZI, O.; DI MARO, D.;

SPAIDACCINI, R.; TEMUSSI, P. A.; PARISI, E. Structural and functional studies of

vertebrate metallothioneins: cross-talk between domains in the absence of physical

contact. Biochemical Journal, 2005, roč. 391. č., s. 95-103.

16. CAPDEVILA, M.; BOFILL, R.; PALACIOS, O.; ATRIAN, S. State-of-the-art

of metallothioneins at the beginning of the 21st century. Coordination Chemistry

Reviews, 2012, roč. 256. č. 1-2, s. 46-62.

17. CAREY, L. C.; BERBEE, P. L.; COYLE, P.; PHILCOX, J. C.; ROFE, A. M.

Zinc treatment prevents lipopolysaccharide-induced teratogenicity in mice. Birth

Defects Research Part a-Clinical and Molecular Teratology, 2003, roč. 67. č. 4, s. 240-

245.

18. CLARKE, M.; COLLINS, R.; DAVIES, C.; GODWIN, J.; GRAY, R.; PETO,

R.; EARLY BREAST CANCER TRIALISTS COLLABORATIVE, G. Tamoxifen for

early breast cancer: An overview of the randomised trials. Lancet, 1998, roč. 351. č.

9114, s. 1451-1467.

19. COLE, K. D.; HE, H. J.; WANG, L. L. Breast cancer biomarker measurements

and standards. Proteomics Clinical Applications, 2013, roč. 7. č. 1-2, s. 17-29.

20. COLVIN, R. A.; HOLMES, W. R.; FONTAINE, C. P.; MARET, W. Cytosolic

zinc buffering and muffling: Their role in intracellular zinc homeostasis. Metallomics,

2010, roč. 2. č. 5, s. 306-317.

21. COSTELLO, L. C.; FRANKLIN, R. B. Zinc is decreased in prostate cancer: an

established relationship of prostate cancer! Journal of Biological Inorganic Chemistry,

2011, roč. 16. č. 1, s. 3-8.

22. COYLE, P.; PHILCOX, J. C.; CAREY, L. C.; ROFE, A. M. Metallothionein:

The multipurpose protein. Cellular and Molecular Life Sciences, 2002, roč. 59. č. 4, s.

627-647.

59

23. CUMMINGS, J. E.; KOVACIC, J. P. The ubiquitous role of zinc in health and

disease. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care, 2009, roč. 19. č. 3, s. 215-

240.

24. DALLINGER, R.; BERGER, B.; HUNZIKER, P. E.; BIRCHLER, N.; HAUER,

C. R.; KAGI, J. H. R. Purification and primary structure of snail metallothionein-

similarity of then-terminal sequence with histones H4 and H2A. European Journal of

Biochemistry, 1993, roč. 216. č. 3, s. 739-746.

25. DING, Z. C.; NI, F. Y.; HUANG, Z. X. Neuronal growth-inhibitory factor

(metallothionein-3): structure-function relationships. Febs Journal, 2010, roč. 277. č. 14,

s. 2912-2920.

26. DOWSETT, M.; HOUGHTON, J.; IDEN, C.; SALTER, J.; FARNDON, J.;

A'HERN, R.; SAINSBURY, R.; BAUM, M. Benefit from adjuvant tamoxifen therapy

in primary breast cancer patients according oestrogen receptor, progesterone receptor,

EGF receptor and HER2 status. Annals of Oncology, 2006, roč. 17. č. 5, s. 818-826.

27. EBERT, M. P. A.; GUNTHER, T.; HOFFMANN, J.; YU, J.; MIEHLKE, S.;

SCHULZ, H. U.; ROESSNER, A.; KORC, M.; MALFERTHEINER, P. Expression of

metallothionein II in intestinal metaplasia, dysplasia, and gastric cancer. Cancer

Research, 2000, roč. 60. č. 7, s. 1995-2001.

28. ECKSCHLAGER, T.; ADAM, V.; HRABETA, J.; FIGOVA, K.; KIZEK, R.

Metallothioneins and Cancer. Current Protein & Peptide Science, 2009, roč. 10. č. 4, s.

360-375.

29. EGLI, D.; SELVARAJ, A.; YEPISKOPOSYAN, H.; ZHANG, B.; HAFEN, E.;

GEORGIEV, O.; SCHAFFNER, W. Knockout of 'metal-responsive transcription factor'

MTF-1 in Drosophila by homologous recombination reveals its central role in heavy

metal homeostasis. Embo Journal, 2003, roč. 22. č. 1, s. 100-108.

30. EJNIK, J.; SHAW, C. F.; PETERING, D. H. Mechanism of Cadmium Ion

Substitution in Mammalian Zinc Metallothionein and Metallothionein alpha Domain:

Kinetic and Structural Studies. Inorganic Chemistry, 2010, roč. 49. č. 14, s. 6525-6534.

31. FABRIK, I.; KRIZKOVA, S.; HUSKA, D.; ADAM, V.; HUBALEK, J.;

TRNKOVA, L.; ECKSCHLAGER, T.; KUKACKA, J.; PRUSA, R.; KIZEK, R.

Employment of electrochemical techniques for metallothionein determination in tumor

cell lines and patients with a tumor disease. Electroanalysis, 2008, roč. 20. č. 14, s.

1521-1532.

32. FABRIK, I.; KUKAČKA, J. P., R.; ECKSCHLAGER, T.; ADAM, V.; KIZEK,

R. Metalothionein a jeho klinický význam. FONS, 2008, roč. 18. č. 2, s. 20-22.

33. FALLER, P. Neuronal growth-inhibitory factor (metallothionein-3): reactivity

and structure of metal-thiolate clusters*. Febs Journal, roč. 277. č. 14, s. 2921-2930.

60

34. FLORIAŃCZYK, B.; GRZYBOWSKA, L.; MARZEC, Z. Metallothionein and

manganese concentrations in breast cancer and mastopathic tissues. Journal of Pre-

Clinical and Clinical Research, 2011, roč. 5. č. 2, s. 63-65.

35. FONG, L. Y. Y.; JIANG, Y. B.; RAWAHNEH, M. L.; SMALLEY, K. J.;

CROCE, C. M.; FARBER, J. L.; HUEBNER, K. Zinc supplementation suppresses 4-

nitroquinoline 1-oxide-induced rat oral carcinogenesis. Carcinogenesis, 2011, roč. 32. č.

4, s. 554-560.

36. GARRETT, S. H.; SENS, M. A.; SHUKLA, D.; FLORES, L.; SOMJI, S.;

TODD, J. H.; SENS, D. A. Metallothionein isoform 1 and 2 gene expression in the

human prostate: Downregulation of MT-1X in advanced prostate cancer. Prostate, 2000,

roč. 43. č. 2, s. 125-135.

37. GOULDING, H.; JASANI, B.; PEREIRA, H.; REID, A.; GALEA, M.; BELL, J.

A.; ELSTON, C. W.; ROBERTSON, J. F.; BLAMEY, R. W.; NICHOLSON, R. A.;

SCHMID, K. W.; ELLIS, I. O. Metallothionein expression in human breast-cancer.

British Journal of Cancer, 1995, roč. 72. č. 4, s. 968-972.

38. GREISEN, P.; JESPERSEN, J. B.; KEPP, K. P. Metallothionein Zn2+- and

Cu2+-clusters from first-principles calculations. Dalton Transactions, roč. 41. č. 8, s.

2247-2256.

39. GUMULEC, J.; MASARIK, M.; KRIZKOVA, S.; ADAM, V.; HUBALEK, J.;

HRABETA, J.; ECKSCHLAGER, T.; STIBOROVA, M.; KIZEK, R. Insight to

Physiology and Pathology of Zinc(II) Ions and Their Actions in Breast and Prostate

Carcinoma. Current Medicinal Chemistry, 2011, roč. 18. č. 33, s. 5041-5051.

40. GUMULEC, J., MASAŘÍK, M., KŘÍŽKOVÁ, S., BABULA, P., HRABEC, R.,

ROVNÝ, A., MASAŘÍKOVÁ, M., KIZEK, R. Zinek, jeho transport a metabolismus u

karcinomu prostaty- vliv metalotioneinu

41. GUMULEC, J., SZTALMACHOVÁ, M., BALVAN, J., RAUDENSKÁ, M.,

TANHAUSEROVÁ, V., KNOPFOVÁ, L., POLANSKÁ, H., RUTTKAY-NEDECKY,

B., SOCHOR, J., BABULA, P., BRÁZDOVÁ, M., ADAM, V., KIZEK, R.,

MASAŘÍK, M. Cisplatin-resistant prostate cancer model: differences in antioxidant

system, apoptosis and cell cycle. 2013, roč. č., s.

42. GUNES, C.; HEUCHEL, R.; GEORGIEV, O.; MULLER, K. H.; LICHTLEN,

P.; BLUTHMANN, H.; MARINO, S.; AGUZZI, A.; SCHAFFNER, W. Embryonic

lethality and liver degeneration in mice lacking the metal-responsive transcriptional

activator MTF-1. Embo Journal, 1998, roč. 17. č. 10, s. 2846-2854.

43. HAYAT, M. J.; HOWLADER, N.; REICHMAN, M. E.; EDWARDS, B. K.

Cancer statistics, trends, and multiple primary cancer analyses from the surveillance,

epidemiology, and end results (SEER) program. Oncologist, 2007, roč. 12. č. 1, s. 20-

37.

61

44. HIDALGO, J.; ASCHNER, M.; ZATTA, P.; VASAK, M. Roles of the

metallothionein family of proteins in the central nervous system. Brain Research

Bulletin, 2001, roč. 55. č. 2, s. 133-145.

45. HOLSTEGE, H.; JOOSSE, S. A.; VAN OOSTROM, C. T. M.; NEDERLOF, P.

M.; DE VRIES, A.; JONKERS, J. High Incidence of Protein-Truncating TP53

Mutations in BRCA1-Related Breast Cancer. Cancer Research, 2009, roč. 69. č. 8, s.

3625-3633.

46. CHAN, H. M., CHERIAN, M.G. Mobilization of hepatic cadmium in pregnant

rats. Toxicol. Appl. Pharmacol. , 1993, roč. 120. č., s. 308–314.

47. CHERIAN, M. G.; JAYASURYA, A.; BAY, B. H. Metallothioneins in human

tumors and potential roles in carcinogenesis. Mutation Research-Fundamental and

Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2003, roč. 533. č. 1-2, s. 201-209.

48. JASANI, B.; SCHMID, K. W. Significance of metallothionein overexpression in

human. Histopathology, 1997, roč. 31. č. 3, s. 211-214.

49. JEMAL, A.; BRAY, F.; CENTER, M. M.; FERLAY, J.; WARD, E.; FORMAN,

D. Global Cancer Statistics. Ca-a Cancer Journal for Clinicians, 2011, roč. 61. č. 2, s.

69-90.

50. JIN, R. X.; CHOW, V. T. K.; TAN, P. H.; DHEEN, S. T.; DUAN, W.; BAY, B.

H. Metallothionein 2A expression is associated with cell proliferation in breast cancer.

Carcinogenesis, 2002, roč. 23. č. 1, s. 81-86.

51. JING, L.; WU, Y. L.; WU, J.; ZHAO, J.; ZUO, D. Y.; PENG, S. Q.

Peroxiredoxins are involved in metallothionein protection from doxorubicin

cardiotoxicity. European Journal of Pharmacology, roč. 659. č. 2-3, s. 224-232.

52. KAGI, J. H. R. Overview of metallothionein. Methods in Enzymology, 1991,

roč. 205. č., s. 613-626.

53. KAROTKI, A. V.; VASAK, M. Reaction of human metallothionein-3 with

cisplatin and transplatin. Journal of Biological Inorganic Chemistry, 2009, roč. 14. č. 7,

s. 1129-1138.

54. KAYAALTI, Z.; ALIYEV, V.; SOYLEMEZOGIU, T. The potential effect of

metallothionein 2A-5 A/G single nucleotide polymorphism on blood cadmium, lead,

zinc and copper levels. Toxicology and Applied Pharmacology, 2011, roč. 256. č. 1, s.

1-7.

55. KAYAALTI, Z.; MERGEN, G.; SOYLEMEZOGLU, T. Effect of

metallothionein core promoter region polymorphism on cadmium, zinc and copper

levels in autopsy kidney tissues from a Turkish population. Toxicology and Applied

Pharmacology, 2010, roč. 245. č. 2, s. 252-255.

62

56. KAYAALTI, Z.; SAHINER, L.; DURAKOGLUGIL, M. E.;

SOYLEMEZOGLU, T. Distributions of interleukin-6 (IL-6) promoter and

metallothionein 2A (MT2A) core promoter region gene polymorphisms and their

associations with aging in Turkish population. Archives of Gerontology and Geriatrics,

2011, roč. 53. č. 3, s. 354-358.

57. KEPP, K. P. Full quantum-mechanical structure of the human protein

Metallothionein-2. Journal of Inorganic Biochemistry, roč. 107. č. 1, s. 15-24.

58. KRIZKOVA, S.; ADAM, V.; ECKSCHLAGER, T.; KIZEK, R. Using of

chicken antibodies for metallothionein detection in human blood serum and cadmium-

treated tumour cell lines after dot- and electroblotting. Electrophoresis, 2009, roč. 30. č.

21, s. 3726-3735.

59. KRIZKOVA, S.; FABRIK, I.; HUSKA, D.; ADAM, V.; BABULA, P.;

HRABETA, J.; ECKSCHLAGER, T.; POCHOP, P.; DARSOVA, D.; KUKACKA, J.;

PRUSA, R.; TRNKOVA, L.; KIZEK, R. An Adsorptive Transfer Technique Coupled

with Brdicka Reaction to Reveal the Importance of Metallothionein in Chemotherapy

with Platinum Based Cytostatics. International Journal of Molecular Sciences, roč. 11.

č. 12, s. 4826-4842.

60. KRIZKOVA, S.; MASARIK, M.; ECKSCHLAGER, T.; ADAM, V.; KIZEK,

R. Effects of redox conditions and zinc(II) ions on metallothionein aggregation revealed

by chip capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A, roč. 1217. č. 51, s.

7966-7971.

61. LACOMBE, J.; MANGE, A.; JARLIER, M.; BASCOUL-MOLLEVI, C.;

ROUANET, P.; LAMY, P. J.; MAUDELONDE, T.; SOLASSOL, J. Identification and

validation of new autoantibodies for the diagnosis of DCIS and node negative early-

stage breast cancers. International Journal of Cancer, 2013, roč. 132. č. 5, s. 1105-1113.

62. LIU, Z. M.; CHEN, G. G.; SHUM, C. K. Y.; VLANTIS, A. C.; CHERLAN, M.

G.; KOROPATNICK, J.; VAN HASSELTA, C. A. Induction of functional MT1 and

MT2 isoforms by calcium in anaplastic thyroid carcinoma cells. Febs Letters, 2007, roč.

581. č. 13, s. 2465-2472.

63. LOEBUS, J.; PEROZA, E. A.; BLUTHGEN, N.; FOX, T.; MEYER-

KLAUCKE, W.; ZERBE, O.; FREISINGER, E. Protein and metal cluster structure of

the wheat metallothionein domain gamma-E(c)-1: the second part of the puzzle. Journal

of Biological Inorganic Chemistry, roč. 16. č. 5, s. 683-694.

64. MARET, W. Fluorescent probes for the structure and function of

metallothionein. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the

Biomedical and Life Sciences, 2009, roč. 877. č. 28, s. 3378-3383.

65. MARGOSHES, M.; VALLEE, B. L. A cadmium protein from equine kidney

cortex Journal of the American Chemical Society, 1957, roč. 79. č. 17, s. 4813-4814.

63

66. MASARIK, M.; GUMULEC, J.; HLAVNA, M.; SZTALMACHOVA, M.;

BABULA, P.; RAUDENSKA, M.; PAVKOVA-GOLDBERGOVA, M.; CERNEI, N.;

SOCHOR, J.; ZITKA, O.; RUTTKAY-NEDECKY, B.; KRIZKOVA, S.; ADAM, V.;

KIZEK, R. Monitoring of the prostate tumour cells redox state and real-time

proliferation by novel biophysical techniques and fluorescent staining. Integrative

Biology, 2012, roč. 4. č. 6, s. 672-684.

67. MCQUITTY, J. T.; DEWYS, W. D.; MONACO, L.; STRAIN, W. H.; ROB, C.

G.; APGAR, J.; PORIES, W. J. Inhibition of tumor growth by dietary zinc deficiency.

Cancer Research, 1970, roč. 30. č. 5, s. 1387-&.

68. METCALFE, K. A.; FINCH, A.; POLL, A.; HORSMAN, D.; KIM-SING, C.;

SCOTT, J.; ROYER, R.; SUN, P.; NAROD, S. A. Breast cancer risks in women with a

family history of breast or ovarian cancer who have tested negative for a BRCA1 or

BRCA2 mutation. British Journal of Cancer, 2009, roč. 100. č. 2, s. 421-425.

69. MINAMI, T.; ICHIDA, S.; KUBO, K. Study of metallothionein using capillary

zone electrophoresis. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the

Biomedical and Life Sciences, 2002, roč. 781. č. 1-2, s. 303-311.

70. MOLEIRINHO, A.; CARNEIRO, J.; MATTHIESEN, R.; SILVA, R. M.;

AMORIM, A.; AZEVEDO, L. Gains, Losses and Changes of Function after Gene

Duplication: Study of the Metallothionein Family. Plos One, roč. 6. č. 4, s. 9.

71. NAGEL, W. W.; VALLEE, B. L. Cell-cycle regulation of metallothionein in

human colonic-cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, 1995, roč. 92. č. 2, s. 579-583.

72. NORMANNO, N.; RACHIGLIO, A. M.; ROMA, C.; FENIZIA, F.; ESPOSITO,

C.; PASQUALE, R.; LA PORTA, M. L.; IANNACCONE, A.; MICHELI, F.;

SANTANGELO, M.; BERGANTINO, F.; COSTANTINI, S.; DE LUCA, A. Molecular

diagnostics and personalized medicine in oncology: Challenges and opportunities.

Journal of Cellular Biochemistry, 2013, roč. 114. č. 3, s. 514-524.

73. OFNER, D.; MAIER, H.; RIEDMANN, B.; BAMMER, T.; RUMER, A.;

WINDE, G.; BOCKER, W.; JASANI, B.; SCHMID, K. W. Immunohistochemical

metallothionein expression in colorectal adenocarcinoma - correlation with tumor stage

and patient survival. Virchows Archiv, 1994, roč. 425. č. 5, s. 491-497.

74. OKUMURA, F.; LI, Y.; ITOH, N.; NAKANISHI, T.; ISOBE, M.; ANDREWS,

G. K.; KIMURA, T. The zinc-sensing transcription factor MTF-1 mediates zinc-

induced epigenetic changes in chromatin of the mouse metallothionein-I promoter.

Biochimica Et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms, roč. 1809. č. 1, s. 56-62.

75. PARKIN, D. M.; FERNANDEZ, L. M. G. Use of statistics to assess the global

burden of breast cancer. Breast Journal, 2006, roč. 12. č. 1, s. S70-S80.

76. PAUL-PONT, I.; GONZALEZ, P.; MONTERO, N.; DE MONTAUDOUIN, X.;

BAUDRIMONT, M. Cloning, characterization and gene expression of a

64

metallothionein isoform in the edible cockle Cerastoderma edule after cadmium or

mercury exposure. Ecotoxicology and Environmental Safety, roč. 75. č., s. 119-126.

77. PAVLOU, M. P.; DIAMANDIS, E. P.; BLASUTIG, I. M. The Long Journey of

Cancer Biomarkers from the Bench to the Clinic. Clinical Chemistry, 2013, roč. 59. č.

1, s. 147-157.

78. PEDERSEN, M. O.; LARSEN, A.; STOLTENBERG, M.; PENKOWA, M. The

role of metallothionein in oncogenesis and cancer prognosis. Progress in Histochemistry

and Cytochemistry, 2009, roč. 44. č. 1, s. 29-64.

79. RAKHA, E. A.; REIS, J. S.; ELLIS, I. O. Combinatorial biomarker expression

in breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment, 2010, roč. 120. č. 2, s. 293-

308.

80. REN, F.; JIANG, H.; SUN, J. L.; HE, L.; LI, W. W.; WANG, Y.; WANG, Q.

Cloning, characterization, expression, and copper sensitivity of the metallothionein-1

gene in the Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis. Molecular Biology Reports, roč. 38.

č. 4, s. 2383-2393.

81. RODRIGUES, P. G.; GONCALVES, L. M.; MAGALHAES, P. J.; PACHECO,

J. G.; RODRIGUES, J. A.; BARROS, A. A. Voltammetric analysis of metallothioneins

and copper (II) in fish for water biomonitoring studies. Environmental Chemistry

Letters, roč. 9. č. 3, s. 405-410.

82. SABOLIC, I.; BRELJAK, D.; SKARICA, M.; HERAK-KRAMBERGER, C. M.

Role of metallothionein in cadmium traffic and toxicity in kidneys and other

mammalian organs. Biometals, roč. 23. č. 5, s. 897-926.

83. SANO, Y.; ONODA, A.; SAKURAI, R.; KITAGISHI, H.; HAYASHI, T.

Preparation and reactivity of a tetranuclear Fe(II) core in the metallothionein alpha-

domain. Journal of Inorganic Biochemistry, 2011, roč. 105. č. 5, s. 702-708.

84. SHAIKH, Z. A.; TOHYAMA, C. Urinary metallothionein as an indicator of

cadmium body burden and of cadmium-induced nephrotoxicity. Environmental Health

Perspectives, 1984, roč. 54. č. MAR, s. 171-174.

85. SHIH, H. A.; COUCH, F. J.; NATHANSON, K. L.; BLACKWOOD, M. A.;

REBBECK, T. R.; ARMSTRONG, K. A.; CALZONE, K.; STOPFER, J.; SEAL, S.;

STRATTON, M. R.; WEBER, B. L. BRCA1 and BRCA2 mutation frequency in

women evaluated in a breast cancer risk evaluation clinic. Journal of Clinical Oncology,

2002, roč. 20. č. 4, s. 994-999.

86. SHIMODA, R.; ACHANZAR, W. E.; QU, W.; NAGAMINE, T.; TAKAGI, H.;

MORI, M.; WAALKES, M. P. Metallothionein is a potential negative regulator of

apoptosis. Toxicological Sciences, 2003, roč. 73. č. 2, s. 294-300.

65

87. SCHMIDT, C.; BEYERSMANN, D. Transient peaks in zinc and

metallothionein levels during differentiation of 3T3L1 cells. Archives of Biochemistry

and Biophysics, 1999, roč. 364. č. 1, s. 91-98.

88. SLAMON, D. J.; CLARK, G. M.; WONG, S. G.; LEVIN, W. J.; ULLRICH, A.;

MCGUIRE, W. L. Human-breast cancer - correlation of relapse and survival with

amplification of the HER-2 NEU oncogene. Science, 1987, roč. 235. č. 4785, s. 177-

182.

89. STUDER, R.; VOGT, C. P.; CAVIGELLI, M.; HUNZIKER, P. E.; KAGI, J. H.

R. Metallothionein accretion in human hepatic cells is linked to cellular proliferation.

Biochemical Journal, 1997, roč. 328. č., s. 63-67.

90. SUHY, D. A.; SIMON, K. D.; LINZER, D. I. H.; O'HALLORAN, T. V.

Metallothionein is part of a zinc-scavenging mechanism for cell survival under

conditions of extreme zinc deprivation. Journal of Biological Chemistry, 1999, roč. 274.

č. 14, s. 9183-9192.

91. SUTHERLAND, D. E. K.; STILLMAN, M. J. The "magic numbers'' of

metallothionein. Metallomics, 2011, roč. 3. č. 5, s. 444-463.

92. TAPIERO, H.; TEW, K. D. Trace elements in human physiology and pathology:

zinc and metallothioneins. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2003, roč. 57. č. 9, s. 399-

411.

93. THEOCHARIS, S. E.; MARGELI, A. P.; KLIJANIENKO, J. T.; KOURAKLIS,

G. P. Metallothionein expression in human neoplasia. Histopathology, 2004, roč. 45. č.

2, s. 103-118.

94. THIRUMOORTHY, N.; SUNDER, A. S.; KUMAR, K. T. M.; KUMAR, M. S.;

GANESH, G. N. K.; CHATTERJEE, M. A Review of Metallothionein Isoforms and

their Role in Pathophysiology. World Journal of Surgical Oncology, 2011, roč. 9. č., s.

95. USHAKOVA, G. A.; KRUCHINENKO, O. A. Peculiarities of the Molecular

Structure and Functions of Metallothioneins in the Central Nervous System.

Neurophysiology, 2009, roč. 41. č. 5, s. 355-364.

96. VALKO, M.; MORRIS, H.; CRONIN, M. T. D. Metals, toxicity and oxidative

stress. Current Medicinal Chemistry, 2005, roč. 12. č. 10, s. 1161-1208.

97. VALKO, M.; RHODES, C. J.; MONCOL, J.; IZAKOVIC, M.; MAZUR, M.

Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-

Biological Interactions, 2006, roč. 160. č. 1, s. 1-40.

98. VAQUEZ-RAMIREZ, F. J.; GONZALEZ-CAMPORA, J. J.; HEVIA-

ALVAREZ, E.; FERNANDEZ-SANTOS, J. M.; RIOS-MARTIN, J. J.; OTAL-

SALAVERRI, C.; GONZALEZ-CAMPORA, R. P-glycoprotein, metallothionein and

NM23 protein expressions in breast carcinoma. Pathology Research and Practice, 2000,

roč. 196. č. 8, s. 553-559.

66

99. VASAK, M.; HASLER, D. W. Metallothioneins: new functional and structural

insights. Current Opinion in Chemical Biology, 2000, roč. 4. č. 2, s. 177-183.

100. WAALKES, M. P., HARVEY, M.J., KLAASSEN, C.D. . Relative in vitro

affinity of hepatic metallothionein for metals. Toxicol. Lett. , 1984, roč. 20. č., s. 33–39.

101. WANG, Y.; WIMMER, U.; LICHTLEN, P.; INDERBITZIN, D.; STIEGER, B.;

MEIER, P. J.; HUNZIKER, L.; STALLMACH, T.; FORRER, R.; RULICKE, T.;

GEORGIEV, O.; SCHAFFNER, W. Metal-responsive transcription factor-1 (MTF-1) is

essential for embryonic liver development and heavy metal detoxification in the adult

liver. Faseb Journal, 2004, roč. 18. č. 10, s. 1071-1079.

102. YAP, X. L.; TAN, H. Y.; HUANG, J. X.; LAI, Y. Y.; YIP, G. W. C.; TAN, P.

H.; BAY, B. H. Over-expression of metallothionein predicts chemoresistance in breast

cancer. Journal of Pathology, 2009, roč. 217. č. 4, s. 563-570.

103. ZORITA, I.; BILBAO, E.; SCHAD, A.; CANCIO, I.; SOTO, M.;

CAJARAVILLE, M. P. Tissue- and cell-specific expression of metallothionein genes in

cadmium- and copper-exposed mussels analyzed by in situ hybridization and RT-PCR.

Toxicology and Applied Pharmacology, 2007, roč. 220. č. 2, s. 186-196.

9 SEZNAM OBRÁZKŮ

Obrázek 1: Struktura metalothioneinu MT složený ze dvou domén (α-doména a β-

doména).

Obrázek 2: Izoformy metalothioneinu a jejich lokalizace v savčím organismu.

Obrázek 3: Porovnání sekvencí AMK izoforem MT1 až MT4 u myši.

Obrázek 4: Zapojení MT v redoxním cyklu.

Obrázek 5: Antiapoptotická role MT zprostředkovaná interakcí s NF-kB.

Obrázek 6: Schéma regulace genové exprese MT.

Obrázek 7: Metabolizmus těžkých kovů.

Obrázek 8: Místo aplikace nádorových buněk.

Obrázek 9: Výsledky MTT testu prostatických linií PNT1A a PC-3 a prsní nádorové

linie 4T1.

Obrázek 10: Růstové křivky „zdravé“ prostatické linie PNT1A po přidání zinečnatých

iontů v koncentracích 0–100 µM.

Obrázek 11: Růstové křivky nádorové prostatické linie PC-3 po přidání zinečnatých

iontů v koncentracích 0–100 µM.

67

Obrázek 12: Růstové křivky nádorové prsní linie 4T1 po přidání zinečnatých iontů v

koncentracích 0–100 µM.

Obrázek 13: Analýza chemotaktické migrace buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A.

Obrázek 14: Analýza chemokinetické migrace buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A.

Obrázek 15: Analýza chemotaktické invazivity buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A.

Obrázek 16: Analýza chemotaktické invazivity buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A.

Obrázek 17: Analýza kinetiky adheze buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A.

Obrázek 18: Exprese izoforem MT1 a MT2 v buněčných liniích

Obrázek 19: Stanovení exprese izoformy MT1 u buněčných linií PNT1A, PC-3 a 4T1.

Obrázek 20: Stanovení exprese izoformy MT2 u buněčných linií PNT1A, PC-3 a 4T1.

Obrázek 21: Exprese genů MTF-1, p53, MT1 a MT2 v jednotlivých tkáních.

Obrázek 22: Hladina MT na proteinové úrovni v jednotlivých tkáních.

Obrázek 23: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů v jaterní

tkáni.

Obrázek 24: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů v ledvinné

tkáni.

Obrázek 25: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů v plicní

tkáni.

Obrázek 26: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů ve tkáni

sleziny.

Obrázek 27: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů v mozkové

tkáni.

Obrázek 28: Efekt suplementace zinkem na expresi genů ve tkáni primárního nádoru.

Obrázek 29: Efekt suplementace zinkem na velikost nádoru.

10 SEZNAM TABULEK

Tabulka 1: Korelace mRNA - MT protein

Tabulka 2: Změny exprese genů u jednotlivých modelů.

68

11 PŘÍLOHY

Seznam příloh:

Příloha 1: Publikační aktivita

Tabulka A: Přehled hmotností a velikosti nádorů během celého experimentu.

Tabulka B: Popisná statistika- játra

Tabulka C: Popisná statistika- ledviny

Tabulka D: Popisná statistika- plíce

Tabulka E: Popisná statistika- mozek

Tabulka F: Popisná statistika- slezina

Tabulka G: Popisná statistika- primární nádor

Příloha 1: Publikační aktivita

Autor a spoluautor 7 vědeckých prací a 5 konferenčních abstrakt indexovaných

v databázi Web of Science, suma citací bez autocitací: 14, h-index 3.

Výběr z publikací:

SZTALMACHOVA, M.; HLAVNA, M.; GUMULEC, J.; HOLUBOVA, M.;

BABULA, P.; BALVAN, J.; SOCHOR, J.; TANHAUSEROVA, V.;

RAUDENSKA, M.; KRIZKOVA, S.; ADAM, V.; ECKSCHLAGER, T.; KIZEK,

R.; MASARIK, M. Effect of zinc(II) ions on the expression of pro- and anti-

apoptotic factors in high-grade prostate carcinoma cells. Oncology Reports, 2012,

roč. 28. č. 3, s. 806-814. ISSN 1021-335X.

SZTALMACHOVA, M.; GUMULEC, J.; CERNEI, N.; HLAVNA, M.; ZITKA, O.;

BABULA, P.; ADAM, V.; KIZEK, R.; MASARIK, M. Prostate Specific Antigen,

Metallothionein and Caveolin-1 as Markers of Formation and Development of

Prostate Carcinoma. Chemicke Listy, 2012, roč. 106. č. 11, s. 1075-1080. ISSN

0009-2770.

GUMULEC, J.; RAUDENSKA, M.; HLAVNA, M.; STRACINA, T.;

SZTALMACHOVA, M.; TANHAUSEROVA, V.; PACAL, L.; RUTTKAY-

NEDECKY, B.; SOCHOR, J.; ZITKA, O.; BABULA, P.; ADAM, V.; KIZEK, R.;

NOVAKOVA, M.; MASARIK, M. Determination of oxidative stress and activities

of antioxidant enzymes in guinea pigs treated with haloperidol. Experimental and

Therapeutic Medicine, 2013, roč. 5. č. 2, s. 479-484. ISSN 1792-0981. DOI:

10.3892/etm.2012.822

69

GUMULEC, J.; SOCHOR, J.; HLAVNA, M.; SZTALMACHOVA, M.; KRIZKOVA,

S.; BABULA, P.; HRABEC, R.; ROVNY, A.; ADAM, V.; ECKSCHLAGER, T.;

KIZEK, R.; MASARIK, M. Caveolin-1 as a potential high-risk prostate cancer

biomarker. Oncology Reports, 2012, roč. 27. č. 3, s. 831-841. ISSN 1021-335X.

DOI: 10.3892/or.2011.1587

HLAVNA, M.; RAUDENSKA, M.; HUDCOVA, K.; GUMULEC, J.;

SZTALMACHOVA, M.; TANHAUSEROVA, V.; BABULA, P.; ADAM, V.;

ECKSCHLAGER, T.; KIZEK, R.; MASARIK, M. MicroRNAs and zinc

metabolism-related gene expression in prostate cancer cell lines treated with zinc(II)

ions. International Journal of Oncology, 2012, roč. 41. č. 6, s. 2237-2244. ISSN

1019-6439. DOI: 10.3892/ijo.2012.1655

MASARIK, M.; GUMULEC, J.; HLAVNA, M.; SZTALMACHOVA, M.; BABULA,

P.; RAUDENSKA, M.; PAVKOVA-GOLDBERGOVA, M.; CERNEI, N.;

SOCHOR, J.; ZITKA, O.; RUTTKAY-NEDECKY, B.; KRIZKOVA, S.; ADAM,

V.; KIZEK, R. Monitoring of the prostate tumour cells redox state and real-time

proliferation by novel biophysical techniques and fluorescent staining. Integrative

Biology, 2012, roč. 4. č. 6, s. 672-684. ISSN 1757-9694. DOI: 10.1039/c2ib00157h

MASARIK, M.; GUMULEC, J.; SZTALMACHOVA, M.; HLAVNA, M.; BABULA,

P.; KRIZKOVA, S.; RYVOLOVA, M.; JURAJDA, M.; SOCHOR, J.; ADAM, V.;

KIZEK, R. Isolation of metallothionein from cells derived from aggressive form of

high-grade prostate carcinoma using paramagnetic antibody-modified microbeads

off-line coupled with electrochemical and electrophoretic analysis. Electrophoresis,

2011, roč. 32. č. 24, s. 3576-3588. ISSN 0173-0835. DOI: 10.1002/elps.201100301

70

Tabulka A: Přehled hmotností a velikosti nádorů během celého experimentu.

Začátek

pokusu

1.

kontrola

2.

kontrola

3.

kontrola

4.

kontrola

5.

kontrola

6.

kontrola

7.

kontrola

8.

kontrola

1. skupina- váha (g) 26,22 26,3 26,08 26,02 26,41 26,59 26,19 26,21 25,69

Směrodatná odchylka 3,28 3,41 3,54 3,63 3,76 3,48 3,48 3,82 3,58

2. skupina- váha (g) 24,39 25,35 25,37 25,84 26 25,66 25,57 25,99 25,29

Směrodatná odchylka 2,79 2,75 2,81 2,49 2,60 2,72 2,55 2,72 2,49

3. skupina- váha (g) 25,73 25,73 25,9 25,87 26,24 26,31 26,63 27,27 26,86

Směrodatná odchylka 3,01 3,15 2,97 3,17 3,54 3,11 2,84 2,86 3,53

3. skupina velikost nádoru

(mm2)

- - 21,54 81,1 83,05 117,1 174,75 189,43 255,48

Směrodatná odchylka - - 19,31 27,34 24,41 31,06 34,83 30,07 65,43

4. skupina – váha (g) 25,25 24,7 24,95 25,25 25,31 25,3 26,24 26,17 26,12

Směrodatná odchylka 2,73 2,59 2,59 2,52 2,98 2,82 3,37 2,82 3,17

4. skupina velikost nádoru

(mm2)

- - 18,93 62,73 73,2 106,8 153,78 181,08 221,7

Směrodatná odchylka - - 14,73 24,11 17,25 28,32 39,77 36,41 60,43

71

Tabulka B: Popisná statistika- játra

Analyzovaný

gen

Zn2+

Nádor Tkáň Počet

vzorků

Průměr Medián Minimum Maximum Dolní

kvartil

Hodní

kvartil

Variance Směrodatná

odchylka

MTF-1

[2-ddCt

]

ne ne játra 8 88,837 1,155 0,004 364,065 0,252 171,906 24661,437 157,040

p53 [2-ddCt

] ne ne játra 8 5,807 1,216 0,021 26,151 0,293 8,632 84,203 9,176

MT-1 [2-ddCt

] ne ne játra 8 5,345 1,275 0,007 25,329 0,251 7,186 78,304 8,849

MT-2 [2-ddCt

] ne ne játra 8 8,054 1,014 0,001 49,516 0,145 6,297 288,059 16,972

MT [ug/g] ne ne játra 3 121,029 48,592 14,173 300,320 14,173 300,320 24405,379 156,222

MTF-1

[2-ddCt

]

ano ne játra 8 1,584 0,826 0,002 6,120 0,053 2,394 4,453 2,110

p53 [2-ddCt

] ano ne játra 8 1,283 0,469 0,002 5,833 0,156 1,587 3,867 1,966

MT-1 [2-ddCt

] ano ne játra 8 1,892 0,709 0,004 9,267 0,049 2,173 9,903 3,147

MT-2 [2-ddCt

] ano ne játra 8 5,515 2,908 0,010 26,151 0,131 5,941 76,435 8,743

MT [ug/g] ano ne játra 3 29,270 34,129 11,879 41,804 11,879 41,804 241,582 15,543

MTF-1

[2-ddCt

]

ne ano játra 8 0,914 0,518 0,002 3,500 0,072 1,313 1,403 1,184

p53 [2-ddCt

] ne ano játra 8 0,218 0,113 0,004 0,744 0,036 0,348 0,065 0,254

MT-1 [2-ddCt

] ne ano játra 8 0,454 0,154 0,005 1,680 0,033 0,787 0,377 0,614

MT-2 [2-ddCt

] ne ano játra 8 2,474 1,336 0,012 9,722 0,171 3,522 10,702 3,271

MT [ug/g] ne ano játra 4 19,043 12,864 0,000 50,445 6,323 31,763 475,054 21,796

MTF-1

[2-ddCt

]

ano ano játra 8 0,297 0,084 0,002 1,478 0,033 0,330 0,245 0,495

p53 [2-ddCt

] ano ano játra 8 1,581 0,047 0,000 12,156 0,014 0,183 18,264 4,274

MT-1 [2-ddCt

] ano ano játra 8 3,026 1,611 0,793 8,156 0,915 5,101 7,583 2,754

MT-2 [2-ddCt

] ano ano játra 8 25,180 13,636 2,312 73,796 6,684 42,346 640,560 25,309

MT [ug/g] ano ano játra 5 10,057 10,663 0,000 20,313 7,755 11,553 53,558 7,318

72

Tabulka C: Popisná statistika- ledviny

Analyzovaný

gen

Zn2+

Nádor Tkáň Počet

vzorků

Průměr Medián Minimum Maximum Dolní

kvartil

Hodní

kvartil

Variance Směrodatná

odchylka

MTF-1

[2-ddCt

]

ne ne ledviny 8 9,178 0,020 0,000 69,232 0,004 2,071 590,585 24,302

p53 [2-ddCt

] ne ne ledviny 8 0,843 0,060 0,000 4,665 0,003 0,977 2,788 1,670

MT-1 [2-ddCt

] ne ne ledviny 8 1,091 0,455 0,006 4,308 0,054 1,697 2,552 1,598

MT-2 [2-ddCt

] ne ne ledviny 8 3,500 2,826 0,166 8,156 1,615 5,398 7,661 2,768

MT [ug/g] ne ne ledviny 4 8,771 10,452 0,000 14,183 4,879 12,664 37,610 6,133

MTF-1

[2-ddCt

]

ano ne ledviny 8 13,327 0,012 0,001 106,526 0,008 0,025 1418,130 37,658

p53 [2-ddCt

] ano ne ledviny 8 0,034 0,027 0,001 0,082 0,004 0,063 0,001 0,032

MT-1 [2-ddCt

] ano ne ledviny 8 9,810 1,779 0,319 64,950 0,985 3,840 498,195 22,320

MT-2 [2-ddCt

] ano ne ledviny 8 19,598 0,896 0,091 151,338 0,459 1,321 2833,752 53,233

MT [ug/g] ano ne ledviny 4 15,501 17,824 7,455 18,902 12,226 18,777 29,491 5,431

MTF-1

[2-ddCt

]

ne ano ledviny 8 0,018 0,015 0,000 0,056 0,008 0,023 0,000 0,017

p53 [2-ddCt

] ne ano ledviny 8 0,319 0,097 0,002 1,409 0,018 0,453 0,251 0,501

MT-1 [2-ddCt

] ne ano ledviny 8 0,042 0,042 0,015 0,069 0,017 0,067 0,001 0,024

MT-2 [2-ddCt

] ne ano ledviny 8 0,041 0,019 0,004 0,129 0,008 0,070 0,002 0,048

MT [ug/g] ne ano ledviny 4 13,085 11,090 0,000 30,161 4,990 21,181 157,745 12,560

MTF-1

[2-ddCt

]

ano ano ledviny 8 0,011 0,007 0,003 0,033 0,005 0,015 0,000 0,010

p53 [2-ddCt

] ano ano ledviny 8 0,148 0,045 0,000 0,499 0,012 0,286 0,036 0,190

MT-1 [2-ddCt

] ano ano ledviny 8 1,910 0,181 0,049 13,377 0,081 0,664 21,566 4,644

MT-2 [2-ddCt

] ano ano ledviny 8 7,926 0,533 0,101 59,968 0,305 0,832 442,259 21,030

MT [ug/g] ano ano ledviny 4 9,124 11,728 0,000 13,041 5,745 12,503 37,421 6,117

73

Tabulka D: Popisná statistika- plíce

Analyzovaný

gen

Zn2+

Nádor Tkáň Počet

vzorků

Průměr Medián Minimum Maximum Dolní

kvartil

Hodní

kvartil

Variance Směrodatná

odchylka

MTF-1

[2-ddCt

]

ne ne plíce 8 0,010 0,004 0,000 0,034 0,001 0,019 0,000 0,013

p53 [2-ddCt

] ne ne plíce 8 0,249 0,043 0,000 1,092 0,006 0,403 0,148 0,385

MT-1 [2-ddCt

] ne ne plíce 8 0,090 0,019 0,002 0,447 0,011 0,106 0,023 0,150

MT-2 [2-ddCt

] ne ne plíce 8 0,346 0,227 0,028 1,182 0,055 0,495 0,157 0,397

MT [ug/g] ne ne plíce 4 176,293 68,738 21,090 546,607 21,403 331,184 62926,134 250,851

MTF-1

[2-ddCt

]

ano ne plíce 8 0,368 0,002 0,000 1,478 0,000 0,729 0,460 0,678

p53 [2-ddCt

] ano ne plíce 8 0,031 0,016 0,002 0,133 0,004 0,035 0,002 0,043

MT-1 [2-ddCt

] ano ne plíce 8 0,023 0,009 0,000 0,097 0,003 0,030 0,001 0,033

MT-2 [2-ddCt

] ano ne plíce 8 0,013 0,010 0,000 0,029 0,005 0,023 0,000 0,011

MT [ug/g] ano ne plíce 3 246,058 213,043 201,166 323,965 201,166 323,965 4587,404 67,730

MTF-1

[2-ddCt

]

ne ano plíce 8 0,000 0,000 0,000 0,001 0,000 0,000 0,000 0,000

p53 [2-ddCt

] ne ano plíce 8 0,001 0,001 0,000 0,004 0,001 0,001 0,000 0,001

MT-1 [2-ddCt

] ne ano plíce 8 0,002 0,001 0,000 0,007 0,000 0,004 0,000 0,003

MT-2 [2-ddCt

] ne ano plíce 8 0,011 0,002 0,000 0,074 0,000 0,005 0,001 0,025

MT [ug/g] ne ano plíce 3 148,832 60,950 58,054 327,491 58,054 327,491 23941,523 154,730

MTF-1

[2-ddCt

]

ano ano plíce 8 0,000 0,000 0,000 0,001 0,000 0,000 0,000 0,000

p53 [2-ddCt

] ano ano plíce 8 0,001 0,001 0,000 0,002 0,001 0,002 0,000 0,001

MT-1 [2-ddCt

] ano ano plíce 8 0,000 0,000 0,000 0,001 0,000 0,000 0,000 0,000

MT-2 [2-ddCt

] ano ano plíce 8 0,001 0,001 0,000 0,004 0,000 0,002 0,000 0,001

MT [ug/g] ano ano plíce 4 112,604 75,983 17,274 281,175 23,945 201,263 14767,467 121,521

74

Tabulka E: Popisná statistika- mozek

Analyzovaný

gen

Zn2+

Nádor Tkáň Počet

vzorků

Průměr Medián Minimum Maximum Dolní

kvartil

Hodní

kvartil

Variance Směrodatná

odchylka

MTF-1

[2-ddCt

]

ne ne mozek 5 0,039 0,023 0,001 0,092 0,022 0,057 0,001 0,036

p53 [2-ddCt

] ne ne mozek 5 0,008 0,004 0,001 0,019 0,003 0,014 0,000 0,008

MT-1 [2-ddCt

] ne ne mozek 5 0,015 0,008 0,001 0,049 0,003 0,014 0,000 0,020

MT-2 [2-ddCt

] ne ne mozek 5 2,827 0,426 0,228 11,404 0,228 1,849 23,447 4,842

MT [ug/g] ne ne mozek 3 344,733 436,686 48,639 548,875 48,639 548,875 68900,682 262,489

MTF-1

[2-ddCt

]

ano ne mozek 5 0,003 0,002 0,000 0,007 0,001 0,003 0,000 0,003

p53 [2-ddCt

] ano ne mozek 5 0,000 0,000 0,000 0,001 0,000 0,000 0,000 0,000

MT-1 [2-ddCt

] ano ne mozek 5 0,004 0,004 0,001 0,007 0,003 0,005 0,000 0,002

MT-2 [2-ddCt

] ano ne mozek 5 0,280 0,247 0,095 0,507 0,214 0,335 0,024 0,154

MT [ug/g] ano ne mozek 3 61,633 58,933 52,199 73,768 52,199 73,768 121,773 11,035

MTF-1

[2-ddCt

]

ne ano mozek 5 0,058 0,009 0,002 0,171 0,002 0,105 0,006 0,077

p53 [2-ddCt

] ne ano mozek 5 0,003 0,002 0,000 0,012 0,001 0,003 0,000 0,005

MT-1 [2-ddCt

] ne ano mozek 5 0,004 0,003 0,002 0,010 0,003 0,004 0,000 0,003

MT-2 [2-ddCt

] ne ano mozek 5 0,300 0,095 0,081 0,710 0,081 0,532 0,090 0,300

MT [ug/g] ne ano mozek 3 217,313 155,116 39,879 456,945 39,879 456,945 46387,222 215,377

MTF-1

[2-ddCt

]

ano ano mozek 5 0,045 0,036 0,001 0,121 0,033 0,036 0,002 0,045

p53 [2-ddCt

] ano ano mozek 5 0,006 0,003 0,000 0,020 0,002 0,003 0,000 0,008

MT-1 [2-ddCt

] ano ano mozek 5 0,005 0,004 0,002 0,010 0,003 0,005 0,000 0,003

MT-2 [2-ddCt

] ano ano mozek 5 0,225 0,127 0,043 0,733 0,093 0,129 0,082 0,286

MT [ug/g] ano ano mozek 4 47,764 15,122 12,132 148,680 12,132 83,396 4534,192 67,336

75

Tabulka F: Popisná statistika- slezina

Analyzovaný

gen

Zn2+

Nádor Tkáň Počet

vzorků

Průměr Medián Minimum Maximum Dolní

kvartil

Hodní

kvartil

Variance Směrodatná

odchylka

MTF-1

[2-ddCt

]

ne ne slezina 7 0,250 0,004 0,000 1,734 0,000 0,006 0,428 0,655

p53 [2-ddCt

] ne ne slezina 8 0,081 0,013 0,000 0,447 0,001 0,088 0,024 0,154

MT-1 [2-ddCt

] ne ne slezina 8 0,156 0,027 0,000 0,916 0,004 0,135 0,099 0,315

MT-2 [2-ddCt

] ne ne slezina 8 1,290 0,108 0,007 5,217 0,010 2,430 4,418 2,102

MT [ug/g] ne ne slezina 4 85,081 18,034 15,644 288,613 16,525 153,637 18412,700 135,693

MTF-1

[2-ddCt

]

ano ne slezina 8 0,002 0,001 0,000 0,007 0,000 0,003 0,000 0,002

p53 [2-ddCt

] ano ne slezina 8 0,073 0,031 0,000 0,255 0,003 0,133 0,010 0,101

MT-1 [2-ddCt

] ano ne slezina 8 0,221 0,009 0,001 1,008 0,004 0,365 0,155 0,394

MT-2 [2-ddCt

] ano ne slezina 8 0,149 0,081 0,014 0,499 0,038 0,221 0,028 0,168

MT [ug/g] ano ne slezina 3 17,077 16,756 14,866 19,608 14,866 19,608 5,699 2,387

MTF-1

[2-ddCt

]

ne ano slezina 7 0,000 0,000 0,000 0,001 0,000 0,001 0,000 0,001

p53 [2-ddCt

] ne ano slezina 7 0,009 0,006 0,000 0,028 0,001 0,014 0,000 0,010

MT-1 [2-ddCt

] ne ano slezina 8 0,021 0,000 0,000 0,151 0,000 0,009 0,003 0,053

MT-2 [2-ddCt

] ne ano slezina 8 0,102 0,001 0,000 0,806 0,000 0,004 0,081 0,284

MT [ug/g] ne ano slezina 4 139,576 25,257 10,846 496,942 17,861 261,290 56806,571 238,341

MTF-1

[2-ddCt

]

ano ano slezina 7 0,000 0,000 0,000 0,001 0,000 0,000 0,000 0,000

p53 [2-ddCt

] ano ano slezina 7 0,001 0,001 0,000 0,003 0,000 0,002 0,000 0,001

MT-1 [2-ddCt

] ano ano slezina 8 0,002 0,000 0,000 0,013 0,000 0,002 0,000 0,004

MT-2 [2-ddCt

] ano ano slezina 8 0,080 0,000 0,000 0,635 0,000 0,001 0,050 0,224

MT [ug/g] ano ano slezina 4 160,364 21,530 15,339 583,060 18,208 302,521 79418,172 281,812

76

Tabulka G: Popisná statistika- primární nádor

Analyzovaný

gen

Zn2+

Nádor Tkáň Počet

vzorků

Průměr Medián Minimum Maximum Dolní

kvartil

Hodní

kvartil

Variance Směrodatná

odchylka

MTF-1

[2-ddCt

]

ne ano primární

nádor

8 2,125 0,000 0,000 15,944 0,000 0,529 31,315 5,596

p53 [2-ddCt

] ne ano primární

nádor

8 0,187 0,000 0,000 1,092 0,000 0,200 0,153 0,391

MT-1 [2-ddCt

] ne ano primární

nádor

8 0,006 0,004 0,000 0,019 0,001 0,009 0,000 0,006

MT-2 [2-ddCt

] ne ano primární

nádor

8 0,040 0,040 0,003 0,089 0,008 0,066 0,001 0,033

MT [ug/g] ne ano primární

nádor

3 262,657 94,001 64,003 629,966 64,003 629,966 101412,190 318,453

MTF-1

[2-ddCt

]

ano ano primární

nádor

8 0,003 0,002 0,000 0,012 0,000 0,005 0,000 0,004

p53 [2-ddCt

] ano ano primární

nádor

8 0,013 0,002 0,000 0,088 0,000 0,007 0,001 0,030

MT-1 [2-ddCt

] ano ano primární

nádor

8 0,037 0,010 0,000 0,211 0,002 0,030 0,005 0,072

MT-2 [2-ddCt

] ano ano primární

nádor

8 0,123 0,016 0,000 0,756 0,008 0,090 0,067 0,260

MT [ug/g] ano ano primární

nádor

4 108,206 59,464 19,432 294,464 23,605 192,806 16444,161 128,235