Uravnavanje encimske aktivnosti

• Uvod • Mehanizmi encimske katalize • Inhibicija encimov • Modulacija aktivnosti alosteričnih encimov • Uravnavanje encimske aktivnosti:

- uravnavanje koncentracije encimov - spreminjanje encimskega okolja - aktivacija encimov s proteolitičnim razcepom (prebava, strjevanje krvi) - alosterična modulacija encimske aktivnosti - kovalentna modifikacija encima → spremenjena

encimska aktivnost - sinteza specifičnih proteinskih encimskih inhibitorjev

Mehanizmi encimske katalize

• Kompleks ES stabilizirajo šibke interakcije

• Sledi razcep ES in nastanek vezi po različnih mehanizmih, ki vključujejo prehodni nastanek kovalentnih vezi

• MEHANIZMI

- približanje in orientacija (praktično vedno!)

- splošna in specifična kislinsko-bazna kataliza

- kovalentna kataliza

- kataliza s kovinskimi ioni

POSPEŠITEV REAKCIJE LE ZARADI PRIBLIŽANJA IN ORIENTACIJE

Mehanizem encimskih reakcij:

Specifična/splošna kislinsko-bazna kataliza primer: razcep amida

encim

Encim: -OH, B in AH ! Splošna!!! Specifična!!!

Kislinsko-bazna kataliza:

• Specifična - proton donor in proton akceptor je molekula H2O

• Splošna - proton donor in proton akceptor je druga molekula (šibke organske kisline in šibke baze)

• Večina encimskih reakcij poteka po mehanizmu splošne kislinsko-bazne katalize

• Aktivna mesta encimov vsebujejo aminokislinske ostanke, ki so šibke kisline in šibke baze

• Povečanje hitrosti reakcije za 100 – 100.000 krat

Aminokislinski ostanki, ki lahko sodelujejo v splošni kislinsko-bazni katalizi

pK vrednosti ak, ki sodelujejo v splošni kislinsko bazni katalizi (pozor: vrednost pKR se lahko zelo spremeni, ko je AK

vpeta v polipeptidno verigo – ZARADI BLIŽINE DRUGIH SKUPIN – INDUKTIVNI EFEKT)

His 1,82 9,17 6,00

Asp 1,88 9,60 3,65

Glu 2,19 9,67 4,25

Lys 2,18 8,95 10,53

Cys 1,96 10,28 8,18

Tyr 2,20 9,11 10,07

aminokislina pK1 pK2 pKR !

pK1 in pK2 sta pomembna le kadar je AK na N ali C koncu!

Kovalentna kataliza

• Med encimom in substratom nastane prehodna kovalentna vez

• Primer: hidroliza vezi med A in B

• Katalizator: encim z nukliofilno skupino X: se prehodno kovalentno veže na substrat

• Reakcija je hitrejša, če ta pot poteka preko nižje energijske bariere kot nekatalizirana reakcija

Primer kovalentne in kislinsko-bazne katalize: razcep peptidne vezi

R1−COOH R2−NH2

1. stopnja: kovalentna kataliza

2. stopnja: kislinsko-bazna kataliza

H+

H2O

katalitična ‘kaskada’ pri tripsinu (analogno je pri

kimotripsinu)

-OH skupina Ser postane veliko reaktivnejša zaradi bližine in

orientacije His in Asp (induktivni efekt!)

• Kovinski ioni so ali trdno vezani na encim ali prihajajo iz okolja • Ionske in/ali koordinativne vezi med ionom in substratom

orientirajo substrat v položaj za reakcijo in stabilizirajo prehodno stanje

• Lahko pride do izmenjave elektronov med kovinskim ionom in substratom (oksidoredukcijska reakcija)

• Približno ena tretjina encimov potrebuje kovinski ion za svojo aktivnost

Primer: metaloproteinaze

Kataliza s kovinskimi ioni

Modulatorji encimske aktivnosti

• Aktivatorji – encimska aktivnost ↑

• Inhibitorji – ecimska aktivnost ↓

- reverzibilna inhibicija - kompetitivna

- akompetitivna

- mešana (npr. nekompetitivna)

- ireverzibilna inhibicija

Encimska inhibicija - uporaba

• Inhibitorji encimov –pomembne farmacevtske učinkovine (npr. aspirin inhibira sintezo prostaglandinov)

• Uporaba inhibitorjev pri študiju mehanizma encimskih reakcij

• Uporaba inhibitorjev pri študiju metaboličnih poti

A → B? → C → D

Inhibitor encima E2, kopičenje vmesnega produkta B,

Sklepamo lahko, da poteka zaporedje reakcij preko B in E2

E1 E2 E3

Kompetitivna inhibicija

Akompetitivna inhibicija Mešana (nekompetitivna) inhibicija

Reverzibilna inhibicija Inhibitor se veže s šibkimi interakcijami na encim!

Kompetitivna inhibicija

S in I sta si podobna in se vežeta na isto mesto, a nikoli sočasno!

Kompetitivna inhibicija

brez inhibitorja z inhibitorjem

Vmax se ne spremeni

Km se poveča (zmanjša se afiniteta za S)

Kompetitivna inhibicija (spremenjena Km)

dvojni recipročni diagram

-1/αKm

Akompetitivna inhibicija (spremenjena Km in Vmax)

dvojni recipročni diagram

Mešana inhibicija (spremenjena Km in Vmax)

dvojni recipročni diagram

Ki = Ki’

a = a’ X

X

Poseben primer mešane kompeticije: nekompetitivna inhibicija (spremenjena Vmax, Km pa ne!)

dvojni recipročni diagram

Ki = Ki’

Bakrov ion (uporablja se CuSO4) je nekompetitivni inhibitor katalaze.

Vmax

Vimax

Km = Kim

Vmax se zmanjša

Km se ne spremeni

Kompetitivna inhibicija Nekompetitivna inhibicija

Akompetitivna inhibicija Mešana inhibicija

DIAGNOSTIČNI DIAGRAMI ZA RAZLIČNE VRSTE INHIBICIJE

Ireverzibilna inhibicija – inhibitor se ireverzibilno veže v aktivnem mestu encima; vez je kovalentna

serin, Ser

Primer: reakcija kimotripsina ali acetilholin-esteraze (v aktivnem mestu je Ser) z diizopropilfluorofosfatom (DIFP)

ENCIM JE TRAJNO OKVARJEN!

acetiholin + voda → ocetna kislina + holin, encim = AChE (serinska hidrolaza)

živčni bojni strup

pesticid

Spojine, kot so nekateri pesticidi ... se ireverzibilno vežejo na encim

acetilholin-esterazo (AChE), ki hidrolizira nevrotransmitor acetilholin

Živčni bojni strupi in večina pesticidov so ireverzibilni inhibitorji AChE!

Inhibitorji so lahko strupi – kako postopati ob zastrupitvah?

• Pri reverzibilnih inhibitorjih uvesti substrat v visoki koncentraciji

• Pri ireverzibilnih inhibitorjih uvesti sredstvo, ki veže inhibitor z večjo afiniteto kot encim

Uravnavanje encimske aktivnosti

• Glede na potrebe celice se encimska aktivnost poveča ali zmanjša – uravnavanje encimske aktivnosti

• Uravnavanje poteka na več ravneh in na več načinov:

- uravnavanje koncentracije encimov

- aktivacija encimov s proteolitičnim razcepom (prebava, strjevanje krvi, delovanje hormonov...)

- kovalentna modifikacija encima → spremenjena encimska aktivnost

- alosterična modulacija encimske aktivnosti

- sinteza specifičnih proteinskih encimskih inhibitorjev

Koncentracija encima vpliva na hitrost reakcije

Ei – koncentracija encima

Glede na potrebe celice se sintetizira več encima → več substrata

se pretvori v produkt v določenem času - višja encimska aktivnost

Konstitutivni in inducibilni encimi!

Ev 0

[E]

v0

Aktiviranje encima s proteolitičnim razcepom: z neaktivnega encima (zimogen/proencim/-ogen) se odcepi

določen peptidni del → aktivni encim

Primer:

aktiviranje prebavnih

proteolitičnih encimov

tripsina in kimotripsina

Uravnavana aktivacija in izločanje zimogenov

Stryer

Stryer

Kaskada v procesu strjevanja krvi

Kaskada zaradi pomnoževanja učinka močno poveča učinkovitost procesa! Večina faktorjev strjevanja je serinskih proteinaz. Končno faktorja X in V cepita protrombin v aktivno proteinazo trombin, ta pa odcepi dele fibrinogena, da nastane fibrin, ki polimerizira.

Hemofilija: mutiran faktor VIII (hemofilija A, 80%) ali mutiran faktor IX (hemofilija B, 20%).

Hemofilija - napaka v procesu strjevanja krvi

trombinogen trombin

Va

fibrinogen fibrin

http://biology.clc.uc.edu/courses/bio105/sex-link.htm

Hemofilija med monarhi Evrope

Alosterična modulacija encimske aktivnosti

• Alosterični encimi – več podenot (katalitska, regulatorna)

• Aktivnost uravnavajo alosterični modulatorji (majhne molekule)

• Modulatorji se vežejo (šibke interakcije) na regulatorno podenoto → sprememba konformacije regulatorne podenote → spremamba konformacije katalitske podenote → sprememba na aktivnem mestu – spremenjena encimska aktivnost

• Modulatorji so aktivatorji ali inhibitorji

• Modulatorji: substrat (homotropična modulacija) ali druge molekule (heterotropična modulacija). Za regulacijo je bistvena heterotropična modulacija.

homotropična modulacija heterotropična modulacija

Dve vrsti modulatorjev alosteričnih encimov

modulatorji vplivajo na Km modulatorji vplivajo na Vmax

heterotropična alosterija!

S S

M M

K0,5+ K0,5+ K0,5 K0,5-

Regulatorni encim – shematski prikaz aktivacije encima z vezavo aktivatorja M na regulatorno podenoto

katalitska podenota regulatorna podenota

Aspartat transkarbamoilaza (ATCaza) je alosterični encim

-Sodeluje v zgodnjih stopnjah sinteze pirimidinskih nukleotidov

-Ima 12 polipeptidnih enot, tako regulatorne (rdeča in rumena), kot katalitične

(modra in vijolična)

- Alosterični modulatorji se vežejo na regulatorne podenote

Dve konformaciji ATCaze

Stryer, Biochemistry

Vezava CTP na regulatorne enote stabilizira manj aktivno stanje T

Alosterični regulatorji ATCaze uravnavajo ravnotežje za

prehod iz T v R obliko

CTP stabilizira T (manj aktivno) stanje

ATP je pozitivni alosterični efektor (velikokrat!).

Inhibicija s povratno zvezo!

L-izolevcin (Ile) je negativni alosterični

modulator E1 ( treonin-dehidrataze, TDH).

Ki za vezavo Ile na alosterično (modulatorsko)

mesto TDH določa koncentracijo Ile.

;][

]].[[

IleTDH

IleTDHKi

][

][

][ IleTDH

TDH

Ile

Ki

INHIBICIJA S POVRATNO ZVEZO

(FEED-BACK INHIBITION)

(Ile)

Sinteza Ile iz

Thr poteka v 5

stopnjah, ki jih

katalizira 5

encimov (E1-E5)

Shema pozitivne alosterične modulacije encimske aktivnosti: substrat A aktivira encim, ki pretvarja B→C ali E→F

substrat lahko izbere pot ( A D ali A F)

Izoencimi so značilni način uravnavanja v različnih tkivih in razvojnih stanjih

Stryer:

-Izencimi (izocimi) so encimi, ki se razlikujejo v aminokislinskem zaporedju, a

katalizirajo isto reakcijo

-Imajo drugačne kinetične parametre in odgovarjajo na različne signale (modulatorje).

-Primer: laktatna dehidrogenaza – izoencimi se razlikujejo v vrstah in sestavi podenot

H4 je izražen v srcu, deluje v aerobnih pogojih, predvarja laktat v piruvat (‚hrana‘ za srce),

piruvat je alosterični negativni modulator; M4 je izražen v mišici in jetrih, v anaerobnih

pogojih pretvarja piruvat v laktat (glikoliza), piruvat ni modulator. H in M imata 75%

aminokislin enakih (75% identičnost).

H4

H2M2

HM3

M4

H3M

dnevi pred (-) in po rojstvu (+)

Kovalentna modifikacija encima → spremenjena encimska aktivnost Vrste kovalentne modifikacije encimov

fosforilacija

adenilacija

uridilacija

ADP-ribozilacija

metilacija

Primer uravnavanja encimske aktivnosti s kovalentno modifikacijo (fosforilacijo)

Adrenalin → β-adrenergični receptor → → → cAMP → aktivirana metabolična pot: koncentracija glukoze

kofein inhibira fosfodiesterazo

adrenalin (epinefrin)

fosfodiesteraza

•kinaze •fosforilacija proteinov •razgradnja glikogena

•glukoza Razgradnja cAMP – inaktivacija

Encimi, ki fosforilirajo proteine so kinaze

encima: razgradnja glikogena – E = glikogenska fosforilaza

Aktivnost glikogenske fosforilaze je uravnavana s

fosforiliranjem / defosforiliranjem encima

• cAMP • kinaze • fosforilacija proteinov (glikogen fosforilaze) • razgradnja glikogena z glikogen fosforilazo • glukoza

E

Primer uravnavanja encimske aktivnosti s fosforilacijo

kinaza

Aktivacija glikogen fosforilaze s fosforiliranjem

fosforilaza-kinazo

aktivira zunanji signal

(cAMP)

fosforilaza-fosfataza deaktivira glikogen fosforilazo

Uravnavanje razgradnje glikogena (kadar potrebujemo glukozo)

Takšno uravnavanje je pogosto preko encimske kaskade, kar poveča učinkovitost (pomnoževanje učinka)!

Glikogen fosforilaza v mišici je uravnavana preko številnih mehanizmov

Proteinske kinaze sestavljajo družino proteinov

Prepoznavna sekvenca na substratu

Nekateri encimi uporabljajo več različnih regulatornih mehanizmov

Glikogen sintaza je lahko fosforilirana na najmanj 9 mestih in to z različnimi kinazami. Fosforilacija INAKTIVIRA glikogen sintazo.

Kinase 1

Kinase 2

Kinase 3

Phosphorylation Cascade

P

P

P

ogrodni protein

Kinaze običajno delujejo v kaskadah, kar poveča njihovo učinkovitost, ker se signal pomnožuje. Včasih jih v kaskade pomaga organizirati ogrodni protein, ki jih ‚drži‘ skupaj.

pomnoževanje signala

Fosforilacijska kaskada

Uravnavanje encimske aktivnosti s sintezo specifičnih inhibitorjev

•Značilno za proteinaze, ki morajo biti strogo uravnavane, drugače razpad celic.

•Znani naravni inhibitorji proteinaz - proteini trdno in specifično vezani na izbrani

encim – preprečijo njegovo delovanje.

•Inhibicija je uravnavana na genski ravni z regulacijo sinteze inhibitorjev v celici.

•PRIMER 1: α1-antitripsin v pljučih. Tobačni dim oksidira ključni Met v tem

proteinu, ki zato ne deluje - ne inhibira tripsina. Prevelika aktivnost tripsina v

pljučih uničuje pljučno tkivo. Posledica: kronični bronhitis in emfizem pri kadilcih.

•PRIMER 2: pankreatični antitripsin

•PRIMER 3: Stefin (odkrit na IJS), inhibira katepsine

Regulatorni encimi- povzetek

-Regulatorni encimi uravnavajo aktivnosti metaboličnih poti.

-Če gre za uravnavanje s povratno zanko (feed back mehanizem), končni produkt

reakcije inhibira prvo encimsko stopnjo.

-Aktivnosti alosteričnih encimov so naravnavane z reverzibilno vezavo

specifičnega modulatorja na regulatorno mesto.

-Modulator je lahko substrat ali drug metabolit (največkrat!).

-Kinetične zakonitosti alosteričnih encimov ponazarjajo kooperativne interakcije

med podenotami encima.

-Nekateri regulatorni encimi spreminjajo svojo aktivnost s kovalentno modifikacijo,

pri čemer je najpogostejša fosforilacija določenih aminokislinskih ostankov.

-Mnogi proteolitski encimi se sintetizirajo kot prekurzorji(cimogeni), ki se kasneje

aktivirajo s proteolitsko cepitvijo.

-Najpomembnejši encimi so uravnavani preko več regulatornih mehanizmov u

različnimi efektorji, kar omogoča koordinacijo aktivnosti različnih med seboj

povezanih signalnih poti.