variação genética em diferentes subtipos do hiv-1 e seu papel na
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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Biologia
Departamento de Genética
______
Variação genética em diferentes subtipos do HIV-1 e seu
papel na susceptibilidade viral a drogas antirretrovirais
André Felipe Andrade dos Santos
Tese apresentada como requisito
parcial para obtenção do título
de Doutor em Ciências Biológicas
– Modalidade Genética
Orientador: Prof. Marcelo Alves Soares
Rio de Janeiro
2010
2
SANTOS, André Felipe Andrade dos
Variação genética em diferentes subtipos do HIV-1 e seu papel na susceptibilidade viral a
drogas antirretrovirais
Rio de Janeiro, Universidade do Brasil / UFRJ, 2010
Páginas: 262
Tese de Doutorado em Ciências Biológicas (Genética)
1. HIV-1 2. Diversidade genética 3. Resistência 4. Hipersensibilidade
5. Tratamento
I. Departamento de Genética – Instituto de Biologia – Universidade do Brasil / UFRJ
II. Título
3
AGRADECIMENTOS
Queria deixar aqui expresso todo o meu carinho às pessoas que tornaram
possível a elaboração deste trabalho.
Primeiramente agradeço ao meu orientador Marcelo Soares a quem devo muito
pela minha formação acadêmica nesse longo caminho da ciência. Obrigado pela
atenção, paciência, amizade, pelas longas discussões de teorias científicas e pela
disposição em ouvir minhas idéias. Graças a esse estágio que começou a mais de seis
anos descobri uma verdadeira paixão pela pesquisa.
Não posso de deixar de agradecer ao professor Eric Arts e ao PhD Denis Tebit.
Ao primeiro por me acolher de braços abertos em seu labs, que permitiu que a espinha
dorsal desta tese se tornasse realidade. A Denis por toda a paciência deste mundo em me
ensinar as técnicas necessárias para desenvolver meus experimentos.
Ao grande amor da minha vida, Cláudia Priscila, por me reensinar toda a
plenitude de se amar. Ao seu lado me sinto a pessoa mais especial, segura, completa e
feliz deste mundo. A nossa separação por um ano foi extramamente difícil e dolorosa,
mas foi graças ao seu apoio, carinho, amizade, paciência (e eu sei que foram em altas
doses), companheirismo e compreensão (agradeçamos ao skype e msn também) que este
eterno nerd conseguiu completar esta tese. Obrigado por ter sempre acreditado em mim.
Tenho muito orgulho de ter você ao meu lado.
Aos meus pais, Dalmo e Cláudia, por todo o carinho, amor, atenção e dedicação
ao longo de minha vida. Mais ainda por todo apoio que sempre me deram desde o
primeiro momento em que decidi optar pelos caminhos da Genética. Também agradeço
aos meus irmãos, Rodrigo e Danielle, por todo o apoio que sempre me deram.
Não menos importantes agradeço aos amigos do LVH unidade UFRJ: Thati,
Lívia, Lian, Elisabete, Gabriel, Priscila, Louise e Luãnna. Obrigado pelo
companheirismo, amizade, esforço e dedicação. Também agradeço aos integrantes do
LVH que trabalham no INCA. Um agradecimento especial à Fátima por todas as pontas
que segura. Agradeço também ao LAGMES por nos ensinar que as dificuldades podem
ser levadas com bom humor.
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“A ciência permanecerá sempre a satisfação do desejo mais alto da nossa
natureza, a curiosidade; fornecerá sempre ao homem o único meio que ele possui de
melhorar a própria sorte.”
Ernest Renan (1823-1892) – Filósofo Francês.
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LISTA DE ABREVIATURAS
3TC – Lamivudina
ABC – Abacavir
AC – Antagonista de CCR5
APV – amprenavir
ATV – atazanavir
AZT – Zidovudina
CCID50 – dose capaz de infectar 50% da cultura celular (do inglês cell culture infectious
dose 50%)
CRF – forma recombinante circulante (do inglês circulanting recombinant form)
d4T – Estavudina
ddC – Zalcitabina
ddI – Didanosina
DLV – delavirdina
DMEM – do inglês Dulbecco/Vogt modified Eagle’s Minimal Essential Medium
DMSO – dimetilsulfóxido
DNA (ou ADN) – Ácido desoxirribonucléico
DNAc – DNA complementar
DNAg – DNA genômico
DRV – darunavir
EFV – efavirenz
ETV – etravirina
fAPV – fosamprenavir
FTC – Emtribicina
HS – hipersusceptibilidade
h – hora
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HAART – terapia antirretroviral altamente ativa (do inglês highly active antiretroviral
therapy).
HIV (ou VIH) – Vírus da Imunodefiência Humana
HTLV – vírus linfotrófico da células T humana (do inglês Human T lymphotropic virus)
IAS – do inglês International AIDS Society
IC50 – concentração média de droga anti-HIV necessária para inibir 50% dos vírus (do
inglês inhibitory concentration 50)
IDV – indinavir
IF – Inibidor de Fusão
II – Inibidor de Integrase
INTR – Inibidor Nucleosídico / Nucleotídico da Transcriptase Reversa
INNTR – Inibidor Não-Nucleosídico da Transcriptase Reversa
IP – Inibidor de Protease
kb – kilobases (= 1000 pares de base)
LAV – do inglês lymphadenopathy-associated virus
LPV/r – lopinavir/ritonavir
LTR – Repetições Terminais Longas (do inglês Long Terminal Repeats)
MOI – multiplicidade de infecção
MRD – mutação de resistência a drogas
NFV – nelfinavir
ng – nanograma
nm – nanomêtro
NR – nível de resistência
NVP – nevirapina
OLA – ensaio de ligação de oligonucleotídeos (do inglês oligonucleotide ligation assay)
PBS – sítio de ligação do iniciador (do inglês primer binding site)
PBS – tampão fosfato-salino (do inglês phosphate buffered saline).
PCR – reação de polimerização em cadeia
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RENAGENO – Rede Nacional de Laboratórios de Genotipagem
RNA (ou ARN) – ácido ribonucléico (do inglês ribonucleic acid)
RNAm – RNA mensageiro
rpm – rotação por minuto
RPMI – do inglês Roswell Park Memorial Institute
RTV – ritonavir
SFB – soro fetal bovino
SIV – vírus da imunodeficiência símia (do inglês simian immunodeficiency virus)
SQV – saquinavir
TDF – Tenofovir
TPV – tipranavir
UNAIDS – Programa das Nações Unidas para a Aids (do inglês United Nations
Programme for HIV/AIDS)
URF – forma recombinante única (do inglês unique recombinant form).
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RESUMO
O HIV é caracterizado por uma grande variabilidade genética, onde o grupo M –
responsável pela pandemia – é dividido em nove subtipos puros e mais de 40 formas
recombinantes circulantes intersubtípicas. A distribuição desta variabilidade viral é
heterogênea no mundo, com o subtipo B sendo prevalente em países desenvolvidos e o
subtipo C presente em países super-populosos e em países africanos, que juntos
comportam 2/3 dos pacientes convivendo com HIV/Aids. O tratamento antirretroviral
foi desenvolvido com base nas informações genéticas do subtipo B e sua eficácia em
outros subtipos do grupo M tem sido alvo de investigação devido ao pouco
conhecimento acerca do comportamento destes subtipos frente aos antirretrovirais.
Paradoxalmente, algumas drogas parecem inibir melhor determinados subtipos não-B
do que o próprio subtipo B, para o qual foram primariamente desenvolvidas. Nosso
objetivo neste projeto foi o de verificar a cinética de aparecimento de MRDs ao longo
do tratamento em diferentes subtipos e determinar as bases genéticas deste fenômeno.
Nós demonstramos que determinados subtipos acumulam uma menor proporção de
determinadas MRDs ao longo de tratamento antirretroviral em 2.245 isolados virais de
diferentes pacientes. Também demonstramos o acúmulo diferencial de TAMs ao longo
do tempo de acordo com o subtipo analisado e a composição terapêutica utilizada. A
proporção de HS também mostrou diferenças entre os subtipos em relação ao subtipo B
para as drogas APV, IDV, NFV ABC, AZT, d4T, ddI e NVP. Os polimorfismos que
conferem o fenótipo HS foram mapeados e inseridos em clone infectivo de CRF02_AG
para medir seu papel individual ou em conjunto na HS. Desta forma, demonstramos que
os polimorfismos 17E e 64M em conjunto conferem HS a NFV e SQV, enquanto 70R
confere HS a APV e IDV. Além disso, tais polimorfismos aumentaram a capacidade
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replicativa viral em relação ao tipo selvagem. Também demonstramos que a MRD
L90M sozinha em isolados de subtipo G não eleva significativamente o nível de
resistência a NFV, mas apenas quando em conjunto com L89I, diferentemente de
isolados do subtipo B. Os resultados deste estudo podem auxiliar a melhor direcionar o
tratamento de pacientes infectados por subtipos não-B, que são responsáveis por cerca
de 80% das novas infecções mundiais, prolongando o tempo de aparecimento de
mutações de resistência a antirretrovirais e garantindo uma melhor expectativa de vida
aos pacientes que convivem com HIV/Aids, ao suprimir a carga viral por mais tempo.
10
ABSTRACT
HIV-1 is characterized by a great genetic variability, in which group M –
responsible by the pandemics – is divided into nine pure subtypes and over 40
intersubtypic circulating recombinant forms. The worldwide distribution of variability is
heterogeneous, in with subtype B being more prevalent in the developed countries and
subtype C in populous in Asian countries and in African countries, where 2/3 of people
living with HIV/AIDS are located. The antiretroviral treatment was developed for
subtype B and its efficacy in the other group M subtypes has been target of investigation
due to the scarce knowledge of their response to antiretrovirals. Paradoxically, some
drugs appear to better inhibit certain non-B subtypes than subtype B, for which they
were primarily designed. Our aim in this project was evaluate the kinetics of drug
resistance mutation (DRM) emergence along treatment in different subtypes and to
elucidate its determinants. We showed that some subtypes accumulated a smaller
proportion of definite MRDs across antiretroviral treatment when compared to subtype
B in 2,245 viral isolates from different patients. We also demonstrated differential
accumulation of TAMs across time according to the subtype analyzed and therapeutic
composition. The proportion of hypersusceptibility (HS) also showed differences within
subtypes compared to subtype B for drugs amprenavir, indinavir, nelfinavir, abacavir,
zidovudine, stavudine, didanosine and nevirapine. The polymorphisms responsible for
the HS phenotype were mapped and inserted in a CRF02_AG infectious clone to verify
their role in HS individually and in combination. We were able to show that the
polymorphisms 17E and 64M together conferred HS to NFV and to SQV, while 70R
conferred HS to APV and to IDV. Moreover, such polymorphisms increased viral
replicative capacity in relation to the wild-type CRF02_AG. We also showed that the
11
DRM L90M per se in subtype G isolates did not elevate significantly the fold-change to
NFV, but only when together with L89I, differently from subtype B isolates. Results of
this work may help to better guide treatment in patients infected with non-B subtypes,
responsible for about 90% of new worldwide HIV infections, prolonging the emergence
of DRMs and ensuring a better life expectancy to patients living with HIV/AIDS.
12
ÍNDICE
1. Introdução ..........................................................................................................................19
1.1. Pandemia da Aids ................................................................................................19
1.2. Classificação e origem do HIV ............................................................................21
1.3. Organização genômica viral ................................................................................24
1.4. A partícula viral ...................................................................................................26
1.5. O cilco de vida do HIV-1 .....................................................................................28
1.6. A diversidade genética do HIV-1 ........................................................................42
1.7. O fenômeno da recombinação ..............................................................................46
1.8. O tratamento antirretroviral e a resistência a drogas ............................................50
1.9. Epidemiologia global do HIV-1 grupo M ............................................................55
1.10. Impacto dos antirretrovirais nos diferentes subtipos do HIV-1 ..........................57
1.11. Seleção diferencial de resistência em subtipos não-B ........................................60
2. Objetivos .............................................................................................................................63
3. Material e métodos ............................................................................................................64
3.1. Obtenção de sequências de isolados virais de pacientes em falha terapêutica
infectados pelos subtipos B e F1 ......................................................................64
3.2. Obtenção de sequências de isolados virais de pacientes em falha terapêutica
infectados com os subtipos B e G .....................................................................64
3.3. Obtenção de sequências virais de diferentes subtipos do HIV-1 oriundos de
falha terapêutica de um banco de dados global ................................................65
3.4. Cinética de aparecimento de mutações de resistência ao longo do tempo de
tratamento .........................................................................................................66
3.5. Fenotipagem de isolados de subtipos do grupo M do HIV-1 ..............................67
3.6. Proporção de hipersusceptibilidade e mapeamento polimórfico .........................67
3.7. Mutagênese sítio-dirigida .....................................................................................68
13
3.8. Sequenciamento dos plasmídeos pBD6-15 mutagenizados .................................71
3.9. Transfecções e ensaio de atividade da transcriptase reversa viral ........................72
3.10. Escolha da melhor linhagem celular para a infecção viral ................................73
3.11. Transfecção e propagação viral em cultura dos clones BD6-15
mutagenizados ...................................................................................................74
3.12. Titulação viral .....................................................................................................76
3.13. Fenotipagem viral aos inibidores de protease .....................................................76
3.14. Competições par-a-par ........................................................................................78
3.15. Fenotipagem de isolados virais com L90M de subtipo B e G ............................79
4. Resultados ...........................................................................................................................81
4.1. Aparecimento de MRD em proteases de subtipos F e B do HIV-1 no Brasil .....81
4.2. Aparecimento de MRDs em proteases de subtipos B e G do HIV-1 em
Portugal .............................................................................................................84
4.3. Aparecimento de MRDs na protease de isolados virais do grupo M do HIV-
1 .........................................................................................................................87
4.4. Aparecimento de MRDs na TR de isolados virais do grupo M do HIV-1
durante a primeira linha terapêutica ..................................................................92
4.5. Proporção de isolados virais hipersensíveis a antirretrovirais oriundos de
pacientes virgens de tratamento.........................................................................98
4.6. Mapeamento dos polimorfismos ligados a HS em IPs .........................................100
4.7. Fenotipagem dos clones infectivos de CRF02_AG ..............................................106
4.8. Capacidade replicativa viral conferida pelos polimorfismos naturais na PR .......114
4.9. Papel diferencial da MRD a IP L90M em subtipos B e G ....................................114
5. Discussão .............................................................................................................................118
6. Conclusões... ..................................................................................................................... ..132
7. Perspectivas Futuras ....................................................................................................... ..134
8. Referências bibliográficas ............................................................................................... ..135
14
ANEXO I – Artigos publicados referentes à tese ................................................................. .174
Distinct resistance mutation and polymorphism acquisition in HIV-1 protease of
subtypes B and F1 from children and adult patients under virological
failure (2009) .....................................................................................................175
Discordant genotypic interpretation and phenotypic role of protease mutations
in HIV-1 subtypes B and G (2009)....................................................................193
HIV genetic diversity and drug resistance (2010) .......................................................200
ANEXO II – Artigos publicados não-referentes à tese ........................................................ .229
Epidemiology and evolutionary trends of HIV-1 CRF31_BC-related strains in
Southern Brazil (2007) ......................................................................................230
Differential drug resistance acquisition in HIV-1 of subtypes B and C (2007) ...........236
Conservation patterns of HIV-1 RT connection and RNase H domains:
identification of new mutations in NRTI-treated patients (2008) .....................245
Impact of HIV-1 protease mutations A71V/T and T74S on M89I/V-mediated
protease inhibitor resistance in subtype G isolates (2008) ................................252
Mutation T74S in HIV-1 subtype B and C proteases resensitizes them to
ritonavir and indinavir and confers fitness advantage (2010) ..........................256
15
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Prevalência de pessoas adultas (15-49 anos) convivendo com HIV ao redor do
globo ......................... ............................................................................................................................20
Figura 2. Relação filogenética do HIV com outros lentívirus conhecidos ..............................21
Figura 3. Árvore filogenética pelo método de neighbor-joining com fragmento do gene
pol (655pb) ....... ....................................................................................................................................22
Figura 4. Organização genômica em diferentes lentivírus de primatas ...................................25
Figura 5. Organização genômica do HIV-1 e a presença das proteínas essenciais na
partícula viral madura ...........................................................................................................................25
Figura 6. A partícula viral e seus componentes .......................................................................27
Figura 7. Ciclo infeccioso do HIV-1 resumido ......................................................................29
Figura 8. Etapa de entrada viral ..............................................................................................30
Figura 9. Processo de fusão mediado pela gp41 ......................................................................30
Figura 10. Ciclo de vida do HIV-1, da entrada viral à integração genômica .........................31
Figura 11. Processo de integração viral ..................................................................................33
Figura 12. Proteínas celulares recrutadas para a transcrição do genoma proviral do
HIV-1 ............... ....................................................................................................................................34
Figura 13. RNA mensageiros produzidos pelo genoma do HIV-1 e os sítios de
processamento ... ...................................................................................................................................35
Figura 14. RNA mensageiro produzido pelo genoma proviral e suas estruturas
secundárias ....... ....................................................................................................................................37
Figura 15. Tradução do RNAm Gag e Gag-Pol ......................................................................40
Figura 16. Estruturas secundárias do RNA genômico viral e o processo de dimerização .....41
Figura 17. Estrutura das partículas virais imatura (virion) e madura (infectiva) ....................42
16
Figura 18. Relações filogenéticas de 1,052 aminoácidos de Gag entre os grupos do
HIV-1 ............... ....................................................................................................................................44
Figura 19. Distância nucleotídica do gene pol entre grupos, subtipos, sub-subtipos,
populações e quasiespécie ....................................................................................................................44
Figura 20. Árvore filogenética de neighbor-joining com genomas completos de
representantes do HIV-1 .......................................................................................................................46
Figura 21. Processo de geração de vírus HIV recombinantes .................................................48
Figura 22. Esquema representando o evento de retrotranscrição ...........................................50
Figura 23. Atuação das classes de inibidores no ciclo de vida do HIV ..................................53
Figura 24. Quasiespécies viral no organismo hospedeiro e seleção de variantes
resistentes ao longo do tratamento .......................................................................................................54
Figura 25. Prevalência de subtipos ao redor do mundo ..........................................................56
Figura 26. Aparecimento de MRDs a IDV em subtipos B e F1 ..............................................82
Figura 27. Acúmulo das MRDs D30N e L90M em pacientes adultos e crianças
infectados pelos subtipos B e F1 sob tratamento com NFV .................................................................83
Figura 28. Aquisição de DRM D30N e L90M em quatro anos de tratamento com
HAART contendo NFV .......................................................................................................................86
Figura 29. Aquisição das MRDs M46I/L e V82A/F/T/S em subtipos B e G do HIV-1
em seis anos de tratamento com HAART contendo IDV .....................................................................87
Figura 30. Acúmulo de mutações D30N e/ou L90M para NFV em diferentes subtipos
do HIV-1 ao longo do tempo ................................................................................................................90
Figura 31. Acúmulo de MRDs majoritárias para IDV em diferentes subtipos do HIV-1
ao longo do tempo ................................................................................................................................91
Figura 32. Acúmulo de L90M em diferentes subtipos do HIV-1 ao longo do tratamento
com SQV ......... ....................................................................................................................................92
Figura 33. Proporção de isolados virais com pelo menos uma TAM em diferentes
subtipos do HIV-1 durante o primeiro esquema terapêutico composto por
AZT/d4T+3TC+INNTR .......................................................................................................................95
17
Figura 34. Acúmulo das MRDs D30N e L90M em pacientes adultos e crianças
infectados pelos subtipos B e F1 sob tratamento com NFV .................................................................96
Figura 35. Aparecimento de TAMs ao longo do tempo dos diferentes subtipos do HIV-
1 frente ao tratamento com AZT/d4T+3TC+INNTR (A) e AZT/d4T+3TC+IP ..................................97
Figura 36. Porcentagem de isolados virais de diferentes subtipos do HIV-1 com pelo
menos uma MRD a INNTRs durante o primeiro esquema HAART composto por
AZT/d4T+3TC+INNTR. .......................................................................................................................98
Figura 37. Proporção de isolados HS para diferentes subtipos do HIV-1 a seis IPs ...............99
Figura 38. Proporção de isolados HS de diferentes subtipos do HIV-1 a oito inibidores
de transcriptase reversa .........................................................................................................................100
Figura 39. Mapeamento de polimorfismos ligados a HS em isolados do subtipo C a
NFV, APV e ATV .................................................................................................................................102
Figura 40. Mapeamento de polimorfismos ligados a HS em isolados do sub-subtipo F1
a SQV, IDV e ATV ..............................................................................................................................103
Figura 41. Mapeamento de polimorfismos ligados a HS em isolados do CRF02_AG a
APV, NFV, SQV e IDV .......................................................................................................................104
Figura 42. Ciclo infeccioso do HIV-1 resumido ....................................................................108
Figura 43. Fenotipagem dos clones oriundos de BD6-15 a APV ...........................................109
Figura 44. Fenotipagem dos clones oriundos de BD6-15 a NFV ............................................110
Figura 45. Fenotipagem dos clones oriundos de BD6-15 a SQV ............................................111
Figura 46. Fenotipagem dos clones oriundos de BD6-15 a IDV ............................................112
Figura 47. Fenotipagem dos clones oriundos de BD6-15 a LPV ............................................113
Figura 48. Nível de resistência de isolados de subtipos B e G com padrões distintos de
MRD a NFV, SQV e todos os IPs testados neste trabalho ...................................................................117
18
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Algumas das principais funções exercidas pelas proteínas regulatórias e
acessórias ......... .....................................................................................................................................26
Tabela 2. Características dos diferentes grupos do HIV-1 .....................................................45
Tabela 3. Resumo das drogas antirretrovirais disponíveis para uso clínico ...........................52
Tabela 4. Assinaturas genéticas e polimorfismos de subtipos não-B do HIV-1
associados com resistência a IPs ..........................................................................................................59
Tabela 5. Sumário das drogas analizadas neste estudo e suas respectivas mutações
majoritárias de resistência .....................................................................................................................66
Tabela 6. Primers desenhados para a mutagênese sítio-dirigida ............................................69
Tabela 7. Meios de cultivo para as linhagens celulares ..........................................................73
Tabela 8. Iniciadores para o OLA ...........................................................................................79
Tabela 9. Padrão de aquisição de MRDs para NFV ...............................................................84
Tabela 10. Padrão de aquisição de MRDs para IDV ...............................................................86
Tabela 11. Clones gerados por mutagênese sítio-dirigida e as drogas testadas por clone .......106
Tabela 12. Proporção de vírus após competição par-a-par ......................................................114
Tabela 13. Nível de resistência médio conferida pela L90M em diferentes vias
mutacionais para os subtipos B e G ......................................................................................................116
Tabela 14. Sumário de MRDs relacionadas a HS ...................................................................127
19
1. Introdução
1.1. Pandemia da Aids
Desde os seus primeiros relatos em 1981 em homens homossexuais que
apresentavam febres prolongadas, grandes perdas de peso e graves casos de
imunodeficiência (Gottlieb et al., 1981; CDC, 1981), a síndrome de imunodeficiência
adquirida (do inglês, acquired immunodeficiency syndrome ou AIDS) se tornou um
grave caso de saúde pública em todo o mundo. Ao longo das últimas duas décadas,
estima-se que 25 milhões de pessoas tenham morrido devido à doença, tornando a aids
uma das piores pandemias da história da Humanidade, perdendo apenas para a gripe
espanhola que dizimou mais de 40 milhões de pessoas (Taubenberger et al., 2002).
Historicamente o agente causador da aids foi caracterizado em 1983 por dois
grupos independentemente. No início foi denominado como LAV pelo grupo francês
chefiado por Luc Montagnier (Barré-Sinoussi et al., 1983) e como HTLV-III pelo grupo
americano chefiado por Robert Gallo (Gallo et al., 1983; Sarngadharan et al., 1984).
Outros nomes foram ainda propostos, sendo o vírus três anos mais tarde renomeado
como HIV, seguindo normas internacionais de nomenclatura viral e com a concordância
de Luc Montagnier (Coffin et al., 1986). Mais recentemente, os franceses Françoise
Barré-Sinoussi e Luc Montagnier co-dividiram o Prêmio Nobel de Medicina e
Fisiologia de 2008 pela descoberta do vírus (http://nobelprize.org/nobel_prizes/lists/
2008.html).
Desde a caracterização da doença no início da década de 80 até o ano de 2007,
estima-se que cerca de 33 milhões de pessoas estejam infectadas pelo vírus
(http://www.unaids.org/en/KnowledgeCentre/HIVData/GlobalReport/2008/). Estima-se ainda
que em 2007 2,7 milhões de pessoas adquiriram o vírus, enquanto outros 2 milhões
20
tenham morrido de aids. Segundo dados da UNAIDS mais de 3% da população mundial
na faixa etária de 15 a 49 anos convive atualmente com o vírus. Entretanto, a
prevalência nos países e regiões varia de menos de 0,1% a 28% (Figura 1). A região
mais afetada pela pandemia é o continente africano, onde os países localizados na região
subsaariana abrigam dois terços da população mundial infectada pelo HIV. Países como
Botsuana, Lesoto e Suazilândia apresentam um hoste de pessoas infectadas que equivale
a mais de 20% da população adulta de seus respectivos países. Como conseqüência
direta da epidemia, a economia de muitos países africanos cresce mais lentamente,
levando ao aumento da pobreza e à diminuição da expectativa de vida da população em
mais de 20 anos, o que torna a epidemia um problema atual de ordem ecônomica, saúde
e social.
]
Figura 1. Prevalência de pessoas adultas (15-49 anos) convivendo com HIV ao redor do globo.
Extraído e traduzido de 2008 Report on the global AIDS epidemic (http://www.unaids.org/
en/KnowledgeCentre/HIVData/GlobalReport/2008/).
21
1.2. Classificação e origem do HIV
O HIV é classificado como pertencente à família Retroviridae, que tem como
principais características: I) partículas virais esféricas e envelopadas com tamanho
aproximado entre 80 e 100nm; II) nucleocapsídeo de forma icosaédrica; III) genoma
viral formado por duas fitas de RNA polaridade positiva com tamanho entre 7 e 10kb;
IV) codificação de uma transcriptase reversa viral; V) a retrotranscrição do RNA
genômico em uma dupla fita de DNAc integrativo, que é incorporado ao genoma da
célula hospedeira (Knipe et al., 2001). O vírus se agrupa dentro do gênero lentivírus,
junto com outros retrovírus exógenos que infectam seis grupos de mamíferos (Figura 2).
Figura 2. Relação filogenética do HIV com outros lentívirus conhecidos. Construção
filogenética através de máxima verosimilhança do gene pol de lentivírus que infectam
mamíferos com 1000 réplicas de bootstrap [extraído e traduzido de Katzourakis et al., 2007].
22
Atualmente os dois tipos distintos de HIV (HIV-1 e HIV-2), além dos SIVs que
infectam in natura mais de quarenta espécies de primatas não-humanos do velho
mundo, formam o grupo de lentivírus que infectam primatas (Figura 3) (revisto por
Hirsch, 2004). Até o momento, primatas asiáticos e primatas do novo mundo não
apresentam SIV circulando em populações selvagens. O surgimento do SIV ancestral
ainda é incerto, mas análises de relógio molecular têm demonstrado uma origem recente
(< 2.500 anos), com subsequente transmissão zoonótica entre as espécies de primatas no
continente africano (Sharp et al., 2000; Wertheim & Worobey, 2007; Wertheim &
Worobey, 2009).
Figura 3. Árvore filogenética pelo método de neighbor-joining com fragmento do gene pol
(655pb) e 1000 réplicas de bootstrap. Em cores, os SIVs descritos no trabalho de Peeters et al.,
2002.
23
Em geral, tem-se observado que os SIVs causam uma infecção assintomática em
seus respectivos hospedeiros naturais, raramente evoluindo para uma imunodeficiência
símia, muito embora a relação SIV-hospedeiro ainda permaneça obscura (revisto por
Hirsch, 2004). Por outro lado, a transmissão zoonótica experimental ou acidental de SIV
para primatas não-humanos asiáticos resulta em imunodeficiência grave e morte, similar
ao que ocorre na aids humana (Hirsch, 2004; Beer et al., 2005; Goldstein et al., 2005).
A história natural dos SIVs revela diversos eventos de transmissão zoonótica
entre primatas (Jin et al., 1994; Bibollet-Ruche et al., 1996), além de eventos de
recombinação entre diferentes cepas virais originando novos SIVs (Souquière et al.,
2001; Beer et al., 2001; Bailes et al., 2003). A entrada do HIV na população humana é
recente e, não surpreendentemente, se deu por pelo menos onze eventos bem sucedidos
de transmissão zoonótica (Wertheim & Worobey, 2007). Os dois tipos de HIV não tem
a mesma origem filogenética, sendo o HIV-2 geneticamente mais próximo de SIVsm
que infecta naturalmente macacos fuligentos (Cercocebus atys) (Gao et al., 1992), e o
HIV-1 mais relacionado ao SIVcpz que infecta naturalmente chimpanzés (Pan
troglodytes troglodytes) (Gao et al., 1999) (Figura 3). Calcula-se que a entrada do HIV-
1 na população humana tenha ocorrida há pouco mais de um século (1884-1924)
(Worobey et al., 2008), devido ao contato de fluidos corporais entre humanos e primatas
decorrente de caçadas promovidas a esses animais, com o subsequente manuseio e
preparo da carne para alimentação, e até mesmo a captura destes como animais de
estimação, o que é bastante comum em comunidades rurais de países africanos (Hahn et
al., 2000; Ndembi et al., 2009). A introdução de novos SIVs na espécie humana está
longe de ser descartada. Um estudo com 16 isolados de SIV de cinco linhagens
diferentes de primatas demonstrou que 12 foram capazes de infectar macrófagos
humanos e 11 foram capazes de se replicar em células mononucleares de sangue
24
periférico daquela espécie (Grimm et al., 2003). Um outro trabalho caracterizou a
presença de SIVs circulando em pessoas HIV-negativas vivendo em regiões rurais da
República dos Camarões, que tinham contato frequente com fluidos corporais de
primatas não-humanos (Kalish et al., 2005).
1.3. Organização genômica viral
Dentro da partícula viral, o genoma do HIV é composto por duas fitas simples
lineares de RNA polaridade positiva com aproxidamente 9,5 kb de tamanho (Ratner et
al., 1987). Uma vez integrado ao cromossomo da célula hospedeira, o genoma do HIV-
1 é flanqueado por duas regiões terminais repetitivas denominadas LTRs, que possuem
sítios promotores de transcrição (Figura 4) (Knipe et al., 2001). Deste modo o genoma
passa a ser denominado proviral. O HIV-1 e seu ancestral SIVcpz, como todo lentívírus,
são considerados retrovírus complexos que possuem, além dos três genes essenciais
(gag, pol e env), dois genes regulatórios (tat e rev) e quatro genes acessórios (vif, vpr,
vpu e nef). O gene vpu é exclusivo da linhagem que abriga o HIV-1, enquanto o gene
vpx é exclusivo da linhagem que abriga o HIV-2 (Peeters & Courgnaud, 2002). A origem
desses genes ainda permanece desconhecida, embora a origem do gene vpx possa ser
explicada por uma duplicação do gene vpr (Tristem et al., 1992).
O gene gag codifica uma poliproteína contendo as quatro proteínas estruturais:
p17 (matriz), p24 (capsídeo), p7 (nucleocapsídeo) e p6, aém de duas proteínas pequenas
p1 e p2 (Figura 5). Já o gene pol codifica uma poliproteína com as três enzimas virais:
protease (p10), transcriptase reversa (p51/p56) e integrase (p32), enquanto o gene env
codifica uma poliproteína com as proteínas do envelope viral: gp120 (superfície) e gp41
(transmembrana). Já as proteínas regulatórias e acessórias acumulam diversas funções
durante o ciclo replicativo do HIV-1, conforme listadas na Tabela 1.
25
Figura 4. Organização genômica em diferentes lentivírus de primatas. Em HIV-1 e SIVcpz (em
vermelho) os genes nef e env não se sobrepõem. Imagem extraída de Peeters & Courgnaud,
2002.
Figura 5. Organização genômica do HIV-1 e a presença das proteínas essenciais na partícula
viral madura. Figura extraída e traduzida de http://www.stanford.edu/group/virus/retro/
2005gongishmail/HIV.html
26
Tabela 1. Algumas das principais funções exercidas pelas proteínas regulatórias e acessórias.
Proteína Classificação Funções
REV Regulatória Controle do processamento de RNA mensageiro viral;
Aumento da expressão de proteínas essenciais;
Diminuição da expressão de proteínas regulatórias;
Transporte dos transcritos para o citoplasma.
TAT Regulatória Transativador de transcrição viral;
Aumento da expressão gênica viral;
Repressor de promotores celulares.
NEF Acessória Endocitose e degradação de moléculas de CD4;
Aumento da eficiência da transcrição reversa;
Permite a fosforilação da proteína de matriz (p24).
VIF Acessória Degradação das proteínas celulares APOBEC3F e APOBEC3G;
Permite a infectividade em macrófagos e linfócitos;
Participação na montagem da partícula viral;
Regulação da atividade da protease viral.
VPR Acessória Bloqueio da divisão celular (mitose);
Localização nuclear do complexo pré-integrativo;
Permanência da célula na fase G2.
VPU Acessória Promove a liberação das partículas virais;
Envolvimento na maturação de proteínas do envelope;
Modulação negativa de CD4 no retículo endoplasmático.
Informações extraídas e traduzidas de www.bioafrica.net/proteomics/HIVproteome.html.
1.4. A partícula viral
A partícula viral, após o brotamento celular, sofre um processo proteolítico das
poliproteínas Gag e Pol mediado pela protease viral, que modifica a estrutura interna da
partícula. Esta partícula madura do HIV-1 é composta então de quatro partes distintas:
envelope viral externo, matriz, capsídeo e complexo nucleocapsídeo (Figura 6).
27
O envelope viral é proveniente da bicamada lipídica celular adquirida durante o
brotamento viral (Gotto et al., 1994). Esta camada externa viral é rica em colesterol e
carreia pelo menos vinte diferentes proteínas derivadas da célula hospedeira, incluindo
os complexos MHC-I e MHC-II (Luo et al., 2008). No envelope viral se encontram as
duas glicoproteínas virais codificadas pelo gene env: proteína de superfície gp120 e
proteína transmembrana gp41. Ambas as proteínas estão associadas não-covalentemente
em trímeros, sendo a gp120 exposta na superfície do envelope e ricamente glicosilada
com numerosas cadeias de oligossacarídeos.
Figura 6. A partícula viral e seus componentes (extraído e traduzido de
http://arapaho.nsuok.edu/~castillo/Cell-mediateddeficiency..html).
Logo abaixo do envelope encontra-se uma matriz proteíca icosaédrica
fortemente associada a esta camada lípidica e formada por trímeros de p17, uma das
proteínas codificadas pelo gene gag. A afinidade de p17 pelo envelope lipídico se dá
por uma ligação covalente do seu domínio N-terminal após um processo de miristilação
(Bryant & Ratner, 1990).
28
Envolvido pela matriz proteíca encontra-se o capsídeo viral com uma forma
cônica característica. O capsídeo é formado por hexâmeros de p24, uma outra proteína
sintetizada pelo gene gag (Gitti et al., 1996; Ganser-Pornillos et al., 2008). No interior
do capsídeo encontra-se o complexo nucleocapsídeo, formado por duas moléculas de
RNA fita simples dimerizadas e altamente condensadas pela proteína p7, a qual se liga
na região 5’ do RNA genômico entre o LTR e gag numa região denominada Ѱ (Knipe
et al., 2001). Além desta, outras proteínas codificadas por gag também estão presentes
no cerne viral: p1, p2 e p6. O domínio p1 parece ter função estrutural no virion imaturo
(Ganser-Pornillos et al., 2008), enquanto p6 é importante para a liberação da partícula
viral (Göttlinger et al. 1991). As três enzimas codificadas pela Pol, protease (PR),
transcriptase reversa (TR) e integrase (IN), também se encontram presentes no
nucleocapídeo, assim como as proteínas acessórias Vif, Vpr e Nef (Knipe et al., 2001).
Um RNAt1,2 lisil (RNA transportador carreador de lisina) oriundo da célula hospedeira
também está associado ao genoma de RNA viral e servirá como iniciador da transcrição
reversa do DNAc integrativo em um novo ciclo infeccioso (Wakefield et al., 1995).
1.5. O ciclo de vida do HIV-1
O ciclo infectivo do HIV-1 pode ser dividido em muitas etapas distintas, das
quais podemos destacar: reconhecimento e ligação vírus-célula, fusão membranar,
translocação do capsídeo em direção ao núcleo, transcrição reversa, integração do
cDNA viral, transcrição das proteínas virais, ancoramento das proteínas na membrana
celular, brotamento e maturação (Figura 7).
29
Figura 7. Ciclo infeccioso do HIV-1 resumido. Imagem obtida e traduzida de
http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/images/figure1_870x660.gif.
A célula hospedeira humana alvo da infecção pelo HIV-1 faz parte do sistema
imunológico que expressa a proteína receptora de superfície CD4 (células T, células
dendríticas e macrófagos) (Klatzmann et al., 1984). Esta glicoproteína possui um papel
essencial no sistema imunológico de reconhecimento de MHC classe II em células
apresentadoras de antígenos. A proteína de superfície viral gp120 reconhece e se liga a
esse receptor em domínios membranares ricos em colesterol. Outras proteínas celulares
incorporadas no envelope também facilitam a adesão viral, tais como ICAM-1, cuja
função é ser um receptor de adesão celular (Fortin et al., 1997). A interação gp120-CD4
promove uma mudança estrutural em gp120, expondo a sua alça V3 que reconhece e se
associa a correceptores de quimiocina CCR5 (expresso em macrófagos e células
dendríticas) e/ou CXCR4 (expresso em células T) (Berson et al., 1996; Deng et al.,
30
1996; Dragic et al., 1996) (Figura 8). Tal interação causa uma nova modificação na
conformação da gp120, que expõe uma região peptídica hidrofóbica (peptídeo de fusão)
da proteína transmembrana gp41. Esta é inserida na membrana da célula hospedeira,
expondo as regiões helicoidais HR1 e HR2 (Figura 9). Quando expostas, essas duas
regiões interagem, entrelaçando-se entre si e gerando a força necessária para aproximar
e promover a fusão entre as membranas viral e celular, o que culmina com a liberação
do capsídeo viral no citoplasma celular (Weissenhorn et al., 1997; Chan & Kim, 1998).
Figura 8. Etapa de entrada viral. Imagem obtida e modifica de http://www.hivmedicine.com/
textbook/haart/horizon.htm.
Figura 9. Processo de fusão mediado pela gp41. Imagem extraída e modificada de Ingallinella
et al., 2009.
31
Uma vez dentro do citoplasma o capsídeo viral começa a sofrer um processo de
dissociação mediado por fatores celulares (Auewarakul et al., 2005). Tal processo parece
ocorrer mediante a fosforilação de sítios específicos da proteína p24 por quinases celulares,
embora ainda seja incerta a importância da fosforilação (Amella et al., 2005; Stantchev et al.,
2007; Wacharapornin et al., 2007). A dissociação do capsídeo viral culmina com a
liberação do complexo pré-integrativo no citoplasma celular, que é translocado em
direção ao núcleo, utilizando a rede de citoesqueleto através da interação com importina
celular (Figura 10) (Levin et al., 2009). Nesse aspecto, as proteínas do complexo viral
caracterizadas como responsáveis pela translocação através de sítios de localização
nuclear foram até o momento integrase, Vpr e p17 (Gallay et al., 1997; Jenkins et al.,
1998; Haffar et al., 2000).
Figura 10. Ciclo de vida do HIV-1, da entrada viral à integração genômica. Imagem traduzida
de Suzuki & Craigie, 2007. RTC = complexo de transcrição reversa; PIC = complexo pré-
integrativo; IN = integrase; MTOC = centro organizador de microtúbulos; NPC = complexo
poro nuclear.
32
Durante a dissociação do capsídeo viral e a translocação do complexo pré-
integrativo ocorre um fenômeno característico dos retrovírus: a retrotranscrição do RNA
genômico viral em uma dupla fita de DNA integrativo através da enzima transcriptase
reversa (TR), ao mesmo tempo em que ocorre a degradação do RNA genômico viral
pela atividade da RNase H. O processo de transcrição é complexo e bastante ordenado,
e se inicia na própria partícula viral madura devido à presença aleatória de nucleotídeos
capturados durante a montagem da partícula, gerando assim uma curta fita de DNA fita
negativa (Knipe et al., 2001). O processo é retomado durante a penetração do capsídeo
viral no citoplasma da célula hospedeira e finalizado ao longo do caminho até o núcleo.
A proteína acessória Vif aumenta a afinidade da TR ao primer de RNAt1,2 lisil e
aumenta a taxa de polimerização da TR (Cancio et al., 2004). A enzima é uma
polimerase que não possui atividade de edição, ocasionando uma taxa de erro de
incorporação na ordem de cinco a dez a cada 10.000 bases por ciclo de replicação viral
(Dougherty & Temin, 1988). Uma vez terminada a transcrição, as regiões terminais
(LTRs) do DNA são flanqueadas por tetrâmeros de integrase formando uma alça, que é
estabilizada pelo fator celular LEDGF/p75 (Figura 5) (Suzuki & Craigie, 2007).
A importação nuclear do complexo pré-integrativo se dá através do complexo de
poro nuclear, que culmina na passagem da dupla de DNA integrativo associado com
integrase (Figura 10) (Suzuki & Craigie, 2007). Para este processo é essencial a
interação da proteína acessória Vpr com nucleoporinas e importinas celulares (Popov et
al., 1998). A interação de integrase e p17 com importinas também facilita o processo
(Suzuki & Craigie, 2007).
A primeira parte do processo de integração acontece ainda no citoplasma,
quando a integrase remove dois nucleotídeos GT adjacentes aos nucleotídeos CA
altamente conservados na ponta 3’ da LTR de cada fita de DNA (Van Maele &
33
Debyser, 2005). Uma vez no núcleo, o complexo pré-integrativo deve se estabilizar com
a cromatina, o que pode ser mediado por fatores celulares como LEDGF/p75 e BAF. A
seguir a integrase cliva as pontes fosfodiéster do DNA cromossômico de forma protrusa
nas duas fitas, e promove a ligação entre as pontas CA-3’-OH livres do DNA viral às
pontas 5’-O-fosfato do DNA hospedeiro, formando um complexo de integração (Figura
11). Por último ocorre a dissociação do tetrâmero de integrases e o subsequente reparo
do DNA, hospedeiro, provavelmente mediado por proteínas celulares, tais como
RAD18 e RAD52 (Yoder & Bushman, 2000; Van Maele & Debyser, 2005).
Figura 11. Processo de integração viral. Figura extraída, modificada e traduzida de
http://www.prn.org/images/pdfs/478_evering-markowitz.pdf.
34
Uma vez integrado ao cromossomo humano, o genoma viral mimetiza um gene
humano e passa a ser denominado como genoma proviral. Esse evento marca o fim da
fase inicial do ciclo de vida do HIV-1 e o início da fase tardia. O LTR viral contém
sítios para fatores transcricionais eucarióticos, como TATA box e regiões ricas em GC,
para recrutamento do complexo de transcrição gênica de RNA polimerase II celular
(Figura 12), além de sítios para reforçadores (do inglês enhancers) de transcrição, como
os dois sítios para NF-κB e fatores relacionados (Krebs et al., 2001).
Figura 12. Proteínas celulares recrutadas para a transcrição do genoma proviral do HIV-1.
Figura extraída e modificada de Richman et al., 2009.
A fase inicial de transcrição do HIV-1 sintetiza nos primeiros nucleotídeos uma
região denominada TAR (do inglês trans-acting response element) (+1/+59), que forma
uma alça na estrutura secundária no RNAm nascente (Karn, 2000). O início da
transcrição do genoma proviral é basal e os RNAm produzidos, tal qual os RNAm
eucarióticos, sofrem processamento (splicing) no núcleo celular antes de migrarem para
o citoplasma. Desta maneira, na fase inicial de transcricção gênica do HIV-1, os
35
primeiros RNAm transcritos são aqueles que sofrem processamento múltiplo pela
maquinaria celular com tamanho final aproximado de 2kb (tat, rev e nef) (Figura 13).
Tat é uma proteína de 101 aminoácidos que funciona como um transativador de
transcrição que se liga a TAR através do complexo P-TEFb, cuja função é aumentar a
processividade da RNA pol II (Kilareski et al., 2009) (Figura 12). Tat também recruta
ciclinas cdk9 e cycT1, para promover a fosforilação de RNA pol II e potencializar a
transcrição do genoma proviral.
Figura 13. RNA mensageiros produzidos pelo genoma do HIV-1 e os sítios de processamento.
Figura extraída e traduzida de Jacquenet et al., 2005.
36
A proteína Nef (do inglês negative factor) é uma proteína acessória específica de
lentívirus de primatas (Figura 4), considerada como um importante fator patogênico,
uma vez que pacientes infectados com HIV-1 nef-deletados desenvolvem aids mais
lentamente (Foster & Garcia, 2008). Essa proteína de 206 aminoácidos está associada a
membranas, propriedade conferida pelos resíduos básicos na sua porção N-terminal
miristilada (Welker et al., 1998). Nef tem várias funções descritas, dentre elas a
regulação negativa da expressão de CD4 e MHC I na superfície celular. Na membrana
celular, Nef se associa ao domínio citoplasmático de CD4, e desencadeia sua
internalização em vesículas formadas por clatrinas, proteínas envolvidas na endocitose
celular, causando a sua posterior degradação dentro dos lisossomos (Foti et al., 1997).
Tal atividade permite que as partículas virais brotem da célula infectada sem correr o
risco de interação entre a gp120 e moléculas CD4. Já a regulação negativa de MHC I
também é feita pela sua internalização da superfície celular e pela redução do tráfico de
proteínas a partir do trans-Golgi (Greenberg et al., 1998). Esta função funciona como
um mecanismo de defesa do HIV-1 para escapar do sistema imune, pois impede o
reconhecimento da célula infectada por linfócitos T citotóxicos (Foster & Garcia, 2008).
Além disso, Nef pode estar diretamente associada com a ativação de células T através
da interação com várias quinases, o que é importante no estabelecimento da infecção
pelo HIV-1 (Ye et al., 2004).
Outra proteína viral oriunda de RNAm que sofreu múltiplos processamentos é a
Rev, uma proteína regulatória de processamento de RNAm viral com composição de
116 aminoácidos e, tal como Tat, codificada por dois éxons. Rev contém duas regiões
funcionais: um domínio rico em arginina, que se liga a RNA e contém sinais de
localização nuclear, e um segmento hidrofóbico que promove a exportação nuclear
através de interações com proteínas do tipo nucleoporinas (Meyer & Malim, 1994).
37
Todo RNAm produzido pelo genoma proviral contém uma estrutura secundária
denominada RRE (do inglês Rev Responsive Element) na região env (Figura 14). Esse
domínio do RNAm se associa com oito ou mais monômeros de Rev, protegendo o
RNAm da maquinaria nuclear de processamento e gerando os RNA mensageiros
parcialmente processados de tamanho aproximado de 4kb e o RNAm não-processado de
9kb (Figura 13) (Knipe et al., 2001). Rev também é responsável pela exportação destes
RNAm parcialmente ou não-processados para o citoplasma, onde se dá o início da fase
tardia de expressão gênica viral, com a tradução das poliproteínas virais Gag, Pol e Env,
além da produção das proteínas acessórias Vif, Vpr e Vpu.
Figura 14. RNA mensageiro produzido pelo genoma proviral e suas estruturas secundárias.
Imagem extraída de Groom et al., 2009.
A proteína acessória Vpr, de 96 aminoácidos, é altamente conservada em
diferentes lentivírus de primatas e é incorporada em grande quantidade na partícula viral
mediada pela sua interação com a proteína p6 da poliproteína Gag. Duas principais
funções são atribuídas no início do ciclo celular: (I) translocar o complexo pré-
integrativo em direção ao núcleo de células não-divisíveis, como o macrófago (Balliet et
al., 1994), (II) além de diminiur a taxa de erro da transcriptase reversa durante a síntese
da dupla fita de DNA integrativo (Mansky, 1996). Dentre outras funções de Vpr
38
podemos citar o aprisionamento de células infectadas na fase G2 do ciclo celular por
inibição de Cdc2, provendo um ambiente favorável para a transcrição gênica do HIV-1
(He et al., 1995), e o estímulo basal da expressão gênica viral mediada por LTR (Cohen
et al., 1990). Outra atribuição de Vpr é a indução de morte celular por apoptose em
células infectadas (Rajan et al., 2006).
A proteína acessória Vif (do inglês virus infectivity factor), de 192 aminoácidos,
está associada à infectividade do HIV-1, permitindo a produção de vírus infecciosos
completos em determinados tipos celulares, como células mononucleares do sangue
periférico (PBMC) e macrófagos (Strebel et al., 1987). Seu mecanismo de ação envolve
a poli-ubiquitinação das proteínas celulares APOBEC3G e APOBEC3F via complexo
ligase E3 e sua consequente degradação via proteossomo (Marin et al., 2003). Vif
também bloqueia a tradução de APOBEC3G a partir do seu respectivo RNAm (Stopak
et al., 2003). APOBEC3G é uma proteína celular da família das citidinas deaminases e
age como um potente inibidor da infecção por HIV-1. Na ausência de Vif, tal proteína é
incorporada na partícula viral através de interações com Gag (Alce & Popik, 2004) e
promove desaminações na fita negativa nascente do DNA viral integrativo, gerando
transições de guanina para adenina durante o processo de retrotranscrição, e podendo
levar à inativação enzimática das proteínas sintetizadas pelo genoma viral (Mangeat et
al., 2003).
O RNAm vpu/env é traduzido em ribossomos associados ao retículo
endoplasmático (RE) em uma poliproteína precursora de 160 kDa (gp160), associada à
membrana, e a proteína acessória Vpu, cuja função está ligada à liberação de virions.
Uma vez no RE esta poliproteína precursora sofre processos de glicosilação pós-
traducional e se agrupa em trímeros (Knipe et al., 2001). É então transportada para o
complexo de Golgi, onde sofre um processo proteolítico por proteases celulares tipo
39
furina, dando origem às proteínas virais de envelope gp41 e gp120 (Hallenberger et al.,
1992). Uma vez clivadas, as proteína gp41 e gp120 se associam não-covalentemente e
são transportadas para a superfície celular. O transporte de gp120 implica na adição
açúcares complexos, o que é vital para o escape viral do sistema imunológico. Mais à
frente, gp41 e p17 irão interagir para dar prosseguimento à montagem de uma nova
partícula viral (Ganser-Pornillos et al., 2008).
A poliproteína precursora Gag é traduzida diretamente do RNA genômico viral
não-processado, enquanto a poliproteína Gag-Pol precursora é resultante de uma única
mudança incomum na fase de leitura ribossomal, na região p6, em um sítio conservado
(5’ UUUUUUA 3’) durante a tradução (Figura 15). Esta mudança de quadro ocorre 1
em cada 20 vezes durante a tradução do RNAm, e desde modo, para cada poliproteína
de Gag-Pol traduzida, são geradas 20 poliproteínas Gag (Scarlata & Carter, 2003). A
ponta N-terminal das poliproteínas Gag e Gag-Pol sofre processo de miristilação pós-
traducional na região precursora da p17 (matriz). Tal processo é responsável pela
afinidade de p17 por lipídos, particularmente PI(4,5)P2, um fosfolipídio concentrado na
membrana celular (Ono et al., 2004). Esta região também promove a associação com a
proteína transmembrana gp41, dando prosseguimento ao processo de montagem de uma
nova partícula viral (Yu et al., 1992). A região C-terminal da futura proteína p24
(capsídeo) é responsável pela multimerização das poliproteínas Gag e Gag-Pol, junto
com a região precursora das proteínas p1 e p7 (nucleocapsídeo) (Ganser-Pornillos et al.,
2008). A montagem da partícula viral é feita em regiões da membrana celular
conhecidas como microdomínios membranares resistentes a detergentes (MRDs), que
são ricas em colesterol, esfingolipídios e determinadas proteínas celulares. Neste
processo a participação de Nef é essencial, uma vez que aumenta diretamente a síntese e
o transporte de colesterol para esses microdomínios (Zheng et al., 2003).
40
Figura 15. Tradução do RNAm Gag e Gag-Pol. (A) Poliproteínas precursoras Gag e Gag-Pol;
(B) Tradução de Gag-Pol depois da mudança da fase de leitura. Sublinhado indica o sítio
genômico indutor de mudança de fase ribossomal. Figura extraída de Leiherer et al., 2009.
Não menos importante é o papel do domínio da região precursora de p7 na
dimerização, mudança estrutural e transporte genômico para a partícula de duas fitas de
RNA genômico viral não-processado. Uma estrutura secundária tipo grampo presente
na região 5´ não-traduzida do RNAm Gag-Pol denominada DIS (do inglês dimerization
initiation site) é a responsável pelo processo de dimerização, através de interações
moleculares entre as duas fitas de RNA, formando um complexo tipo alça (Figura 16)
(Paillart et al., 2004). O sítio de RNA que interage com p7 é denominado Psi e tal
interação com a precursora da proteína do nucleocapsídeo parece mudar a estrutura
secundária do RNA viral, fazendo parar a transcrição de Gag / Gag-Pol e finalizando a
dimerização das fitas de RNA (Figura 16). O resultado final é o transporte de um par de
fitas de RNA genômico viral por partícula viral, o que parece estabilizar o multímero de
Gag e Gag-Pol.
O brotamento viral é mediado por três domínios terminais (do inglês late
domains) de Gag, que interagem com a maquinaria celular responsáveis pela formação
de corpos multivesiculados. A liberação da partícula viral é mediada pela proteína
transmembrana Vpu, de apenas 81 aminoácidos. Essa proteína forma canais iônicos na
membrana da célula hospedeira, que estão ligados à função de liberação do vírus. A
41
presença em microdomínios MRD da proteína transmembrana celular Bst-
2/CD317/tetherin/HM1.24, de função ainda desconhecida, restringe a liberação da
partícula viral. Recentemente, foi demonstrado que Vpu está diretamente relacionada
com a internalização e degradação destas proteínas celulares (Van Damme et al., 2008).
Figura 16. Estruturas secundárias do RNA genômico viral e o processo de dimerização. PBS =
primer binding site; SD = splicing donor. À direita, as estruturas secundárias para o mesmo
RNA. Figura obtida e modificada de Paillart et al., 2004.
O brotamento a partir da membrana plasmática dará origem a um vírion ainda
imaturo. A protease viral, caracterizada como uma enzima de 99 aminoácidos, forma
dímeros e se auto-cliva da poliproteína Gag-Pol durante ou logo após o evento de
liberação do virion, e é responsável pelo amadurecimento viral. Esta enzima irá catalizar
eventos de clivagem nas poliproteínas Gag e Gag-Pol, gerando a conformação estrutural
típica de um vírus infectivo (Figura 17) (Knipe et al., 2001).
42
Figura 17. Estrutura das partículas virais imatura (virion) e madura (infectiva). Extraído de
www.aidsreagent.org.
1.6. A diversidade genética do HIV-1
O HIV-1 pode ser dividido em quatro grupos (M, N, O e P), distintos
filogeneticamente, cada um oriundo de uma transmissão zoonótica distinta (Figura 18)
(Gao et al., 1999; Van Heuverswyn et al., 2008). O grupo O (do inglês outlier) é o mais
divergente dentre os grupos e está presente na África Central e Ocidental (Figura 19).
Originalmente, foi classificado como “subtipo zero” por sua baixa reatividade
43
apresentada com o ensaio ELISA p24 (Gürtler et al., 2001). Sua radiação na espécie
humana ocorreu por volta da década de 20 (Lemey et al., 2004). Na República dos
Camarões, estima-se em apenas 15.000 os indíviduos infectados por este grupo (Tabela
2) (Ayouba et al., 2001; Brennan et al., 2008). Sua origem foi recentemente
correlacionada com SIV que infecta gorilas (Van Heuverswyn et al., 2008). Como
SIVgor está geneticamente relacionado ao SIVcpz, é plausível supor que o gorila tenha
sido um hospedeiro intermediário para o grupo O do HIV-1 (Takehisa et al., 2009). O
grupo N (Novo) do HIV-1 foi caracterizado apenas em 1998, e até o momento foi
identificado em poucas dezenas de pessoas da República dos Camarões (Simon et al.,
1998). Sua entrada na população humana tem sido calculada por volta dos anos 60
(1948-1977), após um evento de recombinação entre um vírus do grupo M e o SIVcpz
(Gao et al., 1999; Wertheim & Worobey, 2009). Mais recentemente, foi descoberto o
grupo P de HIV-1 em uma mulher camaronesa idosa, que até o momento não apresenta
sintomas de aids e nível de CD4 estável por volta de 300 células/mm3
(Plantier et al.,
2009). É o grupo mais próximo de SIVgor já identificado, e sua prevalência na
população humana ainda permanece desconhecida.
O grupo M (majoritário) é o grande responsável pela pandemia da aids, sendo
caracterizada em mais de 95% das pessoas convivendo com HIV/aids. No começo da
década de 90, o sequenciamento e alinhamento de sequencias virais do gene env e gag
de diferentes pacientes ao redor do mundo permitiu estabelecer alguns grupos
filogenéticos bem definidos. Em 1993, foram caracterizados os subtipos A, B, C, D, E e
F. Um ano depois os subtipos G e H foram identificados na África Central (Janssens et
al., 1994). Mais tarde foram caracterizados os subtipos I (1995), J (1999) e K (2000)
(Kostrikis et al., 1995; Laukkanen et al., 1999; Triques et al., 2000). No gene pol, o
44
mais conservado entre os retrovírus, a divergência nucleotídica entre subtipos está entre
9-11% (Figura 19).
Figura 18. Relações filogenéticas de 1,052 aminoácidos de Gag entre os grupos do HIV-1
(Plantier et al., 2009).
Figura 19. Distância nucleotídica do gene pol entre grupos, subtipos, sub-subtipos,
populações e quasiespécie.
Gene pol do HIV-1
45
Tabela 2. Características dos diferentes grupos do HIV-1.
Grupo Origem Isolados
(%)1
Epidemiologia
M SIVcpz 259.678
(98,2%)
Todos os continentes com
exceção da Antártida
O SIVgor ou SIVcpz 1.095
(0,4%)
Encontrado na África
Central e Ocidental
N Recombinação entre
ancestral do grupo M /
SIVcpz
22
(<0,001%)
Somente encontrado na
República dos Camarões
P SIVgor Caso único Indeterminado
1 Sequências disponíveis na Base de Dados de HIV de Los Alamos (15 de dezembro de 2009).
Com a diminuição dos custos do sequenciamento e o avanço da técnica de PCR,
vários isolados dos mais diferentes subtipos tiveram seus genomas completamente
seqüenciados. A análise de alguns dos subtipos “puros” mostrou que eles eram na
verdade vírus recombinantes. A região gag e pol dos ditos subtipos E (classificados com
base somente no gene env) se agrupavam sempre com isolados do subtipo A (Gao et al.,
1996). Desta maneira, ficou evidente a capacidade dos retrovírus de gerarem formas
recombinantes, e o recombinante A/E foi identificado em vários indivíduos do sudeste
asiático. Outro caso envolvendo recombinação diz respeito ao subtipo G, no qual alguns
mosaicos da África Central foram classificados como subtipo A no gene env e G no
gene gag (Carr et al., 1998). Estes recombinantes receberam a nomenclatura de
CRF02_AG (Robertson et al., 2000). Descobriu-se mais tarde que o subtipo I era na
verdade um recombinante múltiplo dos subtipos A, G e I (Gao et al., 1998). Mosaicos
intersubtipos podem ser classificados de duas formas distintas: (I) quando disseminado
na população (com a caracterização de pelo menos 3 genomas completos de indivíduos
não-relacionados epidemiologicamente e com os mesmos pontos de quebra), ele é
caracterizado como CRF (do inglês circulant recombinant form), que é considerada uma
46
linhagem emergente; (II) quando encontrado em um único indivíduo, é classificado
como URF (do inglês unique recombinant form) (Robertson et al., 2000). Deste modo,
os subtipos E e I foram reclassificados como CRF01_AE e CRF06_cpx,
respectivamente. Até o presente momento, mais de 40 CRFs foram caracterizadas e
descritas na literatura.
De acordo com o sistema atual de classificação, existem nove subtipos “puros”
ou formas não-recombinantes dentro do grupo M do HIV-1 (A-D, F-H, J e K) (Figura
20) (Robertson et al., 2000). Alguns subtipos ainda podem ser divididos em sub-
subtipos, com divergência filogenética de 7% no gene pol (Figura 19). É o caso do
subtipo A (A1-A5) e do subtipo F (F1 e F2). Os subtipos “puros” B e D são na verdade
sub-subtipos de um mesmo subtipo não-reconhecido, mas razões históricas dificultam
uma nova renomeação.
Figura 20. Árvore filogenética de neighbor-joining com genomas completos de representantes
do HIV-1. Imagem extraída de Letvin, 2006.
1.7. O fenômeno da recombinação
A descoberta dos isolados recombinantes intersubtipos demonstrou a capacidade
de recombinação do HIV (Robertson et al., 1995). Hoje, sabe-se que a recombinação é
47
um evento recorrente em retrovírus causado pela ação da transcriptase reversa
(Goodrich & Duesberg, 1990). A própria origem do SIVcpz ocorreu num evento de
recombinação entre as linhagens SIVgsn/SIVmus/SIVmon (Bailes et al., 2003). Na
diversidade do HIV-1, já foram detectados recombinantes entre diferentes grupos,
diferentes subtipos e sub-subtipos e até mesmo entre os mesmos subtipos (Robertson et
al., 1995; Takehisa et al., 1999).
O genoma de RNA empacotado durante o brotamento viral consiste de duas fitas
de RNA polaridade positiva, sendo que cada fita separadamente pode servir como
molde para a síntese de um genoma viral completo. Desta maneira, à primeira vista, a
presença de duas fitas de RNA genômicos na partícula viral parece ser redundante, mas
é o requisito essencial para a recombinação. A geração de isolados virais com
recombinação intersubtipos requer que dois vírus de subtipos distintos estejam
integrados em uma única célula dentro do organismo hospedeiro (Figura 21) (Galetto &
Negroni, 2005). As causas de uma dupla infecção podem ser devido à entrada de vírus
de subtipos diferentes simultaneamente por um único evento de transmissão (co-
infecção), ou seqüencialmente em múltiplos eventos de transmissão (superinfecção).
Uma mesma célula infectada por dois subtipos diferentes pode gerar três combinações
de partículas: partículas homozigotas para o duplo RNA de subtipo X, partículas
homozigotas para o subtipo Y e partículas heterozigotas para ambos os subtipos. Essa
partícula heterozigota vai iniciar um novo ciclo infeccioso, onde um genoma
recombinante pode ser gerado através de saltos alternativos da transcriptase reversa em
ambos os genomas de RNA. Entretanto, polimorfismos naturais dentro na região de
dimerização na região LTR (Figura 16) de diferentes subtipos pode afetar a correta
dimerização de RNA e diminuir a taxa de recombinação (Chin et al., 2005; Chin et al.,
2007). Por exemplo, a taxa de recombinação entre os subtipos B e C é nove vezes
48
menor do que a taxa de recombinação intrassubtipo dos parentais (Chin et al., 2005). Já
o CRF01_AE gerou uma taxa de recombinação maior com o subtipo C (ambos com
sequência DIS 5’ GTGCAC 3’) do que com o subtipo B (5’ GCGCGC 3’) (Chin et al.,
2007).
Figura 21. Processo de geração de vírus HIV recombinantes.
Para melhor entender o processo de recombinação é necessário entender o
próprio processo de retrotranscrição viral que ocorre na fase inicial de infecção do HIV
(Figura 22). A transcriptase reversa viral é um heterodímero composto de duas
subunidades: p66 e p51 (Knipe et al., 2001). A subunidade p66 de 560 aminoácidos é
dividida em três regiões: domínio polimerase (1-322) responsável pela síntese de DNA,
domínio de ligação polimerase-RNase H, denominado conexão (323-440) e domínio
49
RNase H (441-560) responsável pela degradação do RNA molde (Figura 22) (Rodgers
et al., 1995). A subunidade p51 com 440 aminoácidos tem sua origem na p66, que sofre
atividade de clivagem pela protease viral, perdendo o domínio da RNase H. O processo
de síntese da fita de DNA polaridade negativa se inicia a partir da ponta 3’OH livre do
RNAt1,2 lisil e procede até a ponta 5’ da região R do RNA genômico. Esse processo
gera uma dupla fita RNA/DNA intermediária, cujo RNA molde será degradado pela
ação da RNAse H, à medida que deoxinucleotídeos são incorporados na fita nascente de
DNA. A pequena fita de DNA recém-sintetizada dará um salto para a outra extremidade
3’ do RNA genômico. Esse salto é devido à homologia entre as duas regiões R
localizadas nas extremidades 3’ e 5’ da fita molde. A síntese da fita negativa de DNA
continua até a região PBS. Nesse processo todo o RNA genômico molde é clivado com
exceção da região PPT (do inglês polypurine tract), que é resistente à ação da RNAse
H. Durante a síntese da fita negativa de DNA, a transcriptase reversa pode alternar a fita
de RNA genômico utilizado como molde (Galetto & Negroni, 2005). Essa troca de
molde ocorre cerca de três vezes em média a cada ciclo replicativo (Zhuang et al.,
2002). Essa troca de molde pode ocorrer por diversos motivos, não excludentes: (I)
quebras no RNA genômico viral (II) sítios de pausa de síntese da fita de DNA; (III)
estruturas secundárias no RNA molde (Galetto & Negroni, 2005). A seguir, a
extremidade livre 3’OH da região PPT não digerida servirá como iniciador para a
síntese da fita positiva de DNA. Por fim, ocorrerá o segundo salto quando este
complexo irá se circularizar graças à complementaridade das regiões PBS. Assim, as
fitas de cDNA integrativo positiva e negativa são completadas, utilizando ambas como
molde (Knipe, 2001). Em vírus heterozigotos, essas trocas de fita RNA molde acarretam
na produção de uma fita dupla de DNA integrativo recombinante (Figura 21). A partir
desse evento, se este recombinante se irradiar na população, será caracterizado como
50
uma nova CRF, ou se ficar confinado a um único indivíduo, será caracterizado como
uma URF (Robertson et al., 2000).
Figura 22. Esquema representando o evento de retrotranscrição. Extraído de Coffin et al.
(1997).
1.8. O tratamento antirretroviral e resistência a drogas
Historicamente, em março de 1987, foi aprovada para uso clínico a primeira
droga anti-HIV conhecida como AZT (zidovudina). Desde então, nos últimos vinte e
três anos 32 drogas antirretrovirais ou combinações destas foram aprovadas para uso
clínico pelo FDA (do inglês Food and Drug Administration) (Tabela 2). As drogas são
divididas em seis classes distintas de acordo com sua atuação direta na inibição do ciclo
replicativo do HIV (Figura 23). Atualmente, o tratamento indicado é uma combinação
51
de drogas, conhecido como tratamento antirretroviral altamente ativo (HAART) ou
coquetel anti-HIV, o qual consiste no uso de pelo menos três diferentes drogas, dois
INTRs (Inibidor Nucleosídico da Transcriptase Reversa) e uma terceira, que pode ser
um INNTR (Inibidor Não-Nucleosídico da Transcriptase Reversa) ou um IP (Inibidor
de Protease). Devido aos altos custos, as três classes mais recentes (IF, AC e II) são
usadas preferencialmente na terapia de resgate de pacientes em falha terapêutica com
múltiplas mutações de resistência para as classes previamente utilizadas (Pomerantz &
Horn, 2003).
A completa erradicação do vírus do organismo hospedeiro ainda é um cenário
distante, mas o atual tratamento permite uma melhora na qualidade de vida para
pacientes com HIV/aids, inibindo a replicação viral, promovendo a recuperação do
sistema imunológico e assim atrasando ou evitando a progressão para aids (Pomerantz
& Horn, 2003). Por outro lado, existem vários fatores que dificultam a eficácia
terapêutica nos pacientes, tais como diversos efeitos colaterais, penetrância limite das
drogas em determinados reservatórios de replicação viral, farmacocinética individual,
aderência ao tratamento, co-infecções com outros agentes patogênicos e a emergência
de isolados virais resistentes às drogas.
O uso da HAART pode efetivamente suprimir a carga viral por muitos anos
(Gulick et al., 2003; Bussman et al., 2008). Isto é uma clara vantagem em comparação
ao uso de monoterapia de AZT no começo histórico do tratamento, onde a maioria dos
pacientes apresentava isolados virais resistentes à droga com poucos meses de terapia
continuada (Larder et al., 1989; Volberding et al., 1995), ou com a dupla terapia com
INTR, onde dois anos de tratamento resultavam no ressurgimento da carga viral
(Fitzgibbon et al., 1993).
52
Tabela 3. Resumo das drogas antirretrovirais disponíveis para uso clínico.
Classe Atividade Droga - Ano
Inibidores
Nucleosídicos /
Nucleotídicos da
Transcriptase
Reversa (INTR)
INTR são miméticos de
nucleotídeos /
nucleosídeos e são
incorporados na cadeia
nascente de DNA,
inibindo a atividade da
transcriptase reversa na
fase inicial do ciclo
Zidovudina (AZT) – 1987
Didanosina (ddI) – 1991
Zalcitabina (ddC)* – 1992
Estavudina (d4T) – 1994
Lamivudina (3TC) – 1995
Abacavir (ABC) – 1998
Tenofovir (TDF) – 2001
Emtribicina (FTC) – 2003
Inibidores de
Protease (IP)
IP são peptídeos-
miméticos que se ligam
covalentementeno sítio
ativo da protease viral,
impedindo a maturação
viral na etapa final do
ciclo
Saquinavir (SQV) – 1995
Ritonavir (RTV) – 1996
Indinavir (IDV) – 1996
Nelfinavir (NFV) – 1997
Amprenavir (APV) – 1999
Lopinavir (LPV/r) – 2000
Atazanavir (ATV) – 2003
Fosamprenavir (fAPV) – 2003
Tipranavir (TPV) – 2005
Darunavir (DRV) – 2006
Inibidores Não-
Nucleosídicos da
Transcriptase
Reversa (INNTR)
INNTR foram projetados
para se ligarem ao bolsão
hidrofóbico da TR,
modificando a estrutura da
enzima e desativando o
sítio ativo no domínio da
polimerase
Nevirapina (NVP) – 1996
Delavirdina (DLV)* – 1997
Efavirenz (EFV) – 1998
Etravirina (ETR) – 2008
Inibidor de Fusão
(IF)
IF são pequenos peptídeos
que se ligam ao domínio
hidrofóbico da gp41,
evitando a fusão das
membranas viral e celular
Enfurvirtida (T-20) – 2003
Antagonista de
CCR5 (AC)
AC são pequenas
moléculas que se inserem
numa cavidade de CCR5,
modificando sua estrutura
e bloqueando sua
interação com gp120
Maraviroc (MVC) – 2007
Inibidores de
Integrase (II)
II se ligam à integrase
viral e bloqueiam a
integração do DNAc no
genoma da célula
hospedeira
Raltegravir (RAL) – 2007
* Drogas não mais utilizadas na terapia antirretroviral.
53
Figura 23. Atuação das classes de inibidores no ciclo de vida do HIV. Imagem traduzida e
modificada de Simon & Ho, 2003.
Um fator chave para o aparecimento de isolados virais resistentes é a TR viral.
Tal enzima não apresenta capacidade de correção exonucleásica característica das
polimerases celulares, facilitando a incorporação errônea de nucleotídeos durante a
síntese de DNAc, que persiste na fita nascente e é incorporada ao genoma da célula
hospedeira, produzindo desta forma uma nova variante. Esta inabilidade de reparo da
TR viral confere uma alta taxa mutacional ao vírus (aproximadamente 5-10
nucleotídeos incorporados erroneamente por genoma por ciclo replicativo) (Preston et
al., 1988). Outra importante característica do HIV é sua alta produtividade viral, com
geração aproximada de 1 bilhão de novas partículas virais por dia em um indivíduo
infectado (Perelson et al., 1996). Esses dois fatores, somados à capacidade de
54
recombinação, são responsáveis pela grande plasticidade viral, acarretando na presença
de quasiespécies dentro do hospedeiro, no escape do sistema imunológico e na
emergência de cepas resistentes ao tratamento sob pressão seletiva das drogas (Figura
24) (Rambaut et al., 2004).
Mutações de resistência a drogas (MRD) têm sido descritas para todas as drogas
atualmente liberadas para uso clínico (Johnson et al., 2009). No domínio polimerase da
TR, até o momento 15 posições foram relacionadas com perda de sensibilidade a INTR
e 14 posições para INNTR. Na região da protease, 38 posições interferem na
susceptibilidade a IP. Sete posições na gp41 estão associadas à resistência a IF,
enquanto três posições foram relacionadas com falha terapêutica ao II. Ainda não foram
estabelecidas as mutações de resistência ao AC, embora seu uso tenha selecionado
cepas virais com tropismo a CXCR4.
Figura 24. Quasiespécies viral no organismo hospedeiro e seleção de variantes resistentes ao
longo do tratamento. Imagem extraída e traduzida de Geretti, 2006.
55
Dois tipos de MRD são reconhecidos. A mutação cuja presença sozinha causa
grande perda de sensibilidade viral a uma ou mais drogas é considerada como mutação
majoritária (Johnson et al., 2009). Em alguns casos uma única mutação pode levar a
uma resistência cruzada para todas (ou quase todas) as drogas de uma mesma classe.
Este é o caso das mutações L100I, K101P e Y181C na TR, que conferem resistência a
todos os INNTRs, e a mutação I84V na protease, que resulta na perda de atividade de
cinco dos oito IPs disponíveis. Em geral, tais mutações estão localizadas próximas aos
sítios de interação entre o alvo viral e a droga. Enzimas virais com MRDs majoritárias
possuem uma menor capacidade replicativa do que suas contrapartes originais
(Martinez-Picado et al., 1994; Miller et al., 1998; Iglesias-Ussel et al., 2002; White et
al., 2002). A perda da capacidade replicativa da enzima mutada é parcialmente ou
totalmente recuperada com a aquisição de MRD acessórias ou compensatórias
(Martinez-Picado et al., 1994; Nijhuis et al., 1999; Nakahara et al., 2009). É importante
destacar que, em alguns casos, a aquisição de duas ou mais MRDs acessórias implica na
perda de sensibilidade a drogas (Johnson et al., 2009). Em adição, algumas DRMs
consideradas majoritárias para uma ou mais drogas podem agir como compensatórias
para outras, como é o caso da mutação L90M na protease, considerada majoritária para
NFV e SQV e compensatória para todos outros IPs, com exceção de DRV.
1.9. Epidemiologia global do HIV-1 grupo M
A distribuição do HIV-1 é heterogênea, com prevalência regional de subtipos e
CRFs específica (Figura 25). Em 2004, um único subtipo era responsável por cerca de
50% das infecções globais, o subtipo C (Hemelaar et al., 2006). Este subtipo é
dominante no sul da África sub-saariana (onde residem dois terços das pessoas
infectadas pelo HIV), no leste da África, na superpopulosa Índia e em países vizinhos.
O subtipo A correspondia a 12% das infecções mundiais, sendo prevalente na Europa
56
Oriental, Ásia Central, além de países da África Central e Oriental. Em todos os casos, o
sub-subtipo A1 é o mais prevalente, enquanto os sub-subtipos A2 e A3 são encontrados
com baixa frequência na África (Hamel et al., 2007; Ndembi et al., 2008). O subtipo B
é a variante mais disseminada, sendo encontrado em quase todos os países. Embora
responsável por 10% das infecções em 2004, esta forma é predominante nos países
ricos, como Estados Unidos, Europa Ocidental, Japão e Austrália. Os demais subtipos
restantes (D, F, G, H, J e K) representavam juntos somente 10% das infecções em 2004
(Hemelaar et al., 2006). Algumas CRFs têm grande impacto na epidemiologia de
determinadas regiões, com por exemplo a dominância de CRF01_AE no sudeste
asiático e a prevalência de CRF02_AG na África ocidental. CRF06_cpx é a segunda
forma mais dominante no oeste africano.
Figura 25. Prevalência de subtipos ao redor do mundo.
A epidemiologia molecular do HIV-1 é dinâmica ao longo do tempo. Por
exemplo, no Brasil, o subtipo C teve sua introdução datada na década de 80 (Salemi et
al., 2005; Santos et al., 2007; Bello et al., 2008), e recentemente tem sido demonstrado
que este subtipo representa 50% das novas infecções no Rio Grande do Sul e 5-30% nos
estados vizinhos (Soares et al., 2005; Brígido et al., 2007; Locateli et al., 2007; Santos
57
et al., 2007). Enquanto este subtipo está se espalhando pelo Brasil, ele sobrepujou
outros subtipos na África sub-saariana até a quase extinção destes últimos, tais como os
subtipos B e D, que eram comum na região na década de 80 (Williamson et al., 1995;
van Harmelen et al., 1997).
1.10. Impacto dos antirretrovirais nos diferentes subtipos do HIV-1
Uma importante questão vem sendo discutida nos últimos anos com respeito ao
impacto das drogas antirretrovirais nos diferentes subtipos. Esta questão é baseada no
fato de que a grande maioria dos estudos feitos com design de drogas anti-HIV,
aquisição de MRDs, genotipagem para avaliação de resistência e o impacto fenotípico
de MRD na HAART têm sido feitos quase que exclusivamente para o subtipo B do
HIV-1. A relevância dessa discussão se deve a dois fatores. O primeiro é a disseminação
do tratamento antirretroviral em países africanos, onde mais de dois terços das pessoas
convivendo com HIV/aids residem e onde a epidemiologia do HIV é largamente
dominada por subtipos não-B (Figura 25). A segunda razão é a disseminação de
subtipos não-B em regiões desenvolvidas, predominadas pelo subtipo B. Em alguns
países da Europa ocidental, a proporção de subtipos não-B vêm aumentando ao longo
do tempo. Em Portugal, por exemplo, o subtipo B foi responsável por 42% das novas
infecções em 2003, enquanto o subtipo G respondeu por 29% e os outros subtipos (C e
F), juntos com formas recombinantes (CRF02_AG e URFs), responderam por outros
29% (Palma et al., 2007). No Reino Unido, o subtipo B foi responsável por 52% das
infecções, o subtipo C por 21% e o subtipo A por 9%, enquanto os demais subtipos (D,
F, G, H e J) e formas recombinantes foram responsáveis por 18% das infecções em
2000 (Tatt et al., 2004). Neste mesmo estudo foi demonstrado que o subtipo C foi
responsável por 35% das infecções em pacientes heterossexuais, superando os subtipos
B (25%) e A (15%). Na França, cerca de um quarto das novas infecções foram
58
atribuídas aos subtipos não-B e formas recombinantes, especialmente CRF02_AG, em
2001-2002 (Descamps et al., 2005). Por último, na Grécia, o subtipo A (42%) superou o
subtipo B (33%) nas novas infecções locais (Paraskevis et al., 2007).
Subtipos não-B representam um desafio para a HAART, uma vez que existem
ainda muito poucos estudos na literatura acerca da eficiência e durabilidade do
tratamento no contexto de infecções por tais subtipos. Os diferentes grupos do HIV-1,
bem como os subtipos e CRFs, comportam em seus genomas assinaturas genéticias
características e polimorfismos que alteram a estrutura das proteínas viriais, os alvos das
drogas antirretrovirais, impedindo assim a correta ligação dos fármacos e a eficácia do
tratamento a médio e longo prazos. O HIV-2, por exemplo, é menos susceptível a
alguns IPs, tais como APV, RTV e IDV (Witvrouw et al., 2004; Ntemgwa et al., 2009).
O AZT também parece ser menos efetivo neste tipo do HIV (Reid et al., 2004;
Ntemgwa et al., 2009), enquanto os INNTRs parecem ser igualmente inócuos (Hizi et
al., 1993). O mesmo foi observado para isolados virais pertencentes ao grupo O do
HIV-1 que apresentavam naturalmente uma cisteína no códon 181 da TR (181C),
considerada uma MRD majoritária para INNTRs (Rambaut et al., 2004). A mutação
compensatória de resistência a INNTR 98G é um polimorfismo natural deste grupo
(Descamps et al., 1997).
Vários subtipos não-B apresentam assinaturas genéticas e polimorfismos em
suas proteases que são considerados como MRDs compensatórias no subtipo B (Tabela
3). Tais diferenças têm gerado discussões do quão naturalmente os subtipos não-B são
menos sensíveis aos IPs, o que poderia comprometer o uso de HAART contendo esta
classe de inibidores (Pieniazek et al., 2000; Vergne et al., 2000; Fonjungo et al., 2002;
Holguínet al., 2002; Kantor & Katzenstein, 2003). A aquisição de várias MRDs
compensatórias podem levar à falha terapêutica aos IPs (Johnson et al., 2009) e, desta
59
maneira, infecções por subtipos não-B poderiam falhar mais rapidamente do que
aquelas promovidas pelo subtipo B. É importante enfatizar que nenhuma MRD
majoritária é encontrada naturalmente em subtipos do grupo M, e que tais questões
estão concentradas exclusivamente para as DRMs compensatórias.
Em anos recentes têm se demonstrado que os inibidores de protease e da
transcriptase reversa são altamente eficazes na inibição da carga viral do HIV de
pacientes virgens de tratamento infectados por subtipos não-B (Palmer et al., 2001;
Holguín et al., 2004; Abecasis et al., 2006; Agwale et al., 2006; Vergne et al., 2006).
Até o momento, não há nenhuma evidência de que a presença de assinaturas e
polimorfismos destes subtipos possam causar resistência natural aos antirretrovirais.
Entretanto, trabalhos recentes têm mostrado que cerca de 10% (04/42) dos isolados de
subtipo G apresentaram resistência natural a pelo menos um IP, sem nenhuma mutação
de resistência conhecida presente no genoma (Holguin et al., 2004; Agwale et al.,
2006).
Tabela 4. Assinaturas genéticas e polimorfismos de subtipos não-B do HIV-1
associados com resistência a IPs.
Mutações
associadas à
resistência
Droga
% no subtipo
B virgem de
tratamento
Assinaturas Polimorfismos
I13V TPV 13% 90-98% nos subtipos A,
G e CRF02_AG
4-78% nos demais
subtipos não-B
K20I ATV 2% 93-98% no subtipo G e
CRF02_AG
1-3,5% nos subtipos
A, F e CRF01_AE
M36I ATV, IDV,
NFV e TPV 13%
81-99% em vários
subtipos não-B ___
H69K TPV 2% 96-97% nos subtipos A,
C, G, CRF01 e CRF02 2% no subtipo F
V82I ATV 2% 87% no subtipo G 1-6% nos demais
60
subtipos não-B
I93L ATV 33% 94% no subtipo C 5-40% em vários
subtipos não-B
1.11. Seleção diferencial de resistência em subtipos não-B
Com a disseminação da HAART em países onde subtipos não-B são prevalentes,
estudos de aquisição de MRDs têm surgido em anos recentes. Isolados virais desses
subtipos oriundos de pacientes em falha terapêutica contêm a maioria das MRDs
conhecidas aos inibidores de protease e TR para o subtipo B (Cane et al., 2001;
Sirivichayakul et al., 2003; Hsu et al., 2005; Kantor et al., 2005). Por outro lado, a
proporção de determinadas MRDs podem ser diferentes dependendo do subtipo. Por
exemplo, a mutação D30N é comumente encontrada em isolados de subtipo B sob
tratamento com NFV, mas ela é raramente vista em outros subtipos (Ariyoshi et al.,
2003; Grossman et al., 2004A; Kantor et al., 2005). Já a incomum MRD majoritária
K65R, selecionada em TR sob tratamento com os INTRs 3TC, ABC, FTC, TDF e ddI, é
mais prevalente no subtipo C do que nos subtipos A e B (Gupta et al., 2005; Turner et
al., 2009). Um estudo conduzido por nosso grupo demonstrou que clones de subtipo B
com D30N ou L90M têm uma perda marginal de capacidade replicativa (90% em
relação ao tipo selvagem). Por outro lado, o impacto foi mais severo no subtipo C, no
qual a L90M resultou numa perda de 20% na capacidade replicativa, enquanto o clone
com D30N não foi capaz de se replicar em cultura de células (Gonzalez et al., 2004).
Com respeito aos INTRs, a frequência de mutações relacionadas à resistência
aos analógos de timina também são diferentes entre subtipos. Existem duas vias
mutacionais de resistência para os análogos de timina: TAM-1 (do inglês thymidine
analogue mutation), que inclui as mutações M41L, L210W e T215Y, e TAM-2, que
61
inclui as mutações D67N, K70R, T215F e K219Q/E (Johnson et al., 2009). No subtipo
B, mutações relacionadas à TAM-1 foram mais frequentes do que àquelas de TAM-2
(Kantor et al., 2005). Este estudo também mostrou que a proporção de mutações TAMs,
independente da via mutacional, foi maior no subtipo B do que nos demais subtipos.
Um estudo com pacientes infectados pelo subtipo C sob HAART contendo AZT/ddI
mostrou uma seleção preferencial de um padrão TAM misto contendo D67N, K70R e
T215Y (Novitsky et al., 2007). Outras DRMs também estavam presentes em uma maior
proporção no subtipo B do que nos outros subtipos do grupo M do HIV-1,
principalmente MRDs relacionadas a IPs e INTRs (Kantor et al., 2005). Uma
explicação para esta diferença poderia ser a exposição prévia de pacientes infectados
pelo subtipo B à mono e dupla terapia, disponíveis no começo da primeira década da
pandemia em países onde subtipo B predomina. No Brasil, os subtipos C e F1 parecem
optar preferencialmente por TAM-2 (Munerato et al., 2010). Como a HAART é mais
recente em países em desenvolvimento, subtipos não-B foram menos expostos a essas
estratégias terapêuticas iniciais e, deste modo, adquirem MRDs mais lentamente.
Entretanto, um estudo que avaliou a capacidade replicativa de cepas virais contendo
mutações TAM demonstrou que o padrão TAM misto é a via preferencial do subtipo C,
enquanto TAM-1 é melhor adaptada ao subtipo B (Armstrong et al., 2009).
Diversos fatores podem influenciar as diferentes proporções de MRDs em
subtipos, dentre eles: fitness viral na presença das mutacões, barreira genética, cinética
de aparecimento de MRDs ao longo do tratamento e mutações subtipo-especificas
(MSEs). Nosso grupo demonstrou recentemente que pacientes infectados pelo subtipo C
sob tratamento antirretroviral acumulam resistência em menor proporção do que aqueles
infectados pelo subtipo B (Soares et al., 2007). Depois de cinco anos de tratamento
HAART contendo INTRs, 45% dos isolados virais de subtipo B apresentavam pelo
62
menos uma MRD majoritária para aquela classe de drogas, enquanto somente 19% dos
isolados de subtipo C eram resistentes no mesmo período de exposição. Para IPs, depois
do mesmo tempo de exposição, 36% dos isolados de subtipo B apresentavam ao menos
uma MRD majoritária versus somente 6% dos isolados de subtipo C. Com respeito à
resistência a INNTRs, ambos os subtipos apresentaram uma cinética de aquisição de
MRDs similar.
O comportamento temporal de outros subtipos para a aquisição de resistência
ainda é desconhecido, bem como a explicação para este fenômeno. Duas podem ser as
causas prováveis. Talvez a presença de determinados polimorfismos possa modular a
susceptibilidade viral ao tratamento, atrasando ou acelerando desde modo o surgimento
das MRDs. Alternativamente (mas não exclusivamente), uma mesma MRD pode gerar
diferentes fenótipos de resistência em subtipos distintos, levando à aquisiçâo de um
número diferente de MRDs para reproduzir o mesmo nível de perda de susceptibilidade.
No presente estudo, a cinética de aquisição de MRDs ao longo do tratamento foi
caracterizada para os principais subtipos não-B. Analisamos também as duas possíveis
causas acima descritas, que teoricamente podem explicar a diferença fenotípica face às
drogas nos distintos subtipos virais.
63
2. Objetivo
Determinar o comportamento dos principais subtipos e CRFs do HIV-1 na
aquisição de resistência a drogas antirretrovirias ao longo do tratamento, analisando as
variações genéticas associadas à susceptibilidade viral àquelas drogas.
2.1. Objetivos secundários
Determinar a cinética de aparecimento de mutações de resistência ao longo do
tratamento nos subtipos A, B, C, F e G e nas CRFs CRF01_AE e CRF02_AG;
Caracterizar a proporção de hipersusceptibilidade às drogas antirretrovirais a
partir de isolados virais de diferentes subtipos do HIV-1 provenientes de
pacientes virgens de tratamento;
Mapear os possíveis polimorfismos ligados à sensibilidade viral às drogas;
Determinar o papel dos polimorfismos encontrados na susceptibilidade a drogas
em um clone infectivo do HIV-1;
Determinar o papel desses polimorfismos na capacidade replicativa viral em
competições par-a-par;
Determinar o papel fenotípico de padrões de resistência similares em subtipo B
e um subtipo não-B.
64
3. Material e Métodos
3.1. Obtenção de sequências de isolados virais de pacientes em falha virológica
infectados pelos subtipos B e F1
Sequências de protease viral foram obtidas a partir de pacientes brasileiros
infectados pelos subtipos B e F1 do HIV-1 sob regime de tratamento com IP, em falha
virológica (carga viral detectável depois de no minímo três meses de tratamento), para
os quais se tinha disponível o histórico completo de tratamento. Desta maneira, foram
obtidas sequências de 165 pacientes (141 adultos e 24 crianças) infectados pelo sub-
subtipo F1 e 189 pacientes (99 adultos e 90 crianças) infectados pelo subtipo B. A
classificação de subtipos se baseou apenas na região da protease e as sequências foram
obtidas, na sua maioria, de trabalhos publicados anteriormente pelo nosso grupo e por
outros (Caride et al., 2001; Brindeiro et al., 2002; Soares et al., 2003; Machado et al.,
2004; Thomson et al., 2004; Rodrigues et al., 2005; Soares et al., 2005; Soares et al.,
2007; Santos et al., 2007). Algumas sequências novas foram geradas durante o trabalho
a partir de pacientes em falha terapêutica da RENAGENO processadas no Laboratório
de Virologia Molecular Animal da UFRJ.
3.2. Obtenção de sequências de isolados virais de pacientes em falha virológica
infectados com os subtipos B e G
Históricos de tratamento de pacientes HIV/Aids em falha virológica infectados
com subtipo B ou G foram obtidos do Hospital de Egaz Muniz, em Lisboa – Portugal.
Testes de genotipagem nesses pacientes foram conduzidos de acordo com a orientação
do Ministério da Saúde Português. Este foi um estudo retrospectivo com resultados de
testes de rotina anônimos, e assim não foi necessário aprovação no conselho de ética
nem de assinatura de um termo de consentimento pelos pacientes. Neste caso, os
65
pacientes foram definidos como em falha terapêutica quando tinham dois testes
consecutivos de carga viral detectável (acima de 400 cópias de RNA viral/mL de
plasma). A região viral da protease (99 aminoácidos) e a região polimerásica da TR
(300 primeiros códons) foram amplificados por PCR aninhado em duas etapas,
purificados, sequenciados e genotipados com o uso do kit ViroSeq HIV-1 Genotyping
System (Celera Diagnostics, EUA), de acordo com as especificações do fabricante.
Muitos inibidores de protease atualmente são utilizados em conjunto com o IP RTV (em
forma de “boosted”), o que poderia gerar confusão na hora de atribuir o surgimento de
uma determinada MRD ao IP correto. Para evitar istso, somente isolados virais de
pacientes utilizando um único IP foram selecionados para este estudo. Deste modo,
foram selecionados 125 isolados de subtipo B provenienetes de pacientes que somente
utilizaram NFV durante o primeiro esquema de HAART, e 176 que utilizaram somente
IDV. Para o subtipo G foram obtidos 90 isolados de pacientes que utilizaram somente
NFV e 94 que utilizaram somente IDV no primeiro esquema de HAART.
3.3. Obtenção de sequências virais de diferentes subtipos do HIV-1 oriundos de
falha virológica de um banco de dados global
Sequências da protease e TR de isolados virais provenientes de pacientes com
histórico completo de tratamento e infectados pelos subtipos do grupo M do HIV-1 A,
B, C, D, F e G, além das formas recombinantes CRF01_AE e CRF02_AG, foram
coletadas do Stanford HIV Drug Resistance Database (Shafer et al., 2000). As drogas
avaliadas foram NFV (366 isolados de HIV-1), IDV/RTV (320 isolados), AZT/d4T
(767 isolados), 3TC (556 isolados) e EFV/NVP (448 isolados).
66
3.4. Cinética de aparecimento de mutações de resistência ao longo do tempo de
tratamento
As sequências dos três datasets foram analisadas separadamente. Os isolados
foram agrupados por subtipos, droga antirretroviral utilizada e tempo de exposição à
droga (em períodos anuais). Nesta análise foram utilizados apenas isolados virais de
pacientes com uso exclusivo de HAART, excluindo os pacientes que fizeram uso prévio
de mono e/ou dupla terapia. O acúmulo temporal de mutações levou em consideração
apenas as MRDs majoritárias para a droga-alvo analisada de acordo com o consenso de
resistência IAS (Johnson et al., 2009), conforme listado na tabela abaixo.
Tabela 5. Sumário das drogas analizadas neste estudo e suas respectivas mutações
majoritárias de resistência.
Droga (classe) Mutações de resistência majoritária
NFV (IP) D30N, N88S, L90M
IDV (IP) M46I/L, I84V, V82A/F/T/S
SQV (IP) G48V, L90M
AZT/d4T (INTR) M41L, D67N, K70R, L210W, T215F/Y, K219Q/E
3TC (INTR) K65R, M184I/V
NVP/EFV
(INNTR)
L100I, K103N, V106A/M, V108I, Y181C/Y, Y188C/H/L,
G190A/S, P225H
Isolados virais foram considerados resistentes quando apresentavam pelo menos
uma MRD majoritária. A proporção de isolados virais de cada subtipo não-B foi
comparada com o subtipo B no mesmo período de utilização da droga analisada
utilizando teste estatístico bi-caudal de Fisher (para proporção de isolados com menos
de 100 isolados) ou qui-quadrado (para proporção de isolados com mais de 100
isolados). Valores de p menores ou iguais a 0,05 foram considerados significativos.
67
3.5. Fenotipagem de isolados de subtipos do grupo M do HIV-1
Dezenove isolados virais de subtipo C brasileiro oriundos de pacientes virgens
de tratamento tiveram sua sensibilidade a drogas antirretrovirais medida utilizando a
metodologia AntivirogramTM
(Virco, Bélgica). Esta é uma metodologia recombinante
que integra um fragmento de DNA amplificado por PCR da região inteira da protease
(99 códons) e da região polimerásica da TR (400 primeiros códons) do isolado viral a
ser analisado dentro de um clone proviral de subtipo B ∆PR-TR400 (Hertogs et al.,
1998). As drogas utilizadas nos ensaios fenotípicos foram: APV, IDV, NFV, LPV,
RTV, SQV e TPV da classe IP; 3TC, ABC, AZT, d4T, ddI, FTC e TDF da classe INTR;
EFV e NVP da classe INNTR. O tipo selvagem de subtipo B (IIIb) foi usado como
controle. O resultado fenotípico foi expresso em valor de nível de resistência (NR), que
é a razão da concentração média de droga anti-HIV necessária para inibir 50% dos vírus
(IC50) para um clone recombinante de um vírus derivado de um paciente pelo valor
médio de IC50 para o controle IIIb.
Fenótipos de isolados virais oriundos de pacientes virgens de tratamento
infectados com subtipos B e não-B foram obtidos de trabalhos recentemente publicados
que tenham usado a metodologia AntivirogramTM
(Virco, Bélgica) (Vergne et al., 2000;
Dumans et al., 2002; Vergne et al., 2003; Abecasis et al., 2006; Vergne et al., 2006;
Vidal et al., 2006). Outros métodos de fenotipagem foram descartados em função da
diferença de metodologia. Desta forma, foram obtidos dados de 165 isolados virais de
subtipo B (72), subtipo C (04), sub-subtipo F1 (26), subtipo G (29) e CRF02_AG (34).
3.6. Proporção de hipersusceptibilidade e mapeamento polimórfico
A hipersusceptibilidade (HS) foi definida quando o nível de resistência de
determinado isolado viral foi pelo menos 2,5 vezes mais sensível a determinada droga
68
do que o controle IIIb (NR ≤ 0,4). A proporção de HS foi determinada para cada droga e
para cada subtipo, e as diferenças entre subtipos B e não-B foram testadas pelo método
de qui-quadrado. Valores de p ≤ 0,05 foram considerados significativamente diferentes.
Uma vez identificada a proporção de HS para drogas individuais, cada subtipo e
forma circulante foi dividida em dois grupos: isolados HS (NR ≤ 0,4) e isolados não-HS
(NR > 0,4). Foram incluídas nas análises isolados virais oriundos de pacientes em
tratamento, mas sem nenhuma MRD conhecida no genoma, que possuíam testes de
fenotipagem para as drogas antirretrovirais. As sequências nucleotídicas foram
alinhadas e traduzidas no programa BioEdit v.7.0 (Tippmann, 2004). Diferenças na
frequência polimórfica entre os dois grupos foi medida e comparada estatisticamente
por teste de Fisher bi-caudal e novamente apenas valores de p ≤ 0,05 foram
considerados significativos.
3.7. Mutagênese sítio-dirigida
O clone molecular infectivo de CRF02_AG pBD6-15 (Tebit et al., 2003), de
tropismo CXCR4, foi selecionado para testar fenotipicamente polimorfismos
relacionados a HS caracterizados para esta forma recombinante neste estudo. Desta
forma, as mutações G16E, G17E, I64M, K70R e I72V foram inseridas na região da
protease do pBD6-15 por mutagênese sítio-dirigida utilizando o QuickChange® II XL
Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, EUA), com os iniciadores listados na tabela
abaixo.
A reação de mutagênese foi feita utilizando cada par de iniciadores a 10 pmol/µl,
5µl 10x reaction buffer, 1µl dNTP mix, 3µl de Quick solution (tampão provido com a
kit), 10ng de DNA dupla-fita molde e 2,5U de polimerase PfuUltra em uma reação de
50µl. A ciclagem utilizada foi: um pré-ciclo de 95ºC por 1’ para ativação da enzima; 18
69
ciclos de 95ºC por 50” para desnaturação do molde, 60ºC por 50” para anelamento dos
iniciadores e 68ºC por 14’ para a síntese de novas fitas de DNA; uma extensão final de
68ºC por 7’ e a permanência das amostras por 10ºC por tempo indeterminado. A reação
de mutagênese sítio-dirigida foi conduzida em termociclador GeneAmp® PCR system
9700 (Applied Biosystems, EUA).
Tabela 6. Primers desenhados para a mutagênese sítio-dirigida.
Mutação Iniciador Sequência 5’3’
G16E Senso 5’-cttagttacagtaaaattaGAGggacagctgatagaagcc-3’
Anti-senso 5’-ggcttctatcagctgtccCTCtaattttactgtaactaag-3’
G17E Senso 5’-cttagttacagtaaaattagggGAAcagctgatagaagcc-3’
Antisenso 5’-ggcttctatcagctgTTCccctaattttactgtaactaag-3’
I64M Senso 5’-gacaatatgatcagatacttATGgaaatttgtggaaaaaaggc-3’
Antisenso 5’-gccttttttccacaaatttcCATaagtatctgatcatattgtc-3’
K70R Senso 5’-cttatagaaatttgtggaaaaAGGgctataggtacagtgttagtagg-3’
Antisenso 5’-cctactaacactgtacctatagcCCTttttccacaaatttctataag-3’
I72V Senso 5’-gaaatttgtggaaaaaaggctGTAggtacagtgttagtagg-3’
Antisenso 5’-cctactaacactgtaccTACagccttttttccacaaatttc-3’
Após o término da reação foi adicionado 1µl de enzima de restrição DpnI
[10U/µl] e a reação foi incubada em termociclador GeneAmp® PCR system 9700 a
37ºC por 1 hora. Terminada a digestão, 2µl de cada reação foram utilizados na
transformação química nas células XL10-Gold Ultracompentent providas com o kit
(Stratagene, EUA), conforme instruções do fabricante. As células transformadas foram
plaqueadas em placas de Petri com LB Ágar e antibiótico kanamicina, e armazenadas
em sala climatizada a 37ºC por 16 horas. Duas placas foram plaqueadas por reação de
70
mutagênese. Após a verificação dos clones mutantes, todas as placas foram
armazenadas a 4ºC.
Foram coletadas individualmente seis colônias de cada placa com um palito de
dente previamente esterilizado para uma placa réplica de LB Ágar com ampicilina, que
após o procedimento era armazenada a 37ºC por mais 16 horas. A seguir, o palito era
inserido em um tubo BD FalconTM
de 14mL (BD Biosciences, Canadá) contendo 2mL
de LB com ampicilina, e incubado a 37ºC a 225 rpm por 16 horas. No dia seguinte, o
plasmídeo com o clone infectivo pBD6-15 mutagenenizado era extraído das células
bacterianas utilizando o kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN, EUA), seguindo as
recomendações do fabricante, e um volume final de 50µl era obtido.
Para confirmar a presença do genoma completo do CRF02_AG nos plasmídeos
mutagenizados, uma reação de digestão era feita na seguinte proporção por amostra,
totalizando 20µl de volume: 5µl de material genético; 2µl de tampão no. 3 10x
(Fermentas, Canadá); 2µl BSA 1x; 0,25µl MluI [10U/µl] (Fermentas, Canadá); 0,25µl
NotI [10U/µl] (Fermentas, Canadá); e 10,5µl de água ultrapura. A reação era incubada a
37ºC por 16 horas, e a análise do sucesso desta reação era feita através da observação de
fluorescência em gel de agarose 0,8% (p/v) da banda do tamanho esperado com a
utilização de brometo de etídio (EtBr) sob luz ultravioleta (UV). Para tal verificação, se
faz necessária uma corrida de eletroforese em gel de agarose de uma alíquota de 4l da
reação homogeneizada com 2 l de tampão de amostras 6X de azul de bromofenol a
0,25% e glicerol a 20% aplicados em um poço do gel em tampão TBE (Invitrogen,
EUA). Aplicou-se também ao gel um marcador de peso molecular 1kb DNA ladder
(Invitrogen, EUA) para estimar o tamanho das bandas geradas. Após a corrida o gel era
imerso em tampão com EtBr por 15 min, e então observado sob luz UV. Os fragmentos
71
esperados eram uma banda de DNA de aproxidamente 9,7kb (genoma completo do
CRF02_AG) e uma outra de 3kb (vetor).
3.8. Sequenciamento dos plasmídeos pBD6-15 mutagenizados
Das amostras que apresentaram as duas bandas de tamanho correto, 2µl de
material eram retirados para uma reação de PCR de única etapa com 50µl de volume
total, com os seguintes reagentes: 5µl PCR rxn Buffer 10x; 1,5µl MgCl2 [50mM]; 0,4µl
dNTP [25mM] (Invitrogen, EUA); 0,4µl iniciador senso PROTU3
(5’AGAGCAGACCAGAGCCAAC3’) [10 pmol/ µl]; 0,4µl iniciador reverso PROTU4
(5’ACTGGTACAGTCTCAATAGG’) [10 pmol/µl]; 0,25µl Platinum® Taq DNA
polymerase [5U/µl] (Invitrogen, EUA); 40,05µl de água ultrapura. As reações eram
conduzidas em termociclador GeneAmp® PCR system 9700. A ciclagem utilizada foi:
um pré-ciclo de ativação da enzima a 94ºC por 2’; trinta e cinco ciclos com uma
desnaturação de 94ºC por 30’’, um anelamento de 52ºC por 30’’ e uma extensão de
72ºC por 1’; uma etapa final de extensão a 72ºC por 10’ para completar todas as fitas
inacabadas. As amostras eram então mantidas por 10ºC por tempo indefinido.
O sucesso da amplificação foi confirmado com a visualização de fluorescência
conferida por brometo de etídio (EtBr) sob luz ultravioleta (UV) em gel de agarose
0,8% (p/v) da banda do tamanho esperado (no caso, 440pb) após corrida de eletroforese
de 3µl de cada amostra. Como marcador de peso molecular foi utilizado o 1kb DNA
ladder (Invitrogen, EUA). As amostras eram purificadas utilizando o QIAquick PCR
Purification Kit (Qiagen, EUA) e quantificadas utilizando o espectrofotômetro
NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, EUA). Como branco foi utilizado 1µl do tampão
de eluição de QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, EUA). A quantificação do DNA
foi feita com 1µl de amostra e expressa em ng/µl.
72
Para o seqüenciamento das amostras, os serviços oferecidos pela empresa Davis
Sequencing (EUA) foram requeridos, no qual foi providenciada uma alíquota de 8ng/µl
de DNA purificado (64ng no total) por amostra, juntamente com uma alíquota do primer
PROTU3 [3 pmol/µl]. As sequências obtidas foram editadas manualmente no programa
SeqMan do pacote DNAStar (DNAStar, EUA), utilizando como padrão de referência a
sequência da região da protease do pBD6-15.
3.9. Transfecções e ensaio de atividade da transcriptase reversa viral
O vetor contendo o clone pBD6-15 original extraído com o QIAprep Spin
Miniprep Kit (Qiagen, EUA) foi utilizado para a transfecção uma linhagem celular
derivada de epitélio renal 293T utilizando Effectene® Transfection Reagent (Qiagen,
EUA), seguindo as orientações do fabricante. Para tanto, 4x105 células 293T foram
suspensas em 2,2ml de DMEM (Invitrogen, EUA) enriquecido com 10% (v/v) de soro
fetal bovino (Invitrogen, EUA) e 0,005% (v/v) de uma solução de
penicilina/estreptomicina (P/E). As células eram depositadas em um poço de uma placa
de 6-poços (BD Biosciences, Canada) no dia anterior à transfecção, e mantidas em
estufa CO2 5% aquecida a 37ºC por 24h antes da transfecção. Para o ensaio de
transfecção, foi utilizado 0,4ng do vetor contendo o clone original de pBD6-15,
conforme instruções da empresa.
Após 48h de cultura um ensaio de atividade da TR viral era feito em duplicata
(Coligan et al., 1999). Para tanto, 10µl de sobrenadante livre de células da cultura
trasnfectada eram coletados e depositados em uma placa de 96-poços (BD Biosciences,
Canadá). Eram acrescidos 25µl de TR-mix [1M Tris (pH 7,8); 2M KCl; 1M ditiotreitol
(DTT); 100mM MgCl2; 1ml de poli(rA)·p(dT) [1U/ml]; 0,5% (v/v) NP-40; 1µl de 10-
mCi/ml [α-32
-P]-dTTP por ml], e a reação era incubada a 37ºC por três horas em caixa
73
de acrílico com o fundo forrado com papel toalha embebido em água destilada. Após o
término do período de incubação, 10µl da reação eram transferidos para um filtro
DEAE (PerkinElmer, EUA), lavado cinco vezes com 5x SSC [NaCl a 0,15M; citrato de
sódio a 0,015M], duas vezes com etanol 80% ,e seco a 50ºC por 20 minutos. O nível de
radiação (contagens por minuto) para cada poço do filtro seco foi medido utilizando um
contador Matrix 96 Direct Beta (PerkinElmer, EUA), e um nível de radiação médio
acima de 500 contagens/minuto foi considerado positivo. A incorporação de [α-32
-P]-
dTTP pela TR do HIV-1 é uma medida relativa desta enzima viral presente nas partícula
virais do sobrenadante da cultura.
A cultura era coletada em tubo BD FalconTM
de 14ml e centrifugada por 5
minutos a 1.500rpm. O sobrenadante era coletado e aliquotado em criotubos de 2ml e
armazenado a -80ºC, enquanto as células eram descartadas.
3.10. Escolha da melhor linhagem celular para a infecção viral
Para testar a melhor linhagem celular para a propagação viral dos clones
infectivos de CRF02_AG, foram utilizadas cinco linhagens de células: TZM-bl (clone
celular de HeLa expressando CD4, CXCR4 e CCR5); U-87 MG (originado de um
glioblastoma-astrocitoma tipo epitelial e expressando CXCR4); C8166, MT-2 e MT-4
(todas linhagens originadas de linfócitos T humanos). Os meios de cultivo para as
linhagens celulares utilizadas neste trabalho estão descritos na tabela abaixo.
Tabela 7. Meios de cultivo para as linhagens celulares
Linhagem
celular Meio
SFB
(v/v)
P/E
[10U/µl] Puromicina
Sulfato de G418
[100µg/ml]*
TZM-bl DMEM 10% 5ml ___ ___
U-87 MG DMEM 10% 5ml 100µl 30ml
74
C8166 RPMI
1640 10% 5ml 100µl 10ml
MT-2 RPMI
1640 10% 5ml 100µl 10ml
MT-4 RPMI
1640 10% 5ml 100µl 10ml
* Análogo de neomicina (Invitrogen, EUA).
Após dois dias de cultivo em frasco de cultura de 250 ml (BD Biosciences,
Canadá) com meio apropriado, 4x105 células TMZ-bl ou U-87 MG eram coletadas e
depositadas por poço em placas de 6-poços (BD Biosciences, Canada), em num volume
total de 4ml de DMEM específico para cada linhagem celular. Já para as linhagens
C8166, MT-2 e MT-4, 1x106 células eram coletadas em 4ml de RPMI 1604 e
depositadas em poços de uma placa de 6-poços. Em cada poço foram adicionados 250µl
de sobrenadante celular contendo vírus BD6-15. As placas eram armazenadas a 37ºC
em incubadora de CO2 a 5%.
Nos dias 3, 6, 8 e 10 pós-infecção, foi feito um ensaio de atividade da TR viral
em duplicata como já descrito acima. Um nível de radiação médio acima de 500
contagens/minuto foi considerado positivo. Foi selecionada a melhor linhagem celular
para a propagação viral, no caso a MT-2. O total de cultura (4ml) foi transferido para
um tubo BD FalconTM
de 14mL e centrifugado a 1,500 rpm por 5 minutos. As células
foram separadas e foram feitas alíquotas de 750µl com o sobrenadante. As aliquotas
foram armazenadas a -80ºC.
3.11. Transfecção e propagação viral em cultura dos clones BD6-15 mutagenizados
Uma vez estabelecido o protocolo, 0,4ng de cada vetor de pBD6-15 gerado por
mutagênese sítio-dirigida foram introduzidos em células 293T numa reação de
transfecção como já descrito acima. Após 48h foi realizado um ensaio de atividade da
75
TR viral em duplicata, já previamente descrito. Das culturas positivas para atividade
viral foram coletados 250µl de sobrenadante livre de células, e estes foram transferidos
para placas de 6-poços, contendo 1x106 células MT-2 em 4ml de meio RPMI 1640
preparado.
Nos dias 3 e 5 pós-infecção, foi realizado um ensaio de atividade da TR viral em
duplicata para confirmar a presença de partículas virais no sobrenadante. Uma vez
confirmada a infectividade viral, o total de cultura (4 ml) era transferido para um frasco
de cultura de 75 cm2 (BD Biosciences, Canadá), e eram acrescidos mais 1x10
6 células
MT-2 em 6 ml de meio RPMI-1640 preparado para a linhagem celular. No quinto dia o
total de cultura (10 ml) era transferido para um tubo BD FalconTM
de 14 mL e era
centrifugado a 1,500 rpm por 5 minutos. O sobrenadante era aliquotado a 750 µl em
criotubos de 1 ml e armazenados a -80ºC. As células MT-2 era separadas e o DNAg era
extraído com o QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, EUA), seguindo as instruções
do fabricante.
Uma única etapa de PCR era conduzida com os primers PROTU3 e PROTU4,
como já descrito anteriormente. As amostras amplificadas foram purificadas e enviadas
para o sequenciamento automático como descrito acima. As sequências obtidas foram
editadas manualmente no programa SeqMan do pacote DNAStar (DNAStar, EUA),
usando como padrão de referência a sequência da região da protease do pBD6-15. Após
a edição, as sequências foram alinhadas no programa BioEdit v.7.0 (Tippmann, 2004),
traduzidas in silico e a mutagênese sítio-dirigida foi confirmada em clones para cada
mutante desejado.
76
3.12. Titulação Viral
Todos os vírus gerados neste trabalho tiveram os seus valores de CCID50 (dose
de vírus capaz de infectar 50% da cultura de células) determinados. Para este
procedimento, células MT-2 foram contadas e 10.000 células foram adicionadas a 150µl
de meio RPMI 1640 preparado e colocadas em cada poço em nove colunas (3-11) de
uma placa de 96-poços (BD Biosciences, Canada). As colunas restantes (1, 2 e 12)
foram preenchidas com 250µl de tampão fosfato-salino (PBS). A titulação de cada clone
foi feita em triplicata, em 8 diluições seriadas de 1:9 da alíquota viral oriunda do
sobrenadante de cultura livre de células em meio RPMI 1640 e cada poço recebeu 100µl
dos vírus diluídos. A placa foi condicionada a 37ºC em incubadora CO2 a 5%, e no
terceiro dia pós-infecção 150µl do sobrenadante foram descartados e 150µl de meio
RPMI 1640 fresco preparado para MT-2 foram adicionados. As culturas foram
acompanhadas diariamente por microscopia óptica para análise de aparecimento de
sincícios. Nos dias 6 e 9 pós-infecção foi feito um ensaio de atividade da TR em
duplicata conforme descrito acima. Os resultados da contagem de radiação foram
analizados em planilha Microsoft Excel® para plataforma Windows através da fórmula:
índice = [(% da diluição infectiva acima de 50% dos poços) - 50%] / [(% da diluição
infectiva acima de 50% dos poços) - (% da diluição infectiva abaixo de 50% dos
poços)]. Esse índice foi então acrescido ao fator de diluição, obtendo-se assim o valor
CCID50.
3.13. Fenotipagem viral aos inibidores de protease
O experimento para determinação do IC50 foi feito com todos os vírus gerados
neste trabalho para seis IPs: APV, ATV, IDV, LPV, NFV e SQV. Para a realização do
ensaio de fenotipagem, placas de 96-poços (BD Biosciences, Canadá) contendo 15x103
77
de células MT-2 foram infectadas com os vírus gerados de CRF02_AG em 225µl de
meio RPMI 1640 preparado para esta linhagem celular a uma MOI (multiplicidade de
infecção) de 0,01. Cada fenotipagem foi feita em quadriplicata. A concentração inicial
das drogas diluídas em DMSO (dimetilsulfóxido) era de 20mM, e estas foram
posteriormente diluídas em RPMI 1640 para 5µM. Posteriormente, foram feitas 11
diluições seriadas de 5x para a droga a ser testada e, 24h pós-infecção, 25µl de cada
diluição foram adicionados ao seu respectivo poço. A cultura era mantida em
incubadora CO2 5% a 37ºC e observada sob microscopia óptica diaramente para a
detecção de sincícios. No quinto e sétimo dias pós-infecção, o ensaio de fenotipagem
era revelado através do ensaio de atividade da TR viral como previamente descrito. Os
resultados eram analisados em planilha Microsoft Excel® para plataforma Windows,
onde o valor da atividade da TR do poço com a concentração mais diluída da droga foi
considerado como 100% de infecção. A concentração de droga necessária para inibir
50% da infecção viral foi calculada em uma curva logarítmica onde o eixo y
correspondia à porcentagem de infectividade, e o eixo x à concentração da droga. O
resultado foi expresso em nível de resistência (NR) calculado pela razão entre o IC50
determinado para o vírus mutante e o IC50 determinado para o vírus BD6-15 (clone
selvagem). A hipersusceptibilidade foi caracterizada quando o NR do vírus mutante
apresentava valores ≤ 0,4. A fenotipagem do vírus de subtipo B, NL4-3, foi utilizada
como controle externo para a sensibilidade viral a drogas. As diferenças nos valores
médios de IC50 para os vírus mutantes foram comparados aos valores médios de IC50
determinado para o vírus original BD6-15 através do teste bi-caudal de Student, e
valores de p ≤ 0,05 foram considerados significativos.
78
3.14. Competições par-a-par
Para medir a capacidade replicativa viral dos vírus mutantes gerados neste
estudo, foram feitas competições par-a-par entre os vírus derivados de CRF02_AG. Para
o ensaio, 5x104 células MT-2 em 500µl de meio RPMI 1640 para esta linhagem foram
infectadas em MOI de 0,001 por cada vírus. Infecções individuais foram feitas nas
mesmas condições como controles positivos para propagação viral. Todas as infecções
foram feitas em triplicatas utilizando placas de 48 poços (BD Biosciences). As culturas
foram armazenadas em incubadora de CO2 a 5% e a 37ºC, e foram observadas
diariamente sob microscopia óptica para detecção de sincícios.
No quinto dia pós-infecção, foi feito um ensaio de atividade da TR viral em
duplicata e, uma vez confirmada a atividade viral, o total de cultura foi transferido para
tubos de 1,5 ml e centrifugado a 1.500 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi
armazenado a -80ºC e as células tiveram seu DNAg extraído com o kit QIAamp DNA
Blood Mini (Qiagen), seguindo as instruções do fabricante. O material genético extraído
teve a região da protease dos provírus integrados amplificada por reação de única etapa
de PCR utilizando os primers PROTU3 e PROTU4 como já descrito acima. Os produtos
de PCR foram purificados utilizando o kit QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), e
quantificadas utilizando o NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, EUA). Os produtos
purificados proveniente das monoinfecções foram sequenciados como já citado acima
para confirmar a não-reversão das mutações inseridas.
A prevalência de cada vírus competidor foi quantificada pelo ensaio OLA (do
inglês oligonucleotide ligation assay), modificado do protocolo estabelecido por
Lalonde et al., 2007. Neste caso, iniciadores à montante da mutação marcados com
fluoróforos distintos descriminam uma posição na protease entre as duas variantes
79
competidoras (Tabela 7). O iniciador à jusante da mutação, também marcado com
fluoróforo, anela sem distinção entre os competidores. Uma reação de ligação foi
conduzida com os seguintes reagentes por tubo em um volume total de 12µl: 1,2µl 10X
OLA buffer; 3,1 µl de água ultrapura; 0,3µl de cada iniciador [0,3µM]; 0,05µl
Ampligase® DNA ligase [100U/µl] (Epicentre Biotechnologies, EUA); e 5µl de
material genético [2ng/µl ou 0,2ng/µl]. A reação foi feita em termociclador GeneAmp®
PCR system 9700 (Applied Biosystems) com a seguinte ciclagem: 170 ciclos de 95ºC
por 10 segundos para desnaturação e 37ºC para anelamento e ligação dos
oligonucleotídeos. O resultado foi lido em fluorímetro e analisado em planilha
Microsoft Excel® para plataforma Windows, onde foi calculada a porcentagem de cada
variante de CRF02_AG na competição.
Tabela 8. Iniciadores para o OLA
Posição
protease Iniciador montante Alvo Iniciador jusante
17 5’-GTTACAGTAAAATTAGGGGA*-3’
5’-GTTACAGTAAAATTAGGGGG-3’
17E
17G 5’-CAGCTGATAGAAGCCTTAT-3’
64 5’-AATATGATCAGATACTTATG-3’
5’-AATATGATCAGATACTTATA-3’
64M
64I 5’-GAAATTTGTGGAAAAAAGGC-3’
72 5’-AATTTGTGGAAAAAAGGCTG-3’
5’-AATTTGTGGAAAAAAGGCTA-3’
72V
72I 5’-TAGGTACAGTGTTAGTAGGA-3’
* As posições sublinhadas correspodem àquelas discriminatórias dos dois variantes
presentes em cada compatição par-a-par.
3.15. Fenotipagem de isolados virais com L90M de subtipo B e G
Trinta e oito diferentes isolados de subtipo G foram fenotipados pela
metodologia AntivirogramTM
(Virco, Bélgica) para os IPs mais comuns, incluindo APV,
IDV, NFV, LPV e SQV. Do total de isolados de subtipo G, 20 eram oriundos de
80
pacientes virgens de tratamento sem nenhuma MRD majoritária, enquanto as demais
tinham L90M e/ou L89I. Para avaliar diferenças fenotípicas entre padrões mutacionais
presentes em subtipos B e G, 55 isolados de subtipo B com valores fenotípicos
determinados foram obtidos do Stanford HIV Drug Resistance Database (Shafer et al.,
2000). Para evitar artefatos metodológicos, somente isolados virais fenotipados pela
metodologia AntivirogramTM
(Virco) foram incluídos neste trabalho. A média de NR de
padrões de resistência idênticos foram comparados entre subtipos por test T Student bi-
caudal, onde valores de p ≤ 0,05 foram considerados significativos.
81
4. Resultados
4.1. Aparecimento de MRD em proteases de subtipos F e B do HIV-1 no Brasil
Com o propósito de analisar o aparecimento de mutações ao longo do tempo na
região da protease do HIV-1 de pacientes adultos e crianças infectados pelos subtipos B
e F, foi compilado o surgimento das MRDs majoritárias para os IPs IDV e NFV. As
demais drogas não foram analisadas devido a seu baixo uso pelo pacientes analisados
neste estudo. Para IDV, as crianças de ambos os subtipos fizeram pouco uso deste
inibidor e foram excluídas desta análise. Nos esquemas dos adultos, IDV pode ser
administrado sozinho ou com outros IPs (na maior parte das vezes com RTV). Assim,
para excluir a possibilidade de que esse esquema duplo pudesse interferir nos
resultados, foi medida a proporção de adultos de cada subtipo que utilizaram IDV
sozinho. Como resultado, 61% (30/49) dos adultos infectados pelo subtipo B fizeram
uso deste inibidor sozinho, contra 70% (59/84) dos adultos infectados pelo sub-subtipo
F1; esta diferença não foi significativa (p = 0,281). Neste caso, foi analisada a média de
tempo de uso de IDV/RTV para ambos os subtipos (13,9 meses para subtipo B e 9,4
meses para F1), e as médias obtidas também não foram significativamente diferentes (p
= 0,232). Deste modo, os adultos que fizeram uso de IDV e IDV/RTV puderam ser
analisados para o acúmulo das MRDs M46I/L e V82A/F/T. A partir do terceiro ano de
tratamento com IDV, a MRD M46I/L foi encontrada em 6% (04/63) dos isolados virais
do sub-subtipo F1 e em nenhum isolado de subtipo B (p = 0,036) (Figura 26A). De
forma interessante, esta MRD só foi vista em subtipo B a partir do quarto ano de
tratamento. Já o aparecimento da MRD V82A/F/T não mostrou diferença significativa
entre os isolados dos dois subtipos de pacientes adultos após quatro anos de tratamento,
embora proporções maiores no grupo do subtipo F1 tenham sido observadas em todos
82
os pontos analisados (Figura 26B). A mutação I84V, apesar de ser majoritária para IDV,
não foi analisada devido à sua rara presença nos isolados estudados.
A. B.
Figura 26. Aparecimento de MRDs a IDV em subtipos B e F1. (A) Acompanhamento para a
MRD M46I/L. (B) Acompanhamento para a MRD V82A/F/T. Os asteriscos denotam períodos
onde diferença na proporção da MRDs foi estatiscamente significativa (p ≤ 0,05) entre os
subtipos. Nas legendas dos códigos de cores, são mostrados os números de cada subtipo em
cada situação analisada.
Para NFV, foram analisados separadamente o aparecimento das MRDs
majoritárias D30N e L90M. Foi feita uma comparação entre adultos e crianças de cada
subtipo por três anos de tratamento com NFV (Figura 27). Após três anos de tratamento,
não houve diferença no acúmulo de D30N em crianças e adultos infectados pelos
subtipos B (p = 0,322) e F1 (p = 0,999) (Figuras 27A e B). O mesmo resultado foi
observado para o acúmulo de L90M para os subtipos B (p = 0,386) e F1 (p = 0,999)
(Figuras 27C e D). Nesse caso, as crianças e adultos infectados por cada subtipo foram
reunidas num só grupo para análise de acúmulo das mutações entre subtipos. No
terceiro ano de tratamento com NFV, 17% (19/110) dos pacientes infectados pelo
subtipo B apresentavam a MRD D30N, contra apenas 6% (06/97) daqueles infectados
*
*
83
pelo sub-subtipo F1 no mesmo período (p = 0,014) (Figura 27E). O mesmo foi visto
para o acúmulo de L90M com maior proporção em subtipo B (16% - 14/89) do que em
sub-subtipo F1 (5% - 04/82, p = 0,021) (Figura 27F).
A. B.
C. D.
E. F.
* *
84
Figura 27. Acúmulo das MRDs D30N e L90M em pacientes adultos e crianças infectados pelos
subtipos B e F1 sob tratamento com NFV. Em asterisco períodos onde a proporção da MRD foi
estatiscamente significativa (p ≤ 0,05) entre os subtipos. Os asteriscos e números entre
parênteses seguem as definições da Figura 26.
4.2. Aparecimento de MRDs em proteases de subtipos B e G do HIV-1 em Portugal
Nós analisamos o perfil de mutações adquiridas por pacientes adultos em falha
terapêutica no Hospital Egaz Moniz de Lisboa, Portugal, infectados com os subtipos do
HIV-1 B e G. A região da protease dos vírus de pacientes que faziam uso de NFV, IDV
ou IDV/RTV como primeira linha terapêutica contendo IP foi analisada.
Para NFV, seis MRDs apresentaram diferenças em proporção entre isolados
virais dos dois subtipos analisados, duas das quais são MRDs majoritárias (Tabela 8).
Nesse caso, a proporção de D30N foi seis vezes maior em isolados do subtipo B do que
em isolados do subtipo G, enquanto a proporção de L90M foi quase duas vezes maior
em subtipo G do que em subtipo B. De forma interessante, três MRDs (I54V,I54L e
L89I), foram encontradas quase que exclusivamente em isolados virais do subtipo G.
Tabela 9. Padrão de aquisição de MRDs para NFV.
MRD Subtipo B (125) Subtipo G (90) Valor de p (Fisher)
D30N 36% (45) 6,7% (06) < 0,001
L33I/F/V 4,8% (06) 22% (02) 0,473
M46I 12,8% (16) 12,2% (11) 0,999
M46L 1,6% (02) 1,1% (01) 0,999
I54V 0,8% (01) 22,2% (20) < 0,001
I54L ___ 4,4% (04) 0,029
I84V 4% (05) ___ 0,076
N88D 27% (34) 5,6% (05) < 0,001
85
N88S 4% (05) 7,8% (07) 0,246
L89I 0,8% (01) 40% (36) < 0,001
L90M 29% (36) 54% (49) < 0,001
Em negrito, as MRDs majoritárias para NFV.
Em cinza valores de p < 0,001.
Para nos certificarmos de que a diferença encontrada nas proporções de MRDs
majoritárias era temporal, nós descartamos os pacientes que não tinham o tempo de
tratamento disponível. Aqueles que tinham o histórico de tratamento com o tempo de
uso de HAART foram estratificados por ano e cada MRD foi analisada. Desta maneira,
foi observado que a mutação D30N só aparece no terceiro ano de tratamento com
HAART contendo NFV em isolados virais do subtipo G. A partir do segundo ano de
tratamento, a aquisição da mutação D30N mostra diferenças na proporção entre os
subtipos (p = 0,013), presente em 20% (11/55) dos isolados de subtipo B e em nenhum
dos isolados de subtipo G (Figura 28). Já para a aquisição de L90M, a diferença entre os
subtipos torna-se significativa no sentido oposto a partir do terceiro ano de tratamento
(p < 0,001). No quarto ano de tratamento, a proporção desta mutação em subtipo G foi
de 55% (16/28), mais de duas vezes maior do que aquela apresentada pelos isolados de
subtipo B (20% - 11/55).
Para IDV, foram descartados os casos de medicação conjunta com RTV, para
evitar que mutações selecionadas por esta última interferissem na análise. Desta forma,
foram analisados apenas os isolados virais de pacientes em falha terapêutica que fizeram
uso exclusivo de IDV como IP de primeira linha da HAART. Cinco MRDs
apresentaram proporções diferentes entre os isolados dos diferentes subtipos, dentre as
quais três MRDs majoritárias para IDV (Tabela 9). Novamente, a mutação L89I foi
selecionada preferencialmente em isolados de subtipo G.
86
A. B.
Figura 28. Aquisição de DRM D30N (A) e L90M (B) em quatro anos de tratamento com
HAART contendo NFV. Os asteriscos e números entre parênteses seguem as definições da
Figura 26.
Tabela 10. Padrão de aquisição de MRDs para IDV.
MRD Subtipo B (176) Subtipo G (94) Valor de p
(Fisher)
V32I 5,7% (10) ___ 0,017
L33I/F 1,7% (03) 3,2% (03) 0,423
M46I 20% (36) 11% (10) 0,043
M46L 2,8% (05) 1,1% (01) 0,668
I54V 13% (26) 20% (19) 0,304
V82A 21% (37) 1,1% (01) < 0,001
V82F 1,1% (02) ___ 0,544
V82M ___ 2,1% (02) 0,120
V82T 4% (07) 11% (10) 0,038
V82S ___ 1,1% (01) 0,348
I84V 11% (19) 5,3% (05) 0,173
L89I 0,6% (01) 14% (13) < 0,001
L90M 13% (23) 15% (14) 0,712
Em negrito, as MRDs majoritárias para IDV.
Em cinza, valores de p < 0,001.
*
*
*
*
*
87
Foi feita uma análise temporal de aquisição de MRDs em regime terapêutico de
HAART contendo IDV para as mutações M46I/V e V82A/F/T/S. A mutação I84V foi
excluída da análise em função de sua baixa frequência nas amostras analisadas. Apesar
da MRD M46I ter sido encontrada em menor proporção no subtipo G (Tabela 9), após
seis anos de tratamento não houve diferença significativa da proporção desta MRD entre
os subtipos B e G (p = 0,468) (Figura 29). Entretanto, o acúmulo das MRDs
V82A/F/T/S foi maior em isolados virais do subtipo B do que em isolados do subtipo G
(p = 0,026). No sexto ano de tratamento, 37% (23/62) dos isolados de pacientes
infectados pelo subtipo B apresentavam alguma mutação na posição 82 versus 16%
(07/43) dos isolados de subtipo G (p = 0,028) (Figura 29).
A. B.
Figura 29. Aquisição das MRDs M46I/L (A) e V82A/F/T/S (B) em subtipos B e G do HIV-1
em seis anos de tratamento com HAART contendo IDV. Os asteriscos e números entre
parênteses seguem as definições da Figura 26.
4.3. Aparecimento de MRDs na protease de isolados virais do grupo M do HIV-1
Para verificar o acúmulo de MRDs ao longo do tratamento em diferentes
subtipos do grupo M do HIV-1, foram analisados isolados virais de pacientes infectados
com sete diferentes subtipos e formas recombinantes do vírus. Somente sequências
* *
*
88
virais de pacientes com histórico completo de tratamento, incluindo o tempo de cada
terapia, foram elegíveis para esta análise. O subtipo B foi usado como referência para
comparação do acúmulo de MRDs ao longo do tempo e, portanto, somente pacientes
falhando a primeira HAART com uso de IP foram selecionados para esta análise. Nos
demais subtipos o uso de mono e/ou dupla terapia, assim como o uso de mais de um
regime de HAART, foram permitidos para a análise. Como as proteases de isolados
CRF01_AE são caracterizadas como puros de subtipo A, estas duas formas foram
analizadas soem um único grupo.
Para NFV, primeiramente foi considerada a porcentagem de isolados virais que
apresentavam alguma MRD majoritária a esta droga (Figura 30A). O subtipo G foi a
forma do HIV-1 que acumulou a maior proporção de cepas resistentes após 54 meses de
tratamento, com 64% (35/55) dos isolados com D30N e/ou L90M, enquanto isolados de
subtipo A/CRF01_AE acumularam apenas 6% (02/33) no mesmo período (p < 0,001).
Com relação ao acúmulo de D30N, cerca de 30% (104/359) dos isolados de subtipo B
apresentaram esta mutação após 54 meses de tratamento, a maior proporção dentre os
subtipos (p < 0,001 em todos os casos, com exceção do sub-subtipo F1, com p = 0,479)
(Figura 30B). Novamente, isolados de subtipo A e CRF01_AE apresentaram a menor
proporção, com nenhum dos seus isolados virais apresentando a D30N. Não houve
diferenças no acúmulo de L90M nos diferentes subtipos do HIV-1 em 54 meses de
tratamento, onde 6-18% dos isolados apresentaram esta MRD (Figura 30C). A exceção
foi o subtipo G que, em 54 meses de tratamento, continha esta mutação em 58% (32/55)
dos seus isolados virais (p < 0,001 comparado a cada um dos demais subtipos).
Para IDV, o acúmulo de isolados virais com pelo menos uma das MRDs
majoritárias conhecidas a esta droga (M46I/L, V82A/F/T/S e I84V) foi avaliado para os
subtipos do HIV-1. Pacientes que fizeram uso de IDV/RTV foram descartados. Não
89
houve diferença de acúmulo entre os subtipos A / CRF01_AE, B, F1 e G após 54 meses
de tratamento (18-32% de isolados resistentes) (Figura 31A). A menor proporção de
isolados virais resistentes foi caracterizada em subtipo C, com 15% (07/47) de isolados
resistentes após 54 meses de tratamento. Tal proporção mostrou diferença estatística
apenas contra isolados resistentes do subtipo B, e somente no último período de
tratamento (p = 0,032). Para o acúmulo apenas de M46I/L, novamente foi observada
apenas a diferença entre subtipo B e C no último período de acompanhamento (p =
0,029) (Figura 31B). Entretanto, foram observados dois grupos de resistência que
demonstraram diferença no acúmulo desta mutação após 54 meses de tratamento: grupo
B/G (18-24%) e grupo A/C/F (8-12%) (p = 0,007) (Figura 31B). Para o acúmulo das
MRDs V82A/F/T/S, a proporção de isolados resistentes por subtipo no último período
de acompanhamento variou de 11 a 23%, sem nenhuma diferença estatística
individualmente ou em conjunto (Figura 31C).
Com relação a SQV, devido ao baixo número de pacientes que fizeram uso deste
medicamento (13 pacientes infectados com subtipo A/CRF01_AE, 10 com sub-subtipo
F1 e seis com subtipo G), apenas os subtipos B e C foram analisados. A MRD
selecionada especificamente para esta droga, G48V, foi detectada em apenas dois
isolados de subtipo B e em apenas um de subtipo C sempre em conjunto com L90M.
Desta maneira, todos os isolados resistentes tinha a presença da L90M, e sendo assim
apenas o acúmulo desta mutação foi considerada nesta análise. Tal qual para NFV
(Figura 30C), não foi encontrada diferença significativa na proporção desta mutação
após 54 meses de tratamento com SQV (p = 0,328) (Figura 32).
90
A.
B.
C.
Figura 30. Acúmulo de mutações D30N e/ou L90M para NFV em diferentes subtipos do HIV-1
ao longo do tempo (A). À direita valores de p em teste estatístico comparando subtipo G e
subtipo A / CRF01_AE com os demais subtipos (em vermelho, valores de p abaixo de 0,05).
Acúmulo da mutação D30N em diferentes subtipos (B). Acúmulo da mutação L90M em
diferentes subtipos (C).
Sub G
versus 54 meses 36 meses 18 meses
Sub B 0,003 0,295 ___
Sub A/01 <0,001 <0,001 0,027
Sub C <0,001 0,001 0,253
Sub-sub F1 0,028 0,209 ___
Sub A / 01
versus 54 meses 36 meses 18 meses
Sub B <0,001 <0,001 0,006
Sub C 0,039 0,101 ___
Sub-sub F1 <0,001 0.018 0.128
91
A.
B.
C.
Figura 31. Acúmulo de MRDs majoritárias para IDV em diferentes subtipos do HIV-1 ao longo
do tempo (A). Acúmulo da mutação M46I/L em diferentes subtipos (B). Acúmulo da mutação
V82A/F/T/S em diferentes subtipos (C).
92
Figura 32. Acúmulo de L90M em diferentes subtipos do HIV-1 ao longo do tratamento com
SQV.
4.4. Aparecimento de MRDs na TR de isolados virais do grupo M do HIV-1
durante a primeira linha terapêutica
O domínio polimerásico da TR de diferentes subtipos do grupo M foi analisado
em diferentes esquemas terapêuticos, com o objetivo de observar diferenças no acúmulo
de mutações. O esquema HAART mais utilizado foi a combinação dos INTRs AZT e
3TC, juntamente com um IP ou INNTR. Nós analisamos estas duas composições de
classes para saber se a escolha deste terceiro terápico poderia influenciar no
aparecimento de TAMs, classificadas como: TAM-1 (M41L, L210W e T215Y) e TAM-
2 (D67N, K70R, T215F e K219E/Q). Com relação ao esquema
AZT/d4T+3TC+INNTR, foi observado que o subtipo C e CRF02_AG tem uma menor
proporção de TAM-1 comparados ao subtipo B (p = 0,004 e 0,047, respectivamente),
enquanto o subtipo C e CRF01_AE apresentaram uma proporção maior de TAM-2
(Figura 33A). Para o esquema terapêutico utilizando AZT/d4T+3TC+IP, foi observado
que a proporção de TAM-1 e -2 é menor em subtipo C do que em subtipo B (p < 0,005
em ambos os casos (Figura 33B). Já na comparação intra-subtipo, a proporção de TAM-
93
1 foi menor em isolados de subtipo B que fizeram uso de um IP do que nos isolados que
utilizaram INNTR (p = 0,022), sendo o mesmo observado para isolados do subtipo C (p
= 0,015). Já a proporção de TAM-2 foi maior em isolados do subtipo C que fizeram de
um INNTR do que aqueles que utilizaram IP na primeira linha terapêutica (p < 0,001).
De forma interessante, a proporção de TAM-1 foi o dobro da proporção de TAM-2 em
isolados de subtipo B sob tratamento com AZT/d4T+3TC+INNTR (p = 0,001), o que
não foi visto em isolados deste subtipo sob AZT/d4T+3TC+IP, onde as proporções das
duas vias foram iguais (p = 0,692). O oposto foi visto para isolados do subtipo C e
CRF01_AE, que apenas sob regime com AZT/d4T+3TC+INNTR acumularam mais
TAM-2 do que TAM-1 (p = 0,003 e 0,049, respectivamente).
Para observar o comportamento dos diferentes subtipos ao longo do tratamento
com a composição HAART mais comum, isolados virais de pacientes infectados pelos
subtipos A, B, C e G, além da CRF01_AE em falha terapêutica na primeira HAART,
foram separados em dois grupos: (I) AZT/d4T+3TC+INNTR e (II) AZT/d4T+3TC+IP.
Em ambos os grupos, os isolados foram divididos em períodos de doze meses. Na
composição AZT/d4T+3TC+INNTR, o subtipo C acumulou mais M184V do que o
subtipo B a partir do terceiro ano de tratamento (p = 0,010), enquanto o subtipo G
acumulou mais M184V do que o subtipo B a partir do quarto ano (p = 0,028) (Figura
34A). No terceiro ano de tratamento, a proporção de M184V foi maior em subtipo C do
que em subtipo A (p = 0,047). Para a composição AZT/d4T+3TC+IP, o subtipo B
acumulou uma proporção maior de M184V do que subtipo C a partir do segundo ano de
tratamento (p = 0,021) e do que o subtipo A a partir do terceiro ano (p = 0,043) (Figura
34B). Isolados virais de subtipo G acumularam uma maior proporção de M184V do que
isolados de subtipo C a partir do quinto ano de tratamento (p = 0,033). Nós também
analisamos o aparecimentos das duas vias mutacionais selecionadas por AZT e d4T,
94
TAM-1 e TAM-2. Para o acúmulo de TAM-1 ao longo de seis anos de terapia com
composição INNTR, não houve diferença entre os subtipos (p > 0,05 em todos os casos)
(Figura 34C). Entretanto, foram observadas diferenças no aparecimento de TAM-1 com
a composição IP. Isolados virais do subtipo B apresentaram uma proporção maior de
TAM-1 do que os subtipos A e C a partir do terceiro ano de tratamento (p = 0,021 e
0,017, respectivamente) (Figura 34D). Com relação a TAM-2, observamos uma menor
proporção em isolados de subtipos B e G a partir do segundo ano de tratamento com
AZT/d4T+3TC+INNTR em relação aos demais subtipos (p < 0,04 em todos os casos)
(Figura 34E). De forma interessante, o inverso ocorre na composição com IP, onde o
subtipo C apresenta uma maior proporção de isolados virais com TAM-2 do que o
subtipo B a partir do terceiro ano (p = 0,025) e do que o subtipo G a partir do quarto ano
de tratamento (p = 0,045) (Figura 34F).
Nós avaliamos também a proporção de isolados virais dos subtipos B, C e G
com TAMs nas duas composições (Figura 35). O aparecimentos de TAMs após seis
anos de tratamento com AZT/d4T+3TC+INNTR foi igual entre os subtipos (20-23%).
Entretanto quando a composição utilizada foi AZT/d4T+3TC+IP, isolados do subtipo C
tiveram uma menor proporção (9%) de vírus contendo TAMs do que os do subtipo B
(27%; p < 0,001) e G (29%; p = 0,003). Não houve diferença na proporção de TAM-1 e
-2 para os subtipos B e G após seis anos de tratamento com AZT/d4T+3TC+INNTR;
entretanto, nesse período, o subtipo C acumulou 2,5x mais isolados com TAM-2 (20%)
do que com TAM-1 (8%; p = 0,001). De maneira interessante, não houve diferenças na
proporção de TAM-1 e -2 para os três subtipos quando a composição era
AZT/d4T+3TC+IP (p > 0,05 em todos os casos). A proporção de TAM-2 em isolados
de subtipo C tratados com AZT/d4T+3TC+INNTR foi 4,5x maior do que em isolados
do mesmo subtipo tratados com IP (p = 0,002).
95
A.
*
*
B.
Figura 33. Proporção de isolados virais com pelo menos uma TAM em diferentes subtipos do
HIV-1 durante o primeiro esquema terapêutico composto por AZT/d4T+3TC+INNTR (A) ou
AZT/d4T+3TC+IP (B). Asteriscos indicam p < 0,05 em comparação com subtipo B.
*
*
* *
96
AZT/d4T+3TC+INNTR AZT/d4T+3TC+IP
A. B.
C. D.
E. F.
Figura 34. Proporção do acúmulo de M184V e TAMs por diferentes subtipos do HIV-1 frente
ao tratamento com AZT/d4T+3TC+INNTR (esquerda) e AZT/d4T+3TC+IP (direita) ao longo
do tempo.
3T
C
AZ
T/d
4T
AZ
T/d
4T
97
Por último, foi analisado o acúmulo de mutações a INNTRs em primeiro
esquema HAART contendo esta classe para diferentes subtipos do HIV-1. Isolados do
subtipo G foram aqueles que mais acumularam mutações após 60 meses de tratamento,
com 93% (39/42) dos isolados com pelo menos uma MRD a INNTRs (Figura 36). A
proporção neste subtipo é maior do que no subtipo B a partir do quarto ano de
tratamento (p = 0,002), e do que no subtipo C a partir do quinto ano (p = 0,028). A
proporção de pacientes infectados pelo subtipo B resistentes a INNTRs foi a menor
entre os subtipos analisados, com 60% dos isolados virais com pelo menos uma MRD.
A proporção de isolados resistentes foi menor em subtipo B do que em subtipo C a
partir do segundo ano de tratamento (p < 0,001) e CRF01_AE a partir de três anos de
tratamento (p = 0,009).
A. B.
Figura 35. Aparecimento de TAMs ao longo do tempo dos diferentes subtipos do HIV-1 frente
ao tratamento com AZT/d4T+3TC+INNTR (A) e AZT/d4T+3TC+IP (B).
98
Figura 36. Porcentagem de isolados virais de diferentes subtipos do HIV-1 com pelo menos
uma MRD a INNTRs durante o primeiro esquema HAART composto por
AZT/d4T+3TC+INNTR.
4.5. Proporção de isolados virais hipersensíveis a antirretrovirais oriundos de
pacientes virgens de tratamento
Para saber se a susceptibilidade aos antirretrovirais diferia entre isolados virais
de cinco representantes do grupo M oriundos de pacientes virgens de tratamento, nós
analisados e comparamos a proporção de isolados de cada subtipo do HIV-1
hipersensíveis (FC ≤ 0,4) para as três principais classes de antirretrovirais. Para os IPs, a
maior proporção de hipersusceptibilidade (HS) foi encontrada para IDV e a menor para
LPV (Figura 37). Isolados do CRF02_AG apresentaram uma proporção maior de HS do
que isolados do subtipo B a APV (p = 0,046), IDV (p = 0,001) e NFV (p = 0,019). Já
isolados do subtipo C apresentaram três vezes mais HS a IDV do que isolados do
subtipo B (p < 0,001). Não foram encontradas diferenças de HS entre subtipos para
ATV, LPV e SQV. O sub-subtipo F1 foi o único representante do grupo M que não
mostrou diferença na proporção de isolados HS para subtipo B.
99
Figura 37. Proporção de isolados HS para diferentes subtipos do HIV-1 a seis IPs. Os asteriscos
indicam diferença significativa na proporção (p ≤ 0,05) em relação ao subtipo B.
Para inibidores da TR, nós também encontramos diferenças na proporção de
isolados HS entre subtipos para cinco das nove drogas analisadas (Figura 38). Para
ABC, 43% (10/23) dos isolados do subtipo C apresentaram HS a esta droga, contra
apenas 12% (02/17) dos isolados de subtipo B (p = 0,040). Com relação ao AZT, quase
50% (06/13) dos isolados do sub-subtipo F1 apresentaram HS a esta droga, a maior
proporção entre todos os subtipos (p < 0,05 para todas as comparações par-a-par). Já os
subtipos C e F apresentaram maior proporção de isolados com HS a d4T do que
isolados do subtipo B (p = 0,001 e 0,026, respectivamente); entretanto, somente o
subtipo C teve a maior proporção comparada aos demais subtipos (p < 0,02 em ambos
os casos). Para DDI, a única diferença encontrada foi entre a proporção de isolados HS
nos subtipos B e G (p = 0,035). Da classe INNTR, foram encontradas maiores
proporções de isolados HS a NVP para os subtipos G e CRF02_AG em relação ao
subtipo B (p = 0,001 e 0,036, respectivamente).
*
*
*
*
*
100
Figura 38. Proporção de isolados HS de diferentes subtipos do HIV-1 a oito inibidores de
transcriptase reversa. Os asteriscos indicam diferenças significativas na proporção de HS (p ≤
0,05) em relação ao subtipo B
4.6. Mapeamento dos polimorfismos ligados a HS em IPs
Se a hipersusceptibilidade for um fenômeno real, e não um artefato causado pelo
ensaio de fenotipagem, sua causa provavelmente está ligada a polimorfimos naturais
presentes nos diferentes subtipos do grupo M do HIV-1. Como nenhum subtipo
apresentou 100% de hipersensibilidade a nenhuma das drogas analisadas (Figuras 37 e
38), nós descartamos as assinaturas genéticas das análises. Os isolados virais utilizados
na análise anterior tiveram suas regiões da protease e transcriptase reversa traduzidas in
silico e analisadas. Alguns isolados em tratamento, mas sem MRD conhecidas, também
foram incluídos na análise. Os isolados de cada subtipo foram divididos em dois grupos:
HS e não-HS. As variações polimórficas entre os dois grupos foram comparadas dentro
de cada subtipo de forma manual, e os polimorfismos apontados foram avaliados
fenotipicamente sozinhos ou em conjunto com outros polimorfismos.
* *
*
* *
*
*
101
Para o subtipo C, nós descobrimos que apenas um único polimorfismo não é
capaz de causar o fenômeno da HS, mas sim um conjunto de três ou mais
polimorfismos. A HS a NFV é causada na presença dos polimorfismos 19L 35E 63L na
protease viral, que está presente 4,5x mais frequentemente em isolados HS do que não-
HS (p = 0,013) (Figura 39A). O NR médio de isolados contendo estes três
polimorfismos foi de 0,59, enquanto que qualquer alteração nesta composição elevou o
nível de resistência médio para 0,96 (p = 0,037). O mesmo conjunto de polimorfismos
causa HS a APV, onde a presença dos três polimorfismos está associada a um nível de
resistência médio de 0,28, enquanto que qualquer alteração elevou em 2,5x o nível de
resistência médio (NR = 0,68; p = 0,003) (Figura 39B). Para ATV, o genótipo
responsável pela HS parece ser a composição 16G 19L 63L, que estava presente 10x
mais frequentemente em isolados HS, que possuíam o dobro da sensibilidade média a
ATV (Figura 39C).
Para sub-subtipo F1 nós mapeamos desde um único polimorfismo ligado a HS
até um conjunto com quatro polimorfismos. Para SQV o polimorfismos 65D parece ser
o responsável pela HS a esta droga em isolados do sub-subtipo F1, uma vez que sua
presença foi quase dez vezes maior no grupo HS e conferiu um nível de resistência
médio de 0,35 (Figura 40A). Para IDV uma composição de três polimorfismos parece
ser a responsável pela HS (12T 15V 20K) que juntos conferem um NR médio de 0,44,
enquanto que qualquer alteração nesta composição eleva o NR para 0,82 (p = 0,006)
(Figura 40B). Para ATV quatro polimorfismos (13I 15V 72V/T 89L) na protease de
isolados do deste sub-subtipo parecem ser responsáveis pela HS, uma vez que tal
conjunto confere um NR médio de 0,25, mais de três vezes mais sensível do que uma
composição com uma ou mais alterações (NR = 0,83; p < 0,001) (Figura 40C). A
102
presença desta composição polimórfica foi encontrada em 80% dos isolados HS (04/05),
mas em nenhum do grupo não-HS (p = 0,004).
A.
Polimorfismo Grupo HS
(07)
Grupo Não-HS
(19) p
19L 86% (06) 63% (12) 0,374
35E 100% (07) 79% (15) 0,546
63L 71% (05) 26% (05) 0,068
19L 35E 63L 71% (05) 16% (03) 0,013
B.
Polimorfismo Grupo HS
(12)
Grupo Não-HS
(15) p
19L 83% (10) 60% (09) 0,235
35E 92% (11) 80% (12) 0,605
63L 67% (08) 27% (04) 0,057
19L 35E 63L 58% (07) 7% (01) 0,008
C.
Polimorfismo Grupo HS
(06)
Grupo Não-HS
(22) p
16G 100% (06) 77% (17) 0,553
19L 83% (05) 54% (12) 0,354
63L 50% (03) 32% (07) 0,634
16G 19L 63L 50% (03) 5% (01) 0,022
103
Figura 39. Mapeamento de polimorfismos ligados a HS em isolados do subtipo C a NFV (A),
APV (B) e ATV (C). À direita, o valor médio de NR para cada composição polimórfica com o
desvio padrão. À esquerda, a proporção dos polimorfismos nos grupos HS e não-HS, e os
respectivos valores de p.
Para CRF02_AG, nós encontramos apenas composições de dois polimorfismos
conferindo HS a IPs. Para APV, os polimorfimos 72I e 89M parecem estar relacionados
com a HS, causando um fenótipo duas vezes mais sensível do que uma composição com
qualquer alteração nestes códons (p = 0,015) (Figura 41A). De forma interessante, a
composição polimórfica 17E 64M parece conferir resistência a NFV e SQV, mesmo
quando apenas uma alteração está presente (Figura 41B e C). A perda da HS acontece
apenas quando a composição muda para 17G 64I, que está presente em 61-68% do
grupo não-HS para ambas as drogas. O polimorfismo 64M ainda parece também
influenciar a HS a IDV quando em conjunto com 70R (Figura 41D). Embora a
proporção de 17E 64M não tenha demonstrado diferença estatística entre os dois
grupos, sua presença conferiu um NR médio de 0,24, contra 0,73 conferido por qualquer
alteração neste genótipo (p = 0,038).
A.
Polimorfismo Grupo HS
(09)
Grupo Não-HS
(18) p
65D 56% (05) 6% (01) 0,008
p < 0,001
104
B.
Polimorfismo Grupo HS
(06)
Grupo Não-HS
(20) p
12T 100% (06) 70% (14) 0,280
15V 100% (06) 50% (10) 0,053
20K 83% (05) 60% (12) 0,379
12T 15V 20K 83% (05) 15% (03) 0,004
C.
Polimorfismo Grupo HS
(05)
Grupo Não-
HS
(20)
p
13I 100% (05) 65% (13) 0,274
15V 100% (05) 75% (15) 0,544
72V/T 80% (04) 20% (04) 0,023
89L 80% (04) 40% (08) 0,160
13I 15V 72V/T 89L 80% (04) ___ <0,001
Figura 40. Mapeamento de polimorfismos ligados a HS em isolados do sub-subtipo F1 a SQV
(A), IDV (B) e ATV (C). À direita, no eixo das ordenadas, o valor médio de NR para cada
composição polimórfica com o desvio padrão; à esquerda, a proporção dos polimorfismos nos
grupos HS e não-HS, com o valor de p em teste exato de Fisher.
A.
Polimorfismo Grupo HS
(14)
Grupo Não-HS
(26) p
72I 100% (14) 73% (19) 0,035
89M 100% (14) 81% (21) 0.142
72I 89M 100% (14) 62% (16) 0,007
p = 0,006
p < 0,001
p = 0,015
105
B.
Polimorfismo Grupo HS
(13)
Grupo Não-HS
(25) p
17E 46% (06) 16% (04) 0,050
64M 69% (09) 20% (05) 0,004
17G 64I 31% (04) 68% (17) 0,042
C.
Polimorfismo Grupo HS
(09)
Grupo Não-HS
(28) p
17E 56% (05) 18% (05) 0,041
64M 67% (06) 25% (07) 0,032
17G 64I ___ 61% (17) <0,001
D.
Polimorfismo Grupo HS
(14)
Grupo Não-HS
(12) p
64M 43% (06) 17% (02) 0.216
70R 71% (10) 50% (06) 0.421
64M 70R 50% (06) 8% (01) 0.081
Figura 41. Mapeamento de polimorfismos ligados a HS em isolados do CRF02_AG a APV (A),
NFV (B), SQV (C) e IDV (D). À direita, no eixo das ordenadas, o valor médio de NR para cada
composição polimórfica com o desvio padrão; à esquerda, a proporção dos polimorfismos nos
grupos HS e não-HS, com o valor de p em teste exato de Fisher.
p = 0,005
p = 0,006
p = 0,038
106
4.7. Fenotipagem dos clones infectivos de CRF02_AG
Apesar do mapeamento ter demonstrado o papel de polimorfismos naturais em
três subtipos não-B, uma vez que foi feito com isolados virais oriundos de pacientes,
outros polimorfismos podem estar atuando e interferindo nos resultados apresentados.
Desta maneira, nós medimos o papel de alguns polimorfismos descritos acima para
CRF02_AG em oito clones infectivos desta forma recombinante gerados por
mutagênese sítio-dirigida neste trabalho, onde foram inseridas cinco diferentes
mutações isoladamente ou em combinações duplas (Tabela 10). O NL4-3 (subtipo B)
foi utilizado como controle externo de fenotipagem. O padrão para o cálculo do NR foi
o BD6-15, assim como para o teste estatístico T de Student bi-caudal.
Tabela 11. Clones gerados por mutagênese sítio-dirigida e as drogas testadas por clone.
Clone CRF02_AG Drogas testadas
BD6-15 APV ATV NFV SQV IDV LPV
17E APV ATV NFV SQV
64M APV ATV NFV SQV IDV LPV
17E/64M APV ATV NFV SQV IDV
70R APV IDV LPV
64M/70R IDV LPV
72V APV ATV NFV SQV IDV LPV
16E ATV IDV
16E/64M ATV IDV
Para APV, a alteração do polimorfismo 72I para 72V não alterou o nível de
resistência a esta droga (Figura 42). De forma interessante, o polimorfismo K70R
sozinho foi capaz de conferir HS a esta droga. Já os polimorfismos 17E e 64M,
separadamente ou em conjunto, aumentaram ligeiramente a susceptibilidade viral a
107
APV. Para ATV, o único polimorfismo que aumentou a sensibilidade viral foi 17E (p <
0,05 em ambas as composições) (Figura 43). Para NFV, os polimorfismos 17E e 64M
conferiram uma susceptibilidade ligeiramente mais alta, entretanto juntas num mesmo
genótipo elas conferiram HS (NR = 0,36) (Figura 44). Tal genótipo também foi
responsável por uma maior sensibilidade a SQV (NR = 0,54), embora separadamente os
polimorfismos 17E e 64M não tenham conferido maisor sensibilidade a este IP (Figura
45). Para IDV, o polimorfismo K70R também conferiu HS (NR = 0,34), enquanto os
demais não alteraram a sensibilidade viral (Figura 46). Para LPV, nenhum dos
polimorfismos analisados conferiu HS, embora 64M e 72V separadamente tenham
aumentado ligeiramente a sensibilidade a esta droga (Figura 47). O vírus NL4-3 foi
ligeiramente mais sensível a APV e LPV do que o BD6-15 (Figuras 42 e 47).
108
Amprenavir (µM)
Média µM (±DP) NR Student (BD6-15)
BD6-15 0,024 (±0,002) 1 ___
17E 0,016 (±0,005) 0,68 0,048
64M 0,016 (±0,002) 0,68 0,005
70R 0,009 (±0,001) 0,41 <0,001
17E/64M 0,015 (±0,001) 0,63 0,003
72V 0,021 (±0,002) 0,89 0,207
NL4-3 0,017 (±0,003) 0,70 0,027
Figura 42. Fenotipagem dos clones oriundos de BD6-15 a APV. Na parte superior, a
concentração média de APV (µM) para inibir 50% dos vírus dos diversos clones. Os asteriscos
denotam diferenças significativas (valores de p ≤ 0,05) em relação ao clone original BD6-15. Na
parte de baixo, a tabela mostra o NR dos diversos clones àquela droga.
* *
*
*
*
109
Atazanavir (µM)
Média µM (±DP) NR Student (BD6-15)
BD6-15 0,0038 (±0,0005) 1 ___
17E 0,0029 (±0,0006) 0,74 0,047
64M 0,0030 (±0,0008) 0,77 0,126
16E 0,0035 (±0,0006) 0,90 0,357
17E/64M 0,0022 (±0,0005) 0,58 0,003
16E/64M 0,0037 (±0,0002) 0,97 0,673
NL4-3 0,0042 (±0,0005) 1,10 0,320
Figura 43. Fenotipagem dos clones oriundos de BD6-15 a ATV. Na parte superior, a
concentração média de ATV (µM) para inibir 50% dos vírus dos diversos clones. Os asteriscos
denotam diferenças significativas (valores de p ≤ 0,05) em relação ao clone original BD6-15. Na
parte de baixo, a tabela mostra o NR dos diversos clones àquela droga.
*
*
110
Nelfinavir (µM)
Média µM (±DP) NR Student (BD6-15)
BD6-15 0,023 (±0,003) 1 ___
17E 0,016 (±0,002) 0,72 0,017
64M 0,016 (±0,002) 0,72 0,017
17E/64M 0,008 (±0,001) 0,36 <0,001
72V 0,025 (±0,005) 1 0,999
NL4-3 0,023 (±0,018) 1,04 0,937
Figura 44. Fenotipagem dos clones oriundos de BD6-15 a NFV. Na parte superior, a
concentração média de NFV (µM) para inibir 50% dos vírus dos diversos clones. Os asteriscos
denotam diferenças significativas (valores de p ≤ 0,05) em relação ao clone original BD6-15. Na
parte de baixo, a tabela mostra o NR dos diversos clones àquela droga.
* *
*
111
Saquinavir (µM)
Média µM (±DP) NR Student (BD6-15)
BD6-15 0,0032 (±0,0002) 1 ___
17E 0,0032 (±0,0002) 1 0,999
64M 0,0032 (±0,0002) 0,96 0,537
17E/64M 0,0018 (±0,0003) 0,54 <0,001
72V 0,0026 (±0,0003) 0,81 0,017
NL4-3 0,0038 (0,0009) 1,15 0,381
Figura 45. Fenotipagem dos clones oriundos de BD6-15 a SQV. Na parte superior, a
concentração média de SQV (µM) para inibir 50% dos vírus dos diversos clones. Os asteriscos
denotam diferenças significativas (valores de p ≤ 0,05) em relação ao clone original BD6-15. Na
parte de baixo, a tabela mostra o NR dos diversos clones àquela droga.
*
*
112
Indinavir (µM)
Média µM (±DP) NR Student (BD6-15)
BD6-15 0,020 (±0,005) 1 ___
16E 0,018 (±0,003) 0,88 0,495
64M 0,016 (±0,002) 0,81 0,326
70R 0,007 (±0,001) 0,34 0,039
72V 0,015 (±0,004) 0,75 0,232
16E 64M 0,019 (±0,002) 0,94 0,719
64M 70R 0,020 (±0,002) 1 0,999
NL4-3 0,013 (±0,003) 0,67 0,133
Figura 46. Fenotipagem dos clones oriundos de BD6-15 a IDV. Na parte superior, a
concentração média de IDV (µM) para inibir 50% dos vírus dos diversos clones. Os asteriscos
denotam diferenças significativas (valores de p ≤ 0,05) em relação ao clone original BD6-15. Na
parte de baixo, a tabela mostra o NR dos diversos clones àquela droga.
*
113
Lopinavir (µM)
Média µM (±DP) NR Student (BD6-15)
BD6-15 0,0046 (±0,0006) 1 ___
64M 0,0035 (±0,0004) 0,74 0,029
70R 0,0048 (±0,0012) 1 0,861
64M 70R 0,0050 (±0,0007) 1,05 0,459
72V 0,0035 (±0,0004) 0,74 0,029
NL4-3 0,0034 (±0,0008) 0,71 0,044
Figura 47. Fenotipagem dos clones oriundos de BD6-15 a LPV. Na parte superior, a
concentração média de LPV (µM) para inibir 50% dos vírus dos diversos clones. Os asteriscos
denotam diferenças significativas (valores de p ≤ 0,05) em relação ao clone original BD6-15. Na
parte de baixo, a tabela mostra o NR dos diversos clones àquela droga.
* * *
114
4.8. Capacidade replicativa viral conferida pelos polimorfismos naturais na PR
Para saber o impacto na capacidade replicativa dos polimorfismos que causam
HS foram feitas competições par-a-par e a proporção de cada competidor após cinco
dias de infecção foi medida (Tabela 11). O vírus com a melhor capacidade replicativa
foi aquele que continha os polimorfismos 17E/64M. Já o vírus original BD6-15
apresentou melhor capacidade replicativa contra o vírus com o polimorfismo 72V.
Desta maneira a ordem de melhor capacidade replicativa foi: 17E/64M > 17E > 64M >
BD6-15 > 72V.
Tabela 12. Proporção de vírus após competição par-a-par.
Competição Melhor capacidade
replicativa
17E x BD6-15 17E (84%)
64M x BD6-15 64M (92%)
17E x 64M 17E (83%)
17E/64M x BD6-15 17E/64M (79%)
17E/64M x 17E 17E/64M (87%)
17E/64M x 64M 17E/64M (72%)
72V x BD6-15 BD6-15 (83%)
4.9. Papel diferencial da MRD a IP L90M em subtipos B e G
Para saber se uma mesma MRD poderia causar níveis diferentes de resistência
em subtipos distintos, nós analisamos a fenotipagem de isolados virais de subtipos B e
G contendo a mutação L90M na protease. Os resultados estão resumidos na Tabela 12
abaixo. Somente a MRD L90M em isolados do subtipo G confeiru um ligeiro aumento
na resistência a NFV (NR médio = 2,1), ao contrário dos isolados de subtipo B, que na
presença desta mutação apresentaram um NR médio de 7,6 (p < 0,001) (Tabela 12 e
115
Figura 48A). Isolados de subtipo G com o genótipo M89I/L90M demonstraram um NR
médio de 10,9, equiparado aos do subtipo B com L90M (p = 0,466). Isolados de subtipo
G com M89I não apresentaram sensibilidade alterada a NFV. Isolados do subtipo G
carreando somente M89I, somente L90M ou M89I/L90M permaneceram susceptíveis a
SQV, com NRs médios de 0,5, 1,2 e 1,4, respectivamente (Figura 48B). Isolados do
subtipo B com L90M apresentaram um NR médio de 2,7 (p = 0,002). O mesmo efeito
foi visto para IDV, onde esta mutação causou um NR médio de 3,5 (p = 0,019). Para
LPV, a presença da L90M sozinha conferiu uma leve resistência em isolados do subtipo
B, o que só foi visto na combinação L89I/L90M em isolados do subtipo G (p = 0,894).
A mutação L90M em isolados do subtipo G não conferiu resistência a LPV.
O padrão I54V/L-L90M conferiu resistência cruzada a todos os IPs analisados
em subtipo B, especialmente para NFV, com um NR médio de 41 (Tabela 12 e Figura
48C). Um efeito similar foi observado em isolados do subtipo G portando o padrão
I54V/L-L89I-L90M, com exceção de IDV e SQV, drogas às quais os isolados
permaneceram susceptíveis. A mutação L89I não foi encontrada em isolados do subtipo
B. A mutação I54V/L não foi encontrada sozinha em isolados do subtipo G, mas sempre
em conjunto com L90M.
116
Tabela 13. Nível de resistência médio conferida pela L90M em diferentes vias
mutacionais para os subtipos B e G.
Via mutacional
L90M
Amprenavir (1,8)a Indinavir (2,1) Lopinavir (1,6)
Sub B Sub G pe Sub B Sub G p Sub B Sub G p
L90M (22/07)b
1,3
(0,8)d
1,4
(0,8) 0,934
3,5
(3,3)
1,4
(1,3) 0,019
1,8
(1,4)
1,1
(0,3) 0,043
M89I L90M (00/06) ___ 2,0
(1,4) 0,324 ___
1,1
(0,7) 0,003 ___
1,9
(0,9) 0,894
I54V/L M89I
L90Mc (05/05)
2,4f
(0,6)
3,5
(1,1) 0,158
8,6
(8,8)
1,8
(1,3) 0,156
5,8
(3,1)
4,9
(2,9) 0,902
Via mutacional
L90M
Nelfinavir (2,3) Saquinavir (1,7)
Sub B Sub G p Sub B Sub G p
L90M (22/07) 7,6 (6,3) 2,1 (0,9) 0,001 2,7 (1,7) 1,2 (0,6) 0,002
M89I L90M (00/06) ___ 10,9 (9,8) 0,466 ___ 1,4 (0,4) 0,005
I54V/L M89I L90Mc (05/05) 41 (18) 26 (18) 0,268 6,0 (0,9) 1,6 (0,9) 0,001
a Valor de cut-off biológico para cada droga como definido pela VIRCO (Verlinden et
al., 2005).
b Números em parênteses correspondem ao número de isolados de subtipo B/ subtipo G
em cada categoria de genótipo.
c Subtipo B não apresenta M89I.
d Desvio-padrão
e Teste T de Student bi-caudal. Valores em negrito representam p ≤ 0,05.
f Números em negrito representam NR acima do cut-off biológico.
117
Figura 48. Nível de resistência de isolados de subtipos B e G com padrões distintos de MRD a
NFV (A), SQV (B) e todos os IPs testados neste trabalho (C). Os padrões de genótipo são
mostrados no eixo x e os números de isolados analisado de cada subtipo são mostrados entre
parênteses. O eixo y corresponde ao NR.
Saquinavir (2,1)
118
5. Discussão
Apesar dos subtipos não-B do grupo M do HIV-1 serem responsáveis por cerca
de 90% das novas infecções mundiais (Hemelaar et al., 2004), são ainda poucos os
trabalhos na literatura científica que abordam a resistência aos antirretrovirais nestes
isolados ao longo do tratamento. Anteriormente, nosso grupo demonstrou que no Brasil
pacientes infectados pelo subtipo C em falha terapêutica continham uma menor
proporção de MRDs a IPs e INTRs do que aqueles infectados pelo subtipo B em
regimes HAART com ou sem tratamento prévio com mono e dupla terapia (Soares et
al., 2007). No presente trabalho, nós demonstramos o acúmulo diferencial de
determinadas MRD em diferentes subtipos do HIV-1 ao longo do tratamento
antirretroviral em isolados virais provenientes de três diferentes localidades mundiais.
Para IPs, o estudo se baseiou quase que exclusivamente em MRD selecionadas
em tratamento com NFV e IDV, as duas drogas mais utilizadas no passado. Os demais
IPs foram mais utilizados em resgate terapêutico ou estavam mais disponíveis em países
desenvolvidos, onde predomina o subtipo B, e portanto não puderam ser analisados
aqui. A presença da MRD D30N, selecionada exclusivamente por NFV, é menor em
subtipos não-B (Ariyoshi et al., 2003; Grossman et al., 2004; Kantor et al., 2005). Aqui,
nós demonstramos o menor acúmulo desta mutação temporalmente em pacientes
infectados pelos subtipos A, C, F1 (somente com amostras brasileiras), G e CRF01_AE
(Figuras 27E, 28 e 30B). De forma interessante, nós demonstramos aqui pela primeira
vez o acúmulo da L90M em tratamento com NFV maior apenas em isolados virais do
subtipo G, em amostras provenientes tanto de Portugal (Figura 28) quanto do mundo
inteiro (Figura 30C).
119
Para IDV, nós encontramos uma maior proporção de M46I/L em isolados de
sub-subtipo F1 do que em isolados de subtipo B sob tratamento com IDV e/ou
IDV/RTV (Figura 26A). Entretanto, no dataset global nós encontramos uma proporção
menor destas mutações no grupo composto pelos subtipos A/C/F1 do que no grupo
composto pelos subtipos B/G (Figura 31B). Essa discrepância em isolados de sub-
subtipo F1 talvez possa ser explicada pela nossa opção de analizar um universo de
pacientes uso de IDV sozinho e IDV/RTV no Brasil, enquanto que no dataset global
foram analizadas apenas isolados virais com uso exclusivo de IDV como único IP,
elinminando das análises os pacientes que fizeram uso de IDV/RTV. Outra discrepância
encontrada para esta droga foi o menor acúmulo da MRD V82A/F/T/S em pacientes
portugueses infectados pelo subtipo G em relação ao subtipo B (Figura 29B), fato não
observado nos isolados oriundos de diversas partes do globo quando diversos subtipos
foram analisados (Figura 31C). Essa diferença poderia ser explicada pela uso de mono
e/ou dupla terapia dos isolados globais, uma vez que no dataset português nós
excluímos da análise todo isolado viral cujo paciente fez uso prévio de mono e/ou dupla
terapia. Desta maneira, alguns isolados virais de subtipo G poderiam estar portando
mutações de resistência às outras classes de drogas e adquirindo mais facilmente a
mutação V82A/F/T/S em função de um menor número de drogas ativas no esquema
terapêutico. O ideal seria a comparação de isolados virais apenas em regime de
HAART. Entretanto, mesmo com o uso prévio de mono e/ou dupla terapia, o que
poderia indicar a presença de MRDs a INTRs e facilitar o surgimento de MRDs a IPs,
mutações como D30N e M46I/L foram menos frequentes em um ou mais subtipos não-
B (Figuras 30B e 31B). Em adição, a menor proporção de M46I/L em subtipo C está de
acordo com trabalho prévio de análise de resistência global em subtipos B e não-B do
HIV-1 (Kantor et al., 2005).
120
Alguns fatores genéticos podem explicar a acúmulo diferencial ao longo do
tempo de tratamento em isolados virais de subtipos distintos. A presença de
polimorfismos silenciosos característicos de determinados subtipos poderia exigir um
maior número de modificações no código genético para a aquisição de uma determinada
MRD. O único códon na protease com acúmulo diferencial entre subtipos é o 82. Nos
subtipos B, C e F, a variante preferencial é a 82A, enquanto o subtipo G tem maior
propensão ao acúmulo de 82T. Entretanto, a barreira genética não explica o acúmulo
diferencial de MRD aos IPs nos subtipos do HIV-1 grupo M (Dumans et al., 2004; van
de Vijver et al., 2006). Outro fator diferencial é a alteração do fitness replicativo
causado pela presença de MRDs majoritárias. A aquisição de resistência geralmente
implica em modificações estruturais dentro ou próximo do sítio ativo enzimático,
permitindo à proteína viral uma melhor discriminação do seu substrato natural em um
ambiente restritivo imposto pelos terápicos. O custo desta vantagem seletiva é
geralmente pago através da perda parcial da capacidade replicativa. Desta maneira, a
frequência das MRDs pode ser inversamente correlacionada ao seu custo ao fitness
viral, isto é, quanto mais alta a frequência observada, menor o custo replicativo.
Gonzalez et al. (2004) demonstraram o custo diferencial da mutação D30N em clones
infectivos de subtipos B e C, onde a presença desta mutação acarretou a perda total da
capacidade replicativa no último subtipo, somente viabilizado pelo acúmulo de
mutações acessórias. Isto pode explicar a menor frequência desta mutação nos isolados
do subtipo C (14%) do que nos isolados do subtipo B (29%) em 54 meses de tratamento
por nós observada (Figura 30B). Apesar de ainda não haver trabalhos na literatura
relatando o custo replicativo desta MRD em outros subtipos do HIV-1, podemos supor
que a presença desta mutação também acarreta em perdas significativas na capacidade
replicativa da protease nos demais subtipos. Trabalhos em modelagem molecular
121
demonstraram que alguns polimorfismos naturais (K20R, E35D e I93L), assim como as
assinaturas genéticas (M36I, R41K, H69K e L89M) de isolados de CRF01_AE
modificam a estrutura da protease de modo a desfavorecer o aparecimento da MRD
D30N (Ode et al., 2007A; Ode et al., 2007B).
Nós também analisamos neste trabalho o aparecimento das MRDs TAM-1,
TAM-2 e M184V em isolados de diferentes subtipos do HIV-1 de pacientes fazendo uso
de esquema HAART de primeira linhacomposto por AZT/d4T+3TC e INNTR ou IP, e
encontramos alguns resultados interessantes. A composição de um análogo de timina
(AZT ou d4T) em conjunto com 3TC é recomendada (Johnson et al., 2009). Embora
ocorra rápida seleção da MRD M184V, que confere grande perda de sensibilidade a
3TC,, sua presença é vantajosa por aumentar a sensibilidade viral ao AZT e ao d4T, e
prevenir o aparecimento das vias mutacionais de TAM na TR de isolados virais em
pacientes sob este esquema terapêtico (Larder et al., 1995; Mouroux et al., 2001; Ait-
Khaled et al., 2002; Boyer et al., 2002). Observamos algumas diferenças entre os
subtipos do HIV-1 no acúmulo desta MRD de acordo com o uso de INNTR ou IP como
componente não-INTR do esquema. Com o uso de INNTRs, houve um maior acúmulo
de M184V nos isolados de subtipos C e G do que nos isolados de subtipo B após cinco
anos de tramento (Figura 34A). Entretanto, com o uso de IPs, houve uma maior
proporção desta MRD nos isolados de subtipo B e G do que nos isolados de subtipo C
após seis anos de tratamento (Figura 34B). O aparecimento das TAMs pode ser
diferente entre os subtipos do HIV-1. No subtipo B, estima-se uma ocorrência duas
vezes maior de TAM-1 do que TAM-2 (Yahi et al., 1999; Marcelin et al., 2004). Sabe-
se que os subtipos C e F têm maior propensão a adquirir mutações relacionadas à via
TAM-2 do que o subtipo B (Soares et al., 2007; Munerato et al., 2010). As mutações
M41L e T215Y, ambas relacionadas à via TAM-1, foram mais comumente observada
122
em isolados de subtipo B do que em isolados de CRF01_AE (Sukasem et al., 2008). No
Brasil, um outro trabalho do nosso grupo mostrou uma maior associação das MRDs
M41L e L210W a isolados virais de subtipo B do que a isolados dos subtipos C e F
(Soares et al., 2003). Entretanto, no presente trabalho não houve diferença no acúmulo
de TAM-1 e TAM-2 entre os subtipos B e G após cinco anos de tratamento com
AZT/d4T+3TC+INNTR, ou diferença após seis anos de tratamento com
AZT/d4T+3TC+IP para os três subtipos (Figura 35). Em compensação, na composição
AZT/d4T+3TC+INNTR, o subtipo C acumulou 4,5x mais mutações de TAM-2 do que
TAM-1 (Figura 35A). Uma observação interessante foi que a composição
AZT/d4T+3TC+IP foi altamente eficaz na prevenção de acúmulo de TAMs em
pacientes infectados pelo subtipo C, que apresentaram apenas 9% dos isolados virais
com pelo menos uma mutação TAM em seis anos de tratamento. Essa proporção foi
significativamente menor do que aquelas de isolados virais dos subtipos B e G (27 e
29%, respectivamente), usando a mesma composição terapêutica por igual período de
tempo. Tal proporção também foi menor do que a apresentada por isolados virais de
subtipo C utilizando a composição AZT/d4T+3TC+INNTR (23%) após cinco anos de
tratamento. A diferença entre as composições foi o acúmulo de TAM-2 neste subtipo
4,6x maior na composição com INNTR. Uma explicação possível para o
direcionamento para TAM-2 é o maior acúmulo de MRDs a INNTRs em isolados do
subtipo C, em concordância com outros trabalhos (Grossman et al., 2004B; Eshleman et
al., 2005A; Eshleman et al., 2005B; Flys et al., 2006). Suspeita-se que MRDs a INTRs
possam aumentar a sensibilidade a INNTRs (Whitcomb et al., 2002). Neste último
estudo, foi observada uma maior hipersensibilidade àquela classe em pacientes com
tratamento contendo INTRs (virgens a INNTRs) e em falha terapêutica. Posteriormente,
Clark et al. (2006) demonstraram que a presença da TAM-1 T215Y em conjunto com
123
H208Y e/ou V118I causam HS à toda a classe de INNTRs, o que poderia explicar a
menor aquisição de TAM-1 no subtipo C. Outra explicação plausível para o maior
acúmulo de TAM-2 seria um aumento na capacidade replicativa de clones infectivos de
subtipo C conferido por D67N ou K70R individualmente, o que não foi visto para o
subtipo B (Armstrong et al., 2009). Neste mesmo trabalho, foi demonstrado que o triplo
mutante TAM-2 (D67N, K70R e T215F) impactou mais negativamente na capacidade
replicativa do clone infectivo de subtipo B do que o triplo mutante TAM-1 (M41L,
L210W e T215Y). Em adição, para os subtipos B e G, não houve diferença na aquisição
de TAMs ao longo do tempo, independente da composição terapêutica utilizada.
Novas mutações ligadas ao tratamento têm sido descritas nos domínios terminais
de TR, conexão e Rnase H (Nikolenko et al., 2007; Delviks-Frankenberry et al., 2007;
Brehm et al., 2007; Yap et al., 2007; Hachiya et al., 2008; Santos et al., 2008; Waters et
al., 2009). As mutações N348I e T369I/V, recentemente descritas, têm um efeito de
resistência classe cruzada conferindo resistência a AZT, NVP, EFV e DLV (Yap et al.,
2007; Hachiya et al., 2008; Gupta et al., 2010). Interessantemente Radzio et al. (2010)
demosntrou que a presença da N348I, selecionada no início da terapia antirretroviral
com INNTR, contrabalança os efeitos de HS conferido por M184V e permitindo a
seleção harmoniosa de M184V e TAMs, o que permitiria um maior acúmulo de TAMs
em pacientes fazendo uso de HAART contendo INNTR.
Aparentemente, a composição de HAART utilizada para tratamento de pacientes
infectados pelo subtipo C influencia o aparecimento de padrões diferenciais de TAMs.
Um trabalho publicado em 2007 demonstrou que pacientes infectados pelo subtipo C
em HAART com AZT+ddI apresentavam como o padrão mais comum de vírus TAMs
mistas contendo D67N, K70R e T215Y (Novitsky et al., 2007). Armstrong et al. (2009)
demonstraram que essa composição mista de TAMs apresenta uma maior capacidade
124
replicativa do que o triplo mutante TAM-2 (D67N, K70R e T215F) em clone infectivo
de subtipo C, o que poderia explicar sua alta frequência. Infelizmente, esta composição
mista de TAMs foi raramente vista em nosso trabalho, onde apenas 3 isolados virais
deste subtipo de um total 249 (1,2%) pacientes sob HAART contendo AZT/d4T+3TC a
apresentaram.
Existem outros exemplos de mutações selecionadas preferencialmente por
alguns subtipos do HIV-1, como a facilidade do subtipo C em adquirir V106M, que
confere resistência cruzada a INNTRs (Brenner et al., 2003; Grossman et al., 2004B;
Kantor et al., 2005; Orrell et al., 2009). Esta mutação é raramente observada em
subtipos não-C, uma vez que estes requerem duas transições no códon 106 para
codificar uma metionina, enquanto o subtipo C presisa de apenas uma única transição
(Brenner et al., 2003; van de Vijver et al., 2006). Outro exemplo de mutação facilmente
adquirida por barreira genética exclusivamente para subtipo C é a K65R na TR. Tal
mutação é selecionada mais facilmente tanto in vitro (Brenner et al., 2006; Coutsinos et
al., 2009) quanto em estudos clínicos (Doualla-Bell et al., 2006; Pillay et al., 2008;
Turner et al., 2009), e confere resistência cruzada a 3TC, ABC, ddI, FTC e TDF
(Johnson et al., 2009). Neste caso, a barreira genética atua em conjunto nos códons 64 e
65. No subtipo B esses códons são representados por AGG AAA, enquanto no subtipo
C a sequência é AAA AAG. Esse sítio é rico em adeninas exclusivamente no subtipo C
e causa uma pausa na TR durante a síntese da fita positiva de DNA, favorecendo a
incorporação errônea de nucleotídeos e aumentando a chance de ocorrência de K65R
(Coutsinos et al., 2009).
Em anos recentes, poucos estudos têm sido feitos com relação à susceptibilidade
a drogas em isolados virais de subtipos do HIV-1 oriundos de pacientes virgens de
tratamento. Tais estudos demonstraram que as drogas utilizadas na HAART clássica são
125
altamente eficientes no tratamento de pacientes infectados por subtipos não-B (Palmer
et al., 2001; Grossman et al., 2004; Holguín et al., 2004; Abecasis et al., 2006; Agwale
et al., 2006; Vergne et al., 2006). Estudos recentes têm demonstrado que determinados
subtipos não-B, notadamente os subtipos C, F, G e CRF02_AG, apresentam
sensibilidades diferenciadas a IPs específicos. De modo interessante, isolados virais de
subtipos C e G oriundos de pacientes virgens de tratamento apresentaram uma maior
susceptibilidade a IDV do que isolados de subtipo B, enquanto isolados virais de
CRF02_AG foram mais sensíveis a IDV e RTV do que isolados virais de subtipos B, C,
F e G (Abecasis et al., 2006). Como todas as drogas foram desenhadas para o subtipo B,
parece paradoxal que alguns subtipos sejam mais sensíveis do que o alvo original. Para
melhor elucidar esta questão, nós resolvemos analisar dados de fenotipagem de isolados
virais de pacientes virgens de tratamento infectados por diferentes subtipos do HIV-1
obtidos de trabalhos recentes (Vergne et al., 2000; Dumans et al., 2002; Vergne et al.,
2003; Abecasis et al., 2006; Vergne et al., 2006; Vidal et al., 2006). De fato, alguns
subtipos apresentavam uma maior proporção de isolados com HS, em relação ao subtipo
B, a drogas das três classes analisadas: IPs, INTRs e INNTRs.
É usual encontrar na literatura mutações de resistência a determinadas terápicos
que conferem HS a outros. Um exemplo, já citado acima, é a MRD a 3TC M184V, que
causa HS a análogos de timina; outro é a participação da T215Y na HS à classe de
INNTRs. Outros exemplos ainda são mostrados na Tabela 13. Entretanto, o
mapeamento de polimorfismos naturais ligados a HS em isolados virais selvagens é
escasso e ninguém testou o real efeito dos polimorfismos mapeados em clones virais
infectivos. Leigh Brown et al. (2004) determinou que os polimorfismos 10V, 13V,
37E/S/Y e 61E estavam correlacionados com HS a IPs em isolados de subtipo B.
Entretanto, tais polimorfismos não previram HS em outro estudo posterior com isolados
126
do mesmo subtipo (Martinez-Picado et al., 2005). Os autores apontaram os
polimorfismos R41K e I93L como possíveis responsáveis pela HS conferida à maioria
dos IPs, enquanto as mutações L10V, T12P/S, I13V, L19P/I e I64L/V foram
negativamente associados a este fenômeno. Já Abecasis et al. (2006) mapearam os
seguintes polimorfismos em subtipos não-B para HS: 35E (APV, NFV e RTV), 37N
(IDV), 57R (TPV), 70R (NFV e RTV) e 89I (LPV). No nosso trabalho, nós separamos
os isolados por subtipo e assim identificamos polimorfismos subtipo-específicos
conferindo HS a uma mesma droga. Nossos resultados concordam parcialmente com o
trabalho de Abecasis et al. (2006). O polimorfismo 35E foi responsável por HS a APV e
NFV apenas em isolados do subtipo C, enquanto 70R foi relacionado a HS a IDV em
isolados de CRF02_AG. Nós ainda encontramos nos três subtipos analisados neste
trabalho (C, F1 e CRF02_AG) composições polimórficas distintas e exclusivas
responsáveis pela HS. Para NFV, por exemplo, nós mapeamos os polimorfismos 19L
35E 63L como responsáveis por HS no subtipo C (Figura 39A), enquanto em isolados
de CRF02_AG os polimorfismos 17E 64M foram os correlacionados à HS àquela droga
(Figura 41B). Gonzalez et al. (2003) descreveram que a assinatura genética I93L em
isolados brasileiros e sul-africanos de subtipo C conferia uma maior sensibilidade viral a
LPV. Entretanto, no nosso trabalho, todos os isolados de subtipo C portavam a
assinatura I93L em seu genoma, mas a proporção de HS a LPV foi baixa (9%), e não
diferente da encontrada para isolados de subtipo B (Figura 37). Uma possível
explicação para esta diferença seria o uso de metodologias distintas de fenotipagem
entre os trabalhos.
127
Tabela 14. Sumário de MRDs relacionadas a HS.
Mutação Região Resistência HS Referências
I47A PR LPV SQV Kagan et al. (2005)
I50L PR ATV demais IPs Weinheimer et al. (2005)
I54L PR DRV TPV Poveda et al. (2010)
N88S PR ATV, NFV APV Ziermann et al. (2000)
∆69 TR 3TC AZT Kisic et al. (2008)
I132M TR NVP 3TC, TDF Ambrose et al. (2009)
Uma crítica pertinente aos trabalhos de mapeamento de HS é o papel indefinido
de cada polimorfismo no fenômeno. Nosso mapeamento mostrou muitas vezes que um
conjunto de polimorfismos, e não um único, confere HS a determinados IPs. Em outros
casos, não conseguimos identificar os fatores genéticos por trás do fenômeno, o que
poderia indicar um complexo conjunto de polimorfismos ou mesmo artefatos resultantes
do ensaio de fenotipagem. Para melhor entender o papel dos polimorfismos no
fenômeno da HS, nós inserimos alguns polimorfismos determinados para CRF02_AG
em um clone infectivo viral “puro” desta forma recombinante. Acreditamos que o uso
deste sistema anula qualquer crítica em relação ao uso de genomas recombinantes
(intersubtípicos) quanto à produção de resulatdos artificiais devido aos sítios diferentes
de clivagem da PR e outras interações de proteínas de subtipos diferentes. Desta
maneira, os polimorfismos 17E e 64M mapeados para SQV e NFV de fato mostraram
um papel importante no fenômeno de HS (Figuras 44 e 45), enquanto 70R conferiu HS
a APV e IDV (Figuras 42 e 46), embora tenha sido mapeada somente para IDV. Já a
mutação 72V não alterou a sensibilidade viral a APV. A frequência desses
polimorfismos em 950 isolados de CRF02_AG virgens de tratamento oriundas do HIV
Sequence Database de Los Alamos (www.hiv.lanl.gov) foi de 5,4% (51) com somente
128
17E, 7,7% (73) somente com 64M e 2,1% (20) portando 17E/64M, enquanto 70R estava
presente em 13% (117) dos isolados desta forma recombinante oriunda de pacientes
virgens de tratamento. De modo interessante, o vírus portando 17G/64M em seu
genoma apresentou uma capacidade replicativa in vitro melhor do que os vírus com 17E
ou com 64M individualmente, e estes últimos apresentaram uma capacidade replicativa
melhor do que o vírus BD6-15 original. Isso pode indicar que protease viral de
CRF02_AG com os polimorfismos 17E e 64M em conjunto ou individualmente
melhora a processividade da enzima, interagindo mais facilmente com seu substrato
natural e, consequentemente, também com alguns de seus inibidores miméticos. Nosso
trabalho está em contraste com trabalhos em isolados virais oriundos de pacientes
virgens de tratamento, que correlacionaram HS a múltiplos IPs à baixa capacidade
replicativa (Leigh Brown et al., 2004; Martinez-Picado et al., 2005). Entretanto, no
trabalho de Martinez-Picado et al., os pacientes escolhidos apresentavam alto nível de
contagem de células T CD4+ antes do tratamento e, de fato, 4 dos 12 pacientes
analisados eram heterozigotos para CCR5∆32, indicando uma patogenia viral mais
atenuada e, portanto, mais responsiva ao tratamento. Neste caso, uma baixa capacidade
replicativa conferida pela protease poderia indicar um vírus mais sensível aos IPs.
O impacto clínico da hipersusceptibilidade vêm sendo discutido ao longo dos
últimos anos. Pacientes com isolados virais de subtipo B experimentados a INTR, mas
virgens a INNTRs e com HS a EFV tiveram uma melhor resposta virológica no resgate
terapêutico que incluía esta droga (Shulman et al., 2001). Este resultado foi corroborado
por outros trabalhos de ensaio de resgate terapêutico (Hammer et al., 2002; Haubrich et
al., 2002; Tozzi et al., 2004; Demeter et al., 2008). Entretanto, o benefício clínico da
HS a IP ainda está a ser determinado. A mutação N88S, que confere HS a APV (Tabela
13), foi correlacionada a uma melhor resposta ao resgate terapêutico in vivo (Zachary et
129
al., 2001), além do fato de que a presença da N88S anulou o efeito de resistência
conferido por I50V àquele IP (Lam & Parkin, 2003). Não sabemos se os polimorfismos
aqui descritos podem anular ou atenuar o efeito de MRDs. Entretanto, nosso trabalho
aponta nessa direção, uma vez que 44% (08/18) dos vírus de pacientes experimentados a
NFV sem MRD possuem 17E e/ou 64M, enquanto apenas 8% (01/12; p = 0,049)
daqueles que possuem MRD a NFV apresentavam algum desses polimorfimos. Desta
maneira, polimorfismos naturais presentes em CRF02_AG conferem HS a determinados
IPs e podem retardar a acúmulo de MRDs.
O efeito fenotípico de MRDs em diferentes subtipos também deve ser
considerada nesta discussão. A classificação das MRDs em majoritárias ou
compensatórias é um conceito exclusivamente baseado em dados gerados por subtipo B.
Em função dos polimorfismos subtipo-específicos que alteram a estrutura das proteínas
virais, uma mesma MRD poderia conferir níveis diferentes de resistência a uma
determinada droga. Aqui, nós demonstramos que a MRD L90M per se confere apenas
duas vezes mais resistência a NFV em isolados de subtipo G em relação ao seu tipo
selvagem, enquanto a mesma MRD confere sete vezes mais resistência em subtipo B
(Tabela 12 e Figura 48A). Entretanto, isolados do subtipo G portando L89I/L90M
apresentam um nível de resistência similar ao da L90M sozinha em isolados do subtipo
B. De modo interessante, isolados de subtipo G com L90M sozinha ou em conjunto com
L89I não mostraram resistência a SQV, ao contrário de isolados do subtipo B, onde a
presença da L90M revelou um aumento de 3,5x na resistência a este terápico (Tabela 12
e Figura 48B). No consenso da IAS, esta MRD é considerada majoritária para NFV e
SQV (Johnson et al., 2009), o que parece ser errôneo para subtipo G. Uma outra
mutação observada é a via de resistência com I54V/L, onde sua presença com L90M
dobrou a resistência a SQV (Tabela 12 e Figura 48C) em isolados do subtipo B,
130
enquanto sua presença per se só não afetou a sensibilidade a esta droga em isolados do
subtipo G. Um outro caso foi descrito pelo nosso grupo com relação a fenótipos
conferidos pela mutação T74S em proteases dos subtipos B e C (Soares et al., 2009).
Esta MRD foi classificada como compensatória, uma vez que melhora a capacidade
replicativa de vírus multirresistentes de ambos os subtipos. Sua presença parece ser
selecionada por NFV, e aumenta a sensibilidade viral a vários IPs, incluindo IDV, SQV,
LPV e RTV. Entretanto, alguns efeitos fenotípicos foram diferentes. A protease do
subtipo B portando as MRDs M46I, I54V, V82A e L90M, e mais a T74S, mostraram
uma ressensibilização a IDV, enquanto que um clone de subtipo C com as mesmas
mutações permaneceu resistente a esta droga. Já a protease multirresistente de subtipo C
mostrou um nível mais elevado de resistência do que o respectivo clone de subtipo B a
NFV (NR = 7,1 e 34, respectivamente) e a LPV (NR = 12,8 e 189, respectivamente). Na
TR viral, Delviks-Frankenberry et al. (2009) demonstraram níveis de resistência
diferenciais conferidas por TAMs aos subtipos B e CRF01_AE. Mutações TAM-1
(M41L, L210W e T215Y) conferiram um nível de resistência mais alto em CRF01_AE
(NR = 51) do que em subtipo B (NR = 17). Resultados similares foram vistos para
TAM-2. A causa da diferença foi mapeada na assinatura genética de CRF01_AE
A400T, no domínio da conexão da TR. Quando esta treonina foi revertida a uma alanina
em CRF01_AE, o nível de resistência ficou similar ao subtipo B. Tal trabalho
representa a primeira evidência experimental de que uma assinatura genética influencia
diretamente nos níveis de resistência a drogas antirretrovirais em subtipos distintos.
Esses achados são importantes para aperfeiçoar o tratamento oferecido a
pacientes infectados por subtipos não-B, que representam cerca de 90% da população
mundial convivendo com HIV/Aids. O uso de medicamentos antirretrovirais,
originalmente desenvolvidos para subtipo B, é eficaz na inibição da replicação viral de
131
outros subtipos. Entretanto, estudos adcionais na área de variação genética em
diferentes subtipos do HIV-1 e na influência dos terápicos a longo prazo ainda se fazem
necessários para traçar o papel de polimorfismos e assinaturas genéticas na dinâmica de
aquisição de MRDs. Uma atenção especial deve ser dada a possíveis efeitos fenotípicos
diferentes entre subtipos, a fim de aperfeiçoar os testes de genotipagem tão necessários
ao melhor direcionamento de resgate terapêutico em pacientes sob falha terapêutica.
Finalmente, o melhor entendimento do impacto clínico de HS causada por
polimorfismos naturais em subtipos do HIV-1 poderia melhorar as diretrizes de
tratamento tanto na primeira linha terapêutica quanto em resgates para pacientes
convivendo com HIV/Aids.
132
6. Conclusões
A aquisição temporal de determinadas MRDs apresentou diferenças em vírus de
diferentes subtipos do HIV-1 oriundos de pacientes sob HAART de diferentes
localidades, tais como a menor proporção de D30N em subtipos não-B, o maior
acúmulo de L90M em subtipo G sob tratamento com NFV e o menor acúmulo
de M46I/L nos subtipos A, C e F sob tratamento com IDV. Já a composição
AZT/d4T+3TC+IP parece retardar o aparecimento de TAMs em subtipo C
comparado aos subtipos B e G;
A proporção de HS a determinados terápicos foi maior em subtipos não-B do
que no subtipo B, arcabouço genético para o qual todas as drogas foram criadas.
APV, IDV, NFV ABC, AZT, d4T, ddI e NVP foram drogas para as quais
observou-se maior proporção de HS em alguns subtipos não-B.
A comparação entre os grupos HS e não-HS para cada droga e cada subtipo
identificou grupos de polimorfismos atuando na HS nos subtipos C, F e
CRF02_AG.
A inserção desses polimorfimos em clone infectivo de CRF02_AG reproduziu o
fenômeno de HS in vitro e acentuou a capacidade replicativa viral. Este é o
primeiro trabalho a determinar o papel de polimorfismos naturais na HS a IPs;
Neste trabalho, também demonstramos que uma MRD pode causar impacto
fenotípico diferente entre subtipos. No caso, a L90M foi capaz de gerar nível
elevado de resistência em isolados do subtipo B, mas somente a presença da
L89I/L90M foi capaz de gerar o mesmo efeito em isolados do subtipo G.
133
Os resultados gerados neste trabalho junto com outros trabalhos recentes
demonstram a importância de se estudar o impacto do tratamento antirretroviral
a longo prazo em subtipos não-B, assim como aprofundar o estudo de HS como
forma de melhorar a eficácia desse tratamento em pacientes convivendo com
HIV/Aids.
134
7. Perspectivas futuras
Comprovar o papel dos polimorfismos mapeados para PR em isolados de
subtipos C e F na HS e no fitness viral, assim como para os polimorfismos
mapeados para TR.
Determinar se os polimorfismos HS anulam ou diminuem o nível de resistência
aos antirretrovirais conferida pelas MRDs majoritárias;
Determinar se os polimorfismos HS retardam o surgimento de MRDs
majoritárias ou interferem nas vias mutacionais selecionadas pelos subtipos;
Avaliar o efeito clínico dos polimorfismos HS na supressão viral e recuperação
de células T CD4+ de indíviduos convivendo com HIV/Aids sob tratamento.
135
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ANEXO I
Artigos publicados referentes à tese
175
ANEXO II
Artigos publicados não-referentes à tese