vitamins book chapter
DESCRIPTION
Vitamin ProductionTRANSCRIPT
������������ ���� ���
��
�������� �� �������������������� �������������������� ������
��������� ����
�������� ���� �� ����� �� ������ � ���� ������� ��� ��� ���������� ����� ����� ��� ������� �������� ��������� ��������� ��������� ����� ��� ������� ��� ��� �� ���� ����� ���������� ���������� ���� ���� ��� ����� !��"�� ��� ���������� ���� ���� ���� ��� #$%$�� ��������� ���� �� ������� ��� ������ �������� ��������� ����������� ���� ����� ����������������� ���� ��� �������� ���� ���� ���� ��� ������� ���� ��� ���������� ��� ��������"���� ���������� ��� ���� ���� ���� ����������� ��� ������� ����� �������� ������������������ ����� ��� �������� ��� ������ ���������� ��� ��� ���������� ��������� ���� ��������"��� ��� ��������� &���� ���� ��'������ ��� ��� ����� ������� ���� ������ �( ���� ��� ��������� ��� ����� ��� � ���� ��� ����� � ���������
��������� ���� �������� ����� ���� ������� ������ ��� ������ ������������ &��� ��)�������� ��������� �� ������������ ��� �������� ��� �������� *� ���� �������� +�� &��� �����)�������� ��������� ���� �������� ,��- ���� ��������.�� �������� ,�� -������ ��� ��� � � ��.�� �������� ,�� -������.�� �������� ,�� -�����(���.���������,�� -��������� � � ��.�� ��������,�� -��� ��.�� �������� ,�� -���������.�� �������� ,�� -�������.����� �������� �� -�� ���� � � ��.�� /��)�������� ��������� ������� ����� ������� ��������� ���� �(����������������)����������������� ������� ������ �������������������������������������������������/��)�������� ��������� ��� ��� ������� ��� ��� ������ �������� ��� ���� ����� ���� ���������)�������� �������� ������ ��� ������� ��� ���� �����
��������� ����� �������� ��� ���� ��� �� ������� �� ������� �� ����� ��� ��������� -����� �������� �.������(������� -����� �������� �.�� ���� ���������� �� ���� ���������� ���� ����������� �� ���� ���� ������������� ���� �������������� -����� �������� *.�� &��� �������� ������� �� ��������� -����� ,� ����(��������.� �� ������ ��� �� ������� ��� ��"���� �� ���� ���)���� ����� - ���"����.� ����� � �� �� ��������� ���� ����������� ��� ������������0���� � ����� ��� ���� �� �� ��������� ��������� ���� ������ ����"������������� �������������� ����������������������� ����� ���"�������� ����� ���� ��������
��� ��������������������������
�������� ��"������ /��� �(������ ��� � � ��� ������� �������� ����� �� ����������� )��������� ��������� ���������� )� ��� ���� ����
!����� "��#$���%���
1���� �� ���� ��������� ��� ��� ����� ��� ����� ���� ������� ���� ���� &���� ��� ����� ��� ���� ������������"���� �������� *� � ���� ��� ������� ��� ���� ����2� �������� �������� *� ���� ���������� *���� ���������&������������� ���� ���������) ������������ ������� ����������� �����&�������� -�������,�.� ��� ����� ��� �������� �������� �������� ������ ������ �������� ����� ������ -��� ������ ���.�� �����������������������������������3��� ����������������� �����������������-�����������������������.���� ��������������� ������������������������������������������������������������������������� �� ��� ��� ����� ��� ������ ���� ���� �������� ����� ����� ������� ����� ���� ������ ������� ���� ��� ���������� � � ��� ���� ������� ����� ������ ������� ������� �������� ����� ���������� ������4�� ������ ���������������/������� �������������,�� �� ����������������-��������������.����������� ������������)������ ������� ���� �������� ���������� ���� ������������ ,������ ����� ������ ������������ ������ ������������� ������ ������ ���� ����� ���� ����� ���� ��� �� ��� � � ���� �������� ,��� ��� ����� ���������� ���������� ��� ���������)������������5���������������� ������������ �� ������������������������������ ������ ����� ����������� ��������� �������� ���� ������4�� ������� �������� ���� ����� ����� ���������� ����������� ���� ���� ����� ���� ��� �� �������� ��� �(������ ��� ��������� ��� ��� ��������� ���� ��� �������� ��� 5���� ���� ���� ��� �� �������� �� �� ����� ������ ����� ����� �������� �� ��� ����� ������������������������������6� ������ �������������+��� �������� �����,���������������� ������� ��������������������� ����������������,������������������������� ��� ������������������� ����������� ���� ������ ����� ���������� �������� ��
&�%� �����'����� �����#$���%���
*��� ��������� ��� ��� �(��� ���� ���� �������� ���� ���� ���� ��)�������� ��������� ���� ����� ���� �� ����� ��������� �������� � �� ������� 3������� ��������� �������� ����������������� ��� ���� ����������� ������ ����� ���� ���� ���� ������ ��� !���������� ��� �� ���� ��������� ���� �( ��������� ���� ������ ���� ��� ����������� ������ �� ��� ������� ���� ���� ��� ������� ��� ���� ��� ���������� ��� ����(��� ������� �������&������� ����������������)������������������������� ��������� �������������������� &���� ���� ���� ��� �� ������� ��������� ��� ������������� ������ �� ������ ����� ����� ������� ���� ������� 1� ������� ���� ����� ��� ����� ������ �������� ��� ����� ���������� �� �� ��� �������� ,���������� ,��� �������� ,��� ���� �������� ��
/������������ �� ���������� ������� ��� ������������ ��� ���� ��� �� ������ ��� ���� ���� ����� �� ������������������� ������ ����������������������� ����������������"��������������������� �������������� � ������������ ���� ��� �������� ���������� ����� ����� ����� ��� ����������� �� ���� ���� ������ ���������� 7���� �� �������� �� ����������� ����� ��� ���� ���� ����� �� ��������� ��� ������������� ���'���� ���� ������ ��� &����� #�
������������ ���� ���
������ �� �� �� ������� ����� �� � ���� � ��������� ��� ��������� ��� �� ���������
�������� ��� �� ���� ����
����������� ���� ��������� ��� ����� � ������ ����� ��� ��� ���� ������� ��� �������� ��� ��� ���� ��
!��"���� ��� ��� ���� �� � ���������� #�$!��� ��� ��� ���� � ����� ������ %�����&� ��� ��� ����
����'��&��� &���"��� (� ����������� ���� �!)���� *� +,��-��� ���� � ������ � �� .������ ��� ��� ���� � ����� ������� �/00 1�!2��� ��� ��� ���� �� � � ����� /��3� ��� ��� ���� � ����� ��� ����� +,!��� *� #���-3� ���� �4++� ����������� ���� �������� +,!��� *� #���-3� ���� � ��� � ���� �� (!33���� *� ��33�� ��� ������� ������ ���� ����� ���5!"�� ��� ��� ���� � ��� � � � � ��,"���� ��� ��� ���� � ��� � ���������� ���$� ��� ��� ���
6���"��� (� �������� �������� ��� %�33���� ��� ��� ��� ������� ������ ����� � 1!�3�-�2+,����� ��� ��� ��� ���� ����� ��� ��� ���0
6���"��� (�� ��������� �� ������ �� ��� ��� ��� ���� ������� ������ ������� 1!�3�-�2+,����� ��� ��� ��0 ����� ������ 378 �������� ��� ��� ���� ����� ���� ������ $�&��� ��-� (���9��-� ��0 ������� � ������ 4!���� ��� ��� ���� � ����� ��� ������ /�������� ��� ��� �:� ������� ������ ���������� ;�� ��� ��� ��� � ������� �� ������� %��)!��� *� !��3,�!"��� ����
�3<����<� �<�-� 6���"��� + ������ �� � � .�,���33� ��� ��� ��� !�������������� "��� �� !��3�9�� ��� ��� ���: #$%� &'()$ � ������� ���"� � ������� ��� ��� ���� �� "���� � ���� � � =��'��� ��� ��� ��� ���������� ������� =��'��� ��� ��� ��� �� � ������� �� =��'��� ��� ��� ��� ������ � �� �� 4���$�"�� ��� ��� ���
��� ��������������������������
&���$�(�����
�������� ,�� ��� ���������� �� ������ ��� ���� �� �������� � �������� �� ������ ����� ���� �(�������� � ������������� ���� ������ � ����� 8�� ��� � ����� ���� ��� ���� ���� ���� ���� �������� ����(� ���������������� ���"�������� ����������������� ��������-/1 .����������������������� ��������-/*�.���� ������������ 8�� ����� �� ���� ����� ��� ������� ������������ ���� ��� ��'������ ��� ���� ����������� ������ ������� �������� ������������� ���� ��������� �������� ,�� ���� ��������� ��� ���� ���� ��� #$99���� ���� ����� ��������"��� ��� #$9:�� ����� ��� ���� ����� �� �������� ,�� ��� ������ ��� /���� #�
������������� ������� ����� ���������������������������� ����������� � ���� ���������������������������� �������� �� ������������� �� ������� ����������� ����� �� �� ��� ����� ���� ���� �������������� ������������ �������� ��� ����� ��� ���� �� �������������������� ������������� ��������������������� &��� ������� ��������� ���� ����� ������ ����� �������� ��� �� ������ ���� �� �����4�� ���� ������ ���������� ���� ��� ������� �� ��� ��������� � -��� �����.� �������� ���������� ���� ��� ���� �� ��������������� ��� �� ����� ���� � ���� ��� ���� �� ���������� ��� ���� ���� ���� ����� ������ �������&��� ���� ��� ������,*3/�������������������������3�����+��������� ������� ����"������������������� ����� ������ ����� ���� ���
1�������� �� ������ ������������ ��� ��������"�� ���������� ���� ������������� ����������3����� ������� ������ ���� �����)����� ����� ���� ����� ��� �������� �� ���������� ������ �� ����� ���������� ���������� ��� '���������� ��� �� �( ���� ������ ��������� ��� ��'����������� &���� ���� ������� � �������� �������� ��� ������� ���� �������� ��� ���� ����������� � ����� 1���� ��� ��� -%;;9.� �������� ������������� ����� ���� ����� ���� ��� ������ ������ � �������� ���� ����� ������ ��� ������� ���� ��� ����������� ����������<;=��������������0����#%:��>7�������� ������������ ���������������� ��������:;� �>7� �������� ���� ���� ������ ����� ���� �������� ���� ���������� �� �������������� #�#%� �>7�� ��� ������������#�?)��������������� ����������� �������������0������ ������������ ����������� ������������ �������� ���� ��� ������� ���� ���� �������� � ������� ���� �� ����� ������ ���� �� ��� ������������� ��������������� ����*��������������������� ��������-%;;<.����������������� ����������������
N
N N
NH
O
OH
OH
OH
HO
O
����� ��� ������� �� ���� �� ��� ������� ��
������������ ���� ���
���� ����� ������� ���� ��� ������������ � �������� ���� ����� ������ ��� ������� ���� ��� ���� ������� �������������������&����������������� ����������������#�:���������������������� ���������������� ���� ���� �����+��������@�+�������� -#$$A.� �������� ���������� ���� ����� ��������������� �������������� ������� ����������������������� ����&��������� �������������������������� ������������������������ �� ������������� �������������� � ��� ���������� ����������&���� �������� ����� �� ������ ���� � �� ��� �� ���������� ��� ���� ���������� ���� ����� ��� �� ������� ���������� ��������� �������������� �����6� ����������� ��������������� ������������� �� ���-<?�#=.�������� �� ���-9#�:=.���������� �� ��� -#B�$=.���� ������������� ���� �������������� ��������������� 8������������ ���� ������ ����� � ���� ����� ���� ������� ������ ��� ��� -#$$B.� ������� ���� ������������ �������� ��� ������� ����������������������������������������������������������������������������������������� ���� �� ����������� ��������� ����������� ���� ����6��������� ���� ����� �������� ��� �� ����������������������%������������������������ �������������� ����������������:��������&���'����������� ���������� ���� ��� ��� ��� ���� ��� ��� ����� ����� B� ����� �� ����� ������������ ����� ����� ����������� ���� 9B$�:� ��>7�� 6��������� ���� ��� ��� ����� ��� ��� ���� ��� ������� B� ����� ������������� ��� �� ��������� ����� ����� ��� ��� ���� ������ ������� ����� ��� ����� ��������
&�!�$�(�����
��������,������������)���������������������� ��������������� ��������������� �������������(���-! .�� �����(��� -!7.�� ���� �����(������ -!1.�� !�����(��� �������� -!7!.� -/���� %.� ��� ���� � �������������� �������� �� ��������������� ��������������� ����������������� ���������������������������������� ���� �� ����(��������� !�����(��� �������� ��� ��������� ��� �� ����������� ���������������������������� ����������� ���������� ����������� ����������� ���������� ���� ����� �(���������1�������� �������������,��� ����� �������������� ������������������������������������ ������������� ����������� ����� ���� �����
8�������������������� ������� �������������������,����� ������ ���������������������(����������3������� �������� �� �� ��� ����������� ������������� ������������� ��������������� ���������� ������������������������� ��!������������������������� ����������,���&������� ������������������������������ �� �������� ,�� �������� �� #=� ��� ����� ;�:=� ���������;�%=� ������ �(��� ��;�#=+C�!D�� ;�;:=� 1�3D�AC�D�� ;�;;#=� 1�3D�AC�D� ���� ;�;;#=� /�3D�AC�D� -C� ?�B.-1���������� ���#$$$.��&��� ����� ���� ��� ��� ��������,������ ���������� 8/D#<BA%���� �� ���� ��:#� ��>7�
����� ��� ������� �� ���� �� ��� ������� ��
HO
HO
OH
N
HO
N
OHHOO
O OP
�� ��������������������������
&�&�$�(������
��������,���-/����9.���������������������������������������������������������������������� ��������� ���� ������ ���� �������� �������� ���� ��� ���� ��������� �� ������� 8�� ����� ��� ��������� ����� �� ���� ����������� ����� � *� ���������� ���� ����� � ��� ����������
&������������������������������ ������������������,�������������6 *������������������������ ��������������)#)������������������������)�6 *����� ������8�� ��� ������������:)������������� �� ���&������� �������:)������������� �� ������� ���������������������������/��������������� �������� �������"��� ��� ���� ��������������� 888�� �� ����(�������� �� ��������������� 888� ������ ��
����� �� ������� �� ���� �� ��� ������� ���
CONH2
CONH2
CONH2H NOC2
H NOC2
H C3
H C3
H C3CH3
AX
B
N N
Co
N NH
CD
CONH2
CH3
CH3
CH3 CH3
CH3
CH3
H C3
HN O
HO
O
OO
N
N
P
O
OOH
������������ ���� ���
���
���
��
���
�
����
��
���
��
����
��
����
��
�
��
���
�
��
�
�
��
���
���
���
��
����
���
����
��
���
��
CO
OH
00
Glu
tam
yl-tR
NA
5-A
min
ole
vulin
icaciu
CO
ON
HN
2
O
HN
2
Chlo
rophyll
Bacte
riochlo
rophyll
Hem
e
Hooc
Hooc
Hooc
Hooc
oooHo
ooH
oooH
oooH
NH
NH
HN
HN
Uro
porp
hynin
ogen
III
Sirohem
e
HO
OCH
OO
C
HO
OC
HO
OC
OO
OH
OO
OH
OO
OH O
OO
HO
H2
H2O
NH
NH
N
HN
Pre
com
in-2
Co
2*
Acata
tcohydo
Acetic
acid
O2
Co
2*
A N A E R O B I C
A E R O B I C
CO
NH
2
HN
OC
2H
C2
HC
2 H2
HN
OC
2
CO
OH
CO
NH
2
CH
2C
H2
CH
2
CH
2
Ado
NN
OCO
2C
H2
OO
NH
2 OO
NH
2
CO
NH
2C
ON
H2
HN
OC
2H
C2 H
C2
HN
NNNC
o
CH
2C
H2
OO
NH
2
CH
2
CH
2
CO
NH
2
HN
OC
2
CH
2C
H2
O
H CH
2
OH
HN
CO
NH
2C
ON
H2
CO
NH
2
CO
NH
2
HN
OC
2
HN
OC
2
HO
HOOO
O O
CH
2
HH
N
OH
HC
H2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2 CH
2
H
HC
2
HC
2
CH
2
CH
2 NC
o
NNN
Ado
Ado
O
H
Adenosylc
obsis
min
Adenosylc
obin
am
ide
Adenosylc
obynlc
acid
��� ��������������������������
���� ������������� �� ������ ���� ������������ ������������ �� ��������������� 888� �������� ��� ������������� �� �� �����)%��*�� �� �����)%�� ���� ���� �������� ��� ��������� ������������� ��������� ������ ������ � �������� �� �����)%� ��� ����������� ��� �� ������� ����������������� ��� ����� �� �����)9*� ������� ��� ���� �������� � �������� �� �����)%� ��� �������� ����� ������ ��� ����� �����)�� �����)%�� &����� ���� �(����)��������� ���� ����������� �������� ��� ,��� ���������� ���� '����� ������ �2� ����(����)����������� ���� �� ���� ������� ������� ����� ���� ���������� �� ������ ����� �� �����)%�� ���������� ��������� ��� ����� ��� ���� �(����)��������� ���� � ���� ����� ����� ����� ������� ��� ����� �����&����(����)������������������'������*&!����� ����������������������� � ������������� ����'�������� ����)������� �'����������� &��� ����������� � ������� �� �������� ,��� ��� ����������� ��� /���� <�
&��� ���� �� ���� ����� �� �������� ,��� ��� ���� ��� ���������� ���� ���� ����� ���� �(�������� ����� ���� �( ��������� ���� ��� ��� ������������ �� ������� ��� ������������� ���������� ��������������� �������������� ���� ���� �������� ����� �� ������ ��� ���� ����� ���� ���� ����� ��������� ,���� &����� ���������� ����� ����� �� �������� ������ ��� ���� ����� ���� ���� ����� ���������,����� ������������������������������������ ��������&����������������� ���������:;�;;;��� #;;�;;;� ������ ����� �������� ,��� ����� ������� ��� ������ ���� �������� 0���� ��� ���������� ���)���� ������������ ��� ������� ����� ���������� ������ �������� � ���������� ��� ���� ����� �� �� �� ������:�?)�����������"�����"���� ���� �����'������� ���� ������� ��� �������� ������� ��� �� ���� ������������ ��������� ��� �������� ,���� &���� ���)���� ������������ ���� ����� ���� ��� ���� ����� �� �������������� ��� ���� ��� ���� ����� �� ������������ ��� ������ /������������ ����� ������������ �������������� �� ������� ���� ������ ���� �(����� ���������� �� ����� ������� ������� �� �(����� �(���"�� ���� ����� �������������������� ��� �� ��������� ��������� �� ������ ��"����� ��� ���� �������
*���� ��� ��� -%;;B.� ������� ���� ������ ������ ������������ ��������(��� �������� ����������� �������*E)AB,� ���� "��� ������� ����������� *E)� B*� ��� ���� �������� ������� ����������� ����� �������� �������� �������� ,������ ������*� ���������� ������������ �� �(��� �������� �������� ,� �������� ������������ ��� 1�"������ ��� ��� -#$BA.� ������ �� ������� ����� ���� �(��F���� ��� ����� &���� ����#�������������� �$���� ��� ���� ���� ����� �� �������� ,�� ������ ��������� ��� ���� ����������
&�)�$�(���
�������� �� ��� 7)�� ���� � � ��� -/���� 9#�:.� ��� ��� ��������� ����������� ��� ����� ������� ����������
����� ��� ������� �� ���� �� ��� ������� ��
OO
H
HO
HO
HO OH
������������ ���� ��
8�� �������� ��� ��� �� ������� ��� �������� ��������� ��� �� ������ ���� ����� ��� ��� ���������� ���������8�� ��� ������� ����� ��� ���� ���������
���������� ������� ����� ������ ����� ���������� ����������������������������������������������8�� ����� ���� ��� ������� �� � ��� "������������ ������������ ���� ����������� ��� ��� ������������ �������� ���������� �� ����"��� ��� ���� -56*3.� �������� C������������� ����� ���������� �� �� ���� ���������� ���� �� 7)�� ���� � ���� 8�������� ��������� ���� � � ���� �� ���� �������� ������� ������� ���� ���� ��� ��������� ����� �������� ��� ������ �� 7)�� ���� � ���� ��� ���� ���� ���� � ������� ��� ����� ����� ������ ��� ������ ��� ���� ��� ������"��� ���)�������� ���� ����� ��� 7)���� ������ ���� ������7)���� ����)#�� <)�� ���� ��� ��������� ����� ���� �� ���� � � ��� -/���� ?.�
�������� �� ��� ����� ������ ����� ������ ��� 6�� ������)5�������� ���������� ��� ��� �� �)��� ������ ������������� ������� ����� ��� �)��������� ��� ��������� ����������� ���� �������� ������ �� �� ��� �������� ���� ����� ��������� ����� ����������� ���%������ &��� ������������ �(���"��� �)����������� 7)��������� ��� �� �����'������� ��������� ��� ��������"������� ���������� ���� �������� � 7)�������� ������� ��������� ��� ���)&)������������)�)7)������������� ��� ��� ����� ����� � ������ ���� �( ��������� � � ��� ��� ���� ������������ ��� ���� ����� �� �� ���� � �������� ��� �� ����� � � ��� ��� ���������&���� ������� �� ��� ����� �(���"��� ��� ��������� ����������� ��� ������� ������� �����(���� ��� ����� ��� �� ���� �������� ��� ��������) ������ ��� ���������*���� ���������� �� ���� ��� ������ ���� ��(������� � ������� ��� ���)&)������������)%)�(�)7)��� ��� � � ���� ��� �� ��� ���������� ����� ����� ����� � ���������������)���� ��������)����������(������������� ���� �� ����&���� ������ ���������������� ����� �� ���� ��� ������ /���� A�
&��� ����� �� ���� �������� ����� ���� 6�� ������� �� ���� ���� ��������� ��� �������� � ��������� ��
����� ��� ������������� ������ ��� ������� �� ��� ����� ��� �����
H
H H
H
OHOH
OH
CH OH2
H
O
L-Gal-DH
NAD NADH
CH OH2
H
HH
HO
OOOH
OHL-GL-DH
cytCON cytCrtd
CH OH2
OHOH
OH OH
H
O
CH OH2
HH
HO
OOH
CH OH2 O
OH OH
H
O
H
H
H
H
H
H
OHOH
OH
O
O
D-Ara-DH
NADP NADPH
O
D-AL-Ox
O2 H O2 2
Pla
nts
L-Galactose L-Galactono-1,4-lactone L-Ascorbic acid
Yeast
D-Arabinose D-Arabinono-1,4-lactone D-Erythroascorbic acid
D-Glucose
��� ��������������������������
#$?$�� 8�� ���� ���)������ �� ����� ���� ���� ��� ��� ������ �� ���� 6�� ������� �� ���� ��� ���� �� ��)� �����)���������� �� ����������� ���������� ������������������������ ���������������������������%)����)7)��� ��� �� ���-G���������%;;#.��&���%)����)7)��� ��� �� ����������� ���� ������� �������� ���� �� 7)�� ���� � � ���
3����������� ��� -%;;:.� ��������7)�� ���� � � ������� ����� ��������������������������������31<;%:� ������ 7)���������� ��� ����������� &��� ������� ���� ��� #�9A�>�� �� 7)�� ���� � � ��� ���� :�>�� �� 7� )����������� 8�� �������� ���� ��� 6��� @� 3����������� -%;;;.� ����� ����� ��� ����� ���� �������������7�)�� ���� �� ��������)��� �������'�������������� ���������������)���� ������� ��������������'�� ��� ��������������� �� ����"��� %)����)7)��� ��� � � ��� ������ �(�������� ������� ��� ���7)�� ���� � � ����H����� ������������ %;�<� �>�� 7)�� ���� � � �������� ����� ��� ���� �(��� �������� �������� �� ���������� ��� ���� #<)���� ������� �� ����� ���� ���� ��� ������ ����� ���� ���� ��������"���� 7)
����� �� ��������� �� ���������� ��� ������� �� � ��������
D-Sorbitol
Fermentation
L-Sorbose
Acetonization
Diacctone-L-sorbose
Oxidation/hydrolysis
2-kcto-L-gluconic acid
Esterification
2-keto-L-gluconic acid methyl ester
Lactonization/isolation
Ascorbic acid
������������ ���� ���
�� ���� � � ��� ���� �)��� ���� -6��� @� 3������������ %;;;.�� 3�������� ��� ��� -#$B%.� ��� ������ ����� ���� ���� ������ ������������ �� ���� ��� %)����)7)��� ��� � � ��� ���� ������ 8�� ���� ����� �����)��� ���� ��� �(���"��� ��� %�:)������)�)� ��� ������ ��� (�)����� ��� ����������� �������� ���� ����������������� �)��� ������ ���� %)����)�)��� ������� 8�� ���� �� ���� ����� �� �������������� ������ �������� %�� :)������)�)��� ������ ��� %)����)7)��� ��� � � ���� &���� ��� ����� ��� �����"��� ��� �� *�!C)��������� %�� :)������)�)��� ������ ���� ������ 8�� �� �������� ���� ��� ������������ ����������� ������������ �� �� ��������������� ���������*�� �%������ ������������������ ����������� ��� ���� ���� �� ���� ����� �� %)����)7)��� ��� � � ��� �����)��� ������ -*�����@�!������ #$$B.�
)�����%"�"�� �����''��*$���%������� �����+#"�%"�������
3������� ���� ��� ���� ������������ ���������� ������ �� �������� ���� �����
)��������,�-.�����(���
)��������
+������������� -#$$<.� ��������C��� ����������������� �� �������������� ��������(����������������� ������ ��� �� ���� ����� ������� ������� ��� ��� �� �������� C������� ������� ����� ����������� �������� C� �� <�:� ���� :�:�� ������ ������� ��� ��� ���������� ���� ���� ���� ��� ������� C� 9�:� ��� B�:�+�������� @� +�������� -#$$A.� ��������� ����� ��� (������������ ������ 667� #9?9� ����� ���� C���� ������� ���� ?�;� ��� ?�:�� ���� �������� ��� ����� ��� ���� ���������� ���� ����� ���� ����� ����*��� ���������C�����?�:����A�;������������������������������ ������������������������������� ���������� ������ ���� ������ C� ?�:� ��� ��� ����� ���� ���� ��� ���� ���� ��"���� � ��������� ��������� ��� ���������� �� ���� ������� &��� C� A�;� ���� ���� ������� ������� ��� ������� ��� ��������� ������������� ������ ���� ������ ����� ���� ��"����� ��������� ��� �������������� ����� ������� ���� � ����� ��� ��������� C� ������ -?�:� F� A�;.�
)���!�����������
3������ ��� ��� -#$$<.� �������� ���� ������ �� �� ����������� ��� �������� ,�� ��������� ��� �������� ������������ ��������� ���� ���������� ���������� ��������� ���� 8���������� ������ ������� ������������ ������������ ���� �������������� *� �� ������ ��� ������������ ����������� ���� 9%� ��� %<I����� ��� ���� ������ �����������,��� ����������J������)������� ��� ��� -#$$<.������"��� �������� ������ �������� ,��� ��� ������ ��� ������������� ����� �� ������� 667� ,9:?$� ��� ���������� �������D������ �������� ,��� ���� ����� ��'������ �� ����������� �� <;I�� ���� ������ � ���������� -;�:� ������������ ��� #;;� ��.� ����� �� C� ������ �� ?�:�
)���&����� �����������
6������������� �������������� ���������������������������������������� �� ���������������� �����
�� ��������������������������
����������������� ��������������������� ���������� � ����������� -+��������@�+��������#$$A.���������� ��� -#$$B.� ������� ������������ �������� ��� ���� ���� ����� �� ���������� ����� ����� ���� ���������������������������������������6������������������������������������� ������������� ��� ��� ������������� ����������� 3����������@�7���������� -#$BB.� �������� ����� ����� ��� ���������� ����� ���� ������������ �� ��"����� �� ���� ���������� ������������� �������� ��� �� ��� ����� �������� ���������� �������� ������ &��� �������� ���� ��� ���������� ���������� ������ �������� ��������������� �� �������������� ��"����� ��� ����� ������ ����� �� ��� ����� ���� ����� �������� ���� ���������������� ����������������������������������� ���� ����"����������������������������������� �� ���������� ��� ����� ��������"��� -������ ��� ��� %;;#.�� 7�� ��� ��� %;;B� �������� ���� �� ��� �� E������������������������"�����"����-�1,8.������������,������� ������������������������������������ ������ ������� &��� �������� ������������� ����� ���� ��������� �� ���� ������ ��������� ��� ��������������� ������� ����� ������ ������ ���������� ���� ������������� �� �������� ,���� *�� �� ��������������� ,#%� ���� ����� ���� �� ������� ���� ?$�9?� ��� AB�%9� K�>���
1������� ��� ��� -#$$$.� �������� ���� �� �� �� ������ ��� ���� ���� ����� �� �������� ,��� !�� ����� ������� �� ���������� ���������� ����� ��� �������� �� ���������� ������� ��� ����� �� �������)3���������)!#������������)G��!��������)3��������(��������� �����������������-?;��>�.� ��������� ���������������� ;�B=� ������ �(��� ��� -B<��>�.��1������� ��� ��� -#$B9.� ����� ����������� ����� �� ������ � ����� �������� ���� ������� ��� �������� ,��� ������������� ��� ���� ������ �������� ���� �������������� ��!�� ��� ���������� :??�� ��� ���������� ���� ��� �������������*+H� #%:#�� &�������������� ����� �������� ������� ����� ������� ������ � ���� -;�;:� =�� ��� ����� ��� ������.�D� ���� ������� ������ � ���� �������� 7)������� � � ��� �������� ����� ������� ���� ���� �� ����������� �� ��(����� ��� ���� ������ ��������
������������������� ���������31�<;%:� ���� ���7)�� ���� � � ��� �����)���������� 7)��������� ���7)������������������������������������������������������ ����������������������31�<;%:����� ��#�9A� �� ��� ������ �� 7)�� ���� � � ��� ���� :�;;� �� ��� ������ �� 7)���������� ������� <� �� �� ������������ ��� 9; �� ������ ���� �������� ���� ��������� ������� :�A;� �� ��� ������ �� ���� ������ D����� ��� ��-#$$A.���������� �����7)���� ���� � � ��� ���� �γ)�� ����� ���������� �� ���� � � ������� ����� ��� ��������� "������������ ������������ ������ ���� ������������ �� ��������� ��������� ������� ����������� ����� �� ����� ��������� ���������������� �������������� ��������� ���������� ����� ��������� �������-�������� �,�!� ?;#%� ���� ?%<%.� ����� ���� ����� �� ���� � � ��� ���� ����� ������� ��� ����� �� ��� ������ ����� �� �� 7)���� ���� � � ��� γ)�� ������ &���� ������� ��� �������� ���� ���� ��� ���� ����������������������������������� ���������������������� �� ����������������� ��������������������������� ����7)���� ���� � � ��� γ)�� ����� ���������� ����� �� �������
/���0�1���"�%��� "����*
����)������� �� ������� ������ ��� ���� �� ������ ���� ���� ������ �� ���� ��� ���� �������� ���� ���� �� ��� ������� ��� ����� ������� ��� ������������ ������� &��� ������ �� ���������� ���� ���� ������� ������ �� ���� ������������ ���� ��� ��� ����� ��������� ��� ������ ����� ���� �� ����� 6� �����
������������ ���� ��
�������� �������� ������������� ��� ���� ������ ����� ���� ��� �������� �������� ����� -�� ��������� �������������� �(��� ������ ��������� ���������� ���� �������.� ��� �� ����� ��� ���� �������� �������������������� ������������ � ���� ���� ��� �� ������ ��� �� ������ �� ���� �������� ���� �� ��������������� ������ ���� ������ ���� ������� ���������� ���� ��� �� ������� �� ���)� ���� ��)������������������������������ �������� ������*�������������� �������������� ����������������������� ����������� ����������� �� ������������������������������������������������ ������������������������ �� ���� �������� ���� �� ����������� �� �������
*��������� ����������� ���� ����� ����� ��� ����������� �� ������� ������ �������� ������ ������� ��������� ����������� ���������� �� �� ��� ���� �� ��������������� ������&������������)����������������� ���'����������������������������������������������������� ��������� �������������)������������������ ���� ������ ������� �� ����� ���� ����������� ���(������� �� ����� D�� ���� ������ ������ ��� ���������������� �� ������� ���� ��� ����������� ���� ���������� ��� ���� �� ����������� ���� ���� ��������������&��� ��� ����� �������������� ������������ ����������� ��� ������������ �� ��� �������������� ���� ������� ���� ��� ����� ���� ��� ���� ���� �� ����� ���� ��� ��� � ������� ��������� �� ��������� �������*� �����)� ���� � �� � ��������� ��������� ������ ����2� ����������� ���������� ������������������� ���� � ���)�� �� �� �� �����)� ���� ���������� �� ���� ��'����� ���� � ����������� ��� ������������ ������ ���������� ����� ��� ���������� �������������� ������1����������� �� ��������� ����������� �����)��'���� �������� ����� ���� ������� �� ����� �� ����� ����������L� ��� �� ���������� ���� ������������� �� ����������� ���� ������ ������� �������� ��� ���� ���������� �� ������������� ��� �������� ���� ���������� ���� ��� ���� ��� ���������� ���� ����� ��� ���� ������� �� �(��� ���� ����������� &��� �������� �� ����������� ��� ���� ����� ���� ��� ���� ����������� �� �� ���� ������ ���������� �� ���� ��)���� �������� ������������)�( ��������������� �������� ����������� ��������������� ��������������������������������������������������������������� ����������������� ���������������!������� ����������� ����� ����� ����� ��� ���� ������ ���� ����� ����������� ��� ���� ����� ����� ���� ��� ��� ���� �������������L��������������� ������������������������������������������� ���� ������� ������������������������ ���������������� �� ������ ����� �����( ������������ �������� ��������&��������������� ������� ��� ��� �(������������ ���� ���� ��������� ��� ���� ���� �� ���� ������������ ���������� ���� ������� �� ���� ���������� �������
/���"2(��,(� 3��(�����
6��������� ��� �� ������� ���� ���� ������ ��� ������������� ����� ��� ��������� �� ���� �� �������������� ������ !�������"������ �� ���� ������ �������� ����� ��� ������� ����� �� ���� ���� ����� ��������� ���������� ��� ���� ����� ���� ���*���� ��������� ���� ���� ����� ��� ��������� ���� ������������ ������ �� ������������������������� ���������������������������������� ������������������� ���������� ������ ������ ��� ��� ��"�� ���� �������������� ����������� 6��������� ��� ����� �� ������� ���� ���)��������� ��� ������ ����������� ���� �� ���� �������
�� ��������������������������
/�!�"2(��,(� 3��(������
/��� ���� �(��� ����� �� �������� ,��� ����� ������������� ���� ������ ������ ��� ��� �'������ ����������� ���������� ����� ��� ������� ��� B;F#%;I�� ��� #;F9;� ���� ��� C� ?�:FB�:�� &��� ���������� �� ���� ��������� ��� ��������� ��� ��������� ���� ������� ������ ��� ���� ���������� ����� ������� ������ ��������&������������������ ��� ����������� ������������� ���������������"�� ������(�������� ������ �������� ���� ��� ���� ��������� �� ����� � � ��� ��� ������ ��� ����� ���� ���� �� �� B;=� ���������� ������������� ����������������� ��������������/��������������������� �� ��� ��'�������������� ���� ��
����� ��� ������ ��� � ��������� ��� ������� ���
Fermentation Broth
Harvesting cells by centrifugation
Extraction (in alcohol) or heat
Purification by adsorption, clarification of filtration
Conversion to cyano form with 0.1% KCN
Feed quality Vitamin B12
Chromatography (eg: Al O )2 3
Crystallization
Food quality Vitamin B12
������������ ���� ��
����� ���� �������� ��������� ��� �(��� ���� ����� ������ � ���������� �� �� ��� ������ ����� ��������� ������������������� ������������� ����������������������� � ���������� 8������������ ������������ ������� �� ��� ��� ���� �( ��������� ���������� �(����� ��� � �������� ������ ��� ��� ������ !���� �������� ,��
������������������ ��������"����������� ��������������������� � ���������� �� ����������� ����������&��� ����� ��� ���� ����������� �� ������� ��� ���� �� ������ �� �������� ,��� ���� �������"��� ��/���� B�
*� ������� �� �������� �������� ,���� ������ ����������� �����(� ����������� ��� ���"���)����������� ,��� ��� �� �������� ���� ����� �� �������� ��� �'������ ��������� ���������� �������� ,��������� ����������� �����(� ����������� ��� ���"���)���� �������� ,���� ��� ��� ������� �� :;)9;;�>7� ��� �� ����������� �� :;� F� B; �L� ������� �������� �� ������ �������� ���� � ������� ���� ���� ������� ����� ���������� �� ����������������� �������� ������� ���������� ������� ������� ��������� ��� �� ���� ��������� ��� ��� ������� �� %;� ��� A;������=� ������ ��� ���� ����� �� ����� ��������� ������������ ��� ���� ���������� ���� ��������� ��� ��������� ������"�������� ���� ����������� ����� ���� � ����������������������������������������������������� ������� ����������������� ����������������� ����� � ���������� �� ����� ��� �� �����(��� �� ������������ �� ��L����� �������������������������������������:�F�%: ���� ���������������,���������� ����������������(� �������������� ���"���)�����������,��� ��� ��������"��� -C�������� ��� ��� #$$$.�
4�5���������$""���%������#$���%���
��������� ��� ��� '�������������� ���������� ��� �������� ��������� �� ������ �� ��������� ��� ������ ������� ������� ������ C!7�� �������������� ��� ����� ������� ���� ��� ���� ����������� �� ���������
4���"�(���(� 3$�(������
����������� �� �������� ,��� ��� ��� ���������� ��� �������� �� ������
4������ ���� ���� ������
*�������� �������� ,��� ��� ��� �������� ������� ����� ����� �� ��� �� ��� ��� ������ ���� �� ��������� ��������� �� ������ ��� �������� ��� �� ��� ��� ����� ����� ���� � ����� ���� �������� �� ���� �� �� ��������� ����� ������ ��� ����� ����� ��� ���� ����� �� �� ������� ���������� 8� ������ M����� ���������N� �������������� ��� ������� ������� ������ ��� �� ������� ���� ���� �������� ���������� ��� ������ ����������� ���� ���� �������� ��� '��������� ������������ �� ���� ����� ���������� ��� �������� ���������� ��� �������� ������ ����� ���� ����*���� ������� ���� �������� ���� ��������� ��� ����� ������ ���� ������� �������������� ��� ���� �� ���������� �� ���� ���������&��� ������� �� �������� ������� ��� ��� ������������� ���������� ���� ���������� ���� ��� ��� �� ������� �� �� ������� ������� ��� ��� '������������ ������ ��� ����������� -����� �� �� � � ��.�� !�������� ������� ����� �� ���� �������� ���������� �� ������ � ������������ ��� ����������� &��� ����� ���������� ��� ��� ������� ��� �� ��)8�� ����),����� ���� �� ������� ��%;� ������ ��� 9AI���&���� ���� ������� ��� ���������� ���� ������� ������ ����������� ��������� ��� ���������� ��������� ��� �� �� ������� ����� �� #;�� �� �����>���� 3������ #;;� ��� �� ������ ���� ��������
� ��������������������������
-�������� ,��.� ��� #� ������ �� ������� ���������� ������ - ������2� #;;� � �>��.�� ,����� ����� ����� ��� ������������������������#;;��>��������������������� ������������/��� ������������������� �� ���������������� �� ���� ��������� ��� ����� ��� �������� ������ �� ��������� ����� ����� ������ ���� ������� ���� :�;� ��� ����� ������� ���������� ������� ,�� ������� ��������� ��������� B9� �� �� ����������� �������,��� -+�����������.� *����� ,����� ��������� ����� %� ��� &����� B;� ��� #� ������ ������� ���������� ��������� �� ���� C� ���� ���� �� �� �� ������� -?�;� ��� %:I�.�� *��� :� ��� �� ������� ������� ��� ���� ���������� ����� �������� ������ ��� ������ �� ���������� ����� ����� ��� ���� �������"�� ��� ���� ������� -#;���� ��� ##:I�.�� *���� ������� ��� ������ ���� ����� ������ -����� ���� �������� �������.� ����� #� ����� ��� �������� �������� 8� ������ ��� %<� ������ ��� 9AI��� &��� ��� ��� �������� -D�.� �� ���� ������ �������������� ������������������������� ��������:<?���������������� ������� ��������*� ���������� ����� ��� ����� ��� ������� ���� ���������� ������� ��� ���� ������� ��������� ��� ���� ������������ � ����������� �� �������� ��� ���� ���������� � ��� �����
H������� ����� ����������� ���������� ���� �� �� )� ����� ������ ��'�������������,����D ������� ��������� +������������ ������������ ���� +�� ������� ���� ������� ����� ��� ������ ���� ���������*������� �� (������ ��'������� ��������,�� ��� ���� �� ���������� ����� ��� �� �������������&���������� ��� ������ ��������� ��� ��������� ���� ������� ������ �������� �� ������� ��� ��� ������� ���� ��� �� �������� ������� 8���� ����� �� ��� ��������� �� �������������� ���� ��� �� ������� �(����� ��� ������ ������� ���� ���� ��� ��������� �� ��������� �� ��� �������� ���� ���� ���� ���� ������ �� �� ���� "����� �� �(���������
,���������� -#$:#.� ���� ��� ������ ���� ���� �� ����� ��������� ��� �� ����� ������ ���� �������� ������������������������������������������������� �������� ������������(�����������������&���� ����)�������� ���'���������������������������������������������� ��������������������������������������)���� �� ���������� ���� �(��� ���
D��� �������� ����� ������ �� ����� �� ��������� ��� ,��� ������ �� ������� ��� ���� �� �� �� �� �� �������� ����� ���������� ���� ��������� ������ ���������� ��� ������� ����������� ��� ������������ � ������� �� ��������������������������������������D��������������������������� ������������ ��������� �������� �� �������� ,��� ����� +������������ ������������ ��� ������������� ,���
4���!����������� � ��
�������� ,��� �� ���������� ��� ������������ ������ ��� ��� ����������� ��� ����)������� �� ��'��� ������������� -C!7�.��&�� ���� ��������� ������B=� -�>�.� � D�� ��� �������&���C� ��� �����������9�;����<�;��������� ����� ��� �� ���������� ��� ���������������9;����������*�������������������(������� ���������� ���� %;� ��� �� �� � #;=� -�>�.� ��� ������ ��� #� ��� �� �'������ ������ &��� ������������� �'������ ����� ��� ���� ���� ����� ���� C!7�� ������� ����� C%� ������ ������ �� ������������ 9?;� ���� &��� ������� ����� ���� %:;� �1� �� ������� � � � ��>� ����������� -9;>A;�� �>�.� -7�� ����� %;;B.�
4���&����������� ���� � ��
/��� �������������� �� �������� ,��� �� ����������� �� ����������� ��� ��������� ��� �� ;�# � �������
������������ ���� ��
����� ��������� ���������� ;�;#=� +� � ��� C� :�:� ��� %;� ���� ��� #;; ��� �������� ,��� ���������� ���������� ��� ����������� �� ������������ ����� ��� ���� �� ����)���� ��� ����������� �� 9?A� ��- ������� #$$?.�
6��������%���$"%"��#��$���%������� ����
6� ���� ����� ��� ��� ���� ������� �� ����������� ��������� ���� ������� ������������� ������ ������������� ���� ������� ��������� ��� ���� ���� �� ��������� �������� ��� �������� ���� ������ 8�� ���� ������������� ���������� ��� ���� ��&� �������� ����� �� ���� ���������� ������� ��� �� �������� ��(� ���� ������������ ��������� ��� ���� ����������� �� �� ������� �� �������� ���� -3������� ��� ��� #$AAL� �������#$B%.�� &��� ��������� ��� ������� �� ����� ���� ���������� ���� ����� ������� ����������� �������������� ������� ����� ��� ������ � ������� ���� ����� ���� ������������ ����������� ����� ������ ������������ �� ���� ���������� ����������� � ������� !������� ��� ��� -#$$$.� ��������� �� �� ���������������������������������� ��������� ��� ����� ����������� ����� ��������� �����������&��������������������������� ������������ ���������������� ������������������������������������������������� ������
C���� ��� ��� -%;;B.� �������� �����(�������� �� ���������� ����������� � ������� ��� ��'�������������������������� ���������������( �������� ����������������������������������������� �������������� ����������)9)�������� �������������� �������� -!*��.�� !���� ��� ��� -%;;A.� �������� �������� ��� ������ ��� �(������ ��� H�� ������� &��� ������� E!<� �������� ���� ��� ��������� �������������� ����� �� ���� ����)����� !������� � ��������� �� E!<� ������� ������� ���� �(�������� �������� ������� ����� �� ������ �������� ��� ���������� ������������� �������� ���� ������ �� ��������)���� ���������� ������ ��"���� � ��������� ����� �������������
+��"����������-%;;;.� ������������������������������������������������ �����������������-�������,%.� �������� �������� � ������������ ������ �� ��������� � *� �� ���'���� ��� ��������������������������� &��� �� ��������� ������� ���� ��� #A)���� ��� �� �� ���������� ��� ���� ����� �������3�������� ��� -#$$A.� ����������� ����7)��������� ���������� �������*���%�����5?%<������� ����������� ������7)��������������������������7)��������������������������*���%�����&)#;;��0���� ������ ��������� �������� ����� ������ ���� ����� �� %)����)7)��� ��� � � ��� -#9;� �>�.� ���� � �������� &��%)����)7)��� ��� � � ��� ���� ����� ���� �������� ��� �� �������� �( ������ ���� �(������������"������ �� ���� �������� ������ ��� ������� %9;=� ������� ��� ����� �� ���� ��������� �������� /����������������� �� ���� ������� ���� �������� ��� ���������� ���� 7)�������� �������
3������� ��� ��� -%;;;.� ���������� �� �� ��������� ������������ ������ ������� ��� ��� �� ���� ������� ������ �)��������� ��������������� 7)�������� ��������������� ���� 7)���������� ����������������� *�� �%����� ����� ������� ��� ���� �(�������� *���� �����"������ �� ������� ����������� ����� ��������� ������� ���� ��� #?� �>�� %)����)7)��� ��� � � ��� ���� :;� �>�� �)���������� 6������� ��� ��-#$$<.� ��� ������ �� ���)���� ������������ �� ���� ��� ���� ���� ����� �� 7)�� ���� � � ��� ������ �������������� � ������ �� ����������������� �����������0������� ���� �������� �� �� ��� <;� ��>�� 7)�� ���� � � ��� ����� ��������� ��� ��������� ����)���� ������ ����� �������� ������� �� ���� ��
�� ��������������������������
������������ ���� �����������������"������� �������������������� ���%��>��7)�� ���� � � �������� ��������&������� ����������� ��������������A;)�����������������7)�� ���� �� �������������� ������� ��� ���� ����)����� ,� ����� ���� ����� �� 7)�� ���� � � ��� ���� ��� ��� ���� �� ���������������� ����� ��������� ������ ������������������� ��������� ��� �������� �������7)�� ���� � � ������ ���� �������� ��� ������� ���� ��� ��� �������� ��������� -��� �� �� ��� ��� #$$?.�
7� �� '���������"���" ��$"�
3������� ��������� ���� ���� ������������� ���� ��� ���� ���� ����� ��� ����� ����� ����� ���� ���� ��� ������ ��������������!���������������������������������( ������������� ������� ���� ������������������� �� ��� ������� ���� ���� ��� ������� ��� ���� ��� ���������� ��� ���� �(��� ����� �� ������� &������ ������ ���� ������)����������� ���� ����� ����� ���� ����� ���� �� ������ ��������� &���� ���� ������ �� ������� ��������� ��� ������������� ������ �� ������ ����� ����� ������� ��� �� ������� 1� ���������� ����� ��� ����� ������ �������� ��� ����� ���������� �� �� ��� �������� ,��� �������� ,��� �������,��� ���� �������� �� ���� ������ ���� ���� ��� ��� ���� �� ������������ ����� ��� �����"��� �������������������� 8�� ��������� �� ������ ���� ���� ������ ��� �� ����(� �� ���� ���� ��� ��������� ������������������������&���������������� ����(���������(�������������� �� ��� �� �������������������������������� ������ ����� �������� ������� �� �����
�"#"�"� "�
��� ���������������3�����������%)����)�)������ �� ���������� ��� �� ������ �)��������"��*������������ �%����� ���� �������������� ���� ������������� +�������� ���� $9$)$<%�
����� ���������� � !"������!������������������������ ����������� � ������� �� ��������� ���� ���������� ���� ����� ��� ����� ���� ��� �#�� �������������� ��� ?A�
����� #$�$�� �#�%����&�'�'� ��(&�'� ������ !���� ����� �� ��������,��� ��� ��� ������������ � ������ ���������� ��� ���� ������ �������������� ���������������� +�������� ��� :;9):;B�
���%����)�"���������!���*�� �����1� ��������� ��� 3������� ��� ����!���� ������ �������� ,��� ���� &��� 1�(��� ��������� ������ 3����� 3����� /������������ ���������� ,������� ��� ����� "�������� ��������� +�� #<?9)#<AA�
$��,& �-�� �"� ��.��� �������������� �� �������� ,��� ����� �� 1������ 3������ �� (����������� �����"�������� ��+�� <:$�
$�//��� � � " ��� �� ����� 3���) ���������� ���� ���������� ���������� ���� ����� ��� �� ���)��������)��������"��� �������� ��� ������� ��� �� ��������� �� ������ ����� ������ � -����� ,������� ��#���������� .� �������������� �+�� 9AA)9B#�
0&���%��1���-��!����2��!���� �������6���������������������,�������������������������*&��� #9?9$� ����(����������� ���������� ��� �����1����� ,������� ��� ����� ��������� .��� #:#<)#:#A
������������ ���� �
3���� 1� %����� 4� !��� $� ��5�6 4 � %���*, 4� ������ C�(�������� �������� ������������� ���������� ���������� ��� ���������� � G����� ���#������� �+� %9)9#�
3���� 7��������&���������������������� ������ 8�)�/�������������������������������*�������-��.�� * ����� � !����� 8� ��� ��� G����� � 99#)9A;�
3 �(&�(, �� %��� "�� "������ �� �,����- 8�� ���2�� 7)*� ���� � � ��� ���������� ��������� ���������� ����������� H3� !������ .�� :%#�� ;$;�
#� (& 9�� � 4 � %5� �� ���+� H����"������ �� 0����� * �������� ,��� ����� ������ ����������!���� D��� ��� 6��������� !���� ����� ��� ����� ���� ���� ,�&�"�� ���� :A)?%�
#����#�:����#���&���3������� ��� ��������������������������6������������� ������� ����� ���� ��� ��� 0����� ,������� ��� (����������� ���� (������������� "�������� ���� 9A#)9A?�
1�*���!"�1�- � 7*(&3���� , ;�78��$ ����,*9�"�������*����<��&����������� ������� �� ��01�� ���2�� ���� ���3� ���������� �� ����� ���������� ������������� ��� ���� G����� ���������������������� #����������� <2�� ::):$�
%���� , #"� 1�* 0� =����� " � $��� � 8�� ��.��� �������� ,��� ���� ����� ���� ������������ ������� ���� ��������� ,������� ��� ����������� :::):?9�
%��� �� 3���&��- � ��(&��� �� ����� D����(�������� �� ���� ���������� ����������� � ��������� ������� ��������� #�������� ����� ����������� <�� %9�
%���*���8�,�*�,��' � ��#�- ���/���%���* �&�� ������*�������� �� �������� �������,�� ���>��� ������������ �������� �������� ������ #���<2<.<>
��� ��%�=������ �������'��= ����=���(� �!�4�*$�3 �5�7���� ����?0&���� ;&���������#�#--*������(������1�����- ��8���������(��%���(&���4�������1������� �������������� �� �� � � ��� �� ������ ��� ���� ���� ������� ����� ���� ����� �������� ����+���)�����$��� %#A)%9:�
� &������%�!��4�0 ���!%�8��(*���1���,!�������7)*� ���� �* ���,�������������� &���������� �������� ������ ���������� 2��� <?:)<?B�
4�������#� ������ &��� ������ �� �� ���������� �� ������� ��� (������������ ������ 667� #9?9���� ������� (������������ ���� <<:)<<$�
4�������#�4���&����"�� ���<��*�� ������ �� ����)����������� ��)���� ��� ��� ������������� ����� ���(������������ ������ 667� #9?9�� � ����� #���������� �������������� +<�� %%?)%9;�
4 �/��� 9� 9 ������ � ����*��� �8� ������ !���� ����� �� ���������� ��� �������� ��������������� �������������� �������������� � ����� #���������� ���� �������������� .@�� ?A<)?A$�
�� ��������������������������
4 � ��� �� ��7� �� "� � �( 3 ����� $�� ���+�� �� �� �� C� ��� �(� �������� ������������� ����� ��� (������������ ������� ,���� �������� 7�������� �2�� A$)B<�
!� 4��?8��� !�� 3 ��?% ��� A&���� 9���?����� =��� 9 ��?% ��� 0&� �� � A&�����?!����������� 8����� ����E�%O����%O����������������"�����"���������������,#%���������������������������� ���������������-����� ,������� ���#���������� �������������������+�� %:%:)%:9;�
������� "9 � �����&,���� �4� ��������� �� ������������� �� �� ���� � � ��� ���� ��� ���� ��'������������� ������� �������� ���� ��� ���)���� ����� ������������� +�������� ��� <;A)<##�
���5�&�������&�"��4����-*�1����@��6������������� ����������������� �����������������,#%�������������� ��� �������� ����� ��������������(�!�������#�������� /����������.��<:<)<:?�
�����,� 8� 4��, B � 8���� %� ����� !���� ����� �� �������� ,�� ��� ��!������ ����������������������� ������������� 2@�� #9AB)#9B%�
��/��-�� 84� '��&� '� 1�,�/�,� �� '���� �� ���<�� !���� ����� �� �(��� �������� �������� ,)#%� ������������������������#����������������$������ �����#�����������������������������2�� :##):#?�
����%����!��#� (&9�����@�*�� ��������0�����* ��������,��� ���������������������6�������D������6���������!���� ����� ��� ����������������������� ������������������������������ <#;)<#A�
��� � 7 �� 4���� 7 3�� � � 7��7� B� � #������ �9 � #�����?! ;�� !� 4����7� � ������ 7 3� ������ 6����������� �������� ���� 3� ������� 3��� ����� ���� ���� 6���������� * �������� ���� 7������6������ �� ����6���������,������������D����� ������������ ��������� ������� ,��������� *��������� ++�� 9$$)<;<�
'�,�� 4� 4��� ,� % � ��������� �� ���2�� C���� �������� ������� �� ��� ��������������������������� ������ ����� ������ � � ��� �������� ������� ����� � �������� ��� ����� ,������� ��������������� ���� ���������������� ���� 9A)<#�
:� )�� ��C� ��� #� ��������� �� 8 �� �� ����((� B �C���� �� :� ���<� 8����� �� �7)���� ���� � � ��� γ)�� ����� ��� �� ������� ���� ����� ��� ����� �������� �������� ���� +���)�����$�<��� %AA)%B;�
���, #9� A&��� �%� 8����� � � 35����� !� ���<�� 8��������� �� ����� ���� ��� ������� ����� �������� ���������� ���� ����� ���������� ��� ����������� �� ��������� ,������� ��� � ����#����������� ��@�� <?B)<A?�
���,��� �$� �� �� � %������ 8� 8&������� 4� A�(&� #� #�-�������� 8� %������ '�0&��������'��=���������"�) ��%��(&"���� �������5����� ������������������������������� ��� ���� ����� ���� ���� ����� �� ���������� ,������� ��� 4���������� #���������� .������������� ���� B)#B�
������������ ���� ��
������ � � 0&��-�� 8�� ������ 3������� ��� �����"������ �� ������� ��������� ��� ����������������� �� ���������� ��� (������������ ������� ��� ������� (������������ �@�� 9;9)9;A�
D��?!�=�8� 0�9��� E��0 ��-E��?���� A� ���<�� D����"������ �� ���������� ���� ������� �� ��������� ��������� �������� 6C<<� ������ �������� ��� ��������� *����� � 1� ���������� ���,���� ��������� <2�� AB9)A$<�
D����-�?0&��� � )�(&�� � � =����� 1� ���+�� D����"������ �� �� ��� ����������������� �� ������� ���������� ������������"���� �� ������� �����#�������������� ���������������+��#?)%#�
D����-�?0&��� ��(&��-?��*��0��(&� �-����0��7��& ?� ����1�$���( B�� ���"� ������ �� �� �� �(����� ����� ��� ��������� ������ � � ���� ���� �������� ,#%� ���� ����� ����� ������������� ����������� -����� ,������� ��� #���������� .� ������������� �+�� B<9)B<?�
"� 9� � �����&,���� �4� ������ ���� �� ������������� �� �� ���� � � ��� ���� ��� ���� ��'����������� ��� ������� �������� ���� ��� ���)���� ����� ������������� +�������� ���� <;A)<##�
" ���� 3 %��( (, � � &� " ���;�� � " ���� �� ��� ������ ,������������ �� 7)�� ���� � � ��-�������� �.� ��� "������������ ������������ �(#"� #���������� +������� ��2�� %<:)%:;�
"��������%���"��:�� ��8����+��C���������� ����� ��������� ���� �� �������� ��������,������� ��� � ����� ��������� 2�� $$)#;<�
����* �� #�?"�)��%������� �9� ������ H����"������ � �� � ���� �� ����� -3����.� ��� ������������� ������������� ��������������� ��� ������ ��� ��� ������� ������������������������ +�����������?#:)?#B�
���� 9� B�&��9� %�*��&� %� B�� 9�,��&� 8�9 �&�,�5� 4� ' ��(&� 9� � �-� �� 9 �&�-��� '�5� �� % � -� � � �&�� ���� 4� ���<�� �������� �� ������ ������ ��� �)�������� ���� �)���������� ��������������� ���� *������������ �%����� ���� �� ������� ���� ����� �� %)����)�)���������� ���� �������� ��� ���� �� ���� ����� �� ���������*���%�������������� �����(������������#����������� 2@�� <:<)<?;�
��,�� � 4��� � � 8��� 9� ���+� 6� ���� �������� �� �������� ,�� �������������� ,������� ��5����������� "������� ���� 6����������� -/�$�.�� .��� ?$)AA�
�&�7� 7�,*����-! �7����, #��������/��������������� ����������������� ������� ���������� �� ������������� ���$�� �������� #�������� �+�� <9:)<<A�
�&����� 8� B(&�,�5� 0� �������� �� 8�,��� 9� ' ��(&� 9� ���� 9 � 9����&��� �� �����1������� ���������������������� �������� �� ��������������%)����)�)������ �� ���������� �������������� �)�� ���� � � ��� ��� ������������ ������ 8/D� 9A9B�� ,������� ��� ����������� ���������������� ���%%9)%%:�
� � *���8�8���%������-�4�4���*���$�8���� � ��4 ��*��&�4�9��� ��4* ����
��� ��������������������������
% � ������&��� 4� ������ !���� ����� �� %)����)�)������ � � ��� ���� �)��� ���� ��� ���)������������������ � ����� ���� (������������� #����������� +@�� #;?<)#;?$�
���&����4�� "�7����� �!� ���������� %� ������ &����� ����� ��� ��� �� ������ �������������� ���������������������������������������� ����������� ���� ����������������� ������� ����#���������� ���� �������������� .@�� :;$):#?�
���;�� 7 B� 4�,�� 7� 9� ���/�� 7 9 � A&-�� 7 ��� ��<<�� *������� �� �������������������� ���� ����(�"���� ������������� ������� ������ 88�� �� �� �� ����������� ��� ���� ����������� ?�A)��������)B)�����������"����� ���������� ����������� ���� ���� ������� �� ��������� ��������*�����$��� �@�� <$;)<$:�
������5�8���*�/�,� 8�% �&�� 8� ���.��1� ������� ���� ����� �� 7)�� ���� � � ��� �����)���������� 7)��������� 7)��� ����� ���� 7)���������� ��� ������������������� �������� �31� <;%:������������ � ���������������� ������������� 2�F@G�� ?:$)??%�
����� � 8� 4������� �� 4�� 8 � ���, # 9� ������ 8������ �� �� ������� ��������� ��� �������(������ � �������������� ������������ ��������� ������������������� ������#������������� �������������� �@�� :%$):9$�
�*�7�� 4 � $���5��- $� ���+�� �������� ,�� !���� ����� ��� ����������� ��������� ��� ��������� ���������� ������� &����� ������������ ���� ���� �� ��������(��� ����� �� ��� !�6��� ����� ���(������������� #����������� #<$:)#<$$�
8�,�*��� %� 4������� � 9 �&�� 9� 4�,��� %� 4�5����� 9 � ��������� 8� ���<�!���� ����� �� �����(������ ���������� β) ��������� �������� �� ���� �������� ��� ��� ���)���� ������� �(������� ���������� ������������� ���� ��������������� .@�� #B:)#$;�
8��� �����, 5�,�$�%�� �-1�4�/*(/, 5�,� =�$��/�5�(/�4 (���"�������D����"����������� ,��� ������������� ��� �� ������ �������� �� +��������� �������� (�!��� ���� #�������/���������� +@�� 9?$)9A<�
9� 4� �&�� � � �&���/� 4� ���2�� �� ����� ���� ����� �� �������� ,#%� ���� ������ � � ���� ������������������ ������������������������(������,���������������������������������������������� <B<)<$#�
9�� �� !��=� D�� 0�9� D� ����� !���� ����� �� �������� �� �� ������ %)����)�)������ � � ������ �)��������� ��� ��(��� ������� �� �� ������������� -��� "����� -�� '��� ����� +��� A;$)A#:�