Využití NMR spektroskopie

pro studium biomakromolekul

RCSB PDB

RCSB PDB

RCSB PDB

Uplatnění NMR spektroskopie ● chemická struktura

– kovalentní struktura

– konformace, geometrie molekul

● dynamické procesy

– chemické a konformační výměny

– reakční kinetika

– dynamika molekul nebo jejich částí

● aplikace v biologických vědách

– analýza přírodních látek

– určení trojrozměrné struktury

□ oligosacharidy a nukleové kyseliny – omezené možnosti

□ peptidy, proteiny

□ komplexy (NA–protein, enzym–substrát)

– dynamické studie

Progr. NMR

Specifika řešení struktury proteinů pomocí NMR ● měření ve fyziologickém prostředí, možnost úpravy fyzikálně-chemických vlastností

prostředí

● sledování průběhu biochemických dějů

● vysoce selektivní odezva na úrovni atomů

Čím jsme omezeni:

● velikost molekuly (ovlivnění rychlostí relaxace NMR signálu)

– do 10 kDa (≡10 kg mol−1) [< 70 AA]

□ lze řešit s přirozeným izotopovým zastoupením

– do 20 kDa [< 180 AA]

□ nutné 100% isotopové obohacení 13C a 15N

– do ~200 kDa

□ 100% isotopové obohacení 13C, 15N a částečné nebo úplné obohacení 2H (odstranění 1H jako hlavního zdroje rychlé relaxace 13C)

– větší proteiny

□ přístupný pouze hrubý „náhled“ na celkovou strukturu, sekundární struktura

● koncentrace vzorku

– alespoň 0,2 mM

● dlouhodobá stabilita vzorku

– několik týdnů (ideálně při pokojové teplotě)

NMR = jaderná magnetická resonance

● interakce elektromagnetického záření s atomovými jádry

vzorku umístěného v silném magnetickém poli

● elektromagnetické záření je v oblasti radiových vln

● (101 – 102 MHz)

→ precese

(Larmorova frekvence)

→ rozdíl v populacích a

rozdíl malý ⇒ nízká citlivost NMR

→ makroskopická magnetizace

… princip NMR spektroskopie …

různé typy jader mají dostatečně odlišné frekvence absorbovaného elmg záření

⇒ při měření se detekuje jen jeden typ jader

gyromagnetická konstanta

… princip NMR spektroskopie – měření

RF vysílač

přijímač

x

y

z

přijíma

č

x

y

z

excitace

Fourierova

transformace

NMR spektrum

zpětné vyzáření, detekce

intenzita = f(t)

intenzita = f(Ω)

RF vysílač

FID (free induction decay)

NMR spektrometry ● FT NMR spektrometry s vysokým rozlišením

– supravodivé magnety s B0 v rozmezí 11,6 až 23,2 T (1H frekvence 500 až

1000 MHz)

● trojresonanční (kryo)sondy s vysokou citlivostí, cívky pro vytváření

definovaných gradientů magnetického pole

Hlavní NMR parametry

2. chemický posun – umístění atomu v molekule

(≡ frekvence absorbovaného záření)

3. interakční konstanty – nejbližší vazebné okolí (počet atomů, geometrie)

1. počet a intenzita signálů – odráží situaci v molekule

4. relaxační vlastnosti – struktura, dynamika molekuly

(NOE)

1.

2.

3.

Příklad 1H-NMR spektra: ethylacetát

H3

C

CH

2

O C

CH

3

O

1H/ ppm

2 3 3 intenzita signálu

● charakteristické oblasti výskytu jednotlivých typů 1H signálů aminokyselin

– kuřecí lysozym (129 AA, M = 14,6 kDa)

H alifatické

HN peptidické

H aromatické

HN

postranní Hα

CH3

Jednodimensionální 1H NMR spektrum proteinu

AA3 AA2 AA1

C C N C

N C

C

O H

H H R2

O

H R1

H R3

N

H

C

O

●1H spinové systémy jednotlivých aminokyselin jsou odděleny C=O skupinami

● 1D 1H spektrum tedy obsahuje superposice spekter jednotlivých aminokyselin v daném proteinu a

● k sekvenčnímu propojení a přiřazení signálů se používají všechna jádra: 1H, 13C a 15N

Vícedimensionální NMR experimenty ● rozlišení informací obsažených v 1D spektrech

● příklad: 1H-15N HSQC spektrum

1

H

15

N

projekce 15N spektra

projekce 1H spektra

1H

(ppm)

1H

(ppm)

15N

(ppm

)

15N

(ppm

) 1H-15N HSQC – „otisk palce“ proteinu

● ověření dobré terciární struktury proteinu, sledování lokálních

strukturních změn, interakcí s jinými molekulami, …

nesbalený protein sbalený protein

Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR

příprava vzorku naměření NMR

spekter

přiřazení signálů

atomům v molekule

přiřazení NMR

parametrů

pro výpočet

struktury

obecné informace o

molekule (primární

struktura, S–S vazby,...) výpočet souboru

počátečních struktur

vyhodnocení

kvality struktur

oprava přiřazení

výpočet

souboru struktur

validace struktur

Interpretace NMR spekter – přiřazení resonancí

● přiřazení NMR signálů jednotlivým atomům v molekule

● postup:

1.přiřazení hlavního řetězce (HN, N, Hα, Cα, CO)

2.přiřazení postranních řetězců (především 1H a 13C)

● je nutné znát sekvenci aminokyselin daného proteinu

C C N C

N C

C

O H

H H R2

O

H

R1

H

R3

N

H

C O

Přiřazení resonancí – experimenty HNCA a HN(CO)CA

13Cα

13C' 15N

13Cα

13C'

15N

O

O 1H

1H 13Cβ

13Cγ

1H

1H 13Cβ

13Cγ

90

11

15

7

55 140

55

35

i − 1 i

< 1

13Cα

13C' 15N

13Cα

13C'

15N

O

O 1H

1H 13Cβ

13Cγ

1H

1H 13Cβ

13Cγ

90

11

15

7

55 140

55

35

i − 1 i

< 1

interakční konstanty J v Hz

HN(CO)CA

– po excitaci HiN je magnetizace je

přenesena na Ni (1JHN,N), dále na

Ci−1 (1JN,C ) a na Ci−1α (1JC ,Cα)

– vývoj chemických posunů nastává pro HN, N a Cα

– každá H – N skupina dává jeden signál o frekvenci {ω(Hi

N), ω(Ni), ω(Cα

i−1)}

HNCA

– po excitaci HiN je magnetizace

přenesena na Ni (1JHN,N) a dále

současně na Ciα (1JN,Cα) a Cα

i−1 (2JN,Cα)

– vývoj chemických posunů nastává pro HN, N a Cα

– každá H–N skupina dává dva signály o frekvencích {ω(Hi

N), ω(Ni), ω(Ci

α)} a {ω(HiN), ω(Ni),

ω(Cαi−1)}

Sekvenční propojení hlavního řetězce – HNCA a HN(CO)CA

● 2D řezy spektry HNCA a HN(CO)CA v rovině H–C na frekvencích jednotlivých

amidických N

HNCA HN(CO)CA HNCA HN(CO)CA HNCA HN(CO)CA HNCA HN(CO)CA

někdy chybí pík… H

N

C

Chemický posun ● chemický posun některých jader je

charakteristicky závislý na

sekundární struktuře

přiřazení resonancí

hlavního řetězce (Hα, Cα a C')

výpočet indexů chemického posunu (CSI)

odhad sekundární struktury podle

lokální hustoty CSI

náhodné klubko

δ(Hα)

α-helix β-sheet

klesá roste

chemický posun

Histogram indexu chemického

posunu jader Hα, Cα a C'

C N

−1

0 +1

sekvence proteinu

helix I

helix II

helix III

helix IV

Nukleární Overhauserův efekt (NOE) ● přímá dipól-dipólová interakce mezi atomy I a S vlivem křížové relaxace

● Vypovídá o blízkosti dvou atomů v prostoru bez ohledu na primární strukturu

γH ... gyromagnetická konstanta 1H

τc ... korelační čas molekuly

ω ... Larmorova frekvence

rIS ... vzdálenost interagujících jader

H H

dosah interakce do 5–6 Å

●NOE je hlavní zdroj informace o struktuře

proteinu. Cílem je nalézt co největší počet NOE

interakcí a jednoznačně je přiřadit dvojicím

konkrétních vodíkových atomů v molekule.

●Pravidelné prvky sekundární struktury tvoří

charakteristické sítě NOE kontaktů.

Přiřazení resonancí

a) páteř

b) postranní řetězce

Strukturní omezení z NMR parametrů

✔vzdálenosti z NOE kontaktů (intra- a

interresiduální)

✔dihedrální úhly z chemických posunů

atomů páteře proteinu

✔případně další omezení

Výpočet trojrozměrné struktury

molekulová mechanika

+ simulované žíhání

Identifikace prvků

sekundární

struktury

Výpočet struktury proteinu ● molekulová mechanika v prostoru kartézských souřadnic (Newtonovy

pohybové rovnice) nebo torsních úhlů (Lagrangeovy rovnice)

energetická plocha v závislosti na

dvou dihedrálních úhlech v

disacharidu

●použití všech dostupných experimentálních

omezení, minimalizace celkové energie systému

–simulované žíhání: molekula se ohřeje na

vysokou teplotu (103 K) a nechá se postupně

chladnout. Po každém ochlazení se vypočítá

nová energie systému. Cílem je překonat lokální

energetická minima a najít (nejlépe) to globální.

–přidáme nové energetické členy pro

experimentální omezení: čím bližší bude shoda

vypočítané struktury s experimentálními údaji,

tím nižší bude celková energie

–například pro NOE:

V případě proteinu se jedná o plochu

závislou na n proměnných (n je počet

optimalizovaných souřadnich/úhlů).

Vypočítané struktury ● obdržíme soubor velice podobných struktur s minimálními energiemi

– Nejedná se o jedinou strukturu jako v případě rentgenové krystalografie, ale

o soubor struktur. NOE omezení se totiž nezadává jako fixní vzdálenost, ale

jako interval vzdálenosti. Souboru NOE tedy bude vyhovovat více struktur,

které by se ovšem měly lišit jen nepatrně.

– Větší rozptyl struktur v určité oblasti může být způsoben nedostatkem

experimentálních dat nebo zvýšenou pohyblivostí dané části proteinu.

● struktura matrixového proteinu Masonova-Pfizerova opičího viru

soubor struktur vybraná reprezentativní

struktura RMSD = 1,3 Å (jen helikální oblasti)

Validace struktur ● ověření “normality” struktur

– Ramachandranův diagram

– páteř proteinu

– rotamery

– Pakování

Program Cing

Interakce proteinu s ligandem • Protein-protein, protein-NK, protein-malá molekula, oligomerace

• Interaguje specificky?

• Kde interaguje?

• Síla interakce (vhodné i pro slabší interakci)

• Farmaceutický průmysl

• Proteomické studie

• Metody pro měření interakce pomocí NMR

• Sledování změn chemických posunů

• Intermolekulární NOE

• Transferred NOESY

• Mapování H-D chemické výměny NH skupin

Změny chemických posunů • Titrace proteinu ligandem

• Sledování změn chemických posunů skupin (nejčastěji HN)

• Interakční povrch

• Disociační konstanta

Transferred NOESY

• Princip: informace o struktuře ligandu ve vázaném stavu je pomocí chemické

• výměny přenesena na ligand ve volném stavu, kde je detekována

• Uspořádání: „malý“ ligand, který je viditelný NMR spektroskopií a velký substrát (Mw > 40 kDa) neviditelný pro NMR

• Podmínka vhodná kinetika systému 10-8 > Kd > 10-3 M-1

• Využití: - struktura ligandu

• - nepřímo struktura vazebného místa

• - způsob vazby

H

H

H

H

r < 5 Å

r > 5 Å

chemická

výměna

NOE

•Peptid antikolagulační kaskády •Inhibitor trombinu

Interakce fragmentu trombomodulinu s trombinem

• 18 aminokyselin z vazebného místa trombomodulinu

NOESY spektrum fragmentu trombomodulinu za přítomnosti trombinu

NOESY spektrum samotného fragmentu trombomodulinu

Důležité NOE interakce dalekého dosahu ligandu TM52+5C v komplexu s thrombinem

Complex between thrombin and TM52+5C Struktura komplexu thrombinu a ligandu TM52+5C

Studium dynamického chování molekul ● molekuly nejsou statické, reagují a pohybují se v různých časových škálách

– různě rychlé pohyby se vzájemně doplňují

● funkce mnoha biomolekul závisí na jejich flexibilitě

– regulace dějů, interakce molekul, oligomerizace

● vypočítaná struktura je někdy průměrem mnoha stavů – charakterizace

● NMR dává možnost měřit molekulární procesy v různých časových škálách

– chemické reakce (ms – s)

– konformační výměny (μs – ms)

– dynamika pohybu – relaxační vlastnosti 15N a 13C (ps – ns)

● příklad: adenylát kinasa

– globální konformační výměna; zde limituje rychlost enzymatické přeměny

– rychlá dynamika residuí v místě ohybu

Wolf-Watz et al.

(2004) Nat. Struct.

červeně: residua ovlivněná konformační výměnou žlutá šipka: rychlá dynamika