Utilizarea compușilorbioactivi din propolis șivenin ca opterapeutice în cancerelemamare umane

REZUMAT AL TEZEIDE DOCTORAT

Doctorand Flaviu Drîglă

Conducător de doctorat Prof. Univ. Dr. DHC Liviu-Alexandru Mărghitaș

Utilizarea compușilor bioactivi din propoliscancerele mamare umane

1

INTRODUCERECancerul este o boală genetică a celulelor somatice care semanifestă printr-o acumulare de celule ca rezultat al unei expansiuniclonale. Pe plan internainciden (FERLAY, 2013), constituind principala cauză dedeces în Europa și a doua în SUA (ALTHUIS, 2005).Terapia convenţională a cancerului de sân include chirurgia,scheme terapeutice bazate pe terapii citostatice, hormonale, imunologicerealizarea unei vindecări complete. Utilizarea unor terapii neconvenţionalepe bază de compuşi naturali cu efecte antitumorale şi de stimulareimunitară poate amplifica efectul antitumoral al terapiilor convenţionale.Dezvoltarea de noi terapii bazate atât pe compuși pe compuși non-tradicancerului de sân triplu negativ, constituie o mare provocare. În prezent,terapiile non-tradialbine sunt un subiect de dezbatere al aplicabilităcancerului. Studiile recente au descris proprietă umorale alepropolisului prin blocarea ciclului celular, activarea apoptozei(SAWICKA,2012), inducerea stresului mitocondrial (BENGUEDOUAR, 2008), inhibareacreșterii și proliferării tumorale (BIRT, 2001; CHEN, 2004, SZLISZKA,2009), iar a veninului de albine prin inhibarea dezvoltării și proliferăriitumorale (LIU, 2002, ORSOLIC, 2003c). tirea mai multor căi desemnalizare prin intermediul compușilor naturali a deschis noi abordăripentru terapiile antitumorale sugerând noi oportunitătratamentele non-convenţionale (SARKAR, 2009).Apiterapia foloseşte mierea, propolisul, ceara, lăptisorul de matcăşi veninul de albine pentru tratarea şi prevenirea diverselor afecţiuni aleorganismului uman.În apiterapie se folosesc produse apicole naturale alestupului, farănici o prelucrare, se utilizează extracte sau medicamenteapiterapice standardizate. Apiterapia şi aplicaţiile ei reprezintă oalternativă naturală de tratament, iar interesul pentru această abordareeste tot mai larg răspandită pe plan mondial.Cuvinte cheie: cancer mamar, venin de albine, propolis, apoptoză,activitate antitumorală

Flaviu Drîglă

2

STRUCTURA LUCRĂRIILucrareaintitulată"Utilizarea compușilor bioactivi din propolis șivenin ca op "conţine 122 depaginişi esteredactatăconformnormelorînvigoareîndouăpărţi.Prima parte cuprinde 18 pagini, structurate într-un capitol şisintetizează cadrul general actual al cunoaşterii legat de cancerul de sân,caracteristicile celulelor tumorale, proliferareatumorale, calea extrinsecă și intrinsecă de inducere a apoptozei,supravegherea sistemului imun, răspunsul imun: mediatori moleculari airăspunsului imun, terapii convenalternative cu computerapeutice, activitatea antitumorală, veninul de albine: proprietăterapeutice, activitatea antitumorală.ParteaaII-a,extinsăpe85depagini,cuprindecercetărilepersonalerealizate înperioada2012–2015, axate pe două direcţii de cercetare. În primul rând pecaracterizarea rolului supravegherii imune în cancerul mamar şi în al doilearând pe identificarea unor strategii de ţintire a proliferării şi supravieţuiriicelulare şi stimulare a răspunsului imun în celulele tumorale mamare.Fiecare capitolestestructuratînsubcapitoleceprezintă scopulşiobiectivele,materialele şimetodeleutilizate,rezultatele obţinutecudiscuţiiasupra noutăţiiacestoracomparativ cualtestudiiefectuateşiconcluziileaduseîn urmaefectuăriistudiului.Rezultatelecercetăriisuntilustrateîntr-unnumărde39defigurişisintetizateîn18tabele.Lucrarea se încheie cu lista bibliografică (183de titluri).REZULTATELE CECETĂRIICapitolul 3 intitulat “Identificarea particularităţilor de expresiegenică în sângele integral recoltat de la pacientele cu cancer de sân şicorelarea acestora cu datele clinico-patologice” cuprinde trei obiectiveprincipale: asocierea datelor clinico-patologice cu expresia Her2 în tumorileprimare ale pacientelor, identificarea profilelor de expresie specifice pentruexprimarea Her2 în tumorile primare la pacientele cu cancer de sân,identificarea mecanismelor moleculare asociate cu răspunsul la terapiastandard.Pentru realizarea acestui studiu, au fost selectate 30 de pacientediagnosticate cu cancer de sân în cadrul Institutului Oncologic “Prof. Dr. IonChiricu -Napoca (IOCN) în perioada 2010-2012. Comisia de eticăa Institutului Oncologic “Prof. Dr. Ion Chiricu -Napoca a aprobatacest studiu, iar toate pacientele incluse în studiu și-au dat aprobarea scrisăpe baza unui consim

Utilizarea compușilor bioactivi din propoliscancerele mamare umane

3

subtipizarea tumorilor s-a evaluat conform criteriului AJCC (American JointCommittee on Cancer).Statusul receptorilor pentru estrogen, progesteron și Her2 a fostdeterminat prin analiza de imunohistochimie (IHC).În acest studiu au fostincluse doar pacientele cu receptori negativi pentru estrogen şiprogesteron. Dintre pacientele incluse în studiu, 18 au prezentat subtipultriplu negativ (ER-, PR-, HER2-) iar 12 paciente au avut subtipul non-luminal Her2+ (ER-, PR- și HER2+). Recoltarea probelor de sânge a celor 30de paciente incluse în studiu s-a efectuat anterior administrarii oricăreitreapii, în vacutainere cu anticoagulant EDTA. După îndepărtarea plasmei șia hematiilor, celulele nucleate au fost procesate în vederea izolării ARN-uluitotal. Extractia ARN-ului total s-a realizat prin metoda clasică folosindTriReagent (Invitrogen), cloroform şi alcool etilic, pe baza unui protocolvalidat anterior.Ulterior, ARN-ul ob cat pe coloane de gel-silicat, cu ajutorul kitului RNeasy Mini Kit (Qiagen).Concentra -ulextras a fost măsurată cu ajutorul spectrofotometrului NanoDrop ND-1000(Nanodrop Technologies), iar evaluarea integrităajutorul Bioanalizorului 2100 (Agilent).Pentru sinteza de ADN complementar (cADN) s-a utilizat ocantitate de 300 ng de ARN și reactivii din kitul RT2 First Strand conformspecifica i (Qiagen). După sinteza de cADN, probeleob luate 1/10 și amplificate în plăci de PCR array cu 96 degodeuri utilizând kitul Human Breast Cancer PAHS-131Z (Qiagen) carecon 84 de gene implicate în cancerul mamar.Setările pentruprogramul de amplificare au fost stabilite conform specificaproducătorului și efectuate cu ajutrul aparatului LightCycler 480 II (Roche,România). Pentru detec -a folosit SYBR green, iar punctelede inflexiune, specifice numărului de cicluri de amplificare (Ct) au foststabilite prin metoda de analiză automată, denumită metodă derivativăsecundară.Corelaexact Fischer sau testul chi pătrat. Rezultatele de PCR array au fostanalizate pentru calcularea valorii fold-change, prin metoda ΔΔCt pentruvalori Ct cu un cut-off la 35 de cicluri. Au fost considerate de interes genelecu -1,5<fold change>1,5 și cu o valoare p ajustată <0,05 obţinute prinmetoda Benjamini și Hochberg. Pacientele au fost grupate pe baza expresieiHer2 din tumora primară la diagnostic. Genele diferit exprimate au fostulterior analizate din punct de vedere a interacde Analiză Ingenuiy Pathway (Ingenuity Pathway Analysis IPA). Prinutilizarea informa y (IngenuityKnowledge Base IKB), genele au fost grupate în re

Flaviu Drîglă

4

canonice dintre gene/refunc biologice a fost evaluată cu ajutorul testului exact Fischer (p<0,05).În urma analizei de imunohistochimie, receptorul pentru Her2 afost exprimat în tumorile primare la 18 paciente, în timp ce la restulpacientelor nu a fost prezentă expresia proteinei. Douăzeci și opt depaciente au fost diagnosticate cu carcinom ductal invaziv, iar două pacienteau prezentat carcinom lobular invaziv. Aproximativ 75% dintre paciente aufost diagnosticate cu tumori mamare în stadiul III. Majoritatea pacientelorau prezentat ganglioni pozitivi, fără detectarea de metestaze secundare ladistan -au identificat valori statistic semnificative între statusulganglionar și expresia Her2 (p<0,03), mai puţine paciente Her2 pozitiv auavut ganglioni axilari mobili decat pacientele Her2 negativ.Pe baza analizei transcripgene diferit exprimate între grupul pacientelor cu Her2- și cel al pacientelorcu Her2+. În cazul pacientelor cu Her2-, toate genele au fost subexprimateexceptând Ciclina A1 care a fost supraexprimată. Aceste gene suntcodificatoare pentru reglatorii ciclului celular: CCNA1, JUN, MKI67, RASSF1,SFN; molecule implicate în adeziunnea celulară: CDH1, CTNNB1, HER2,factori de transcriptransductori de semnal: GLI1.Pe baza expresiei genice, ciclu celular (p=9,21E-15-3,99E-04)reprezintă cea mai importantă funcmotilitatea celulară (p=4,13E-13-6,01E-04) și dezvoltarea celulară(p=2,40E-11-5,69-04). Conform așteptărilor, aceste gene au fost incluse însemnalizarea moleculară a căilor canonice implicate în cancer, în modspecial a mecanismelor de semnalizare din sistemul reproducător(p=1,68E-13-4,22E-04), precum și a mecanismelor de semnalizare careasigură dezvoltarea -05-5,17E-04).Capitolul 4 intitulat “Evaluarea mecanismelor moleculare deacţiune a unor tratamente alternative cu propolis, venin sau combinareaacestora în tratamentul cancerului mamar subtipul triplu negativ” estestructurat în patru obiective majore: obţinerea şi purificarea soluţiilorapoase de propolis şi venin, evaluarea efectelor tratamentului cu propolissau venin pe modele in vitro de cancer mamar, identificarea mecanismelormoleculare modulate de aceste tratamente, investigarea mecanismelorcelulare şi moleculare de acţiune sinergică a celor două tratamente .Rezultate obflavonoidelor totaleapos și alcolic de propolis relevă faptul că valoarea cea mai mare pentrurandamentul de extrac -a obalcool etilic 96%, iar cantitatea cea mai mare de compuși biologic activi

Utilizarea compușilor bioactivi din propoliscancerele mamare umane

5

(polifenoli totali și flavonoide totale), precum și activitatea antioxidantă(DPPH și FRAP) s-au ob cazul extractulului alcoolic de propolis 20%în alcool etilic 70%.În urma analizei de cromatografie lichidă de înaltă performan(HPLC) pentru extractul apos de propolis s-au evidenprincipali: acidul cafeic, acidul p-cumaric şi acidul ferulic, în timp ce în cazulveninului de albine s-a evidenA2 (21.84%) și apamina (4.36%). Prin tehnica cromatografiei lichidecuplată cu detector spectrometru de masă (LC-MS) s-au detectataminoacizii liberi din veninul de albine ca fiind predominancistina, alanina, arginina, în timp ce pentru extractul apos de propolis 30%s-au evidenob bdeterminarea mineralelor au indicat o cantitate bogată în Mg(28297.57µg/kg), Na (4243.08 µg/kg), Ni (4162.61 µg/kg), Ca(3636.06µg/kg) în cazul veninului de albine, în timp ce în extractul depropolis apos 30 % au predominat Mg (21436.13µg/kg), Mn(5744.11µg/kg), Cu (5249.00µg/kg) și Ca (4173.93µg/kg).În vederea efectuării studiului in vitro, au fost selectate două liniicelulare de cancer de sân reprezentative: linia Hs578T (subtipul triplunegativ), respectiv linia MCF-7 (subtipul luminal) (ECACC), care au fostcrescute în mediul de cultură DMEM respectiv MEM, suplimentat cu 10%ser fetal bovin, glutamină 1%, penicilină-streptomicină 1% la 37°C într-unincubator cu CO2 5%. S-a folosit testul MTT pentru evaluarea activităantitumorale a celor două tratamente.valoarea jumătăinhibitorii maxime (IC50) au fost stabilite prin reprezentarea graficului deabsorbanprin identificarea concentra re 50% dintre celule intră în moartecelulară. Conform curbelor grafice ob -răspuns,s-a constatat că pentru a induce moartea celulară la jumătate din polulacelulară este necesară o concentra lulareMCF-7, respectiv 0,05 mg/ml pentru linia celulară Hs578T.După identificarea concentratratament și linie celulară în parte, a fost investigată posibilitatea induceriiunui efect sinergic prin combina amente în cadrul celordouă linii celulare.Având acest obiectiv stabilit, au fost combinate cele douătratamente potrivit dozei IC50 stabilite pentru fiecare linie celulară şi au fostefectuate dilu -astabilit o concentramg/ml venin de albine, respectiv pentru al doilea tratament o concentracombinată de 0,09 mg/ml extract apos de propolis și 1 mg/ml venin dealbine. În cazul testării celei de-a doua concentra

Flaviu Drîglă

6

(0,09 mg/ml extract apos de propolis și 1 mg/ml venin de albine), s-aobservat un efect de 5 respectiv 2 ori mai crescut în ambele linii celulareMCF-7 și Hs578T.Deoarece pacientele cu cancer de sân subtipul triplu negativrăspund cel mai slab la tratamentele actuale, studiile moleculare din aceastălucrare s-au axat pe linia celulară Hs578T de cancer de sân triplu negativ, învederea utilizării tratamentelor cu extracte de propolis şi venin ca șitratament ţintit pe acest subtip de cancer mamar. În vederea analizei debiologie moleculară prin tehnica de qRT PCR, un număr de 2.5x105 de celuleHs578T au fost depuse în plăci de 12 godeuri cu o zi înainte de tratament. Înziua tratamentului, mediul de pe celule a fost înlocuit cu mediu proaspăt cecon 0.072 mg/ml extract apos de propolis, 0.05 mg/ml venin, sau 0.072mg/ml extract apos de propolis plus 0.05 mg/ml venin. Celulele au fostincubate pentru 24 ore cu tratamentul stabilit, după care acestea au fostlizate în TriZol şi procesate pentru extracţia ARN-ului total prin metodaclasică cu fenol-cloroform. În urma evaluării cantitative cu ajutorulspectrofotometrlui NanoDrop ND-1000,concentra -urilor extrase afost cuprinsă între 171.37 - 441.29 ng/µl. În urma analizei calitative cuajutorul Bioanalizorlui Agilent 2100, valoarea RIN (RNA Integrity Number)a fost cuprinsă între 8.9 – 9.6. Pentru sinteza de ADN complementar (cADN)s-a folosit o cantiate de 500 ng ARN total din fiecare probă și kit-ulTranscriptor First Strand cDNA Synthesis Kit, urmărind protocolul indicatde producător (Roche Technologies). ADN-urile complementare obţinute aufost diluate 1:10 şi amplificate pentru fiecare genă de interes, cu kit-ulLightCycler TaqMan Master kit în aparatul LightCycler 480 (RocheTechnologies). Valorile Ct au fost calculate prin metoda AbsoluteQuantification Second Derivative max, după care nivele de expresie pentrufiecare genă au fost normalizate la gena housekeeping 18S şi calculate prinmetoda 2-ΔΔCt.Pentru elucidarea mecanismelor moleculare de acţiune aleextractului apos de propolis și venin de albine, am investigat modificările deexpresie genică induse de cele două tratamente individuale și combinate aunui panel de 22 gene implicate în procesul de apoptoză şi răspuns imun.Investigarea procesului de apoptoză a fost ales pe baza datelor dinliteratură conform cărora aceste tratamente ac ionează în principal prininducerea morţii celulare. În vederea identificării unui tratament care săstimuleze răspunsul imun compromis al pacientelor cu cancer de sân,subtipul triplu negativ identificat în studiul din capitolul precedent, aminvestigat dacă tratamentul cu propolis sau/şi venin reglează transcripunor gene de semnalizare a răspunsului imun. Prin urmare, am identificat şitestat un panel de 7 gene care au fost descrise a regla principalele căi desemnalizare ale apoptozei, 8 gene implicate în semnalizarea răspunsuluiimun, şi 7 gene care reglează atât procesul de apoptoză cât şi cel de răspunsimun.

Utilizarea compușilor bioactivi din propoliscancerele mamare umane

7

Rezultatele obţinute arată că tratamentul cu extract apos depropolis induce o supraexprimare a genelor FAS, ATM, SPP1, IL8, VEGFA,TGFB2, CSF2, IL4 şi TGFB1 şi subexprimarea genelor PCNA, PTTG1, p53 șiEGF. Tratamentul cu venin de albine stimulează transcripţia genelorDRAM1, TGFB2, CSF2 şi MYC şi reprimă transcripţia genei SPP1.Tratamentul combinat al celor două are un efect de stimulare sinergicasupra genelor CSF2 şi MYC şi de inhibare a genelor EGF, p53, PTTG1 şiPCNA. De asemenea, tratamentul combinat al extractului apos de propoliscu venin de albine exercită efecte antagoniste asupra genei SPP1,determinând astfel pierderea oricărui efect.În general, genele reglate înurma tratamentului cu extractul apos de propolis se păstrează şi întratamentul combinat. Mai mult, gena DRAM1 şi BCL2 care sunt activate înurma tratamentului cu venin, îşi pierd efectul când se adaugă şi propolis,datele acestea sugerând că tratamentul cu propolis este decisiv în reglareatranscrip genă este reglată deambele tratamente în mod similar, tratamentul sinergic nu duce la oamplificare a semnalizării, precum s-a observat în cazul genelor ATM, IL8,IL4 și TGFB1.În schimb, în cazul genelor FAS şi VEGFA care sunt puternicactivate prin tratamentul cu propolis, acest efect dispare la tratamentulsinergic, sugerand că aceste gene sunt reglate în principal prin tratamentulcu venin. Un efect similar se observă şi în cazul genelor PTGS2 şi MYC, carenu sunt reglate în tratamentul cu propolis, dar devin activate în urmatratamentului cu venin sau sinergic. Aceste date sugerează că aceste douătratamente acţionează pe căi specifice de semnalizare, efectul lor sinergicfiind reglat selectiv de unul sau de celălalt tratament.Genele şi valorile fold change corespunzătoare fiecărui tratamentau fost încărcate în Ingenuity Pathway Analysis (IPA) pentru o analiză depredicţie a reglării transcripţionale a acestor gene şi organizarea acestoraîn reţele de semnalizare, precum şi predicţia efectelor biologice modulatede aceste gene. Genele analizate au fost organizate în 3 reţele principale desemnalizare, scorul atribuit fiecărei re rul degene identificat în fiecare reţea.Tratamentul cu extract apos de propolis a indus subexprimarea a 4gene și supraexprimarea a 10. Dintre acestea, p53 și PTTG1 sunt factori cuacurmare a tratamentului sugerând o inhibare a expresiei genelor reglate deacestea. PTTG1 reglează negativ expresia ATM (CHESNOKOVA , 2007) șipozitiv expresia VEGFA (MCCABE, 2002), datele observate sunt înconcordan la

Flaviu Drîglă

8

supraexprimarea ATM, în timp ce datele pentru reglarea VEGFA suntinconsistente, astfel că, deși PTTG1 este subexprimată în acest experiment,nivelul de expresie al VEGFA este crescut.Totodată, nivelul VEGFA este reglat și de p53 care inhibă expresiaacesteia (PAL, 2001), datele noastre indicând o reglare a VEGFA dominantprin p53. Gena p53 fiind inhibată în urma tratamentului cu propolispermite transcrip De asemenea, p53 reglează negativ și expresiaCSF2 (MORI, 1997), TGFB1 (IZZOTTI, 2004), PTTG1 și IL4 și pozitivexpresia EGF (KOMAROVA, 1998), TGFB2 (BOIKO, 2006), IL8, SPP1, PCNA,ATM și FAS. La rândul lor, activarea genelor IL4, IL8, CSF2, TGFB 1 și 2semnalizează eliberarea de citokine pro-inflamatorii.Tratamentul cu venin de albine a indus subexprimarea uneisingure geneacestui tratament se face aparent prin gena MYC și nu prin p53 precum încazul propolisului. MYC reglează pozitiv expresia TGFB2 (SHU, 2013) șinegativ cea a genelor BCL2 (CORY, 2002) și FAS (SHIVAPURKAR, 2002). Deasemenea, s-a raportat implicarea MYC în reglarea SPP1 (WANG, 2000) șiIL8 (FLORCZYK, 2011), dar direc de semnalizare nu a fost descrisă.Și încazul acestui tratament, activarea genelor IL4, IL8, CSF2 și TGFB 2sugerează inducerea de citokine pro-inflamatorii.Tratamentul combinat cu propolis și venin a indus subexprimareaa 4 gene și supraexprimarea a 8. Tratamentul combinat păstreazăcaracteristicile moleculare ale rereglată atât prin p53 și PTTG1 precum în cazul tratamentului cu propoliscât și prin MYC precum în cazul tratamentului cu venin. Astfel, se observăun efect molecular de reglare sinergistic al celor două tratamente.Analiza de prediceste considerat semnificativ când -2 ≤ scor de activare ≥2, astfel cândpentru un proces biologic dat este calculat un scor de activare ≥ -2, acestproces este considerat ca fiind dezactivat, iar când scorul de activare ≥ 2,procesul biologic este considerat ca fiind activat. Pe baza nivelelor deexpresie ale genelor studiate este estimat că tratamentul cu propolis scadeapoptoza (scor de activare -1.928, p=1.6*10-22) și crește viabilitateacelulelor tumorale (scor de activare 2.658, p=6.96*10-20). Aceste rezultatemoleculare sunt în contradicconcentra -se o reducere cu 50% anumărului de celule tumorale la 24 ore de tratament. Din analiza acestorrezultate se poate emite ipoteza conform căreia propolisul activează căiadiacente de semnalizare a apoptozei decât cele principale prin p53, FASsau TNF. Una dintre aceste căi ar putea fi reglarea preferenaceasta fiind singura moleculă a cărui nivel de expresie este invers corelatcu efectul biologic presupus, creșterea expresiei TGFB1 fiind corelată cuinducerea apoptozei în celulele tumorale (HOFMANN, 2003).

Utilizarea compușilor bioactivi din propoliscancerele mamare umane

9

Analiza efectelor celulare induse prin tratamentul cu venin, deși nuau dus la o predicpentru propolis: scăderea apoptozei (scor de activare -1.49) și creștereasupravie (LOTEM, 1996)cât și BCL2 (JIANG, 2011) opresc inducerea morcelulelor mamare (RUIZ-RUIZ, 2003). Pe de altă parte, gena MYC a fostaratată a stimula apoptoza celulelor tumorale de sân (BEARSS, 2002;BEARSS, 2000; DEB, 2004), sugerând că în condi s arputea fi reglat de MYC. În cazul supravienivele de expresie au fost statistic semnificativ afectate în urmatratamentului cu venin de albine indică o activare a procesului desupravieÎn cazul tratamentului combinat, se observă sinergismul molecularal celor două tratamente, cu un scor de activare pentru apoptoză de -1.85 șipentru supravie lculată ale celor douăprocese se păstrează, întărind ipoteza conform căreia aceste procese suntreglate prin căi de semnalizate alternative decât cele studiate.Pentru a investiga efectele moleculare pe care tratamentul cupropolis, venin sau propolis combinat cu venin le-ar putea avea asupramodulării sistemului imun, s-a calculat scorul de activare pentru douăprocese reprezentative, precum expansiunea celulelor imune și proliferareaacestora.În urma tratamentul cu propolis s-a calculat un scor de activare de1.689 pentru expansiunea celulelor imune și de 1.159 pentru proliferareaacestora. Deși aceste scoruri nu sunt semnificative din punct de vedere alpredictranscrierea unor gene care preponderent semnalizează modulareasistemului imun. Analiza predictivă arată că supraexprimarea unor geneprecum VEGFA (TERME, 2013) și CSF2 poate duce la expansiunea șiproliferarea celulelor imune (KARMALI, 2011), modulând astfel sistemulimun să lupte impotriva dezvoltării tumorale. Pe de altă parte, p53 regleazăprintr-o buclă negativă celulele imune activate prin CSF2 (ISHII, 2009), iarsubexprimarea concomitentă a p53, sugerează un mecanism de amplificarea semnalului.În urma tratamentului cu venin de albine, procesul de proliferare acelulelor imune nu pare să fie afectat semnificativ (scor de activare 0.737),spre deosebire de procesul de expansiune a acestora (scor de activare 2.4).Deși CSF2 (KARMALI, 2011), MYC (CHARLOT-RABIEGA , 2011) și BCL2(JOSHI, 2007) promovează expansiunea și proliferarea celulelor sistemuluiimun, TGFB2 în schimb inhibă proliferarea acestora (BESWICK, 2011).Pentru tratamentul combinat cu propolis și venin, s-a calculat unscor de activare de 1.977 pentru expansiunea celulelor imune și de 1.337

Flaviu Drîglă

10

pentru proliferarea acestora, aceste procese fiind aparent controlate prinp53, MYC un.CONCLUZII GENERALEÎn conformitate cu primul obiectiv al acestei teze, am identificat șicaracterizat câteva gene implicate în modularea răspunsului la tratament apacientelor cu cancer de sân triplu negativ. Această caracterizare s-a făcutprintr-o metodă de explorare non-invazivă, folosindu-se ca și materialbiologic sânge integral recoltat de la pacientele introduse în studiul decercetare. Datele de expresie genică au fost corelate cu cele clinio-patologice, genele identificate fiind asociate cu un răspuns scăzut latratametele clasice, precum și un sistem imun compromis la acestepaciente.În vederea îmbunăcu cancer de sân subtipul triplu negativ, am realizat studii in vitro deactivitate antitumorală a unor compuși naturali, precum propolisul șiveniunul de albine, pe culturi celulare de cancer mamar triplu negativ. Prinaceste studii am identificat atât mecanismele celulare și moleculareindividuale de semnalizare a propolisului și veninului de albine cât și celesinergice induse prin combinarea celor două tratamente.Rezultatele noastre au evidenbazat pe propolis și venin de albine se induce un efect antiproliferativsinergic într-un mod dependent de concentramamare.Analiza mecanismelor moleculare de semnalizare arată căpropolisul aciar veninul de albină prin calea MYC. Prin combinarea celor douătratamente, s-a observat un sinergism molecular, de reglaretranscrip atât prin calea p53 cât și prin calea MYC. Mai mult, acestetratamente reglează transcrierea unor gene implicate în semnalizarearăspunsului imun, ceea ce poate sugerea căaceste tratamente pot stimularăspunsul imun în celulele tumorale mamare subtipul triplu negativ. Acesteobservaunor scheme pentru tratamente multiapariactivarea unor mecanisme moleculare adiacente de reglare a proliferării șisupravie

Utilizarea compușilor bioactivi din propoliscancerele mamare umane

11

BIBLIOGRAFIE1. ALTHUIS, M.D., DOZIER, J.M., ANDERSON, W.F., DEVESA, S.S., BRINTON,L.A., 2005, Global trends in breast cancer incidence and mortality 1973-1997, Int JEpidemiol, 34 (2), 405-412.2. BEARSS, D.J., LEE, R.J., TROYER, D.A., PESTELL, R.G., WINDLE, J.J., 2002,Differential effects of p21 (WAF1/CIP1) deficiency on MMTV-ras and MMTV-mycmammary tumor properties, Cancer Res, 62 (7), 2077-2084.3. BEARSS, D.J., SUBLER, M.A., HUNDLEY, J.E., TROYER, D.A., SALINAS, R.A.,WINDLE, J.J., 2000, Genetic determinants of response to chemotherapy in transgenicmouse mammary and salivary tumors, Oncogene, 19 (8), 1114-22.4. BENGUEDOUAR, L., BOUSSENANE, H.N., WIDED, K., ALYANE, M.,ROUIBAH, H., LAHOUEL, M., 2008, Efficiency of propolis extract againstmitochondrial stress induced by antineoplasic agents (doxorubicin and vinblastin)in rats, Indian J ExpBiol, 46 (2), 112-9.5. BESWICK, E.J., PINCHUK, I.V., EARLEY, R.B., SCHMITT, D.A., REYES, V.E.,2011, Role of gastric epithelial cell-derived transforming growth factor beta inreduced CD4+ T cell proliferation and development of regulatory T cells duringHelicobacter pylori infection, Infect Immun, 79 (7), 2737-2745.6. BIRT, D.F., HENDRICH, S., WANG, W., 2001, Dietary agents in cancerprevention: flavonoids and isoflavonoids, Pharmacol Ther, 90 (2-3), 157-177.7. BOIKO, A.D., PORTEOUS, S., RAZORENOVA, O.V., KRIVOKRYSENKO, V.I.,WILLIAMS, B.R., GUDKOV, A.V., 2006, A systematic search for downstreammediators of tumor suppressor function of p53 reveals a major role of BTG2 insuppression of Ras-induced transformation, Genes Dev, 20 (2), 236-252.8. CHARLOT-RABIEGA, P., BARDEL, E., DIETRICH, C., KASTELEIN, R.,DEVERGNE, O., 2011, Signaling events involved in interleukin 27 (IL-27)-inducedproliferation of human naive CD4+ T cells and B cells, J Biol Chem, 286 (31), 27350-27362. 9. CHEN, C.N., WENG, M.S., WU, C.L., LIN, J.K., 2004, Comparison of RadicalScavenging Activity, Cytotoxic Effects and Apoptosis Induction in Human MelanomaCells by Taiwanese Propolis from Different Sources, Evid Based Complement AlternatMed, 1 (2), 175-185.10. CHESNOKOVA, V., ZONIS, S., RUBINEK, T., YU, R., BEN-SHLOMO, A.,KOVACS, K., WAWROWSKY, K., MELMED, S., 2007, Senescence mediates pituitaryhypoplasia and restrains pituitary tumor growth, Cancer Res, 67 (21), 10564-10572.11. CORY, S., ADAMS, J.M., 2002, The Bcl2 family: regulators of the cellularlife-or-death switch, Nat Rev Cancer, 2 (9), 647-656.12. DEB, T.B., COTICCHIA, C.M., DICKSON, R.B., 2004, Calmodulin-mediatedactivation of Akt regulates survival of c-Myc-overexpressing mouse mammarycarcinoma cells, J Biol Chem, 279 (37), 38903-38911.13. FERLAY, J., STELIAROVA-FOUCHER, E., LORTET-TIEULENT, J., ROSSO,S., COEBERGH, J.W., COMBER, H., FORMAN, D., BRAY, F., 2013, Cancer incidence andmortality patterns in Europe: estimates for 40 countries in 2012, Eur J Cancer, 49(6), 1374-1403.

Flaviu Drîglă

12

14. FLORCZYK, U., CZAUDERNA, S., STACHURSKA, A., TERTIL, M., NOWAK,W., KOZAKOWSKA, M., POELLINGER, L., JOZKOWICZ, A., LOBODA, A., DULAK, J.,2011, Opposite effects of HIF-1 alpha and HIF-2 alpha on the regulation of IL-8expression in endothelial cells, Free Radic Biol Med, 51 (10), 1882-1892.15. HOFMANN, T.G., STOLLBERG, N., SCHMITZ, M.L., WILL, H., 2003, HIPK2regulates transforming growth factor-beta-induced c-Jun NH(2)-terminal kinaseactivation and apoptosis in human hepatoma cells, Cancer Res, 63 (23), 8271-8277.16. ISHII, N., MATSUMURA, T., KINOSHITA, H., MOTOSHIMA, H., KOJIMA, K.,TSUTSUMI, A., KAWASAKI, S., YANO, M., SENOKUCHI, T., ASANO, T., NISHIKAWA, T.,ARAKI, E., 2009, Activation of AMP-activated protein kinase suppresses oxidizedlow-density lipoprotein-induced macrophage proliferation, J BiolChem, 284 (50),34561-34569.17. IZZOTTI, A., CARTIGLIA, C., LONGOBARDI, M., BAGNASCO, M.,MERELLO, A., YOU, M., LUBET, R.A., DE FLORA, S., 2004, Gene expression in the lungof p53 mutant mice exposed to cigarette smoke, Cancer Res, 64 (23), 8566-8572.18. JANG, M.H., SHIN, M.C., LIM, S., HAN, S.M., PARK, H.J., SHIN, I., LEE, J.S.,KIM, K.A., KIM, E.H., KIM. C.J., 2003, Bee venom induces apoptosis and inhibitsexpression of cyclooxygenase-2 mRNA in human lung cancer cell line NCI-H1299, JPharmacol Sci, 91 (2), 95-104.19. JOSHI, A.D., HEGDE, G.V., DICKINSON, J.D., MITTAL, A.K., LYNCH, J.C.,EUDY, J.D., ARMITAGE, J.O., BIERMAN, P.J., BOCIEK, R.G., DEVETTEN, M.P., VOSE, J.M.,JOSHI, S.S., 2007, ATM, CTLA4, MNDA, and HEM1 in high versus low CD38expressing B-cell chronic lymphocytic leukemia, Clin Cancer Res, 13 (18 Pt 1), 5295-5304. 20. KARMALI, R., LARSON, M.L., WOOLDRIDGE, J.E., GREGORY, S.A.,O'BRIEN, T., SHAMMO J.M., BUESCHEL, K., VENUGOPAL, P., 2011, Granulocyte-macrophage colony stimulating factor-induced immune priming ofcyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone with rituximabchemoimmunotherapy in previously untreated patients with diffuse large B-celllymphoma and mantle cell lymphoma, Leuk Lymphoma, 52 (11), 2097-2104.21. KOMAROVA, E.A., DIATCHENKO, L., ROKHLIN, O.W., HILL, J.E., WANG,Z.J., KRIVOKRYSENKO, V.I., FEINSTEIN, E., GUDKOV, A.V., 1998, Stress-inducedsecretion of growth inhibitors: a novel tumor suppressor function of p53, Oncogene,17 (9), 1089-1096.22. LIU, X., CHEN, D., XIE, L., ZHANG, R., 2002, Effect of honey bee venom onproliferation of K1735M2 mouse melanoma cells in-vitro and growth of murine B16melanomas in-vivo, J Pharm Pharmacol, 54 (8), 1083-1089.23. LOTEM, J., PELED-KAMAR, M., GRONER, Y., SACHS, L., 1996, Cellularoxidative stress and the control of apoptosis by wild-type p53, cytotoxiccompounds, and cytokines, Proc Natl AcadSci, USA, 93 (17), 9166-9171.24. MCCABE, C.J., BOELAERT, K., TANNAHILL, L.A., HEANEY, A.P.,STRATFORD, A.L., KHAIRA, J.S., HUSSAIN, S., SHEPPARD, M.C., FRANKLYN, J.A.,GITTOES, N.J., 2002, Vascular endothelial growth factor, its receptor KDR/Flk-1, andpituitary tumor transforming gene in pituitary tumors, J Clin Endocrinol Metab, 87(9), 4238-4244.25. MORI, N., KASHANCHI, F., PRAGER, D., 1997, Repression oftranscription from the human T-cell leukemia virus type I long terminal repeat andcellular gene promoters by wild-type p53, Blood, 90 (12), 4924-4932.

Utilizarea compușilor bioactivi din propoliscancerele mamare umane

13

26. ORSOLIC, N., SVER, L., VERSTOVSEK, S., TERZIC, S., BASIC, I., 2003c,Inhibition of mammary carcinoma cell proliferation in vitro and tumor growth invivo by bee venom, Toxicon, 41 (7), 861-870.27. PAL, S., DATTA, K., MUKHOPADHYAY, D., 2001, Central role of p53 onregulation of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor(VPF/VEGF) expression in mammary carcinoma, Cancer Res, 61 (18), 6952-6957.28. RUIZ-RUIZ, C., ROBLEDO, G., CANO, E., REDONDO, J.M., LOPEZ-RIVAS,A., 2003, Characterization of p53-mediated up-regulation of CD95 gene expressionupon genotoxic treatment in human breast tumor cells, J BiolChem, 278 (34), 31667-31675. 29. SARKAR, F.H., LI, Y., WANG, Z., KONG, D., 2009, Cellular signalingperturbation by natural products, Cell Signal, 21 (11), 1541-1547.30. SAWICKA, D., CAR, H., BORAWSKA, M.H., NIKLINSKI, J., 2012, Theanticancer activity of propolis, Folia Histochem Cytobiol, 50 (1), 25-37.31. SHIVAPURKAR, N., REDDY, J., MATTA, H., SATHYANARAYANA, U.G.,HUANG, C.X., TOYOOKA, S., MINNA, J.D., CHAUDHARY, P.M., GAZDAR, A.F., 2002, Lossof expression of death-inducing signaling complex (DISC) components in lungcancer cell lines and the influence of MYC amplification, Oncogene, 21 (55), 8510-8514. 32. SHU, J., WU, C., WU, Y., LI, Z., SHAO, S., ZHAO, W., TANG, X., YANG, H.,SHEN, L., ZUO, X., YANG, W., SHI, Y., CHI, X., ZHANG, H., GAO, G., SHU, Y., YUAN, K., HE,W., TANG, C., ZHAO, Y., DENG, H., 2013, Induction of pluripotency in mouse somaticcells with lineage specifiers, Cell, 153 (5), 963-975.33. SZLISZKA, E., CZUBA, Z.P., DOMINO, M., MAZUR, B., ZYDOWICZ, G.,KROL, W., 2009, Ethanolic extract of propolis (EEP) enhances the apoptosis -inducing potential of TRAIL in cancer cells, Molecules, 14 (2), 738-754.34. TERME, M., PERNOT, S., MARCHETEAU, E., SANDOVAL, F.,BENHAMOUDA, N., COLUSSI, O., DUBREUIL, O., CARPENTIER, A.F., TARTOUR, E.,TAIEB, J., 2013, VEGFA-VEGFR pathway blockade inhibits tumor-induced regulatoryT-cell proliferation in colorectal cancer, Cancer Res, 73 (2), 539-549.35. WANG, D., YAMAMOTO, S., HIJIYA, N., BENVENISTE, E.N., GLADSON,C.L., 2000, Transcriptional regulation of the human osteopontin promoter:functional analysis and DNA-protein interactions, Oncogene, 19 (50), 5801-5809.

Flaviu Drîglă

14