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VARICELLA ZOSTER IgG ELISA

KAPRVIG20

VARICELLA ZOSTER IgG ELISA EN

26.11.2018 2/20 version 1

CONTENT

1 Introduction ..................................................................................................... 3

2 Test Principle.................................................................................................... 4

3 Materials Provided ........................................................................................... 5

4 Other Material Required for Manual Test Performance ................................... 6

5 Storage and Stability ........................................................................................ 6

6 Preparation of Reagents ................................................................................... 6

7 Preparation of Samples .................................................................................... 7

8 Assay Procedure ............................................................................................... 7

9 Working Schedule ............................................................................................ 9

10 Quality Control ............................................................................................... 10

11 Results Interpretation .................................................................................... 10

12 Safety Precautions ......................................................................................... 11

13 Procedural Notes............................................................................................ 12

14 Index of Avidity .............................................................................................. 13

15 IFU Symbols ................................................................................................... 17


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Enzyme immunoassay for the detection of IgG antibodies to Varicella zoster virus and IgG avidity in human serum, plasma or

cerebrospinal fluid

1 Introduction

Varicella zoster virus (VZV, HHV-3) belongs to the Herpetoviridae family. The virus causes chicken-pox, varicella (primary infection) and shingles, herpes zoster (reactivation). Primary VZV infection occurs mainly in childhood and it is transmitted by means of droplet infection. Up to 90% of humans without specific antibodies can be infected during close contact with an infected person. The symptoms include fever, malaise and skin itching preceding the development of characteristic exanthema. The disease usually terminates without any lasting effects. Primary infection in adolescents and adults can be generally more severe with serious complications (e.g. encephalitis, pneumonia and hepatitis) especially in immunocompromised patients. The virus can be transmitted via placenta to the foetus; this can lead to severe congenital defects. Maternal infection of seronegative female (i.e. without specific antibodies) in late gestation presents serious risk for a newborn.

As a member of the Herpetoviridae family, the virus may persist latently in the organism and can be reactivated subsequently (reduced immunity) producing a disease known as shingles.

Diagnosis of the disease is based on clinical manifestation, epidemiological anamnesis and laboratory tests. The most widespread serological method used for the detection of specific IgA, IgM and IgG (avidity) antibodies to VZV in laboratory diagnosis of the infection is ELISA. Specific IgG antibodies have anamnestic character and serve for patient immunological status assignment.

Antibodies of IgM and IgA class are a sign of an active infection (primary infection and reactivation) and disappear during convalescence. In some cases they can persist for several months.

Specific IgG antibodies mostly remain in reduced levels throughout the entire life of the infected person. The method of IgG avidity detection is used for discrimination between primary infection and past infection or reactivation.


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2 Test Principle

The kit is intended for detection of specific IgG antibodies in a sample by means of a sandwich type of the EIA method (i.e. a solid phase coated with specific antigen – antibody from the analysed sample – labelled antibody). The labelled antibody (conjugate) is an animal immunoglobulin fraction to human IgG conjugated with horseradish peroxidase. Peroxidase activity is determined in the test by a substrate containing TMB. Positivity is indicated when blue colour appears; after stopping solution has been added, blue changes to yellow. The yellow colour intensity is measured by a photometer at 450 nm, and it is proportional to the concentration of specific IgG antibodies in the sample.

Antigen Used

Purified and inactivated antigen VZV with a high content of specific immunodominant epitopes


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3 Materials Provided

Microtiter Plate 1 pc

coated with antigen, 12 x 8 wells in bag with desiccant

Negative Control (Calibrator 1) 10 IU/l 1 × 2 ml

Solution containing no specific human antibodies, ready to use

CUT-OFF (Calibrator 2) 100 IU/l 1 × 3 ml

Solution containing specific human antibodies in cut-off concentration, ready to use

Positive Control (Calibrator 3) 500 IU/l 1 × 2 ml

Solution containing specific human antibodies, ready to use

Calibrator 4 (2500 IU/l) 1 × 2 ml

Solution containing specific human antibodies, ready to use

Conjugate 1 × 15 ml

Solution containing peroxidase labelled animal immunoglobulin to human IgG, ready to use

Sample Diluent 2 1 × 105 ml

Buffer with protein stabilisers, ready to use

TMB Solution 1 × 15 ml

Chromogenic substrate solution containing

TMB/H2O2 ready to use

Wash Solution 1 × 75 ml

20× concentrated buffer

Stop Solution 1 × 15 ml

1M sulphuric acid solution, ready to use

Avidity Solution 1 1 × 7 ml

Stabilised urea solution

Instructions for use 1 pc


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4 Other Material Required for Manual Test Performance

Single and multichannel pipettes

Disposable tips

Microplate washer

Timer

Incubator (37°C)

Microplate reader

5 Storage and Stability

Store the kit at +2°C to +8°C. Do not freeze. If the kit is stored as described, the labelled expiration date is valid. The expiration date is indicated on the package. The opened kit should be used within three months.

Samples Preparation and Storage

The following human body liquids can be used for testing: serum, citrate plasma and cerebrospinal fluid. Anticoagulants in the plasma (except for citrate) as well as bacterially contaminated, haemolytic or chylous samples can affect the test results.

Samples can be stored at +2°C to +8°C for one week. For a longer period, store samples at -20°C. Diluted samples should be used as soon as possible.

6 Preparation of Reagents

Dilute the Wash Solution 1:20 (1 part of solution and 19 parts of distilled water); e.g. 75 ml of the concentrated Wash Solution + 1425 ml of distilled water.

Salt crystals might develop in the bottle with the concentrated Wash Solution. Prior to use, it is necessary to dissolve the crystals by warming the bottle in a water bath. The diluted Wash Solution is stable at +2°C to +8°C for one week.

The Controls and the Calibrators are supplied ready to use, do not dilute further!

The Conjugate is supplied ready to use, do not dilute further!

TMB Solution is a one-component chromogenic substrate solution ready to use, do not dilute further!

Interchangeability of reagents

The Sample Diluent, TMB Solution and the Avidity Solution are interchangeable between some ELISA of DIAsource ImmunoAssays S.A., provided they have the identical numeric marking (e.g. Sample Diluent 2, Sample Diluent 3, etc.). Further information relative to this interchangeability can be requested to DIAsource ImmunoAssays S.A.


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7 Preparation of Samples

Mix gently the Sample Diluent prior to use.

Dilution of sera and plasma samples

Dilute well mixed samples 1:101 with the Sample Diluent:

E.g.: 10 µl of sample + 1 ml of the Sample Diluent

Mix well.

Dilution of cerebrospinal fluid samples (CSF)

Dilute well mixed CSF 1:3 with the Sample Diluent:

E.g.: 50 µl of CSF + 100 µl of the Sample Diluent

Mix well.

8 Assay Procedure

Allow all reagents to come to room temperature and mix well. If you do not use a whole microplate, return unnecessary strips into the bag with desiccant. Seal the bag tightly and store at +2°C to +8°C. Keep dry!

1. Dispense the controls (calibrators) and the diluted samples according to the working schedule.

Semiquantitative evaluation in Index of Positivity (IP)

• Leave A1 well empty (blank).

• Pipette 100 µl of the Negative Control (Calibrator 1) into 1 well.

• Pipette 100 µl of CUT-OFF (Calibrator 2) into 2 wells.

• Pipette 100 µl of the Positive Control (Calibrator 3) into 1 well.

• Pipette 100 µl of the diluted samples (see Chapter Preparation of Samples) into the other wells.

Quantitative evaluation in Units IU/l




• Pipette 100 µl of the Positive Control (Calibrator 3) into 2 wells.

• Pipette 100 μl of the Calibrator 4 into 2 wells.

• Pipette 100 µl of the diluted samples (see Chapter Preparation of Samples) into the other wells.

2. Cover the microplate with the lid and incubate at 37°C for 30 minutes.


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3. Aspirate the content of the wells and wash 5× with the working strength Wash Solution. Fill the wells up to the edge. Finally, tap the inverted microplate thoroughly on an absorbent paper to remove solution remnants.

4. Pipette 100 µl of the Conjugate into all wells except A1 well.

5. Cover the microplate with the lid and incubate it at 37°C for 30 minutes.


7. Pipette 100 µl of TMB Solution into all wells. Avoid contamination – see Chapter Procedural Notes.

8. Cover the microplate with the lid and incubate at 37°C for 30 minutes. Keep out of light.

9. Stop the reaction by adding 100 µl of the Stop Solution in the same order and intervals as the substrate was added.

10. Read the colour intensity in wells against blank (A1 well) using photometer set to 450 nm. The absorbance should be read within 30 minutes after stopping the reaction.


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9 Working Schedule

Semiquantitative evaluation Quantitative evaluation

Index of Positivity (IP) Units IU/l

BL TS 4

NC TS 5

CO

CO

PC

TS 1

TS 2

TS 3

A

B

C

D

E

G

H

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

BL TS 1

Cal1 TS 2

Cal2 TS 3

Cal2 TS 4

Cal3 TS 5

Cal3

Cal4

Cal4

A

B

C

D

E

G

H

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

BL Blank (empty well) BL Blank (empty well)

NC 100 µl Cal1 100 µl

CO 100 µl Cal2 100 µl

PC 100 µl Cal3 100 µl

TS 1-x 100 µl diluted tested sample Cal4 100 µl

TS 1-x 100 µl diluted tested sample


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10 Quality Control

The test is valid if:

The absorbance of blank is lower than 0.150.

BLANK < 0.150

The absorbance of the Negative Control (Calibrator 1) is lower than half of the mean absorbance of CUT‒OFF (Calibrator 2).

< 0.5 ×

The mean absorbance of CUT-OFF (Calibrator 2) is within a range of 0.150 – 0.900.

0.150 < < 0.900

The absorbance of the Positive Control (Calibrator 3) is 1.5-fold higher than the mean absorbance of CUT‒OFF (Calibrator 2).

> 1.5 ×

The absorbance of the Calibrator 4 is higher than the absorbance of the Positive Control (Calibrator 3).

>

11 Results Interpretation

Calculation of Index of Positivity (IP)

Divide the absorbance of a tested sample by the mean absorbance of CUT-OFF measured in the same test run:

Interpretation of the test results is described in Table 1.

Table 1 Interpretation of test results

Index of Positivity (IP)

Evaluation

lower than 0.9 negative

0.9 to 1.1 borderline

higher than 1.1 positive


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Examination of borderline samples, i.e. samples with Index of Positivity from 0.9 to 1.1, should be repeated from a new sample collected after certain time regarding to the disease specifics.

Quantitative evaluation in Units (IU/l)

Construct a calibration curve by plotting the concentration (X) of the calibrators in IU/l against the corresponding absorbance (Y). Construct the calibration curve by single point cross connection. Read the values of antibody level (IU/l) in samples from the calibration curve. Interpretation of the quantitative test results is described in Table 2.

Note

The quantitative evaluation in International units was derived from the WHO International Standard (W1044).

Table 2 Quantitative interpretation in Units (IU/l)

Antibody level (IU/l) Evaluation

lower than 90 negative

90 to 125 borderline

higher than 125 positive

Examination of borderline samples should be repeated from a new sample collected after specific time regarding to the disease specifics.

Serological finding can be interpreted only in the context of results of other laboratory tests and patient clinical picture.

12 Safety Precautions

The kit is intended for in vitro diagnostic use only.

The sera used for controls were tested and found to be negative for HIV 1 and HIV 2, HBsAg, HCV, TPHA. In spite of this fact, they still need to be handled as potentially infectious materials.

Some reagents contain sodium azide, which is a toxic compound. Avoid contact with skin.

The Stop Solution contains diluted acid solution. Avoid contact with eyes and skin.

It is necessary to observe the local safety rules and regulations.

First aid

In case of contact with eyes, flush with copious amount of water and seek medical assistance. In case of contact with skin and clothing, remove all the contaminated clothes. Wash the skin with soap and plenty of running water. In case of contact


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with solutions containing plasma or clinical samples, disinfect the skin. In case of accidental ingestion, flush the mouth with drinking water and seek medical assistance.

Remnants disposal

All the materials used for performing the test must be treated as potentially infectious due to the contact with biological materials. Therefore they need to be disposed together with biological waste.

Expired kit disposal

Disassemble the kit and dispose the components as biological material. Discard the packaging material as required by local regulations.

13 Procedural Notes

In order to obtain reliable results, it is necessary to strictly follow the Instructions for Use. Always use clean preferably disposable tips and glassware.

Microtiter Plate – in order to prevent water condensation on the surface of the microplate, always allow the bag with the microplate to warm up to room temperature before opening.

Wash Solution – use high quality distilled water for preparing the working strength Wash Solution.

Washing procedure – keep to the prescribed number of wash cycles and fill the wells to the upper edge. The soak time (i.e. interval between two different wash cycles during which the wells stay filled up with the Wash Solution) should be approx. 30-60 seconds.

TMB Solution – the vessel used for multichannel pipetting should not be used for other reagents. Do not return the surplus TMB Solution from the pipetting vessel into the vial.

Non-reproducible results might be caused by improper methodology as following:

• insufficient mixing of reagents and samples before use

• improper replacement of vial caps

• using the same tip for pipetting different reagents

• reagent exposure to excessive temperature; bacterial or chemical contamination

• insufficient washing or filling of the wells (the wells should be filled to the upper edge), improper aspiration of Wash Solution remnants

• contamination of the well edges with Conjugate or samples

• using reagents from different kit lots

• contact of reagents with oxidants, heavy metals and their salts


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The kit might be used for sequential examinations. When preparing working strength solutions, use only the amount of reagents needed for the analysis.

The kit might be used in all types of automatic EIA analysers.

If necessary, DIAsource ImmunoAssays S.A. can offer a certified modification of the Instructions for Use for the specific type of analyser.

The producer cannot guarantee that the kit will function properly if the assay procedure instructions are not strictly adhered to.

14 Index of Avidity

14.1 Introduction

Antibody avidity expresses the strength of bond between antigen and antibody. Low avidity antibodies are produced in the early stages of a primary infection. As the infection progresses, immune response of organism matures and avidity of antibodies increases. Antibodies show high avidity in the latent phase of the disease. High avidity IgG antibodies are produced by memory B-cells from the beginning of a secondary infection or reactivation.

Determination of IgG antibodies avidity enables differentiation of various stages of infection and is a useful addition to serological diagnostics.

14.2 Test Principle

Avidity determination is based on dissociation of antigen-antibody bond by means of Avidity Solution (urea solution). After Avidity Solution treatment, low avidity antibodies are released and washed out while high avidity antibodies remain bound to the antigen. The binding strength is expressed by the Index of Avidity (IAv). IAv determines the portion of IgG antibodies that remains bound to antigen after incubation with Avidity Solution. IAv assay procedure is a modification of the standard ELISA procedure using Avidity Solution.

The IgG avidity is determined only in IgG positive samples.

14.3 Dilution of Samples

Dilution of sera and plasma samples (see Chapter Preparation of Samples).


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14.4 Assay Procedure

Allow all reagents including the Avidity Solution to come to room temperature and mix well. Crystals might develop in the vial with the Avidity Solution. Prior to use, it is necessary to dissolve the crystals by short-time warming up. The functionality of the Avidity Solution is indicated by yellow colour. The solution is thermolabile. The solution is deteriorated, if it changes its colour from yellow to red. A red-coloured Avidity Solution cannot be used further!

1. Dispense the controls and the diluted samples according to the working schedule.




• Pipette 100 µl of the Positive Control (Calibrator 3) into 1 well.

• Pipette 100 µl of the diluted samples (see Chapter Preparation of Samples) into two adjacent wells of N and Av strips.



4. Pipette 100 µl of the Avidity Solution into all wells of Av strips.

5. Pipette 100 µl of the working strength Wash Solution into all wells of N strip.

6. Cover the microplate with the lid and incubate at room temperature for 5 minutes.


8. Pipette 100 µl of the Conjugate into all wells except A1 well.



11. Pipette 100 µl of TMB Solution into all wells. Avoid contamination – see Chapter Procedural Notes.

12. Cover the microplate with the lid and incubate at 37°C for 30 minutes. Keep out of light.

13. Stop the reaction by adding 100 µl of the Stop Solution in the same order and intervals as the substrate was added.


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14. Read the colour intensity in wells against blank (A1 well) using photometer set to 450 nm. The absorbance should be read within 30 minutes after stopping the reaction.

14.5 Working Schedule

BL

NC

CO

CO

PC

TS 1 TS 1

TS 2 TS 2

TS 3 TS 3

A

B

C

D

E

G

H

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

AvN

N strip for ELISA (without Avidity Solution)

Av strip for avidity test (incubation with Avidity Solution)

BL Blank (empty well)

NC 100 µl

CO 100 µl

PC 100 µl

TS 1-x 100 µl diluted tested sample


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14.6 Quality Control

Quality control of the test is performed in N strips (see Chapter Quality Control).

14.7 Results Interpretation

Calculation of Index of Avidity (IAv)

Divide the absorbance of a tested sample in Av strip by the absorbance of the tested sample in N strip measured in the same test run:

Interpretation of the test results is described in Table 3.

Table 3 Interpretation of test results

Index of Avidity (IAv) in %

Evaluation of avidity

Interpretation of results

< 40 low primary infection

40 - 45 borderline repeat examination

> 45 high latent infection

reactivation of latent infection or reinfection, if IgM antibodies are detected at the same

time

Examination should be repeated in case of borderline results. Collect a second sample after more than seven days after the first collection and examine both samples in the same test run.


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15 IFU Symbols

Temperature limitation

Biohazard

Expiry date

Lot number

Manufactured by

Consult instructions

Catalogue number

Number of tests

In vitro diagnostic medical device


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Notes


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Notes


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Summary of VARICELLA ZOSTER IgG ELISA Protocol

Step No. Symbol Test steps

1

Dilute samples

serum/plasma 1:101 (10 µl + 1 ml)

cerebrospinal fluids 1:3 (50 µl + 100 µl)

2 Pipette Controls (Calibrators) and diluted samples – 100 µl

Blank = empty well

3 Incubate at 37°C for 30 min

4 Aspirate and wash the wells 5×

5 Pipette Conjugate – 100 μl

Blank = empty well


7 Aspirate and wash the wells 5×

8 Pipette Substrate (TMB Solution) – 100 µl

Including blank


10 Pipette Stop Solution – 100 µl

Including blank

11 Read colour intensity at 450 nm


KAPRVIG20

VARICELLA ZOSTER IgG ELISA DE

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INHALT

1 Einleitung ......................................................................................................... 3

2 Testprinzip ....................................................................................................... 4

3 Bestandteile des Kits ........................................................................................ 5

4 Erforderliche, nicht im Kit enthaltene Geräte und Materialien, für die manuelle Durchführung ................................................................................................... 6

5 Lagerung und Haltbarkeit des Kits .................................................................... 6

6 Vorbereitung der Reagenzien ........................................................................... 6

7 Probenverdünnung .......................................................................................... 7

8 Testdurchführung ............................................................................................. 7

9 Arbeitsschema ................................................................................................. 9

10 Testvalidität ................................................................................................... 10

11 Auswertung der Ergebnisse ............................................................................ 11

12 Arbeitssicherheit ............................................................................................ 12

13 Technische Anmerkungen .............................................................................. 12

14 Index der Avidität........................................................................................... 14

15 Symbolerklärung ............................................................................................ 19


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Enzymimmunoassay zur Bestimmung von IgG-Antikörpern gegen das Varicella-Zoster-Virus und ihrer Avidität im

menschlichen Serum, Plasma oder Liquor

1 Einleitung

Das Varizella-Zoster-Virus (VZV, HHV-3) gehört zur Gruppe der Herpesviren und verursacht die Infektionserkrankungen Windpocken (Primärinfektion) und Gürtelrose (Reaktivierung).

Die Primärinfektion durch VZV erfolgt am häufigsten in der Kindheit durch Tröpfcheninfektion. Nach dem Kontakt mit einer infizierten Person erkranken bis zu 90 % der Menschen ohne spezifische Antikörper. Die Symptome der Infektion umfassen Fieber, Unwohlsein und Juckreiz an jenen Stellen, an denen später das charakteristische Exanthem in Erscheinung tritt. Die Erkrankung klingt in der Regel ohne bleibende Folgen ab. Primärinfektionen bei Jugendlichen und Erwachsenen haben einen schwereren Verlauf, mitunter mit ernsthaften Komplikationen (z.B. Enzephalitis, Pneumonie und Entzündungen der Leber), und zwar insbesondere bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem. Das Virus durchdringt auch die Plazenta, wobei die nachfolgende Infektion des Fötus zu schweren angeborenen Defekten führen kann. Kommt es zu einer Ansteckung der seronegativen Mutter (ohne spezifische Antikörper)in der Spätphase der Schwangerschaft, bedeutet dies eine ernsthafte Gefahr für das ungeborene Kind.

Eine charakteristische Eigenschaft des VZV ist die Neigung zur Persistenz im Organismus. Bei Verringerung der Abwehrkräfte können die Reaktivierung des Virus und das Entstehen einer Gürtelrose die Folge sein.

Die Diagnostik der Erkrankung basiert auf dem klinischen Bild und Labortests. Bei der VZV-Labordiagnostik werden häufig serologische Methoden zum Nachweis der spezifischen Antikörper der Klasse IgM, IgA, IgG (Avidität) mittels der ELISA-Methode verwendet. Die spezifischen Antikörper der Klasse IgG haben anamnestischen Charakter und dienen der Feststellung des immunologischen Status des Patienten.

Die spezifischen Antikörper der Klasse IgM und IgA sind ein Indikator der aktiven Infektion (Primärinfektion und Reaktivierung), wobei sie in der Rekonvaleszenzphase verschwinden. In einigen Fällen können sie auch mehrere Monate überdauern.

Die spezifischen IgG-Antikörper persistieren zumeist lebenslang in geringen Konzentrationen. Der Unterscheidung einer Primärinfektion von einer früher durchgemachten Infektion oder Reaktivierung dient die Feststellung der Avidität der IgG-Antikörpe.


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2 Testprinzip

Das Kit ermöglicht die Bestimmung spezifischer IgG-Antikörper in der Probe mittels der Sandwich-EIA-Methode (d.h. antigenbeschichtete feste Phase - Antikörper aus der untersuchten Probe - markierter Antikörper). Der markierte Antikörper (Konjugat) ist eine tierische Immunoglobulinfraktion gegen menschliches IgG, die mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist. Die Peroxidaseaktivität wird durch das TMB-Lösung bestimmt, das sich bei einer positiven Reaktion blau färbt. Die Enzymreaktion wird mit einer Stopplösung beendet. Die blaue Färbung schlägt in eine gelbe um. Die Intensität der Gelbfärbung wird mit dem Photometer (bei einer Wellenlänge von 450 nm) gemessen und ist proportional zur Konzentration der spezifischen IgG-Antikörper in der Probe.

Verwendetes Antigen

Aufgereinigtes und inaktiviertes Antigen VZV mit einem hohen Gehalt an spezifischen immunogenen Epitopen


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3 Bestandteile des Kits

Beschichtete Platte 1 Stck.

mit gebundenem Antigen, 12 x 8 Vertiefungen im Beutel mit Trocknungsmittel

Negative Kontrolle (Kalibrator 1) 10 IU/l 1 × 2 ml

Lösung ohne spezifische menschliche Antikörper gebrauchsfertig

CUT-OFF (Kalibrator 2) 100 IU/l 1 × 3 ml

Lösung mit grenzwertiger Konzentration spezifischer menschlicher Antikörper, gebrauchsfertig

Positive Kontrolle (Kalibrator 3) 500 IU/l 1 × 2 ml

Lösung mit spezifischen menschlichen Antikörpern, gebrauchsfertig

Kalibrator 4 (2500 IU/l) 1 × 2 ml

Lösung mit spezifischen menschlichen Antikörpern, gebrauchsfertig

Konjugat 1 × 15 ml

Lösung mit tierischem Immunoglobulin gegen menschliches IgG, Peroxidase-Konjugiert, gebrauchsfertig

Verdünnungslösung für die Proben 2 1 × 105 ml

Puffer mit Eiweißstabilisatoren, gebrauchsfertig

TMB-Lösung 1 × 15 ml

Einkomponenten-Substratlösung, TMB/H2O2,

gebrauchsfertig

Waschlösung 1 × 75 ml

20× konzentrierter Puffer

Stopplösung 1 × 15 ml

Säurelösung, gebrauchsfertig

Aviditätslösung 1 1 × 7 ml

Stabilisierte Harnstofflösung

Arbeitsanweisung 1 Stck.


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4 Erforderliche, nicht im Kit enthaltene Geräte und Materialien, für die manuelle Durchführung

Ein- und Mehrkanalpipetten

Einmalspitzen

Wascher

Stoppuhr

Inkubator für 37°C

Photometer für Mikrotiterplatten

5 Lagerung und Haltbarkeit des Kits

Das Kit muss bei einer Temperatur von +2°C bis +8°C gelagert werden. Bei Einhaltung der Lagerungsbedingungen gilt das auf der Verpackung des Kits angegebene Haltbarkeitsdatum. Der angebrochene Kit sollte innerhalb von drei Monaten verbraucht werden. Das Kit darf nicht einfrieren!

Proben und ihre Lagerung

Als Probe kann menschliches Serum, Zitratplasma und Liquor verwendet werden. Mit Bakterien verseuchte Proben, hämolytische Proben oder Proben mit Chylus und im Plasma enthaltene Antikoagglutinationsmittel (Zitrat ausgenommen) können das Testergebnis beeinflussen.

Die Proben können bei einer Temperatur von +2°C bis +8°C höchstens 1 Woche lang aufbewahrt werden. Frieren Sie die Proben bei längerer Lagerung bei -20°C ein. Verdünnte Proben sind möglichst bald zu untersuchen.

6 Vorbereitung der Reagenzien

Verdünnen Sie die Waschlösung im Verhältnis 1:20 (1 Teil Lösung und 19 Teile destilliertes Wasser). Z.B. 75 ml konzentrierte Waschlösung + 1425 ml destilliertes Wasser.

In der Flasche mit der Waschlösung können sich Salzkristalle bilden. Diese Kristalle müssen vor Gebrauch durch Erwärmung im Wasserbad aufgelöst werden. Die verdünnte Lösung ist eine Woche lang bei +2°C bis +8°C haltbar.

Die Kontrollen und die Kalibratoren sind gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen!

Das Konjugat ist gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen!

Das TMB-Lösung ist eine chromogene Einkomponenten-Substratlösung und gebrauchsfertig, nicht weiter verdünnen!

Austauschbarkeit der Lösungen

Die Verdünnungslösung für die Proben, TMB-Lösung und Aviditätspuffer können problemlos mit einigen ELISA-Produkten von DIAsource ImmunoAssays S.A.


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austauschbar, wenn sie die gleiche numerische Kennzeichnung aufweisen (z.B. Verdünnungslösung für die Proben 2, Verdünnungslösung für die Proben 3, usw.). Weitere Informationen zu dieser Austauschbarkeit können Sie bei DIAsource ImmunoAssays S.A. anfordern.

7 Probenverdünnung

Mischen Sie die Verdünnungslösung für die Proben vor der Verwendung schonend.

Verdünnung der Serum- und Plasmaproben

Verdünnen Sie die gründlich gemischten Proben 1:101 mit der Verdünnungslösung für die Proben:

z.B: 10 µl Probe + 1 ml Verdünnungslösung für die Proben.

Gut mischen.

Verdünnung der Liquorproben

Verdünnen Sie die gründlich gemischten Proben 1:3 mit der Verdünnungslösung für die Proben:

z.B: 50 µl Liquor + 100 µl Verdünnungslösung für die Proben.

Gut mischen.

8 Testdurchführung

Es ist sehr wichtig, alle Reagenzien vor ihrer Verwendung auf Raumtemperatur zu bringen und gründlich zu mischen. Sofern Sie nicht die gesamte Platte verwenden, so legen Sie die nicht benötigten Strips in die Verpackung mit dem Trocknungsmittel zurück, verschließen diese luftdicht und lagern sie bei +2°C bis +8°C. Sorgfältig vor Feuchtigkeit schützen!

1. Pipettieren Sie die Kontrollen (Kalibratoren) sowie die verdünnten Proben gemäß dem Arbeitsschema.

Semiquantitative Auswertung im Index der Positivität (IP)

• Lassen Sie die Vertiefung A1 leer (Blank).

• Pipettieren Sie 100 µl der Negativen Kontrolle (Kalibrator 1) in 1 Vertiefung.

• Pipettieren Sie 100 µl CUT-OFF (Kalibrator 2) in 2 Vertiefungen.

• Pipettieren Sie 100 µl der Positiven Kontrolle (Kalibrator 3) in 1 Vertiefung.

• Pipettieren Sie 100 µl der verdünnten Proben (siehe Kapitol Probenverdünnung) in die restlichen Vertiefungen.

Quantitative Auswertung in Units IU/l



26.11.2018 8/20 version 1



• Pipettieren Sie 100 µl der Positiven Kontrolle (Kalibrator 3) in 2 Vertiefungen.

• Pipettieren Sie 100 μl Kalibrator 4 in 2 Vertiefungen.

• Pipettieren Sie 100 µl der verdünnten Proben (siehe Kapitol Probenverdünnung) in die restlichen Vertiefungen.

2. Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab und lassen Sie sie 30 Minuten bei 37°C inkubieren.

3. Saugen Sie den Inhalt der Vertiefungen ab und waschen Sie 5× mit Arbeitswaschlösung. Füllen Sie die Vertiefungen bis zum oberen Rand. Verbleibende Flüssigkeit zum Schluss durch Ausklopfen auf saugfähigem Papier entfernen.

4. Pipettieren Sie in alle Vertiefungen mit Ausnahme von A1 100 µl Konjugat.



7. Pipettieren Sie in alle Vertiefungen 100 µl TMB-Lösung. Achten Sie auf Verschmutzungen – siehe Kapitol Technische Anmerkungen.

8. Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab und lassen Sie sie 30 Minuten bei 37°C im Dunkeln inkubieren.

9. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 µl Stopplösung in der gleichen Reihenfolge und den gleichen Intervallen, wie das Substrat pipettiert wurde.

10. Messen Sie am Photometer bei einer Wellenlänge von 450 nm die Intensität der Verfärbung der Lösungen in den Vertiefungen im Vergleich zum Blank (Vertiefung A1), und zwar innerhalb von 30 Minuten nach dem Stoppen der Reaktion.


26.11.2018 9/20 version 1

9 Arbeitsschema

semiquantitative Auswertung quantitative Auswertung

im Index der Positivität (IP) in Units IU/l

BL TP 4

NK TP 5

CO

CO

PK

TP 1

TP 2

TP 3

A

B

C

D

E

G

H

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

BL TP 1

Kal1 TP 2

Kal2 TP 3

Kal2 TP 4

Kal3 TP 5

Kal3

Kal4

Kal4

A

B

C

D

E

G

H

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

BL Blank (leere Vertiefung) BL Blank (leere Vertiefung)

NK 100 µl Kal1 100 µl

CO 100 µl Kal2 100 µl

PK 100 µl Kal3 100 µl

TP 1-x 100 µl verdünnte Testprobe Kal4 100 µl

TP 1-x 100 µl verdünnte Testprobe


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10 Testvalidität

Der Test ist gültig, wenn:

Die Blank-Extinktion ist kleiner als 0,150.

BLANK < 0,150

Die Extinktion der Negativen Kontrolle (Kalibrator 1) ist kleiner als die Hälfte des

Durchschnitts der Extinktion von CUT‒OFF (Kalibrator 2).

< 0,5 ×

Die durchschnittliche Extinktion von CUT‒OFF (Kalibrator 2) liegt im Bereich von

0,150 – 0,900.

0,150 < < 0,900

Die Extinktion der Positiven Kontrolle (Kalibrator 3) ist größer als das 1,5-fache der

durchschnittlichen Extinktion von CUT‒OFF (Kalibrator 2).

> 1,5 ×

Die Extinktion des Kalibrators 4 ist größer als die Extinktion der Positiven Kontrolle (Kalibrator 3).

>


26.11.2018 11/20 version 1

11 Auswertung der Ergebnisse

Berechnung des Positivitätsindex (IP)

Dividieren Sie die Extinktion der getesteten Probe durch die durchschnittliche in der gleichen Serie der Untersuchung gemessene Extinktion von CUT-OFF:

Interpretation der Untersuchungsergebnisse siehe Tabelle (Tabelle 1).

Tabelle 1 Interpretation der Untersuchungsergebnisse

Positivitätsindex (IP) Auswertung

kleiner als 0,9 negativ

0,9 bis 1,1 grenzwertig

höher als 1,1 positiv

Grenzwertiger Proben mit einem Positivitätsindex von 0,9 bis 1,1, sollten mit einer neuen Patientenprobe wiederholt werden, die zu einem, für die Erkrankungscharakteristik spezifischen Zeitabstand entnommen werden sollte.

Quantitative Auswertung in Units (IU/l)

Erstellen Sie eine Kalibrierungskurve, indem Sie die Konzentrationen der Kalibratoren in IU/l (x-Achse) gegen die entsprechenden Extinktionen (y-Achse) auftragen. Durch Verbindung der einzelnen Punkte erstellen Sie die Kalibrierungskurve. Bestimmen Sie den Antikörperspiegel in den Proben (IU/l) durch Ablesen dieser Werte von der Kalibrierungskurve. Die Interpretationen der Ergebnisse der quantitativen Auswertung des Tests siehe Tabelle (Tabelle 2).

Anmerkung

Die quantitative Auswertung in internationalen Einheiten wurde vom internationalen Standard der WHO (W1044) abgeleitet.

Tabelle 2 Quantitative Auswertung in Units (IU/l)

Antikörperspiegel (IU/l) Auswertung

kleiner als 90 negativ

90 bis 125 grenzwertig

höher als 125 positiv


26.11.2018 12/20 version 1

Die Untersuchung grenzwertiger Proben sollte von erneuter Entnahme wiederholt werden, die mit einem gewissen Zeitabstand und im Hinblick auf die Spezifika der jeweiligen Erkrankung erfolgt.

Der serologische Befund kann nur im Kontext mit den Ergebnissen anderer Labortests und mit dem klinischen Bild des Patienten interpretiert werden.

12 Arbeitssicherheit

Der Test ist nur für Diagnosezwecke in vitro vorgesehen.

Die bei der Fertigung der Kontrollen verwendeten Seren wurden mit negativem Ergebnis auf HIV 1 und HIV 2, HBsAg, HCV, TPHA untersucht. Dennoch ist es erforderlich, mit den Seren so umzugehen, als seien sie potentielles Infektionsmaterial.

Einige Reagenzien enthalten das giftige Natriumazid. Vermeiden Sie Hautkontakt.

Die Stopplösung enthält eine verdünnte Säurelösung.

Schützen Sie bei der Arbeit mit dieser Lösung Ihre Augen und Ihre Haut!

Es ist notwendig, die örtlichen Arbeitssicherheitsbestimmungen einzuhalten.

Erste-Hilfe-Maßnahmen

Spülen Sie bei Augenkontakt Ihre Augen gründlich mit lauwarmem Wasser und suchen Sie einen Arzt auf. Entledigen Sie sich bei Kleidungs- und Hautkontakt sämtlicher kontaminierter Kleidung. Spülen Sie die Haut gründlich mit Wasser und Seife ab. Desinfizieren Sie die Haut, sofern Spritzer einer Lösung, die Plasma oder eine klinische Probe enthält, auf diese gelangen. Spülen Sie bei zufälligem Verzehr Ihren Mund mit Trinkwasser aus und nehmen Sie ärztliche Hilfe in Anspruch.

Resteentsorgung

Sämtliche zur Testdurchführung verwendeten Hilfsmittel sind hinsichtlich des Kontakts mit biologischem Material als potentiell infektiös zu betrachten. Deshalb sind sie als biologischer Abfall zu entsorgen.

Entsorgung des Kits nach Ablauf der Haltbarkeitsdauer

Zerlegen Sie das Kit in seine einzelnen Komponenten und entsorgen Sie diese als biologisches Material. Entsorgen Sie die Verpackungen und Verpackungsreste gemäß den örtlichen Vorschriften als sortierten Abfall.

13 Technische Anmerkungen

Um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen, ist die genaue Einhaltung der Anleitung notwendig. Verwenden Sie bei der Arbeit stets Hilfsmittel höchsten Sauberkeitsgrades. Bevorzugen Sie Hilfsmittel für den einmaligen Gebrauch.

http://slovnik.seznam.cz/de-cz/?q=S%C3%A4ure


26.11.2018 13/20 version 1

Mikrotiterplatte – Bringen Sie vor dem Öffnen den Beutel mit der Mikrotiterplatte auf Labortemperatur, damit auf der Plattenoberfläche kein Wasserdampf kondensiert.

Waschlösung – verwenden Sie zur Vorbereitung der Waschlösungs-Arbeitsverdünnung hochwertiges destilliertes Wasser.

Waschen – halten Sie die vorgeschriebene Anzahl der Waschzyklen ein und füllen Sie die Vertiefungen bis zum oberen Rand. Die Zeitdauer, während der die Vertiefungen zwischen den Waschzyklen mit der Waschlösung gefüllt verbleiben (soak time), sollte etwa 30 – 60 Sekunden betragen.

TMB-Lösung – verwenden Sie die Pipettierwanne für TMB-Lösung für keine anderen Lösungen. Füllen Sie den Lösungsrest aus der Pipettierwanne nicht in die Flasche zurück.

Nicht nachvollziehbaren Ergebnissen können methodische Fehler zugrunde liegen, insbesondere:

• unzureichendes Mischen der Lösungen und der Proben vor der Verwendung

• Vertauschen der Flaschenverschlüsse

• Verwendung der gleichen Spitze zum Pipettieren verschiedener Lösungen

• die Reagenzien wurden zu hohen Temperaturen, bakterieller oder chemischer Kontamination ausgesetzt

• unzureichendes Auswaschen der Vertiefungen, die Vertiefungen wurden nicht bis zum Rand gefüllt, schlechtes Absaugen der Lösungsreste

• Verschmutzung der Vertiefungsränder mit Konjugat oder mit Proben

• Vertauschen der Reagenzien aus verschiedenen Kit-Chargen

• Kontakt der Reagenzien mit Oxidationsmitteln, Schwermetallen und deren Salzen.

• Das Kit kann in mehrere Tests aufgeteilt werden. Entnehmen Sie zur Vorbereitung der Arbeitslösungen nur so große Mengen Reagenzien, wie für die Analyse notwendig sind.

• Der Test kann auf allen Typen automatischer ELISA-Analysatoren durchgeführt werden. Bei Bedarf bietet DIAsource ImmunoAssays S.A. eine zertifizierte Modifizierung der Arbeitsanweisung für den jeweiligen Automatentyp an.


26.11.2018 14/20 version 1

Bei Nichteinhaltung des Arbeitsverfahrens haftet der Hersteller nicht für die korrekte Funktion des Tests.

14 Index der Avidität

14.1 Einleitung

Die Avidität der Antikörper bringt die Festigkeit der Bindung zwischen dem Antigen und den Antikörpern zum Ausdruck. Bei der Primärinfektion werden zunächst Antikörper mit geringer Avidität gebildet. Im Verlaufe der Infektion reift die Immunreaktion des Organismus aus und die Avidität der Antikörper nimmt zu. In der latenten Phase der Erkrankung sind die Antikörper hochavid und bei einer Sekundärinfektion oder einer Reaktivierung produzieren die Gedächtnis-B-Zellen sofort IgG-Antikörper mit hoher Avidität. Die Feststellung der Avidität der IgG-Antikörper ermöglicht die genauere Bestimmung der Ansteckungsphase und ist eine sinnvolle Ergänzung zur serologischen Diagnostik.

14.2 Testprinzip

Die Bestimmung der Avidität der Antikörper basiert auf dem Prinzip der Beeinträchtigung der Bindung zwischen dem Antigen und den Antikörpern durch eine Aviditäslösung (Harnstofflösung). Antikörper mit geringer Avidität werden durch das Wirken der Aviditätslösung aus der Bindung an das Antigen freigesetzt und ausgeschwemmt. Im Gegensatz hierzu bleiben die hochaviden Antikörper auch nach dem Wirken der Aviditätslösung zum Großteil an das Antigen gebunden. Die Festigkeit der Bindung wird durch den Index der Avidität (IAv) ausgedrückt, der festlegt, welcher Anteil der Antikörper (in %) nach der Inkubation mit der Aviditätslösung an das Antigen gebunden blieb. Die praktische Bestimmung besteht in der Durchführung des modifizierten ELISA-Verfahrens unter Verwendung der Aviditätslösung, im Vergleich zum normalen Verfahren ELISA.

Die Bestimmung der IgG-Avidität erfolgt nur bei IgG-positiven Proben.

14.3 Probenverdünnung

Verdünnung der Serum- und Plasmaproben (siehe Kapitol Probenverdünnung).


26.11.2018 15/20 version 1

14.4 Testdurchführung

Bringen Sie alle Reagenzien, einschließlich der Aviditätslösung, auf Labortemperatur und mischen sie gründlich. Im Fläschchen mit der Aviditätslösung können sich Kristalle bilden. Diese Kristalle sind vor Gebrauch durch kurzes Erwärmen aufzulösen. Die Funktionsfähigkeit der Aviditätslösung wird durch gelbe Färbung angezeigt. Die Lösung ist temperaturempfindlich. Ein Farbumschlag von gelb auf rot bedeutet eine Verschlechterung, rotgefärbte Aviditätslösung kann nicht mehr verwendet werden!

1. Pipettieren Sie die Kontrollen sowie die verdünnten Proben gemäß dem Arbeitsschema.




• Pipettieren Sie 100 µl der Positiven Kontrolle (Kalibrator 3) in 1 Vertiefung.

• Pipettieren Sie 100 µl der verdünnten Proben (siehe Kapitol Probenverdünnung) in zwei benachbarte Vertiefungen des Strips N und Av.



4. Pipettieren Sie in alle Vertiefungen der Strips Av 100 µl Aviditätslösung.

5. Pipettieren Sie in alle Vertiefungen der Strips N 100 µl der Arbeitswaschlösung.

6. Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab und lassen Sie sie 5 Minuten bei Labortemperatur inkubieren.


8. Pipettieren Sie in alle Vertiefungen mit Ausnahme von A1 100 µl Konjugat.


10. Saugen Sie den Inhalt der Vertiefungen ab und waschen Sie 5x mit Arbeitswaschlösung. Füllen Sie die Vertiefungen bis zum oberen Rand. Verbleibende Flüssigkeit zum Schluss durch Ausklopfen auf saugfähigem Papier entfernen.


26.11.2018 16/20 version 1

11. Pipettieren Sie in alle Vertiefungen 100 µl TMB-Lösung. Achten Sie auf Verschmutzungen – siehe Kapitol Technische Anmerkungen.

12. Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab und lassen Sie sie 30 Minuten bei 37°C im Dunkeln inkubieren.

13. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 µl Stopplösung in der gleichen Reihenfolge und den gleichen Intervallen, wie das Substrat pipettiert wurde.

14. Messen Sie am Photometer bei einer Wellenlänge von 450 nm die Intensität der Verfärbung der Lösungen in den Vertiefungen im Vergleich zum Blank (Vertiefung A1), und zwar innerhalb von 30 Minuten nach dem Stoppen der Reaktion.


26.11.2018 17/20 version 1

14.5 Arbeitsschema

BL

NK

CO

CO

PK

TP 1 TP 1

TP 2 TP 2

TP 3 TP 3

A

B

C

D

E

G

H

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

AvN

N Strip für den Normaltest (ohne Aviditätslösung)

Av Strip für den Aviditätstest (Inkubation mit Aviditätslösung)

BL Blank (leere Vertiefung)

NK 100 µl

CO 100 µl

PK 100 µl

TP 1-x 100 µl verdünnte Testprobe


26.11.2018 18/20 version 1

14.6 Testvalidität

Die Auswertung der Validität des Tests erfolgt anhand der N-Strips (siehe Kapitol Testvalidität)

14.7 Auswertung der Ergebnisse

Berechnung des Aviditätsindex (IAv)

Dividieren Sie die Extinktion der getesteten Probe auf dem Strip Av durch die in der gleichen Serie der Untersuchung gemessene Extinktion der auf dem Strip N getesteten Probe:

Interpretation der Untersuchungsergebnisse siehe Tabelle (Tabelle 3).

Tabelle 3 Interpretation der Untersuchungsergebnisse

Aviditätsindex (IAv) in %

Auswertung der Avidität

Interpretation der Ergebnisse

< 40 niedrig Primärinfektion – bis zu 18 Wochen nach

Infektion

40 - 45 grenzwertig unklar, Untersuchung wiederholen

> 45 hoch latente Infektion

Reaktivierung einer latenten Infektion oder Reinfektion, bei gleichzeitigem IgM-

Antikörpernachweis

Sind die Ergebnisse in grenzwertigem Bereich, wird empfohlen, eine zweite Probe nicht früher als sieben Tage nach der ersten Probe zu entnehmen und gemeinsam mit der ersten Probe eine Paralleluntersuchung durchzuführen.


26.11.2018 19/20 version 1

15 Symbolerklärung

Lagerungstemperatur

Biogefährdung

Mindesthaltbarkeitsdatum

Chargennummer

Hersteller

Gebrauchsanleitung beachten

Katalognummer

Testanzahl

In-Vitro-Diagnostikum


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Testschema VARICELLA ZOSTER IgG ELISA

Step Symbol Einzelne Testschritte

1

Verdünnung der Proben

von Serum/Plasma 1:101 (10 µl + 1 ml)

von Liquor 1:3 (50 µl + 100 µl)

2 Pipettieren der Kontrollen (Kalibratoren) und der verdünnten Proben 100 µl

Blank = leere Vertiefung

3 Inkubation 30 Min. bei 37°C

4 Absaugen und Waschen der Vertiefungen 5×

5 Pipettieren des Konjugats 100 µl

Blank = leere Vertiefung


7 Absaugen und Waschen der Vertiefungen 5×

8 Pipettieren des Substrats (TMB-Lösung) 100 µl

Einschließlich Blank


10 Pipettieren der Stopplösung 100 µl

Einschließlich Blank

11 Photometrische Messung bei 450 nm


KAPRVIG20

VARICELLA ZOSTER IgG ELISA ES

26.11.2018 2/20 versión 1

ÍNDICE

1 Introducción ..................................................................................................... 3

2 Principio del test .............................................................................................. 4

3 Composición del conjunto ................................................................................ 5

4 Otro equipamiento necesario para hacer el test de forma manual ................... 6

5 Almacenaje y caducidad de los juegos .............................................................. 6

6 Preparación de soluciones de trabajo ............................................................... 6

7 Dilución de muestras ........................................................................................ 7

8 Procedimiento de trabajo ................................................................................. 7

9 Esquema de trabajo ......................................................................................... 9

10 Validez del test ............................................................................................... 10

11 Valoración de los resultados .......................................................................... 10

12 Seguridad en el trabajo .................................................................................. 12

13 Condiciones técnicas ...................................................................................... 12

14 Índice de avidez.............................................................................................. 13

15 Explicación de los símbolos ............................................................................ 18


26.11.2018 3/20 versión 1

Juego inmunoenzimático para establecer los anticuerpos IgG contra el virus de la varicela zóster y su avidez en el suero

humano, plasma o líquido cefalorraquídeo

1 Introducción

El virus varicela-zóster (VZV, HHV-3) es parte del grupo de los herpesvirus y provoca la enfermedad infecciosa de la varicela (infección primaria) y herpes (reactivación).

La infección primaria del VZV ocurre con más frecuencia en la infancia, con infección por gotitas. Tras el contacto con la persona infectada hasta el 90% de las personas sin anticuerpos específicos se infectan. Los síntomas de infección incluyen fiebre, escalofríos, malestar estomacal o diarrea, picazón o dolor en la piel, en lugares donde un exantema característico aparece más tarde. Como regla general, la enfermedad va desapareciendo sin consecuencias. La infección primaria en adolescentes y adultos es más difícil, a veces tiene complicaciones graves (p. ej. encefalitis, neumonía e inflamación del hígado), especialmente en personas con inmunidad deteriorada. El virus también penetra por la placenta y la infección fetal posterior puede provocar defectos congénitos graves. Si una infección de una madre seronegativa (sin anticuerpos específicos) ocurre alrededor del término del parto, la vida del recién nacido está seriamente amenazada.

El rasgo característico del VZV es su propensión a la persistencia en el cuerpo. Cuando se reduce la respuesta inmune, el virus puede reactivarse y aparece el herpes.

El diagnóstico de la enfermedad está basado en el cuadro clínico y en pruebas de laboratorio. En el diagnóstico de laboratorio de VZV se utilizan a menudo métodos serológicos, determinados por anticuerpos específicos de la clase IgG, IgA, IgG y su avidez por el método ELISA. Los anticuerpos específicos de clase IgG son de naturaleza anamnésica y sirven para determinar el estado inmunológico del individuo.

Los anticuerpos específicos de clase IgM e IgA son indicadores de infección activa (infección primaria y reactivación) y desaparecen en la fase de convalecencia. En algunos casos pueden durar meses.

Los anticuerpos específicos IgG permanecen a un nivel bajo durante toda la vida. Establecer la avidez de los anticuerpos IgG sirve para diferenciar la infección primaria de infecciones previas o su reactivación.


26.11.2018 4/20 versión 1

2 Principio del test

El juego permite la detección de anticuerpos específicos de la clase IgM en la muestra del método EIA, tipo sándwich (fase fija con antígeno específico unido - anticuerpo de la muestra de ensayo - anticuerpo marcado). El anticuerpo marcado (conjugado) es una fracción de inmunoglobulina animal contra IgG humana, conjugada con peroxidasa de rábano picante. La actividad de la peroxidasa la determina el sustrato con TMB, que se vuelve azul en el caso de positividad. Toda la reacción se acaba con una solución de parada. Se produce un cambio del colorido azul a amarillo. La intensidad del amarillo se mide en el fotómetro (longitud de onda de 450 nm) y es proporcional a la concentración de anticuerpos IgG específicos presentes en la muestra.

Uso del antigen

Antígeno VZV purificado e inactivado con alto contenido de epítopos inmunodominantes específicos


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3 Composición del conjunto

Placa cubierta 1 un.

con antígeno unido, 12 x 8 pocillos en una bolsa con un desecante

Control negativo (Calibrador 1) 10 IU/l 1 × 2 ml

La solución no contiene anticuerpos humanos específicos, en dilución de trabajo

CUT-OFF (Calibrador 2) 100 IU/l 1 × 3 ml

La solución contiene anticuerpos humanos específicos en concentración límite, en dilución de trabajo

Control positivo (Calibrador 3) 500 IU/l 1 × 2 ml

La solución contiene anticuerpos humanos específicos en dilución de trabajo

Calibrador 4 (2500 IU/l) 1 × 2 ml

La solución contiene anticuerpos humanos específicos en dilución de trabajo

Conjugado 1 × 15 ml

La solución contiene inmunoglobulina animal contra la IgG humana marcada con peroxidasa, en dilución de trabajo

Solución de dilución en muestra 2 1 × 105 ml

Tampón con estabilizador de proteínas, en solución de trabajo

Solución de TMB 1 × 15 ml

Solución de substrato de un componente con

contenido TMB/H2O2 en solución de trabajo

Solución de lavado 1 × 75 ml

Tampón concentrado 20 veces

Solución de parada 1 × 15 ml

Solución de ácido en dilución de trabajo

Solución avídica 1 1 × 7 ml

Solución estabilizada de urea

Manual de trabajo 1 un.


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4 Otro equipamiento necesario para hacer el test de forma manual

Pipetas sencillas y multicanal

Puntas de uso único

Dispositivo de lavado

Huellas

Termostato a 37 °C

Fotómetro para placa de microtracción

5 Almacenaje y caducidad de los juegos

Almacene los juegos a temperatura entre +2 °C y +8 °C. Si se observan la condiciones de almacenaje es válida la fecha de caducidad. Tras la abertura se recomienda consumir el juego dentro de 3 meses. ¡El juego no se debe congelar!

Las muestras y su almacenaje

Como muestra para el examen se puede usar suero humano, plasma de citrato y líquido cefalorraquídeo. Las muestras con contaminación bacteriana, hemolíticas o de quilosano y anticoagulantes contenidos en el plasma (excepto el citrato) pueden afectar el resultado de la prueba.

Las muestras examinadas se pueden almacenar entre + 2 ° C y + 8 ° C durante un máximo de 1 semana. Para un almacenamiento más prolongado, congelar a -20 ° C. Las muestras diluidas deben examinarse cuanto antes.

6 Preparación de soluciones de trabajo

Diluya la solución de lavado 1:20 (1 parte de solución y 19 partes de agua destilada). Por ej. 75 ml de solución de lavado concentrada + 1425 ml de agua destilada.

En el frasco con solución de lavado se pueden crear cristales de sal. Estos cristales es necesario disolverlos antes del uso con un baño en agua caliente. La solución diluida es estable una semana entre +2 °C y +8 °C.

¡Los controles y los calibradores están en solución de trabajo, no diluir más!

¡El conjugado está en la solución de trabajo, no diluir más!

Solución de TMB es una solución de sustrato cromogénico de un componente en dilución de trabajo, ¡no diluirla más!

Intercambiabilidad de las soluciones

El Diluyente de muestra, la Solución de TMB y la Solución de avidez son intercambiables entre algunos ELISA de DIAsource ImmunoAssays S.A., siempre que tengan la marca numérica idéntica (por ejemplo, Solución de dilución en muestra 2, Solución de dilución en muestra 3, etc.). Se puede solicitar más información relativa a esta intercambiabilidad a DIAsource ImmunoAssays S.A.


26.11.2018 7/20 versión 1

7 Dilución de muestras

Mezcle bien antes de usarla la solución de dilución de muestras.

Dilución de muestras de suero y plasma

Diluya 1:101 con solución de dilución de muestras las mezclas bien mezcladas:

por ej.: 10 µl muestras + 1 ml solución de dilución de muestras.

Mezcle bien.

Dilución de la muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR)

Diluya LCR bien mezclado 1:3 con solución de dilución de la muestra:

por ej.: 50 µl LCR + 100 solución de dilución de muestras.

Mezcle bien.

8 Procedimiento de trabajo

Deje que todos los reactivos se aclimaten a la temperatura del laboratorio y mézclelos bien. Si no utiliza toda la placa, devuelva las tiras sobrantes al embalaje con secante, cierre de forma hermética y almacene a +2 °C y +8 °C. ¡Proteja bien de la humedad!

1. Dosifique los controles (calibradores) y las muestras diluidas según el esquema de trabajo.

Evaluación semicuantitativa en el índice de positividad (IP)

• Deje el pocillo A1 vacío (blank).

• Pipetee 100 µl de control negativo (calibrador 1) en 1 pocillo.

• Pipetee 100 µl de CUT-OFF (calibrador 2) en 2 pocillos.

• Pipetee 100 µl de control positivo (calibrador 3) en 1 pocillo.

• Pipetee 100 µl de muestras en solución correspondiente (véase capítulo de dilución de muestras) en el resto de los pocillos.

Evaluación cuantitativa en unidades IU/l

• Deje vacío el pocillo A1 (blank).

• Pipetee 100 μl de control negativo (Calibrador 1) en 1 pocillo.


• Pipetee 100 µl de control positivo (calibrador 3) en 2 pocillos.

• Pipetee 100 µl de calibrador 4 en 2 pocillos.

• Pipetee 100 μl de muestras en la dilución control correspondiente (ver capítulo de Dilución de muestras) en los restantes pocillos.

2. Cubra la placa con una cubierta e incúbela 30 minutos a 37 °C.


26.11.2018 8/20 versión 1

3. Absorba el contenido de los pocillos y lave 5 veces con solución lavado de trabajo. Llene los pocillos hasta el borde superior. Al final sacuda bien los restos de solución en material absorbente.

4. Dosifique conjugado en todos los pocillos excepto A1 100 µl.



7. Dosifique en todos los pocillos 100 µl de substrato Solución de TMB de un componente. Cuidado con la suciedad – ver capítulo de Comentarios técnicos.

8. Cubra la placa con una cubierta e incúbela 30 minutos a 37 °C en la oscuridad.

9. Detenga la reacción añadiendo 100 µl de solución de parada en el mismo orden e intervalos como se dosificó el sustrato.

10. Mida en el fotómetro a una longud de onda de 450 nm la intensidad de la coloración de la solución en los pocillos contra el blank (pocillo A1), dentro de 30 minutos tras detenerse la reacción.


26.11.2018 9/20 versión 1

9 Esquema de trabajo

evaluación semicuantitativa evaluación cuantitativa

en el índice de positividad (IP) en unidades IU/l

BL TV 4

NK TV 5

CO

CO

PK

TV 1

TV 2

TV 3

A

B

C

D

E

G

H

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

BL TV 1

Kal1 TV 2

Kal2 TV 3

Kal2 TV 4

Kal3 TV 5

Kal3

Kal4

Kal4

A

B

C

D

E

G

H

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

BL Blanc (pocillo vacío) BL Blanc (pocillo vacío)

NK 100 µl Kal1 100 µl

CO 100 µl Kal2 100 µl

PK 100 µl Kal3 100 µl

TV 1-x 100 µl muestra de prueba diluida

Kal4 100 µl



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10 Validez del test

El test es válido si:

La absorbancia del blank es menor de 0,150.

BLANK < 0,150

La absorbancia del control negativo (calibrador 1) es menor que la mitad del promedio de absorbancia de CUT-OFF (calibrador 2).

< 0,5 ×

La absorbancia promedio de CUT-OFF (calibrador 2) está en el rango 0,150 - 0,900.

0,150 < < 0,900

La absorbancia del control positivo (calibrador 3) es 1,5 veces mayor que la absorbancia media de CUT‒OFF (calibrador 2).

> 1,5 ×

La absorbancia del calibrador 4 es mayor que la absorbancia del control positivo (calibrador 3).

>

11 Valoración de los resultados

Cálculo del índice de positividad (IP)

Divida la absorbancia de la muestra de prueba por la absorbancia CUT-OFF media, medida en la misma serie de exámenes:


26.11.2018 11/20 versión 1

La interpretación de los resultados del tratamiento se indica en la tabla(Tabla 1).

Tabla 1 Interpretación de los resultados del tratamiento

Índice de positividad (IP)

Valoración

menor que 0,9 negativo

de 0,9 a 1,1 límite

mayor que 1,1 positivo

El examen de las muestras límite, esto es con índice de positividda de 0,9 a 1,1, es necesario repetirlo en una nueva selección al cabo de 2 a 6 semanas considerando lo específico de la enfermedad concreta.

Evaluación cuantitativa en unidades internacionales (IU/l)

Elabore la curva de calibración de modo que en el eje X refleje las concentraciones de calibrador en IU/l y en el eje Y la absorbancia correspondiente. Enlazando los puntos individuales cree la curva de calibración. Determine el nivel de anticuerpos en muestras (IU/l) restando estos valores de la curva de calibración. La interpretación de los resultados de la evaluación cuantitativa del test se indica en la tabla (Tabla 2).

Nota

La evaluación cuantitativa en unidades internacionales se deriva de la norma internacional WHO (W1044).

Tabla 2 Interpretación cuantitativa en unidades internacionales (IU/l)

Nivel de anticuerpos (IU/l) Valoración

menor que 90 negativo

de 90 a 125 límite

mayor que 125 positivo

El examen de las muestras límite es necesario repetirlo en una nueva selección al cabo de 2 a 6 semanas considerando lo específico de la enfermedad concreta.

El hallazgo serológico se puede interpretar solo en el contexto de los resultados de los otros tests de laboratorio y con el cuadro clínico del paciente.


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12 Seguridad en el trabajo

El juego está destinado solo para finalidades de diagnóstico in vitro.

Los sueros utilizados en la producción de controles se examinaron para detectar VIH 1 y VIH 2, HBsAg, HCV, TPHA, con resultado negativo. A pesar de ello es necesario tratarlos como material potencialmente infeccioso.

Algunos reactivos contienen el componente tóxico de la azida sódica. Evite el contacto con la piel.

La solución de parada contiene solución de ácido diluida. ¡Al trabajar con esta solución protéjase los ojos y la piel!

Es necesario seguir la normativa local en relación con la seguridad en el trabajo.

Primeros auxilios

Si entra en contacto con los ojos con gran cantidad de agua tibia y busque ayuda médica. Si entra en contacto con la ropa y la piel retire toda la vestimenta contaminada. Lave la piel con gran cantidad de agua y jabón. Desinfecte la piel en caso de salpicadura con solución que contenga plasma o muestras clínicas. En caso de ingestión accidental enjuáguese la boca con agua potable y busque ayuda médica.

Liquidación de restos tras hacer los tests

Todos los accesorios utilizados para el test es necesario considerarlos como potencialmente infecciosos debido al contacto con material biológico. Por ello debe desecharlos junto con los residuos biológicos.

Liquidación del juego después de la caducidad

Desmonte el juego en sus componentes individuales y deséchelos como material biológico. Deseche el embalaje y los residuos del embalaje como de acuerdo con las normativas locales de reciclado de residuos.

13 Condiciones técnicas

Para obtener resultados fiables es necesario seguir estrictamente el manual. En el trabajo utilice siempre accesorios con la mayor limpieza. Dé preferencia a accesorios de un uso.

Placa de microtitulación – antes de abrir, deje siempre la placa de microtitulación a temperatura ambiente para evitar la condensación del vapor de agua en la superficie de la placa.

Solución de lavado – utilice agua destilada de alta calidad para preparar la solución de lavado en dilución de trabajo.


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Lavado – siga el número prescrito de ciclos de lavado y llene siempre el pocillo hasta el borde superior. El tiempo en que los pocillos permanecen llenos con la solución entre ciclos de lavado (tiempo de remojo) debe ser de unos 30-60 segundos.

Solución de TMB – no utilice para otras soluciones la tina de pipeta para Solución de TMB. No devuelva el resto de la solución de la pipeta al frasco.

Los resultados no reproductibles pueden venir de errores metódicos, en especial:

• mezcla insuficiente de la solución y de las muestras antes del uso

• reemplazo de tapas de frascos

• uso de la misma punta al pipetear diferentes soluciones

• exposición de reactivos a temperaturas excesivas, contaminación bacteriana o química

• insuficiente llenado de los pocillos, no llenar los pocillos hasta el borde, mala aspiración de los restos de solución

• contaminación de los bordes de los pocillos con conjugado o muestra

• sustitución de reactivos de diferentes lotes de juegos

• contacto de los reactivos con antioxidantes, metales pesados o sus sales.

El juego se puede procesar de forma gradual. Para preparar soluciones de trabajo, recoja solo la cantidad de reactivos que se consumirán para el análisis.

El juego se puede procesar en todos los tipos de analizadores ELISA automáticos. Si es necesario DIAsource ImmunoAssays S.A ofrece una modificación certificada del manual de trabajo para tipos concretos de analizador.

En caso de no observarse el procedimiento de trabajo el fabricante no responde del funcionamiento correcto del juego.

14 Índice de avidez

14.1 Introducción

La avidez de los anticuerpos expresa la firmeza del vínculo entre el antigen y el anticuerpo. En la infección primaria se crean antes anticuerpos con baja avidez. Durante la infección la respuesta inmunológica del organismo madura y se incremente la avidez de los anticuerpos. En la fase latente de la enfermedad los anticuerpos son muy ávidos y durante la infección secundaria o la reactivación las células B de memoria producen enseguida anticuerpos IgG con alta avidez. El establecimiento de la avidez de los anticuerpos IgG permite determinar de forma más precisa la fase de infección y es un complemento adecuado del diagnóstico.

14.2 Principio del test

El establecimiento de la avidez de los anticuerpos se basa en el principio de cancelar los vínculos entre el antígeno y el anticuerpo de la solución de avidez (solución de


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urea). Los anticuerpos con baja avidez por efecto de la solución de avidez se liberan de los enlaces al antígeno y se lavan. Por el contrario los anticuerpos de alta avidez permanecen después del efecto de la solución de avidez en su mayor parte vinculado al antígeno. La fortaleza del vínculo se expresa por el Índice de Avidez (IAv), que establece qué parte de los anticuerpos (en %) permanece vinculada al antígeno para la incubación con solución de avidez. El establecimiento práctico consiste en la realización de un procedimiento ELISA modificado con el uso de la solución de avidez, comparado con el procedimiento ELISA normal.

El establecimiento de la avidez IgG se lleva a cabo solo en muestras positivas IgG.

14.3 Dilución de muestras

Dilución de muestras de suero y plasma (véase el capítulo Dilución de muestras).


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14.4 Procedimiento de trabajo

Deje que todos los reactivos incluida la solución de avidez se aclimaten a la temperatura del laboratorio y mézclelos bien. En el botellín con solución Avídica de lavado se pueden crear cristales. Estos cristales es necesario disolverlos antes del uso calentándolos brevemente. La funcionalidad de la solución avídica la indica una coloración amarilla. La solución es termolábil y en caso de cambio de color de amarillo a rojo significa que se ha degradado. ¡La solución de avidez coloreada de rojo ya no se puede usar!

1. Dosifique controles y las muestras diluidas según el esquema de trabajo.

• Deje vacío el pocillo A1 (blank).

• Pipetee 100 μl de control negativo (Calibrador 1) en 1 pocillo.


• Pipetee 100 μl de control positivo (calibrador 3) en 1 pocillo.

• Pipetee 100 μl de muestras en solución correspondiente (ver capítulo de dilución de muestras) en dos pocillos adyacentes en la tira N y Av.



4. Dosifique en todos los pocillos de las tiras Av 100 µl de solución de avidez.

5. Dosifique en todos los pocillos de las tiras N 100 µl de solución de lavado.

6. Cubra la placa con una cubierta e incúbela 5 minutos a temperatura del laboratorio.

7. Absorba el contenido de los pocillos y lávelo 5 veces con una solución de lavado de trabajo. Llene los pocillos hasta el borde superior. Al final sacuda bien los restos de solución en material absorbente.

8. Dosifique en todos los pocillos excepto A1 100 µl de conjugado.



11. Dosifique en todos los pocillos 100 µl de substrato Solución de TMB de un componente. Cuidado con la suciedad – ver capítulo de Comentarios técnicos.

12. Cubra la placa con una cubierta e incúbela 30 minutos a 37 °C en la oscuridad.

13. Detenga la reacción añadiendo 100 µl de solución de parada en el mismo orden e intervalos como se dosificó el sustrato.


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14. Mida en el fotómetro a una longud de onda de 450 nm la intensidad de la coloración de la solución en los pocillos contra el blank (pocillo A1), dentro de 30 minutos tras detenerse la reacción.

14.5 Esquema de trabajo

BL

NK

CO

CO

PK

TV 1 TV 1

TV 2 TV 2

TV 3 TV 3

A

B

C

D

E

G

H

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

AvN

N tiras para un test normal (sin solución de avidez)

Av tiras para un test de avidez (incubación con solución de avidez)

BL Blanc (pocillo vacío)

NK 100 µl

CO 100 µl

PK 100 µl



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14.6 Validez del test

La valoración de la validez del test se lleva a cabo en tiras N (véase el capítulo Validez del test)

14.7 Valoración de los resultados

Cálculo del índice de avidez (IAv)

Divida la absorbancia de la muestra de prueba en la tira Av por la absorbancia de la muestra de prueba en la tira N medida en la misma serie de exámenes:

La interpretación de los resultados del examen se indica en la tabla (Tabla 3).

Tabla 3 Interpretación de los resultados del examen

Índice de avidez (IAv) v %

Valoración de la avidez

Interpretación de los resultados

< 40 baja infección primaria

40 - 45 límite no concluyente, repetición de exámenes

>45 alta infección latente,

reactivación de la infección latente o reinfección (con detección simultánea de

anticuerpos IgM)

Si los resultados del test están en zona límite, se recomienda tomar una segunda muestra no antes de siete días después de la primera muestra y realizar un examen paralelo junto con la primera muestra.


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15 Explicación de los símbolos

Temperatura de almacenaje

Riesgo biológico

Utilizar hasta la fecha

Número de lote

Fabricante

Lea el manual de instrucciones

Número de catálogo

Número de tests

Producto de diagnóstico sanitario in vitro


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Notas


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Esquema de test VARICELLA ZOSTER IgG ELISA

Paso Símbolo Pasos individuales del test

1

Dilución de muestras

suero/plasma 1:101 (10 µl + 1 ml)

líquido cefalorraquídeo 1: 3 (50 μl + 100 μl)

2 Dosificación del control (calibradores) y dilución de las muestras 100 µl

Blank = pocillo vacío

3 Incubación 30 min a 37 °C

4 Absorción y lavado de los pocillos 5 veces

5 Dosis de conjugado 100 μl

Blank = pocillo vacío


7 Absorción y lavado de los pocillos 5 veces

8 Dosificación de sustrato (Solución de TMB) 100 μl

Incluyendo los blanks


10 Dosificación de la solución de parada 100 µl

Incluyendo los blanks

11 Medición fotométrica a 450 nm

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