1

VAJA 1 ALBUMINU NEZNANE KONCENTRACIJE DOLOČITE KONCENTRACIJO: • Izmerite A280 albumina v vzorcu. Vrednost absorbance vzorca naj ne preseže 1! • S pomočjo standardne raztopine (raztopina albumina koncentracije 2mg albumina /ml)

določite koncentracijo albumina • Izračunajte koncentracijo albumina, če veste da je ekst. koef. albumina pri 280 nm

39080 M-1 cm-1 • Izračunajte koncentracijo albumina, če izračunate ekst. koef. (ε) iz a.k. zaporedja s

pomočjo formule: ε (280)(M-1 cm-1) = št Trp x 5500 + štTyr x 1490 + štS-S x 125 1 MKWVTFISLL LLFSSAYSRG VFRRDTHKSE IAHRFKDLGE EQFKGLVLIA 51 FSQYLQQCPF DEHVKLVNEL TEFAKTCVAD ESHAGCEKSL HTLFGDELCK 101 VASLRETYGD MADCCEKQEP ERNECFLSHK DDSPDLPKLK PDPNTLCDEF 151 KADEKKFWGK YLYEIARRHP YFYAPELLYY ANKYNGVFQD CCQAEDKGAC 201 LLPKIETMRE KVLASSARQR LRCASIQKFG ERALKAWSVA RLSQKFPKAE 251 FVEVTKLVTD LTKVHKECCH GDLLECADDR ADLAKYICDN QDTISSKLKE 301 CCDKPLLEKS HCIAEVEKDA IPENLPPLTA DFAEDKDVCK NYQEAKDAFL 351 GSFLYEYSRR HPEYAVSVLL RLAKEYEATL EECCAKDDPH ACYSTVFDKL 401 KHLVDEPQNL IKQNCDQFEK LGEYGFQNAL IVRYTRKVPQ VSTPTLVEVS 451 RSLGKVGTRC CTKPESERMP CTEDYLSLIL NRLCVLHEKT PVSEKVTKCC 501 TESLVNRRPC FSALTPDETY VPKAFDEKLF TFHADICTLP DTEKQIKKQT 551 ALVELLKHKP KATEEQLKTV MENFVAFVDK CCAADDKEAC FAVEGPKLVV 601 STQTALA Primerjajte dobljene rezultate! Kakšna je razlika v izračunanih ekstinkcijskih koeficientih, če upoštevamo da vsi cisteini tvorijo/ne tvorijo S-S vezi? Kateri način določevanja koncentracije je najbolj točen? RAZREDČEVANJE VZORCEV: Dobili boste točno določeno koncentracijo proteina. Pripravite si razredčitve tako, da bo končna koncentracija proteina v kiveti (1 ml) 20pM. Ne pipetirajte manjših vrednosti kot 10 µl. Razredčitve z vodo smete delati le do 1ml. PRIPRAVA PUFRA ZA ENCIMSKI TEST IZOCITRAT DEHIDROGENAZO: Pripravi 0.1 l desetkratnega pufra (10X) 1 M Tris/HCl pH 8.5, ki vsebuje 10 mM MgCl2. Molska masa Trisa je 121 g/mol. Raztopina 1 M MgCl2 je že pripravljena.

2

VAJA 2

IZOCITRAT DEHIDROGENAZA (IDH) Encimi so biološki katalizatorji, ki so sposobni pospešiti kemijsko reakcijo vsaj za 106 krat. Delujejo na način, da znižajo aktivacijsko energijo, kar omogoča, da reakcija poteče pod fiziološkimi pogoji. Encimi so zelo specifični do substratov in do reakcij, ki jih katalizirajo. Encimi delujejo optimalno v razredčenih vodnih raztopinah pri zmerni T, pH in koncentraciji soli. Nekateri encimi pa potrebujejo še enega ali več neproteinskih komponent, koencim (organska molekula) ali kofaktor (kovinski ion). IDH je primer encima, ki potrebuje oboje, NADP+ kot koencim in Mg2+ oz. Mn2+ kot kofaktor. IDH je encim, ki ima dve katalitični aktivnosti: dehidrogenacijsko (odstrani H iz substrata (izocitrata)) in dekarboksilacijsko (odstrani CO2 iz substrata s 6 C-atomi in tvori produkt s 5 C-atomi (α-ketoglutarat)). Reakcija poteče ob prisotnosti NADP+ in dvovalentnega iona Mg2+.

Slika 1: Dehidrogenacija in dekarboksilacija izocitrata v α-ketoglutarat z encimom IDH

Slika 2: Struktura NADP+

3

IDH aktivnost se rutinsko meri s pomočjo spektrofotometra, pri čemer se spremlja redukcijo NADP+ do NADPH. Meri se pri valovni dolžini 340 nm . DOLOČITE ABSORBCIJSKI MAXIMUM ZA NADPH IN NADP+ Izmerite absorpcijske spektre 0.25 mM raztopin NADP+ in NADPH (200-450 nm). IZVEDBA ENCIMSKEGA TESTA: Raztopine: 10x pufer: 1M Tris/HCl pufer pH 8.5, ki vsebuje 10 mM MgCl2

razredčimo 10x Izhodna raztopina NADP+: 14,4 mM (11mg NADP+ / ml pufra) razredčimo 5x z

0,1 M Tris/HCl pufer pH 8.5, ki vsebuje 1 mM MgCl2 in uporabimo 50 µl za test

Izhodna raztopina izocitrata : 23 mM (5.95mg izocitrat / ml pufra) razredčimo 5x z

0,1 M Tris/HCl pufer pH 8.5, ki vsebuje 1 mM MgCl2 in uporabimo 50µl za test

Izhodna raztopina IDH: 13,4 mg encima/ml (4,5 U / mg) razredčimo 50x z 0,1

M Tris/HCl pufer pH 8.5, ki vsebuje 1 mM MgCl2 in uporabimo 20µl za test

Reakcijska mešanica vsebuje: 880 µl 0.1 M Tris/HCl pufer pH 8.5

1mM MgCl2 50µl NADP+ (0.144 mM končna konc) 50µl izocitrat (0.23 mM končna konc) 20µl encim IDH ------------------------------------ Σ = 1ml Reakcija se začne po dodatku encima (ENCIM REDČITE TIK PRED MERJENJEM NA SPEKTROFOTOMETRU). Vse eksperimente pri vajah 2, 3, 4 in 5 izvajamo pod zgoraj opisanimi pogoji, če ni napisano drugače!

4

Ali test za spremljanje aktivnosti IDH potrebuje izocitrat, IDH in NADP+ istočasno? Št.epruvete Pufer (µl) NADP+ (µl) IDH (µl) Izocitrat (µl) v (hitrost)

1 1000 - - - 2 930 50 20 - 3 900 50 - 50 4 930 - 20 50 5 880 50 20 50 6 880 50 20 50

Ali se rezultati ujemajo s pričakovanimi? VPLIV KONCENTRACIJE ENCIMA: Št.epruvete Pufer (µl) NADP+ (µl) IDH (µl) Izocitrat (µl) v (hitrost)

1 50 5 50 2 50 10 50 3 50 15 50 4 50 20 50 5 50 25 50

Narišite graf hitrosti v odvisnosti od končne koncentracije encima!

5

VAJA 3 VPLIV KONCENTRACIJE SUBSTRATA: 23 mM izhodno raztopino izocitrata razredčimo 100x z 0,1 M Tris/HCl pH 8.5, ki vsebuje 1 mM MgCl2. NADP+ in IDH razredčimo enako kot je opisano na strani 3. Št.epruvete Pufer (µl) NADP+ (µl) IDH (µl) Izocitrat (µl) v (hitrost)

1 50 20 5 2 50 20 10 3 50 20 20 4 50 20 50 5 50 20 100

Narišite graf odvisnosti hitrosti reakcije od končne koncentracije izocitrata! VPLIV PH NA AKTIVNOST IDH: Vpliv pH na aktivnost IDH bomo ugotovili s spremljanjem hitrosti nastanka produkta pri različnih pH-jih. Pufri z različnimi pH-ji (0.1 M acetatni pufer z 1mM MgCl2 za pH 6.00, 1 M Tris/HCl z 1mM MgCl2 za pH območje 7,0-9 in 0,1 M karbonatni pufer za pH 9,5-10) so že pripravljeni. NADP+, IDH in izocitrat razredčimo kot je napisano na strani 3! Št.epruvete pH Pufer (µl) NADP+ (µl) IDH (µl) Izocitrat (µl) v (hitrost)

1 6.0 50 20 50 2 7.0 50 20 50 4 8.0 50 20 50 5 8.5 50 20 50 6 9.0 50 20 50 7 9.5 50 20 50 8 10.0 50 20 50

Kakšni so vplivi pH na encimski test? Razmislite zakaj bi lahko bila v kislem hitrost nastanka produkta počasnejša!

6

VAJA 4 VPLIV KOVINSKIH IONOV NA AKTIVNOST IDH: Dodaj ustrezne volumne raztopin kovinskih ionov v 0,1 M Tris/HCl pH 8,5 (100 mM MnCl2,100 mM MgCl2,100 mM CaCl2, 100 mM ZnCl2, 500 mM EDTA), da bo končna koncentracija v 1 ml 1mM. NADP+, IDH in izocitrat razredčimo 5x v pufru brez kovinskih ionov. Št.epruvete Kov. Ion (µl)

1mM končna Pufer (µl)

Brez kov.ionov

NADP+ (µl) IDH (µl) Izocitrat (µl) v (hitrost)

1 0 20 2 EDTA 20 3 Mg2+ 20 4 Mn2+ 20 5 Ca2+ 20 6 Zn2+ 20

Kakšen je vpliv različnih dvovalentnih ionov na aktivnost IDH ? Zakaj dodatek EDTA inhibira delovanje encima ? VPLIV TEMPERATURE NA STABILNOST IDH: V šest mikrocentrifugirk odpipetiraj 20 µl IDH. Inkubiraj jih na 37 °C in po 1, 2, 4, 6 in 8 minut daj posamezne mikrocentrifugirke na led. Encimsko aktivnost IDH spremljaš po dodatku raztopine izocitrata in NADP+ v 980 µl pufra. NADP+, IDH in izocitrat razredčimo kot je opisano na strani 3. Št.epruvete Min, 370C Pufer (µl) (µl) IDH (µl) Izocitrat (µl) v (hitrost)

1 0 20 2 1 20 3 2 20 4 4 20 5 6 20 6 8 20

Kaj se zgodi s stabilnostjo IDH, če encim inkubirano pri 37 0C ? Kako bi lahko poskus izvedli še drugače ? Ali temperatura vzorca vpliva na izmerjeno hitrost reakcije ?

7

VAJA 5 VPLIV KONCENTRACIJE NADP+ NA AKTIVNOST IDH: 14.4 mM izhodno raztopino NADP+ razredčimo 100x z 0,1 M Tris/HCl pH 8.5, ki vsebuje 1 mM MgCl2. IDH in izocitrat razredčimo enako kot je opisano nastrani 3. Št.epruvete Pufer (µl) NADP+ (µl) IDH (µl) Izocitrat (µl) v (hitrost)

1 10 20 2 25 20 3 50 20 4 100 20 5 150 20

Kakšna je zveza med hitrostjo encimske reakcije in koncentracijo koencima v reakcijski mešanici, pri čemer je koncentracija encima konstantna? VPLIV KONCENTRACIJE NACL NA AKTIVNOST IDH (0 - 1M): Vpliv koncentracije NaCl na aktivnost IDH bomo ugotovili s spremljanjem hitrosti nastanka produkta pri različnih koncentracijah NaCl. Pripravljeno imate raztopino 1M NaCl v 0,1 M Tris/HCl. Dodaj ustrezne volumne, da bo končna koncentracija soli od 0-0.5 M. NADP+, IDH in izocitrat razredčimo enako kot je opisano na strani 3. Št.epruvete

[NaCl] M

končna koncentracija

Pufer (µl) NADP+ (µl) IDH (µl) Izocitrat (µl) v (hitrost)

1 0 20 2 0.1 20 3 0.2 20 4 0.3 20 5 0.4 20 6 0.5 20

Kakšen je vpliv NaCl na hitrost razgradnje substrata z IDH ?

8

VAJA 6

DOLOČITE KM VREDNOSTI ZA IZOCITRAT IN NADP+. Načrtajte in izvedite eksperimenta s katerima boste določili Km za izocitrat in NADP+! Ali bi določili večjo vrednost za Km, če bi delali pri višji koncentraciji encima?

9

VAJA 7

DOLOČANJE KONCENTRACIJE AKTIVNEGA PAPAINA S TITRACIJO Z IREVERZIBILNIMA INHIBITORJEMA E-64 IN EP-475

a) Določanje koncentracije papaina z merjenjem absorbance pri 280 nm Koncentracijo papaina določimo z merjenjem absorbance vzorca. Ekstinkcijski koeficient papaina je ε280 (papain) = 55950 M-1cm-1.

Papain je v raztopini stabiliziran z MMTS (metil metantiosulfonat), ki reagira s Cys25 v aktivnem mestu na način:

O H+

║ +

CH3SSCH3 + RS- RSSCH3 + CH3SO-2 + H+

║

O RSH

Papain je tako stabilen pri 4oC več mesecev. b) Določanje aktivne koncentracije papaina s titracijo aktivnega mesta s sintetskim ireverzibilnim inhibitorjem E-64 ali Ep-475 Aktivno koncentracijo papaina določamo s titracijo aktivnega mesta s sintetskima ireverzibilnima inhibitorjema cisteinskih proteinaz E-64 oziroma Ep-475. Tvorita tioetersko vez s tiolno skupino aktivnega cisteina (molarno razmerje encim/inhibitor je 1:1) (slika 7.1), kar vodi v ireverzibilno inaktivacijo encima.

Slika 7.1: Delovanje ireverzibilnega inhibitorja E-64

Točne koncentracije inhibitorjev lahko brez težav pripravimo s tehtanjem inhibitorja. Ker se E-64 in Ep-475 pretežno vežeta v aktivno mesto encima (vezava na nizko molekularne tiole ali druge dele encima je zanemarljiva), sta oba izvrstna titranta cisteinskih proteinaz.

10

Struktura E-64

HO-Eps-Leu-NH(CH2)4NH-C(=NH)NH2

L-trans-epoksisukcinil-levcilamid-(4-gvanido)-butan ali

N-[N-(L-trans-karboksioksiran-2-karbonil)-L-levcil]-agmatin Struktura Ep-475

HO-Eps-Leu-NH(CH2)2CH(CH3)2

L-trans-epoksisukcinil-levcilamid-2-metil butan

Najnižja koncentracija papaina, ki jo lahko titriramo je (z ireverzibilnim inhibitorjem) odvisna od občutljivosti substrata. Pri vaji uporabljamo fluorogena substrata BANA in Z-Phe-Arg-AMC. Substrat Z-Phe-Arg-AMC je mnogo bolj občutljiv zato lahko delamo z 10 krat nižjimi koncentracijami encima. Princip vaje V posamezne mikrocentrifugirke odpipetiramo po enak volumen papaina ustrezne koncentracije (koncentracijo papaina smo določili s pomočjo merjenja absorbance pri 280 nm in ekst. koeficienta). Encim najprej aktiviramo z reducentom, nato pa dodamo naraščajoče koncentracije inhibitorja (Io/Eo se giblje v območju od 0 do 1,2). Preostalo aktivnost encima izmerimo s pomočjo fluorogenega substrata. Naklon premice (dA/dt) je sorazmeren s hitrostjo reakcije. Delež preostale aktivnosti (a) izračunamo kot količnik med navidezno hitrostjo encimske reakcije z dodanim inhibitorjem z navidezno hitrostjo brez inhibitorja. Rezultate podamo v obliki grafa a v odvisnosti od (Io/Eo) (glej sliko 7.2).

Slika 7.2: Prikaz preostale encimske aktivnosti v odvisnosti od Io/Eo

10.80.60.40.20

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

Io/Eo

a

11

Presečišče premice z absciso, nam podaja razmerje med koncentracijo inhibitorja in koncentracijo encima. Ker je reakcijska hitrost pri tem razmerju inhibitorja z encimom enaka nič, je ves aktiven encim inhibiran z dodanim inhibitorjem. Koncentracija aktivnega encima je torej enaka koncentraciji inhibitorja, katerega točno koncentracijo poznamo. Presečišče na abscisi nam torej podaja delež aktivnega encima. Izvedba titracije: • V 11 mikrocentrifugirk odpipetiramo enak volumen (~20µl) ustrezno razredčenega

papaina začetne koncentracije 20 µM, da dobimo ustrezne končne koncentracije v 2 ml (10 nM, če delamo s substratom Z-Phe-Arg-pNA oz. 100 nM, če delamo s substratom BANA.

• Dodamo enak volumen BANA pufra, ki vsebuje 10 mM DTT • Dodajamo naraščajoče koncentracije inhibitorja razredčenega v BANA pufru (Io/Eo je

v območju od 0-1,2; volumen dodanega inhibitorja naj ne preseže 150 µl). • Dopolnimo z BANA pufrom do 200 µl. • Pred dodatkom fluorogenega substrata počakamo 15-20 minut, da se vzpostavi

ravnotežje med E-I (kompleks). • V kiveto odpipetiramo 1800 µl z BANA pufrom razredčenega substrata in dodamo

200µl reakcijske zmesi. Izračunajte potreben volumen substrata, če veste, da je potrebna končna koncentracija substrata Z-Phe-Arg-pNA v 2 ml 5 µM oziroma 100 µM v primeru substrata BANA. Izhajate iz 1 mM začetne koncentracije substrata Z-Phe-Arg-pNA in 30 mM začetne koncetracije substrata BANA. Pri fluorogenem substratu Z-Phe-Arg-AMC spremljamo spektrofluorometrično nastajanje produkta 7-amino-4-metilkumarina pri vzbujevalni valovni dolžini 370 nm in emisijski valovni dolžini 460 nm. Produkt pri razgradnji BANA substrata spektrofluorometrično spremljamo pri vzbujevalni valovni dolžini 335 nm in emisijski valovni dolžini 415 nm.

Izhodne raztopine: BANA pufer: 0.1 M fosfatni pufer pH 6.0, ki vsebuje 1.5 mM EDTA BANA pufer z 10 mM DTE Papain: 20 µM (hranimo na ledu!) Inhibitorja: 1 mM E-64 v DMSO

1 mM Ep-475 v DMSO Substrati: 1 mM Z-Phe-Arg-AMC v DMSO

30 mM substrat BANA v DMSO

12

Končne koncentracije v 2 ml:

Končne koncentracije

[2 ml v kiveti]

Končne koncentracije

[2 ml v kiveti]

Z-Phe-Arg-AMC

5 µM BANA 100 µM

papain 10 nM papain 100 nM

E-64 oz. Ep-475 0-12 nM E-64 oz. Ep-475 0-120 nM

µl papaina

papain

[nM]

µl

10 mM DTE

µl

E-64

E-64 [nM]

µl pufra

do 200 µl

Io/Eo a preostala aktivnost

1 0 0

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 1) Zakaj blokiramo aktivno mesto papaina z MMTS? 2) Razmislite kako bi aktivirali encim! 3) Ali je izračunana koncentracija višja/nižja od dejanske, če veste da MMTS absorbira pri

280 nm? 4) Izračunajte koncentracijo aktivnega encima! 5) Ali je lahko delež aktivnega encima večji od 1? 6) Kaj bi se zgodilo, če bi čas inkubacije močno podaljšali? 7) Zakaj substrat ni potrebno razredčiti v BANA pufru z dodanim DTT? 8) Zakaj hranimo encim na ledu? 9) Kakšna je razlika med ireverzibilnimi in reverzibilnimi inhibitorji! Kako bi lahko

odstranili reverzibilni inhibitor vezan v aktivno mesto encima?

13

VAJA 8

DOLOČANJE KONCENTRACIJE AKTIVNEGA STEFINA A S TITRACIJO S PAPAINOM

a) Določanje koncentracije stefina A Aminokislinsko zaporedje stefina A je: 10 20 30 40 50 60 | | | | | | MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVVAG TNYYIKVRAG 70 80 90 98 | | | | DNKYMHLKVF KSLPGQNEDL VLTGYQVDKN KDDELTGF Izmerite absorbanco stefina A, izračunaj ekstinkcijski koeficient po enačbi (1) in izračunaj koncentracijo stefina A.

ε280(M-1 cm-1) = št Trp x 5500 + štTyr x 1490 + štS-S x 125 (1)

b) Določanje aktivne koncentracije stefina A Princip titracije je identičen kot pri vaji 7, le da sedaj poznamo točno koncentracijo papaina in določamo aktivno koncentracijo stefina A. Koncentracijo stefina A smo ocenili iz absorbance stefina A.

Pri interakciji papain/stefin A je vrednost ravnotežne inhibicijske konstanate za njuno interakcijo Ki = 0.02 nM. V primeru, ko gre za inhibicijo s tesno vezavo (encim je inhibiran s koncentracijo inhibitorja, ki je podobna koncentraciji encima), je izmerjena rezidualna aktivnost (a) funkcija koncentracije encima (Eo), koncentracije inhibitorja (Io) in konstante inhibicije (Ki) (glej enačbo 2). Če hočemo reverzibilni inhibitor titrirati z encimom mora biti razmerje med Eo/Ki večje od 100 (Slika 8.1).

2Eo4EoIoKi)Io(EoKi)Io(Eo

a2 −++−++

= (2)

14

Slika 8.1: Prikaz preostale encimske aktivnosti kot funkcija razmerja Io/Eo pri različnih razmerjih Eo/Ki Izvedba titracije: • V 11 mikrocentrifugirk odpipetiramo enak volumen ustrezno razredčenega papaina

(aktivno koncentracijo ste določili v prejšnji vaji), da dobimo ustrezne končne koncentracije (končna koncentracija v 2 ml naj bo 10 nM, če uporabljaš substrat Z-Phe-Arg-pNA oziroma 100 nM, če uporabljaš substrat BANA; volumen dodanega encima naj bo v območju ~20 µl). Dodamo enak volumen BANA pufra, ki vsebuje 10 mM DTE. Reducent v pufru aktivira cistein v aktivnem mestu papaina.

• Dodamo naraščajoče koncentracije inhibitorja-stefina A (Io/Eo je v območju od 0-1,5;

volumen dodanega inhibitorja naj ne preseže 150 µl). • Dopolnimo z BANA pufrom do 200 µl • Pred dodatkom substrata počakamo 15 minut, da se papain aktivira in da se vzpostavi

kompleks papain-stefin A • Po 15 minutah inkubacije na sobni temperaturi merimo preostalo encimsko aktivnost v

posameznih paralelkah z dodatkom fluorogenega substrata. Izračunajte potreben volumen substrata, če veste, da je potrebna končna koncentracija substrata Z-Phe-Arg-pNA v 2 ml 5 µM oziroma 100 µM v primeru substrata BANA. Izhajate iz 1 mM začetne koncentracije substrata Z-Phe-Arg-pNA in 30 mM začetne koncetracije substrata BANA. Pri fluorogenem substratu Z-Phe-Arg-AMC spremljamo spektrofluorometrično nastajanje produkta 7-amino-4-metilkumarina pri vzbujevalni valovni dolžini 370 nm in emisijski valovni dolžini 460 nm. Produkt pri razgradnji BANA substrata spektrofluorometrično spremljamo pri vzbujevalni valovni dolžini 335 nm in emisijski valovni dolžini 415 nm.

15

Končne koncentracije

[2 ml v kiveti]

Končne koncentracije

[2 ml v kiveti]

Z-Phe-Arg-AMC

5 µM BANA 100 µM

papain 10 nM papain 100 nM

stefin A 0-15 nM stefin A 0-150 nM

µl papaina

papain

[nM]

µl

10 mM DTE

µl

stefin A

Stefin A

[nM]

µl pufra

do 200 µl

Io/Eo a

preostala aktivnost

1 0 0

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 1) Narišite graf preostale encimske aktivnosti v odvisnosti od Io/Eo. Kako s pomočjo grafa določite aktivno koncentracijo inhibitorja? 2) Zakaj smo čas inkubacije encima z inhibitorjem podaljšali? 3) Ali bi lahko titrirali 0.2 nM raztopino papaina s stefinom A? Zakaj? Kaj pa z E-64?

16

VAJA 9

DOLOČITEV KONSTANTE ASOCIACIJE IN DISOCIACIJE Z MORRISONOVO

ENAČBO

Hitro delujoči inhibitorji (klasični inhibitorji) so tisti inhibitorji, kjer se ravnotežje po dodatku encima v zmes inhibitorja in substrata vzpostavi hitro. Produkt nastaja linearno (glej sliko 9.2).

Če se ravnotežje po dodatku encima v zmes inhibitorja in substrata vzpostavi počasi lahko nastanek produkta opišemo z nelinearno funkcijo (predstacionarno stanje), tej pa sledi linearen nastanek produkta (stacionarno stanje). Inhibitorje te vrste imenujemo inhibitorje s počasno vezavo (glej sliko 9.2). Reakcijo inhibitorja s počasno vezavo in encimom predstavlja shema 9.1.

Kd k

E + S ES E + P + I

kas kdis

EI

Shema 9.1 : Interakcija inhibitorja s počasno vezavo in encimom

Slika 9.2 : Nastajanje produkta pri klasični inhibiciji, inhibiciji s počasno vezavo in pri samem encimu (brez dodanega inhibitorja)

17

Če je koncentracija inhibitorja s počasno vezavo vsaj desetkrat večja od koncentracije encima ustvarimo reakcijski pogoji psevdoprvega reda in lahko nastajanje produkta opišemo z Morrisonovo enačbo:

P = vst+(vi-vs) (1-e-kt)/k

vi je začetna hitrost, vs hitrost v stacionarnem stanju, k pa hitrostna konstanta psevdoprvega reda. Tangeta na krivuljo, ko gre čas proti nič je dana z enačbo P=vit, medtem ko enačba P=vst+(vi-vs)/k predstavlja asimptoto krivulje, ko gre t proti neskončno (glej sliko 9.2).

S prileganje enačbe eksperimentalnim podatkom izračunamo vrednosti paramentrov vi, vs in k. vi, vs in k določeni z nelinearno regresijo nam omogočijo izračun hitrostnih konstant disociacije (kdis) in asociacije (kas) ter ravnotežne konstante inhibicije (Ki) z uporabo naslednjih enačb:

vs/vi = kdis/(kdis + Iokas(nav)) (1)

kas(nav) = kas(1+So/Km) (2) (kompetitivna inhibicija)

k = kdis + Iokas(nav) (3)

So je koncentracija substrata, Km Michaelis-Mentenova konstanta, kas(nav) pa navidezna konstanta asociacije. S kombinacijo (1) in (3) enačbe dobimo enačbo (4) s katere lahko izračunamo kdis.

kdis = k vs/vi (4)

Z uporabo enačb (2) in (3) izračunamo kas. Konstanta inhibicije, pa je dana z razmerjem:

Ki = kdis / kas (5)

kdis, kas in Ki lahko dobimo iz ene same meritve.

18

Natančneje in točneje lahko določimo kas grafično iz več meritev. S prileganjem krivulj, ki opisujejo nastanek produkta pri različnih koncentracijah inhibitorja Morrisonovi enačbi, izračunamo hitrostne konstante psevdoprvega reda. Linearna predstavitev k(Io) dovoli grafično določitev kdis in kas s pomočjo enačb opisanih na strani 18.

Slika 9.2: Grafična predstavitev k = f(Io) Standardno napaka (odklon, deviacija) določitve naklona in presečišča z y osjo lahko ocenimo (napaka pri določitvi naklona in presečišča pri metodi najmanjših kvadratov). Standardna napaka Ki je podana kot: sKi/Ki=((skdis/kdis)2 + (skas/kas)2)0.5 Izvedba eksperimenta Kinetiko interakcije med papainom in stefinom A analiziramo s kontinuirnim merjenjem nastajanja produkta (substrat Z-Phe-Arg-AMC) pod reakcijskimi pogoji psevdoprvega reda, kjer je najmanj desetkratni prebitek inhibitorja nad koncentracijo encima. 20 µl papaina (končna koncentracija v 2 ml 5 nM) aktiviramo 5 min z dodatkom enakega volumna 10 mM DTT v BANA pufru. Po 5 minutah prenesemo aktiviran encim v kiveto, kamor smo že odpipetirali ustrezno količino inhibitorja (bomo določili glede na točno količino uporabljenega encima), 10 µM substrat Z-Phe-Arg-AMC in BANA pufer do volumna 1960 µl. Delajte (mešajte) hitro, da ujamete eksponentni del krivulje! Nastanek produkta spremljajte 10-15 minut. Določite kas, kdis in Ki za dobljene krivulje. Km vrednost za interakcijo papaina s substratom Z-Phe-Arg-AMC je 65 µM. S pomočjo svojih in podatkov kolegov določite kas in kdis tudi grafično. Ker je kdis težko določljiva direktno z grafa (ker je presečišče premice blizu koordinatnega izhodišča) določite kdis kot povprečje vseh izmerjenih kdis.

k = kas/(1+So/Km)Io + kdis

k kdis

Io