viviano gomes de oliveira neves...pessoa com muita luz por onde passa. as meninas do grupo da...
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ii
VIVIANO GOMES DE OLIVEIRA NEVES
ANÁLISE DO MICROBIOMA FECAL DE RATOS
WISTAR SUBMETIDOS A UMA DIETA RICA EM
CARBOIDRATOS SIMPLES E TREINAMENTO DE
NATAÇÃO AERÓBICO
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Ouro Preto, como parte das exigências do Programa de
Pós-Graduação em Ciências Biológicas, para obtenção
do título de Mestre em Ciências Biológicas.
Área de Concentração: Bioquímica Estrutural e
Biologia Molecular
Orientadora: Profa. Dr.a Renata Guerra de Sá
Co-orientadora: Dr.a Natália Rocha Barboza
OURO PRETO/MG
Março / 2019
Trabalho desenvolvido no Instituto de Ciências Exatas e
Biológicas (ICEB/UFOP) no Laboratório de Bioquímica e
Biologia Molecular (LBBM) associado ao NUPEB/UFOP, no
Biotério Centro de Ciência Animal da UFOP (CCA), e
financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior (CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa
do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e pelo Conselho
Nacional de Pesquisa (CNPq).
vi
Agradecimentos:
Se resumisse todas as experiências que vivi nesses últimos dois anos, provavelmente
resumiria numa única palavra: "GRATIDÃO".
Primeiramente gostaria de agradecer a Deus como grande abrigo espiritual e ter dado
forças em todas as minhas dificuldades e conquistas.
Agradecer o apoio dos meus pais José de Oliveira Neves e Maria Ventura Gomes Neves.
Meus irmãos José Maria Gomes Neves e Deivisson Gomes Neves.
Minha sobrinha Cecília Charlotte que é mais nova integrante da família.
A professora Dra Renata por ter dado a oportunidade em fazer o mestrado, assim como
estágio acadêmico, e todo o suporte na execução do projeto. E também por todos os
ensinamentos e atenção fora do meio acadêmico
A Talita, ex-colega de EFAR e Cbiol gostaria de agradecer a amizade, e igualmente pelas
parcerias que fizemos nas diferentes disciplinas que cursamos, sempre tínhamos êxitos quando o
trabalho era de dupla.
A Deborah pela ajuda na fase do biotério, todos os dias eram uma aventura ou uma
surpresa diferente, mas com seu jeito cativante as coisas sempre ficavam mais leve e muitas
risadas e momentos legais vão permanecer na minha memória.
A Natália, muito obrigado pela sua generosidade, amizade e sempre com seus conselhos
sábios e principalmente pela comida deliciosa (bolos e tira gostos) na sua casa. De fato uma
pessoa com muita luz por onde passa.
As meninas do grupo da epigenética e as que ainda não citei como: Daiane, Isabela e
Grazi. Obrigado pela ajuda nas eutanásias, eu sei que não é fácil acordar muito cedo em Ouro
Preto principalmente em dias de inverno, e também por ceder o carro para carona e ajudar a levar
os materiais; Sobretudo, pela disposição por terem encarado tudo como uma equipe. E se hoje
consegui resultados satisfatório teve toda uma equipe que me amparou.
Ao professor Elísio, além da ajuda no biotério, é uma pessoa cativante com suas histórias
que é um legado de sabedoria para quem o conhece.
vii
A técnica do Laboratório de Genoma, Luiza, pela sua ajuda e contribuição no trabalho, e
por ser uma pessoa divertida e ter compartilhado momentos memoráveis com sua convivência.
A Éster e France Anne, pelas conversas amenas, risadas, e muitas das vezes por serem
companhia de janta no RU.
A Pollyana por ter convivido momentos divertidos e pelos convites de rock e festa junina
na sua casa.
E aos demais membros do laboratório que tive o prazer de conviver: Técnico Ezequiel,
Mônica, Thales, Virgínia, Joana, Yuri e Luciene.
A UNESP de Jaboticabal, por ter tido a oportunidade de ser selecionado para fazer curso
de verão em Metagenoma com grandes especialistas na área e que me fez ampliar a visão em
relação a essa técnica que vem sendo empregada em diferentes estratégias.
Agradeço a estrutura oferecida pela UFOP: NUPEB, CBIOL, CCA, DECBI e LAPAC.
As agências de fomento: CAPES, CNPQ e FAPEMIG.
Obrigado!!!
viii
“... A pior prisão é um coração fechado."
Papa João Paulo II
“ É preciso ser sábio para adquirir muito conhecimento”
Natália Barboza, 2019
“.. Looking deeper through the telescope
You can see that your home's inside of you …”
Jason Mraz
"Não é sobre chegar ao topo do mundo e saber que venceu
É sobre escalar e sentir que o caminho te fortaleceu"
Ana Vilela
ix
ÍNDICE
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................... xi
LISTA DE TABELAS .................................................................................................................. xii
LISTA SUPLEMENTAR ............................................................................................................ xiii
LISTAS DE ABREVIAÇÕES:.................................................................................................... xiv
RESUMO ........................................................................................................................................ 1
ABSTRACT .................................................................................................................................... 2
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 3
1.1. Microbiota de mamíferos ................................................................................................. 4
1.2. Benefícios da microbiota em mamíferos .......................................................................... 7
1.3. Microbiota intestinal versus doença metabólica ............................................................ 12
1.4. Dieta rica em carboidratos simples ................................................................................ 16
1.5. Treinamento aeróbico ..................................................................................................... 18
1.6. Metagenoma e microbioma intestinal ............................................................................ 21
2. Justificativa ............................................................................................................................ 22
3. OBJETIVO ............................................................................................................................ 23
3.1. Objetivos específicos...................................................................................................... 23
4. METODOLOGIA .................................................................................................................. 24
4.1. Desenho experimental .................................................................................................... 24
4.2. Composição da dieta ...................................................................................................... 25
4.3. Consumo alimentar e ganho de massa corporal ............................................................. 26
4.4. Treinamento ................................................................................................................... 26
4.5. Medida do lactato ........................................................................................................... 27
4.6. Teste de Tolerância Oral a glicose (TTOG) ................................................................... 28
4.7. Gaiola Metabólica .......................................................................................................... 28
4.9. Análises Hematológicas e Bioquímicas ......................................................................... 29
4.10. Parâmetros Biométricos .............................................................................................. 29
4.11. Análise do microbioma fecal de ratos Wistar ............................................................. 30
x
4.11.1. Extração do DNA nas fezes ................................................................................................ 30
4.11.2. Biblioteca 16S V3 e V4 ...................................................................................................... 31
4.11.3. Sequenciamento Illumina Miseq ......................................................................................... 32
4.11.4. Plataforma Illumina BaseSpace .......................................................................................... 33
4.12. Análises Estatísticas ................................................................................................... 35
5. RESULTADOS ..................................................................................................................... 36
5.1. Avaliação do consumo calórico e do ganho de massa corporal dos ratos durante o
período de experimentação........................................................................................................ 36
5.2. Efeito da dieta rica em carboidratos simples e do treinamento aeróbico sobre os
parâmetros bioquímicos e hematológicos ................................................................................. 37
5.3. A dieta rica em carboidratos simples e o treinamento de natação aeróbico com carga
afetam os parâmetros biométricos ............................................................................................. 39
5.4. Variação da pressão arterial e frequência cardíaca em relação à dieta e ao treinamento
de natação com carga ................................................................................................................ 40
5.5. Efeito do treinamento de natação aeróbico com carga sobre os níveis sérico de lactato 41
5.6. Consumo calórico, água e volume urinário dos grupos experimentais não diferiram em
um período de 24 horas ............................................................................................................. 42
5.7. Consumo dieta rica em carboidratos simples apresentou maior glicemia no TTOG ..... 43
5.8. Análise do efeito da dieta rica em carboidratos simples e do treinamento físico de
natação no microbioma intestinal de ratos Wistar .................................................................... 44
5.8.1. Extração do DNAg fecal e avaliação da sua integridade e qualidade ................................. 44
5.8.2. Análises dos dados sequenciados ........................................................................................ 47
6. DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 58
7. CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 68
8. PERSPECTIVAS................................................................................................................... 69
REFERÊNCIA .............................................................................................................................. 70
SUPLEMENTAR ......................................................................................................................... 86
xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1- DENSIDADE DE MICRO-ORGANISMOS QUE COLONIZAM O SISTEMA GASTROINTESTINAL .. 6
FIGURA 2- ESQUEMATIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE SAIS BILIARES PRIMÁRIOS E SECUNDÁRIOS VIA
BACTÉRIA. ................................................................................................................................ 9
FIGURA 3- CONTROLE DA PRODUÇÃO DE ÁCIDO BILIAR PELO FATOR DE CRESCIMENTO FGF15
ATIVADO PELO FXR ............................................................................................................... 10
FIGURA 4- METABÓLITOS PRODUZIDOS PELA MICROBIOTA E SUAS INTERFERÊNCIA NO HOSPEDEIRO
............................................................................................................................................... 14
FIGURA 5- MODELO ESQUEMÁTICO DA DISTRIBUIÇÃO DOS RATOS WISTAR MACHOS COM 28 DIAS DE
VIDA EM 4 DIFERENTES GRUPOS. ............................................................................................. 25
FIGURA 6- WORKFLOW PREPARO DA BIBLIOTECA 16S ................................................................... 32
FIGURA 7- GANHO DE MASSA CORPORAL DOS RATOS WISTAR AO LONGO DE 15 SEMANAS DE
EXPERIMENTAÇÃO .................................................................................................................. 36
FIGURA 8- CONSUMO CALÓRICO ESTIMADO PARA OS 4 GRUPOS EXPERIMENTAIS AO LONGO DE 15
SEMANAS EXPERIMENTAIS ...................................................................................................... 37
FIGURA 9- AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS SÉRICOS DE LACTATO NOS RATOS WISTAR NAS CONDIÇÕES PRÉ-
TREINO ................................................................................................................................... 42
FIGURA 10- PERFIL GLICÊMICO DOS RATOS E ÁREA TOTAL DA CURVA CORRESPONDENTE
AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE GLICOSE PELO TOTG NOS TEMPOS 0, 30, 60 E 120 MINUTOS. ...... 44
FIGURA 11- RESULTADO DA EXTRAÇÃO DO DNAG ....................................................................... 45
FIGURA 12- AMPLICON CORRESPONDENTE A REGIÃO RNAR UTILIZANDO OS PRIMERS 8F/1392 R .. 47
FIGURA 13- ESTIMATIVA DA RIQUEZA DE DIVERSIDADE DE ESPÉCIES ENCONTRADA NAS AMOSTRAS
FECAIS CALCULADAS PELO ÍNDICE DE DIVERSIDADE DE SHANNON. ........................................ 50
FIGURA 14- DENDROGRAMA REFERENTE AS AMOSTRAS FECAIS DOS RATOS WISTARS ................... 51
FIGURA 15- ANÁLISES ESTATÍSTICA DA ABUNDÂNCIA AO NÍVEL REINO ........................................ 52
FIGURA 16- ANÁLISES ESTATÍSTICAS DA ABUNDÂNCIA AO NÍVEL FILO ......................................... 53
FIGURA 17- ANÁLISES ESTATÍSTICA DA ABUNDÂNCIA AO NÍVEL CLASSE. ..................................... 54
FIGURA 18- ANÁLISES ESTATÍSTICAS DA ABUNDÂNCIA AO NÍVEL ORDEM ..................................... 54
FIGURA 19- ANÁLISES ESTATÍSTICAS DA ABUNDÂNCIA AO NÍVEL FAMÍLIA ................................... 56
FIGURA 20- ANÁLISES ESTATÍSTICAS DA ABUNDÂNCIA AO NÍVEL GÊNERO ................................... 57
FIGURA 21- RESUMO DO EFEITO DA MODULAÇÃO DO MICROBIOMA INFLUENCIADO PELA DIETA E
SEU IMPACTO NO MODELO EXPERIMENTAL E EFEITO DA INTERFERÊNCIA DO TREINAMENTO ... 66
FIGURA 22- RESUMO DO EFEITO DA MODULAÇÃO DO MICROBIOMA INFLUENCIADO PELO
TREINAMENTO E INTERAÇÃO COM A DIETA ............................................................................. 67
xii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1- COMPOSIÇÃO DA DIETA PADRÃO NUVILAB E DIETA RICA EM CARBOIDRATOS SIMPLES. 26
TABELA 2 - PROTOCOLO DO TREINAMENTO DE NATAÇÃO DOS RATOS WISTAR .............................. 27
TABELA 3- PRECISÃO ESTATÍSTICA DO GRAU DE ACURÁCIA DA IDENTIFICAÇÃO TAXONÔMICA
UTILIZANDO O ALGORITMO RDP NAÏVE BAYES. .................................................................... 34
TABELA 4- NÚMEROS DE DADOS EM DIFERENTES NÍVEIS TAXONÔMICO UTILIZANDO O CONSÓRCIO
GREENGENES TENDO A ÚLTIMA ACURÁCIA EM MAIO DE 2013. ............................................... 34
TABELA 5- ANÁLISES BIOQUÍMICA DOS RATOS WISTAR 15 SEMANAS ............................................ 38
TABELA 6- ANÁLISES HEMATOLÓGICA DOS RATOS WISTAR. ......................................................... 39
TABELA 7- PARÂMETRO BIOMÉTRICO RATOS WISTARS 15 SEMANAS ............................................. 40
TABELA 8- AVALIAÇÃO DA PRESSÃO E FREQUÊNCIA CARDÍACAS DOS RATOS WISTAR POR
PLETISMOGRAFIA CAUDAL ...................................................................................................... 41
TABELA 9- ANÁLISES QUANTITATIVA DO CONSUMO DE RAÇÃO, ÁGUA E VOLUME URINÁRIO DOS
RATOS WISTAR NUM PERÍODO DE 24 HORAS EM GAIOLA METABÓLICA ................................... 43
TABELA 10- ANÁLISES DA QUALIDADE E QUANTIFICAÇÃO DO DNA EXTRAÍDA DAS FEZES DE RATOS
WISTARS................................................................................................................................. 46
TABELA 11 - NÚMERO DE READS GERADOS E A PORCENTAGEM DE BACTÉRIAS IDENTIFICADAS A
NÍVEL DE GÊNERO ................................................................................................................... 48
TABELA 12- NÚMEROS DE ESPÉCIES ESTIMADO PELA DIVERSIDADE DE SHANNON NAS AMOSTRAS E
NÚMERO DE ESPÉCIES IDENTIFICADAS PELO BANCO GREENGENES. ......................................... 49
xiii
LISTA SUPLEMENTAR
SUPLEMENTAR 1- IDENTIFICAÇÃO DOS ANIMAIS POR GRUPO ......................................................... 86
SUPLEMENTAR 2- RESUMO SIMPLIFICADO DO EFEITO DA DIETA RICA EM CARBOIDRATO SIMPLES NO
MICROBIOMA DE RATOS WISTAR PARTINDO DO SEU FILO CLASSIFICATÓRIO ........................... 87
SUPLEMENTAR 3- RESUMO SIMPLIFICADO DO EFEITO DO TREINAMENTO DE NATAÇÃO CONSUMINDO
DIETA PADRÃO NO MICROBIOMA DE RATOS WISTAR PARTINDO DO SEU FILO CLASSIFICATÓRIO.
............................................................................................................................................... 88
SUPLEMENTAR 4- RESUMO SIMPLIFICADO DO EFEITO DO TREINAMENTO DE NATAÇÃO
ESPECIFICAMENTE SOBRE EFEITO DA DIETA RICA EM CARBOIDRATO SIMPLES NO MICROBIOMA
DE RATOS WISTAR PARTINDO DO SEU PRINCIPAL FILO CLASSIFICATÓRIO. ............................... 89
SUPLEMENTAR 5- RESUMO SIMPLIFICADO DO EFEITO DA INTERAÇÃO DIETA RICA EM CARBOIDRATO
SIMPLES SIMPLES NO MICROBIOMA DE RATOS WISTAR PARTINDO DO SEU FILO
CLASSIFICATÓRIO. .................................................................................................................. 90
SUPLEMENTAR 6- LISTA DE POSSÍVEIS BACTÉRIAS PATOGÊNICAS ENCONTRADAS NAS FEZES DOS
RATOS WISTAR, ASSIM COMO NÚMERO DE CÓPIAS DO DNA IDENTIFICADAS NO
SEQUENCIAMENTO EM CADA ANIMAL. .................................................................................... 91
xiv
LISTAS DE ABREVIAÇÕES:
A- Adenina
AGCC- Ácidos Graxos de Cadeia Curta
ALT- Alanina Aminotransferase
AMP - Monofosfato de Adenosina Proteina Quinase
AMPK- Monofosfato de Adenosina
Angpt 4- Angiopoietina-4
AST- Aspartato Aminotransferase
ATP- Trifosfato de Adenosina
BDNF- Fator Neuronal Derivado do Cérebro
bpm- Batimentos Cardíaco por Minuto
C- Citosina
CA- Ácido Cólico
CAPES- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoa de Nível Superior
CCA- Centro de Ciência Animal
CDCA - Ácido Quenodesoxicólico
CEUA- Comissão de Ética no Uso de Animais
CHM- Hemoglobina Corpuscular Média
CHCM - Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média
CNPQ- Conselho Nacional de Pesquisa
DECBI- Departamento de Ciências Biológicas
DNAg- DNA genômico
EDTA- Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
FAPEMIG- Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais
xv
FFAR 2- Receptor de Ácidos Graxos livres 2
FFAR 3 - Receptor de Ácidos Graxos livres 3
FGF-15- Fator de crescimento Fibroblasto 15
Fl- Fenolitro
Fiaf- Fasting Induced Adipose Factor
FRX- Receptor Farnesoid X
G- Guanina
g- Gramas
GLP-1 Peptídeo Semelhante ao Glucagon 1
H- Uma base que vem sempre depois da guanina, pode ser lida como Cistosina ou Timina
HDL-c- Lipoproteina Colesterol de Alta Densidade
IL- 4- Interleucina-4
IL-13- Interleucina-13
IL-1B- Interleucina-1beta
Kcal- Quilocaloria
LAPAC- Laboratório Piloto de Análises Clinica
LBBM- Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular
LDL-c- Lipropoteína Colesterol de Baixa Densindade
LPL- Lipase lipoprotéica
β-MCA -β-Murinoquólico
MAPK- Proteíno-Quinases Ativadas por Mitógenos
uL- Microlitro
mg/dL- Miligrama por decilitros
MHCII- Molécula de Histocompatibilidade II
mL- Mili Litro
xvi
Mmol/L- Mili mol por Litro
n- Número Amostral
N- Qualquer Nucleotídio
NAFLD -Doenças Hepática Não Alcoólica
NASH- Esteatose Hepática Não Alcoólica
nm- nanômetro
ng/uL- Nanograma por Microlitro
NGS- Sequenciamento de Nova Geração.
NUPEB- Núcleo de Pesquisas Biológicas
OMS- Organização Mundial da Saúde
OTUs - Unidades Taxonômicas Operacional
PAR2- Receptor Ativado por Protease2
pb- Pares de Bases
PCR- Reação em Cadeia da Polimerase
PCR ou C-PR- Proteína C- reativa
PCSK9- Proteína Convertase Subtilisina Kexina 9
Pg- Petagrama
PGC-1α - Coativador 1-alfa do Receptor Ativado por Proliferadores do Peroxissoma
PM- Peso Molecular
PVPP- Polivinilpolipirrolidone
PYY- Peptídeo YY
RDW CV- Red Cell Distribution Witdth ( Amplitude de distribuição de glóbulo Vermelho com
coeficiente de variação)
RDW SD- Red Cell Distribution Witdth (Amplitude de distribuição de glóbulo Vermelho com
desvio padrão)
rpm- Rotação Por Minuto
xvii
SDP- Sedentário Dieta Padrão
SDRC- Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples
T- Timina
TCA- Taurina-Ácido Cólico
TDP- Treinado Dieta Padrão
TDRC- Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples
TE- Tampão Tris EDTA
Th-1- T helper 1
Th-17- T helper 17
TLR- Receptores do Tipo Toll
TMA- trimetilamina
TMAO - N-oxido de trimetilamina
TNF-α-Fatores de Necrose Tumoral Alfa
TTOG- Teste de Tolerância Oral a Glicose
UCP- Proteínas Desacopladoras
UFOP- Universidade Federal de Ouro Preto
U/L- Unidades por Litro
UNESP- Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho"
V- Uma base que vem depois de uma Timina ou Uracila, pode ser lida como Guanina ou
Cistosina
VCM- Volume Corpuscular médio
VIP- Peptídeo Vaso intestinal
VLDL- Lipoproteina Colesterol de Muito Baixa Densidade
VPM - Volume Plaquetário Médio
W- Uma base pode ser lida como Adenina ou Timina
1
RESUMO
Os mamíferos são habitados por trilhões de micro-organismos e a maior diversidade de
micróbios, tais como: fungos, vírus, protozoários e bactérias, está localizada especificamente no
trato gastrointestinal. Dentre esses, as bactérias representam a maior proporção dos micro-
organismos que habitam a região do trato gastrointestinal e elas são responsáveis por muitos
benefícios para a saúde do seu hospedeiro como: produção de metabólitos, maturação do sistema
imunológico, balanço energético e entre outras funções. Contudo, diferentes variáveis como tipo
de alimentação e prática de exercício físico podem ser agentes moduladores do microbioma e
isso pode vir a contribuir para instalação de várias doenças metabólicas. Dados do nosso
laboratório mostraram que a dieta rica em carboidratos simples foi capaz de induzir aumento de
adiposidade em modelos de ratos Wistar e o treinamento de natação aeróbico sem carga
conseguiu reverter em parte os efeitos provocado pela dieta. Desse modo, este trabalho teve
como objetivo avaliar se o microbioma pode ser modulado pela dieta rica em carboidratos
simples e pelo treinamento de natação aeróbico com carga num período de 15 semanas
experimentais. Os resultados mostraram que a dieta rica em carboidratos simples induziu o
aumento nos níveis basais de triglicérides e armazenamento dos coxins adiposos. Em relação à
composição da microbiota intestinal a dieta foi capaz de aumentar a abundância de
Enterobacteriales (p<0,05), Enterobacteriaceae (p<0,05), Odoribacteraceae (p<0,05),
Helicobacteraceae (p<0,001), Escherichia (p<0,05) e Butyricimonas (p<0,05). Já o treinamento
de natação aeróbico com carga, favoreceu a diminuição nos níveis de triglicerides e
armazenamento dos coxins adiposos. Na modulação da microbiota, o treinamento aumentou
Bacteroidetes (p<0,05), Bacteroidaceae (p<0,05), Porphyromonadaceae (p<0,05),
Lactobacillaceae (p<0,05), Succivivibrionaceae (p<0,05), e Parabacteroides (p<0,01), e diminuiu
abundância de Enterobacteriales (p<0,05), Enterobacteriaceae (p<0,05), Helicobacteraceae
(p<0,01) e Escherichia (p<0,05), que de certo modo conteve os danos metabólicos induzidos pela
dieta. Em conjunto, os dados permitem concluir que a dieta rica em carboidratos simples induz
um enriquecimento de bactérias do filo Proteobacterias, que estão associadas ao
desenvolvimento de obesidade. A interação treinamento de natação aeróbico e dieta rica em
carboidratos simples mostraram que só treinamento não é totalmente eficiente para manter
abundância de táxons com efeitos probióticos e reduzir grupos de bactérias que apresentam
propriedades nas disfunções do metabolismo, por isso, para uma modulação mais benéfica a
saúde do hospedeiro é importante à prática de exercício físico associado com uma dieta
equilibrada.
Palavras chaves: microbiota, microbioma, 16S, treinamento aeróbico, adiposidade, carboidratos
2
ABSTRACT
Mammals are inhabited by trillions of microorganisms, and specifically in the gastrointestinal
tract is where the greatest diversity of microbes such as fungi, viruses, protozoa, and bacteria are
located. Bacteria represent the largest proportion of the microorganisms that inhabit the intestine
region and they are responsible for many health benefits of their host such as the production of
metabolites, maturation of the immune system, energy balance and among other functions.
However, different variables such as diet and physical exercise can be modulating agents of the
microbiome and this may contribute to the installation of several metabolic diseases. According
to data from our laboratory showed that the diet rich in simple carbohydrates was able to induce
increase of adiposity in Wistar rats models, and aerobic swimming training without load was
able to partially reverse the effects caused by diet. Therefore, this study aimed to evaluate if the
microbioma can be modulated by diet rich in simple carbohydrates and aerobic swimming
training with load in a period until 15 experimental weeks. The results showed that a high
carbohydrate diet-induced an increase in basal triglyceride levels and storage of adipose
cushions. In relation to the composition of the intestinal flora the diet was able to increase the
abundance of Enterobacteriales (P<0.05), Enterobacteriaceae (p<0.05), Odoribacteraceae
(p<0.05), Helicobacteraceae (p<0.001) Escherichia (p<0.05) and Butyricimonas (p<0.05). On the
other hand, the aerobic training of swimming with load favored the decrease in the levels of
triglycerides and storage of the adipose cushions. Bacteroidetes (P<0.05), Bacteroidaceae
(p<0.05), Porphyromonadaceae (p<0.05), Lactobacillaceae (p<0.05) and Succivivibrionaceae
(P<0.05), and Enterobacteriaceae (p<0.05), and Helicobacteraceae (p<0.01) and Escherichia
(p<0,05), which in a way contained the metabolic damages induced by diet. In conclusion, the
data allow concluding that the diet rich in simple carbohydrates induces an enrichment of
bacteria of the phylum Proteobacteria, which are associated with the development of obesity.
The interaction aerobic swimming training and diet rich in simple carbohydrates showed that
only training is not fully efficient to maintain abundance rate of probiotic bacteria, and to reduce
groups of bacteria that present properties in the metabolic dysfunctions, therefore, for a more
beneficial modulation to Host health is important to the practice of physical exercise associated
with a balanced diet.
Key words: microbiota, microbiome, 16S, aerobic training, adiposity
3
1. INTRODUÇÃO
O conjunto de micro-organismos que habitam os seres vivos é denominado microbiota e
em humanos é estimado um número 10 vezes maior de micro-organismo compondo a microbiota
do que todas as suas células somáticas e germinativas (TURNBAUGH et al., 2007).
Outro termo intercambiável que se refere aos micro-organismos simbiontes que habitam
os seres vivos é denominado microbioma e, neste contexto, leva-se em consideração o genoma
dos organismos que ali fazem parte (TURNBAUGH et al., 2007). O microbioma para alguns
especialistas no assunto é considerado um órgão porque seus produtos são responsíveis ao
ambiente e possui interação com outros sistemas (WEINSTOCK, 2012).
A interação homem e micróbios pode inferir que o homem não evoluiu sozinho, podendo
assim dizer que apresentamos uma característica "supra-humana" (TURNBAUGH et al., 2007).
Como resultado de uma evolução interdependente, o microbioma intestinal de mamíferos tem
um papel crítico na maturação do sistema imunológico, proteção contra patógenos, influência na
proliferação celular e vascularização, regula a função endócrina do intestino, gera 10% da
energia consumida pelo hospedeiro, atua na biossínteses de vitaminas e neurotransmissores, no
metabolismo de sais biliares, na metabolização de fármacos e eliminação de toxinas exógenas
(LYNCH; PEDERSEN, 2016).
Durante o desenvolvimento dos mamíferos, principalmente a espécie humana, fatores
ambientais, socioeconômico (HARRISON; TAREN, 2017), idade (KEMPPAINEN et al., 2015;
LIN et al., 2013; SARASWATI; SITARAMAN, 2015), sexo (MARKLE et al., 2013),
alimentação (DONG; GUPTA, 2018), práticas de atividades físicas (CAMPBELL;
WISNIEWSKI, 2017; DENOU et al., 2016a) e a genética do hospedeiro (WALTER; LEY, 2011)
são variantes que modulam o microbioma humano, podendo assim, favorecer determinado nicho
microbiológico que pode estar relacionado com o funcionalismo do metabolismo do hospedeiro.
A citação referida a Hipócrates (460 A.C-370 A.C): "Deixe o alimento ser seu remédio e
seu remédio será seu alimento"; é mais atual do que nunca uma vez que a ampliação do
4
conhecimento sobre a composição da microbiota intestinal mostra que esta pode ser modulada
principalmente pelo tipo de alimento consumido e conferir benefícios para a saúde e
desenvolvimento dos mamíferos ou favorecer a instalação de doenças (CANI et al., 2008;
DAVENPORT et al., 2014; PRESCOTT, 2017).
De fato, nos últimos 50 anos, a sociedade passou por uma série de mudanças como o
modo de exposição aos antibióticos, processamento e higienização dos alimentos os quais
geraram perturbação microbiológica e igualmente se infundiu como variável no desenvolvimento
de doenças tais como: obesidade, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), diabetes
tipo II, alergias, doenças cardiovasculares e inflamação intestinal (ARRIETA et al., 2014; CHO;
BLASER, 2012a; HALL; TOLONEN; XAVIER, 2017).
1.1. Microbiota de mamíferos
Em relação colonização do trato gastrointestinal, sempre existiu uma dúvida: "Quando
ocorre o primeiro contato dos micro-organismos colonizadores com a região do trato
gastrointestinal?", pois durante a gestação o útero é considerado um local estéril. Hoje é sabido
que as mães são as responsáveis por transferir os primeiros micróbios para as crianças durante o
seu nascimento. Em crianças que nascem de parto normal a primeira entrada de micro-
organismos se dá pelo contato do bebê com a vagina da mãe a qual contém uma microbiota. Nos
bebês que nascem por parto cesárea, estudos mostram que as primeiras bactérias a colonizarem a
região do trato intestinal são as mesmas bactérias que habitam a microbiota da pele
(DOMINGUEZ-BELLO et al., 2010, 2016). Estudos apontam que bebês que nascem de parto
cesárea tendem a desenvolver mais doenças como asma e obesidade, durante seu
desenvolvimento, e as primeiras bactérias que neles colonizam são evidências para tal efeito.
(GOEDERT et al., 2014).
Contudo, em janeiro de 2018, um editorial publicado por Willyard na revista Científica
Nature, debateu um achado científico o qual relata que o útero pode não ser um local estéril,
trazendo a tona uma discussão de que as bactérias poderiam colonizar os bebês durante a
5
gestação. No mesmo editorial foi descrito que o pesquisador Aagaard realizou uma biópsia no
líquido amniótico pós-parto e os resultados mostraram que o líquido amniótico contém DNA de
bactérias que habitam a microbiota da mãe (WILLYARD, 2018).
Apesar de ainda não ter chegado a uma conclusão de qual é o primeiro contato dos bebês
com os micro-organismos, é bem estabelecido que após o nascimento e até os primeiros meses
de vida dos bebês a modulação da microbiota se dá principalmente pelo leite materno. A
amamentação é importante, pois está relacionada à diversidade de micro-organismos que neles
habitam e assim podendo influenciar no seu ganho de peso (MUELLER; BLASER, 2018) e
maturação do sistema imune (PRAVEEN et al., 2015).
A maior parte da microbiota dos mamíferos está localizada na região do trato
gastrointestinal onde os números de células microbianas presente correspondem de 10 a 100
trilhões de micro-organismos. Outra estimativa é que o microbioma intestinal é constituído de
100 vezes mais genes do que o hospedeiro, podendo esse ser chamado de segundo genoma
humano (GILL et al., 2006; INSTITUTE OF MEDICINE (US) FOOD FORUM, 2013; QIN et
al., 2010).
A região do sistema gastrointestinal possibilita a habitação de um maior número de
micro-organismos, uma vez que existe condições físico-químicas, pH, potencial oxi-redução,
suplementos alimentares e secreções por parte do hospedeiro como: ácido clorídrico, enzimas
digestivas, bile e muco (GERRITSEN et al., 2011). Na Figura 1, pode-se observar que a
densidade de micro-organismos que compõem o sistema do trato gastrointestinal aumenta ao
percorrer o eixo longitudinal dos órgãos que compõem o sistema, e a região do cólon apresenta
maior densidade de micróbios, sendo estimadas 109-12 células microbianas. (GERRITSEN et al.,
2011).
6
Figura 1- Densidade de micro-organismos que colonizam o sistema gastrointestinal
Ao longo do eixo longitudinal do sistema gastro intestinal ocorre o aumento da densidade de micro-organismos,
sendo que a região do cólon com apêndice apresenta maior densidade. Adaptado: (GERRITSEN et al., 2011).
Os micro-organismos que habitam a microbiota intestinal compreendem os reinos
Bactéria, Archea, Fungi e Viruses. Todavia, as bactérias são as que estão em maior proporção,
correspondendo em torno de 99% e sendo a maioria delas anaeróbicas (BULL; PLUMMER,
2014). Em humanos e camundongos os filos Bacteroidetes e Firmicutes são os mais abundantes,
seguido dos demais filos como Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia e Fusobacteria.
(GOODRICH et al., 2016; HALL; TOLONEN; XAVIER, 2017; NGUYEN et al., 2015).
Contudo, trabalhos mostram que em níveis taxonômicos mais aprofundados como gênero foi
observado que a composição microbiana de camundongos difere em 85% dos achados em
humanos. Em humanos encontra-se maior abundância dos gêneros Prevotella, Faecalibacterium
e Ruminococcus, já em camundongos encontram-se os gêneros Lactobacillus, Alistipes e
Turibacter (NGUYEN et al., 2015).
Estudos metagenômicos usando ratos da linhagem Sprague-Dawley mostraram que a
diversidade da comunidade bacteriana aumenta ao longo do percurso longitudinal do trato
gastrointestinal, entretanto na região gástrica e duodenal há o mesmo nível de diversidade
microbiana (LI et al., 2017). Flemer et al, usando o mesmo modelo de rato mostrou que há uma
maior taxa de abundância de bactérias presente nas fezes dos animais pertencentes aos filos
Firmicutes e Bacteroidetes. Todavia essa taxa de abundância decresceu com tempo de vida dos
7
animais. Flemer também observou que a microbiota da linhagem Sprague-Dawley era mais
próxima a dos humanos quando comparado com camundongos (FLEMER et al., 2017).
1.2. Benefícios da microbiota em mamíferos
São inúmeros os benefícios produzidos pela microbiota intestinal como: produção de
vitaminas, folato, ácidos biliares, ácidos graxos de cadeias curtas e maturação do sistema
imunológico. As vitaminas correspondem um grupo heterogêneo de micronutrientes que são
essenciais para o desenvolvimento humano devido elas serem precursoras de coenzimas
intracelulares que são necessárias para a regulação de reações bioquímicas dentro das células
(BURKHOLDER; MCVEIGH, 1942; HILL, 1997). As vitaminas não são sintetizadas
endogenamente, assim, elas devem ser obtidas de fontes externas. A microbiota intestinal é uma
fonte de produção de vitaminas, tais como: Vitamina K e muitas das vitaminas do complexo B
incluindo a biotina, ácido nicotínico, folato, riboflavina, tiamina, piroxidina, ácido pantoténico e
cobalamina (LEBLANC et al., 2011, 2013; ROSSI; AMARETTI; RAIMONDI, 2011). Na
produção de vitaminas B são descritas muitas bactérias fermentadoras ácido-láticas. Já a
produção de vitamina K são descritas as espécies Bacilli subtillis e Escherichia coli.
(BURKHOLDER; MCVEIGH, 1942; LEBLANC et al., 2011; O’KEEFE et al., 2009).
Os organismos procariotos e eucariotos requerem o folato para biossínteses de purina,
timina e metionina. Estudos epidemiológicos tem associado à deficiência de folato com risco de
desenvolvimento de câncer de mama, hipometilação do DNA e doenças intestinais. Como
prevenção, a União Europeia recomenda o consumo 400 mg/dia de folato para contribuição na
regulação das células retal contra o desenvolvimento de câncer (CAMILO et al., 1996; ROSSI;
AMARETTI; RAIMONDI, 2011). O folato é uma molécula hidrofílica aniônica que não
atravessa a membrana biológica por difusão, e sua produção se dá pelos gêneros dos
Lactobacillus e Bifidobacteria. Estudos mostram que as espécies Bifidobacterium bifidium,
Bifidobacterium longum subespécie infantes são os maiores produtores de folato, enquanto as
espécies Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum subespécie longum e Bifidobacterium
adolescentis produzem folato em menores quantidades. A administração das cepas das bactérias
8
produtoras de grandes níveis de folato, tanto em humanos quanto em ratos promoveram um
aumento expressivo de folato nas fezes (LEBLANC et al., 2011; O’KEEFE et al., 2009).
A secreção dos sais biliares tem um importante papel na emulsificação da dieta lipídica e
também podem atuar como um sinalizador induzindo resposta mediada pelo receptor Farnesoid
X (FRX) acoplado ao receptor da proteína G (DEKANEY et al., 2008). Os sais biliares são
sintetizados por um processo que requer mais de 14 enzimas no fígado tendo o colesterol como
principal percussor. A partir do colesterol, são sintetizados o ácido cólico (CA) e
quenodesoxicólico (CDCA) em humanos, já em camundongos o colesterol é precursor de CA e
ácido b-murinoquólico (β-MCA). Os ácidos biliares são conjugados com glicina ou taurina
formando T(G)- CA, T(G)-CDCA e T(G)- β-(MA) (Figura 2). Logo após a conjugação, os sais
biliares são estocados na vesícula biliar antes da secreção no duodeno pela via ducto biliar.
Quando a bile se torna desconjugada, ela é eficientemente reabsorvida (> 95%) no intestino por
transporte ativo no íleo e também por transfusão passiva no intestino delgado e cólon (RIDLON
et al., 2014; SAYIN et al., 2013).
9
Figura 2- Esquematização da produção de sais biliares primários e secundários via bactéria
O colesterol é precursor na produção de ácidos biliares primários e posteriormente são conjugados com glicina ou
taurina formando os sais biliares. Os sais biliares liberados pela glândula biliar são desconjugados pela microbiota e
podem produzir ácidos biliares secundários a qual regulam a sínteses dos ácidos biliares primários. Adaptado:
(SCHNEIDER; ALBERS; TRAUTWEIN, 2018).
A enzima CYP7A1 inicia a via clássica da síntese de sais biliares, sendo que essa enzima
é regulada pelo FGF 15 produzida pelos enterócitos do íleo. A liberação de sais biliares como o
TCA ativa FRX que induz a transcrição do fator de crescimento FGF 15 sinalizando para o
fígado parar a produção dos sais biliares (Figura 3). Estudos apontam que as bactérias do
intestino podem regular a expressão dos genes FGF15 e CYP7A1 pois elas codificam enzimas
que levam a desconjugação dos sais biliares, em seguida produzem ácido biliares secundários
cujos produtos podem ser agonista ou antagonista para ativação de FG15. Os sais biliares
secundários também podem ajudar a regular ou controlar o crescimento de determinados micro-
organismos presente no intestino, pois os mesmos são nocivos para algumas bactérias (RIDLON
et al., 2014; SAYIN et al., 2013).
10
Figura 3- Controle da produção de ácido biliar pelo fator de crescimento FGF15 ativado pelo FXR
A microbiota é capaz de produzir ácidos biliares secundários através dos sais biliares primário provenientes do hospedeiro, os
ácidos biliares secundários podem regular a sínteses de sais biliares primários ativando o fator de crescimento FGF15 nas células
enterócitos. Fonte: (SAYIN et al., 2013).
A produção de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) correspondente ao produto final da
fermentação anaeróbica de carboidratos, proteínas e carboidratos não digeríveis como as fibras,
as que são fermentadas principalmente na região do cólon. A fermentação pode produzir outros
metabólitos, todavia, AGCC são produzidos em maior número (DEN BESTEN et al., 2013).
AGCC são compostos orgânicos alifáticos, sendo o acetato, o propionato e o butirato os mais
abundantes, tendo suas obtenções nas seguintes proporções 60:20:20 no cólon e fezes de
indivíduos humanos normais. (DEN BESTEN et al., 2013).
Na alimentação humana se consome de 20 a 25 g de fibras por dia correspondendo à
produção de 400- 600 mmol AGCC pelas bactérias do trato gastrointestinal (DEN BESTEN et
al., 2013). Os AGCC são utilizados pelo hospedeiro e sua metabolização equivale a 10% do
11
requerimento energético humano. O tipo de fibra consumida tem um efeito direto na composição
da microbiota e consequentemente na quantidade AGCC produzidos (DEN BESTEN et al.,
2013). Os carboidratos não digestíveis são degradados por bactérias sacarolística como os
Bacteroidetes produzindo AGCC, dióxido de carbono, gás hidrogênio e metano. A fonte de ureia
que é proveniente da primeira fermentação das bactérias proteolíticas resulta na produção de
ácidos graxos de cadeia ramificada, metabólitos tóxicos, compostos fenólicos e sulfúricos
voláteis. A via da cetogenese pode depletar o hidrogênio como fonte de energia e contribuir para
a produção do composto acetato (DEN BESTEN et al., 2013; SUN; O’RIORDAN, 2013).
Os AGCC também desempenham um papel sinalizador, pois eles se ligam aos receptores
FFAR2 e FFAR3 que estão envolvidos na produção des hormônios como PYY e glucagon, os
quais exercem um papel importante no controle do apetite (Figura 4) (FLINT et al., 2012). Além
disso, o AGCC butirato é usado como principal fonte de energia pelos colinócitos, também
desempenha funções na regulação do sistema imunológico e pode influenciar na reprogramação
epigenética do indivíduo uma vez que este pode inibir as enzimas deacetilases (SUN;
O’RIORDAN, 2013).
O trato gastrointestinal é o local mais importante onde se inicia a interação entre o
sistema imune e micro-organismos. Uma hipótese prevalente do início do comensalismo entre
humano e micróbios foi postulado por Metchnikoff na qual ele propôs que a microbiota pode
influenciar no balanço pró-inflamatório e o sistema imunológico na composição da microbiota
(CERF-BENSUSSAN; GABORIAU-ROUTHIAU, 2010; KAU et al., 2011). O sistema imune
intestinal muda incessantemente de acordo com a carga microbiana. Uma função importante do
sistema imune intestinal é controlar a exposição das bactérias aos tecidos dos hospedeiros a qual
é feita em dois níveis distintos: região da superfície da célula epitelial e na região de
confinamento. Alguns efetores imunes funcionam em conjunto para estratificar os micróbios
luminais e reduzir o contato bacteriano-epitelial, como a glicoproteína da mucina, e o Reg IIIγ.
(CERF-BENSUSSAN; GABORIAU-ROUTHIAU, 2010; HOOPER; LITTMAN;
MACPHERSON, 2012).
12
O desenvolvimento do status gnotobiótica foi fundamental para entender a interação entre
o microbioma e o sistema imune do hospedeiro. O princípio da técnica consiste na criação de
animais (camundongos) sob condições livres de germes (germ-free), podendo ou não ter sucesso
na exposição em vários estágios da vida pós-natal ou na velhice para um consórcio microbiano.
As primeiras comparações de camundongos germ- free e camundongos colonizados revelaram
um efeito ponderado da colonização microbiana na formação de tecidos linfóides e subsequente
no desenvolvimento do sistema imunológico. Os germ- free apresentaram expressão reduzida do
receptor TLR, principal molécula de histocompatibilidade II (MHCII), células T CD4 +, células
dendríticas (DC) e agregados de células B, podendo assim ter uma resposta imune menos
eficiente. (HOOPER; LITTMAN; MACPHERSON, 2012; KAU et al., 2011; STATOVCI et al.,
2017). A análise sistemática de camundongos gnotobióticos indicou que a colonização intestinal
por microbiota ajudou na produção de respostas pró-inflamatórias T helper 1 (Th1), Th17 e
células T reguladoras. A amostra de uma bactéria filamentosa segmentada, uma espécie não
cultivável relacionada ao gênero Clostridia, mostrou-se importante para a maturação das
respostas de células T induzidas (FENG et al., 2010; GABORIAU-ROUTHIAU et al., 2009;
WEAVER; HATTON, 2009).
1.3. Microbiota intestinal versus doença metabólica
A composição da microbiota e sua relação com o desenvolvimento de doenças
metabólicas vêm sendo muito estudado nas últimas décadas principalmente doenças como
obesidade, diabetes, doenças do fígado gorduroso não alcoólico e doenças cardiovasculares. A
obesidade e o sobrepeso são caracterizados por acumulação excessiva de gordura proveniente de
uma ingestão energética maior do que o gasto gerado. A Organização Mundial da Saúde (OMS)
tem definido como indivíduo com sobrepeso aquele que apresenta o índice de massa corporal
entre 25,0 e 29,9 kg/m2 e obeso maior ou igual a 30,0 kg/m2 (DURANTI et al., 2017).
A prevalência da obesidade tem aumentado exponencialmente, levando ao aparecimento
precoce de diversas doenças associadas. Mediante a esse cenário, muito tem sido feito para
entender a instalação da obesidade e os seus efeitos deletérios. Vários estudos tem demonstrado
13
que um fator importante na obesidade é a microbiota intestinal, uma vez que sua composição
varia entre indivíduos magros e obesos, tanto em estudos animais como em humanos (KHAN et
al., 2016).
A dieta se apresenta como principal modulador do microbioma intestinal. Estudos
utilizando o consumo de dieta rica em lipídeos que induziu obesidade em camundongos mostrou
uma diminuição na taxa de Bacteroidetes e aumento de Firmicutes e Protobacteria. Uma pesquisa
clássica no qual se transferiu a microbiota fecal de adultos humanos com fenótipo magros em
camundongos germ-free C57BL/6J mostrou que os camundongos apresentaram a mesma
composição bacteriana do doador. Porém, após mudar a dieta do animal para uma dieta ocidental
rica em carboidratos e lipídeos em um único dia já foi possível alterar a composição da
microbiota dos camundongos. (TILG; KASER, 2011).
O microbioma é um importante regulador da proteína semelhante a angiopoietina 4
(Angptl4), um derivado intestinal no metabolismo de lipídios também chamado de fasting-
induced adipose factor (fiaf). O Angptl4 regula a oxidação de ácidos graxos no músculo e tecido
adiposo por inibir a lipase lipoprotéica (LPL) e, dessa forma, previne o acúmulo de gordura.
Estudos realizados com camundongos germ-free na qual foram transferidas a microbiota de
camundongos com fenótipo normal, mostrou que a produção Angptl4 foi suprimida e uma
grande quantidade de triglicérides começou a ser depositado no tecido adiposo. Todavia, os
animais germ-free ao longo do tempo apresentaram certa proteção contra o ganho de
adiposidade. Assim, a supressão de Angptl4 aumenta atividade da LPL gerando uma maior
adiposidade (Figura 4) (LEY, 2010).
14
Figura 4- Metabólitos produzidos pela microbiota e suas interferências no hospedeiro
Os Ácidos Graxos de Cadeias Curtas podem ativar a produção de hormônios peptídeos PYY e GLP-1 mesmos quais
diminuem a motilidade do trato gastrointestinal e induzem à saciedade e maior absorção de alimentos. Na via da
AMP-Q, essa enzima é inibida pela microbiota e ocorre uma diminuição da oxidação dos ácidos graxos que são
estocados nos tecidos adiposos e contribui para resistência à insulina. Os Lipopolissacarídeos produzidos pela
microbiota estimulam a produção de receptores TLR que aumentam a produção de citosinas inflamatórias que induz
resistência à insulina. O FIAF é inibido pela microbiota o que aumenta a atividade da lipase e, dessa forma, induz o
armazenamento de triglicérides no tecido adiposo que podem contribuir para a resistência à insulina. Fonte:
(MORAES et al., 2014).
A via que envolve a AMPK (monofosfato-adenosina proteína quinase), uma enzima
altamente conservada desde leveduras até em humanos, possui um papel importante no controle
energético celular. Camundongos com o fenótipo magros germ-free sob uma ingestão de dieta
calórica ocidental aumentou os níveis de AMPK fosforilado no músculo esquelético e no fígado
o que levou a um aumento de marcadores envolvidos na oxidação de ácidos graxos, como acetil-
CoA carboxilase, um aumento na reserva de glicogênio e na sensibilidade à insulina. A
microbiota pode inibir AMPK e, assim, induzir uma diminuição na oxidação de ácidos graxos e
aumentar a adiposidade (Figura 4) (TILG; KASER, 2011).
15
Outro mecanismo indireto proporcionado pela microbiota intestinal é a influencia na
produção de hormônios envolvidos com a saciedade e motilidade do trato gastrointestinal. Os
AGCC, que são produzidos pela microbiota, podem se ligar aos receptores acoplados a proteína
G, como FFAR2 e FFAR3, sendo esses receptores localizados em células enteroendócrinas L e
epitélio do intestino que produzem PYY e GLP-1. O hormônio PYY age inibindo a secreção
gástrica e favorecendo a diminuição da motilidade do intestino, o que proporciona maior
absorção de nutrientes como AGCC que podem induzir a lipogênese no fígado. Outra função do
PYY é na atuação no sistema nervoso central a qual inibe neurônios orexígenos do núcleo
arqueado do hipocampo, proporcionado, assim, um estado de saciedade (Figura 4), (EVERARD;
CANI, 2014; MORAES et al., 2014).
Peptídeo similar ao glucagon (GLP-1 e GLP-2), em conjunto com PYY, melhora nas
respostas glicêmicas e insulinêmicas, e reduz a grelina que é o hormônio associado a fome. Um
novo estudo apontou que sulfito de hidrogênio (H2S), um gás produzido por micro-organismo
redutor de sulfeto, pode diretamente estimular GLP-1. Esta descoberta mostra uma maior relação
do comprometimento do microbioma na regulação do metabolismo (MORAES et al., 2014;
NICHOLSON et al., 2012).
Em relação as diabetes do tipo II, bactérias gram-negativas apresentam endotoxinas
denominadas lipolissacarídeos (LPS) na superfície das suas células que podem atuar como
antígenos, os quais estimulam uma resposta inflamatória no hospedeiro. Um alto consumo de
lipídeos está relacionado com uma maior permeabilidade intestinal, a qual permite uma maior
concentração de LPS na corrente sanguínea que são reconhecidos pelos receptores Toll-like
(TLR) das células imune inata. Uma vez ativado, o TLR pode ativar produção de citocinas pró-
inflamatória tais como: IL-1β, IL-4, IL-13 e PAR-2 e TNF-α. (MORAES et al., 2014;
PFLUGHOEFT; VERSALOVIC, 2012), tanto pelas células do sistema imune quanto pelas
células do tecido adiposo. A inflamação induz uma maior resistência à insulina contribuindo para
o desenvolvimento diabetes tipo II (Figura 4) (DEVARAJ; HEMARAJATA; VERSALOVIC,
2013; MORAES et al., 2014).
16
Doença do fígado gorduroso não alcoólico, NAFLD, é conhecida por acumular lipídeos
no fígado, sendo essa causa associada à lipogênese de novo e excesso de consumo de lipídeos
proveniente da dieta. A dieta ocidental rica em caloria contribui com NAFLD e a microbiota
pode agravar para um estado de esteatose não alcoólica no fígado (NASH) (HOUGHTON et al.,
2016). A alteração da microbiota pode influenciar na produção de sais biliares que podem
aumentar absorção intestinal de lipídios e contribuir para desenvolvimento de NAFLD. Também,
o aumento da resposta inflamatória provocado pela microbiota pode favorecer a instalação de
NASH (CHO; BLASER, 2012b; MACHADO; CORTEZ-PINTO, 2014; SANDEVA et al.,
2018).
Em relação as doenças cardiovasculares, os metabólitos produzidos pela microbiota como
trimetilamina (TMA), podem contribuir para o desenvolvimento de aterosclerose. As TMAs são
derivadas de fontes de nutrientes como l-carnitina, colina e fosfatidilcolina e é oxidado por
enzimas no fígado produzindo N-óxido de trimetilamina (TMAO), sendo que esse interfere no
transporte de colesterol contribuindo assim para o desenvolvimento de aterosclerose (TANG;
KITAI; HAZEN, 2017; THOMAS et al., 2017).
O risco de hipertensão e doenças coronárias vem sendo associado com aumento do
gênero Prevotella e Klebsiella. Embora ainda sejam desconhecidos os mecanismos pelos quais
as bactérias podem influenciar na hipertensão, a microbiota de humanos hipertensos transferida
para animais germ-free demonstraram uma influência direta da microbiota no desenvolvimento
da hipertensão (THOMAS et al., 2017).
1.4. Dieta rica em carboidratos simples
Os alimentos ricos em açúcares como glicose, lactato, sacarose e frutose vem tendo um
acréscimo muito grande do seu consumo ao longo dos últimos anos, este fato se deu
principalmente devido à adição de tais açúcares nos alimentos industrializados, os quais
passaram a ser altamente consumido pela população mundial (RIPPE; ANGELOPOULOS,
2016).
17
Alimentos enriquecidos em carboidratos se tornaram pauta na ciência da nutrição, pois o
seu consumo está associado com desenvolvimento de muitas doenças como: obesidade, diabetes,
dislipidemia, doenças cardiovasculares, NAFLD, câncer e déficit no desenvolvimento cognitivo.
Esta comprovação se deu basicamente por evidências de estudos epidemiológicos populacionais,
meta-análises e experimentações usando animais e grupos de voluntários humanos (RIPPE et al.,
2016).
A população mundial apresentou um aumento no número de pessoas obesas ao longo dos
últimos anos e, segundo a OMS, existem aproximadamente 600 milhões de pessoas obesas e esse
número pode dobrar segundo estimativas em 30 anos (DAVIS, 2017). Alimentos ricos em
carboidratos podem induzir saciedade em curto prazo, isso pode estar relacionado pelo "vício" de
muitas pessoas quererem comer alimentos açucarados. Outra forte evidência é que o excesso de
energia proveniente dos carboidratos pode levar ao aumento dos estoques de lipídios nos tecidos
adiposos ao longo prazo proporcionado o desenvolvimento da obesidade (MORRIS et al., 2015;
RIPPE; ANGELOPOULOS, 2016).
O consumo aumentado de carboidrato leva ao aumento da produção de insulina que leva
a captação de glicose para dentro das células principalmente do fígado e músculo a qual leva a
produção de acetil-CoA que é precursor da produção de ácido graxo que será estocado no tecido
adiposo na forma esterificada. A elevação de triglicérides pelo consumo de carboidratos pode
agravar para os quadros de dislipidemia e aterosclerose. Estudos apontam que o carboidrato
diminui os níveis de HDL colesterol e alguns outros trabalhos científicos mostrou que pode
aumentar os níveis LDL colesterol que contribui no desenvolvimento da aterosclerose
(ACHESON et al., 1988; ZU et al., 2012).
Trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa demonstraram que ratos Wistar
alimentados por 12 semanas com uma dieta rica em carboidratos simples apresentaram
hipertrofia no tecido adiposo retroperitoneal. Essa hipertrofia está relacionada à upregulation de
genes pró-adipogênico relacionados à via PPARγ, e a uma downregulation de genes anti-
adipogênico relacionado com a via Wnt (DE QUEIROZ et al., 2014).
18
O aumento da pressão arterial tem uma relação direta devida uma maior depleção de
trifosfato de adenosina (ATP) que ocorre no processo de conversão do lactato em glicose e isso
faz com que aumente a produção de monofosfato de adenosina (AMP) que é convertido em
ácido úrico. eEste pode induzir aumento da pressão sanguínea, pois o ácido úrico pode inibir a
produção de óxido nítrico, aumentar a produção de espécies reativas de oxigênio e induzir
disfunção do endotélio renal (BUYKEN et al., 2014; DINICOLANTONIO; BERGER, 2016;
EVANS et al., 2017; KANBAY et al., 2010).
Diabetes do tipo II também podem estar relacionados com o consumo de carboidratos
simples, embora fatores como predisposição genética e obesidade sejam variáveis que podem
somar para instalação da doença (BUYKEN et al., 2014).
A perda cognitiva relacionada ao consumo de carboidrato está envolvida com aumento
das espécies reativas de oxigênio no processo da quebra da glicose, e isso pode levar a inativação
da produção do hormônio do fator neuronal derivado do cérebro (BDNF), resultando numa perda
do aprendizado cognitivo (MORRIS et al., 2015).
1.5. Treinamento aeróbico
Desde a década de 1950 muitos trabalhos sobre os benefícios da atividade física vêm
sendo relatada principalmente nas condições de diminuir a taxa de mortalidade causada por
doenças crônicas e intervir diretamente no ciclo fisiometabólico, como a diminuição de
marcadores de risco associado as doenças causadas pelo sedentarismo. (ESPELAND et al., 2016;
JAKICIC et al., 2018; SHUVAL et al., 2017).
O treinamento físico aeróbico tem enormes benefícios para a saúde humana e estudos
mostram que o exercício físico combinado com um consumo de dieta restrita a baixa caloria
pode ser efetivo na perda de peso corporal. Isso se explica principalmente, pois ocorre uma
19
demanda energética que induz uma maior oxidação dos ácidos graxos, e também como uma
maior produção de hormônios relacionados ao controle metabólico (WASHBURN et al., 2014).
As proteínas desacopladoras (UCP) localizadas na membrana interna das mitocôndrias
têm a função de translocação dos prótons e elétrons do espaço intermembranas para a matriz
mitocondrial, dissipando o gradiente de prótons através da membrana interna da mitocôndrias
desempenhando um importante papel na regulação do balanço energético, (BOSCHINI;
GARCIA JÚNIOR, 2005) dados publicado pelo nosso grupo mostrou que o treinamento
aeróbico diminuiu a relação do RNAm Ucp1/Ucp3 em músculos de ratos que fizeram o consumo
de carboidratos simples por 8 semana, mostrando que o treino pode induzir uma grande
eficiência no gasto energético (QUEIROZ et al., 2012). Outro estudo também realizado pelo
nosso grupo mostrou que o treinamento pode reverter os efeitos do ganho de massa corpórea e
aumento dos índices de adiposidade provocado pela dieta rica em carboidratos simples em ratos
Wistar alimentados no período de 4 e 8 semanas, sendo que o treino pode apresentar uma relação
direta no controle epigenético no tecido adiposo do animal como a downregulation dos RNAm
das sirtruínas 3 e 5 (SILVA; 2018).
Em relação às doenças cardiovasculares, o exercício aeróbico melhora o prognostico da
doença aumentando o volume respiratório e melhorando a frequência cardíaca. Outros benefícios
ocorrem pelo aumento de HDL-C a qual se apresenta como protetor contra doença coronária. O
exercício aeróbico pode apresentar diminuição do LDL-c embora isso possa ser controverso em
algumas pessoas devido a sua genética. Também, o exercício aeróbio tem relação no aumento da
proteína convertase subtilisina Kexina 9 (PCSK9) a qual desempenha um papel importante na
regulação do receptor de LDL-c cujos mecanismos não estão elucidados. Quanto menor a
produção de PCSK-9 maior será a absorção e excreção do LDL-c pelo fígado (WANG; XU,
2017).
Outros benefícios em relação ao treinamento aeróbico são ativação de lipases
responsáveis pela hidrolise de quilomícrons, VLDL e triacilglicerol, e também no aumento da
produção de transportador ABCA1 de HDL, e do receptor X localizado no fígado (FRX) a qual
tem papel importante no metabolismo do colesterol (WANG; XU, 2017).
20
Em relação ao sistema nervoso, o treinamento é capaz de aumentar o fluxo sanguíneo no
cérebro e eleva a produção de BDNF e NT-3, bem como a produção de neurotransmissores como
a dopamina e serotonina. Ambos, BDNF e neurotransmissores aumentam a função cognitiva do
cérebro, a melhoram o humor, a excitação e protege contra a neurodegeneração (MANG et al.,
2013).
O exercício aeróbico aumenta a biogênese mitocondrial nos tecidos muscular esquelético,
esse mecanismo se dá pela ativação MAPK que leva ativação de PGC1α que induz a produção
de fatores de transcrição como TFam. (JOSEPH; ADHIHETTY; LEEUWENBURGH, 2016;
KIM; TRIOLO; HOOD, 2017). O TFam é direcionado para DNA mitocondrial e ativa
transcrição de genes responsáveis por codificar subunidade de cadeia transportadoras de elétrons
na qual proporciona maior captação de oxigênio e produção de ATP (JOSEPH; ADHIHETTY;
LEEUWENBURGH, 2016; KIM; TRIOLO; HOOD, 2017).
O exercício também pode influenciar na morfologia mitocondrial, pois aumenta a
produção de proteínas de fusão das mitocôndrias como a Mfns e Opal, e também proteínas como
Drp1 e Fis1 que levam a fissão das mitocôndrias. A modulação morfológica permite uma
limpeza das mitocôndrias danificadas e facilita a dissipação de energia para células musculares
(JOSEPH; ADHIHETTY; LEEUWENBURGH, 2016; KIM; TRIOLO; HOOD, 2017).
Também em nível mitocondrial o exercício eleva a produção de marcadores de autofagia
o que permite a degradação das mitocôndrias danificadas, e diminuiu a produção de fatores
apoptóticos permitindo assim que as células musculares esqueléticas possam manter a produção
de miofibrinas (JOSEPH; ADHIHETTY; LEEUWENBURGH, 2016).
Segundo trabalho publicado pelo nosso grupo de pesquisa, LBBM, foi demonstrado que a
dieta rica em carboidratos simples levou a alterações morfológicas nas mitocôndrias no músculo
gastrocnêmico de ratos Wistar e a atividade física foi capaz de manter os padrões morfológicos
da mitocôndria devido a diminuição ao estresse oxidativo promovido pelo exercício (BARBOSA
DE QUEIROZ et al., 2017).
21
1.6. Metagenoma e microbioma intestinal
Sucintamente, a realização dos primeiros estudos avaliando a composição da microbiota
se fazia com um trabalho muito árduo, pois muitos dos micro-organismos foram isolados,
identificados e quantificados usando técnicas de crescimento por meio de cultura. Todavia, a
técnica por meio de cultura apenas tinha acurácia de identificar 10 % a 25 % dos isolados
presente na microbiota, isto se deu principalmente pelo fato da maior parte dos micro-
organismos serem anaeróbicos, assim sendo incultiváveis (JANDHYALA et al., 2015).
Nas últimas décadas, modernas técnicas de metagenoma foram capazes de avaliar
amostras complexas de diferentes localizações ambientais que contém mais de um micro-
organismo. O emprego da metagenoma começou a ser realizado com avanço das técnicas de
Sequenciamento de Nova Geração (NGS). A técnica de metagenoma pode ser usada basicamente
de duas formas: utilizando marcador metagenômico como 16S universal para identificação de
bactérias e o Shotgun a qual amplifica as sequências do genoma inteiro de todos os micro-
organismos presente numa amostra (AMRANE; LAGIER, 2018). Como grande vantagem, o uso
da técnica de metagenoma permite identificar micro-organismo não cultiváveis e quantificá-los.
(JANDHYALA et al., 2015).
Após o sequenciamento é implementado o uso de ferramentas de bioinformática para avaliar
os dados gerados. Basicamente o metagenoma parcial gera as anotações de Unidades
Taxonômicas Operacionais (OTUs) e avalia os dados estatísticos. Para o metagenoma Shotgun é
feita a sobreposição dos fragmentos para montagem do genoma, realizando assim as anotações
funcionais gênicas (OULAS et al., 2015).
22
2. Justificativa
Ao longo das últimas décadas ocorreu um aumento expressivo no consumo per capita de
alimentos industrializados ricos em carboidratos simples, (RIPPE; ANGELOPOULOS, 2016).
No entanto, o seu consumo vêm sendo uma das principais causas inferida no crescente número
populacional de pessoas obesas e com sobrepeso em diversos estudos transversais prospectivos e
experimentais em grupos de crianças e adultos ao longo dos últimos anos (CRINO et al., 2015;
DONG et al., 2015; MALIK; SCHULZE; HU, 2006; ROGERS et al., 2016; SCHULZE et al.,
2004; SMITH et al., 2015). De acordo com os dados divulgados pela OMS, no mundo existem
600 milhões de obesos sendo que as crianças correspondem 41 milhões (LEONG et al., 2017).
Segundo estimativas da OMS, o número de pessoas obesas irá dobrar nos próximos 30 anos
(DAVIS, 2017).
Para entender melhor os mecanismos dos efeitos da dieta rica em carboidratos simples,
nosso laboratório, ao longo dos últimos anos, mostrou que modelo experimental de ratos Wistar
alimentados com uma dieta rica em carboidratos simples em 4, 8 e 12 semanas obtiveram um
aumento de adiposidade e o treinamento de natação sem carga conseguiu reduzir em partes o
efeito da dieta (BARBOSA DE QUEIROZ et al., 2017; SANTOS, 2018).
Nas últimas décadas, com os avanços das técnicas de metagenoma, inúmeros estudos
vêm mostrando que existe um efeito direto no tipo de dieta consumida pelo hospedeiro na
modulação no microbioma do trato gastrointestinal, sendo que o produto dessa modulação pode
estar relacionado com o aumento da abundância de táxons de micro-organismos como o filo de
Firmicutes e Proteobacteria que podem favorecer o desenvolvimento da obesidade.
(DUBROVSKY; KITTS, 2018; MORAES et al., 2014).
Diante dos dados anteriores divulgados pelo nosso Laboratório e das novas descobertas
da influência do microbioma na saúde do hospedeiro, nossa hipótese é que a interação do uso
crônico da dieta rica em carboidrato simples e do treinamento aeróbico de natação modulam o
microbioma favorecendo uma melhora no metabolismo celular.
23
3. OBJETIVO
Analisar os efeitos da dieta rica em carboidratos simples e do treinamento de natação
aeróbico sobre o microbioma fecal de ratos Wistar no período de 15 semanas.
3.1. Objetivos específicos
➢ Avaliar se os efeitos do consumo da dieta rica em carboidratos simples e o
treinamento de natação aeróbico afetam nos parâmetros bioquímicos, biométricos, fisiológicos e
hematológicos;
➢ Identificar os constituintes mais abundantes da microbiota intestinal;
➢ Correlacionar os constituintes da microbiota com os dados bioquímicos e
biométricos e fisiológicos dos ratos Wistar.
24
4. METODOLOGIA
4.1. Desenho experimental
O experimento foi realizado utilizando ratos Wistar macho com 21 dias de vida com a
média de pesagem 56,93 ± 5,2 g recém desmamados. Os animais foram disponibilizados pelo
Centro de Ciência de Animais (CCA), biotério da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).
O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA), sob o protocolo nº
26/2016. Os animais foram mantidos em caixas sob condição de luz controlada ciclo claro e
escuro (12:12 horas) (CHÍRICO et al., 2018), temperatura ambiente de 24 ± 2 °C, e alimentados
com ração da marca Nuvilab CR1, Colombo, Brasil. Todos os cuidados com os animais foram de
acordo com as normas do guia "National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use
of Laboratory Animals, 8th edition, 2011" (NIH et al., 2011).
Utilizou-se 32 animais que foram previamente marcados com um número para facilitar na
sua identificação (Suplementar 1) e subdivididos em 4 grupos após completarem 28 dias (Figura
5), a subdivisão ocorreu de acordo com seu consumo alimentar e prática de treinamento de
natação aeróbico, sendo os 4 grupos: Sedentário Dieta Padrão (SDP) com n=8 animais, pesagem
inicial 90,5 ± 15,0 g; Treinado Dieta Padrão (TDP) com n=8 animais, pesagem inicial 91,6 ±
14,15 g; Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples (SDRC) com n= 8 animais, pesagem
inicial 91,10 ± 8,87 g; Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRCS) com n= 8
animais e pesagem inicial 85,62 ± 6,39 g .
O experimento foi realizado durante um período de 15 semanas e os ratos permaneceram
durante este período em caixas com seu respectivo grupo. Não foi extrapolado mais do que
quatro animais por caixa, e duas vezes por semana as caixas eram trocadas e ocorria reposição da
dieta e água.
25
.
Figura 5- Modelo esquemático da distribuição dos ratos Wistar machos com 28 dias de vida em 4 diferentes grupos
Sedentário Dieta Padrão (SDP), Treinado dieta Padrão (TDP), Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples
(SDRC) e Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRC). * O grupo TDP apresentou perda de 3 animais
durante o experimento restando n=5 animais.
4.2. Composição da dieta
A dieta padrão utilizada é da marca Nuvilab, Colombo, Brasil. De acordo com o
resultado bromatológico realizado pela empresa Hidrocepe - Serviços de Qualidade Ltda,
determinou-se que a dieta padrão possui 308,52 Kcal/100g e sua composição é descrita na
Tabela 3.
A dieta rica em carboidratos simples foi preparada através da mistura da ração marca
Nuvilab, Colombo, Brasil; leite condensado da marca Leite Moça, Nestlé, Brasil; açúcar cristal e
água. De acordo com os resultados disponibilizados pela Hidrocepe, a dieta apresenta 267,57
kcal/100 g e sua composição é descrita na Tabela 1.
Ratos Wistar (n=32)
(recém desmamados 28 dias)
Dieta Padrão
SDP
(n=8)
TDP
(n=5)*
Dieta rica em CHO
SDRC (n=8)
TDRC (n=8)
26
Tabela 1- Composição da dieta padrão Nuvilab e dieta rica em carboidratos simples
Componentes Unidade Dieta controle Dieta rica em
carboidratos simples
Calorias Kcal/100 g 308,52 267,54
Carboidratos g/100 g 44,08 51,63
Cinzas g/100 g 6,87 3,63
Fibra bruta g/100 g 11,43 5,08
Fibra detergente neutro FDN g/100 g 17,85 8,70
Fibra detergente ácido FDA g/100 g 7,82 2,86
Gordura Total g/100 g 5,06 1,09
Lipídios g/100 g 5,06 1,09
Proteína g/100 g 21,67 12,81
Umidade g/100 g 10,89 25,77
Análise bromatológica realizada pela empresa Hidrocep.
4.3. Consumo alimentar e ganho de massa corporal
O consumo alimentar dos animais foi mensurado durante todo o período experimental. A
ingestão calórica foi calculada multiplicando-se o consumo alimentar pela densidade energética
da dieta padrão (3,0852 kcal/g) e dieta rica em carboidratos simples (2,6757 kcal/g) (DE LIMA
et al., 2008). O ganho de massa corpórea foi calculado semanalmente, sendo que o ganho ou
perda da massa foi calculado pela massa final subtraída o pela massa inicial. (PERERA et al.,
2018).
4.4. Treinamento
Os animais pertencentes ao grupo de treinamento realizaram natação nas instalações do
CCA, sendo que a piscina apresenta dimensões de 175 cm de comprimento, 53 cm de largura e
65 cm de profundidade, preenchida com água térmica proveniente de duchas elétricas
proporcionando uma temperatura morna próxima a 30 ± 2° C (BARBOSA DE QUEIROZ et al.,
27
2017). Os animais foram treinados 5 dias por semana. Na primeira semana ambos os grupos TDP
e TDRC passaram por um processo de adaptação, como descrito na Tabela 2. Na segunda
semana, os animais passaram a treinar 60 minutos por dia. A partir da terceira semana, os
animais continuaram a nadar 60 minutos por dia, porém foi acoplada uma carga na cauda
correspondente a 2% da massa corporal do animal, e em cada semana a carga foi ajustada de
acordo com o peso dos animais até completarem 15 semanas (Tabela 2).
Tabela 2 - Protocolo do treinamento de natação dos ratos Wistar
4.5. Medida do lactato
Realizou-se a coleta de sangue periférico da veia caudal de todos os grupos de animais
treinados na 14° semana e analisou-se os níveis de lactato pré e pós treino. O sangue foi coletado
e transferido em tubos contendo conservante fluoreto, seguido de centrifugação a 10.000 rpm por
5 minutos e dosou-se o lactato pelo kit da Bioclin/ Quibasa Química Básica Ltda/ Santa Branca-
MG no Laboratório Piloto de Análises Clínica da Escola de Farmácia (LAPAC)/ UFOP. Os
grupos TDP e TDRC tiveram duas coletas: uma em repouso e outra pós-treinamento.
Semana Tempo de treinamento/dias por semana Carga
1a 15 minutos (1° dia),
30 minutos (2°dia),
45 minutos (3°dia),
60 minutos (4 °e 5 °dia)
-
2a 60 minutos (5 dias por semana) -
3a até 15a 60 minutos (5 dias por semana) 2% da massa do animal
adaptado cada semana
28
4.6. Teste de Tolerância Oral a glicose (TTOG)
Para a realização TOTG os animais estiveram previamente em jejum por 12 h, coletou-se
por capilaridade da cauda o sangue venoso e mediu a glicose no tempo 0 com auxílio do
glicosímetro ACCU-CHECK/ Roche Diagnostic/ Brasil. Importante ressaltar que antes da coleta
do sangue na cauda os animais foram anestesiados com lidocaína na forma farmacêutica de
pomada para amenizar a dor. Logo em seguida, foi administrada uma carga de dextrose através
de gavagem nos animais correspondendo a 2% da sua massa corpórea, depois mediu novamente
a concentração de glicose no sangue venoso dos ratos nos intervalos de tempo de 30 minutos, 60
minutos e 120 minutos. Todas as quantificações da glicose foram realizadas em duplicata. Após
TTOG, os dados foram plotados e calculou-se a área total da curva. (SANTOS et al., 2008).
4.7. Gaiola Metabólica
Na 15° semana coletou-se as fezes e urina dos animais em gaiola metabólica durante um
período de 24 horas. O consumo de água (mL) e ração (Kcal/g) e o volume urinário (mL) foram
comparados entre os grupos. É importante frisar que após a coleta das fezes, estas foram
imediatamente armazenadas em freezer -80 °C até o período da realização da extração do DNA.
4.8. Avaliação da Pressão Arterial por Pletismografia
Na 13° semana experimental todos os 4 grupos tiveram a pressão sistólica, diastólica,
média das pressões e a frequência cardíaca de batimentos por minutos (bpm) mensuradas. Todas
as medidas foram feitas utilizando aparelho de pletismografia caudal, sendo realizadas 4 medidas
por dia em cada animal, e repetidas em 4 dias seguidos no horário matutino. No final calculou-se
as médias de todas as pressões e bpm por animal e grupo.
29
4.9. Análises Hematológicas e Bioquímicas
Para as análises hematológicas da série vermelha, coletou-se o sangue em tubos com
EDTA e avaliou os seguintes parâmetros: Hemácia, Hemoglobina, Hematócrino, VCM, CHM,
CHCM e RDW SD utilizando o kit BIOCONTROL HEMATO 3P, Bioclin/ Quibasa Química
Básica/ Santa Branca- MG. Para a contagem das células da série branca utilizou-se sangue sem
conservante e realizou-se o esfregaço em lâminas de microscópio e coradas com o reagente May
Grunwald-Giemsa/ Bioclin/ QUIBASA Química Básica/ Santa Branca-MG. Em seguida, foi
avaliada em microscópio no aumento de 40X a contagem de 100 células por lâminas de cada
animal. (CARMO, 2014).
Na dosagem bioquímica pela coleta do soro dos animais eutanasiados os quais estiveram
previamente em jejum por 12 horas, foi feita a dosagem dos níveis séricos de glicose,
triglicérides, colesterol total, HDL-colesterol (HDL-c), LDL-Colesterol (LDL-c), VLDL-
colesterol (VLDL-c), ureia, creatinina, ALT (alanina aminotransferase), AST (aspartato
aminotransferase) e proteína C reativa. As análises bioquímicas foram feitas utilizando os kits da
Bioclin, QUIBASA Química Básica, Santa Branca- Minas Gerais, Brasil, exceto para PCR, para
qual usou o kit PCR-latex da Centerlab, MG, Brasil. Tanto as análises bioquímicas quanto
hematológica foram feitas em analisadores automáticos no LAPAC.
4.10. Parâmetros Biométricos
Na 15° semana os animais foram eutanasiados, e os tecidos adiposos epididimal,
inguinal, marrom, retroperitoneal e o sangue foram coletados para as análises. A massa dos
coxins adiposos foi pesada, e foi avaliado o Índice de Adiposidade (TAYLOR; PHILLIPS, 1996)
e o Índice de Lee. (BERNARDIS, 1970; BERNARDIS; PATTERSON, 1968), como mostrado
nas fórmulas abaixo:
𝐼𝒏𝒅𝒊𝒄𝒆 𝒅𝒆 𝒂𝒅𝒊𝒑𝒐𝒔𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 =∑ 𝒄𝒐𝒙𝒊𝒏𝒔 𝒂𝒅𝒊𝒑𝒐𝒔𝒐𝒔 (𝒈)
𝒎𝒂𝒔𝒔𝒂 𝒄𝒐𝒓𝒑𝒐𝒓𝒂𝒍 (𝒈)× 𝟏𝟎𝟎
30
Í𝒏𝒅𝒊𝒄𝒆 𝒅𝒆 𝑳𝒆𝒆 = √𝒎𝒂𝒔𝒔𝒂 𝒄𝒐𝒓𝒑𝒐𝒓𝒂𝒍(𝒈)
𝒄𝒐𝒎𝒑𝒓𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒏𝒂𝒔𝒐𝒂𝒏𝒂𝒍 (𝒄𝒎)
𝟑
4.11. Análise do microbioma fecal de ratos Wistar
4.11.1. Extração do DNA nas fezes
Foram realizadas as extrações de DNA das fezes de 5 ratos de cada grupo que foram
previamente coletados e descrito no procedimento da gaiola metabólica. As extrações foram
realizadas utilizando o protocolo do International Human Microbiome Standard
(IHMS/http://www.microbiome-standards.org/). Sendo utilizado o Protocolo H (FOR;
SAMPLES; EXTRACTION, 2015) com algumas adaptações.
Pesou-se 200 g de fezes de cada animal em tubos eppendorf de 2 mL. Essas amostras
foram tratadas com 250 µL de solução de isotiocianato de guanidina (4M) que atua como agente
desnaturante. Em seguida, foi adicionado 40 µL da solução 10% N-lauril que é um detergente o
qual possibilitou a remoção de lipídeos da amostra. Na próxima etapa foi usado 750 mg debeads
de vidro com diâmetro 0,1 cm a qual possibilitou a lise de todas as células presente na amostra.
Em seguida a amostra foi tratada com 15 mg Polivinilpolipirrolidone (PVPP) seguido de
centrifugações e adicionou 500 µL TENP que é um tampão no qual contém PVPP que
desempenha função na remoção de metabólitos presente na amostra. Para garantir uma eficiência
na purificação, foi adicionado um passo extra no protocolo, em que foi misturada clorofórmio na
amostra numa proporção 1:1 ajudando assim na remoção de proteínas. A amostra foi tratada com
10 ng/µL de Rnase (Sigma), e nas últimas etapas adicionou-se 1mL de isopropanol gelado para a
precipitação do DNA e adicionou 500 µL de etanol 70% para sua lavagem. No final do
procedimento o DNA foi diluído em 200 µL do tampão Tris-EDTA (TE) com pH 8 (BAG et al.,
2016; SAMBROOK, JOSEPH & MANIATIS, 1987).
31
Para controle de qualidade da extração do DNA, quanto a sua integridade, realizou-se
eletroforese do DNA genômico (DNAg) em gel de agarose 0,8% contendo brometo de etídio. A
eletroforese ocorreu numa tensão elétrica de 80 Volts por 30 minutos em tampão TBE 0,5 X
(BAG et al., 2016; SAMBROOK, JOSEPH & MANIATIS, 1987) e foto documentada em
transiluminador UV comprimento de onda 302 a 312 nm.
Outra avaliação realizada foi a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando
primers correspondente a região RNA ribossomal (RNAr) de procariotos: 8 Foward (AGA GTT
TGA TCC TGG CTC AG ) e 1392 Reverse (ACG GGC GGT GTG TGT AC) (GILL et al.,
2006; LIN et al., 2013). Para essa mesma reação utilizou o kit da Thermofisher/Brasil, a
configuração do termociclador foi: 1 vez 94° C por 5 minutos, 30 vezes 94° C por 2 minutos/
50°C 30 segundo/ 72° C por 9 minutos e 1 vez 4° C por tempo indeterminado. Após a PCR, foi
realizada a eletroforese como descrita no parágrafo acima, porém utilizando gel de agarose 1,8
%.
Para avaliar contaminação por proteína mediu-se a razão das absorbâncias A260/A280
utilizando no aparelho NanoDrop da Thermofisher/ Brasil, e a quantificação foi feita usando
método de florescência Qubit / Thermofisher/ Brasil.
4.11.2. Biblioteca 16S V3 e V4
Para a constatação da biblioteca utilizou-se os primers correspondente a região V3 (TCG
TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG) e
V4 (GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT
CTA ATC C) (KLINDWORTH et al., 2013) do RNAr 16S. O processamento da biblioteca
seguiu os procedimentos do kit biblioteca Miseq Illumina 16S, e para os adaptadores utilizou o
Kit Nextera® XT (ILLUMINA, 2013). O amplicon gerado foi de aproximadamente 254 pb. A
Figura 6 representa a esquematização do workflow do preparo da biblioteca da região 16S.
32
Primeira etapa: os primers se ligam na região específica para sua amplificação. Após primeiro ciclo de amplificação
ocorre a ligação de adaptadores para identificação das amostras utilizando o kit Nextera® XT. Após segundo ciclo
da amplificação já com a instalação dos adaptadores faz-se o pool de todas as amostras para o sequenciamento.
4.11.3. Sequenciamento Illumina Miseq
Para o sequenciamento utilizou o Sequenciador de Nova Geração Illumina Miseq. Todo o
procedimento seguiu o protocolo do kit Sequenciamento MiSeq Reagent Kit v2 (500cycle)
(15M). O sequenciamento dos amplicons de 250 pb gerou 500 Megabase de dados. Tanto para a
produção das bibliotecas como para o sequenciamento foram contratados os serviços do
Laboratório Multiusuário Centralizado para Sequenciamento de DNA em Larga Escala e Análise
de Expressão Gênica localizado no Campus da UNESP em Jaboticabal, no Departamento de
Tecnologia.
Figura 6- Workflow preparo da biblioteca 16S
33
4.11.4. Plataforma Illumina BaseSpace
As análises dos dados de sequenciamento do RNAr 16S foram realizadas no portal online
Illumina (http://www.illumina.com/) e os dados foram submetidos ao aplicativo 16S
metagenômica do Basespace (https://basespace.illumina.com/ home /index) (BASESPACE,
2014). Os arquivos gerados no formato FASTQ foram carregados na plataforma e executou-se a
performance utilizando o aplicativo 16 S metegenoma, a qual foram feitas análises numa versão
de alto desempenho utilizando o algorítimo RDP Naïve Bayes. (WANG et al., 2007). As
sequências completas com as extremidades pareadas foram referenciadas contra a versão curada
do banco de dados de Greengenes (maio de 2013).
O Metagenoma 16S app gerou o números de reads totais após a filtragem das sequências
de boa qualidade. E de acordo com a classificação dos reads pôde-se calcular abundância
relativa nos diferentes níveis taxonômicos pela formula abaixo:
𝑎𝒃𝒖𝒏𝒅â𝒏𝒄𝒊𝒂 % =𝒓𝒆𝒂𝒅𝒔 𝐞𝐬𝐩𝐞𝐜í𝐟𝐢𝐜𝐨𝐬 𝐝𝐨𝐬 𝐠𝐫𝐮𝐩𝐨𝐬 𝐞 𝐬𝐮𝐛𝐠𝐫𝐮𝐩𝐨𝐬 𝐭𝐚𝐱𝐨𝐧ô𝐦𝐢𝐜𝐨𝐬
𝒓𝒆𝒂𝒅𝒔 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒊𝒔 × 𝟏𝟎𝟎
Os níveis Taxonômicos Reino, Filo, Classe, Ordem, Família e gênero foram todos
avaliados na proporção dos mais abundantes e comparados com a média entre os grupos de
animais. Para a avaliação da acurácia em diferentes níveis de classificação taxonômico, usando o
algoritmo RDP Naïve Bayes, aparece uma estatística de precisão subamostral das taxonomias
como mostrado na Tabela 3.
34
Tabela 3- Precisão estatística do grau de acurácia da identificação taxonômica utilizando o algoritmo RDP Naïve
Bayes
Nível Taxonômico Acurácia%
Reino 100%
Filo 100%
Classe 100%
Ordem 99.98%
Família 99.97%
Gênero 99.65%
Espécies 98.24%
O banco de dados taxonômico que foi utilizado é uma versão curada pela Illumina na
versão de maio de 2013 do banco de dados do Greengenes Consortium
(greengenes.secondgenome.com/downloads). Na Tabela 4 está descrito o atual número de micro-
organismos que são identificados no banco Greengenes em diferentes níveis taxonômicos.
Tabela 4- Números de dados em diferentes níveis taxonômico utilizando o consórcio Greengenes tendo a última
acurácia em maio de 2013
Nível Taxonômico n° Classificados
Reino 3
Filo 33
Classe 74
Ordem 148
Família 321
Gênero 1086
Espécies 6466
Entre os dados gerados no BaseSpace obteve-se do Dendograma por Hierarquia de
Clustering e Índice de Shannon. O dendrograma mostra um agrupamento hierárquico de
amostras com base em classificações em nível de gênero. O cálculo da medida Shannon ou
índice de Shannon consegue prever o número de espécies possíveis que podem ser encontrada
35
nas amostras pela quantificação da entropia de conteúdo de incertezas ou informação.
(BERGER; PARKER, 1970).
4.12. Análises Estatísticas
Para a realização das análises estatística utilizou-se o Software GraphPad Prisma V.6. A
estatística utilizada foi o teste Two Way ANOVA seguido do pós-teste Bonferroni. Para a
avaliação do tipo de treino realizado pelos animais utilizou teste Wilcoxon. A avaliação proteína
C-retiva foi usado o teste qui-quadrado. Os dados foram apresentados com média e desvio
padrão, exceto para proteína C reativa que é um dado qualitativo, e foi considerado como
significativo os valores de p< 0,05.
36
5. RESULTADOS
5.1. Avaliação do consumo calórico e do ganho de massa corporal dos
ratos durante o período de experimentação
Com 28 dias de vida, as médias da massa corporal dos grupos de animais foram: SDP
90,5 ± 15,0 g, TDP 91,6 ± 14,15 g, SDRC 91,1 ± 8,8 g e TDRCS 85,6 ± 6,3 g. Podemos observar
na figura 9 que os animais tiveram ganho de massa ao longo das 15 semanas e que o grupo
SDRC apresentou maior ganho de massa seguido dos gurpos SDP e TDRC sendo que o grupo
TDP foi quem apresentou menor ganho de massa.
Figura 7- Ganho de massa corporal dos ratos Wistar ao longo de 15 semanas de experimentação
S e m a n a s
Ma
ss
a (
g)
0 5 1 0 1 5 2 0
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
S D P
T D P
S D R C
T D R C
Os animais foram pesados 2 vezes por semana e a plotagem foi realizada com as médias da semana. Sedentário Dieta Padrão
(SDP), Treinado Dieta Padrão (TDP), Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples (SDRC) e Treiando Dieta Rica em
Carboidratos Simples (TDRC). SDP n=8 animais, TDP n=5 animais, SDRC n=8 animais e TDRC n=8 animais. P >0,05
Em relação ao consumo calórico (Kcal) das dietas até o final da 15° semana
experimentai, não foi observada diferença significativa entre os grupos de animais (Figura 10).
Na última semana o consumo Kcal médio por grupo foi: SDP 483,9 ± 67,0 Kcal; TDP 445,9 ±
37
26,4 Kcal, SDRC 388,3 ± 33,5 Kcal e TDRC 452,8 ± 27,0 Kcal. Quanto ao crescimento dos
ratos, na 15° semana não foi observada diferença significativa (Figura 8).
Figura 8- Consumo calórico estimado para os 4 grupos experimentais ao longo de 15 semanas experimentais
Co
ns
um
o K
ca
l
0 5 1 0 1 5 2 0
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
S D P
S D R C
T D P
T D R C R
S e m a n a s
Sedentário Dieta Padrão (SDP), Treinado Dieta Padrão (TDP), Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples (SDRC) e
Treiando Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRC). SDP n=8 animais, TDP n=5 animais, SDRC n=8 animais e TDRC n=8
animais O teste estatístico utilizado foi two-way Anova comparação pós teste Bonferroni, p>0,05.
5.2. Efeito da dieta rica em carboidratos simples e do treinamento
aeróbico sobre os parâmetros bioquímicos e hematológicos
Os dados bioquímicos avaliados (Tabela 5) mostraram que os parâmetros de Triglicérides
e VLDL estão aumentados no SDRC, sendo que os valores médios foram respectivamente: 151,0
± 42,0 mg/dL (p< 0,05) e 30,2 ± 8,4 mg/dL (p< 0,05) quando comparados ao grupo SDP 96,0 ±
33.3 mg/dL e 19,2 ± 6,6 mg/dL. Não obstante, o efeito do treino no grupo TDRC pôde reduzir os
níveis de Triglicérides e VLDL quando comparado SDRC, sendo os valores: 94,7 ± 28,0 mg/dL
(p< 0,05) e 18,9 ± 5,6 mg/dL (p< 0,05). Os demais parâmetros bioquímicos não tiveram
alterações pela dieta e treinamento de natação aeróbico com carga.
38
Tabela 5- Análises bioquímica dos ratos Wistar com 15 semanas
Analito
Bioquímico
unidades SDP TDP SDRC TDRC
Colesterol mg/dL 82,7 ± 11,1 84,1 ± 15,8 75,4 ± 14,2 77,3 ± 21
Creatinina mg/dL 0,74 ± 0,18 0,64 ± 0,05 0,77 ± 0,05 1,20 ± 1,42
Glicose mg/dL 119,1 ± 15,2 122,0 ± 28,5 132,2 ± 10,6 126,0 ± 18,0
HDL-c mg/dL 23,2 ± 2,4 26,2 ± 2,1 23,47 ± 3,3 26,1 ± 4,9
LDL-c mg/dL 40,2 ± 6,2 41,3 ± 13,9 24,8 ± 11,2 32,2 ± 16,8
TGO U/L 241,4 ± 102,3 390,1 ±323,4 234,5 ± 46,50 282,5 ± 90,5
TGP U/L 72,8 ± 10,48 82,3 ± 32,1 60,3 ± 6,5 59,4 ± 18,6
Triacilglicerol mg/dL 96,0 ± 33,3 82,6 ± 15,9 151,2± 42,2a* 94,7 ± 28,2 c *
VLDL mg/dL 19,2 ± 6,6 16,5 ± 3,2 30,2 ± 8,4a * 18,94± 5,64c*
Ureia mg/dL 56,4 ± 6,90 59,3 ± 17,3 47,9 ± 5,6 49,5 ± 18,50
PCR >ou<
6mg/dL
< 6mg/dL < 6mg/dL < 6mg/dL < 6mg/dL
Sedentário Dieta Padrão (SDP) n=5 animais Treinado Dieta Padrão (TDP) n=5 animais; Sedentário Dieta Rica em Carboidratos
Simples (SDRC) n=5 animais; Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRC) n=5 animais; a= SDRC X SDP, c=
TDRCX SDRC. * p<0,05.
As análises hematológicas, tanto a séries brancas e quanto a vermelha não diferiram entre
as médias dos grupos de animais (Tabela 6).
39
Tabela 6- Análises hematológica dos ratos Wistar com 15 semanas
Unidades SDP TDP SDRC TDRC
Leucócitos 103/µL 11,6 ± 5,5 8,7 ± 2,9 12,2 ± 3,3 11,1 ± 4,6
Hemácias 106/µL 8,9 ± 0,22 8,3 ± 0,57 9,0 ± 0,48 8,4 ± 1,00
Hemoglobina g/dL 16,8 ± 0,49 15,9 ± 1,75 16,2 ± 0,47 15,1 ± 1,64
Hematócrino (%) 49,7 ± 1,62 46,6 ± 4,35 49,5 ± 2,02 45,7 ± 5,56
VCM - 55,4 ± 0,93 56,1 ± 1,82 55,0 ± 1,32 54,5 ± 1,54
CHM (Pg) 18,7 ± 0,38 19,1 ± 0,89 18,0 ± 0,63 18,0 ± 0,56
CHCM (g/dL) 33,8 ± 0,49 34,0 ± 1,08 32,7 ± 0,50 33,1 ± 0,65
RDW SD (FI) 30,1 ± 1,45 30,28 ± 0,91 30,7 ± 1,20 30,8 ± 1,02
RDW CV (%) 14,2 ± 1,83 13,7 ± 0,66 14,7 ± 1,26 15,1 ± 1,18
VPM - 7,4 ± 0,62 7,0 ± 0,17 7,4 ±0,38 7,3 ± 0,42
Plaquetas 103/µL 978,8 ± 179,6 691,0 ± 390,2 869,0 ± 104,1 725,7 ± 348,7
Neutrófilos (%) 18,1 ± 5,43 21,8 ± 9,28 18,5 ± 5,09 23,8 ± 12,4
Linfócitos (%) 74,7 ± 3,7 69,0 ± 5,6 74,5 ± 6,7 68,8 ± 11,9
Monócitos (%) 6,50 ± 2,61 8,40 ± 4,82 6,37 ± 3,06 5,87 ± 1,35
Eosinófilos (%) 0,62 ± 0,51 0,60 ± 0,54 0,50 ± 0,75 0,12 ± 0,35
Bastonete (%) - - - -
Sedentário Dieta Padrão (SDP) n= 8 animais; Treinado Dieta Padrão (TDP) n= 5 animais; Sedentário Dieta Rica em
Carboidratos Simples (SDRC) n= 8 animais e Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRC) n= 8 animais.
O teste estatístico utilizado foi two-way Anova comparação pós-teste Bonferroni, todas as comparações
apresentaram p>0,05.
5.3. A dieta rica em carboidratos simples e o treinamento de natação
aeróbico com carga afetam os parâmetros biométricos
A dieta rica em carboidratos simples aumentou os tecidos adiposos epididimal,
retroperitoneal e inguinal: 15,0 ± 4,0 g (p< 0,05), 13,0 ± 4,0 g (p< 0,05) e 13,0 ± 4.5 (p< 0,01),
respectivamente, e o treinamento físico de natação foi capaz de reduzir o efeito da dieta rica em
40
carboidratos simples nos mesmo tecidos: 9,6 ± 4,0 g (p< 0,01) para o epididimal, 7,5 ± 3,6 g (p<
0,01) para inguinal e 6.9 ± 4.6 (P<0,5) para retroperitoneal. Também, o grupo TDRC teve
aumento significativo do tecido adiposo marrom (p<0,05) comparado SDRC. Além disso, o
treinamento físico associado com a dieta balanceada diminui os índices de adiposidade (p<0,05).
Tabela 7- Parâmetro biométrico ratos Wistars com 15 semanas
Animais
Parâmetros SDP TDP SDRC TDRC
Massa corporal (g) 422,0 ± 36,0 362 ± 23,6 480 ± 33,0 a* 417,0 ± 48,0 c*
Marrom 0,52±0,18 0,78±0,23 0,68±0,14 1,02±0,28 c*
Inguinal (g) 10,0 ± 3,0 6,0 ± 2,0 15,0 ± 4,0 a* 9,6 ± 4,0 c**
Epididimal (g) 6,5 ± 2,0 3,5 ± 1,3 13,0 ± 4,0 a** 7,5 ± 3,6 c**
Retroperitoneal (g) 6,5 ± 2,6 3,13 ± 2,5 13,0 ± 4,5 a* 6,9 ± 4,6c*
Índice Adiposidade 5,6 ± 1,5 3,7 ± 1,5 7,5 ± 2,13 7,3 ± 2,0d*
Índice de Lee 0,32 ± 0,02 0,31 ± 0,01 0,32 ± 0,01 0,32 ± 0,02
Sedentário Dieta Padrão (SDP) n=5 animais Treinado Dieta Padrão; (TDP) n=5 animais; Sedentário Dieta Rica em
Carboidratos Simples (SDRC) n=5 animais; Treinado Dieta Rica em Carboidrato Simples(TDRC) n=5 amostra; a=
SDRC X SDP, c= TDRCX SDRC; d= TDRC X TDP. * p<0,05, e **P<0,01.
5.4. Variação da pressão arterial e frequência cardíaca em relação à
dieta e ao treinamento de natação com carga
Na 13a semana foi aferida a pressão arterial e os dados são apresentados na Tabela 8. Os
resultados mostraram que a frequência cardíaca e a pressão diastólica não apresentaram diferença
significativa na média entre os grupos. Contudo a pressão sistólica e a média apresentaram-se
significativamente diferentes entre os grupos TDP e TDRC, sendo que o valor médio da sistólica
foi 146 ± 7 mmHg no grupo TDP e 164 ± 15 mmHg no TDRC. E a média das pressões foram
maiores no TDRC (155 ± 14 mmHg) comparado ao TDP 136 ± 16 mmHg.
41
Tabela 8- Avaliação da pressão e frequência cardíacas dos ratos Wistar por pletismografia caudal
Pletismografia Unidade SDP TDP SDRC TDRC
Frequência b.p.m 354 ± 16 353 ± 33 377 ± 27 357 ± 26
Pressão
Diastólica
mmHg 112 ± 14 128 ± 16 110 ± 11 127 ± 8
Pressão
Sistólica
mmHg 144 ± 9 155 ± 14 146 ± 7 164 ± 15d*
Média mmHg 122 ± 11 136 ± 16 122 ± 7 140 ± 11 d*
Sedentário Dieta Padrão (SDP) n= 8 animais, Treinado Dieta Padrão (TDP) n= 5 animais, Sedentário Dieta Rica em Carboidratos
Simples (SDRC) n= 8 animais e Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRC) n= 8 animais. O teste estatístico utilizado
foi two-way Anova comparação pós teste Bonferroni, d= TDRC X TDP, * p< 0,05.
5.5. Efeito do treinamento de natação aeróbico com carga sobre os níveis
sérico de lactato
A avaliação da concentração de lactato no plasma mostrou que o exercício de natação
com carga não alterou os níveis de lactato quando foi comparado o tempo inicial em repouso
(3.32 ± 0,93 mmol/L) com o período de pós treino (3.51 ± 1,00 mmol/L) (Figura 9). Desse
modo, confirmou-se que o treinamento dos animais foi do tipo aeróbico. Segundo dados
divulgados por VOLTARELLI, 2004 o treinamento de natação utilizando ratos, mostrou que
níveis de lactato < 6 mmol/L são classificados como treinamento do tipo aeróbico, e não foi
observado uma diferença significativa entre os valores pré e pós treinamento.
42
Figura 9- Avaliação dos níveis séricos de lactato nos ratos Wistar nas condições Pré-Treino e Pós- Treino
La
cta
to m
mo
l/L
Pré
-T
Pó
s-T
0
2
4
6
Pré-T, repouso, n=14 animais e Pós- treino (Pós-T) n=14 animais. A estatística utilizada foi Teste Wilcoxon sendo
que comparação apresentou p > 0,05.
5.6. Consumo calórico, água e volume urinário dos grupos
experimentais não diferiram em um período de 24 horas
Na 15° semana foram coletadas as fezes dos animais, e avaliou o consumo da água e
ração e o volume urinário (Tabela 9). Os resultados mostraram que, num período de 24 horas,
não houve diferença significativa entre os grupos para o consumo de água e ração como também
o volume urinário.
43
Tabela 9- Análises quantitativa do consumo de ração, água e volume urinário dos ratos Wistar num período de 24
horas em gaiola metabólica
Analito Unidades SDP TDP SDRC TDRC
Ração Kcal 54,0 ± 22,6 62,3 ± 14,0 36,1 ± 14,0 73,5 ± 34,2
Água mL 25,5 ± 8,5 24,6 ± 9,0 24,2 ± 10,5 23,2 ± 8,2
Urina mL 14,8 ± 3,8 12,7 ± 4,70 9,5 ± 3,14 11,0 ± 5,00
A experimentação ocorreu na 15° semana. Sedentário Dieta Padrão (SDP) n= 8 animais, Treinado Dieta Padrão
(TDP) n= 5 animais, Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples (SDRC) n= 8 animais e Treinado Dieta Rica
em Carboidratos Simples (TDRC) n= 8 animais. O teste estatístico utilizado foi two-way Anova comparação pós
teste Bonferroni, todas as comparações apresentaram p>0,05.
5.7. Consumo dieta rica em carboidratos simples apresentou maior
glicemia no TTOG
Em relação ao TTOG (Figura 10), ambos os grupos tiveram uma glicemia abaixo de 100
mg/dL no tempo 0 de leitura (jejum). Após a administração da carga de dextrose 2% da massa do
animal, foi observado um aumento da concentração de glicose nos tempo de 30 minutos e 60
minutos sendo que os grupos SDRC e TDRC apresentaram médias mais altas de concentração
da glicose tendo pico próximo 150 mg/dL. Todavia, passado-se 2 horas após administração da
carga de dextrose, todos os grupos tiveram baixa na glicose, retornando próximo aos níveis
basais do tempo inicial exceto o grupo SDRC pois no tempo de 2 horas sua glicemia média foi
128,3 ml/dL.
As áreas totais da curva calculada dos grupos foram: SDP 15275 ± 1673 n= 6 animais,
TDP 14470 ± 2384 n= 3 animais, SDRC 16847 ± 2212 n= 6 animais e TDRC 16425 ± 2212 n= 6
animais. Embora os valores médios estejam aumentados nos grupos que consomem a dieta rica
em carboidratos simples, não houve diferença estatística (Figura 10).
44
Figura 10- Perfil glicêmico dos ratos e Área total da curva correspondente avaliação dos níveis de glicose pelo
TTOG nos tempos 0, 30, 60 e 120 minutos
M in u to s
Gli
co
se
mg
/dL
030
60
120
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
S D P
T D P
S D R C
T D R C
Animais
Áre
a T
ota
l
S T
0
5000
10000
15000
20000
25000Dieta Padrão
Dieta Rica carboidratos simples
A B
Figura A- Perfil glicêmico dos ratos Wistar observados através do TTOG após administração da carga de dextrose
correspondente a 2% da massa dos animais nos tempos 0, 30, 60 e 120 minutos. Figura B- área total da curva em
relação TTOG, Sedentário Dieta Padrão (SDP) n= 6 animais, Treinado Dieta Padrão (TDP) n=3 animais, Sedentário
Dieta Rica em Carboidratos Simples (SDRC) n=6 e Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRC) n=6.
P>0,05
5.8. Análise do efeito da dieta rica em carboidratos simples e do
treinamento físico de natação no microbioma intestinal de ratos
Wistar
5.8.1. Extração do DNAg fecal e avaliação da sua integridade e qualidade
Para as análises das bactérias presente nas fezes, extraiu-se o DNAg. A Figura 11 mostra
a eficiência da extração pela presença de uma única banda, embora algumas amostras
apresentaram rastros que possivelmente podendo ser vestígio de RNA.
45
Figura 11- Análise da integridade do DNAg
Figura A, Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRC) n=5 animais, amostras 4, 12, 20, 24 e 28,
Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples (SDRC) n=5 animais, amostras 3, 7, 11, 15 e 31. Figura B,
Sedentário Dieta Padrão (SDP) n= 5 animais, amostras 1, 5, 9, 13 e 17, Treinado Dieta Padrão (TDP) n= 5 animais,
amostras 2, 6, 10, 14 e 18. Amostras em gel 0,8% corada em brometo de etídio.
Em relação à contaminação por proteína, a razão entre as dosagem obtidas a 260/280nm
mostrou que o DNAg extraído apresentava pouca contaminação (valor de referência ente 1,8-2,0)
(WILFINGER; MACKEY; CHOMCZYNSKI, 1997) e a quantidade de DNA extraído foi
suficiente (Tabela 10) para posteriores análises, uma vez que para a produção da biblioteca da
região V3-V4 é requerido 5ng de DNA (ILLUMINA, 2013).
Já os amplicons obtidos pela PCR utilizando os primers 8F/1392R geraram bandas únicas
no tamanho esperado de 1384 pb (Figura 12), isso demonstrou que o DNA se apresentou integro
na região ribossomal, podendo assegurar a próxima etapa que foi a produção da biblioteca da
região V3-V4 RNAr e sequenciamento pelo Illumina Miseq.
46
Tabela 10- Análises da qualidade e quantificação do DNA extraído das fezes de ratos Wistars
Grupos Amostras Concentração ng/uL (Qubit) Razão 260/280
SDP
1 174,58 1.75
5 39,00 1.76
9 118,4 1.78
13 143,78 1.82
17 127,68 1.77
TDP
2 355 1.93
6 237 1.81
10 71,53 1.78
14 53,43 1.76
18 84,87 1.75
SDRC
3 349,44 1.75
7 110,4 1.76
11 63,048 1.78
15 59,4 1.78
31 80,64 1.8
TDRC
4 47,4 1.78
12 89,49 1.76
20 76,8 1.82
24 122,4 1.84
28 46,39 1.77
Sedentário Dieta Padrão (SDP) n=5 amostras 1, 5, 9, 13 e 17; Treinado Dieta Padrão (TDP) n=5 animais amostras 2,
6, 10, 14 e 18; Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples (SDRC) n=5 animais amostras 3, 7, 11, 15 e 31;
Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRC) n=5 animais, amostras 4, 12, 20, 24 e 28. A quantificação
ocorreu pelo método Qubit e a análise de contaminação por proteína (260/280) se deu por nanodrop.
47
Figura 12- Amplicon correspondente a região RNAr utilizando os primers 8F/1392 R
A: Sedentário Dieta Padrão (SDP) n=5 amostras 1, 5, 9, 13 e 17; Treinado Dieta Padrão (TDP) n=5 animais
amostras 2, 6, 10, 14 e 18. B : Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples (SDRC) n=5 animais amostras 3, 7,
11, 15 e 31; Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRC) n=5 animais amostras 4, 12, 20, 24 e 28. O gel
1,8 % foi corado com brometo de etídio. PM= Peso Molecular de 2Kb (Invitrogen).
5.8.2. Análises dos dados sequenciados
Após o sequenciamento, os dados foram gerados no formato FASTQ e as análises foram
feitas utilizando a plataforma BaseSpace. De acordo com a Tabela 13, os números totais de reads
por amostras foram em torno de 400 mil a 600 mil. Em nível de gênero, o banco Greengenes
pôde identificar de 81,8% a 93,4 % dos reads por amostras. (Tabela 11). O índice de diversidade
de Shannon deduziu que existe de 1841 à 2737 espécies nas amostras avaliadas (Tabela 12),
todavia, o número de espécies identificada pelo banco Greengenes corresponde a menos de 30%
do número de espécies estimadas. Embora estimado pelo índice de Shannon várias espécies por
amostras, não foi encontrada diferença estatística em relação ao nível de diversidade de espécies
entre o grupo (Figura 13).
48
Tabela 11 - Número de reads gerados e a porcentagem de bactérias identificadas a nível de gênero
Grupos Amostras Número de Reads %Gênero Identificado
SDP
1 674059 82.63 %
5 581491 81.87 %
9 602550 88.80 %
13 686436 90.22 %
17 441072 91.00 %
TDP
2 590029 90.30 %
6 613980 84.36 %
10 572521 88.79 %
14 475548 90.71 %
18 639530 85.24 %
SDRC
3 537103 84.65 %
7 588662 82.38 %
11 600956 88.18 %
15 620274 90.14 %
31 479809 93.63 %
TDRC
4 634613 87.09 %
12 670725 90.05 %
20 492978 91.08 %
24 554173 87.73 %
28 529709 82.81 %
Sedentário Dieta Padrão (SDP); Treinado Dieta Padrão (TDP); Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples (SDRC);
Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRC).
49
Tabela 12- Números de espécies estimado pela Diversidade de Shannon nas amostras e número de espécies
identificadas pelo banco Greengenes
Grupos Amostras Número de espécies
por Diversidade de Shannon
Número de espécies
Identificadas
SDP
1 2.495 666
5 2.453 656
9 2.650 591
13 2.661 568
17 2.132 440
TDP
2 2.097 452
6 2.583 613
10 2.737 589
14 2.126 468
18 2.390 551
SDRC
3 2.566 583
7 2.579 689
11 2.553 553
15 2.509 526
31 1.841 367
TDRC
4 2.628 573
12 2.292 449
20 2.282 472
24 2.479 509
28 2.115 547
Sedentário Dieta Padrão (SDP) n=5 amostras 1, 5, 9, 13 e 17; Treinado Dieta Padrão (TDP) n=5 animais amostras 2,
6, 10, 14 e 18, Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples (SDRC) n=5 animais amostras 3, 7, 11, 15 e 31;
Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRC) n=5 animais amostras 4, 12, 20, 24 e 28.
50
Figura 13- Estimativa da riqueza de diversidade de espécies encontrada nas amostras fecais calculadas pelo índice
de diversidade de Shannon
Div
ers
ida
de
de
Sh
an
no
n
S T
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
3 0 0 0
D P
D R C
Sedentário Dieta Padrão (SDP) n=5; Treinado Dieta Padrão (TDP) n=5, Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples (SDRC)
n=5 animais; Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples (TDRC) n=5 animais. S= Sedentário, T=Treinado, DP= Dieta Padrão
e DRC= Dieta Rica em Carboidratos simples ( P>0,05).
O Dendograma (Figura 14) mostrou que as amostras se subdividem em 3 clusters, sendo
que o cluster 1 compreende as amostras 10 TDP, 11 SDRC, 12 TDRC, 20 TDRC, 14 TDP, 18
TDP, 9 SDP, 13 SDP, 15 SDRC, 2 TDP, 31 SDRC, 1 SDP, 6 TDP, 17 SDP, 3 SDRC, 1SDRC, 1
SDP, 6 TDP, 17 SDP, 3 SDRC, 4 TDRC e 24 TDRC. O cluster 2 corresponde as amostras 5
SDP e 7 SDRC, e o cluster 3 corresponde a amostra 28 TDRC. As amostras fecais da região do
cluster 1, 4 TDRC e 24 TDRC; 9 SDP e 13 SDP; 12 TDRC e 20 TDRC possuem um grau de
similaridade quanto a sua composição e igualdade de abundância relativa a nível de gênero, e a
comparação foi favorável pois são animais de mesmo agrupamento. As amostras do cluster 1, 6
TDP e 17 SDP tem alta similaridade, todavia as mesmas amostras analisadas tem em comum o
consumo da mesma dieta padrão. Amostras 28 TDRC, 5 SDP e 7 SDRC foram as que
apresentaram uma maior diferenciação no grau de similaridade na composição da microbiota ao
nível de gênero comparada com o restante das demais amostras avaliadas, uma característica
marcante dessas três amostra é uma baixa da abundância de Prevotella que está presente em
todas as amostras correspondente ao cluster 1.
51
Figura 14- Dendrograma referente as amostras fecais dos ratos Wistars
O dendograma é um agrupamento hierárquico de amostras baseado em classificações no nível de gênero. Sedentário Dieta Padrão (SDP) n=5 amostras 1, 5, 9, 13 e 17; Treinado
Dieta Padrão (TDP) n=5 animais amostras 2, 6, 10, 14 e 18; Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples (SDRC) n=5 animais amostras 3, 7, 11, 15 e 31; Treinado Dieta Rica
em Carboidratos Simples (TDRC) n=5 animais amostras 4, 12, 20, 24 e 28.
Legenda:
Cluster 1 Cluster 2 Cluster 3
52
Ao nível de Reino, Figura 15, nas subclassificações Bacteria e Archaea não ocorreram
variações estatísticas entre os grupos, porém a dieta rica em carboidratos simples foi capaz
diminuir a taxa do reino Viruses (p< 0,05). O gene 16S RNAr se apresenta universal na
identificação de bactéria, porem é importante destacar que vários bacteriófagos possuem regiões
no DNA que codificam para região ribossomal assim como para proteínas do ribossoma
(JASKUNAS; LINDAHL; NOMURA, 1975; LUND et al., 1976), por isso, foi possível a
identificação do reino Viruses.
Ao nível de Filo, Figura 16, a dieta rica em carboidratos simples reduziu a abundância de
Actinobacteria ( p<0,05) e Fibrobacteres ( p<0,01). O treinamento foi capaz de aumentar
Bacteroidetes (p<0,05) e diminuir a razão Firmicutes/ Bacteroidetes ( p<0,05), ou seja a taxa de
Bacteroidetes aumentou a ponto de sobressair sobre o filo Firmicutes que é o segundo mais
abundante nos dados analisados. Também, o treinamento reduziu Synergistetes (p<0,01),
Fibrobacteres (p<0,001) e Actinobacteria (p<0,05).
S = Sedentário, T= Treinado, (●) = Dieta padrão , (■) = Dieta Rica em Carboidrato Simples. a= Significativo SDRC X SDP;
b= Significativo TDPX SDP, c= significativo TDRC X SDRC; d= Significativo TDRC X TDP . * P<0,05, ** P<0,01 e ***
P<0,001. Estatística utilizada foi Two way ANOVA comparação pós-teste Bonferroni.
Figura 15- Análises estatística da abundância ao nível Reino
53
Figura 16- Análises estatísticas da abundância ao nível Filo
S = Sedentário, T= Treinado, (● ) = Dieta padrão, (■ ) = Dieta Rica em Carboidratos Simples. a = Significativo SDRC X SDP; b
= Significativo TDP X SDP , c= significativo TDRC X SDRC; d= Significante TDRC X TDP . * P<0,05, ** P<0,01 e ***
P<0,001. Estatística utilizada foi Two way ANOVA comparação pós-teste Bonferroni.
No nível de Classe, Figura 17, tanto a dieta rica em carboidratos simples quanto o
treinamento induziram uma diminuição na abundância de Actinobacteria (p<0,05), Fibrobacteria
(p<0,01 DRC; e p<0,001 Treinamento). A interação dieta rica em carboidratos simples e
treinamento aumentou a abundância de Gammaproteobacteria (p< 0,05).
54
Figura 17- Análises estatística da abundância ao nível Classe
S = Sedentário, T= Treinado, (● ) = Dieta padrão , (■ ) = Dieta Rica em Carboidratos Simples. a = Significativo
SDRC X SDP; b = Significativo TDP X SDP , c= significativo TDRC X SDRC; d= Significativo TDRC X TDP . *
P<0,05, ** P<0,01 e *** P<0,001. Estatística utilizada foi Two way ANOVA comparação pós-teste Bonferroni.
No nível de Ordem, Figura 18, a dieta rica em carboidratos simples aumentou a
abundância de Enterobacteriales (p<0,05) e o treinamento foi capaz de reduzi-la (p<0,05). Tanto
a dieta rica em carboidratos simples quanto o treinamento diminuiram a abundância de
Fibrobacterales (p<0,01 DRC; e p<0,001 Treinamento). O treinamento e a interação treinamento
e dieta aumentaram a abundância de Aeromonadales (p<0,05).
Figura 18- Análises estatísticas da abundância ao nível Ordem
S = Sedentário, T= Treinado, (●) = Dieta padrão, ( ■) = Dieta Rica em Carboidratos Simples. a = Significativo
SDRC X SDP; b = Significativo TDP X SDP , c= significativo TDRC X SDRC; d= Significativo TDRC X TDP . *
P<0,05, ** P<0,01 e *** P<0,001. Estatística utilizada foi Two way ANOVA comparação pós-teste Bonferroni.
55
No nível Família, Figura 19, a dieta rica em carboidratos simples aumentou a abundância
de Enterobacteriaceae (p<0,05), Helicobacteriaceae (p<0,01), Odoribacteriaceae (p<0,05) e
diminuiu Fibrobacteriaceae (p<0,01). O treinamento de natação aróbico foi capaz de aumentar a
abundância de Bacteroidaceae (p<0,05), Porphyromonadaceae (p<0,05), Lactobacillaceae
(p<0,05), Succivibrionaceae (p<0,05) e diminuiu a abundância Enterobacteriaceae (p<0,05) e
Fibrobacteriaceae (p<0,001). A interação da dieta rica em carboidratos simples e Treinamento de
Natação Aeróbico aumentou Veillonellaceae (p<0,05), Succinovibrionaceae (p<0,05) e diminuiu
Lactobacillaceae (p<0,05).
No nível Gênero, Figura 20, a dieta rica em carboidratos simples aumentou a abundância
de Escherichia (p<0,05), Porphyromonas (p<0,01), Butyricimonas (p<0,01) e diminuiu a
abundância de Lachnospira (p<0,01), Pediococcus (p<0,05) e Fibrobacter (p<0,01). O
treinamento de natação aeróbico aumentou Parabacteroides (p<0,01) e diminuiu a abundância
Escherichia (p<0,05), Lachnospira (p<0,001) e Fibrobacter (p<0,001). A interação dieta e
treinamento aumentou Anaerovibrio (p<0,05), Anaerobiospirillum (p<0,05) e diminuiu
Parabacteroides (p<0,001).
56
Figura 19- Análises estatísticas da abundância ao nível Família
S = Sedentário, T= Treinado, (●) = Dieta padrão , (■ ) = Dieta Rica em Carboidratos Simples. A = Significativo
SDRC X SDP; b = Significativo TDP X SDP, c= significativo TDRC X SDRC; d= Significativo TDRC X TDP . *
P<0,05, ** P<0,01 e *** P<0,001. Estatística utilizada foi Two way ANOVA comparação pós-teste Bonferroni.
57
Figura 20- Análises estatísticas da abundância ao nível Gênero
S = Sedentário, T= Treinado, (● ) = Dieta padrão, (■ ) = Dieta Rica em Carboidratos Simples. A = Significativo
SDRC X SDP; b = Significativo TDP X SDP, c= significativo TDRC X SDRC; d= Significante TDRC X TDP. *
P<0,05; ** P<0,01 e *** P<0,001. Estatística utilizada foi Two way ANOVA comparação pós-teste Bonferroni.
58
6. DISCUSSÃO
A microbiota apresenta uma grande importância na saúde do hospedeiro, sendo que sua
composição pode estar diretamente envolvida no funcionamento do metabolismo do organismo,
assim como na disfunção metabólica que pode contribuir para o desenvolvimento de patologias.
(RIAZ RAJOKA et al., 2017). Os nossos resultados mostraram que a dieta modulou a microbiota
intestinal dos ratos Wistar no intervalo de 15 semanas, atento ao fato de que uma dieta rica em
carboidrato é utilizada como fonte energética por muitos táxons de bactérias assim como para
produção de seus metabólitos (RIAZ RAJOKA et al., 2017). O treinamento de natação aeróbico
também foi uma variável que interferiu na composição da microbiota intestinal. Hoje já se sabe
que o treinamento aeróbico de alta performance interfere na microbiota por produção de
metabólitos por parte do hospedeiro como os neurotransmissores liberados pela ativação do
sistema parassimpático, mediadores das respostas inflamatórias, hipo-oxigenação intestinal e
diminuição da absorção no intestino (BARTON et al., 2018; CRONIN et al., 2015).
Nosso modelo experimental mostrou que a dieta rica em carboidratos simples induziu
aumento da massa corpórea nos animais sedentários na 15° semana, assim como o aumento dos
estoques de coxins dos adiposos inguinal, epididimal e retroperitoneal (Tabela 7). Dados
anteriores do nosso grupo de pesquisa LBBM/DECBI/NUPEB demonstraram que a partir da 4°
semana de consumo da dieta rica em carboidratos simples já se observa um aumento da massa
corporal e os índices biométricos dos animais comparados aos animais dieta controle. Outros
estudos com 8 e 12 semanas se manteve significativo os mesmos efeitos da dieta (BARBOSA
DE QUEIROZ et al., 2017; BOONE et al., 2017; DE QUEIROZ et al., 2012, 2014). O alto
consumo de carboidratos simples pode estar induzindo um aumento na produção de insulina que
propícia a sínteses de novo de triglicérides (TG) o qual também teve um aumento significativo
no grupo SDRC (Tabela 5). O nível elevado da síntese de TG leva ao seu armazenamento nas
células dos tecidos adiposos justificando também o aumento dos coxins adiposos observados no
grupo SDRC (BASARANOGLU; BASARANOGLU; BUGIANESI, 2015; MAKI et al., 2017;
MARDINOGLU et al., 2018; MOCK et al., 2017; PARKS, 2001; PARKS et al., 1999;
STANHOPE, 2016; WONG et al., 2016; YKI-JÄRVINEN, 2014).
59
As dosagens glicêmicas dos animais eutanasiados (Tabela 5), revelou que não há
diferença estatística entre os grupos, porém foi observado que os animais do grupo SDRC
apresentaram uma maior média na dosagem (132,2 ± 10,2 mg/dL). Estudo realizado com ratos
Wistar saudáveis, n=110 animais, mostrou que a média de glicemia desses animais eram 117, 06
± 1,96 mg/dL (DANIELA BRĂSLAŞU et al., 2007). Em outro estudo realizado com ratos
Wistar em diferentes idades, animais com 16 semanas de vida apresentaram a média glicêmica
109 ± 8 mg/dL, n=8 animais (GHEZZI et al., 2012). Por estes estudos, poderíamos inferir que os
animais pertencentes aos grupos SDP, TDP e TDRC estão com os valores próximos com que já
foram descritos na literatura. Em nosso experimento foi realizado a dosagem de insulina com o
kit Rat Insulin ELISA, Thermofisher/ Brasil, porém o mesmo deverá ser repetido uma vez que
algumas amostras por animal não deram leitura.
Foi observado que a dieta e o treinamento de natação aeróbico não variaram
significativamente os níveis de creatinúria: SDP 113,7 ± 19,63 mg/dL (n=3), TDP 97,5 ± 28,83
mg/dL (n=4), SDRC 155,62 ± 31,91 mg/dL (n=4), e TDRC 113,75 ± 26,3 mg/dL (n=4).
Contudo, os níveis de creatinúria estão aumentados no grupo SDRC. Indivíduos que apresentam
quadro diabetes tem maior propensão de desenvolver disfunção renal (DINICOLANTONIO;
BERGER, 2016; WONG et al., 2016).
Durante a experimentação houve uma perda de 3 animais do grupo TDP e junto com a
diretoria do CCA, levantamos a hipótese de que alguns ratos estariam com infecção por
Mycoplasma, uma bactéria causadora de infecção pulmonar (BARRETO et al., 2002), e que isso
teria ocasionado à morte dos animais. Ao nível de espécie, o sequenciamento identificou as
bactérias patogênicas do gênero Mycoplasma e Mycobacterium nas fezes dos animais como
mostrado no Suplementar 6. Dessa forma foram realizadas as análises hematológicas para
averiguar a saúde dos animais (Tabela 6). Foi observado no hemograma que as séries brancas
dos animais não estão alteradas, e de acordo com os dados obtidos estão dentro dos valores de
referência para ratos Wistar machos encontrado nos biotérios das Universidades Federais da
Paraíba e Ceará e Canadian Council Animal Care (CCAC), (CAMILLO SILVEIRA
CASTELLO BRANCO et al., 2011) mostrando assim que o modelo experimental não apresentou
sintomas de infecção.
60
A dieta rica em carboidratos simples apresentou efeito na modulação de algumas
classificações taxonômicas que podem ter contribuído para o aumento do armazenamento dos
coxins adiposos. A dieta rica carboidratos simples proporcionou o aumento da abundância de
táxons pertencentes ao filo Proteobactéria (Suplementar 2), sendo que o mesmo está associado
com desenvolvimento de patologias (ZIJLMANS et al., 2015). A classificação da ordem
Enterobacteriales e sua subclassificação família Enterobacteriaceae são definidas por serem
bactérias aeróbicas facultativas, podendo realizar fermentação da glicose e gerando como
produto da fermentação: fumarato, lactato, acetato, etanol, gás hidrogênio e gás carbônico
(WÜST; HORN; DRAKE, 2011), sendo que os produtos dessa fermentação pode induzir
ativação da adipogênese (MORAES et al., 2014; RIAZ RAJOKA et al., 2017). Foi observado
que a família Helicobacteriaceae, RONG et al., 2016 apresentou um aumento da sua abundância
em ratos submetidos a uma dieta high-fat , os quais desenvolveram obesidade. O gênero
Escherichia, em condições anaeróbica, é capaz de realizar fermentação de carboidrato e, assim,
os seus produtos gerados pela fermentação, podem estar envolvidos na ativação da via da
adipogêneses, (ZHU et al., 2013). A dieta rica em carboidratos simples reduziu a taxa da
abundância do gênero Pediococcus que são bactérias ácido-láticas e, de modo geral, em animais
vertebrados este gênero está relacionado na melhora da microvilosidade e morfologia do
intestino e também na redução da gordura visceral (FERGUSON et al., 2010; HIGASHIKAWA
et al., 2016). As espécies Pediococcus acidilactici possuem atividades contra Escherichia
(RODRIGUEZ-PALACIOS et al., 2009), mais uma vez corroborando com o resultado de
Escherichia estarem aumentadas no grupo SDRC.
O aumento das Bactérias pertencentes ao filo Proteobacteria no grupo SDRC, pode ter
ocorrido pela baixa taxa na abundância de Viruses induzido pela dieta (Figura 15). Nos dados
gerados no Illumina BaseSpace a nível espécie foi possível identificar o bacteriofago Microvirus
Enterobacteria phage PhiX174 sendo que o mesmo é capaz de controlar o crescimento das
Enterobacteria uma vez que, ao se replicar, o bacteriófago pode levar a lise das bactérias
(LEUNG; WU, 2015; MICHEL et al., 2010; ŚLIWA-DOMINIAK et al., 2013). Ou seja, esses
resultados corroboram com nossa hipótese, a dieta diminui a taxa de bacteriófago o que, por sua
vez, levou ao maior número de Enterobacteriaceae.
61
Em relação ao filo Bacteroidetes, (Suplementar 2) a dieta rica em carboidratos simples
aumentou a abundância relativa da família Odoribacteriaceae e o gênero Porphyromonas. Tanto
em humanos quanto em camundongos, um aumento da família Odoribacteriaceae está associado
com inflamação do intestino (LIU et al., 2016; MORENO-INDIAS et al., 2016; OMER;
ATASSI, 2017; WADE, 2013). O gênero das Butyricimonas é conhecido pelo fato de serem
produtoras de butirato, sendo que esse AGCC pode inibir a produção de citocinas, tais como IL-
12 e IL-10 e também inibe a enzima histona deacetilase (HUITEMA; SCHENK, 2018;
KRAUTKRAMER et al., 2017). Ainda, estudo realizado por LEE et al., 2018, mostrou que
camundongos obesos que fazem o uso de metformina, o qual diminuiu a resistência a insulina,
apresentaram aumento significativo no gênero Butyricimonas. Em nossos dados, os animais
SDRC não apresentaram diferença em relação a resistência à insulina pelo TTOG e área total da
curva (Figura 10). Como questionamento, será que este resultado ocorreu devido à interferência
por mecanismos epigenéticos e inibição da inflamação promovidos pela produção de butirato
pelas bactérias do gênero Butyricimonas, levando a inibição das deacetilase e das citosinas?
O grupo SDP apresentou aumento da abundância dos filos Actinobacteria, Synergistetes e
Fibrobacteres. (Figura 16); nas classes Actinobacteria e Fibrobacteres (Figura 17) na ordem
Fibrobacterales (Figura 18); Família Fibrobacteraceae (Figura 19) e nos gêneros Lachnospira e
Fibrobacter (Figura 20). De acordo com dados da literatura, todos esses níveis taxonômicos são
caracterizados por se tratarem de bactérias que utilizam fontes alimentares ricas em fibras o que
corrobora com os nossos achados já que a dieta padrão apresenta maior concentração de fibras na
sua composição, sendo o dobro encontrado na dieta rica em carboidratos simples (BERTINO-
GRIMALDI et al., 2013; BRIONES; COATS; BRINKMAN, 2014; DAVIS et al., 2012; DE
FILIPPO et al., 2010; HENDERSON et al., 2015; KOIKE; KOBAYASHI, 2001; MANDAL et
al., 2016; MARCHANDIN et al., 2010; MATHERON et al., 1996; NEUMANN;
MCCORMICK; SUEN, 2017; PANASEVICH et al., 2015). A fermentação das fibras leva a
produção de AGCC que se ligam aos receptores FFAR2 e FFAR3 e induz a produção de
hormônio como o PYY a qual pode diminuir a motilidade intestinal de modo que favorece maior
tempo para uma completa fermentação das fibras promovido pelas bactérias (EVERARD; CANI,
2014; MORAES et al., 2014). Os animais TDP foram favoráveis à diminuição dos mesmos
62
grupos taxonômicos aumentado pela dieta padrão, pois o exercício aeróbico pode aumentar a
motilidade do trato gastrointestinal através de uma alta produção de peptídeo vaso intestinal
(VIP) e prostaglandina podendo causar aumento da secreção intestinal e diarreia (LIRA et al.,
2008). Portanto, os nutrientes alimentares como as fibras permanecerão por menos tempo no
intestino para ser degradadas e fermentadas, podendo assim contribuir para o menor crescimento
desses microrganismos.
O treinamento apresentou eficiência na redução do ganho de massa corporal e redução
dos estoques dos tecidos adiposos inguinal, retroperitoneal e epididimal causados pela dieta
(Tabela 7). A literatura aponta os benefícios causados pelos exercícios físicos, entre eles a
redução da massa gorda, (PETRIDOU; SIOPI; MOUGIOS, 2018), o que leva a baixo risco de
desenvolvimento de sobrepeso e obesidade. O treinamento aeróbico exige um maior consumo de
energia que induz a queima dos ácidos graxos pela sua oxidação revertendo assim à diminuição
dos índices antropométricos (CORREA et al., 2015; KEATING et al., 2015; KOCH; BRITTON;
WISLØFF, 2012; PANISSA et al., 2016; STAIANO et al., 2017). O treinamento também foi
capaz de aumentar significativamente o tecido marrom no grupo TDRC (Tabela 7). Estudos
realizados em roedores mostraram que o treinamento induziu produção de mitocôndria por
biogêneses a qual apresentou maior expressão gênica de UCP-1 e consequentemente levou ao
aumento do tecido adiposo marrom (SEPA-KISHI; CEDDIA, 2016; STANFORD;
MIDDELBEEK; GOODYEAR, 2015).
O treinamento pôde reverter parcialmente os efeitos causados pela dieta e entre esses
efeitos está a redução da taxa de abundância das bactérias que se apresentaram aumentada pelo
consumo da dieta rica em carboidratos como: ordem Enterobacteriales, famílias
Enterobacteriaceae e Helicobacteriaceae e o gênero Escherichia, sendo todas essas classificações
pertencentes ao Filo Protobacteria. Trabalho realizado com ratas mostrou que o exercício de
corrida de alta intensidade foi capaz de diminuir a abundância de bactéria relacionada com o filo
Proteobacteria (LIU et al., 2015). Uma hipótese que pode corroborar com a diminuição do
agrupamento das Proteobactrias é que o exercício proporciona uma variação do fluxo sanguíneo
afetando a oxigenação e fluxo de hormônios e metabolitos que percorre o intestino, desse modo
63
favorecendo o crescimento ou o não crescimento da taxa de determinados nichos de micro-
organismos (CAMPBELL; WISNIEWSKI, 2017; DENOU et al., 2016b).
O treinamento aeróbico foi capaz de aumentar o filo Bacteroidetes e diminuir a razão dos
filos Firmicute/Bacteroidetes. Segundos dados publicados, existe uma relação de maior
abundância de Bacteroidetes em humanos e animais de fenótipos magros assim como os que
fazem prática regular de exercícios ou praticam esporte. (CORTEZ et al., 2018; COX-YORK et
al., 2015; KASAI et al., 2015; TSENG; WU, 2018). Estudos usando camundongo ob/ob, o qual
não codifica o gene da leptina e desenvolve obesidade, mostrou que a taxa
Fermicutes/Bacteroidetes é aumentada nesses animais, e nos camundongos que realizaram
exercício essa razão diminuiu, assim corroborando com os nossos resultados, nos quais
observamos que o treinamento proporcionou aumento do filo Bacteroidetes. Esse aumento
podeestar relacionado à prevenção do desenvolvimento e instalação da obesidade. (DENOU et
al., 2016b; MORALES MARROQUÍN, 2017; TSENG; WU, 2018). A nível família, as
Bacteroidaceae e Porphyromonadaceae tiveram aumento significativo dentro do filo
Bacteroidetes (suplementar 3). O gênero das Parabacteroides (suplementar 3), também presente
no filo Bacteroidetes, apresentou aumento da abundância no grupo TDP e a espécie
Parabacteroides. goldsteinii têm correlacionado efeitos probióticos contra o desenvolvimento da
obesidade. (WU et al., 2018).
A interação dieta e treino aumentou o índice de adiposidade quando comparado com o
grupo TDP, (Tabela 7). A microbiota dos animais TDRC aumentou a abundância do
agrupamento de subtáxons que estão interligados hierarquicamente nos mesmos grupos da classe
Gammaproteobacteria, ordem Aeromonadales, família Succinivibrionaceae e o gênero
Anaerobiospirullum quando comparado com TDP. Os mesmos táxons fazem parte do filo
Proteobacteria (Suplementar 5). O aumento da Gammaproteobactéria está relacionado com
ganho da adiposidade e obesidade (CANI et al., 2012; DELZENNE; CANI, 2011; DELZENNE;
NEYRINCK; CANI, 2011; EJTAHED et al., 2018), e os agrupamentos taxonômicos citados
acima podem realizar fermentação da glicose e seus metabólitos favorecer a adipogêneses (CANI
et al., 2012; DELZENNE; CANI, 2011; DELZENNE; NEYRINCK; CANI, 2011; EJTAHED et
al., 2018). Sendo assim, esses dados podem explicar, pelo menos em parte, o fato do grupo
64
TDRC ter apresentado um maior índice de adiposidade quando comparados ao grupo TDP
(Tabela 7).
Também, a interação treino e dieta, favoreceu o aumento da taxa de abundância da
família Veillonellaceae no grupo TDRC, assim como o gênero Anaerovibrio pertencente à
mesma família (Suplementar 4). Mell et al (MELL et al., 2015) realizou um estudo com
modelos de ratos Dahl onde foi feito uma troca de microbiota entre animais hipertensos e
normotensos. Como esperado, a linhagem normotensa após a troca de microbiota passou a ser
hipertensa e a linhagem hipertensa se normalizou. Segundo o estudo, a família das
Veillonellaceae foram as que se apresentaram como a principal evidência dos constituintes da
microbiota que pudesse afetar o aumento da pressão sistólica. Esse estudo corrobora com nossos
dados, sendo que o grupo TDRC teve um aumento da pressão sistólica (Tabela 8) apresentando
estatisticamente significativo quando comparado com grupo TDP.
Já a família Lactobacillaceae apresentou diminuição da sua abundância no grupo TDRC
quando comparado com grupo TDP (Figura 37), as Lactobacillaceae fazem parte do grupo de
bactéria produtora de ácido lático e apresentam muitas vantagens como efeito probióticos,
induzindo a mitigação da intolerância à lactose, imunomodulação, resistência a ácido biliares e
produção de bacteriocinas (TURPIN et al., 2012). Também, a interação dieta e treino diminuiu
abundância de Parabacteroidetes, no grupo TDRC quando comparado TDP (Figura 20). Estudos
apontam que espécies deste mesmo gênero são usadas como probiótico apresentando efeitos
positivos sobre a obesidade (WU et al., 2018).
De acordo com os resultados obtidos no dendograma, os mesmos revelaram que as
amostras estão bem próximas quanto sua composição microbiana nas diferentes
subclassificações taxonômica embora as amostras 5 SDP, 7 SDRC e 28 TDRC foram as que
apresentaram maior divergência comparadas as demais amostras. Uma possibilidade que
provavelmente poderia explicar a variação na composição das bactérias intestinais dos três
animais em relação ao restante, pode se ter dado ao fato deles serem proles de progenitores
diferentes, nisso ocorre duas grandes variáveis como o período pré-natal e amamentação que
65
podem ter interferido na composição da microbiota. (HOOPER; LITTMAN; MACPHERSON,
2012).
As variáveis testadas nesse trabalho como a alimentação rica em carboidratos simples e o
treinamento físico aeróbico, mostraram que foram eficientes na modulação da microbiota, sendo
que a dieta rica em carboidratos simples favoreceu aumento na taxa da abundância de táxons
relacionados ao filo Proteobacteria que está interligado a vários estudos no desenvolvimento de
patologias como obesidade (Figura 21). O treinamento foi capaz de reverter parcialmente à taxa
de abundância dos mesmos táxons aumentada pela dieta. O treino também foi benéfico para o
aumento da taxa de abundância de táxons de bactérias que apresentam efeitos probióticos.
Todavia, embora o treinamento aeróbico tenha sido benéfico para modulação do microbioma, a
associação treinamento e consumo da dieta rica em carboidratos simples mostraram que o
exercício sozinho não foi capaz de manter a abundância de bactérias com efeitos probióticos e
não foi capaz de diminuir a abundância de alguns táxons associados com patologias como
hipertensão e adiposidade (Figura 22).
66
DP= Dieta Padrão, DRCS= Dieta Rica em Carboidratos Simples, SDP= Sedentário Dieta Padrão, SDRC= Sedentário Dieta Rica
em Carboidratos simples. A dieta rica em carboidrato simples modulou a microbiota a ponto de favorecer o aumento dos tecidos
adiposos. O treinamento de natação aeróbica foi capaz de reduzir a abundância dos táxons favorecidos pelo consumo de ambas as
dietas.
Figura 21- Resumo do efeito da modulação do microbioma influenciado pela dieta e seu impacto no modelo
experimental e efeito da interferência do treinamento
67
Figura 22- Resumo do efeito da modulação do microbioma influenciado pelo treinamento e interação com a dieta
TDP= Treinamento Dieta Padrão, TDRCS= Treinamento Dieta Rica em Carboidrato Simples, DP= Dieta Padrão, DRC= Dieta
Rica em Carboidrato. Associação DRC mais o treinamento de natação aeróbico favoreceu aumento do índice de adiposidade
comparado TDP. Também no grupo TDRC, diminuiu o gênero Parabacteroides e Lactobacillales a qual apresentam efeito
probiótico. A família Veillonellaceae pode estar envolvida no aumento da pressão arterial no grupo TDRC comparado TDP.
Observação: Os táxons sublinhados de vermelho pertencem à mesma subclassificação.
68
7. CONCLUSÃO
O consumo da dieta rica em carboidratos simples possibilitou aumento da adiposidade;
Todavia a modulação da microbiota intestinal provocado pela dieta permitiu o aumento na taxa
de abundância de agrupamento de táxons pertencente ao filo Proteobacteria cujo produto da
fermentação proveniente da fonte de carboidrato favoreceu a adipogênese. Entretanto, o
treinamento de natação aeróbico foi eficiente na redução da taxa de abundância dos mesmos
táxons e possibilitou o aumento de bactérias probióticas reduzindo assim o efeito da adipogênese
provocado pela dieta.
A composição da dieta padrão, a qual possui o dobro de fibras na sua composição
comparada a dieta rica em carboidratos simples, pôde favorecer o aumento da abundância dos
filos Actinobacteria, Fibrobacter e Synergistetes e o gênero Lachnospira pois todos esses níveis
taxonômicos são bactérias que fazem fermentação de fibras. O treinamento diminuiu a
abundância dos mesmos grupos, pois o treino pode induzir mecanismos que aumenta a
motilidade do trato gastrointestinal e não permitiu que as fibras alimentares permaneçam em
tempo suficiente para sua completa fermentação.
Não obstante, a interação treinamento de natação aeróbico e dieta rica em carboidratos
simples mostraram que só treinamento não é totalmente eficiente para manter abundância de
táxons com efeitos probióticos e reduzir grupos de bactérias que apresentam propriedades nas
disfunções do metabolismo, por isso, para uma modulação mais benéfica a saúde do hospedeiro é
importante à prática de exercício físico associado com uma dieta equilibrada.
69
8. PERSPECTIVAS
➢ Quantificar insulina no soro dos animais para confirmar se a dieta induziu resistência à
insulina (IR) seguido dos testes índice de Homa Beta e resistência à insulina.
➢ Realizar teste de predição metabólica usando o programa PICRUST
➢ Avaliar a concentração de AGCC e vitaminas tanto nas fezes quanto no soro do animal.
➢ Realizar (qPCR) de genes citocinas inflamatórias, hormônios e receptores do hospedeiro
localizados no tecido intestinal dos animas para tentar elucidar possíveis mecanismos que
a dieta e o treinamento estão modulando a microbiota.
70
REFERÊNCIA
ACHESON, K. J. et al. Glycogen storage capacity and de novo lipogenesis during massive
carbohydrate overfeeding in man. The American Journal of Clinical Nutrition, v. 48, n. 2, p.
240–247, 1 ago. 1988.
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86
SUPLEMENTAR
Suplementar 1- Identificação dos animais por grupo
SDP (Sedentário Dieta Padrão), TDP (Treinado Dieta Padrão), SDRC (Sedentário Dieta Rica em Carboidratos simples),
TDRC (Treinado Dieta Rica em Carboidrato simples). Os números destacados em vermelhos correspondem os animais
que foram perdidos durante o experimento.
Grupo Animais
SDP 1 5 9 13 17 21 25 29
TDP 2 6 10 14 18 22 26 30
SDRC 3 7 11 15 19 23 27 31
TDRC 4 8 12 16 20 24 28 32
87
Suplementar 2- Resumo simplificado do efeito da dieta rica em carboidrato simples no microbioma de ratos Wistar partindo do seu filo classificatório
88
Suplementar 3- Resumo simplificado do efeito do treinamento de natação consumindo dieta padrão no microbioma de ratos Wistar partindo do seu filo
classificatório
89
Suplementar 4- Resumo simplificado do efeito do treinamento de natação especificamente sobre efeito da dieta rica em carboidrato simples no microbioma de ratos Wistar
partindo do seu principal filo classificatório
90
Suplementar 5- Efeito da interação dieta rica em carboidratos simples e treinamento de natação aeróbico no microbioma de ratos Wistar partindo do seu filo
classificatório
91
Suplementar 6- Lista de possíveis bactérias patogênicas encontradas nas fezes dos ratos Wistar, assim como número de cópias do DNA identificadas no
sequenciamento em cada animal
Espécies/
Animal
31 28 24 20 18 15 14 12 13 10 11 9 7 6 5 4 3 1 2
Mycoplasma
verecundum
1 9 2 4 0 0 4 1 4 5 1 1 6 2 3 1 2 3 2
Mycoplasma
timone
0 1 1 1 1 0 3 0 7 6 3 6 2 4 3 2 1 6 2
Mycoplasma
haemominutum
0 0 2 0 2 1 0 0 2 3 10 7 0 5 3 3 0 3 0
Mycoplasma
lipophilum
1 2 1 0 1 0 4 0 0 7 0 2 1 1 1 1 0 7 0
Mycoplasma
coccoides
0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 2 2 0 2 0 0 0 3 0
Mycoplasma
sualvi
1 1 10 52 3 67 17 1270 186 54 3432 11 10 6 1 19 1 0 2
Mycoplasma
insons
2 10 2 8 3 7 10 2 4 25 6 26 14 18 31 6 4 31 3
Mycoplasma
iguanae
2 9 0 1 2 1 5 3 3 5 13 4 44 8 28 2 12 13 0
Mycoplasma
edwardii
1 7 2 3 3 7 5 3 4 9 6 3 5 5 5 2 6 12 6
Mycobacterium
simulans
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1
Mycobacterium
crocinum
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
Mycobacterium
tilburgii
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0
Mycobacterium
senuense
5 8 16 3 8 14 8 5 5 10 7 17 20 14 8 11 11 17 16
92