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UNIVERSIDADE VALE DO RIO DOCE – UNIVALE

PROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

NÚCLEO DE PESQUISA EM IMUNOLOGIA

GABRIELLA FREITAS FERREIRA

AVALIAÇÃO DE FATORES IMUNOLÓGICOS NA OSTEOMIELITE

ESTAFILOCÓCICA CRÔNICA

GOVERNADOR VALADARES

2009

GABRIELLA FREITAS FERREIRA

AVALIAÇÃO DE FATORES IMUNOLÓGICOS NA OSTEOMIELITE

ESTAFILOCÓCICA CRÔNICA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Biológicas da Universidade Vale do Rio Doce, para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas na área de Imunopatologia das Doenças Infecciosas e Parasitárias.

Orientador: Dr. Luiz Cosme Cotta Malaquias

Co-orientadora: Dra Lúcia Alves de Oliveira Fraga

GOVERNADOR VALADARES

2009

Reconhecida pelo Parecer nº 16/92 CFE Portaria 1037/92 MEC

Mantenedora: FUNDAÇÃO PERCIVAL FARQUHAR

Ata da Banca Examinadora de Dissertação de Mestrado Intitulada:

“AVALIAÇÃO DE FATORES IMUNOLÓGICOS NA OSTEOMIELITE

ESTAFILOCÓCICA CRÔNICA”

Aos trinta e um dias do mês de março de 2009, às 13:00 hs, na sala 01 do edifício

Pioneiros no campus Antônio Rodrigues Coelho da Universidade Vale do Rio Doce,

reuniu-se a Comissão Examinadora da Dissertação de Mestrado da aluna Gabriella

Freitas Ferreira. A defesa da dissertação iniciou-se pela apresentação oral feita pela

candidata e, em seguida, argüição pelos membros da banca. Ao final, os membros da

banca examinadora reuniram-se e decidiram por

..................................................................................

Membros da Banca Examinadora:

____________________________________________ Prof. Dr. Luiz Cosme Cota Malaquias

Presidente

_____________________________________________ Examinador

____________________________________________

Examinadora

DATA DA DEFESA: 31/03/09

EXECUÇÃO DO TRABALHO:

Laboratório de Pesquisa em Imunologia da Universidade Vale do Rio Doce (UNIVALE),

Governador Valadares, MG.

COLABORADORES:

Universidade Vale do Rio Doce

Maria de Fátima da Silva

Marlucy Rodrigues Lima

Lilia Cardoso Pires

Ivanete dos Santos Nascimento

Centro de Pesquisas René Rachou

Drª Andréa Teixeira de Carvalho

Universidade Federal do Estado de Minas

Gerais

Drº Simeão do Carmo

Hospital Municipal de Governador

Valadares

Médico Ms Cícero Moraes

Enfermeiro Anízio Pereira Brito

ÓRGÃOS FI>A>CIADORES:

Universidade Vale do Rio Doce - UNIVALE

Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais – FAPEMIG

Dedico este trabalho

A Deus, Pai Onipotente, por tudo aquilo que me lega ao longo da vida.

AGRADECIME>TOS

Ao meu orientador, professor doutor Luiz Cosme Cotta Malaquias, cuja orientação permitiu a

realização deste estudo.

À minha co-orientadora, professora doutora Lúcia Alves de Oliveira Fraga, pelas informações

e ensinamentos concedidos. Além de mestre, foi para mim uma grande amiga.

Aos amigos do Laboratório de Pesquisa em Imunologia da UNIVALE, especialmente Lília,

Fátima e Marlucy, pelo constante apoio e incentivo.

À professora doutora Andréa Teixeira de Carvalho, pelo apoio técnico fornecido.

Aos professores do curso de Mestrado em Ciências Biológicas da UNIVALE, em especial a

professora doutora Alda Maria Soares Silveira, pelos ensinamentos que contribuíram

intensamente para minha formação.

Ao professor mestre Cícero Moraes e ao enfermeiro Anízio Pereira Brito pela especial

colaboração neste trabalho.

Aos meus pais, meu noivo e familiares, por sempre acreditarem em mim.

Ao Hospital Municipal de Governador Valadares, pelos dados fornecidos.

Àqueles participantes deste estudo, pela oportunidade de aprendizado.

E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

RESUMO

A osteomielite, caracterizada por um processo infeccioso no tecido ósseo, tem como principal

agente etiológico o Staphylococcus aureus. O objetivo desse trabalho foi avaliar a resposta

imune de pacientes na fase crônica da osteomielite estafilocócica e comparar com a resposta

de indivíduos não portadores da doença. Este estudo incluiu 20 indivíduos portadores de

osteomielite crônica, residentes em Governador Valadares e região, e 20 indivíduos não

portadores da doença, sem história de infecção articular-óssea, como grupo controle. Os

critérios de inclusão de pacientes nesse estudo foram infecção por S. aureus, presença do

seqüestro ósseo e fístulas em um período menor ou igual a um ano. Células mononucleares

do sangue periférico (PBMC) foram estimuladas in vitro com a toxina estafilocócica A (SEA)

e com o mitógeno fitohematoglutinina A (PHA) e avaliadas quanto à proliferação celular e à

produção das citocinas interferon-gama (IFN-γ), fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α),

interleucina-2 (IL-2), IL-6, e IL-10 por citometria de fluxo. A concentração plasmática de

óxido nítrico (NO) foi determinada. Nossos resultados mostraram uma forte correlação

positiva entre IFN-γ, TNF-α e IL-10, e uma reduzida produção de IL-6 pelas PBMC dos

pacientes frente ao SEA. O estudo proposto sugere que os pacientes com osteomielite

estafilocócica crônica apresentam alterações na resposta imune relacionadas com a produção

das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-10 e do NO. A presença de IL-10 nos sobrenadantes das

culturas de PBMC estimuladas pelo SEA poderia indicar um papel dessa citocina na

cronificação da doença, resultando na diminuição da IL-6 e do NO.

Palavras-chave: Osteomielite crônica. Staphylococcus aureus. Resposta imune.

ABSTRACT

Osteomyelitis is an inflammatory reaction in the bone accompanied by bone destruction.

Most of the cases are caused by Staphylococcus aureus. The aim of this study was to evaluate

the immune response of chronic osteomyelitis patients comparing to individuals without the

disease. This study included 20 chronic osteomyelitis patients and 20 normal individuals

without history of bone and joint infection as a control both from Governador Valadares,

Brazil. The inclusion criteria were the presence of S. aureus infection, bone sequestrum and

fistulous in less than a year. Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) were stimulated in

vitro by staphylococcal toxin A (SEA) and mitogen phytohemagglutinin A (PHA) and

evaluated the cellular proliferation and the production of the cytokines interferon-gama (IFN-

γ), tumor necrosis factors-alfa (TNF-α), interleukin-2 (IL-2), IL-6, e IL-10 by flow cytometry

technique. Also, the levels of nitric oxide (NO) in the plasma were determinate. Our results

showed a strong correlation among IFN-γ, TNF-α e IL-10, and low production of IL-6 by

PBMC from patients in presence of SEA. This study suggest that chronic osteomyelitis

patients has impairment of immune response associated with the cytokines IFN-γ, TNF-α, IL-

6, IL-10 production and of NO. The presence of IL-10 in the SEA-stimulated PBMC

supernatants could point out a role in the chronic disease, resulting in low IL-6 and NO

production.

Key-words: Chronic osteomyelitis. Staphylococcus aureus. Immune response.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Avaliação da concentração de estímulo utilizada para o teste de proliferação de

PBMC de pacientes com osteomielite e indivíduos do grupo controle estimuladas por SEA ou

PHA -------------------------------------------------------------------------------------------------------50

Figura 2 – Proliferação de PBMC de pacientes com osteomielite e indivíduos do grupo

controle estimuladas por SEA ou PHA ---------------------------------------------------------------28

Figura 3 – Produção de citocinas IFN-γ, TNF-α por PBMC de pacientes com osteomielite e

indivíduos controle---------------------------------------------------------------------------------------29

Figura 4 – Produção de citocinas IL-10. IL-2 por PBMC de pacientes com osteomielite e


Figura 5 - Produção de citocina IL-6 por PBMC de pacientes com osteomielite e indivíduos

controle----------------------------------------------------------------------------------------------------31

Figura 6– Níveis plasmáticos de NO em pacientes com osteomielite estafilocócica crônica e


LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Perfil clínico dos pacientes com osteomielite estafilocócica crônica----------------26

Tabela 2 – Avaliação de parâmetros laboratoriais dos pacientes com osteomielite

estafilocócica crônica------------------------------------------------------------------------------------27

Tabela 3 – Correlação entre a produção de citocinas frente ao SEA------------------------------30

Tabela 4 - Freqüência de indivíduos alto e baixo produtores de IL-6 no grupo de pacientes e

de indivíduos controle-----------------------------------------------------------------------------------32

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

µµµµg – micrograma

µµµµL – microlitro

µµµµM– micromolar

ºC – Graus centígrados

C3b – Fragmento do complemento 3b

CD4 – Cluster of differention 4 positivo

CD8 – Cluster of differention 8 positivo

CO2 – dióxido de carbono

DP – Desvio Padrão

ELISA – enzyme-linked immunosorbent

assay

FAD – Flavina Adenina Dinucleotídeo

FAPEMIG – Fundação de Amparo a

Pesquisa de Minas Gerais

FM> – Flavina Monocleotídeo

H3PO4 – Ácido Fosfórico

IgA - Imunoglobulina A

IgE – Imunoglobulina E

IgG – Imunoglobulina G

IgM – Imunoglobulina M

IL-1 – Interleucina 1

IL-2 - Interleucina 2





IL-12 p40 - Interleucina 12 p40

IL-12 p75 - Interleucina 12 p75




IL-10- Interleucina 10


I>F-γ– Interferon gama

>OS - Óxido Nítrico Sintase

c>OS – Óxido Nítrico Sintase constitutiva

i>OS - Óxido Nítrico Sintase indutiva

máx. – máximo

MEM – minimum essencial medium

MHC II - complexo de

histocompatibilidade principal classe II

min. – mínimo

mm - milímetro

mm3 - milímetro cúbico

mM - milimolar

>ADPH – Fosfato de Nicotinamida

Adenina Dinucleotídeo reduzido

nm - nanômetro

>O – Óxido Nítrico

>O-2 – Íon nitrito

>O-3 – Íon nitrato

>a>O2 – Nitrato de Sódio

PBMC - Células mononucleares do sangue

periférico

PHA - fitohematoglutinina A

PCR – Proteína C Reativa

Q1 - Primeiro quartil

Q3 - Terceiro quartil

RPM – Rotações por minuto

RPMI - Roswell Park Memorial Institute

medium

SEA - Toxina estafilocócica A

SEB - Toxina estafilocócica B

SEC - Toxina estafilocócica C

TCR - Receptor de linfócitos T

TH1– Resposta de linfócitos T helper tipo

1

TH2 –Resposta de linfócitos T helper tipo

2

TGF-β – Fator de Crescimento

Transformante

TSST-1 - Toxina da síndrome do choque

tóxico

T>F–α – Fator de necrose tumoral gama

U/mL – Unidade por mililitro

U>IVALE – Universidade do Vale do Rio

Doce

ZnSO4 – Sulfato de Zinco

SUMÁRIO

1. I>TRODUÇÃO ..............................................................................................................14

2. JUSTIFICATIVA...........................................................................................................20

3. OBJETIVO GERAL ......................................................................................................21

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................21

4. MATERIAIS E MÉTODOS..........................................................................................22

5. RESULTADOS...............................................................................................................26

5.1 PERFIL CLÍNICO-HEMATOLÓGICO E SÓCIO-DEMOGRÁFICO DOS INDIVÍDUOS

COM OSTEOMIELITE ESTAFILOCÓCICA CRÔNICA ....................................................26

5.2 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS

MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO ..............................................................29

5.3 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE CITOCINAS IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-2 e IL-6

............... ...................................................................................................................................30

5.4 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE NO .........................................................................34

6. DISCUSSÃO ...................................................................................................................35

7. CO>CLUSÃO.................................................................................................................41

8. REFERÊ>CIAS BIBLIOGRÁFICAS .........................................................................42

9. A>EXOS .........................................................................................................................50

1. I>TRODUÇÃO

A osteomielite, doença caracterizada por um processo infeccioso no osso, apresenta a

forma clínica aguda que pode evoluir para cura ou para a forma crônica ou até mesmo levar à

septicemia e morte. O tratamento e a resposta imunológica do paciente são fundamentais

nessa evolução, existindo uma maior ocorrência da forma aguda em crianças

imunodeprimidas (DORMANS & DRUMMOND, 1994; LAZZARINI et al., 2004).

Atualmente a osteomielite crônica representa a complicação mais séria dos traumas,

provavelmente devido ao aumento de acidentes com veículos motorizados. A prevalência da

osteomielite crônica é de 2 casos para cada 10.000 pessoas e 30% das osteomielites agudas se

transformam em crônicas (KLOSTERHALFEN et al., 1996; CIAMPOLINI & HARDING,

2000).

Historicamente, a osteomielite tem sido classificada de acordo com a forma clínica

apresentada pelo paciente: aguda, subaguda e crônica (CAREK et al., 2001; LAZZARINI et

al, 2004). Por causa da complexidade dessa infecção, vários sistemas de classificação

surgiram a partir das suas vertentes clínicas. A classificação proposta por WALDVOGEL et

al., (1970) divide a osteomielie em hematogênica, secundária a um foco adjacente de infecção

e crônica. Já a classificação proposta por CIERNY et al., (1985) divide a osteomielite em

quatro estágios e baseia-se na anatomia do osso infectado e nas condições clínicas do

paciente.

É importante ressaltar que não existe um critério claro que distingue a osteomielite aguda

da crônica. Alguns definem a osteomielite como crônica quando os sintomas permanecem por

mais de um mês, no entanto outros defendem um período maior de seis meses

(WALDVOGEL et al., 1970; WEILAND et al., 1984, DORMANS & DRUMMOND, 1999).

Do ponto de vista clínico, a primeira infecção é considerada aguda, e a recidiva é considerada

crônica (CAREK et al., 2001). A principal característica da osteomielite crônica é a presença

do osso morto, chamado de seqüestro. O invólucro (a formação de um tecido ósseo sobre o

seqüestro), a perda óssea local e a presença de pus persistente são outras características

comuns da osteomielite crônica. O paciente com osteomielite crônica normalmente apresenta

dor crônica, formação de um sinus com secreção purulenta e febre baixa ou ausente. Exames

laboratoriais indicativos de infecção como por exemplo, a dosagem de proteina C reativa,

apresenta-se ligeiramente elevada. Normalmente não ocorre leucocitose e alterações no

hemograma (CAREK et al., 2001; LAZZARINI et al., 2004; LEE & WALDOGEL, 2004).

O quadro clínico da osteomielite se caracteriza pelo aparecimento de sintomas típicos de

uma doença infecciosa aguda, geralmente um mês após a presença do microrganismo no osso.

Sintomas tais como febre alta, dor metafisária intensa e imobilidade do membro acometido

são comumente observados. Com a progressão da infecção, há uma trombose dos vasos

medulares comprometendo a mobilização das células de defesa imunológica.

Conseqüentemente um exsudato é formado na vizinhança levando a hiperemia, dor e

descalcificação do osso circundante. Há uma reação subperióstica que evolui para o seu

descolamento e necrose óssea. A forma crônica apresenta períodos de latência e reagudização

(MORREY & PETERSON, 1975; LEE & WALDOGEL, 2004; LAZZARINI et al., 2004;

SHEFF, 2005).

As formas mais habituais de infecção ocorrem por via hematogênica, onde um êmbolo

séptico penetra na artéria nutrícia indo se alojar nos capilares metafisários longos e de fluxo

lento, principalmente dos ossos longos. Por via de inoculação direta, a osteomielite se inicia

pela penetração de bactérias através de traumas e contaminações cirúrgicas. E finalmente, por

via indireta, o agente etiológico oriundo de infecções de partes moles vizinhas chega ao tecido

ósseo por meio de uma solução de continuidade (MORREY & PETERSON, 1975;

LAZZARINI et al., 2004).

Constituem os princípios básicos do tratamento da osteomielite a identificação do agente

etiológico, a seleção do antibacteriano apropriado e a cirurgia precoce nos quadros que não

melhoram nas primeiras 24 a 48 horas após tratamento com os antibacterianos (LEE &

WALDOGEL, 2004). O tratamento cirúrgico também deve ser adotado na fase crônica da

doença que consiste na drenagem do abscesso subperiosteal para remover todo o tecido

necrótico (GILMOUR, 1962; LEE & WALDOGEL, 2004).

O Staphylococcus aureus é o principal agente etiológico da osteomielite crônica, sendo

responsável por cerca de 80 a 90% dos casos. São cocos Gram positivos normalmente em

forma de cacho de uva, imóveis e não produzem esporos. Crescem na presença ou não de

oxigênio por respiração aeróbica ou fermentação. Pertencem à família Micrococccaceae e ao

gênero Staphylococcus. Dentro das espécies pode haver uma subdivisão em vários grupos

(NAIR et al., 2000; LEE & WALDOGEL, 2004).

O S. aureus está presente na microbiota normal de 20 a 50% da população mundial.

Estruturas como pele e mucosas funcionam como uma barreira para o S. aureus, prevenindo o

seu acesso a tecidos e órgãos internos. Para essa bactéria causar infecções ósseas, como a

osteomielite, algumas condições são necessárias, tais como: capacidade da cepa de se fixar no

tecido, de evadir as defesas do hospedeiro e de causar danos teciduais. Apesar dessas

condições dependerem em parte, das características intrínsecas do hospedeiro, elas estão

intimamente ligadas aos fatores de virulência produzidos pelo S. aureus. A presença dos

componentes moleculares da parede celular (polissacarídeos e peptideoglicanos) e a

capacidade de secretar proteínas, tais como as exotoxinas, são alguns exemplos desses fatores

de virulência (NAIR et al., 2000).

As exotoxinas estafilocócicas mais conhecidas compreendem três distintos grupos: toxina

da síndrome do choque tóxico (TSST-1) enterotoxinas e toxinas esfoliativas. As enterotoxinas

e a TSST-1 são consideradas superantígenos clássicos e são caracterizadas pela capacidade de

induzir febre alta e agir como mitógeno de células T (MARRACK & KAPPLER, 1990,

BALABAN & RASSOLY, 2000; THOMAS et al., 2007).

Vários estudos demonstraram que as cepas de S. aureus capazes de produzir as

enterotoxinas A, B, C, D ou TSST-1 são mais patogênicas nas infecções ósseas, como a

osteomielite (NAIR et al., 2000). UCHIYAMA et al. (1989) compararam a capacidade

mitogênica e a capacidade de induzir a produção de IL-2 das enterotoxinas A, B, C e TSST-1

a partir de culturas de linfócitos de camundongos e humanos. Os resultados mostraram que as

quatro exotoxinas são fortes ativadores policlonais de células T humanas. No entanto, o

TSST-1 e a enterotoxina estafilocócica A (SEA) foram mais potentes do que a enterotoxina

estafilocócica B (SEB) e a enterotoxina estafilocócica C (SEC). Dentre as enterotoxinas, a

SEA foi a melhor ativadora de células T, induzindo a proliferação dos linfócitos e produção

de IL-2 utilizando-se concentrações bem menores dessa toxina do que das outras exotoxinas.

Nesses experimentos foram utilizadas células esplênicas de camundongos e células

mononucleares do sangue periférico humano. Resultados similares também foram

encontrados por YOKOMIZO et al., (1995).

As enterotoxinas estafilocócicas, SEA, SEB, SEC e TSST-1 consideradas superantígenos,

têm a propriedade de estabelecer uma ligação química direta entre o domínio Vbeta do

receptor de linfócitos T (TCR) e o complexo de histocompatibilidade principal classe II

(MHC II) das células apresentadoras de antígenos (APC) sem requerer um processamento

prévio das enterotoxinas pelas APCs. Essa ligação química produz um sinal que induz a

proliferação policlonal de cerca de 10% a 30% do repertório de células T, sendo as células T

CD4 efetoras a população de células dominante (CALLAHAN et al., 1990; JOHNSON et al.,

1991). Segundo BAVARI & ULRICH (1995) as moléculas CD4 participam da estabilização

da ligação do superantígeno bacteriano, especialmente a SEA e a TSST-1, com o complexo

formado pelo receptor de célula T e a molécula MHC II. Essa ativação induz a produção das

citocinas IL-2, IFN-γ e TNF-α de maneira dose-dependente (YOKOMIZO et al. 1995).

UCHIYAMA et al., (1989) demonstraram que essas mesmas enterotoxinas, SEA e TSST-1,

induzem a proliferação de linfócitos T e secreção de IL-2 e IFN-γ, bem como produção de IL-

1 e TNF-α pelos monócitos. GROSSMAN et al. (1992) mostraram que a produção de TNF-α

pelos monócitos é diretamente proporcional a produção de IFN-γ pelos linfócitos T ativados

pelo SEA e SEB.

Segundo GOODGLICK & BRAUN (1994) a resposta induzida pelos superantígenos é

diminuída pela anergia ou apoptose das células que responderam ao contato inicial com o

superantígeno. A população anérgica é heterogênea e incluem tanto células que não

respondem mais aos superantígenos como também células T regulatórias (IVARS, 2007).

A interação S. aureus e hospedeiro na gênese e evolução da osteomielite têm sido

investigados. Entretanto, muitos dos aspectos imunológicos permanecem ainda pouco

esclarecidos (EID, 1980; ALVAREZ et al. 1992; WAGNER et al., 2003).

Fatores imunológicos, virulência das cepas ou presença de próteses interferem na

resposta do hospedeiro à osteomielite. Pacientes com doenças crônicas granulomatosas,

neutropenias, síndrome da hiper-IgE, deficiências na adesividade dos leucócitos, asplenia,

dentre outras enfermidades possuem maior suscetibilidade à infecções pelo S. aureus

(CARNEIRO-SAMPAIO & COUTINHO, 2007). O S. aureus expressa a proteína A que se

liga à porção Fc de IgG, interferindo na opsonização e na fagocitose dessa bactéria. O S.

aureus também pode escapar do sistema imune através da sua internalização pelo osteoblasto

(JEVON et al., 1999) ou pela formação dos biofilmes microbianos depositados nos sequestros

ósseos ou em próteses médicas, o que também difulta a chegada de antimicrobianos no local

da infecção (RIBEIRO & CONSOLARO, 1999). Os metais usados nas próteses estimulam a

produção de citocinas que interferem na atividade dos linfócitos. O cromo e o titâneo inibem a

capacidade dos linfócitos B e T responderem a mitógenos bem como a produção de IL-2 e

IFN-γ (TSUKAYAMA, 1999). Sem uma resposta imune eficiente, a bactéria não é eliminada

e o paciente passa a desenvolver a forma crônica da osteomielite.

Dada a escassez da literatura em relação à avaliação de fatores imunológicos na

osteomielite crônica humana causada pelo S. aureus, a maioria dos relatos provêm de estudos

realizados em modelos animais. Tem-se demonstrado a participação das citocinas IL-4, IL-6,

IL-10, IFN-γ e TNF-α em camundongos infectados com S. aureus (FERRANTE et al.,1993;

NAKANE et al., 1995). Estes autores demonstraram que TNF-α é importante na resistência

do hospedeiro, provavelmente devido à sua propriedade em aumentar a capacidade de

aderência, de fagocitose, de degranulação e de geração de superóxidos pelos neutrófilos.

Além disso, o TNF-α é capaz de induzir uma maior expressão de receptores para os

fragmentos 3 e 4 do complemento, contribuindo para a melhor eliminação dessa bactéria. Por

outro lado, observaram que o IFN-γ promove proteção apenas na primeira fase da infecção,

tendo um efeito deletério no decorrer da doença. As citocinas IL-4 e IL-10 apresentaram um

efeito protetor nos camundongos infectados pelo S. aureus, por regular a produção do IFN-γ e

a IL-6 não interferiu no curso da infecção.

YOON et al. (1999), demonstraram também em modelos animais, que a infecção óssea

pelo S. aureus poderia diminuir a resposta mediada por células T, diminuindo a produção das

citocinas IL-2 e IFN-γ, em comparação com as citocinas IL-1 e TNF-α. Esse fato poderia

aumentar a gravidade da infecção sistêmica e a destruição óssea na osteomielite hematogênica

aguda.

Tanto em humanos como em modelos animais, verificou-se que o S. aureus é

internalizado pelo osteoblasto (NICHOLSON & BENTO, 1999). Normalmente, a bactéria

vive livre no citoplasma e não interfere na diferenciação do osteoblasto para ostiócito. Os

osteoblastos infectados secretam IL-6, IL-12p40 e IL-12p75. Essas citocinas estimulam os

osteoclastos e inibem a produção da matriz celular, provocando a formação do sequestro

ósseo bem caracterizado na osteomielite crônica (BOST et al., 1999).

Na osteomielte estafilocócica crônica humana, SCHLUTER et al., (1991) mostraram que

os pacientes apresentavam menor resposta ao teste de hipersensibilidade cutânea e menor

proliferação dos linfócitos T frente à fitohemaglutina, em comparação com indivíduos não

portadores da doença. Entretanto, esses pacientes apresentavam proliferação normal dos

linfócitos B frente a um lisado de S. aureus, níveis normais de anticorpos IgG no soro e uma

diminuição na relação CD4+/CD8+. Além disso, quando induziram a produção de anticorpos

policlonais dependentes de células T in vitro, observaram uma reduzida produção de

anticorpos. Resultados semelhantes foram encontrados por ALVAREZ et al. (1992).

Nos casos de osteomielite crônica pós-traumática, tem-se observado alterações no

sistema imunológico relacionadas com uma menor atividade do sistema complemento,

decréscimo no potencial fagocitário e microbicida dos macrófagos e granulócitos bem como

diminuição da expressão de receptores C3b nos fagócitos (HIERHOLZER & HIERHOLZER,

1982; SCHLUTER et al., 1991).

A participação do óxido nítrico (NO) nos processos infecciosos causados pelo S. aureus

também tem sido relatada. O NO é um gás incolor à temperatura ambiente, pouco solúvel em

água e altamente reativo, que possui vida média de 5 a 30 segundos devido a sua rápida

oxidação, com conseqüente geração de nitritos (NO-2) e nitratos (NO-

3) (QUEIROZ &

BATISTA, 1998). A reação bioquímica envolvida na produção de NO é catalisada pela

enzima óxido nítrico sintase (!itric Oxide Sinthase – NOS), que pode ser constitutiva (cNOS)

ou induzida (iNOS) nos processos inflamatórios (MONCADA, 1992).

A atividade da NOS é inibida pelo próprio NO por um sistema de feedback negativo

(ISOBE & NAKASHIMA, 1992; ASSREUY et al., 1993). As citocinas IL-4, IL-10, IL-13 e

TGF-β também são inibidoras da produção de NO (NORMAN & LIEW, 1995). No grupo de

indutores, o IFN-γ, importante ativador de macrófagos, é o que possui a maior capacidade de

estimular a síntese de NO. Adicionalmente, observa-se marcada sinergia entre IFN-γ e outras

citocinas que por si só são incapazes de estimular a síntese de NO (TNF-α, TNF-β, IL-1, IL-2,

IL-6) (VESPA, 1994; NORMAN & LIEW, 1995).

Outros estudos sobre o papel do óxido nítrico em infecções causadas por S. aureus em

camundongos indicaram que o óxido nítrico tem um importante papel em diminuir a

mortalidade dos animais, mas não interfere na resistência do hospedeiro contra infecções

estafilocócicas (SASAKI et al.,1998).

Tendo em vista que na osteomielite estafilocócica crônica humana o padrão de resposta

imune frente a fatores de virulência bacterianos ainda não está bem caracterizado, definimos

para este estudo investigar a resposta de proliferação de células mononucleares do sangue

periférico frente à enterotoxina estafilocócica do tipo A, a produção de citocinas e a presença

do óxido nítrico no soro de indivíduos portadores dessa infecção.

2. JUSTIFICATIVA

A osteomielite representa uma importante causa de morbidade em todo o mundo com

uma alta incidência em nosso meio. Somente no Hospital Municipal de Governador

Valadares, nos anos de 2001 a 2006, foram identificados 352 casos de osteomielite, sendo

65% do sexo masculino e 35% do sexo feminino. Do total de internações, 59,67% foram

tratadas cirurgicamente e 40,33% com tratamento conservador utilizando antibioticoterapia.

Nesse período, constatou-se um tempo médio de internação dos pacientes de 13,4 dias com

mínimo de 01 e máximo de 133 dias, o que certamente onera o tratamento da osteomielite

para o Sistema Único de Saúde (dados coletados a partir dos prontuários do Hospital

Municipal de Governador Valadares).

As infecções por S. aureus são várias e freqüentes, acometendo cerca de 80 a 90% dos

pacientes com osteomielite. De um modo geral, essas infecções estão relacionadas com

desnutrição e resposta imune deficiente. Tais deficiências podem contribuir para o insucesso

do tratamento, cronificação da osteomielite e até mesmo levar a seqüelas irreversíveis como

deformidades e dificuldades de locomoção.

É importante ressaltar que o perfil imunológico de pacientes portadores de

osteomielite ainda não está bem definido, existindo lacunas sobre a evolução da doença da

forma aguda para a cura ou para a forma crônica.

Dentro deste contexto, o objetivo do trabalho foi avaliar a participação de fatores

imunológicos em indivíduos portadores da forma crônica da osteomielite causada por S.

aureus. Essa pesquisa se faz necessária em virtude da elevada ocorrência de osteomielite em

Governador Valadares, sua importância clínica e o impacto social desta doença na

comunidade.

3. OBJETIVO GERAL

• Avaliar a resposta imune de pacientes na fase crônica da osteomielite causada pelo S.

aureus.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Caracterizar os parâmetros clínico-hematológicos e sócio-demográficos de pacientes

portadores de osteomielite estafilocócica crônica.

• Avaliar a resposta de proliferação de PBMC de pacientes portadores de osteomielite

estafilocócica crônica após estimulação in vitro com a toxina estafilocócica SEA ou

com o mitógeno PHA.

• Avaliar os níveis das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-6 e IL-10 em sobrenadantes de

culturas de PBMC de pacientes portadores de osteomielite estafilocócica crônica após

estimulação in vitro com a toxina estafilocócica SEA ou com o mitógeno PHA.

• Avaliar os níveis de óxido nítrico (NO) no plasma de pacientes portadores de

osteomielite estafilocócica crônica.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

• Caracterização da população de estudo

Este estudo incluiu 20 indivíduos portadores de osteomielite crônica, residentes na cidade

de Governador Valadares e região. Os participantes foram selecionados entre os pacientes

atendidos no Hospital Municipal de Governador Valadares, de janeiro a setembro de 2006. Os

pacientes foram abordados e sua participação dependeu do seu consentimento por escrito.

Foram incluídos 20 indivíduos não portadores da doença, sem história de infecção articular-

óssea, com média de idade de 35 anos, sendo 14 homens e 6 mulheres, como grupo controle,

procedentes do campus da Universidade Vale do Rio Doce

O diagnóstico clínico e o tratamento foram realizados por equipe de médicos do corpo

clínico deste Hospital. A presença de infecção óssea por S. aureus, de fístulas em um período

menor ou igual um ano e do seqüestro ósseo (zona de osso morto) foram os critérios de

inclusão de pacientes nesse estudo. O exame microbiológico foi realizado através da prova da

coagulase positiva e do crescimento em meio de hipertônico manita, seletivo para S. aureus.

Todos os pacientes foram radiografados em pelo menos duas incidências na região acometida

pela doença. Os pacientes foram tratados de acordo com o protocolo previamente estabelecido

pelo profissional do corpo clínico do Hospital. Todo tratamento foi oferecido gratuitamente

pelo serviço de saúde do município, e consistiu na antibioticoterapia com oxaciclina e

drenagem cirúrgica somente nos casos que apresentassem formação de abscessos ósseos. É

importante ressaltar que os pacientes não recebiam terapia corticóide. O consentimento livre e

esclarecido foi obtido de todos os participantes. Em caso de menores, a inclusão somente foi

feita após assinatura do consentimento pelos pais ou guardião. A nenhum indivíduo foi

negado o tratamento, independente da participação no projeto. O projeto possui parecer

aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIVALE (parecer nº 04/2003). Todos os

pacientes possuem uma ficha de atendimento própria do hospital.

• Coleta de sangue e separação de células mononucleares do sangue periférico

Foi coletado um volume de 30 mL de sangue venoso por paciente para extração do

plasma e células. O plasma foi armazenado a menos 20º C até o momento da análise. Foram

utilizados tubos heparinizados, estéreis a vácuo e descartáveis. A coleta foi realizada por

pessoal técnico qualificado, respeitando as técnicas de biossegurança, tais como uso de luvas,

material estéril e descartável.

A separação de células mononucleares do sangue periférico foi feita segundo

GAZZINELLI et al. (1983). O sangue heparinizado foi aplicado sobre uma mistura de ficoll-

diatrozoato (Ficcoll-Hypaque) e centrifugado a 1350 rpm por 40 minutos a 20o C. As células

mononucleares foram coletadas com uma pipeta de Pasteur e transferidas para um tubo falcon

de 50 mL graduado, de fundo cônico. As células foram ressuspendidas em meio de cultura

MEM – “minimum essencial medium” – (GIBCO, Grand Island, NY), centrifugadas a 1250

rpm 10 minutos a 4o C. Esse procedimento de lavagem das células foi repetido por mais duas

vezes. Em seguida as células foram contadas e diluídas para uma concentração de 8 x 106

células por mL em RPMI 1640.

• Ensaio de proliferação celular

O meio de cultura consistiu de RPMI 1640 contendo 1,6% de L-glutamina (200 mM), 3%

de uma mistura de antibiótico e antimicótico, (10000 U de penicilina, 10000 µg de fungizona

por mL, SIGMA) e 5% de soro humano normal inativado. As culturas foram feitas em placas

de fundo chato de 96 poços em triplicatas. Cada poço continha 150 µL de meio de cultura, 25

µL de suspensão de células diluídas em RPMI 1640 (8 x 106/mL) e 25 µL da toxina A de S.

aureus na concentração de 10-1 µg/mL ou do mitógeno PHA na concentração de 2,5 µg/mL ou

de meio. As placas de cultura foram preparadas em capela de fluxo laminar e depois

incubadas por três dias a 37oC com 5% de CO2 em ar úmido. Após o período de incubação as

placas foram marcadas com 1,0 µCi de timidina, por poço, diluída em RPMI 1640. As placas

foram reincubadas por seis horas e as células coletadas em papel de fibra de vidro com auxílio

de um coletor automático de células e a radioatividade incorporada foi determinada por

cintilografia líquida.

Nas culturas realizadas para a coleta de sobrenadantes para os ensaios de citocinas foram

feitas em placas de fundo chato de 24 poços. Cada poço continha 800 µL de meio de cultura,

100 µL de suspensão de células diluídas em RPMI 1640 (8 x 106/ml) e 100 µL da toxina A de

S. aureus na concentração de 100 µg/mL ou do mitógeno PHA na concentração de 2,5 µg/mL

ou de meio. As placas de cultura foram preparadas em capela de fluxo laminar e depois

incubadas por três dias a 37oC com 5% de CO2 em atmosfera úmida. Os sobrenadantes foram

coletados e estados a a -20oC para posterior análise em citômetro de fluxo.

É importante ressaltar que foi realizada uma curva para estabelecer a concentração de

superantígeno a ser utilizada nos ensaios de proliferação celular. Foram testadas as seguintes

concentrações do SEA 100, 10-1, 10-2 e 10-3 µg/mL, utilizando-se 200.000 PBMC de seis

pacientes, em placas de 96 poços (Figura 1 - anexo). Os resultados indicaram que a melhor

faixa da concentração SEA para a estimulação das células era de 100 a 10-1 µg/mL.

• Detecção de citocinas

A detecção de citocinas em sobrenadante de cultura foi realizada através do ensaio de

citometria de fluxo utilizando kits CBA (Citometric Bead Array Set System/BD). Foram

quantificadas as seguintes citocinas: IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-6 e IL-10. O ensaio consiste

basicamente em adicionar 25 µL do sobrenadante de cultura de PBMC de pacientes com

osteomielite e dos indivíduos do grupo controle com 25 µL da suspensão de beads do kit

CBA/BD. Posteriormente, adicionava-se 18 µL do reagente de detecção e incubava a

temperatura ambiente por 2 horas. A seguir, lavou-se com 500 µL da solução tampão e

centrifugou-se a 2.500 rpm, temperatura ambiente, por 10 minutos. O sobrenadante foi

aspirado e acrescentou-se 200 µL de solução tampão. Em seguida, os tubos foram lidos em

citômetro de fluxo e os níveis relativos das citocinas quantificados em programa fornecido

pelo fabricante. O ensaio foi realizado no Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ/MG

com a colaboração da Dra Andrea Teixeira de Carvalho.

• Antígeno de S. aureus

Nos experimentos foi utilizado a toxina A solúvel do S. aures (SEA). Este reagente foi

fornecido pelo Dr. Luiz Simeão do Carmo/UFMG, colaborador nesse projeto.

• Avaliação da produção de óxido nítrico (NO)

A avaliação das concentrações de NO foi realizada pela medida de nitritos (NO-2) e

nitratos (NO-3)

nos plasmas dos indivíduos selecionados, de acordo com uma vasta literatura

que recomenda o uso do plasma sanguíneo nessa avaliação (BENJAMIN & VALLACE et al.,

1994; CASTILLO et al., 1995; MOSHAGE et al., 1995; MOSHAGE et al., 1998). As

amostras foram descongeladas e alíquotas de 50 µL diluídas 4 vezes em água bidestilada em

triplicata. Para a conversão de nitratos em nitritos foram adicionados às amostras 30 µL de um

coquetel contendo 10 µL de FAD (Sigma®) (200 µM), 10 µL de NADPH (Sigma®) (6 mM) e

10 µL da enzima nitrato redutase na concentração de 1U/mL (Sigma®) conforme descrito por

SCHIMIDT et al. (1989). As amostras foram incubadas 24 horas a 37ºC. Um segundo

coquetel contendo 10 µL de piruvato (Sigma®) (100 mM) e 10 µL de lactato desidrogenase

(Sigma®) (5mg/mL), na quantidade de 20 µL foi adicionado às amostras, seguido de uma

incubação por 10 minutos a 37ºC para que o excesso de NADPH e FAD fosse oxidado. A

desproteinização foi feita através da adição de 10 µL sulfato de zinco (ZnSO4) (Sigma®)

(300g/L) seguida por 5 minutos de centrifugação a 5000 rpm.

Após esta etapa, foram pipetados 100 µL das amostras preparadas e 100 µL do reagente

de Griess em placas de 96 poços, em duplicata e incubados à temperatura ambiente por 10

minutos. A seguir foi determinada a absorbância a 540 nm em leitor de ELISA (GREEN et

al., 1982). Os resultados expressos em µM foram determinados após a extrapolação de

valores obtidos de uma curva padrão realizada com nitrito de sódio (NaNO2) nas

concentrações de 0,78 a 100 µM para cada placa.

O reagente de Griess foi preparado na hora do uso, homogeneizando partes iguais da

solução A - sulfanilamida 1% em H3PO4 2,5% (MERCK®) e da solução B - naftilenodiamina

0,1% em água bidestilada (GREEN et al, 1982).

• Análise estatística:

Foi realizada utilizando-se testes específicos para comparar os grupos estudados, com o

apoio instrumental dos softwares PRISMA 5.0. As variáveis quantitativas foram analisadas

por teste t para dados paramétricos e por teste de Mann-Whitney para os dados não-

paramétricos. Nas análises realizadas entre os grupos de indivíduos testados foram retirados

os out-liers, que foram definidos como aqueles pontos que se afastaram em mais que 1,5

vezes o terceiro quartil (Q3) menos o primeiro quartil (Q1), ou seja, se o valor for maior que

Q3+[1,5 vezes(Q3-Q1)] ou menor que Q1-[1,5 vezes(Q3-Q1)]. A relação entre as citocinas

foi examinada pelo teste de correlação de Pearson quando os dados eram paramétricos e pela

correlação de Spearman quando os dados eram não paramétricos.

5. RESULTADOS

5.1 PERFIL CLÍNICO-HEMATOLÓGICO E SÓCIO-DEMOGRÁFICO DOS

INDIVÍDUOS COM OSTEOMIELITE ESTAFILOCÓCICA CRÔNICA

Neste estudo foi observado que a maioria dos pacientes eram do sexo masculino e

possuiam em média 35 anos. O trauma foi o modo de infecção mais encontrado (19 em 20

casos) nos pacientes. Os ossos mais acometidos foram a tíbia seguida pelo fêmur, pois

também são os ossos frequentemente expostos a fraturas. O tempo médio de internação dos

pacientes estudados foi de 25 dias e o tempo médio de última reagudização (apresentação de

sinais e sintomas da fase aguda como febre, dor óssea intensa, presença de fístula e secreção

purulenta) foi de 5,2 meses (Tabela 1).

Foi realizada uma coleta de dados nos prontuários dos pacientes com osteomielite

estafilocócica crônica que ficaram internados. Verificou-se que 47% dos pacientes

apresentavam níveis elevados de proteína C reativa (PCR), que consiste em um exame

indicativo da existência de processos inflamatórios agudos. Já em relação à contagem

eritrocitária, a média dos resultados foi de 4,2 milhões/µL/mm e em relação ao leucograma a

média foi de 10173 células/µL/mm3 (Tabela 2).

Tabela 1 – Perfil clínico dos pacientes com osteomielite estafilocócica crônica

Características Nº % Sexo

Masculino 14 70 Feminino 6 30

20 100 Osso acometido

Tíbia 15 75 Fêmur 2 10 Outros* 3 15

20 100 Causa

Trauma 19 95 Infecção secundária 1 5

20 100 Tipo de tratamento

Cirúrgico 10 50 Antibioticoterapia 10 50

20 100 Idade (anos)

Média ± DP 35 ± 16,2 Mediana (Q1/Q3) 31,5 (24,0/48,0)

Min-Máx. 10,0-60,0 anos Tempo de última reagudização (em meses)

Média ± DP 5,2 ± 3,7 Mediana (Q1/Q3) 4,5 (2,0/7,8)

Min-Máx. 1,0-12,0 Tempo de internação (em dias)(1)(2)


Min-Máx. 0,0-58,0 (1) excluídas as fichas sem informação (2) n=16 Q1 = Primeiro quartil Q3= Terceiro quartil

Tabela 2 – Avaliação de parâmetros laboratoriais dos pacientes com osteomielite estafilocócica crônica

Parâmetros hematológicos Nº % Proteína C Reativa (1)

Igual ou menor que 6 8 53 Maior que 6 7 47

15 100 Contagem eritrocitária (milhões/µL/mm) (1)


Min-Máx. 2,6-5,6 Contagem leucocitária (células/µL/mm3) (1)

Média ± DP 10173 ± 5396 Mediana (Q1/Q3) 9200 (7200/10600)

Min-Máx. 6100-28700 (1) excluídas as fichas sem informação Valores de referência: Proteína C Reativa – igual ou menor que 6 / Contagem eritrocitária - 4,2-5,9 milhões/µL/mm / Contagem leucocitária – 4300 a 10800 células/µL/mm3 (SPRINGHOUSE, 2005) Q1 = Primeiro quartil Q3= Terceiro quartil

5.2 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS

MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO

A avaliação da proliferação de PBMC na ausência ou presença de estímulos SEA e PHA

foi realizada através do ensaio de proliferação celular. O objetivo deste teste é verificar se as

PBMC sofreram aterações em sua taxa de proliferação quando colocadas frente a um estímulo

e se essas alterações foram diferentes entre os grupos estudados. A Figura 2 mostra os valores

máximos e mínimos e os percentis 25, 50 e 75 da proliferação total da cultura de PBMC dos

pacientes e dos controles estimuladas na ausência ou presença de SEA ou PHA. O símbolo +

representa a média dos valores encontrados. Não houve diferenças significativas entre os

dados referentes aos pacientes e aos controles, indicando que as PBMC de pacientes e

controles responderam de maneira semelhante frente aos estímulos.

Figura 2 – Proliferação de PBMC de pacientes com osteomielite e indivíduos do grupo controle estimuladas por SEA ou PHA. 2 x 105 células/poço cultivadas na ausência ou presença de 0,1µg/mL de SEA e 2,5µg/mL de PHA (concentração final) 3 dias a 37ºC e 5% de CO2. Linhas horizontais representam percentis 25, 50 e 75, linhas verticais os valores máximos e mínimos e o símbolo + a média dos valores encontrados. Para dados paramétricos foi realizado o teste t e para não paramétricos o teste de Mann-Whitney.

0

10000

20000

30000

40000

MEIO SEA PHA

Grupo de indivíduos controle

Pacientes

CPM

5.3 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE CITOCINAS IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-2 e IL-6

As Figuras 3 e 4 mostram os valores máximos e mínimos e os percentis 25, 50 e 75,

dos níveis de citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-2 produzidas no sobrenadante de cultura de

células mononucleares do sangue periférico dos pacientes e dos indivíduos controle, na

ausência ou na presença dos estímulos de SEA ou PHA. O símbolo + representa a média dos

valores encontrados. Não foi observada diferença significativa nos níveis de IFN-γ, TNF-α,

IL-10, IL-2.

Figura 3 – Produção de citocinas IFN-γ, TNF-α por PBMC de pacientes com osteomielite e indivíduos controle. 2 x 105 células/poço cultivadas na presença de 1µg/mL de SEA e 2,5 µg/mL de PHA (concentração final) por 3 dias a 37C a 5% de CO2. Os sobrenadantes foram coletados e as citocinas foram analisadas por citometria de fluxo. Os resultados foram expressos em IMF (intensidade média de fluorescência). Linhas horizontais representam percentis 25, 50 e 75, linhas verticais os valores máximos e mínimos e o símbolo + a média dos valores encontrados. Para dados paramétricos foi realizado o teste t e para não paramétricos o teste de Mann-

Whitney.

0

2000

4000

6000

8000

MEIO SEA PHA

Grupo de indivíduos controle Pacientes

IFN- γγ γγ (IMF)

0

1500

3000

4500

6000

MEIO SEA PHA

TNF- αα αα (IMF)

Figura 4 – Produção de citocinas IL-10. IL-2 por PBMC de pacientes com osteomielite e indivíduos controle. 2 x 105 células/poço cultivadas na presença de 1µg/mL de SEA e 2,5 µg/mL de PHA (concentração final) por 3 dias a 37C a 5% de CO2. Os sobrenadantes foram coletados e as citocinas foram analisadas por citometria de fluxo. Os resultados foram expressos em IMF (intensidade média de fluorescência). Linhas horizontais representam percentis 25, 50 e 75, linhas verticais os valores máximos e mínimos e o símbolo + a média dos valores encontrados. Para dados paramétricos foi realizado o teste t e para não paramétricos o teste de Mann-Whitney.

Foram realizadas correlações entre as citocinas TNF-α, IFN-γ e IL-10 produzidas pelas

células mononucleares do sangue periférico estimuladas pelo SEA, como mostrado na tabela

3. Verificou-se que o grupo de pacientes apresentava forte correlação positiva entre as

citocinas IFN-γ e IL-10 (r=0,75/p=0,0009), o que não foi observado no grupo controle

(r=0,43/p=0,08). Também verificou-se forte correlação positiva entre as citocinas IFN-γ e

TNF-α nos dois grupos de indivíduos testados. Os pacientes apresentaram uma correlação

mais forte (r=0,94/p<0,0001) do que os indivíduos do grupo controle sem história de infecção

ósteo-articular (r=0,71/p=0,001). O mesmo aconteceu na correlação feita entre as citocinas

TNF-α e IL-10 (pacientes: r=0,83/p<0,0001; grupo controle: r=0,68/p=0,002).

Tabela 3 – Correlação entre a produção de citocinas frente ao SEA

A análise de correlação de Pearson para os dados com distribuição Normal e análise de Spearman(*) para os dados que não seguem distribuição Normal. NS = Não significativo

IL-10 TNF-α Pacientes (r/p) Controles (r/p) Pacientes (r/p) Controles (r/p) IFN-γ 0,75/0,0009 0,43/0,08 0,94/<0,0001 (*) 0,71/0,001 TNF-α 0,83/<0,0001 (*) 0,68/0,002 1 1

0

100

200

300

400

MEIO SEA PHA

Grupo de indivíduos controle Pacientes

IL-10 (IMF)

0

35

70

105

140

MEIO SEA PHA

IL-2 (IMF)

A Figura 5 mostra os valores máximos e mínimos e os percentis 25, 50 e 75, dos

níveis de citocina IL-6 produzida no sobrenadante de cultura de células mononucleares do

sangue periférico dos pacientes e dos indivíduos controle, na ausência ou na presença dos

estímulos de SEA ou PHA. O símbolo + representa a média dos valores encontrados.

Verificou-se que as PBMC dos pacientes com osteomielite estafilocócica crônica produziram

menores quantidades de IL-6 do que as PBMC dos indivíduos não portadores da doença

quando estimuladas pelo SEA (p=0,03) (Figura 5).

Figura 5 - Produção de citocina IL-6 por PBMC de pacientes com osteomielite e indivíduos controle. A figura 5 representa os dados expressos em IMF (intensidade média de fluorescência). 2 x 105 células/poço cultivadas na presença de 1µg/mL de SEA e 2,5 µg/mL de PHA (concentração final) por 3 dias a 37C a 5% de CO2. Os sobrenadantes foram coletados e as citocinas foram analisadas por citometria de fluxo. Os resultados foram expressos em IMF. Linhas horizontais representam percentis 25, 50 e 75, linhas verticais os valores máximos e mínimos e o símbolo + a média dos valores encontrados. Para dados paramétricos foi realizado o teste t e para não paramétricos o teste de Mann-Whitney. Valores significativos p< 0,05.

0

5000

10000

15000

p=0,03


Pacientes

IL-6 (IMF)

A Tabela 4 compara a freqüência de indivíduos alto e baixo produtores de IL-6 dentro

dos grupos estudados. Usou-se como valor de referência para categorizar os 40 indivíduos a

mediana dos níveis de IL-6 de todos em conjunto. Observou-se uma diminuição na freqüência

de indivíduos altos produtores de IL-6 nos grupo de pacientes quando as PBMC foram

estimuladas pelo SEA (p=0,057).

Tabela 4 - Freqüência de indivíduos baixo e alto produtores de IL-6 no grupo de pacientes e de indivíduos controle.

Os indivíduos foram categorizados em baixo e alto produtores através da mediana dos níveis de IL-6 dos 40 indivíduos estudados. PBMC foram estimuladas por SEA e PHA.

SEA Número de indivíduos/Total de

indivíduos (%)

PHA Número de indivíduos/Total de

indivíduos (%) Citocinas Pacientes Controles p Pacientes Controles p

IL-6 Baixo 13/20 (65) 7/20 (35) 0,057 12/20 (60) 8/20 (40) 0,205 Alto 7/20 (35) 13/20 (65) 8/20 (40) 12/20 (60)

5.4 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE NO

A Figura 6 mostra os valores máximos e mínimos e os percentis 25, 50 e 75, dos níveis

de nitrito e nitrato, que indiretamente retratam os níveis de NO, no plasma dos pacientes e dos

indivíduos do grupo controle. O símbolo + representa a média dos valores encontrados.

Observou-se uma diferença significativa de p=0,04 entre os grupos testados, mostrando que o

grupo de indivíduos com osteomielite estafilocócca crônica apresentam uma menor produção

de NO.

Figura 6– Níveis plasmáticos de NO em pacientes com osteomielite estafilocócica crônica e indivíduos controle. Plasmas dos indivíduos foram tratados com a enzima nitrato redutase, e em seguida com o reagente de Griess. A concentração de nitrito foi avaliada em leitor de ELISA a 540 nm. Os resultados foram expressos em µM. Linhas horizontais representam percentis 25, 50 e 75, linhas verticais os valores máximos e mínimos e o símbolo + a média dos valores encontrados. Foi realizado o teste t. Valores significativos p< 0,05.

0

6

12

18

24p=0,04


Pacientes

Nitrito + Nitrato (uM)

6. DISCUSSÃO

As formas clínicas da osteomielite, aguda e crônica, são diferenciadas pela persistência

da infecção e pelo desenvolvimento de uma zona de sequëstro ósseo (CAREK et al., 2001).

Em nosso estudo, os pacientes foram avaliados clinicamente por um médico ortopedista e

tiveram o seu diagnóstico de osteomielite estafilocócica crônica baseado em exames

laboratoriais, radiográficos (seqüestro ósseo) e microbiológicos (presença de S. aureus). Outro

ponto importante a ser ressaltado é que todos os pacientes apresentaram fístulas em um

período menor ou igual a um ano, o que confere ao estudo uma margem de segurança para

afirmar que os pacientes ainda não estavam curados (Tabela 1). Os indivíduos que

participaram do grupo controle eram saudáveis e não apresentavam história prévia de infecção

articular-óssea.

O modo de infecção mais freqüente da osteomielite aguda é por via hematogênica, e os

pacientes mais acometidos normalmente são crianças. Já a osteomielite crônica tem como

etiologia mais comum o trauma, o que explica a sua maior prevalência em homens jovens,

devido a clara associação entre traumas e acidentes automobilísticos (KLOSTERHALFEN et

al., 1996). Esse fato foi constatado em nosso estudo, uma vez que o modo de infecção mais

frequente foi através do trauma (19 em 20 casos). Os ossos mais acometidos foram a tíbia

seguida pelo fêmur, que são frequentemente expostos a fraturas. A maioria dos pacientes

eram do sexo masculino e tinham em média 35anos (Tabela 1).

Neste estudo, todos os pacientes receberam antibioticoterapia e 50% deles o tratamento

cirúrgico (Tabela 1). Entretanto, a literatura mostra que a maioria dos casos são submetidos a

osteotomia do sequestro ósseo seguida de antibioticoterapia endovenosa. (LEW &

WALDVOGEL, 2004; LAZZARINI et al., 2004).

O tempo médio de internação dos pacientes estudados foi de 25 dias (Tabela 1), resultado

semelhante ao trabalho realizado por GLOVER et al. (1982) que avaliaram 58 pacientes, e

cujo tempo de internação variava entre 2 a 133 dias com média de 32 dias. Além disso, os

dados referentes às variáveis tais como sexo, idade, osso acometido e tipo de tratamento

adotado, descritas em nosso estudo, corroboraram com o perfil epidemiológico dos pacientes

com osteomielite atendidos no Hospital Municipal de Governador Valadares, no período de

2001 a 2006 (MORAES, C. manuscrito em preparação).

Os resultados dos exames laboratoriais dos pacientes neste estudo foram compatíveis

com aqueles normalmente encontrados em pacientes com osteomielite crônica relatados na

literatura (FULLILOVE et al., 2000; LAZZARINI et al., 2004). Foi observada uma ligeira

anemia em 31,2% dos pacientes e 47% apresentou PCR levemente aumentado. Apenas um

paciente com leucograma elevado, indicando a presença de uma infecção persistente, mas não

agudizada (Tabela 2).

A avaliação da proliferação de PBMC na ausência ou presença dos estímulos SEA e PHA

mostrou que não houve diferença significativa entre a proliferação de PBMC dos pacientes e

do grupo controle (Figura 2). Entretanto SCHLUTER et al. (1991); ALVAREZ et al. (1992)

verificaram que o índice de estimulação de linfócitos frente ao PHA foi menor para pacientes

com osteomielite pós-traumática do que para indivíduos sadios. Por outro lado o índice de

estimulação frente a concavalina A foi semelhante entre os dois grupos de indivíduos. Tal

divergência pode ser explicada porque esses autores trabalharam com pacientes com infecção

por bactérias Gram positivas e Gram negativas e utilizaram apenas linfócitos e não PBMC em

seus ensaios.

Além da proliferação de PBMC, procurou-se investigar outros elementos da resposta

imune que poderiam estar alterados na osteomielite estafilocócica crônica. As citocinas

constituem importantes mediadores da resposta imune, seja ativando ou regulando a atividade

celular (CAMERON & KELVIN, 2003). Não foram encontradas diferenças estatisticamente

significativas nos níveis das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-2 produzidas no sobrenadante

de cultura de PBMC de pacientes comparado com indivíduos do grupo controle, na ausência

ou na presença dos estimulos SEA ou PHA (Figura 3 e 4). Todavia, foi observado que as

PBMC dos pacientes apresentavam uma tendência em produzir níveis mais elevados dessas

citocinas quando comparadas as PBMC de individuos do grupo controle, após estímulo com

SEA. Sendo assim, buscou-se avaliar a correlação entre as citocinas TNF-α, IFN-γ e IL-10

produzidas pelas PBMC estimuladas pelo SEA, como mostrado na tabela 3. Verificou-se que

no grupo de pacientes havia uma forte correlação positiva entre as citocinas IFN-γ e IL-10

(r=0,75/p=0,009), o que não foi visto no grupo de indivíduos do grupo controle (r=0,43/0,08).

Também foi observada uma forte correlação entre as citocinas TNF-α e IL-10 no grupo de

pacientes (r=0,83/p<0,0001) e de forma menos expressiva nos indivíduos do grupo controle

(r=0,68/p=0,002).

Sabe-se que o S. aureus pode tanto colonizar a matriz óssea através da formação dos

biofilmes (RIBEIRO & CONSOLARO, 1999) como também ser internalizado pelos

osteoblastos (JEVON et al., 1999). A forma de interação com os tecidos do hospedeiro pode

favorecer o escape da bacteria à resposta imune, bem como facilitar a liberação de toxinas

estafilocócicas, como o SEA, no decorrer da infecção. Após a estimulação antigênica e na

ausência de sinais co-estimulatórios, durante o processo infeccioso, as células T são induzidas

a anergia ou apoptose. (GOODGLICK & BRAUN, 1994). A população anérgica é

heterogênea e inclui células T regulatórias e células T efetoras (SUNDSTEDT et al., 1997;

IVARS, 2007). Dessa forma, o controle da infecção pode não ser restabelecido, e a doença

passa para a sua fase crônica.

A IL-10 é uma citocina imunossupressora que foi originalmente descrita como um

produto de macrófagos ativados e de células T auxiliares tipo 2 capaz de inibir a produção de

citocinas IFN-γ, IL-1, TFN-α, IL-6 (MOORE et al., 2001). Tem-se demonstrado que a IL-10

também é produzida por outras sub-populações de linfócitos T tais como células CD4+

Foxp3+ e recentemente, foi descrita a produção de IL-10 por células T auxilares do tipo 1

com atividade reguladora (JANKOVIC & TRINCHIERI, 2007). A IL-10 está envolvida em

diversos mecanismos de regulação da resposta inflamatória, de modo a proteger o hospedeiro

contra possíveis danos provocados pela resposta imune (CORRÊA-OLIVEIRA et al., 1998;

TRINCHIERI, 2007). Outros estudos mostraram ainda que linhagens de células T CD4+

produtoras de IL-10 possuem um papel importante na modulação de infecções crônicas.

JANKOVIC et al. (2007) demontraram que a sobrevivência de animais infectados pelo T.

gondii dependia do padrão de citocinas produzidas pelos linfócitos Th1 com perfil regulador.

Os animais que apresentavam linfócitos Th1 produtores de IL-10 e IFN-γ simultaneamente,

evoluiam para a forma crônica da doença. ANDERSON et al. (2007) verificaram que tanto os

linfócitos T CD4+ do tipo 1 como os linfócitos T CD4+ Foxp3+ oriundos de camundongos

com infecção por L. major eram capazes de produzir IL-10.

Evidências sobre o papel protetor da IL-10 produzida pelas células T regulatórias em

experimentos com animais infectados por Escherichia coli, H. hepaticus e Helicobacter pylori

têm sido descritas (MILLS et al., 2004).

A forte correlação positiva entre as citocinas IFN-γ e IL-10 demonstrada em nosso

estudo, sugere que as PBMC dos indivíduos com osteomielite estafilocócica crônica

estimuladas pelo SEA in viro possam estar produzindo simultaneamente ambas as citocinas.

Esse fato foi realçado pelos níveis significativamente mais elevados de IFN-γ detectados no

grupo de pacientes alto produtores de IL-10. Entretanto, nosso estudo não nos permite

concluir qual a fonte específica de produção de IFN-γ e IL-10, uma vez que as populações de

células tais como linfócitos T CD8+, linfócitos B, monócitos, além das células T CD4+

também produtoras de IL-10 estavam presentes nos ensaios de cultura in vitro. Estudos

futuros que envolvam a purificação de células T CD4+ do pool de PBMC dos pacientes com o

objetivo de melhor avaliar a produção dessas citocinas estão sendo planejados.

O TNF-α é um dos principais mediadores da resposta inflamatória aguda a agentes

infecciosos, produzido principalmente por linfócitos T e macrófagos. É responsável pelo

recrutamento de neutrófilos e monócitos para os locais de infecção. Normalmente, IFN-γ e

TNF-α agem em conjunto na resposta imune celular para a eliminação dos patógenos. A

produção de TNF-α pelo macrófago é dependente de IFN-γ (LOCKSLEY et al., 2001). Em

nosso estudo, observamos uma forte correlação positiva entre as citocinas IFN-γ e TNF-α nos

dois grupos de indivíduos testados. Entretanto, os pacientes apresentaram uma correlação

mais forte (r=0,94/p<0,0001) do que os indivíduos do grupo controle (r=0,71/p=0,001) sem

história de infecção articular-óssea.

A IL-2, produzida por linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+ é considerada um fator de

crescimento para linfócitos T (NELSON & WILLERFORD et al., 1998). CORNWELL &

ROGERS (1999) verificaram que SEA induziu a proliferação de célula Th1 de camundongos

em um período inicial da infecção que foi seguido de anergia profunda e diminuição dos

níveis da IL-2. Contudo esses pesquisadores sugerem que os eventos de transdução de sinal

que levam a ocorrência de anergia coincidem, mas não dependem da diminuição da produção

de IL-2 (JENKINS & SCHWARTZ, 1987; KANG et al., 1992). No presente estudo, não foi

encontrada diferença quanto a produção de IL-2 nos pacientes com osteomielite estafilocócica

crônica frente ao SEA e ao PHA.

A IL-6, produzida por fagócitos mononucleares, linfócitos T ativados, dentre outras

linhagens de céulas, parece ter um papel importante no desenvolvimento da osteomielite

(ISHIHARA & HIRANO, 2003). No início da infecção pelo S. aureus observa-se que há uma

produção significativa de mediadores inflamatórios, dentre eles TNF-α, IL-1-β, IL-6, e IL-8

(KLOSTERHALFEN et al., 1996) e sinais clínicos como febre alta, secreção de pus e dor

intensa, o que caracteriza a forma aguda da infecção (LEW & WALDVOGEL, 2004). No

presente estudo foi encontrada uma menor produção de IL-6 por PBMC dos pacientes frente

ao SEA quando comparada com a produção de IL-6 por PBMC dos indivíduos do grupo

controle (p=0,03) (Figura 5). KLOSTERHALFEN et al. (1996) não detectaram níveis

significativos de TNF-α, IL-1β, IL-6, e IL-8 em plasmas de pacientes com osteomielite

crônica. EVANS et al. (1998) e FULLILOVE et al. (2000) também observaram que não havia

diferença significativa na produção de IL-6, TNF-α e IL-8 quando sangue total de pacientes

com ostemielite bacteriana era estimulado com LPS e comparado com indivíduos do grupo

controle. Em nosso estudo, quando comparamos a freqüência de indivíduos alto e baixo

produtores de IL-6, observamos uma redução na freqüência de indivíduos alto produtores de

IL-6 nos grupos de pacientes quando as PBMC foram estimuladas pelo SEA (p=0,057)

(Tabela 4). A menor produção de IL-6 pelas PBMC dos pacientes com osteomielite

estafilocócica poderia interferir no desenvolvimento dos linfócitos B, e consequentemente,

com a produção de anticorpos, bem como afetar a sobrevivência dos fagócitos (ABBAS &

LICHTMAN, 2005). BANSAL et al. (1992) observaram que pacientes com osteomielite

apresentavam níveis reduzidos de IgG, IgA e IgM no soro.

Tem sido discutido na literatura, o papel do óxido nítrico em várias doenças causadas por

fungos (GRANGER et al., 1990), bactérias (SUMMERSGILL et al., 1992), protozoários

(VESPA, 1994) e helmintos (OLIVEIRA et al., 1998). Entretanto, a participação do óxido

nítrico no desenvolvimento da osteomielite estafilocócica crônica ainda não está

completamente elucidada. O NO parece estar envolvido com a eliminação do S. aureus

através da ativação de neutrófilos e macrófagos, fator importante na fisiopatologia dessa

doença (CHADHA et al., 1999). TSUKAYAMA (1999) relatou que pacientes com doença

crônica granulomatosa causada principalmente pelo S. aureus apresentavam neutrófilos

incapazes de produzir radical livre, contribuindo assim para o desenvolvimento da doença.

Nossos resultados mostraram que os pacientes com osteomielite estafilocócica crônica

apresentaram níveis plasmáticos de nitrito e nitrato menores que os indivíduos do grupo

controle (p=0,04) (Figura 6). Todavia, trabalhos realizados com outras doenças ósseas

mostraram que os níveis de óxido nítrico estavam mais elevados no grupo de paciente do que

na população sadia (VANT´HOF & RALSTON 2001).

Interessantemente, ASENSI et al. (2004) e OCANA et al. (2007) encontraram uma

correlação negativa entre níveis de IL-6 e apoptose dos neutrófilos de pacientes com

osteomielite. Uma menor sobrevida dos fagócitos causada pela deficiência de IL-6 sugere

uma diminuição na produção plasmática de NO nos pacientes com osteomielite estafilocócica

crônica (Figura 6). A presença de IL-10 nos sobrenadantes das culturas de PBMC estimuladas

pelo SEA poderia indicar a participação da IL-10 no processo de evolução da osteomielite

para a fase crônica da doença, resultando na diminuição da IL-6 e do NO (HUANG et al.,

2002). ROILIDES et al. (1998) demonstraram que a IL-10 reduz a atividade bactericida dos

monócitos humanos infectados pelo S. aureus, apesar de não reduzir a sua capacidade

fagocítica.

Finalmente, a forte correlação positiva entre IFN-γ, TNF-α e IL-10, descrita em nosso

estudo, bem como a reduzida produção de IL-6 pelas PBMC dos pacientes frente ao SEA,

aponta para um possível mecanismo de regulação da resposta imune pela infecção por S.

aureus na fase crônica da doença. A deficiência de IL-6 é sugestiva de uma menor produção

de anticorpos que normalmente é observada em pacientes com osteomielite crônica. A menor

sobrevida dos fagócitos e consequentemente a diminuição da produção de radicais livres

poderia comprometer a eliminação do S. aureus, contribuindo também para a cronificação da

doença. Embora nossos resultados tenham indicado alterações da resposta imune em pacientes

com osteomielite estafilocócica crônica, estudos complementares estão sendo planejados no

sentido de melhor avaliar a produção de citocinas por populações específicas de células T

CD4+ do pool de PBMC de pacientes.

7. CO>CLUSÃO

O estudo proposto sugere que pacientes com osteomielite estafilocócica crônica

apresentam alterações na resposta imune relacionadas com a produção das citocinas IFN-γ,

TNF-α, IL-6, IL-10 e do NO. A presença de IL-10 nos sobrenadantes das culturas de PBMC

estimuladas pelo SEA poderia indicar a participação da IL-10 no processo de evolução da

osteomielite para a fase crônica da doença, resultando na diminuição da IL-6 e do NO.

8. REFERÊ>CIAS BIBLIOGRÁFICAS

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9. A>EXOS

Figura 1 – Avaliação da concentração de estímulo utilizada para o teste de proliferação de PBMC de pacientes com osteomielite e indivíduos do grupo controle estimuladas por SEA ou PHA. 2 x 105 células/poço cultivadas na ausência ou presença de 1µg/mL, 0,1µg/mL, 0,01µg/mL e 0,001µg/mL de SEA e 2,5µg/mL de PHA (concentração final) 3 dias a 37ºC e 5% de CO2. Linhas horizontais representam percentis 25, 50 e 75, linhas verticais os valores máximos e mínimos e o símbolo + a média dos valores encontrados. Para dados paramétricos foi realizado o teste t e para não paramétricos o teste de Mann-Whitney. Valores significativos p< 0,05.


MEIO

g/mL

µµµµ

SEA 1

g/mL

µµµµ

SEA 0,1

g/mL

µµµµ

SEA 0,01

g/mL

µµµµ

SEA 0,001

g/mL

µµµµ

PHA 2,5

0

7500

15000

22500

30000

CPM

Pacientes

MEIO

g/mL

µµµµ

SEA 1

g/mL

µµµµ

SEA 0,1

g/mL

µµµµ

SEA 0,01

g/mL

µµµµ

SEA 0,001

PHA 2,5mg/mL

0

10000

20000

30000

40000

CPM

universidade vale do rio doce – univale programa de...

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