universidade federal do rio grande do norte centro … · todos os sacrifícios que enfrentou para...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

MARIANA SANTANA SANTOS PEREIRA DA COSTA

POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE MACROALGAS

VERDES: CORRELAÇÃO COM PARÂMETROS AMBIENTAIS E

OBTENÇÃO DE GLUCOGALACTANAS SULFATADAS

ANTICOAGULANTES

NATAL/RN

2016

MARIANA SANTANA SANTOS PEREIRA DA COSTA

POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE MACROALGAS

VERDES: CORRELAÇÃO COM PARÂMETROS AMBIENTAIS E

OBTENÇÃO DE GLUCOGALACTANAS SULFATADAS

ANTICOAGULANTES

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Bioquímica. Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha Co-orientador: Leandro Silva Costa

NATAL/RN

2016

Dedico esta obra:

À minha mãe Fátima, exemplo de mulher e de mãe, por sua dedicação, apoio e amor, por

todos os sacrifícios que enfrentou para que eu pudesse chegar até aqui. Ao meu pai, Tadeu

(homenagem póstuma), por seu apoio, proteção, cuidado e amor, sei que hoje você estaria

muito orgulhoso por eu ter conseguido esta conquista. Obrigada por nãо medirem esforços

para qυе еυ chegasse аté esta etapa dе minha vida. Espero um dia ser, para os meus filhos,

exemplos de pais como vocês são para mim. Amo muito vocês!

Ao meu esposo Adaíres pelo companheirismo, compreensão, apoio, incentivo, paciência e

amor. Agradeço a Deus por ter colocado você em minha vida há 13 anos e por você estar hoje

presente ao meu lado de uma forma indispensável. Te amo muito!

Dedico esta obra:

Ao meu orientador, Prof. Dr. Hugo Rocha, por ser um grande professor e orientador, por

confiar no meu trabalho, pelo incentivo, por não ter desistido de mim, mesmo em meio as

minhas dificuldades e ausências; e por hoje servir de exemplo para minha vida como docente.

E ao meu amigo e padrinho Hugo, pelo apoio, preocupação, amizade, viagens, por estar

sempre presente em todos os momentos de minha vida acadêmica e pessoal.

A você, a minha eterna gratidão!!!

“O professor medíocre conta. O bom

professor explica. O professor superior

demonstra. O grande professor inspira.”

(William Arthur Ward)

AGRADECIMENTOS

A Deus por estar sempre ao meu lado, me guiando e ajudando a vencer todos os obstáculos que aparecem em meu caminho. “Ainda que eu ande pelo vale da sombra da morte, não

temerei mal nenhum, porque tu estás comigo” (Salmo 23:4).

Aos meus pais, Tadeu (homenagem póstuma) e Fátima, por todos os obstáculos que tiveram que superar para que hoje eu pudesse ser o que sou, por ficarem felizes com minhas

vitórias, por sempre estarem ao meu lado, me apoiando e incentivando. Amo muito vocês!

Ao meu esposo, Adaíres, que vem acompanhando de perto todas as fases da minha vida acadêmica desde a graduação, por estar ao meu lado em todos os momentos, pela força,

paciência, incentivo e amor. Muito obrigada, meu amor!

Aos meus irmãos, Thiago e João Neto, as minhas avós Conceição e Mãezinha (homenagem póstuma), as minhas cunhadas Flávia e Marilandy, a minha sobrinha Letícia, que veio para

alegrar ainda mais nossas vidas, obrigada pelo amor de vocês. E a todos os meus demais familiares pelo carinho, cuidado e apoio, em especial, ao meu Tio Eider (homenagem

póstuma) que hoje, com certeza, estaria muito orgulhoso por mais esta minha conquista; e as primas Rosa e Yasmim pelo carinho e admiração.

Ao meu orientador Prof. Hugo Rocha por há 12 anos ter confiado que eu seria capaz. Por seus ensinamentos, paciência, convívio e amizade. Obrigada!

À Universidade Federal do Rio Grande do Norte por fornecer as condições necessárias para realização deste trabalho.

À CAPES e ao CNPq por financiarem este trabalho.

Ao professor Elizeu Antunes da UFRN e aos seus alunos Antônio, Anderson e Jonalson pela ajuda com o AKTA.

Á professora Suely Chavantes da UFRN e a sua aluna Lais Palhares pelo auxílio nos ensaios de inibição da trombina.

A Diego Sabry (Popó) por ceder o “kit” para o ensaio de trombina.

Ao professor Heitor Bruno do IFRN - Campus Macau pelo auxílio nas análises estatísticas.

Aos professores e funcionários do Departamento de Bioquímica da UFRN pelo convívio e ensinamentos desde a minha graduação.

Aos professores da banca de qualificação, Diego Sabry, Leandro Costa e Luciana Guimarães, por disponibilizarem seu tempo para lerem esta tese e por todas as contribuições que deram

para melhoria deste trabalho.

Aos professores da banca de defesa, Cinthia Telles, Giulianna Souza, Leandro Costa, Luciana Bertini e Kátia Scortecci, a contribuição de cada um de vocês foi muito válida e

enriquecedora.

Trabalhar com uma espécie de alga já é difícil, logo, trabalhar com várias espécies, durante 12 meses não foi fácil. Foram muitas coletas, muitas algas para lavar, secar, fazer

proteólise... Eu não teria conseguido chegar até aqui sem a ajuda de vários amigos que fazem parte do nosso querido BIOPOL, nesta tese há pedacinho de cada um de vocês. Ao Prof.

Hugo (por ter me dado a oportunidade de fazer parte do BIOPOL), Jailma, Ruth, Cinthia, Dayanne, Karol, Joana, Daniele (amigas muito queridas, obrigada pelo carinho, apoio, conversas, desabafos...), Leandro e Ivan (por terem sido os primeiros a me receberem no

laboratório e terem me ensinado muito do que hoje sei), Rafael, Leonardo, Gabriel, Moacir (por estarem sempre dispostos a ajudar), Raniere, Rony e Éder (muito obrigada por me

aguentar sempre aperreando pelas liofilizações de amostras), Vínicius (obrigada pela ajuda com o AKTA) e a Talita, Arthur, Mônica, Maíra, Marília, Monique, Almino, Fabiana, Jefferson, Larisse, Letícia, Pablo, Samanta, Lucas, Cauê, Carol, Socorro e Cintia pelo

convívio e carinho. Nunca vou esquecer vocês!!!

Quero agradecer, em especial, a Ruth e Maxsuel pela ajuda nos experimentos referentes a sazonalidade; Dayanne e Rayanara pelo auxílio nos experimentos da parte purificação dos

polissacarídeos; Leandro por me ajudar na finalização deste trabalho; e Jailma, Karol e Dayanne por todo o apoio na finalização deste trabalho, pelo carinho, ajuda nos ensaios, no

lanche... Eu não teria conseguido sem vocês! Meu muito obrigada!

“Um amigo fiel é uma poderosa proteção: quem o achou, descobriu um tesouro” (Eclesiástico 6:14). Sara e Jailma, vocês são tesouros que ganhei na UFRN. Jailma, a pessoa mais

prestativa e bondosa que conheço, obrigada por sempre estar disposta a me ajudar, pelo carinho, paciência e amizade; não sei o que seria dos meus slides e formatações sem você,

amiga. Sara, minha primeira companheira de bancada, uma amiga que posso contar em todas horas; obrigada por estar sempre por perto, desde a graduação e agora também na minha vida

profissional, pela amizade, incentivo, apoio, viagens, por ajudar nas minhas atividades do projeto do IFRN enquanto estou afastada... Meninas, obrigada por se alegrarem comigo nas

minhas vitórias e chorarem comigo nos momentos difícieis. Amo vocês!

Aos vários colegas de Departamento de Bioquímica da UFRN pela convivência, pelos sorrisos e conversas nos corredores do DBQ .

Aos professores do Grupo de Biologia do IFRN-Campus Macau (Lilian, Tarciana, Heitor, Sidney, Paulo Augusto, Daniel, Danielly, Maria Aparecida e Francinaide) e ao Diretor

Acadêmico Hudson Carlos por terem apoiado o meu afastamento das atividades acadêmicas do IFRN para poder finalizar o doutorado. Obrigada pelo apoio!

“A vida é em parte o que nós fazemos dela, e em parte o que é feito pelos amigos que nós escolhemos" (Tennessee Williams). Aos meus amigos de longos anos, Mileide, Ricardo, Jobson, Leila, Cybelle, Luciana e Rochele, pelo apoio e carinho. Aos meus amigos de

aventuras e viagens, Sara, Katia, Lourdinha, Maria da Paz, Hugo e Adriana, pela força. Já podemos marcar uma viagem para comemorar meu doutorado. Vocês são maravilhosos!

E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

“Talvez não tenha conseguido fazer o

melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas graças

a Deus, não sou o que era antes”. (Marthin Luther King)

RESUMO

Polissacarídeos de algas podem ter sua síntese, sua estrutura e propriedades

farmacológicas modificadas devido a alterações de fatores ambientais. Contudo, poucas algas já foram analisadas com essa ótica. A alga verde C. cupressoides var. flabellata Børgesen é uma alga abundante na costa do Rio Grande do Norte e já foi demostrado que esta alga coletada na mesma época, mas em praias com grau de salinidade diferentes, sintetizava polissacarídeos sulfatados (PS) com propriedades diferentes, inclusive atividade anticoagulante. Dessa forma, o objetivo do presente foi avaliar a influência do período de coleta e de parâmetros ambientais na composição química e atividade anticoagulante de PS obtidos de algas verdes do litoral potiguar, bem como obter e avaliar o potencial anticoagulante de PS purificados da alga C. cupressoides. Inicialmente, foram obtidos extratos ricos em polissacarídeos sulfatados (ERPS), por proteólise seguido por precipitação com metanol, da alga C. cupressoides coletada mensalmente, durante um ano na praia de Búzios, Nísia Floresta/RN. Observou-se que havia variações no rendimento da extração, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides de acordo com o mês de coleta, sendo o mês de março aquele em que se obteve ERPS com maior potencial anticoagulante, vale salientar que esta atividade foi maior que a do Clexane®, uma heparina de baixo peso molecular comercial. Ao se analisar a influência de fatores ambientais do local de coleta no rendimento, composição química e atividade anticoagulante observou-se que existe uma correlação positiva significativa (p < 0,05) entre o rendimento da extração dos ERPS e a salinidade da água do mar e a insolação; para a quantidade de sulfato observou-se uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com a salinidade da água do mar. Já a quantidade de açúcares totais teve uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com: sólidos totais, sódio, cloreto e insolação. Como o mês de março foi o mês com ERPS com maior potencial anticoagulante, resolveu-se purificar, caracterizar e avaliar o potencial anticoagulante de PS extraídos neste mês. Após proteólise e fracionamento com volumes crescentes de acetona obteve-se quatro frações polissacarídicas da C. cupressoides (CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0), como a CCB-0.5 apresentou maior atividade anticoagulante, esta foi submetida a cromatografia de troca-iônica e eluída em duas novas frações (FI e FII), após eletroforese em gel de agarose, coloração da lâmina com azul de toluidina e descoloração, observou-se o aparecimento de uma única banda em ambas as subfrações, o que indica a presença de uma única população de PS, o que permite inferir que estes PS foram purificados. Análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) indicam que os PS FI e FII tratam-se de glucogalactanas. Estas glucogalactnas sulfatadas exibiram atividade anticoagulante pela via intrínseca (teste de aPTT), pela via extrínseca (teste PT) e pela via comum (teste TT) da cascata de coagulação. Um resultado interessante foi que a atividade no teste de aPTT das glucogalactanas sulfatadas foi similiar a atividade do Clexane®. Além disso, estes PS foram capazes de inibir parcialmente a trombina. Isto é indicativo que os PS da C. cupressoides podem estar agindo em diversas proteases da cascata de coagulação. Entretanto, mais estudos são necessários para explicar detalhadamente quais os alvos de ação destes polímeros. Por fim, analisou-se a influência do período de coleta e de fatores ambientais em ERPS de outras algas verdes do litoral do RN (Caulerpa prolifera, Caulerpa racemosa var. occidentalis, Caulerpa sertularioides e Codium isthmocladum) coletadas também mensalmente, durante um ano na praia de Búzios, Nísia Floresta/RN; e observou-se

que, da mesma forma da C. cupressoides, houve variações no rendimento, composição química e atividade anticoagulante para os ERPS algas verdes C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum. No entanto, um fato interessante é que cada alga responde de forma diferente as condições ambientais do local de coleta. Estes dados indicam que dependendo do período do ano que a alga é coletada, os PS extraídos destas espécies de algas podem ter suas estruturas químicas afetadas e, consequentemente, suas atividades biológicas poderão ser distintas. Estes tipos de estudos levam ao esclarecimento de quais seriam as melhores condições para se obter o PS com as características estruturais e biológicas de interesse, o que é fundamental para o uso destes polímeros na indústria.

PALAVRAS-CHAVE: algas marinhas. atividade anticoagulante. Caulerpa cupressoides var. flabellata. Chlorophyta. sazonalidade. período de coleta.

ABSTRACT

Polysaccharides of seaweeds can have their synthesis, structure and pharmacological properties modified due to changes in environmental factors. But few algae have been analyzed in this light. The green seaweed C. cupressoides var. flabellata Børgesen is an abundant alga in the coast of Rio Grande do Norte and it was already shown that this seaweed collected at the same time in beaches with different degree of salinity synthesized sulfated polysaccharides (PS) with different properties, including anticoagulant activity. Therefore the objective of this study was to obtain and characterize PS of green seaweed of the coast of Rio Grande do Norte evaluating the influence of the collection period and environmental parameters in the chemical composition and anticoagulant activity of PS as well as purify, characterize and evaluate the anticoagulant potential of at least one PS of the seaweed C. cupressoides. Initially, extracts rich in sulfated polysaccharides (ERPS) were obtained by proteolysis followed by precipitation with methanol of the seaweed C. cupressoides collected monthly for one year on the beach in Búzios, Nísia Floresta/RN. It was noted that there were variations in performance of extraction, chemical composition and anticoagulant activity of ERPS C. cupressoides according to the month of collection, with the month of March being the one in which they obtained more anticoagulant potential of ERPS. It is worth noting that this activity was greater than that of Clexane®, a low molecular weight commercial heparin. When analyzing the influence of environmental factors in the collection site in regards to performance, chemical composition and anticoagulant activity it has been observed that there is a significant positive correlation (p < 0.05) between the performance of the extraction of ERPS and salinity of sea water and insolation; for the amount of sulfate it was observed a significant negative correlation (p < 0.05) with the salinity of the seawater. The amount of total sugars had a significant negative correlation (p < 0.05) with: total solids, sodium, chloride and insolation. Since the month of March was the month with ERPS with more anticoagulant potential, it was decided to purify, characterize and evaluate the PS anticoagulant potential extracted on that month. After proteolysis and fractionation with increasing volumes of acetone four fractions of polysaccharide C. cupressoides (CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0) were obtained. Since the CCB-0.5 had higher anticoagulant activity, it was submitted to a chromatography ion-exchange column and eluted in two new fractions (FI and FII) after agarose gel electrophoresis, slide staining with toluidine blue and discoloration it was observed the appearance of a single band on both SP which indicates the presence of a single population of PS, which allows inferring that these PS were purified. Analysis by high-performance liquid chromatography (HPLC) indicate that SP FI and FII are glucogalactanas. These sulfated glucogalactans exhibited by the intrinsic pathway anticoagulant activity (APTT assay) the extrinsic pathway (PT test) and common pathway (TT test) of the coagulation cascade. An interesting result was that activity in the aPTT test of sulfated glucogalactans was similiar activity of Clexane®. In addition, these PS were able to partially inhibit thrombin. This is an indicative that the PS C. cupressoides may be acting on various proteases of the coagulation cascade. But more studies are needed to explain in detail which are the targets of action of these polymers. Finally, we analyzed the influence of the period of collection and environmental factors in ERPS of other green seaweeds RN coast (Caulerpa prolifera, Caulerpa racemosa var. occidentalis, Caulerpa sertularioides and Codium isthmocladum) also collected monthly for one year on the beach of Búzios, Nísia Floresta/RN; and it was observed that, like the C. cupressoides, there were variations in the performance, chemical composition and anticoagulant

activity for ERPs green seaweeds C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides and C. isthmocladum. However, an interesting fact is that each alga responds differently to environmental conditions of the collection site. These data indicate that depending on the time of the year that the algae are collected, the PS extracted from these species of algae may have their chemical structures affected hence its biological activity may be different. These types of studies lead to the clarification of which would be the best conditions to obtain the PS with the structural and biological characteristics of interest, which is essential for the use of these polymers in the industry.

KEYWORDS: green seaweed. anticoagulant activity. Caulerpa cupressoides var. flabellata. Chlorophyta. seasonality. harvest season.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Gêneros de algas verdes utilizados como matérias básicas para se

extrair polissacarídeos sulfatados .....................................................

23

Figura 2 - Polissacarídeos encontrados na parede celular de algas da ordem

Ulvales ..............................................................................................

24

Figura 3 - Modelo clássico de coagulação sanguínea ...................................... 28

Figura 4 - Modelo de coagulação baseado em superfícies celulares ................ 29

Figura 5 - Mecanismos de ação anticoagulante dos polissacarídeos

sulfatados de algas marinhas ...........................................................

32

Figura 6 - Localização do ponto de coleta das algas na Praia de Búzios, litoral

Sul do Rio Grande do Norte ..............................................................

46

Figura 7 - Algas verdes utilizadas neste trabalho ............................................. 47

Figura 8 - Rendimento da extração dos ERPS da alga C. cupressoides de

acordo com o mês de coleta ............................................................

60

Figura 9 - Comportamento eletroforético dos PS da alga C. cupressoides ....... 61

Figura 10 - Quantidade de açúcares totais e sulfato dos ERPS da alga C.

cupressoides de acordo com mês de coleta ......................................

62

Figura 11 - Atividade anticoagulante pelo ensaio de aPTT dos ERPS da alga

C. cupressoides de acordo com o mês de coleta ...............................

63

Figura 12 - Comparação da variação anual do rendimento da extração dos

ERPS da C. cupressoides com parâmetros ambientais do local de

coleta (insolação e salinidade) ..........................................................

65

Figura 13 - Comparação da variação anual da quantidade de sulfato dos ERPS

da C. cupressoides a salinidade da água do mar ..............................

65

Figura 14 - Comparação da variação anual da quantidade de açúcares totais

dos ERPS da C. cupressoides com parâmetros ambientais do local

de coleta (sólidos totais, cloreto, sódio e insolação) ..........................

66

Figura 15 - Rendimento percentual do fracionamento com acetona ................... 69

Figura 16 - Perfil de eluição da fração CCB-0.5 em cromatografia de troca

aniônica em sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)

em equipamento AKTA .....................................................................

71

Figura 17 - Comportamento eletroforético dos PS da alga C. cupressoides ....... 72

Figura 18 - Efeito dos PS FI e FII da C. cupressoides na inativação da trombina

na presença do HCII .........................................................................

77

Figura 19 - Efeito dos PS FI e FII da C. cupressoides na inativação da trombina

na ausência do HCII e da AT .............................................................

77

Figura 20 - Rendimento da extração dos ERPS de acordo com o mês de coleta 78

Figura 21 - Comportamento eletroforético dos PS das algas C. prolifera, C.

racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum ................................

80

Figura 22 - Quantidade de açúcares totais (A) e sulfato (B) dos ERPS das algas

verdes de acordo com o período de coleta ........................................

81

Figura 23 - Atividade anticoagulante dos ERPS das algas verdes de acordo

com o período de coleta ....................................................................

83

Figura 24 - Coeficiente de correlação (n=12) para os parâmetros ambientais do

local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com

a quantidade de açúcares totais e atividade anticoagulante dos

ERPS da C. prolifera .........................................................................

87



o rendimento, composição química e atividade anticoagulante dos

ERPS da C. racemosa ......................................................................

89



o rendimento e composição química dos ERPS da C. sertularioides

91



o rendimento e composição química dos ERPS da C. isthmocladum

93

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Atividades farmacológicas atribuídas aos polissacarídeos sulfatados

extraídos de algas marinhas verdes ..................................................

26

Tabela 2 - Resumo do atual modelo de coagulação baseado em superfícies

celulares ............................................................................................

30

Tabela 3 - Polissacarídeos sulfatados de algas verdes com atividade

anticoagulante ...................................................................................

38

Tabela 4 - Média e variação anual dos fatores ambientais da Praia de

Búzios/RN durante o período de estudo (média ± desvio padrão e

variação, n=12) ..................................................................................

63

Tabela 5 - Coeficiente de correlação (n=12) entre o rendimento, composição

química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides e

os parâmetros ambientais do local de coleta .....................................

67

Tabela 6 - Atividade anticoagulante das frações polissacarídicas da C.

cupressoides .....................................................................................

70

Tabela 7 - Composição química do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS FI e FII

da alga C. cupressoides .....................................................................

73

Tabela 8 - Relação molar dos monossacarídeos ERPS, da fração CCB-0.5 e

dos PS FI e FII da alga C. cupressoides .............................................

73

Tabela 9 - Atividade anticoagulante no teste de aPPT do ERPS, da fração

CCB-0.5 e dos PS purificados FI e FII da C. cupressoides .................

74

Tabela 10 - Atividade anticoagulante no teste de PT do ERPS, da fração CCB-

0.5 e dos PS purificados FI e FII da C. cupressoides ..........................

75

Tabela 11 - Atividade anticoagulante no teste de TT da fração CCB-0.5 e dos

PS purificados FI e FII da C. cupressoides .........................................

76

Tabela 12 - Média e variação anual da quantidade de açúcar e sulfato dos ERPS

(média ± desvio padrão, n=12) e ANOVA (Razão-F e probabilidade)

82

Tabela 13 - Média e variação anual da atividade anticoagulante dos ERPS das

algas verdes (média ± desvio padrão, n=12) e ANOVA (Razão-F e

probabilidade) ....................................................................................

83


química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. prolifera e os

parâmetros ambientais do local de coleta ..........................................

86


química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. racemosa e os

parâmetros ambientais do local de coleta ..........................................

88


química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. sertularioides e

os parâmetros ambientais do local de coleta .....................................

90


química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. isthmocladum

e os parâmetros ambientais do local de coleta ...................................

92

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABS Absorbância

aPTT Tempo de tromboplastina parcial ativada

AT Antitrombina

BIOPOL Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais

CCB-0.3 Fração precipitada com 0,3 volumes de acetona da

C. cupressoides de Búzios







CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

DEAE Dietilaminoetil

CETAVLON Brometo de cetiltrimetilamônio

EMPARN Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande

do Norte

ERPS Extrato rico em polissacarídeo sulfatado

FF Fast flow

FI PS proveniente da CCB-0.5 eluído na faixa de 0,48

- 0,65 M de NaCl

FII PS proveniente da CCB-0.5 eluído na faixa de 0,73

- 0,78 M de NaCl

FIIa Trombina

FIX Fator de Christmas

FPLC Fast Protein Liquid Chromatography

FT Fator tecidual

FUC Fucose

FV Pró-acelerina

FVII Pró-convertina

FVIII Anti-hemofílico

FX Fator de Stuart-Power

FXI Antecedente de tromboplastina

FXII Fator de Hageman

FXIII Fator estabilizante de Fibrina

GAG’s Glicosaminoglicanos

GAL Galactose

GLC Glicose

HCII Cofator II da heparina

MAN Manose

MIN. Minutos

ND Não determinado

NT Não detectado

PDA 1,3 diamino propano acetato

OS Polissacarídeo sulfatado

PT Tempo de protrombina

RHA Ramnose

RN Rio Grande do Norte

TFPI Inibidor da via do fator tecidual

TT Tempo de Trombina

XIL Xilose

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 22

1.1 Polissacarídeos sulfatados de algas marinhas .............................................. 22

1.2 Polissacarídeos sulfatados de algas verdes .................................................. 23

1.3 Atividade anticoagulante de polissacarídeos sulfatados de algas verdes .. 27

1.3.1 Coagulação sanguínea x anticoagulantes ........................................................ 27

1.3.2 Polissacarídeos sulfatados anticoagulantes de algas marinhas ....................... 31

1.4 Carboidratos x período de coleta da alga e parâmetros ambientais ............ 40

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 45

2.1 Objetivo geral .................................................................................................... 45

2.2 Objetivos específicos........................................................................................ 45

3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 46

3.1 Local de coleta .................................................................................................. 46

3.2 Materiais ............................................................................................................. 46

3.2.1 Material biológico ............................................................................................. 46

3.2.3 Outros materiais ............................................................................................... 48

3.2.4 Aparelhos ......................................................................................................... 48

3.3 Métodos .............................................................................................................. 50

3.3.1 Obtenção dos ERPS das algas verdes C. cupressoides, C. prolifera, C.

racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum ........................................................ 50

3.3.2 Obtenção das frações polissacarídicas da C. cupressoides ............................ 50

3.3.3 Obtenção dos PS purificados da C. cupressoides ........................................... 51

3.3.4 Caracterização físico-química das amostras .................................................... 51

3.3.4.1 Eletroforese em gel de agarose .................................................................... 51

3.3.4.3 Análises químicas ......................................................................................... 52

3.3.4.4 Composição monossacarídica ...................................................................... 53

3.3.5 Atividade anticoagulante das amostras ............................................................ 53

3.3.5.1 Ensaio de aPTT, PT e TT .............................................................................. 54

3.3.5.2 Inibição da trombina mediada pela AT .......................................................... 54

3.3.5.3 Inibição da trombina mediada pelo HCII........................................................ 55

3.3.5.4 Inibição direta da trombina ............................................................................ 55

3.3.6 Determinação dos parâmetros ambientais do local de coleta (Praia de Búzios,

Nísia Floresta/RN) ..................................................................................................... 55

3.3.6.1 Coleta da água do mar .................................................................................. 55

3.3.6.2 Obtenção dos dados de precipitação pluviométrica e insolação ................... 56

3.3.6.3 Determinação da salinidade e temperatura da água do mar ......................... 56

3.3.6.4 Determinação de outros parâmetros ambientais ........................................... 56

3.3.7 Análise estatística ............................................................................................ 57

4 RESULTADOS ....................................................................................................... 59

4.1 Parte I: Análise das possíveis mudanças na composição química/atividade

anticoagulante de ERPS da alga C. cupressoides de acordo com o período de

coleta ........................................................................................................................ 59

4.1.1 Rendimento da extração dos ERPS da alga C. cupressoides .......................... 59

4.1.2 Perfil eletroforético dos ERPS da alga C. cupressoides ................................... 60

4.1.3 Composição química dos ERPS da alga C. cupressoides ............................... 61

4.1.4 Atividade anticoagulante dos ERPS da alga C. cupressoides .......................... 62

4.1.5 Parâmetros ambientais do local de coleta ........................................................ 63

4.1.6 Correlações entre o rendimento, composição química e atividade anticoagulante

dos ERPS da C. cupressoides e os parâmetros ambientais do local de coleta ........ 64

4.2 Parte II: Purificação, caracterização e atividade anticoagulante de PS

purificados da alga C. cupressoides ..................................................................... 68

4.2.1 Obtenção das frações polissacarídicas da alga C. cupressoides ..................... 68

4.2.2 Atividade anticoagulante das frações polissacarídicas da alga C. cupressoides69

4.2.3 Purificação da fração CCB-0.5 da alga C. cupressoides .................................. 70

4.2.4 Eletroforese em gel de agarose dos PS FI e FII da alga C. cupressoides ....... 71

4.2.5 Composição química do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS purificados FI e FII

da alga C. cupressoides ............................................................................................ 72

4.2.6 Atividade anticoagulante do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS purificados FI e

FII da alga C. cupressoides ....................................................................................... 74

4.3 Parte III: Análise das possíveis mudanças na composição química/atividade

anticoagulante de ERPS de outras algas verdes de acordo com o período de

coleta ........................................................................................................................78

4.3.1 Rendimento anual e análises químicas dos ERPS das algas verdes .............. 78

4.3.2 Perfil eletroforético dos ERPS das algas verdes .............................................. 79

4.3.3 Composição química dos ERPS das algas verdes .......................................... 80

4.3.4 Atividade anticoagulante dos ERPS das algas verdes ..................................... 83

4.3.5 Correlações entre o rendimento, composição química e atividade anticoagulante

dos ERPS das algas verdes e os parâmetros ambientais do local de coleta ............ 84

5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 94



coleta ........................................................................................................................ 94

5.2 Parte II: Purificação, caracterização e atividade anticoagulante dos PS

purificados da alga C. cupressoides ..................................................................... 98



coleta ......................................................................................................................103

6 CONCLUSÕES .................................................................................................... 110

REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 112

APÊNDICE ............................................................................................................. 126

Introdução 22

Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica

1 INTRODUÇÃO

Os oceanos cobrem mais de 70% da superfície terrestre e são habitados por

uma enorme variedade de seres vivos. Fazem parte desse universo as macroalgas

marinhas que são importantes para a manutenção da estabilidade do ecossistema,

pois suas comunidades produzem nutrientes necessários para reprodução de outros

organismos (PINTO et al., 2002). Além disso, presume-se que por viverem num

ambiente tão hostil, com características únicas, como o ambiente marinho, são

capazes de sintetizar uma diversidade de compostos bioativos com interesse para a

humanidade (RAJAPAKSE; KIM, 2011).

Dentre estes biopolímeros, destacam-se os polissacarídeos, os quais possuem

grande importância para as indústrias alimentícia, cosmética e farmacêutica (AHMED

et al., 2014), como o ágar, carragenana e alginatos, que são bastantes utilizados

comercialmente devido a sua viscosidade e suas propriedades emulsificante e

gelificante (CARDOZO, 2007). Destacam-se também outros tipos de polissacarídeos,

como fucanas, fucoidans e diferentes tipos de homo e heteropolissacarídeos

sulfatados, que ainda não são utilizados comercialmente de forma correspondente ao

seu potencial, mas apresentam um grande apelo econômico devido ao elevado

número de atividades farmacológicas que possuem (NGO; KIM, 2013; JIAO et al.,

2011).

1.1 Polissacarídeos sulfatados de algas marinhas

Por definição os PS são polímeros formados por unidades repetidas de

açúcares e carregados negativamente devido a presença do grupo sulfato

(CARVALHO; GAMA, 2015), estes podem ocorrer na forma de homopolissacarídeos

ou heteropolissacarídeo, dependendo se é formado por um ou por mais de dois

monossaccarídeos diferentes, respectivamente (ROCHA, 2006).

Nas algas marinhas, estes PS se localizam na matriz mucilaginosa e sua

função biológica, nesses seres, ainda não está bem esclarecida, porém, devido ao

seu caráter altamente higroscópico, acredita-se que protejam a alga da desidratação

quando esta é submetida a longos períodos de exposição ao sol durante as marés

baixas. A natureza mucilaginosa destes compostos, também parece contribuir para

tornar a alga flexível o bastante para crescer em ambiente líquido e rígida o suficiente

Introdução 23


para permanecer estendida, e assim, melhor captar a luz e os nutrientes existentes

(PERCIVAL; MCDOWELL, 1967).

Os PS de algas apresentam estruturas bastante diversas, variando de espécie

para espécie e, às vezes, em diferentes partes da mesma alga (DIETRICH et al., 1995;

ALVES, 2000). A seguir, serão descritos os principais dados da literatura relacionados

com a composição e atividades farmacológicas atribuídas a PS de algas verdes, uma

vez, que as espécies estudadas nesta tese fazem parte deste grupo.

1.2 Polissacarídeos sulfatados de algas verdes

De acordo com Wang e colaboradores (2014) cerca de 40 espécies de algas

verdes, pertencentes a oito famílias, foram globalmente usadas para extrair PS. Os

grupos com o maior número de espécies das quais PS foram extraídos e estudados

incluem os gêneros Ulva (38%), Enteromorpha (14%), Monostroma (14%), Codium

(16%) e Caulerpa (11%). Outros gêneros, inclui Capsosiphon, Chaetomorpha,

Bryopsis e Halimeda (7%) (Figura 1).

Figura 1 - Gêneros de algas verdes utilizados como matérias básicas para se extrair polissacarídeos sulfatados.

Fonte: Adaptado de WANG et al., 2014.

Os principais polissacarídeos encontrados na Ordem Ulvales, em especial nas

de espécies do gênero Ulva e Enteromorpha, são as ulvanas, as quais possuem como

principais constituintes sulfato, ramnose, xilose e ácido glucorônico ou idurônico

(LAHAYE; ROBIC, 2007; JIAO et al., 2011; WANG et al., 2014). Estes polímeros

sulfatados são um dos principais constituintes da parede celular dessas algas e

Introdução 24


juntamente com a celulose, xiloglucanas e glucuronanas representam em torno de 38

- 54% do peso seco da alga (LAHAYE; ROBIC, 2007). A distribuição e associações

destes polissacarídeos na parede celular da Ulva é descrito esquematicamente no

modelo apresentado na Figura 2.

Figura 2 - Polissacarídeos encontrados na parede celular de algas da ordem Ulvales.

Fonte: Adaptado de LAHAYE; ROBIC, 2007.

Já as espécies do gênero Codium sintetizam arabinanas e arabinogalactanas

sulfatadas e, principalmente, galactanas sulfatadas, no entanto, estes polímeros são

mais heterogêneos e complexos do que as galactanas sulfatadas sintetizadas por

algas vermelhas (WANG et al., 2014). Por exemplo, da alga Codium isthmocladum

purificou-se uma galactana sulfatada composta preponderantemente de unidades -3)-

β-D-galactopiranose-(1-, sendo a maioria delas sulfatada em C4, esta galactana ainda

possue menores quantidades de unidades -3)β-D-galactopiranose(4,6-di-O-(SO4 )-(1,

ramificações -6)β-D-galactopiranose(4-mono-O-(SO4)-(1- e uma substituição

característica dos terminais não redutores, o resíduo 3,4-O-(1’-carboxi)-etilideno, cetal

cíclico com cinco membros (FARIAS, 2011). Outra galactana sulfatada, também

extraída de C. isthmocladum é formada por β-D-galactopiranoses unidas por ligações

β-1,6 (predominante) e β-1,3. Alguns resíduos de galactoses apresentam sulfatação

em C4 ou em C6, e algumas galactoses em posição não redutora apresentam

piruvatação na forma de 3,4-O-(1’-carboxi)-etilideno, cetal cíclico com cinco membros

(SABRY, 2010). Como exemplos de algas desse gênero que sintetizam outros PS que

não galactanas tem-se a alga C. dwarkense, de onde foram extraídas

Introdução 25


arabinogalactanas sulfatadas (SIDDHANTA et al., 1999) e a C. latum de onde se

obteve arabinanas sulfatadas (UEHARA; TAKESHITA; MAEDA, 1992).

Os PS extraídos de espécies do gênero Caulerpa são mais heterogêneos do

que as espécies de algas das famílias Codiaceae e Ulvaceae. Estes

heteropolissacarídeos são constituídos por diferentes monossacarídeos, sendo a

galactose o açúcar principal e xilose, glicose, arabinose e manose os outros

componentes comuns (WANG et al., 2014). Este fato pode ser observado com os PS

da C. racemosa, a qual sintetiza uma xiloarabinogalactana sulfatada

(CHATTOPADHYAY et al., 2007) e para PS de duas espécies de Caulerpa que vem

sendo estudadas pelo grupo de pesquisa a qual está inserida esta tese, a C.

cupressoides var. flabellata (COSTA et al., 2012) e C. prolifera (CÂMARA, 2015),

ambas apresentam galactose como principal monossacarídeo, no entanto, as frações

polissacarídicas obtidas dessas algas também apresentam outros monossacarídeos

como: glicose, xilose, manose e fucose. Mas isso não é uma regra, pois a C.

sertularioides, estudada por Shevchenko e colaboradores (2009), sintetiza uma

homogalactana sulfatada que é composta por unidades de -3)β-D-galactopiranose-(1-

e -6)β-D-galactopiranose-(1- sulfatada em C2.

Por fim, do gênero Monostroma obtem-se predominantemente ramnanas

sulfatadas. Harada e Maeda (1998) extraíram da Monostroma nitidum uma ramnana

sulfada, constituída por resíduos de L-ramnose α-(1→3) ligados, alguns dos quais

foram substituídos com grupos sulfato, principalmente, na posição O-2. Já da M.

latissimum obteve-se uma ramnana sulfatada com resíduos α-(1→3)- e α-(1→2)-

ligados, com sulfatação na posição 3 dos resíduos α-(1→2)-ligados (LEE et al., 1998).

Diversas atividades farmacológicas vêm sendo atribuídas aos polissacarídeos

sulfatados de algas verdes. A Tabela 1 sumariza algumas destas atividades.

Introdução 26


Tabela 1 - Atividades farmacológicas atribuídas aos polissacarídeos sulfatados extraídos de algas marinhas verdes.

ATIVIDADE ALGA REFERÊNCIA

Antiadesiva Ulva rotundata GADENNE et al., 2013

Antiadipogênica Caulerpa prolifera CAMARA, 2015

Antiangiogênica Codium cylindricum MATSUBARA et al., 2003

Antimicrobiana Caulerpa racemosa PIRES et al., 2013

Antinociceptiva

Caulerpa cupressoides

Caulerpa racemosa

Codium isthmocladum

RODRIGUES et al., 2012

RIBEIRO et al., 2014

CORDEIRO, 2013

Antioxidante


Caulerpa prolifera

Caulerpa sertularioides

Codium isthmocladum

Enteromorpha linza

Enteromorpha prolifera

Ulva fasciata

Ulva pertusa

COSTA et al., 2012

CAMARA, 2015

COSTA et al., 2010

COSTA et al., 2010

WANG et al., 2013

LI et al., 2013

SHAO et al., 2013

QI et al., 2005

Antitumoral

Caulerpa racemosa

Enteromorpha intestinalis

Monostroma nitidum

Ulva lactuca

Ulva fasciata

JI et al., 2008

JIAO et al., 2009

KARNJANAPRATUM; YOU, 2011

KAEFFER et al., 1999

SHAO et al., 2013

Imunomodulatória

/anti-inflamatória

Capsosiphon fulvescens

Caulerpa lentillifera

Caulerpa racemosa


Codium fragile

Monostroma nitidum

Ulva rigida

NA et al., 2010

MAEDA et al, 2012

RIBEIRO et al., 2014

RODRIGUES et al., 2012

LEE et al., 2010a

KARNJANAPRATUM; YOU, 2011

LEIRO et al., 2007

Introdução 27


Antiviral

Caulerpa racemosa

Gayralia oxysperma

Monostroma latissimum

Monostroma nitidum

GHOSH et al., 2004;PUJOL et al., 2012

CASSOLATO et al., 2008

LEE et al., 1999

LEE et al., 2010b

Fonte: Autoria própria

1.3 Atividade anticoagulante de polissacarídeos sulfatados de algas verdes

1.3.1 Coagulação sanguínea x anticoagulantes

O entendimento sobre a bioquímica do processo de coagulação sanguínea

iniciou-se na década de 40, quando Paul Owren (1947) reconheceu que a diatese

hemorrágica, tendência a sangramento sem causa aparente, em uma jovem não

poderia ser explicado pelo conceito de 4 fatores de coagulação vigente na época,

sugerindo que ela teria perdido um quinto fator de coagulação de seu plasma.

Estudos sobre o processo de coagulação foram sendo ampliados ao longo das

décadas de 40 e 50 e vários outros fatores de coagulação foram sendo descobertos;

e estes fatores foram designados por algarismos romanos de acordo com sua

sequência de descoberta (RIDDEL et al., 2007; VINE, 2009).

No entanto, somente na década de 60 foi que se tornou claro como estes

múltiplos fatores interagem para converter a protrombina em trombina, resultando na

formação de um coágulo de fibrina. Estudos realizados por dois grupos independentes

de bioquímicos (o grupo de Macfarlane e o de Davie e Ratnoff) em 1964 investigaram

como estes múltiplos fatores interagiam e propuseram um modelo “cascata” e

“cachoeira” de coagulação, respectivamente. Em ambos os casos o processo de

coagulação se dava numa série de passos em que a ativação de cada um dos fatores

de coagulação leva à ativação de um outro, culminando na formação de trombina

(RIDDEL et al., 2007).

De acordo com estes modelos o mecanismo de coagulação é dividido

inicialmente em duas vias: via intrínseca, assim chamada porque todos os

componentes estão presentes no sangue; e via extrínseca, em que a proteína da

membrana das células subendoteliais, o fator tecidual (FT), é necessária, além de

componentes circulantes (Figura 3).

Introdução 28


A via extrínseca é desencadeada pela formação do complexo Fator Tecidual

(FT): Fator VIIa (FVIIa) que resulta na ativação do fator X. Já a via intrínseca é iniciada

pela ativação do fator XII (FXII), quando o sangue entra em contato com qualquer

superfície contendo cargas negativas (ativação por contato), este processo requer

ainda a presença de outros componentes do plasma: pré-calicreína (uma serino-

protease) e cininogênio de alto peso molecular (um cofator não enzimático). O fator

XII ativo (FXIIa), desencadeia uma série de ativações proteicas, que culmina na

ativação do fator X (VINE, 2009).

O ponto de convergência das vias extrínseca e intrínseca é conhecido como

via comum da coagulação e é caracterizada pela ativação de fibrinogênio à fibrina

pela trombina, formando uma malha de fibrina que vai ser estabilizada pelo fator XIIIa

(FERREIRA et al., 2010).

Figura 3 - Modelo clássico de coagulação sanguínea. HMWK – cininogênio de alto peso molecular.

Fonte: Adaptado de RIDDEL, et al. 2007.

Introdução 29


Embora o modelo de cascata da coagulação descreva as interações

bioquímicas dos fatores de coagulação e tenha sido um avanço significativo no

entendimento da coagulação, observações experimentais e clínicas demonstraram

que a hipótese da cascata não reflete completamente os eventos da hemostasia in

vivo. Por isto, um novo modelo de coagulação foi proposto e denominado de modelo

celular de coagulação ou modelo da coagulação com base na superfície celular

(Figura 4).

Figura 4 - Modelo de coagulação baseado em superfícies celulares. Representação do modelo da coagulação baseado em superfícies celulares compreendendo as fases de iniciação, amplificação e propagação. FT – Fator tecidual, a – ativado, FvW – Fator de von Willebrand).

Fonte: Adaptado de FERREIRA et al., 2010.

Este modelo enfatiza a interação entre os fatores solúveis, a membrana celular

e a célula, todos são considerados elementos essenciais para o processo de

coagulação. O novo modelo realça a importância de um complexo TF/FVIIIa na fase

de ativação do sistema e propõe a ativação do processo de coagulação sobre

Introdução 30


diferentes superfícies celulares em quatro fases que se sobrepõem: iniciação,

amplificação, propagação e finalização (VINE et al., 2009; FERREIRA et al., 2010).

Estas fases estão resumidas na Tabela 2.

Tabela 2 - Resumo do atual modelo de coagulação baseado em superfícies celulares. Fases da coagulação

Iniciação Amplificação Propagação Finalização

Endotélio vascular e

células sanguíneas

circulantes são

perturbados;

Interação do FVIIa

derivado do plasma

com o FT.

Trombina ativa

plaquetas, cofatores

V e VII, e fator XI na

superfície das

plaquetas.

Produção de grande

quantidade de

trombina, formação

de um tampão

estável no sítio da

lesão e interrupção

da perda sanguínea.

Processo da

coagulação é

limitado para evitar a

oclusão trombótica

ao redor das áreas

íntegras dos vasos.

Fonte: FERREIRA et al., 2010.

A coagulação sanguínea é controlada por anticoagulantes que sob condições

normais prevalecem sobre as forças procoagulantes (DAHLBACK; VILLOUTREIX,

2005). As reações bioquímicas da coagulação devem ser reguladas para evitar a

ativação excessiva, formação inadequada de fibrina e a oclusão vascular. Os

inibidores fisiológicos da coagulação (anticoagulantes naturais) de maior relevância

fisiológica são a AT, também chamada de antitrombina III pela literatura mais antiga;

TFPI (inibidor da via do fator tecidual); proteína C e proteína S (KUBIER; O’BRIEN,

2012).

Anticoagulantes têm sido amplamente utilizados para o tratamento de sangue

durante diálises e cirurgias; como fármacos em várias doenças, como coagulação

intravascular disseminada e trombose; e para testes sanguíneos in vitro (WANG et al.,

2010).

O principal fármaco anticoagulante, usado há mais de 80 anos, é a heparina,

um polissacarídeo sulfatado de origem animal, extraído de intestino de suínos e

pulmão de bovinos, constituído por unidades dissacarídicas repetitivas, onde um dos

resíduos é uma hexosamina (glucosamina); e o outro, um ácido urônico (L-idurônico

e D-glucurônico), a sulfatação pode ocorrer em vários pontos da molécula (NADER et

al., 2004). No entanto, o uso deste composto pode provocar algumas reações

adversas, como trombocitopenia decorrente do seu uso prolongado (FABRIS et al.,

Introdução 31


2000) e efeito hemorrágico residual, apresentado por fragmentos da heparina sem

atividade anticoagulante (NADER et al., 1979; 2004). Heparinas de baixo peso

molecular, obtidas a partir de hidrólise da heparina não fracionada também são

utilizadas como anticoagulante. A enoxaparina (que pode ter como nome comercial

Clexane®), é uma das heparinas de baixo peso molecular mais utilizada em uma

ampla variedade de doenças tromboembólicas e tem várias vantagens sobre a

heparina não fracionada (IQBAL; COHEN, 2011). No entanto, quadros de hemarragias

ainda são comuns em pacientes que fazem uso deste medicamento (CROWTHER;

WARKENTIN, 2008; NEVIASER et al., 2010).

Portanto, se faz necessário a busca por novos compostos anticoagulantes, que

apresentem menos reações adversas e que possam vir a substituir a heparina e/ou

as heparinas de baixo peso molecular, ou os seus usos em algumas situações

específicas.

1.3.2 Polissacarídeos sulfatados anticoagulantes de algas marinhas

Os PS de algas marinhas têm uma grande variedade de atividades biológicas,

mas a sua ação anticoagulante é a mais amplamente estudada (WANG et al., 2014).

Apesar do modelo de coagulação sanguínea em “cascata” (Figura 3, página

28) ter sido considerado inadequada do ponto vista fisiológico, a divisão do processo

de coagulação em vias, como propõem este modelo, ainda é utilizado para

interpretação de testes laboratoriais que avaliam a coagulação sanguínea. Por

conseguinte, a atividade anticoagulante dos PS é geralmente avaliada por esses

testes, como: tempo de protrombina (PT) e tempo de tromboplastina parcial ativada

(aPTT), que avaliam se o polissacarídeo age nas vias extrínseca e intrínseca da

coagulação, respectivamente; e pelo tempo de trombina (TT), que é o teste para a via

comum da coagulação, que avalia a formação de fibrina mediada por trombina

(CIANCIA; QUINTANA; CEREZO, 2010).

A ação anticoagulante dos polissacarídeos sulfatados reside, principalmente,

na potencialização dos inibidores naturais das proteases (trombina e fator Xa) do

plasma: antitrombina (AT) e cofator II da heparina (HCII). Esses PS podem agir por

dois mecanismos distintos: induzindo a mudança alostérica nas serpinas (AT e HCII)

ou a cadeia do PS pode atuar como uma ''ponte'', aproximando a protease à serpina

(NADER et al., 2004; CIANCIA; QUINTANA; CEREZO, 2010). No entanto, há casos

Introdução 32


de PS que exibem um efeito anticoagulante independente de serpinas, por exemplo,

inibindo diretamente a atividade da trombina (MATSUBARA et al., 2001; MAO et al.,

2006). O mecanismo de ação dos PS sob as proteases trombina e fator Xa pode ser

avaliado por testes in vitro utilizando substratos cromogênicos na presença ou

ausência de serpinas (CIANCIA; QUINTANA; CEREZO, 2010).

A Figura 5 sumariza os mecanismos de ação anticoagulante dos PS de algas

marinhas.

Figura 5 - Mecanismos de ação anticoagulante dos polissacarídeos sulfatados de algas marinhas. PS – polissacarídeo sulfatado, X – fator X inativo, Xa – fator X ativo, Va – fator V ativo, AT – antitrombina, HCII – cofator II da heparina, TFPI – inibidor da via do fator tecidual, HS – heparan sulfato.

Fonte: Adaptado de Costa (2012).

Em 1936 foi feito o primeiro relato de um PS de alga anticoagulante, uma

galactana sulfatada extraída da alga vermelha Iridaea laminarioides (CHARGAFF;

BANCROFT; STANLEY-BROWN, 1936). A partir de então, foi crescente o interesse

em se estudar polissacarídeos sulfatados anticoagulantes de algas marinhas. Sendo

os mais bem estudados, os extraídos das algas marrons (ALBUQUERQUE et al.,

2004; SILVA et al., 2005; ATHUKORALA et al., 2007; MEDEIROS et al., 2008;

AZEVEDO et al., 2009) e vermelhas (FARIAS et al., 2000; ROCHA et al., 2006;

FONSECA et al., 2008; ALVES, 2015).

Apesar de o primeiro relato de polissacarídeos sulfatados anticoagulantes de

algas marinhas ter sido feito em 1936 (CHARGAFF; BANCROFT; STANLEY-BROWN,

Introdução 33


1936), só em 1985 verificou-se a presença de polissacarídeos sulfatados com

atividade anticoagulante em algas verdes (DEACON-SMITH; LEE-POTTER;

ROGERS, 1985).

Dentre as algas verdes, o gênero Codium é aquele que tem o maior número de

espécies com PS extraídos e avaliados quanto ao seu potencial anticoagulante.

Dentre as espécies de Codiaceae, a alga Codium fragile foi a que teve seus

polissacarídeos sulfatados anticoagulantes mais estudados, sendo extraídos por

metodologias diferentes por 4 grupos de pesquisadores (JURD et al., 1995;

HAYAKAWA et al. 2000; CIANCIA et al., 2007; ATHUKORALA et al., 2007), o que

proporcionou a obtenção de polímeros diferentes da mesma alga. Apesar de terem

sido obtidos através de métodos de extração distintos os PS obtidos apresentaram

mecanismo de ação anticoagulante similar, que foi a inibição da trombina, via

potencialização da ação HCII e da atividade da AT (JURD et al., 1995; HAYAKAWA

et al., 2000). Posteriormente em 2007, Ciancia e colaboradores e Athukorala e

colaboradores avaliaram a atividade anticoagulante dos PS da C. fragile pelos ensaios

anticoagulantes de aPTT, PT e TT; e verificaram que estes polímeros foram capazes

de prolongar o tempo de coagulação apenas nos ensaios de aPTT e TT, indicando

que agem na via intrínseca e/ou comum da coagulação (CIANCIA et al., 2007;

ATHUKORALA et al., 2007).

Das algas C. divaricatum, C. adhaerence e C. latum foram extraídos PS ricos

em arabinose que possuem a capacidade de inibição da trombina, via potencialização

da ação HCII e da atividade da AT. Estes autores também verificaram que os PS

destas algas eram capazes de interagir com o HCII em sítios distintos de onde interage

a heparina e o dermatan sulfato (HAYAKAWA et al., 2000).

Da alga Codium dwarkense foram purificadas por troca iônica, seguida por gel

filtração, arabinanas sulfatadas e arabinogalactanas sulfatadas, as quais

apresentaram excelente atividade nos diversos ensaios anticoagulante in vitro (aPTT,

PT e TT) (SIDDHANTA et al., 1999). Posteriormente, um outro PS, rico em galactose

e arabinose, foi obtido desta mesma alga e apresentou atividade anticoagulante pelo

teste de PT. Vale salientar que neste trabalho este foi o único teste anticoagulante

realizado (SHANMUGAM et al., 2002).

Extratos de PS das algas C. indicum, C. tomentosum e C. geppi também foram

avaliados por Shanmugam e colaboradores (2002) e como os da C. dwarkense,

Introdução 34


também apresentaram excelente atividade nos ensaios de PT (SHANMUGAM et al.,

2002). Contudo, os estudos com os PS dessas algas como agentes anticoagulantes

não foi continuado.

Matsubara e colaboradores (2001) demonstram que um PS rico em galactose

e com pequenas quantidades de glicose de C. cylindricum apresentou atividade nos

testes aPTT e TT, porém não teve atividade no teste de PT. Quando estes autores

analisaram o mecanismo de ação deste polímero, verificaram que o mesmo não teve

a capacidade de potencializar as serpinas AT e HCII e por isto os autores sugeriram

que o mecanismo de ação deste polímero é diretamente inibindo a polimerização da

fibrina ou inibindo a via intrínseca da coagulação sem agir na AT (MATSUBARA et al.,

2001). Contudo, os autores não apresentaram resultados que confirmasse ou

refutassem nenhumas dessas duas hipóteses.

Outra espécie estudada foi a Codium vermilara, que teve polissacarídeos

sulfatados anticoagulantes ativos nos testes de aPTT e TT, porém estes não

apresentaram atividade no ensaio de PT (CIANCIA et al., 2007). Neste caso, o

mecanismo de ação do PS não foi avaliado.

Já da alga Codium isthmocladum foram obtidas frações ricas em galactose,

manose e arabinose e sulfato que apresentaram atividade pelo ensaio de aPTT,

porém não apresentaram atividade quando submetidas ao teste de PT, uma destas

frações foi purificada por cromatografia de troca iônica, obtendo-se uma galactana

sulfatada também com potente ação anticoagulante pelo teste de aPTT (FARIAS,

2006).

O segundo gênero de algas verdes mais estudado em relação a PS

anticoagulantes é o gênero Monostroma. Uma atividade relativamente alta em inibir a

trombina foi encontrada para extratos de PS de M. nitidum (MAEDA et al., 1991). Um

polissacarídeo ativo destes extratos foi purificado por cromatografia de troca iônica e

gel filtração, obtendo-se um homopolissacarídeo (ramnana sulfatada), que foi capaz

de inibir a trombina de forma seis vezes mais potente que a heparina (HARADA;

MAEDA, 1998). Posteriormente, dois polissacarídeos sulfatados ricos em ramnose,

com pequenas quantidades de glicose e xilose, foram obtidos desta mesma alga por

Mao e colaboradores (2008), os mesmos apresentaram alta atividade anticoagulante

pelos testes de aPTT e TT e foram potentes inibidores da trombina mediado pelo HCII.

Introdução 35


Estes PS também aceleraram a inibição da trombina e do factor Xa pela potenciação

AT, mas com menor eficácia.

Uma ramnana sulfatada anticoagulante também foi encontrada na alga M.

latissimum, este PS é formado por resíduos de ramnose 1,3- e 1,2-ligados, numa

razão de 3:2, o sulfato encontra-se, principalmente, na posição C3 ou C4 dos resíduos

de ramnose 1,2-ligados (LEE et al., 1998).

Zhang e colaboradores (2008) extraíram desta mesma alga outra ramnana, no

caso uma heteroramanana sulfatada com massa molecular de 725,4 kDa, e este foi

fragmentado por degradação com H2O2 em 5 fragmentos com massa molecular de

216,4; 123,7; 61,9; 26,0 e 10,6 kDa. Estes fragmentos apresentaram composição e

estrutura química similares entre si, sendo também ricos em ramnose. Os mesmos

tiveram atividade anticoagulante pelos testes de aPTT e TT. Os dados mais relevantes

desses autores foi demonstrar que os fragmentos de maior massa molecular

possuíam maior atividade anticoagulante em comparação com os de menor massa

molecular. Este foi um dos primeiros artigos que mostrou com correlação entre a

massa molecular de PS de algas verdes e atividade anticoagulante.

Nos anos seguintes, não houve mais referências a essa ramnana de alta massa

molecular, e este mesmo grupo de pesquisa passou a publicar trabalhos com

ramnanas de massa molecular menor extraídas de M. latissimum. Para tal, o grupo

submeteu extratos aquosos obtidos de M. latissimum a cromatografia de troca iônica

e obteve três frações de PS, as quais foram eluídas com 0,5; 2,0 e 3,0 M de NaCl

(MAO et al., 2009; LI et al., 2011). No primeiro trabalho do grupo a fração obtida com

0,5 M de NaCl foi submetida a cromatografia de gel filtração e assim obteve-se uma

ramnana sulfatada de 55 kDa, composta principalmente por resíduos de L-ramnose

1,2-ligados sulfatados em C3 e/ou C4, este PS apresentou atividade pelos testes de

aPTT e TT, além disso, os autores propuseram que o mecanismo de ação deste PS

era promovendo a inibição da trombina mediada pelo HCII (MAO et al., 2009). Apesar

da estrutura dessa ramnana se assemelhar com aquela descrita por Lee

colaboradores (1998), Mao e colaboradores (2009) não fazem referências a estes. Já

no trabalho de Li e colaboradores (2011), da fração de PS obtida com 2,0 M de NaCl,

após cromatografia de gel filtração, obteve-se outra ramnana sulfatada, com massa

molecular de 513 kDa, formada por resíduos de α-L-ramnose (1→3)-ligados, α-L-

ramnose (1→2)-ligados e resíduos de α-L-ramnose (1→2,3)-ligados, em uma razão

Introdução 36


molar de 4:1:1, podendo haver sulfatação em C2 dos resíduos de α-L-ramnose (1→3)-

ligados e em C3 de resíduos de α-L-ramnose (1→2)-ligados. Esta ramnana também

apresentou atividade nos testes de aPTT e PT, de acordo com os autores as

ramnanas obtidas foram mais potentes do que PS obtidos por Zhang e colaboradores

(2008) e Mao e colaboradores (2009) (LI et al., 2011). No entanto, o mecanismo de

ação desta nova ramnana não foi proposto por Li e colaboradores (2011).

Posteriormente, a ramnana sulfatada obtida por Li e colaboradores (2011), a

qual tinha massa molecular aproximadamente de 513 kDa, foi degrada por hidrólise

ácida e obteve-se um polissacarídeo de baixa massa molecular (aproximadamente

33,6 kDa), formada por resíduos α-L-ramnose 1,3-ligados, sulfatada parcialmente em

C2. Este PS também teve a capacidade de prolongar o tempo de coagulação no

ensaio de aPTT e foi potente inibidor da trombina mediada pelo HCII (LI et al., 2012).

Espécies de Ulva e Enteromorpha também vem tendo seus PS anticoagulantes

extraídos e avaliados. Por exemplo, PS ricos em ramnose extraídos da Ulva

conglobata agem inibindo diretamente a trombina ou potencializando a ação do HCII

(MAO et al., 2006). Já da alga E. clathrata foi extraída uma arabinana sulfatada,

formada principalmente por resíduos de α-L-ramnopiranose (1→4)-ligados,

parcialmente sulfatados em C3 (QI et al., 2012) e da alga E. linza foram extraídos

polissacarídeos ricos em ramnose e xilose (WANG et al. 2013), os polissacarídeos de

ambas as espécies tiveram ação anticoagulante quando submetidos aos ensaios de

aPTT e TT, porém não apresentaram atividade anticoagulante no ensaio de PT,

indicando que os mesmos agem na via intrínseca e/ou comum da coagulação.

O interesse por polissacarídeos anticoagulantes de espécies da família

Caulerpaceae também vem crescendo nos últimos anos, no entanto, diferente dos

trabalhos citados anteriormente para espécies de Monostroma e Codium, a maioria

dos trabalhos com espécies de Caulerpa se detem aos testes clássicos de atividade

anticoagulante (aPTT, PT e TT), não sendo o mecanismo de ação destes polímeros

explorados.

Caulerpa okamurai e Caulerpa brachypus possuem polissacarídeos sulfatados

anticoagulantes, os quais são ricos em galactose e têm um efeito específico na

inibição da trombina dependente do HCII (HAYAKAWA et al., 2000).

Costa e colaboradores 2010 estudaram a atividade anticoagulante de extratos

ricos em PS de 11 algas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte, destas 3 foram

Introdução 37


Caulerpaceae (Caulerpa cupressoides var. flabellata, Caulerpa prolifera e Caulerpa

sertularioides). Todos os extratos obtidos das algas verdes apresentaram atividade

anticoagulante pelo teste de aPTT, e, interessantemente, das 11 espécies estudadas,

o extrato da C. cupressoides foi o único que teve a capacidade de prolongar o tempo

de coagulação no teste de PT (COSTA et al., 2010). Posteriormente, o extrato rico em

polissacarídeos de C. cupressoides foi fracionado e se obteve quatro frações ricas em

galactose denominadas de CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0 todas

apresentaram atividade pelos testes de aPTT e PT de maneira dose-dependente,

além disso CCB-0.3, CCB-0.5 apresentaram atividade semelhante a Clexane®, uma

heparina de baixo peso molecular comercial (COSTA et al., 2012).

Um grupo do estado do Ceará também vem trabalhando com polissacarídeos

sulfatados anticoagulantes de C. cupressoides, porém da variedade lycopodium.

Dessa alga obteve-se um polissacarídeo anticoagulante por cromatografia de troca

iônica, seguida por gel filtração, com potente ação anticoagulante pelo teste de aPPT,

o qual age inibindo a trombina na presença da AT (RODRIGUES et al. 2011a;

RODRIGUES et al. 2011b).

Recentemente, a atividade anticoagulantes de extratos de PS de mais 3

espécies de algas verdes (Penicillus capitatus, Udotea flabellum e Halimeda opuntia)

foi avaliada. Todos os extratos são formados por heteropolissacarídeos sulfatados e

tiveram atividade anticoagulante pelos testes de aPTT e TT, no entanto, não tiveram

a capacidade de prolongar o tempo de coagulação no ensaio de PT. O extrato da P.

capitatus foi purificado e observou-se que a fração denominada de F1 também teve

atividade pelos testes de aPTT e TT e foi capaz de inibir a formação de fibrina (ARATA

et al., 2015).

A Tabela 3 sumariza os dados descritos acima a respeito da atividade

anticoagulante de PS de algas verdes.

Introdução 38


Tabela 03 - Polissacarídeos sulfatados de algas verdes com atividade anticoagulante.

Família Espécie Composição química aPTT PT TT ATa HCIIb IIac Ref.d

Cod

iace

ae

C. adhaerence xiloglucoarabinana nd nd nd + + - 1

C. cylindricum glucogalactana + - + - - + 2

C. divaricatum xiloglucoarabinana nd nd nd + + - 1

C. dwarkense

arabinana/

arabinogalactana

galactoarabinana

+

nd

+

+

+

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

3

15

C. fragile

nd

xiloarabinana

glucoarabinogalactomanana

nd

+

nd

+

+

-

nd

-

-

+

nd

+

+

+

+

nd

nd

+

+

nd

nd

-

-

nd

nd

4

1

5

16

C. geppi nd nd + nd nd nd nd 15

C. isthmocladum arabinomanogalactanas /

galactanas + - nd nd nd nd 6

C. indicum nd nd + nd nd nd nd 15

C. latum arabinana

arabinana

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

+

nd

+

+

-

7

1

C. pugniformes galactoarabinoglucana + - + + - + 17

C. tomentosum galactoarabinana nd + nd nd nd nd 15

C. vermilara glucoarabinogalactomanana + - + nd nd nd 5

Cau

lerp

acea

e

C. brachypus galactana nd nd nd - + - 1

C. cupressoides

var. flabellata

xiloglucomanogalactanas /

manogalactanas + + nd nd nd nd 20

C. cupressoides

var. lycopodium

nd

nd

+

nd

-

nd

nd

nd

nd

+

nd

nd

nd

nd

22

21

C. prolifera nd + - nd nd nd nd 23

C. sertularioides nd + - nd nd nd nd 23

C. okamurai manoxilogalactana nd nd nd - + - 1

Halim

edaceae

H. opuntia glucomanogalactanas + - + nd nd nd 26

Introdução 39


1 - HAYAKAWA et al., 2000. 2 - MATSUBARA et al., 2001. 3 - SIDDHANTA et al., 1999. 4 - JURD

et al., 1995. 5 - CIANCIA et al., 2007. 6 - FARIAS, 2006. 7 – UEHARA; TAKESHITA; MAEDA,

1992. 8 - LEE et al., 1998. 9 - ZHANG et al., 2008. 10 - MAO et al., 2009. 11 - MAEDA et al., 1991.

12 - HARADA; MAEDA, 1998. 13 - MAO et al., 2008. 14 – MAO et al., 2006. 15 - SHANMUGAN

et al., 2002. 16 - ATHUKORALA et al., 2007. 17 - MATSUBARA et al., 2000. 18 – QI et al., 2012.

19 – WANG et al., 2013. 20 – COSTA et al., 2012. 21 – RODRIGUES et al., 2011a. 22 –

RODRIGUES et al., 2011b. 23 – COSTA et al., 2010. 24 – LI et al., 2011. 25 – LI et al., 2012. 26

– ARATA et al., 2015. a Inibição da trombina via AT; b Inibição da trombina via HCII; c Inibição direta

da trombina; d Referências. + apresenta atividade, - não apresenta atividade, nd – não determinado

Fonte: Autoria própria.

A partir dos dados sumarizados na Tabela 3 observa-se que todos os PS que

foram avaliados pelo teste de aPTT e TT tiveram atividade anticoagulante. Além disso,

quando se observa os dados do teste de PT, dos 26 PS que foram avaliados por este

teste apenas 6, em sua maioria do gênero Codiaceae, tiveram atividade. Isso leva a

propor que, com poucas exceções, a via de ação PS anticoagulantes de algas verdes

se dá na via íntriseca e comum da cascata de coagulação. Ainda, pode-se perceber

que esses PS são potentes inibidores da trombina, principalmente, via serpinas HCII

e AT, visto que quando avaliados em testes específicos de inibição desta protease

Mo

nostr

om

ata

cea

e

M. latissimum

ramnana

glucuronoglucoxiloramnana

xiloglucoramnana

xiloglucoramnana

ramnana

ramnana

nd

nd

+

+

+

+

nd

nd

-

-

-

nd

nd

nd

+

+

+

nd

nd

+

nd

+

nd

+

nd

+

nd

+

nd

+

+

-

nd

-

nd

-

8

1

9

10

24

25

M. nitidum

glucuronoglucoramnana

ramnana

glucuronoglucoxiloramnana

sulfatada

xilogalactoglucoramnana

manoxiloglucoramnana

nd

nd

nd

+

+

nd

nd

nd

-

-

nd

nd

nd

+

+

nd

nd

+

+

+

nd

nd

+

+

+

+

+

-

+

+

11

12

1

13

13

Ulv

ace

ae

U. conglobata glucofucoramanas + nd nd + + + 14

E. clathrata arabinana + - + nd nd nd 18

E. linza xiloarabinana + - + nd nd nd 19

Udo

teace

ae

P. capitatus glucogalactanas /

galactoglucanas + - + nd nd nd 26

U. flabellum glucogalactanas + - + nd nd nd 26

Introdução 40


apresentaram significante capacidade de inibi-la via HCII (87,5% dos que foram

avaliados no teste) e via AT (82,4% dos que foram avaliados no teste).

1.4 Carboidratos x período de coleta da alga e parâmetros ambientais

As alterações nas estruturas dos polissacarídeos podem ocorrer em todos os

seres vivos. Por exemplo, com relação a animais, há trabalhos com mais de trinta

anos que já demonstram a influência de parâmetros ambientais na

composição/estrutura destes polímeros. Na década de 80, Nader e colaboradores

investigaram a correlação entre a quantidade de PS, conhecidos como

glicosaminoglicanos (GAG's), e a salinidade da água, para tanto, selecionaram

espécies semelhantes de três grupos de invertebrados (Crustacea, Pelecypoda e

Gastropoda) provenientes de habitat de diferentes salinidades e verificaram que há

correlação direta entre o logaritmo da concentração de GAG’s e o grau de salinidade

do habitat (NADER et al., 1983).

Um outro invertebrado que teve as mudanças em seus PS investigadas em

relação aos parâmetros ambientais do local de coleta foram os PS produzidos pelo

ouriço do mar Lytechinus variegatus. Cinelli e colaboradores (2007) demonstraram

que essa espécie produz uma fucana sulfatada durante todas as estações do ano,

denominada de P1, e que no inverno, além da P1, o ouriço produz outro tipo de fucana

sulfatada, a P2, ambas com estruturas distintas, de acordo com os autores,

aparentemente, há uma correlação entre temperatura da água do mar e a síntese da

P2.

Além disso, de acordo com Aquino e colaboradores (2005), a ocorrência de PS

de angiospermas marinhas resulta da adaptação fisiológica, devido à pressão

ambiental, principalmente da salinidade, uma vez que estão ausentes nas plantas

terrestres e de água doce. Fato este que foi também comprovado por Aquino, Grativol

e Mourão (2011), estes autores analisaram PS de halófitas (plantas resistem a

salinidade) artificialmente e naturalmente expostas a diferentes salinidades e

demostraram que a concentração de PS, bem como o grau em que estes compostos

foram sulfatados nas espécies de halófitas, foram correlacionados positivamente com

a salinidade. Além disso, quando cultivaram a planta Ruppia maritima na ausência de

salinidade, a mesma deixou de produzir PS, sugerindo, assim, que a sulfatação destes

polissacarídeos seja uma adaptação ao meio salino.

Introdução 41


No entanto, posteriormente, a presença de PS também foi descrita na planta

de água doce Eichhornia crassipes (DANTAS-SANTOS et al., 2012), estes autores

sugeriram que a produção de PS em plantas de água doce não está relacionado ao

estresse salino, e que outros fatores poderiam promover a sua produção, por exemplo

estresse hídrico. Indicando que os fatores que levam uma espécie vegetal a sintetizar

PS podem não ser os mesmos.

Em se tratando de algas marinhas, alguns estudos demonstram que a

composição química de certas espécies é afetada por parâmetros abióticos. Estudo

realizado durante um ano com algas vermelhas Grateloupia doryphora e

Gymnogongrus griffithsiae demonstrou que o conteúdo de carboidratos dessas

espécies aumenta gradualmente durante a primavera, tornando-se maior no verão;

período onde se observa os maiores valores de salinidade, temperatura e intensidade

luminosa (PERFETO, 1998). Esse resultado se assemelha ao obtido para as algas

Gracilaria gracilis e Gracilaria bursa pastoris, no qual o rendimento do ágar variou

significativamente de acordo com a sazonalidade, sendo os maiores rendimentos

obtidos na primavera e no verão, respectivamente. Além disso, essa variável também

foi correlacionada positivamente com a salinidade e temperatura da água do mar

(MARINHO-SORIANO; BOURRET, 2003).

Houve também uma correlação positiva entre a produção de carboidratos e a

temperatura e salinidade da água para alga vermelha Gracilaria cervicornis e entre o

conteúdo de carboidratos e a salinidade para alga marrom Sargassum vulgare

(MARINHO-SORIANO et al., 2006). Essas correlações entre a salinidade e

temperatura e o conteúdo de carboidratos totais e de ágar, sugere que esses dois

parâmetros ambientais podem influenciar no metabolismo de carboidratos.

Além disso, o teor de sulfato também pode ser influenciado por fatores

abióticos, por exemplo, a quantidade de sulfato do ágar das algas Gracilaria gracilis e

Gracilaria bursa pastoris foi correlacionado negativamente com salinidade

(MARINHO-SORIANO; BOURRET, 2003).

Com relação a PS de algas marinhas, que não o ágar, foi observado que a

sazonalidade pode ou não influenciar a composição/estrutura de PS. Galactofucanas

sulfatadas foram extraídas da alga marrom Saccharina longicruris em quatro períodos

(maio, agosto e novembro de 2005 e junho de 2006) e verificou-se que havia uma

diferença significativa no rendimento e composição monossacarídica entre maio 2005

Introdução 42


e junho 2006, além de haver também uma diferença significativa no teor de sulfato

das galactofucanas entre 2005 e 2006, no entanto, esta diferença não estava

correlacionada com a temperatura e salinidade da água, já que esses parâmetros se

mantiveram constantes durante o período de estudo (RIOUX; TURGEON; BEAULIEU,

2009).

Variações sazonais (de abril a outubro) no rendimento de extratos ricos em

fucanas obtidos da alga marrom Laminaria japonica foram observadas por Honya e

colaboradores (1999), estes autores verificaram um aumento gradual no rendimento

de abril a setembro e um aumento acentuado de setembro para outubro. De acordo

com os autores, este aumento no rendimento esta correlacionado com o crescimento

da alga, vale salientar que neste caso a alga foi cultivada e não coletada de ambientes

naturais.

Outra alga marrom que teve seus PS estudados em diferentes períodos do ano

foi a Costaria costata (IMBS et al., 2009). Estes autores coletaram a alga C. costata e

extraíram PS da mesma na primavera (abril, maio) e verão (junho e julho) e verificaram

que havia mudanças no rendimento, composição química, massa molecular e

conteúdo de sulfato dependendo da estação do ano. Na primavera foram extraídas

heterofucanas pouco sulfatadas, constituídas por fucose, galactose, manose e

ramnose, além de traços de xilose e glicose (Fuc:Gal:Man:Rha razão

1:0,27:0,38:0,19), com massa molecular de 200 - 800 kDa. Já no verão houve uma

diminuição significativa na quantidade dos monossacarídeos manose e ramnose e

não observou-se os traços de xilose e glicose (Fuc:Gal:Man:Rha

razão1:0,29:0,08:0,06), obtendo-se assim uma galactofucana com massa molecular

em torno de 20 - 300 kDa e que foi mais sulfatada que o polímero extraído na

primavera (IMBS et al., 2009).

Posteriormente, também foram vistas mudanças no rendimento, composição

monossacarídica e quantidade de sulfato do fucoidan (PS contendo α-L-fucose

extraídos de algas marrons) de alga marrom Padina pavonica coleta nos meses de

abril, maio, junho e julho de 2009. Observou-se que o rendimento da extração do

fucoidan foi 2 vezes maior em abril do que em maio e tendeu a aumentar de maio para

julho. Além disso, os fucoidans extraídos nos diferentes meses foram constituídos por

fucose, galactose, manose, xilose, ramnose e glicose, no entanto, de acordo com os

autores houve uma variação significativa apenas no conteúdo de ramnose e galactose

Introdução 43


durante o período de estudo, a quantidade destes monossacarídeos aumentaram de

abril a julho, houve também uma variação no conteúdo de sulfato de acordo com o

mês de coleta (MEN´SHOVA et al., 2012).

Variações sazonais (setembro a dezembro de 1995 e de janeiro a março de

1996) no rendimento, composição monossacarídica e quantidade de sulfato de

extratos de PS obtidos da alga verde Ulva fasciata foram observadas por Siddhanta e

colaboradores (2001). É importante mencionar que nestes quatro últimos trabalhos

citados, os autores não avaliaram os parâmetros ambientais do local de coleta, para

poder verificar se as mudanças na composição/estrutura destes PS estavam

correlacionadas com os fatores ambientais do local de coleta.

Já os PS obtidos da alga Delesseria sanguinea, coletada mensalmente durante

um ano, não tiveram sua composição monossacarídica, nem conteúdo de sulfato

alterado com sazonalidade (GRÜNEWALD; GROTH; ALBAN, 2009). No entanto, mais

uma vez os autores não avaliaram a influência de fatores abióticos, como a salinidade

e temperatura, sobre os PS produzidos por essas algas.

Estes dados indicam que dependendo do período do ano que a alga é coletada,

períodos estes em que os fatores ambientais do local de coleta podem ser distintos,

os PS extraídos destas espécies de algas podem ter suas estruturas químicas

afetadas e, consequentemente, suas atividades biológicas poderão ser distintas. No

entanto, como descrito acima, cada espécie de alga responde de forma diferente às

mudanças ambientais do local de coleta. Por isso, é de fundamental importância

estudos para se averiguar as possíveis mudanças na composição/estrutura de PS de

acordo com o período de coleta, bem como a influência de fatores ambientais sobre

estes PS, uma vez que PS distintos, apresentam atividades biológicas também

distintas. Estes tipos de estudos levariam ao esclarecimento de quais seriam as

melhores condições para se obter o PS com as características estruturais e biológicas

de interesse, o que é fundamental para o uso destes polímeros na indústria.

No litoral do estado do Rio Grande do Norte encontram-se mais de cem

espécies de algas marinhas e de várias destas espécies já foram obtidos PS com

pronunciadas atividades farmacológicas, no entanto, não há, até o momento, estudos

que demonstrem como o período de coleta poderia influenciar a estrutura e,

consequentemente, as atividades farmacológicas desses PS. Em relação a como

parâmetros ambientais poderiam afetar os PS de algas do litoral potiguar, há apenas

Introdução 44


um estudo, o qual foi realizado com a alga Caulerpa cupressoides var. flabellata,

estudo este realizado pelo grupo em que se insere esta tese. Neste trabalho foi

demonstrado que quando a C. cupressoides era coletada na mesma época, mas em

praias com grau de salinidade diferente, sintetizava PS com propriedades diferentes,

inclusive atividade anticoagulante (COSTA, 2010), o que indica que ela, e, por

conseguinte, seus PS são susceptíveis a fatores ambientais.

Daí a necessidade de se obter mais estudos que demonstrem como o período

de coleta e fatores ambientais poderiam afetar a composição de PS de espécies de

algas do litoral potiguar e, consequentemente, as propriedades farmacológicas destes

biopolímeros. E qual seria o melhor período para se coletar as algas para se obter PS

com as características de interesse.

Além disso, foi demostrando por Costa (2010) que a alga C. cupressoides

sintetiza frações ricas em PS com atividade anticoagulante, algumas delas com

atividade similar a do Clexane®, por isso, surge a necessidade de se purificar estes

polímeros e avaliar mais detalhamente a atividade anticoagulante dos mesmos.

Em suma, a alga Caulerpa cupressoides sintetiza PS anticoagulantes, estes

polissacarídeos apresentam atividades cuja a potência pode ser influenciada pela

salinidade. Portanto, para que esta alga venha a ser atrativa para uso comercial é

necessário, dentre outras coisas, que se determine que fatores ambientais são

importantes para que C. cupressoides sintetize a maior quantidade de PS com

atividade anticoagulante, para que esses possam ser utilizados futuramente pela

indústria que se forme ao redor do cultivo, extração e comercialização dos PS de C.

cupressoides.

Objetivos 45


2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar a influência do período de coleta e de parâmetros ambientais na

composição química e atividade anticoagulante de polissacarídeos sulfatados obtidos

de algas verdes do litoral potiguar, bem como obter e avaliar o potencial

anticoagulante de polissacarídeos sulfatados purificados da alga C. cupressoides.

2.2 Objetivos específicos

Obter extratos ricos em polissacarídeos sulfatados (ERPS) de cinco

macroalgas marinhas abundantes no litoral potiguar mensalmente durante um ano;

Realizar a caracterização química dos ERPS;

Analisar a atividade anticoagulante dos ERPS;

Determinar parâmetros ambientais do local de coleta mensalmente;

Correlacionar as possíveis mudanças no rendimento, composição e

atividade anticoagulante dos ERPS com os parâmetros ambientais do local de coleta;

Purificar pelo menos um PS da alga C. cupressoides;

Caracterizar através de métodos químicos e físico-químicos os PS

purificados da alga C. cupressoides;

Avaliar o potencial anticoagulante dos PS purificados e propor seu possível

mecanismo de ação anticoagulante.

Materiais e Métodos 46


3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Local de coleta

A coleta das algas objetos de estudo deste trabalho foi realizada na Praia de

Búzios, litoral Sul do Rio Grande do Norte (Figura 6).

A praia de Búzios pertence ao município de Nísia Floresta, a 38 Km de Natal.

Está localizada a uma latitude sul 6°1'8.19" e longitude oeste 35°6'33.40". A praia é

relativamente rasa, de fundo arenoso, em muitos pontos cobertos por algas calcárias

e protegida do embate das ondas pelos arrecifes (FONSECA, 2001). Esta praia possui

uma vasta diversidade de algas marinhas com grande número de espécies dos Filos

Stramenopiles, Rhodophyceae e Chloroplastida, nova classificação dada por Adla e

colaboradores (2012) aos filos antigamente denominados de Phaeophyta,

Rhodophyta e Chlorophyta, respectivamente.

Figura 6 - Localização do ponto de coleta das algas na Praia de Búzios, litoral Sul do Rio Grande do Norte.

Fonte: Google Earth.

3.2 Materiais

3.2.1 Material biológico

Como objetos deste estudo foram escolhidas as algas verdes Caulerpa

cupressoides var. flabellata Børgesen, Caulerpa prolifera (Forsskal) J. V. Lamouroux,

Caulerpa racemosa var. occidentalis (J. Agardh) Børgesen, Caulerpa sertularioides



(S.G. Gmelin) M Howe e Codium isthmocladum Vickers (Figura 7), devido serem

espécies facilmente encontradas e abundantes na praia de Búzios, além de serem de

fácil coleta. Os espécimes foram coletados na praia de Búzios durante o período de

um ano, de janeiro a dezembro de 2010, em períodos de maré baixa entre 0,0 - 0,2

metros.

Figura 7 - Algas verdes utilizadas neste trabalho. Caulerpa cupressoides var. flabellata (A), Caulerpa prolifera (B), Caulerpa racemosa var. occidentalis (C), Caulerpa sertularioides (D) e Codium isthmocladum (E).

Fonte: Autoria própria.

Após coleta, as algas foram acondicionadas em sacos de polietileno, levadas

ao laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL) do Departamento de

Bioquímica da UFRN no mesmo dia da coleta, lavadas em água corrente, examinadas

cuidadosamente para que ficassem livres de epífitas, inclusões calcárias e sais e,

então, foram postas para secar em estufa aerada a 45 ºC. Em seguida, foram

trituradas, pesadas e guardadas em frascos hermeticamente fechados.

A B C

D E



3.2.3 Outros materiais

- Acetona, ácido acético, ácido sulfúrico, álcool etílico, álcool metílico, azul de

toluidina, brometo de cetiltrimetilamônio P.A. (CETAVLON), citrato de sódio, cloreto

de bário, cloreto de sódio, coomasie brilliant blue R 250, hidróxido de sódio e sulfato

de sódio da CRQ (Diadema, SP, Brasil);

- Ácido clorídrico da Synth (Diadema, SP, Brasil);

- Albumina sérica bovina (BSA), azul de dimetilmetileno (DMB), 1,3 diamino propano

acetato, heparina, substrato cromogênico N-benzoyl-Phe-Val-Arg-p-

nitroamilidahydrochloride e cofator II da heparina da Sigma-Aldrich Brasil (São Paulo,

SP, Brasil);

- Agarose (Standart L’ow-MR) da BioRad Laboratories (Richmond, CA, EUA);

- Bacto-Getatina da Difco Laboratories (Detroit, MI, USA).

- Clexane® (enoxaparina sódica) da Sanofi Winthrop Industrie (Maisons, Alfort,

França);

- Fenol 80% da SRB Comércio e Produtos Farmacêuticos (Natal, RN, Brasil);

- L-fucose, D-xilose, D-galactose, D-manose, D-glucose, D-arabinose, D-ramnose e

ácido D-glucurônico da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA);

- “Kit” de tempo de tromboplastina parcial ativada e “kit” de tempo de protrombina da

Wiener Lab. (Rosario, Argentina);

- “Kit” de tempo de trombina da Instrumentation Laboratory (Bedford, MA, EUA);

- “Kit” Actichrome Heparin (Anti-FIIa) assay da Sekisui Diagnostics (Lexington, MA,

EUA)

- Prozima (preparação enzimática a base de protease alcalina PROLAV 750) da

Prozyn Biosolutions (São Paulo, SP, Brasil);

Todos os demais materiais e reagentes utilizados foram da melhor qualidade

disponível.

3.2.4 Aparelhos

Além dos aparelhos usuais do laboratório pode-se destacar:

- Agitador de tubos modelo 251 da FANEM (São Paulo, SP, Brasil);

- Agitador magnético modelo TE-0851 da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil);



- Balança analítica modelo B-TEC-210A da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil);

- Balança de precisão modelo Mark 5000 da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil);

- Banho maria de temperatura ajustável modelo 100 da FANEM (São Paulo, SP,

Brasil);

- Bomba à vácuo modelo TE-058 da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil);

- Câmara para eletroforese em gel de agarose, modelo desenvolvido por Jaques e col.

(1968) da Técnica Permatron Ltda (São Paulo, SP, Brasil);

- Centrífuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co. Ltda (Tóquio, Japão);

- Centrifuga refrigerada 5804 R foi obtida da Eppendorf (São Paulo, SP, Brasil);

- Coagulômetro modelo Quick Timer da Drake (São Paulo, SP, Brasil).

- Cromatógrafo líquido Elite Lachrom da Hitachi (Tóquio, Japão);

- Destilador de água tipo pilsen modelo SL 71/10 da Solab (Piracicaba, SP, Brasil);

- Espectrofotômetro modelo 600S da FEMTO Ltda (São Paulo, SP, Brasil);

- Espectrofotômetro de microplacas Epoch™ da BioTek Instruments (Califórnia, EUA);

- Estufa modelo 002 CB da FANEM (São Paulo, SP, Brasil);

- Fontes de corrente contínua da BioAgency Biotecnologia Ltda. (São Paulo, SP,

Brasil);

- Liofilizador, FreeZone Plus 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System, da

Labconco (Kansas City, MO, EUA);

- Medidor de pH modelo TEC-5 da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil);

- Sistema de purificação de água BarnsteadTM NanopureTM – DISCONTINUED modelo

7155 da Thermo Scientific (Califórnia, EUA);

- Refratômetro portátil modelo RTS 101ATC da Instrutherm (Freguesia do Ó, SP,

Brasil);

- Sistema cromatográfico: Sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)

adaptado para cromatografia de troca iônica, com coluna de troca aniônica HiTrap

DEAE FF 5mL e com o equipamento ÄKTA Protein Purification Systems da empresa

GE Healthcare Life Sciences (Little Chalfont, Bucks, Reino Unido);

- Sonicador modelo Q1.8/40A da Eco-Sonics (Indaiatuba, SP, Brasil);

- Termômetro centígrado da Incoterm (Porto Alegre, RS, Brasil).



3.3 Métodos

3.3.1 Obtenção dos ERPS das algas verdes C. cupressoides, C. prolifera, C.

racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum

Como já mencionado, as algas verdes C. cupressoides, C. prolifera, C.

racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum foram coletadas mensalmente, durante

um ano, e delas se obteve ERPS referente a cada mês de coleta.

A obtenção dos ERPS das algas verdes seguiu a metodologia aplicada pelo

grupo pesquisa que em está inserido esta tese (ROCHA et al., 2001) e mais

recentemente utilizada por Costa e colaboradores (2010) durante a obtenção de

ERPS de algas do litoral potiguar.

As algas secas e pulverizadas foram tratadas com dois volumes de etanol para

despigmentação e delipidação do material. A cada saturação do álcool, que foi

observada visualmente, realizava-se a troca deste reagente. Posteriormente, o

resíduo foi separado do álcool, e colocado para secar a temperatura ambiente, após

seco este material despigmentado foi utilizado para a obtenção dos ERPS.

Foram pesados 40 g do pó da alga depilidado e adicionado ao mesmo dois

volumes de NaCl 0,25 M, sendo o pH ajustado para 8,0. A este material, foi adicionada

a enzima proteolítica prozima (15 mg por grama de pó de alga delipidado), e o material

foi incubado a 60 ºC por 18h. A suspensão foi, em seguida, centrifugada a 8.000 x g

por 15 min. O precipitado foi desprezado e ao volume do sobrenadante foi adicionado

2 volumes de metanol, esta mistura foi deixada a 4 ºC durante 24h. Após esse período,

o material foi centrifugado (10.000 x g, durante 10 min. a 4 ºC). O sobrenadante foi

descartado e o precipitado, denominado ERPS, foi seco à pressão reduzida, pesado

e devidamente guardado.

3.3.2 Obtenção das frações polissacarídicas da C. cupressoides

O sobrenadante obtido após proteólise foi fracionado com volumes crescentes

de acetona. Este fracionamento foi realizado de acordo com a metodologia descrita

por Costa (2010). Os valores de acetona adicionados foram determinados pela

turvação da solução, que caracteriza a precipitação de polissacarídeos devido à



adição desse solvente. Inicialmente, foi adicionado 0,3 volumes de acetona, sob

agitação leve, volume necessário para que se visualize uma turvação da solução, essa

solução foi mantida em repouso a 4 ºC durante 18h, o precipitado foi coletado por

centrifugação a 8.000 x g por 15 min. a 4 ºC e seco a pressão reduzida. Em seguida,

esse procedimento foi repetido utilizando-se 0,5, 1,0 e 2,0 volumes de acetona,

obtendo-se as quatro frações polissacarídicas, denominadas de CCB-0.3, CCB-0.5,

CCB-1.0 e CCB-2.0, de acordo com o volume de acetona acrescentado.

Para o cálculo do rendimento do fracionamento, a massa de cada fração obtida

após a precipitação em acetona foi determinada, posteriormente todos os valores

individuais foram somados e o valor obtido foi considerado 100%. Com este valor, o

percentual correspondente a cada fração foi determinado.

3.3.3 Obtenção dos PS purificados da C. cupressoides

A fração CCB-0.5, obtida após fracionamento com acetona, foi fracionada por

cromatografia de troca iônica em sistema FPLC no equipamento AKTA. Para tal, 1 mL

de solução desta fração a 5 mg/mL (em NaCl 0,25 M) foi aplicada em coluna de troca

iônica Hitrap DEAE FF 5 mL e eluída com gradiente linear de 0,25 - 3,0 M de NaCl. A

taxa de fluxo da coluna foi 2,0 mL/min. e frações de 0,5 mL foram coletadas. Este

procedimento foi realizado repetidas vezes até a obtenção de uma quantidade

satisfatória de amostra. O perfil de eluição dos PS foi monitorado por metacromasia

(FARNDALE; BUTTLE; BARRETT, 1986) e dosagem de açúcares totais (DUBOIS et

al., 1956). As frações contendo PS obtidas foram agrupadas, dialisadas contra água

destilada, utilizado membranas com limite de exclusão de 6 kDa; e, em seguida,

liofilizadas.

3.3.4 Caracterização físico-química das amostras

3.3.4.1 Eletroforese em gel de agarose

As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose. O preparo

das lâminas passa pela pesagem do gel de agarose 0,6% (m/v) e diluição no

tampão 1,3 diamino propano acetato (PDA) 0,05 M, pH 9,0. Alíquotas de 5 μL de cada



amostra na concentração de 10 μg/μL foram aplicadas em canaletas no gel e

submetidos à eletroforese em cuba resfriada a 4 ºC. Após a corrida eletroforética (a

100 Volts), os compostos foram precipitados com CETAVLON 0,1% por 2h, à

temperatura ambiente. Em seguida, o gel foi seco sob uma corrente de ar quente e

corado com azul de toluidina 0,1%, numa solução de ácido acético 1% e etanol 50%.

O excesso de corante foi removido utilizando-se uma solução de ácido acético 1% em

etanol 49% (solução descorante). A operação foi repetida até completo

descoloramento do fundo da lâmina. A seguir, o gel foi seco à temperatura ambiente

(DIETRICH; DIETRICH, 1976).

A revelação das bandas de migração foi feita pela atividade metacromática

característica de cada composto. Neste caso, os compostos ricos em sulfato

desenvolvem uma coloração roxa característica.

3.3.4.2 Densitometria das bandas de PS do gel de agarose

Foi feita densitometria da imagem digitalizada do gel de agarose com o uso do

software PhotoShop CS2 9.0 2005 (Adobe® Photoshop CS®).

3.3.4.3 Análises químicas

Açúcares totais

Para se verificar a quantidade de polissacarídeos nas amostras realizou-se a

determinação de açúcares totais pelo método fenol/ácido sulfúrico, utilizando-se a

galactose como padrão, sendo as leituras realizadas a 490 nm (DUBOIS et al., 1956).

Sulfato

A quantidade de sulfato nas amostras foi determinada após uma hidrólise ácida

(HCl 4 N, 6h, 100 ºC) e quantificada por turbimetria pelo método da gelatina-bário,

tendo-se como padrão o sulfato de sódio (DODGSON; PRICE, 1962).



Proteína

O grau de contaminação proteíca nas amostras foi determinado utilizando o

reagente comercial de Bradford®, como descrito em Melo e colaboradores (2013). Um

total de 10 μL de cada uma das soluções das amostras (10 mg/mL) foi aplicada um

em microplaca de 96 poços e a estas foi acrescentado o reagente de Bradford® em

um volume pré-determinado (200 μL). Após 10 min. a temperatura ambiente (22 ºC),

a microplaca, contendo as amostras juntamente ao reagente, foi lida em

espectrofotômetro a 595 nm, tendo como padrão albumina sérica bovina (BSA).

3.3.4.4 Composição monossacarídica

As amostras foram hidrolisadas (HCl 2 N, 2h, 100 ºC) e os monossacarídeos

constituintes das frações foram determinados através de cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE), como descrito por Câmara (2015), utilizando-se a coluna

LiChroCART® 250-4 LiChrospher® 100 NH2 (10 μm), tendo como fase móvel

acetonitrila:água (80:20) em um fluxo de 1 mL/min. a 40 ºC . Usou-se como padrões

de açúcares: L-fucose, D-xilose, D-galactose, D-manose, D-glicose, D-arabinose, D-

ramnose e ácido D-glucurônico.

3.3.5 Atividade anticoagulante das amostras

A atividade anticoagulante das amosras foi avaliada pelos ensaios de tempo de

tromboplastina parcial ativada (aPTT), tempo de protrombina (PT) e tempo de

trombina (TT). O plasma citratado utilizado nestes ensaios foi obtido após a

centrifugação de sangue humano retirado de indivíduos adultos, sadios e de ambos

os sexos.

Para se averiguar o mecanismo de ação dos PS purificados foram realizados

ensaios de inibição direta da trombina e inibição da trombina mediada pelas serpinas,

AT e HCII, usando-se substratos cromogênicos.



3.3.5.1 Ensaio de aPTT, PT e TT

Os ensaios de aPTT e PT foram realizados seguindo-se o protocolo fornecido

pelos “kits” comerciais adquiridos (Wiener Lab). Já o ensaio de TT realizou-se de

acordo com metodologia descrita por Sabry (2015).

Para o ensaio de aPTT o plasma humano citratado (90 µL) foi misturado com

10 µL de solução das amostras ou da clexane® (1,5 a 33 µg/mL). Em seguida, 100 µL

de cefalina foi adicionada a mistura e incubou-se por 3 min. a 37 ºC. Então, 100 µL de

CaCl2 0,025 M foram adicionados e o tempo de formação do coágulo foi registrado,

utilizando-se um coagulômetro automático da marca Drake.

Para o ensaio de PT o plasma humano citratado (90 µL) foi misturado com 10

µL de solução das amostras ou da heparina (67 a 333 µg/mL) e incubados por 2 min.

a 37 ºC. Em seguida, 200 µL do reagente do kit foi adicionado a mistura e incubada

por mais 2 min. a 37 ºC. Então, 100 µL de CaCl2 0,025 M foram adicionados e o tempo

de formação do coágulo foi registrado.

Para o teste de TT, o plasma humano citratado foi incubado juntamente com a

amostra (3 a 66 µg/mL) a 37 ºC, totalizando 75 µL, por 1 min., então, o reagente de

TT foi adicionado (75 µL) e o tempo de formação do coágulo foi registrado.

Todos os ensaios foram realizados em triplicata. Os resultados dos testes para

as frações e PS purificados foram apresentados em tempo de coagulação em

segundos. Para atividade anticoagulante dos ERPS das algas verdes os resultados

foram expressos como razão de aPTT, obtida pela divisão do tempo de coagulação

obtido com os ERPS (5 µg) pelo tempo de coagulação do controle.

3.3.5.2 Inibição da trombina mediada pela AT

O ensaio de inibição da trombina mediada pela AT foi realizado em microplaca

de 96 poços de acordo com as instruções do kit Actichrome Heparin (Anti-FIIa) assay

(Sekisui Diagnostics, ref: 820). 50 μL de trombina foram incubadas a 37 ºC por 2 min.

na presença de concentrações crescentes dos PS purificados (0,01; 0,1; 1 e 10

µg/mL), diluídos previamente em plasma humano citratado fresco e em seguida,

novamente diluídos em solução contendo AT. 50 μL de trombina bovina purificada

foram adicionados a cada poço, homogeneizados e incubados a 37 ºC por exatos 2



min. Em seguida, 50 μL do substrato cromogênico para trombina foram adicionados,

homogeneizados e incubados a 37 °C por exatos 2 min. Após incubação, 50 μL de

ácido acético a 30% (v/v) foram adicionados para interromper a reação e a

absorbância foi mensurada a 405 nm.

3.3.5.3 Inibição da trombina mediada pelo HCII

O teste de inibição da trombina mediada pelo HCII na presença dos PS foi

realizado em microplaca de 96 poços com volume final de 100 µL de acordo com

Pavão e colaboradores (1995). Para ocorrência da reação 25 µL dos PS purificados

(0,001; 0,01; 0,1; 1,0 e 10 µg/mL) em tampão 0,02 M Tris/HCl, 0,15 M NaCl (pH 7,4)

e 25 µL de HCII (70 nM) foram incubados por 2 min a 37 ºC. Em seguida, foi adicionado

25 µL de trombina (48 nM) e incubados por 1 min a 37 ºC. Posteriormente, foi

adicionado 25 µL do substrato cromogênico N-benzoyl-Phe-Val-Arg-p-

nitroamilidahydrochloride (100 mM) e a mistura foi incubada por mais 1 min. a 37 ºC.

Após a incubação foi adicionado 25 µL de ácido acético a 30% para parar a reação. A

absorbância foi lida a 405 nm. O branco da amostra foi feito utilizando os mesmos

reagentes, no entanto o substrato somente foi adicionado após a reação ter sido

parada com o ácido acético a 30%. Para avaliar a atividade total da enzima (100% de

atividade enzimática), não foi adicionada a amostra teste.

3.3.5.4 Inibição direta da trombina

A inibição direta dos PS na trombina foi determinada usando a metodologia

descrita acima, no entanto, substitui-se o HCII por tampão 0,02 M Tris/HCl, 0,15 M

NaCl (pH 7,4).

3.3.6 Determinação dos parâmetros ambientais do local de coleta (Praia de Búzios,

Nísia Floresta/RN)

3.3.6.1 Coleta da água do mar



Para coleta da água do mar seguiu-se procedimento recomendando pela norma

NBR 9898 (ABNT, 1987). Durante a coleta, segurou-se o frasco, previamente limpo,

pela parte de baixo, submergindo a uma profundidade de aproximadamente 20 cm, a

boca do frasco foi levemente inclinada para cima, direcionada contra a correnteza,

para retirada do ar e entrada do líquido. Após a coleta descartou-se parte do líquido,

deixando espaço para homogenização da amostra em laboratório, em seguida, o

frasco foi tampado com o papel protegendo o gargalo e devidamente identificado.

3.3.6.2 Obtenção dos dados de precipitação pluviométrica e insolação

Os dados de precipitação pluviométrica e a insolação solar foram obtidos na

estação meteorológica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

3.3.6.3 Determinação da salinidade e temperatura da água do mar

Os valores de salinidade (‰) e de temperatura (ºC) da água do mar foram

determinados mensalmente durante cada coleta. A salinidade foi determinada por

intermédio de um refratômetro portátil, modelo RTS 101ATC da Instrutherm e a

temperatura foi verificada com auxílio de um termômetro de mercúrio centígrado.

3.3.6.4 Determinação de outros parâmetros ambientais

Para determinação dos outros parâmetros ambientais, como pH, turbidez,

nitrogênio, potássio, sulfato, condutividade elétrica, sólidos totais e dissolvidos,

alcalinidade de carbonato e bicarbonato, sódio, ferro, bicarbonato, carbonato e cloreto

foi feita coleta de água do mar do local de coleta das algas mensalmente, e esta foi

enviada à Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte (EMPARN)

para a determinação dos parâmetros citados. Os métodos de análises realizados pela

EMPARN seguiram o procedimento recomendado pelo Standand Methods for the

Examination of Water and Wastewater (1998).



3.3.7 Análise estatística

Os dados referentes ao rendimento e atividade anticoagulante do ERPS, da

fração CCB-0.5 e dos PS purificados da C. cupressoides foram submetidos ao teste

estatístico ANOVA One-way, seguido do pós-teste de Student-Newman-Keuls usando

o GraphPad Prisma 5.01 (GraphPad Software). As diferenças estatísticas foram

consideradas significativas, quando o valor de p < 0,05.

Os dados relativos ao rendimento, composição química e atividade

anticoagulante do ERPS das algas verdes foram analisados por ANOVA one-way para

verificar se haveria diferenças estatísticas significativas (p < 0,05) nestes parâmetros

ao longo período de estudo e foram apresentados o valor de F e o seu respectivo valor

de p. A análise de variância, ou mais resumidamente ANOVA, refere-se, de maneira

ampla a um conjunto de situações experimentais e procedimentos estatísticos para

análise de respostas quantitativas de unidades experimentais. O ANOVA One-way

envolve a análise de dados de experimentos em que foram empregados mais de duas

populações (distribuições) ou dados de experimentos em que foram empregados mais

de dois tratamentos (DEVORE, 2006). O procedimento ANOVA se constrói em torno

de um teste de hipótese chamado de teste-F, que compara o quanto os grupos diferem

entre si em relação à quantidade de variabilidade dentro de cada grupo, sendo então

utilizado quando se precisa comparar diversas médias e se existe relação entre eles

(RUMSEY, 2014). O valor-p é a probabilidade de se obter uma estatística de teste

igual ou mais extrema que aquela observada em uma amostra, sob a hipótese nula.

Em termos gerais, um valor-p pequeno (aqui, p < 0,05) significa que a probabilidade

de obter um valor da estatística de teste como o observado é muito improvável,

levando assim à rejeição da hipótese nula (RUMSEY, 2014).

Para verificar possíveis relações entre rendimento da extração, composição

química e atividade anticoagulante e os parâmetros ambientais ao longo do período

de estudo foi realizado análise de coeficiente de correlação de Pearson (r). Usou-se o

software Dell Statistica 13 (Dell Inc. 2015). Segundo Rumsey (2014), o coeficiente de

Pearson mede o grau da correlação (e a direção dessa correlação - se positiva ou

negativa) entre duas variáveis de escala métrica (razão). Assim este coeficiente

assume apenas valores entre -1 e 1. Desse modo, quanto mais próximo de 1 mais as

variáveis são dependentes e têm forte relação linear; quanto mais próximo de zero



significa que as variáveis são independentes e não tem relação linear; já quando a

variável é próxima de -1 significa que as variáveis são inversamente dependentes, ou

seja, quando uma das variáveis aumenta a outra diminui.

Resultados 59


4 RESULTADOS

Os resultados desta tese foram divididos em três partes para que haja um

melhor entendimento do andamento dos experimentos realizados durante a execução

do projeto de doutorado. A primeira parte contempla os resultados da análise das

possíveis mudanças na composição química/atividade anticoagulante dos PS da C.

cupressoides coletada mensalmente durante um ano, bem como a correlação da

composição química/atividade anticoagulante com parâmetros ambientais do local de

coleta; na segunda parte mostra-se as várias etapas de purificação de dois

polissacarídeos bioativos de C. cupressoides; já na terceira parte contempla-se os

resultados obtidos quando se verificou as possíveis mudanças na composição

química/atividade anticoagulante dos ERPS de acordo com o período de coleta de

outras algas verdes (C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum).


anticoagulante de ERPS da alga C. cupressoides de acordo com o período

de coleta

4.1.1 Rendimento da extração dos ERPS da alga C. cupressoides

O rendimento da extração dos ERPS (mg de extrato/g de alga seca) da alga C.

cupressoides coletada na Praia de Búzios/RN, no período de um ano está sumarizado

na Figura 8.

Observa-se que houve uma variação no rendimento da extração dos ERPS

obtidos da C. cupressoides de acordo com o mês de coleta, sendo o maior rendimento

observado no mês de novembro (42,80 mg de extrato/g da alga seca) e o menor no

mês de março (16,21 mg de extrato/g da alga seca). Além disso, a média anual do

rendimento foi de 26,48 ± 6,90 mg de extrato/g da alga seca.

Resultados 60


Figura 8 - Rendimento da extração dos ERPS da alga C. cupressoides de acordo com o mês de coleta. Resultados são expressos em mg de extrato/g da alga seca.

4.1.2 Perfil eletroforético dos ERPS da alga C. cupressoides

A mobilidade eletroforética dos PS de ERPS em gel de agarose da C.

cupressoides, usando tampão PDA 0,05 M pH 9,0 é mostrada na Figura 9A.

Não houve diferenças no padrão de mobilidade das populações de PS da C.

cupressoides de acordo com o mês de coleta, já que os mesmos apresentaram padrão

de mobilidade de bandas semelhantes, no entanto, houve diferença na intensidade de

coloração destas bandas. Para comprovar, estas diferenças foram realizadas

densitometria das bandas características do PS (Figura 9B) e verificou-se diferenças

nos valores de densitometria das bandas eletroréticas dos PS de acordo com o mês

de coleta.

0

10

20

30

40

50

Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez

Rendim

ento

(mg d

e e

xtr

ato

/ g d

e a

lga s

eca)

Resultados 61


JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV DEZ

Figura 9 - Comportamento eletroforético dos PS da alga C. cupressoides. Alíquotas de 5 µL (50 µg) dos extratos foram aplicados em lâminas de agarose em tampão PDA 0,05 M pH 9,0. Após precipitação com CETAVLON as lâminas foram corado com azul de toluidina (A). Densitometria das bandas eletroréticas dos PS de acordo com o mês de coleta (B). Or – origem, - Polo negativo, + Polo positivo.

4.1.3 Composição química dos ERPS da alga C. cupressoides

Os resultados das quantificações de açúcares totais e sulfato dos ERPS obtidos

da alga C. cupressoides são mostrados na Figura 10. Houve uma variação no

conteúdo de açúcares totais e sulfato dos ERPS durante o período de estudo. Para

se verificar se esta variação seria significativa realizou-se o teste estatístico de análise

de variância (ANOVA) e observou-se que esta variação anual era estatisticamente

significante.

Os ERPS da alga C. cupressoides apresentaram maior quantidade de açúcares

totais no mês de julho (77,00%) e a menor quantidade em novembro (40,05%) (F =

82,52, p < 0,001). Já a quantidade de sulfato foi maior no mês de junho (39,03%) e

menor em setembro (20,20%) (F = 39,17, p < 0,001). Apesar da tendência de se ter

mais carboidratos e sulfato em meses semelhantes ou próximos não foi observada

correlação significativa entre a quantidade de açúcares totais e a quantidade se sulfato

dos PS da C. cupressoides (Tabela 5).

+

_

Or -_

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Valo

r da d

ensitom

etr

ia

A B

Resultados 62


Figura 10 - Quantidade de açúcares totais e sulfato dos ERPS da alga C. cupressoides de acordo com mês de coleta. Os dados são expressos

como média ± desvio padrão (n=3). ( ) açúcares totais (%), ( ) sulfato (%).

.

4.1.4 Atividade anticoagulante dos ERPS da alga C. cupressoides

A atividade anticoagulante dos ERPS da alga C. cupressoides foi avaliada pelo

ensaio de aPTT e foi expressa em razão de aPTT. Os ERPS obtidos em todos os

meses de coleta apresentaram capacidade de prolongar o tempo de coagulação do

plasma. Observa-se uma variação significativa na capacidade dos ERPS em

prolongar o tempo de coagulação (F = 80,99, p < 0,01), sendo a menor razão de aPTT

obtida de 3,00 (setembro) e a maior de 7,00 (março) (Figura 11).

Além disso, observou-se que o clexane®, composto usado como controle

positivo nesse teste, promoveu uma alteração no tempo de coagulação do plasma que

forneceu uma razão de aPTT igual a 6 (dados não mostrados). Portanto, vale salientar

que dois ERPS, os que são referentes aos meses de março (razão de aPTT igual 7)

e agosto (razão de aPTT igual 6), apresentaram valores de razão de aPTT maior e

igual do que o clexane®, respectivamente.

Vale salientar que não se observou correlações significativas (p < 0,05) entre a

atividade anticoagulante e a quantidade de açúcar ou sulfato dos ERPS da C.

cupressoides (Tabela 5).

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out NovDez

Sulfato

(%

)

Açúcare

s tota

is (

%)

Resultados 63


Figura 11 - Atividade anticoagulante pelo ensaio de aPTT dos ERPS da alga C. cupressoides de acordo com o mês de coleta. Os dados são expressos como média ± desvio padrão (n=3). A atividade anticoagulante foi expressa como razão de aPTT, obtida pela divisão do tempo de coagulação obtido com os ERPS (5 µg) pelo tempo de coagulação do controle (29 ± 0,4 s).

4.1.5 Parâmetros ambientais do local de coleta

Simultaneamente, durante o período de coleta das algas foram analisados 19

parâmetros ambientais do local de coleta (Apêndice). Os dados referentes à média e

variação anual destes parâmetros ambientais estão sumarizados na Tabela 4.

Tabela 4 - Média e variação anual dos fatores ambientais da Praia de Búzios/RN durante o período de estudo (média ± desvio padrão e variação, n=12).

Parâmetros abióticos Média ± desvio padrão Variação anual

Salinidade (‰) 37,7 ± 1,12 (35,0 - 39,5)

Temperatura da água (ºC) 30,0 ± 3,22 (26,0 - 36,0)

Turbidez (UT) 0,80 ± 0,78 (0,0 - 2,2)

pH 8,2 ± 0,53 (6,7 - 8,5)

Nitrogênio amoniacal (mg/L) 0,1 ± 0,08 (0,0-0,3)

Potássio (mg/L) 461,9 ± 86,14 (375,0 - 666,6)

Sulfato (mg/L) 2763,3 ± 513,43 (1822,0 - 3389,4)

Condutividade elétrica (µS/cm) 49680,2 ± 4649,00 (44132,0 - 58300,0)

Sólidos totais (mg/L) 39257,1 ± 728,60 (37592,0 - 40444,0)

Sólidos dissolvidos totais (mg/L) 39257,1 ± 728,60 (37592,0 - 40444,0)

0

2

4

6

8

10

Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez

Razão d

e a

PT

T

Resultados 64


Alcalinidade de carbonato (mg/L) 10,9 ± 12,69 (0 - 31,1)

Alcalinidade de bicarbonato (mg/L) 111,9 ± 15,37 (85,3 - 131,9)

Sódio (mg/L) 10862,0 ± 810,80 (9714,4 – 12500,0)

Ferro (mg/L) 1,0 ± 0,22 (0,7 - 1,5)

Carbonato (mg/L) 6,6 ± 7,61 (0,0 - 18,7)

Bicarbonato (mg/L) 136,5 ± 18,77 (104,0 - 160,9)

Cloreto (mg/L) 20656 ± 1384,90 (18585,6 - 22988,4)

Precipitação pluviométrica (mm) 98,8 ± 77,30 (4,2 -262,6)

Insolação (h) 251,1 ± 43,86 (167,2 - 316,7)

4.1.6 Correlações entre o rendimento, composição química e atividade

anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides e os parâmetros ambientais do local de

coleta

Ao se fazer estudos de correlações entre o rendimento, composição química e

atividade anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides com os 19 parâmetros

ambientais analisados do local de coleta mensalmente (Tabela 5), evidenciou-se que

existe uma correlação positiva significativa (p < 0,05) entre o rendimento da extração

dos ERPS e a salinidade da água do mar (r = 0,59) e a insolação (r = 0,75) (Figura

12).

Para a quantidade de sulfato e açúcar só foram observadas correlações

significativas negativas com os parâmetros ambientais. Para a quantidade de sulfato

dos ERPS observou-se uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com a

salinidade da água do mar (r = -0,58) (Figura 13).

Já a quantidade de açúcar dos ERPS desta alga teve uma correlação negativa

significativa (p < 0,05) com: sólidos totais (r = -0,87), sódio (r = -0,64), cloreto (r = -

0,70) e insolação (r = -0,80) (Figura 14).

Além disso, não foi observada correlações significativas entre a atividade

anticoagulante dos ERPS e os parâmetros ambientais (tabela 5).

Resultados 65


Figura 12 - Comparação da variação anual do rendimento da extração dos ERPS da C. cupressoides com parâmetros ambientais do local de coleta (insolação e salinidade). r – coeficiente de correlação de Pearson (p < 0,05).

Figura 13 - Comparação da variação anual da quantidade de sulfato dos ERPS da C. cupressoides com a salinidade da água do mar. r – coeficiente de correlação de Pearson (p < 0,05).

Resultados 66


Figura 14 - Comparação da variação anual da quantidade de açúcares totais dos ERPS da C. cupressoides com parâmetros ambientais do local de coleta (sólidos totais, cloreto, sódio e insolação). r – coeficiente de correlação de Pearson (p < 0,05).

Resultados 67


Tabela 5 - Coeficiente de correlação (n=12) entre o rendimento, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides e os parâmetros ambientais do local de coleta.

Em vermelho valores para p < 0,05.

Sa

lin

ida

de

Te

mp

era

tura

Tu

rbid

ez

pH

Nitro

gê

nio

Po

tássio

Su

lfa

to

Co

nd

utivid

ad

e

Só

lid

os to

tais

Só

lid

os

dis

so

lvid

os

Alc

alin

ida

de

de

ca

rbo

na

to

Alc

alin

ida

de

de

bic

arb

on

ato

Só

dio

Fe

rro

Ca

rbo

na

to

Bic

arb

on

ato

Clo

reto

Pre

cip

ita

çã

o

Inso

laçã

o

Su

lfa

to d

os E

RP

S

Açú

ca

r d

os E

RP

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Ativid

ad

e

an

tico

ag

ula

nte

do

s E

RP

S

Temperatura -0,30

Turbidez 0,01 -0,40

pH -0,14 0,34 -0,21

Nitrogênio 0,16 0,15 0,20 -0,27

Potássio -0,72 0,02 -0,07 0,29 -0,51

Sulfato -0,37 0,19 0,15 0,27 -0,71 0,33

Condutividade 0,26 0,62 -0,58 0,42 -0,03 -0,09 -0,07

Sólidos totais 0,33 0,07 -0,68 0,22 -0,55 0,05 0,11 0,63

Sólidos dissolvidos 0,33 0,07 -0,68 0,22 -0,55 0,05 0,11 0,63 1,00

Alcalinidade de carbonato 0,04 -0,11 -0,29 0,53 -0,39 0,18 0,18 -0,06 0,18 0,18

Alcalinidade de bicarbonato -0,32 0,33 0,04 -0,49 0,28 0,12 -0,12 0,01 -0,17 -0,17 -0,82

Sódio 0,55 0,02 -0,55 0,34 -0,20 -0,23 -0,06 0,64 0,70 0,70 0,33 -0,50

Ferro 0,41 -0,25 0,49 0,18 -0,22 -0,35 0,25 -0,08 -0,03 -0,03 0,00 -0,35 -0,03

Carbonato 0,04 -0,11 -0,29 0,53 -0,39 0,18 0,18 -0,06 0,18 0,18 1,00 -0,82 0,33 0,00

Bicarbonato -0,32 0,33 0,04 -0,49 0,28 0,12 -0,12 0,01 -0,17 -0,17 -0,82 1,00 -0,50 -0,35 -0,82

Cloreto 0,59 -0,02 -0,57 0,07 -0,33 -0,17 -0,08 0,60 0,81 0,81 0,14 -0,24 0,87 0,02 0,14 -0,24

Precipitação -0,33 0,33 -0,06 0,04 0,39 -0,26 0,06 -0,10 -0,19 -0,19 -0,09 0,05 -0,14 -0,16 -0,09 0,05 -0,35

Insolação 0,57 -0,50 -0,17 -0,06 -0,31 -0,20 -0,07 0,26 0,61 0,61 -0,01 -0,36 0,75 0,21 -0,01 -0,36 0,76 -0,28

Sulfato dos ERPS -0,58 0,52 -0,40 0,38 0,00 0,14 0,12 0,11 -0,14 -0,14 0,13 0,04 -0,20 -0,15 0,13 0,04 -0,35 0,36 -0,46

Açúcar dos ERPS -0,44 0,29 0,47 0,00 0,49 0,16 -0,04 -0,35 -0,87 -0,87 -0,08 0,26 -0,64 -0,13 -0,08 0,26 -0,70 0,13 -0,80 0,20

Atividade anticoagulante dos ERPS 0,12 0,10 -0,12 0,29 -0,23 -0,06 0,23 0,06 0,17 0,17 0,56 -0,36 0,01 0,01 0,56 -0,36 -0,15 -0,06 -0,26 0,09 -0,11

Rendimento da extração 0,59 -0,49 0,03 -0,07 0,01 -0,25 -0,38 0,27 0,45 0,45 -0,10 -0,32 0,48 0,26 -0,10 -0,32 0,44 -0,17 0,75 -0,52 -0,65 -0,07

Resultados 68


4.2 Parte II: Purificação, caracterização e atividade anticoagulante de PS

purificados da alga C. cupressoides

Como foi observado que os ERPS obtidos da C. cupressoides coletada no mês

de março foram os extratos mais potentes em relação a atividade anticoagulante,

então, resolveu-se purificar os PS desta alga coletada neste mês, como descrito

abaixo.

4.2.1 Obtenção das frações polissacarídicas da alga C. cupressoides

Após o fracionamento com volumes crescentes de acetona obteve-se quatro

frações polissacarídicas da alga C. cupressoides, denominadas de CCB-0.3, CCB-

0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0, de acordo com o volume de acetona acrescentado. Da

massa total obtida após a precipitação de todas as frações calculou-se o rendimento

do fracionamento.

Pôde-se observar que a quantidade de material obtido após cada passo de

fracionamento não foi semelhante. Observa-se que a menor quantidade de material

foi obtida com o acréscimo de 0,3 e 2,0 volumes de acetona, que correspondem as

frações a CCB-0.3 e a CCB-2.0, primeira e última fração, respectivamente.

Já a maior quantidade de material precipitado foi aquela que se obteve com o

acréscimo 1,0 volume de acetona, seguido pelo acréscimo de 0,5 volumes, que

correspondem as frações CCB-1.0 e CCB-0.5, respectivamente, no entanto, a

diferença entre a quantidade de material obtida entre estas frações não foi

estatisticamente significativa (p > 0,05) (Figura 15).

Resultados 69


Figura 15 - Rendimento percentual do fracionamento com acetona: Após precipitação com acetona PA as frações foram centrifugadas (8.000 x g, 15 min., 4 ºC), secas sob pressão reduzida e pesadas. Da massa total obtida após a precipitação de todas as frações calculou-se o rendimento do fracionamento (n = 4). A,B Letras distintas indicam diferenças significativas entre as frações (p < 0,001).

4.2.2 Atividade anticoagulante das frações polissacarídicas da alga C. cupressoides

A atividade anticoagulante das frações polissacarídicas da C. cupressoides no

teste de aPTT, o qual avalia a via intrínseca da coagulação, está sumarizada na

Tabela 6. Observa-se que as frações CCB-0.3, CCB-0.5 e CCB-1.0 apresentaram

atividade anticoagulante de maneira dose-dependente. No entanto, em todas as

concentrações testadas (3,0 a 33,0 µg/mL) a fração CCB-0.5 foi a mais potente. Já

com o uso da fração CCB-2.0 não se observou a prolongação do tempo de

coagulação.

0

10

20

30

40

CCB-0.3 CCB-0.5 CCB-1.0 CCB-2.0

Rendim

ento

(%

)

Frações

A

B

A

B

Resultados 70


Tabela 6 - Atividade anticoagulante das frações polissacarídicas da C. cupressoidesa

aPTT (s)b

Concentração (µg/mL)

3,0 8,0 16,5 33,0

CCB-0.3 38,2 ± 1,0AW 60,9 ± 1,1BV 103,1 ± 0,1CV Nd

CCB-0.5 50,5 ± 0,6AY 72,05 ± 1,8BW 120,0 ± 16,5CV > 240DX

CCB-1.0 31,0 ± 0,6AW 42,6 ± 0,2BY 79,5 ± 2,1CW 173,4 ± 3,5Dw

CCB-2.0 31,1 ± 0,2AW 32,6 ± 0,6AZ 32,0 ± 0,2AZ 32,4 ± 0,5AV

Clexane®c 74,7 ± 3,4BX 144,5 ± 2,1CX > 240DX > 240DX

a Os dados são expressos como a média ± desvio padrão (n=3). b aPTT: tempo de tromboplastina parcial ativada. Tempo de coagulação do controle 29,2 ± 0,7 s. c Clexane®: heparina de baixo peso molecular. Letras distintas (A-D) indicam diferença significativa entre as diferentes concentrações do mesmo PS (p < 0,001). Letras distintas (V-Z) indicam diferença significativa entre os PS na mesma concentração (p < 0,01). nd – não determinado.

4.2.3 Purificação da fração CCB-0.5 da alga C. cupressoides

Levando em consideração que a fração CCB-0.5 foi uma das frações em que

se obteve maior quantidade de material precipitado com acetona; e também que foi a

fração que apresentou maior atividade anticoagulante, escolheu-se a mesma para se

purificar PS com atividade anticoagulante. Assim, a fração CCB-0.5 foi submetida a

cromatografia de troca iônica. Na Figura 16 observa-se o perfil de eluição da

cromatografia da fração CCB-0.5. Após análise de açúcares totais e de metacromasia,

observou-se a presença de um pico único no eluato, porém com uma base larga, fato

este que permitiu divisão deste pico em dois, um eluído na faixa de 0,48 - 0,65 M de

NaCl (tubos de 22 a 35) e o outro eluído na faixa 0,73 - 0,78 M de NaCl (tubos de 41

a 45), estes foram denominados de PS FI e FII, respectivamente.

Após a liofilização da solução correspondente à FI e FII, o material resultante

foi pesado e verificou-se que eles corresponderam a 11,9 ± 3,6 % e 4,2 ± 1,3% da

quantidade de fração CCB-0.5 administrada à coluna, respectivamente.

Resultados 71


Figura 16 - Perfil de eluição da fração CCB-0.5 em cromatografia de troca aniônica em sistema

FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) em equipamento AKTA. ( ) sulfato (525

nm). ( ) açúcar (490 nm). (-----) concentração de NaCl (M).

4.2.4 Eletroforese em gel de agarose dos PS FI e FII da alga C. cupressoides

Para se verificar se os PS FI e FII estavam purificados foi realizado uma

eletroforese em gel de agarose PDA 0,05 M pH 9,0. Após coloração da lâmina com

azul de toluidina e descoloração, observou-se o aparecimento de uma única banda

em ambas as amostras, o que indica a presença de uma única população de PS, o

que leva a inferir que estes PS foram purificados. O perfil eletroforético dos PS

purificados (FI e FII) é mostrado na Figura 17.

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

1 713

19

25

31

37

43

49

55

61

67

73

79

85

91

97

103

109

115

121

127

133

139

145

151

157

163

169

175

181

187

193

199

205

Concentr

ação d

e N

aC

l (M

)

AB

S 4

90 n

m

A

BS

525 n

m

Tubos

FI FII

Resultados 72


Figura 17 - Comportamento eletroforético dos PS da alga C. cupressoides. Alíquotas de 5 µL do ERPS, da fração CCB-0.5 (50 µg) e dos PS FI e FII (25 µg) foram aplicados em lâmina de agarose em tampão PDA 0,05 M pH 9,0. Após precipitação com CETAVLON lâmina foi corado com azul de toluidina. Or – origem, - Polo negativo, + Polo positivo.

4.2.5 Composição química do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS purificados FI e

FII da alga C. cupressoides

Os resultados das análises químicas do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS

purificados FI e FII são mostrados na Tabela 7.

Verifica-se que os PS FI e FII são constituídos por diferentes percentuais de

açúcar, 58,9% e 50,7%, respectivamente. Percentuais estes, significativamente, mais

elevados que o do ERPS e da fração CCB-0.5. Observa-se, para o percentual de

sulfato fato semelhante, FI e FII apresentaram quantidade de sulfato de 33,4% e

36,4%, respectivamente, valores estes mais elevados que os observados para o

ERPS e para a fração CCB-0.5. A relação sulfato/açúcar variou de 0,20 a 0,72, sendo

a relação sulfato/açúcar do ERPS < CCB-0.5 < FI < FII.

ERPS CCB-0.5 FI FII

Or

+

_

Resultados 73


Além disso, foi observada a ausência de contaminação por proteínas no ERPS

e nos PS FI e FII, já a fração CCB-0.5 encontrou-se uma baixa contaminação por

proteínas.

Tabela 7 - Composição químicaa do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS FI e FII da alga C. cupressoides.

Polissacarídeo Açúcares

totais (%)

Sulfato

(%)

Relação

sulfato/açúcar

(%)

Proteínas (%)

ERPS 40,1 ± 0,7 8,2 ± 0,1 0,20 nt

CCB-0.5 25,4 ± 0,4 13,9 ± 0,6 0,55 0,05

FI 58,9 ± 1,5 33,4 ± 0,8 0,57 nt

FII 50,7 ± 1,0 36,4 ± 1,0 0,72 nt

a O total de açúcares e sulfato dos polissacarídeos foi determinado pelos métodos de fenol/H2SO4 e gelatina/BaCl2, respectivamente. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3). nt – não detectado.

Com relação a análise da composição monossacarídica observa-se que o

ERPS e a fração CCB-0.5 são constituídos por galactose, glicose, manose e xilose.

Já os PS FI e FII são constituídos, predominantemente, por galactose e glicose. Além

disso, foram encontrados traços de manose e xilose no PS FII, já no FI estes

monossacarídeos não foram detectados (Tabela 8).

Tabela 8 - Relação molar dos monossacarídeos do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS FI e FII da alga C. cupressoides.

Polissacarídeo Composição monossacarídica (razão molar)a

Gal Glc Man Xil

ERPS 1,0 0,5 0,3 0,3

CCB-0.5 1,0 0,6 0,6 0,7

FI 1,0 0,6 nt nt

FII 1,0 0,5 tr tr

aA composição monossacarídica foi estimada por CLAE. Gal – Galactose, Glc – Glicose, Man – Manose, Xil – Xilose, nt – não detectado, tr – traços.

Resultados 74


4.2.6 Atividade anticoagulante do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS purificados FI

e FII da alga C. cupressoides

A atividade anticoagulante do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS purificados

FI e FII da alga C. cupressoides está sumarizada nas Tabelas 9 a 11.

No teste de aPTT, o qual avalia a via intrínseca da coagulação, todas as

amostras apresentaram atividade anticoagulante de maneira dose-dependente (1,5 a

33 µg/mL) (Tabela 9). Quando se compara a atividade destas amostras entre si

observa-se que FII foi a mais potente, seguida pela FI. Estas subfrações apresentaram

atividade anticoagulante similar (na concentração de 3 µg/mL) e maior (na

concentração de 8 µg/mL) que o Clexane®, uma heparina de baixo peso molecular

comercial (p < 0,01).

Além disso, observa-se uma correlação positiva ente a atividade anticoagulante

das amostras (8 µg/mL) e a quantidade de sulfato das mesmas (r = 0,96), bem como

a razão sulfato/açúcar (r = 0,75).

Tabela 9 - Atividade anticoagulante no teste de aPPT do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS purificados FI e FII da C. cupressoidesa

Polissacarídeo

aPTT (s)b


1,5 3,0 8,0 16,5 33,0

ERPS nd 47,4 ± 4,5Aw 75,4 ± 0,8AW 117,1 ± 22,6BW 211,8 ± 12,7CW

CCB-0.5 nd 50,5 ± 0,6Aw 72,05 ± 1,8BW 120,0 ± 16,5CW > 240DX

FI 40,2 ± 1,1Aw 70,3 ± 3,3Bx 176,7 ± 4,3CY > 240DX > 240DX

FII 39,7 ± 5,1Aw 75,1 ± 4,4Bx 232,7 ± 2,4CZ > 240CX > 240CX

Clexane®c 53,9 ± 1,5Ax 74,7 ± 3,4Bx 144,5 ± 2,1CX > 240DX > 240DX

a Os dados são expressos como a média ± desvio padrão (n=3). b aPTT: tempo de tromboplastina parcial ativada. Tempo de coagulação do controle 29 ± 0,5s. c Clexane®: heparina de baixo peso molecular. Letras distintas (A-D) indicam diferença significativa entre as diferentes concentrações do mesmo PS (p < 0,001). Letras distintas (W-Z) indicam diferença significativa entre os PS na mesma concentração (p < 0,01). nd – não determinado.

No teste de PT, o qual avalia a via extrínseca da coagulação, todas as amostras

apresentaram atividade anticoagulante de maneira dose-dependente (Tabela 10). No

entanto, foi necessário o uso de concentrações maiores (67 a 333 µg/mL) das mostras

Resultados 75


do que as utilizadas no teste de aPTT (1,5 a 33 µg/mL), para que as amostras

apresentassem atividade anticoagulante significativa.

Da mesma maneira que observado no teste aPTT, quando se compara a

atividade destas amostras entre si, observa-se que FII foi a mais potente.

Além disso, observa-se uma correlação positiva entre a atividade

anticoagulante das amostras (333 µg/mL) e a quantidade de sulfato das mesmas (r =

0,44), bem como a razão sulfato/açúcar (r = 0,61).

Tabela 10 - Atividade anticoagulante no teste de PT do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS purificados FI e FII da C. cupressoidesa

Polissacarídeo

PT (s)b


67,0 133,0 267,0 333,0

ERPS nd 25,6 ± 0,4AW 33,8 ± 2,3BW 44,6 ± 1,0CW

CCB-0.5 18,7 ± 0,0AW 24,7 ± 0,6BW 32,0 ± 1,8BW 54,2 ± 3,7CX

FI 24,9 ± 1,4AX 41,2 + 0,4BX 35,3 ± 1,0CW 36,5 ± 0,6CY

FII 32,6 ± 1,3AY 40,0 ± 1,0BX 77,3 ± 0,4CX 90,6 ± 5,9CZ

Heparinac > 120 > 120 > 120 > 120

a Os dados são expressos como a média ± desvio padrão. b PT: tempo de protrombina. Tempo de coagulação do controle 14,9 ± 0,5 s. c Heparina: heparina não fracionada. Letras distintas (A-D) indicam diferença significativa entre as diferentes concentrações do mesmo PS (p < 0,05). Letras distintas (W-Z) indicam diferença significativa entre os PS na mesma concentração (p < 0,05). nd – não determinado.

Já no teste de TT, o qual avalia a via comum da coagulação, todas as amostras

também apresentaram atividade anticoagulante de maneira dose-dependente nas

concentrações de 3 a 16,5 µg/mL, concentrações semelhantes as utilizadas no teste

de aPTT. Vale salientar, que em concentrações maiores que 33 µg/mL, neste teste,

os PS precipitam provocando turvação da solução, o que interfere nos resultados do

teste, por isso, testou-se apenas até 33 µg/mL (Tabela 11).

Não houve diferença significativa entre as atividades anticoagulantes das

observada com o uso dos PS FI e FII, no entanto, estas duas foram superiores àquela

verificada na presença de CCB-0.5.

Resultados 76


Além disso, observa-se uma correlação positiva entre a atividade

anticoagulante das amostras (33 µg/mL) e a quantidade de sulfato das mesmas (r =

1,0), bem como a razão sulfato/açúcar (r = 0,73).

Tabela 11 - Atividade anticoagulante no teste de TT da fração CCB-0.5 e dos PS purificados FI e FII da C. cupressoidesa

Polissacarídeo

TT (s)b


3,0 6,5 16,5 33,0

ERPS nd nd nd nd

CCB-0.5 nd 16,2 ± 0,4AW 29,2 ± 0,4BW 32,2 ± 1,5CW

FI 16,2 ± 0,6AX 24,4 ± 1,5BX 35,9 ± 2,2CX 36,5 ± 0,1CX

FII 16,4 ± 1,9AX 24,9 ± 0,8BX 37,4 ± 1,3CX 37,6 ± 2,3CX

a Os dados são expressos como a média ± desvio padrão (n=3). b TT: tempo de trombina. Tempo de coagulação do controle 13,1 ± 0,2 s. Letras distintas (A-C) indicam diferença significativa entre as diferentes concentrações do mesmo polissacarídeo sulfatado (p < 0,001). Letras distintas (W-Z) indicam diferença significativa entre os polissacarídeos sulfatados na mesma concentração (p < 0,05). nd – não determinado.

Para se esclarecer se o mecanismo de ação anticoagulante dos PS FI e FII

estava relacionado com a inibição da protease trombina, foi realizado ensaio de

inibição da trombina, na presença e ausência das serpinas AT e HCII, usando

substrato cromogênico. Utilizou-se as amostras até a concentração de 10 µg/mL, pois,

mais uma vez, em concentrações maiores os PS precipitavam interferindo nos

resultados do teste.

Os PS FI e FII, até a concentração testada, não foram capazes de inibir a

atividade da trombina na presença de AT (dados não mostrados). Já na presença do

HCII detectou-se que os PS purificados tiveram a capacidade de inibir da trombina

nas concentrações intermediárias testadas (Figura 18). Para os dois PS purificados,

a maior inibição da trombina mediada pelo HCII se deu na concentração de 1 µg/mL,

que foi de 35,1% e 37,8% para FI e FII, respectivamente.

Resultados 77


Figura 18 - Efeito dos PS FI e FII da C. cupressoides na inativação da trombina na presença do HCII. Os dados são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).

Para se verificar se os PS tinham a capacidade de inibir diretamente a trombina,

realizou-se o teste de inibição desta protease na ausência das serpinas, na

concentração de 0,1 a 10 µg/mL. Começou-se o teste com a concentração de 0,1

µg/mL, tendo em vista que no experiento anterior os PS não tiveream atividade em

concentrações inferiores a esta. Observou-se uma inibição da trombina de 26,3% e

30,3% quando se utilizou os PS FI e FII na concentração intermediária (1 µg/mL),

respectivamente, efeito este que não foi observado quando se aumentou a

concentração dos compostos (Figura 19).

Figura 19 - Efeito dos PS FI e FII da C. cupressoides na inativação da trombina na ausência do HCII e da AT. Os dados são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).

0

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0,1 1 10

Ativid

ade d

a t

rom

bin

a (

%)


FI

FII

Resultados 78


4.3 Parte III: Análise das possíveis mudanças na composição

química/atividade anticoagulante de ERPS de outras algas verdes de acordo

com o período de coleta

Como observou-se uma variação anual significativa no rendimento,

composição química e atividade anticoagulante de ERPS da alga verde C.

cupressoides, resolveu-se investigar as possíveis mudanças na composição e

atividade anticoagulante de ERPS de outras algas verdes (Caulerpa prolifera,

Caulerpa racemosa, Caulerpa sertularioides e Codium isthmocladum).

4.3.1 Rendimento anual e análises químicas dos ERPS das algas verdes

O rendimento da extração dos ERPS (mg de extrato/g de alga seca) das algas

verdes C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum coletadas

durante o período de um ano, na Praia de Búzios/RN está sumarizado na Figura 20.

Em setembro e outubro não se encontrou no local de coleta biomassa suficiente

da alga C. isthmocladum e no mês de dezembro biomassa da C. racemosa para que

fosse possível realizar a extração de ERPS, pois isso, os dados de rendimento dos

referidos meses sobre estas algas não aparecem nos resultados de rendimento, bem

como nos demais testes.

Figura 20 - Rendimento da extração dos ERPS de acordo com o mês de coleta. Resultados são expressos em mg de extrato/g da alga seca.

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C. prolifera C. racemosa C. sertularioides C. isthmocladum

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Resultados 79


Comparando-se a média anual dos rendimentos dos ERPS das algas verdes

analisadas, observa-se que os maiores rendimentos da extração dos ERPS foram os

obtidos da C. isthmocladum, com média anual de 36,24 ± 17,82 mg de extrato/g da

alga seca, com maior rendimento no mês de dezembro (74,67 mg de extrato/g da alga

seca) e menor em março (17,68 mg de extrato/g da alga seca).

Já o rendimento da extração C. sertularioides teve média de 26,71 ± 10,16 mg

de extrato/g da alga seca. O mês no qual obteve-se um maior rendimento para C.

sertularioides foi o mês de fevereiro (41,19 mg de extrato/g da alga seca) e o menor

rendimento foi observado no mês de abril fevereiro (10,52 mg de extrato /g da alga

seca).

Os mais baixos rendimentos foram observados para os extratos provenientes

das algas C. racemosa e C. prolifera, que foram de 16,50 ± 5,77 e 16,02 ± 3,15 mg de

extrato/g da alga seca, respectivamente. O mês no qual obteve-se um maior

rendimento para C. racemosa foi o mês de outubro (29,27 mg de extrato/g da alga

seca) e o menor rendimento foi observado no mês de abril (10,64 mg de extrato/g da

alga seca). Já para C. prolifera o maior rendimento foi observado em agosto (20,05

mg de extrato/g da alga seca) e o menor em abril (11,06 mg de extrato/g da alga seca).

4.3.2 Perfil eletroforético dos ERPS das algas verdes

A mobilidade eletroforética dos PS das algas verdes C. prolifera, C. racemosa,

C. sertularioides e C. isthmocladum em gel de agarose, usando tampão PDA 0,05 M

pH 9,0 é mostrada na Figura 21. De acordo com as lâminas, observa-se que cada

alga sintetiza populações distintas de PS, o que é visto no padrão de mobilidade das

bandas coradas com o azul de toluidina.

De acordo com a técnica de eletroforese utilizada foi possível observar o

aparecimento duas bandas distintas coradas com o azul de toluidina nas lâminas dos

ERPS das algas C. prolifera, C. racemosa e C. isthmocladum, ou seja, uma população

de PS com baixa mobilidade e outra com alta mobilidade, indicando que estas algas

sintetizam duas populações de PS.

Já os PS da C. sertularioides são mais polidispersos que os extraídos das

demais algas, ou seja, não estão concentrados em um só ponto, ao contrário, se

Resultados 80


estendem desde a origem até quase o fim da lâmina (exceto os PS obtidos em

fevereiro).

Não houve diferenças no padrão de mobilidade das populações de

polissacarídeos de cada alga de acordo com o mês de coleta, já que os PS

apresentaram padrão de mobilidade de bandas semelhantes (exceto para C.

sertularioides), no entanto, houve diferença na intensidade de metacromasia destas

bandas para os PS extraídos de todas as algas.

Figura 21 - Comportamento eletroforético dos PS das algas C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum. Alíquotas de 5 µL (50 µg) dos extratos foram aplicados em lâmiana de agarose em tampão PDA 0,05 M pH 9,0. Após precipitação com CETAVLON as lâminas foram coradas com azul de toluidina. Or – origem, - Polo negativo, + Polo positivo.

A - C. cupressoides;

4.3.3 Composição química dos ERPS das algas verdes

Os resultados das quantificações de açúcares totais e sulfato dos ERPS obtidos

das algas verdes são mostrados na Figura 22. Houve uma variação no conteúdo de

açúcares totais (Figura 22A) e sulfato (Figura 22B) dos ERPS obtidos de todas as

algas analisadas durante o período de estudo. Para se verificar se esta variação seria


JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV

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+

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+

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Banda 1 _

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JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO NOV DEZ

C. prolifera

C. racemosa C. sertularioides

C. isthmocladum

Resultados 81


significativa realizou-se o teste estatístico de análise de variância (ANOVA) e

observou-se que esta variação era estatisticamente significante (Tabela 12).

Não houve coincidência em relação aos meses em que os ERPS de cada alga

apresentou maior ou menor quantidade de açúcares totais e/ou sulfato.

Os ERPS da C. prolifera apresentaram maior quantidade de açúcares totais em

agosto (69,62%) e a menor em março (49,61%) (F = 39,45, p < 0,001). Para C.

racemosa a quantidade de açúcar variou de 46,34 em agosto a 77,16% em abril (F =

84,40, p < 0,001). Para C. sertularioides a variação foi de 56,76 em julho a 68,00%

em dezembro e janeiro (F = 26,22, p < 0,001). Já para C. isthmocladum a variação foi

de 39,08 (janeiro) a 80,03% (novembro) (F = 9,81, p < 0,001).

Já a quantidade de sulfato variou de 19,23 (março) a 31,08% (novembro) para

os ERPS de C. prolifera (F = 11,80, p < 0,001); 6,92 (novembro) a 41,82% (janeiro)

para os ERPS de C. racemosa (F = 42,91, p < 0,001); 26,57 (março) a 36,60%

(novembro) para os ERPS de C. sertularioides (F = 24,53, p < 0,001); e 21,73 (abril)

a 36,08% (agosto) para os ERSP de C. isthmocladum (F = 56,06, p < 0,001).

Figura 22 - Quantidade de açúcares totais (A) e sulfato (B) dos ERPS das algas verdes de acordo com o período de coleta. Os dados são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).

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Resultados 82


Tabela 12 - Média e variação anual da quantidade de açúcar e sulfato dos ERPS (média ± desvio padrão, n=12) e ANOVA (Razão-F e probabilidade).

Alga Composição Média ± DP Variação ANOVA

Razão-F Probabilidade

C. prolifera Açúcar 60,60 ± 6,00 (49,61 - 69,62) 39,45 <0,001

Sulfato 26,36 ± 3,28 (19,23 - 31,08) 11,80 <0,001

C. racemosa Açúcar 61,06 ± 9,12 (46,34 - 70,00) 84,40 <0,001

Sulfato 26,80 ± 8,82 (6,92 - 41,82) 42,91 <0,001

C. sertularioides Açúcar 63,05 ± 4,25 (56,76 - 68,00) 26,22 <0,001

Sulfato 33,44 ± 2,71 (26,57 - 36,00) 24,53 <0,001

C. isthmocladum Açúcar 65,42 ± 15,93 (39,08 - 80,03) 9,81 <0,001

Sulfato 28,20 ± 5,29 (21,73 - 36,08) 56,06 <0,001

A quantidade de açúcar e sulfato são expressos em %.

Foi realizado também a quantificação das proteínas totais e verificou-se uma

baixa contaminação protéica em todos os ERPS. A quantidade de proteínas nos

ERPS da alga C. prolifera variou de 0,18% (março) a 1,42% (junho); da C. racemosa

variou de 0,00% (janeiro, junho, julho, agosto e dezembro) a 0,67% (abril); da C.

sertularioides variou de 0,00% (fevereiro) a 1,06% (julho); da C. isthmocladum variou

de 0,20% (janeiro) a 1,07% (abril).

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Mar

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Su

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%)

B

Resultados 83


4.3.4 Atividade anticoagulante dos ERPS das algas verdes

A atividade anticoagulante dos ERPS das algas verdes está sumarizada na

Figura 23. Todos os ERPS apresentaram atividade no teste de aPTT. Além disso,

observa-se uma variação anual significativa para todos os ERPS (Tabela 13).

A atividade anticoagulante, expressa em razão de aPTT, variou de 1,31 a 3,70

para os ERPS de C. prolifera (F = 7,16, p < 0,01); 2,03 a 4,33 para os ERPS de C.

racemosa (F = 21,03, p < 0,01); 1,12 a 5,50 para os ERPS de C. sertularioides (F =

147,32, p < 0,01); e 1,57 a 2,60 para os ERSP de C. isthmocladum (F = 3,62, p <

0,01).

Figura 23 - Atividade anticoagulante dos ERPS das algas verdes de acordo com o período de coleta. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=3). A atividade anticoagulante foi expressa como razão de aPTT, obtida pela divisão do tempo de coagulação obtido com os ERPS (5 µg) pelo tempo de coagulação do controle (29,7 ± 0,3 s). * Clexane® heparina de baixo peso molecular.

Tabela 13 - Média e variação anual da atividade anticoagulante dos ERPS das algas verdes (média ± desvio padrão, n=12) e ANOVA (Razão-F e probabilidade).

Alga Média ± DP Variação ANOVA

Razão-F Probabilidade

C. prolifera 2,64 ± 0,66 (1,31 - 3,70) 7,16 <0,01

C. racemosa 3,21 ± 0,65 (2,03 - 4,33) 21,03 <0,01

C. sertularioides 4,08 ± 1,17 (1,12 - 5,56) 147,32 <0,01

C. isthmocladum 1,92 ± 0,32 (1,57 - 2,60) 3,62 <0,01

A atividade anticoagulante foi expressa como razão de aPTT, obtida pela divisão do tempo de coagulação obtido com os ERPS (5 µg) pelo tempo de coagulação do controle (29,7 ± 0,3 s).

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Ju

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razã

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PT

T

Resultados 84


4.3.5 Correlações entre o rendimento, composição química e atividade

anticoagulante dos ERPS das algas verdes e os parâmetros ambientais do local de

coleta

Foram feitas análises de correlação entre os parâmetros ambientais do local de

coleta (19 parâmetros) e o rendimento, composição química e atividade

anticoagulante dos ERPS das algas C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C.

isthmocladum. Os resultados destas análises de correlações estão sumarizados nas

Tabelas 14 a 17.

Como já mencionado, não se encontrou biomassa de C. racemosa no mês de

dezembro e de C. isthmocladum nos meses de setembro e outubro, por isso, os

valores dos parâmetros ambientais destes meses foram desconsiderados ao se

realizar as análises de correlações entre os parâmetros ambientais e o rendimento,

composição química e atividade anticoagulante dos ERPS obtidos da C. racemosa e

da C. isthmocladum (Tabela 15 e 17).

Para melhor visualização dos dados de correlação, nas Figuras de 24 a 27

expõem-se apenas aqueles parâmentos ambientais em que se identificou correlações

estatísticas significativas com o rendimento, composição química e atividade

anticoagulante dos ERPS.Observa-se que os parâmetros ambientais do local de

coleta podem afetar de forma distinta o rendimento, a composição química e a

atividade anticoagulante dos ERPS dependendo da espécie de alga, ou seja, cada

alga responde de forma diferente às condições ambientais do local de coleta.

Para os ERPS da C. prolifera evidenciou-se que existe uma correlação positiva

significativa (p < 0,05) entre a quantidade de açúcares totais e a turbidez (r= 0,61). O

tempo de coagulação foi correlacionado negativamente (p < 0,05) com a precipitação

pluviométrica do local de coleta (r= -0,59). Já o rendimento da extração e a quantidade

de sulfato dos ERPS não tiveram correlações significativas com nenhum parâmetro

ambiental analisado (Tabela 14, Figura 24).

Os ERPS da C. racemosa foram o que sofreram maior influência dos

parâmetros ambientais. Evidenciou-se que existe uma correlação positiva significativa

(p < 0,05) entre o rendimento da extração dos ERPS e salinidade da água do mar (r=

0,66), sódio (r= 0,68), cloreto (r=69) e insolação (r= 0,73) A quantidade de açúcares

totais foi correlacionada positivamente (p < 0,05) com a temperatura (r= 0,79),

alcalinidade de bicarbonato (r= 0,76) e bicarbonato (r= 0,76); e correlacionada

Resultados 85


negativamente (p<0,05) com a salinidade (r= -0,70) e insolação (r= 0,59). Já a

quantidade de sulfato dos ERPS foi correlacionada negativamente com a

condutividade elétrica (r= -0,71). O tempo de coagulação foi correlacionado

positivamente (p < 0,05) com cloreto (r= 0,71) e insolação (r=0,63) (Tabela 15, Figura

25).

Já nos ERPS da C. sertularioides evidenciou-se que existe uma correlação

positiva significativa (p < 0,05) entre o rendimento da extração dos ERPS e o potássio

(r= 0,61), e negativa entre o rendimento e o nitrogênio (r= -0,58) e precipitação

pluviométrica (r= -0,75). A quantidade de açúcares totais foi correlacionada

negativamente (p < 0,05) com o nitrogênio (r= -0,64). Já a quantidade de sulfato dos

ERPS foi correlacionada positivamente com a insolação (r= 0,70). Não houve

correlação significativa entre tempo de coagulação dos ERPS e os parâmetros

ambientais (Tabela 16, Figura 26).

Por fim, para os ERPS da C. isthmocladum evidenciou-se que existe uma

correlação negativa significativa (p < 0,05) entre o rendimento da extração dos ERPS

e a temperatura da água do mar (r= -0,65). A quantidade de açúcar foi correlacionada

positivamente (p < 0,05) com a temperatura (r= 0,64) e condutividade elétrica, por

outro lado, estes dois fatores ambientais afetaram de forma inversa a quantidade de

sulfato dos ERPS, uma vez que, foi visto que a quantidade de sulfato dos ERPS foi

correlacionada negativamente com a temperatura (r= -0,71) e condutividade elétrica

(r= -0,65). Não houve correlação significativa entre tempo de coagulação dos ERPS e

os parâmetros ambientais (Tabela 17, Figura 27).

Resultados 86


Tabela 14 - Coeficiente de correlação (n=12) entre o rendimento, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. prolifera e os parâmetros ambientais do local de coleta.


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S

Temperatura -0,30

Turbidez 0,01 -0,40

pH -0,14 0,34 -0,21

Nitrogênio 0,16 0,15 0,20 -0,27

Potássio -0,72 0,02 -0,07 0,29 -0,51

Sulfato -0,37 0,19 0,15 0,27 -0,71 0,33

Condutividade 0,26 0,62 -0,58 0,42 -0,03 -0,09 -0,07

Sólidos totais 0,33 0,07 -0,68 0,22 -0,55 0,05 0,11 0,63




Sódio 0,55 0,02 -0,55 0,34 -0,20 -0,23 -0,06 0,64 0,70 0,70 0,33 -0,50

Ferro 0,41 -0,25 0,49 0,18 -0,22 -0,35 0,25 -0,08 -0,03 -0,03 0,00 -0,35 -0,03

Carbonato 0,04 -0,11 -0,29 0,53 -0,39 0,18 0,18 -0,06 0,18 0,18 1,00 -0,82 0,33 0,00

Bicarbonato -0,32 0,33 0,04 -0,49 0,28 0,12 -0,12 0,01 -0,17 -0,17 -0,82 1,00 -0,50 -0,35 -0,82

Cloreto 0,59 -0,02 -0,57 0,07 -0,33 -0,17 -0,08 0,60 0,81 0,81 0,14 -0,24 0,87 0,02 0,14 -0,24

Precipitação -0,33 0,33 -0,06 0,04 0,39 -0,26 0,06 -0,10 -0,19 -0,19 -0,09 0,05 -0,14 -0,16 -0,09 0,05 -0,35

Insolação 0,57 -0,50 -0,17 -0,06 -0,31 -0,20 -0,07 0,26 0,61 0,61 -0,01 -0,36 0,75 0,21 -0,01 -0,36 0,76 -0,28

Sulfato dos ERPS -0,11 -0,33 0,11 0,06 0,19 0,29 -0,33 0,09 -0,03 -0,03 -0,14 -0,12 0,19 -0,28 -0,14 -0,12 -0,02 -0,03 0,37

Açúcar dos ERPS -0,01 -0,47 0,61 0,21 -0,05 0,15 0,19 -0,30 -0,15 -0,15 0,09 -0,40 -0,01 0,32 0,09 -0,40 -0,22 0,20 0,24 0,52

Atividade anticoagulante dos ERPS 0,07 -0,38 0,14 0,08 0,03 0,18 -0,37 0,00 -0,12 -0,12 -0,14 0,01 -0,06 0,08 -0,14 0,01 -0,12 -0,59 0,18 0,48 -0,02

Rendimento da extração -0,15 -0,51 0,42 -0,24 -0,22 -0,05 0,26 -0,49 -0,25 -0,25 0,04 -0,36 -0,24 0,41 0,04 -0,36 -0,32 0,14 0,19 0,21 0,42 0,09

Resultados 87


Figura 24 - Coeficiente de correlação (n=12) para os parâmetros ambientais do local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com a quantidade de açúcares totais e atividade anticoagulante dos ERPS da C. prolifera.

Resultados 88


Tabela 15 - Coeficiente de correlação (n=11) entre o rendimento, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. racemosa e os parâmetros ambientais do local de coleta.


Sa

lin

ida

de

Te

mp

era

tura

Tu

rbid

ez

pH

Nitro

gê

nio

Po

tassio

Su

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Co

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Só

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do

s E

RP

S

Temperatura -0,30

Turbidez 0,02 -0,45

pH -0,13 0,02 -0,47

Nitrogênio 0,18 0,08 0,20 -0,91

Potássio -0,72 -0,03 -0,07 0,37 -0,55

Sulfato -0,37 0,22 0,15 0,57 -0,72 0,34

Condutividade 0,31 0,56 -0,64 0,21 -0,13 -0,15 -0,07

Sólidos totais 0,32 0,13 -0,69 0,62 -0,54 0,06 0,11 0,73




Sódio 0,58 -0,06 -0,56 0,35 -0,25 -0,26 -0,06 0,63 0,74 0,74 0,29 -0,48

Ferro 0,42 -0,31 0,49 0,20 -0,24 -0,37 0,25 -0,13 -0,02 -0,02 -0,03 -0,34 -0,05

Carbonato 0,06 -0,25 -0,31 0,61 -0,47 0,15 0,20 -0,18 0,22 0,22 1,00 -0,80 0,29 -0,03

Bicarbonato -0,36 0,51 0,05 -0,48 0,37 0,17 -0,13 0,13 -0,21 -0,21 -0,80 1,00 -0,47 -0,34 -0,80

Cloreto 0,59 0,04 -0,57 0,36 -0,31 -0,16 -0,08 0,71 0,81 0,81 0,19 -0,29 0,92 0,04 0,19 -0,29

Precipitação -0,32 0,29 -0,06 -0,22 0,36 -0,28 0,06 -0,18 -0,17 -0,17 -0,14 0,11 -0,18 -0,18 -0,14 0,11 -0,34

Insolação 0,57 -0,46 -0,17 0,26 -0,27 -0,18 -0,07 0,37 0,60 0,60 0,05 -0,46 0,83 0,24 0,05 -0,46 0,75 -0,25

Sulfato dos ERPS -0,51 -0,21 0,23 -0,07 0,04 0,40 0,08 -0,71 -0,58 -0,58 0,39 -0,19 -0,40 -0,20 0,39 -0,19 -0,41 0,16 -0,40

Açúcar dos ERPS -0,70 0,79 -0,18 -0,20 0,14 0,36 0,22 0,20 -0,19 -0,19 -0,46 0,76 -0,39 -0,57 -0,46 0,76 -0,33 0,31 -0,59 0,05

Atividade anticoagulante dos ERPS 0,29 -0,21 -0,32 0,13 -0,17 0,20 -0,36 0,44 0,53 0,53 -0,12 0,01 0,51 0,01 -0,12 0,01 0,71 -0,45 0,63 -0,17 -0,25

Rendimento da extração 0,66 -0,25 0,01 0,10 -0,13 -0,31 -0,09 0,42 0,29 0,29 0,06 -0,45 0,68 0,43 0,06 -0,45 0,69 -0,52 0,73 -0,26 -0,53 0,55

Resultados 89


Figura 25 - Coeficiente de correlação (n=11) para os parâmetros ambientais do local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com o rendimento, composição química e atividade

anticoagulante dos ERPS da C. racemosa.

Resultados 90


Tabela 16 - Coeficiente de correlação (n=12) entre o rendimento, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. sertularioides e os parâmetros ambientais do local de coleta.


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PS

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RP

S

Temperatura -0,30

Turbidez 0,01 -0,40

pH -0,14 0,34 -0,21

Nitrogênio 0,16 0,15 0,20 -0,27

Potássio -0,72 0,02 -0,07 0,29 -0,51

Sulfato -0,37 0,19 0,15 0,27 -0,71 0,33

Condutividade 0,26 0,62 -0,58 0,42 -0,03 -0,09 -0,07

Sólidos totais 0,33 0,07 -0,68 0,22 -0,55 0,05 0,11 0,63




Sódio 0,55 0,02 -0,55 0,34 -0,20 -0,23 -0,06 0,64 0,70 0,70 0,33 -0,50

Ferro 0,41 -0,25 0,49 0,18 -0,22 -0,35 0,25 -0,08 -0,03 -0,03 0,00 -0,35 -0,03

Carbonato 0,04 -0,11 -0,29 0,53 -0,39 0,18 0,18 -0,06 0,18 0,18 1,00 -0,82 0,33 0,00

Bicarbonato -0,32 0,33 0,04 -0,49 0,28 0,12 -0,12 0,01 -0,17 -0,17 -0,82 1,00 -0,50 -0,35 -0,82

Cloreto 0,59 -0,02 -0,57 0,07 -0,33 -0,17 -0,08 0,60 0,81 0,81 0,14 -0,24 0,87 0,02 0,14 -0,24

Precipitação -0,33 0,33 -0,06 0,04 0,39 -0,26 0,06 -0,10 -0,19 -0,19 -0,09 0,05 -0,14 -0,16 -0,09 0,05 -0,35

Insolação 0,57 -0,50 -0,17 -0,06 -0,31 -0,20 -0,07 0,26 0,61 0,61 -0,01 -0,36 0,75 0,21 -0,01 -0,36 0,76 -0,28

Sulfato dos ERPS 0,27 -0,43 0,14 -0,11 -0,11 -0,25 0,05 0,01 0,33 0,33 -0,17 -0,30 0,34 0,33 -0,17 -0,30 0,26 0,31 0,70

Açúcar dos ERPS 0,10 -0,39 0,02 -0,14 -0,64 0,30 0,24 -0,17 0,45 0,45 0,16 -0,10 -0,02 0,31 0,16 -0,10 0,32 -0,32 0,27 0,26

Atividade anticoagulante dos ERPS 0,03 -0,49 -0,27 0,14 -0,23 0,33 -0,23 -0,28 0,25 0,25 0,48 -0,30 0,23 -0,22 0,48 -0,30 0,28 -0,13 0,26 0,04 0,43

Rendimento da extração -0,06 -0,36 0,04 0,00 -0,58 0,61 0,08 0,08 0,33 0,33 -0,07 0,06 0,00 0,12 -0,07 0,06 0,24 -0,75 0,33 0,06 0,57 0,19

Resultados 91


Figura 26 - Coeficiente de correlação (n=12) para os parâmetros ambientais do local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com o rendimento e composição química dos ERPS da C. sertularioides.

Resultados 92


Tabela 17 - Coeficiente de correlação (n=10) entre o rendimento, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. isthmocladum e os parâmetros ambientais do local de coleta.


Sa

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pH

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PS

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ag

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nte

do

s E

RP

S

Temperatura -0,30

Turbidez -0,08 -0,35

pH -0,22 0,36 -0,28

Nitrogênio 0,28 0,15 0,33 -0,22

Potássio -0,74 0,00 -0,04 0,31 -0,56

Sulfato -0,53 0,24 0,06 0,23 -0,68 0,38

Condutividade 0,24 0,62 -0,57 0,40 0,02 -0,10 -0,11

Sólidos totais 0,34 0,04 -0,74 0,21 -0,57 0,04 0,12 0,62



Alcalinidade de bicarbonato -0,27 0,44 -0,11 -0,46 0,22 0,13 -0,05 0,20 -0,11 -0,11 -0,81

Sódio 0,60 -0,08 -0,56 0,29 -0,11 -0,29 -0,21 0,57 0,79 0,79 0,12 -0,32

Ferro 0,38 -0,16 0,16 0,17 -0,11 -0,47 0,08 0,05 0,08 0,08 0,33 -0,67 0,12

Carbonato 0,02 -0,22 -0,11 0,55 -0,41 0,19 0,21 -0,25 0,12 0,12 1,00 -0,81 0,12 0,33

Bicarbonato -0,27 0,44 -0,11 -0,46 0,22 0,13 -0,05 0,20 -0,11 -0,11 -0,81 1,00 -0,32 -0,67 -0,81

Cloreto 0,57 -0,06 -0,72 -0,06 -0,24 -0,18 -0,25 0,55 0,90 0,89 -0,03 0,00 0,84 -0,07 -0,03 0,00

Precipitação -0,21 0,36 0,01 0,16 0,30 -0,33 0,24 -0,01 -0,19 -0,19 -0,04 -0,13 0,10 0,08 -0,04 -0,13 -0,17

Insolação 0,52 -0,56 -0,23 -0,17 -0,22 -0,20 -0,21 0,17 0,64 0,64 -0,12 -0,24 0,75 0,16 -0,12 -0,24 0,70 -0,11

Sulfato dos ERPS 0,31 -0,71 0,55 -0,12 0,31 -0,16 -0,45 -0,65 -0,49 -0,49 0,43 -0,54 -0,18 0,22 0,43 -0,54 -0,32 -0,23 0,00

Açúcar dos ERPS -0,08 0,64 -0,47 0,47 0,03 -0,03 -0,04 0,83 0,34 0,34 -0,33 0,22 0,28 0,17 -0,33 0,22 0,19 0,10 0,02 -0,65

Atividade anticoagulante dos ERPS0,17 0,01 -0,14 -0,23 0,09 -0,58 -0,06 0,08 0,06 0,06 -0,32 -0,04 0,07 0,58 -0,32 -0,04 0,05 0,32 0,27 -0,20 0,40

Rendimento da extração 0,13 -0,65 -0,17 -0,58 -0,33 0,13 -0,21 -0,29 0,27 0,27 -0,23 0,19 0,06 -0,15 -0,23 0,19 0,37 -0,54 0,58 0,10 -0,25 0,21

Resultados 93


Figura 27 - Coeficiente de correlação (n=10) para os parâmetros ambientais do local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com o rendimento e composição química dos ERPS da C.

isthmocladum.

Discussão 94


5 DISCUSSÃO



coleta

Os organismos marinhos, como as algas, são uma rica fonte de compostos com

atividades farmacológicas promissoras para uso pela indústria farmacêutica. Dentre

estes compostos destacam-se os PS, aos quais vem sendo atribuídas diversas

atividades farmacológicas, com destaque para a atividade anticoagulante.

No entanto, apesar destas promissoras atividades farmacológicas, não há até

o momento nenhum medicamento a base de PS. Provavelmente, isso se deve ao fato

da grande variabilidade estrutural destes polímeros, uma vez que variam de espécie

para espécie (DIETRICH et al., 1995; ALVES, 2000) e também pelo fato da estrutura

química destes polímeros poder ser modificada de acordo com o período de coleta

da alga (RIOUX; TURGEON; BEAULIEU, 2009; IMBS et al., 2009; MEN´SHOVA et

al., 2012), bem como por fatores ambientais do local de coleta. Apesar disso, poucos

são os estudos que analisam como fatores ambientais do local de coleta podem afetar

a composição química / atividades farmacológicas de PS de algas marinhas.

O grupo de pesquisa no qual está inserida esta tese demostrou que a alga C.

cupressoides var. flabellata coletada na mesma época, mas em praias com grau de

salinidade diferentes, sintetizava PS com propriedades diferentes, como também, PS

com atividades anticoagulantes diferentes (COSTA, 2010), o que indica que esta alga,

e, por conseguinte, seus PS são susceptíveis a fatores ambientais. Por isso, no

presente trabalho resolveu-se analisar de forma mais detalhada a influência do

período de coleta, bem como, das alterações de fatores ambientais que ocorreram

durante este período, no rendimento da extração, na composição e atividade

anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides.

Observou-se que o rendimento da extração dos ERPS da C. cupressoides

variou durante o período de estudo, sendo a maior quantidade de ERPS obtida no

mês de novembro, seguido pelo mês de maio e agosto, respectivamente, e que dois

fatores influenciaram positivamente este aumento: insolação e salinidade. Variações

no rendimento de extrações, de acordo com o período de coleta, já foram observadas

para extratos ricos em PS obtidos algas marrons Saccharina longicruris (RIOUX;

Discussão 95


TURGEON; BEAULIEU, 2009), Costaria costata (IMBS et al., 2009), Padina pavonica

(MEN´SHOVA et al., 2012) e da alga verde Ulva fasciata (SIDDHANTA et al., 2001).

Destes estudos, apenas o primeiro avaliou também a influência de fatores ambientais

no rendimento da extração, como a salinidade, porém nenhuma correlação foi

observada, diferente do que aconteceu nesta tese.

Como dito, a insolação (quantidade de horas de exposição a luz solar de um

dado local) foi correlacionada positivamente com o rendimento dos ERPS de C.

cupressoides. Isto poderia ser explicado pelo fato de aumento de fotossíntese, ou

seja, quanto maior a insolação, maior a quantidade de horas de exposição a luz, por

conseguinte, maior a quantidade de fotossíntese, maior a quantidade de carboidratos

sintetizados, e maior seria o rendimento. Fonseca (2001) demonstrou correlação

semelhante entre esse parâmetro ambiental com a quantidade de carboidratos totais

da alga vermelha Gracilaria cervicornis, coletada também na praia de Búzios-RN. O

autor sugere que isso se deva, provavelmente, ao fato da insolação está relacionada

com o aumento da taxa de fotossíntese desta alga, aumentando, consequentemente,

a quantidade de carboidratos sintetizados por esta espécie.

Esta poderia ser uma justificativa para os resultados aqui descritos. Entretanto,

quando se fez a correlação entre açúcares totais e insolação, observou-se uma

correlação negativa (r = -0,80), o que descarta esta possibilidade. Outro fato que deve

ser observado, é que existe uma forte correlação negativa entre quantidade sólidos

totais e carboidratos (r = -0,87).

Os sólidos totais de uma dada amostra de água referem-se à quantidade de

sólidos em suspensão e aos sólidos dissolvidos contidos na mesma. Foi demonstrado

que os sólidos totais na água diminuem a eficiência da fotossíntese de algas, pois

bloqueiam a passagem de fótons (SILVA et al., 2008). Verificou-se aqui que há uma

forte correlação positiva entre a quantidade de sólidos totais e insolação (r = 0,61), ou

seja, nos meses que há um período maior de luz, há também mais sólidos bloqueando

a passagem dessa luz até as algas.

Estes dados em conjunto levam a observação de que nos meses em que se

obteve o maior rendimento da extração também seriam os meses que a fotossíntese

estaria mais prejudicada, por conseguinte o metabolismo de carboidratos também.

Portanto, acredita-se que esses maiores rendimentos das extrações nesses meses

Discussão 96


de maior insolação seriam decorrentes da presença de outras moléculas que não

carboidratos.

No que diz respeito à salinidade não se identificou nenhum estudo que

apontasse correlação entre salinidade e rendimento de extração. Porém, os dados

aqui apresentados mostram que o aumento da salinidade seria um fator que

promoveria o aumento no rendimento da extração e, provavelmente, o seu aumento

estaria, como a insolação, estimulando anabolismo de diferentes moléculas da alga.

Contudo, infelizmente, aqui neste estudo não foi possível identificar que moléculas

seriam essas.

Com relação as análises químicas dos ERPS da C. cupressoides observou-se

uma variação no conteúdo de açúcares totais e sulfato dos ERPS durante o período

de estudo. Dados semelhantes foram observados por Siddhanta e colaboradores

(2001) ao avaliarem o teor dessas moléculas em extratos obtidos da alga Ulva

fasciata.

A variação na quantidade de açúcares totais dos ERPS da C. cupressoides

teve uma correlação negativa significativa com a quantidade de sólidos totais (r = -

0,87) e sólidos dissolvidos (r = -0,87) na água do mar do local de coleta. Como já

mencionado, os sólidos totais de uma dada amostra de água referem-se à quantidade

de sólidos em suspensão e aos sólidos dissolvidos contidos na mesma, sendo que os

sólidos em suspensão são as partículas capazes de serem retidas por processos de

filtração, já os sólidos dissolvidos são compostos por partículas que continuam em

solução mesmo após a filtração (SILVA et al., 2008). Não foram encontrados relatos

da influência destes parâmetros na quantidade de açúcares em extratos de algas

marinhas, no entanto, já é descrito na literatura que a alta concentração de sólidos

totais pode reduzir a fotossíntese da vegetação enraizada submersa e de algas; e isso

pode, consequentemente, afetar negativamente a quantidade de açúcares totais

presentes nos ERPS.

Já com relação ao teor de sulfato, verificou-se que ele variou conforme o passar

dos meses. Só se identificou mais um artigo que quantificou sulfato de extratos de

alga, nesse caso, da alga U. fasciata (SIDDHANTA et al., 2001). E foi relatado que o

teor de sulfato nesse extrato também se alterava com o passar dos meses.

O parâmetro com maior correlação negativa com o teor de sulfato foi a

salinidade (r = -0,58). Em geral, se atribui um aumento na quantidade de sulfato dos

Discussão 97


polissacarídeos em resposta ao aumento da salinidade. Por exemplo, Nader e

colaboradores (1983) observaram que havia um aumento na concentração de PS em

função do aumento da salinidade do habitat. Posteriormente, Aquino e colaboradores

(2011) analisaram PS de plantas artificialmente e naturalmente expostas a diferentes

salinidades e mostraram que o grau em que estes compostos foram sulfatados em

plantas halófitas aquáticas estava correlacionado positivamente com a salinidade,

sugerindo que a sulfatação destes polímeros seria uma adaptação ao meio salino, e

quando a planta estava num ambiente de salinidade zero, ela não produzia PS.

Posteriormente, foi demonstrado que a planta de água doce Eichhornia crassipes

(DANTAS-SANTOS et al., 2012), sintetiza PS, ou seja, uma planta em um ambiente

cuja a salinidade é zero, sintetiza PS. O que indica que a salinidade pode interferir ou

não na síntese de PS dependendo do organismo.

Em algas isto também parece acontecer, pois não foi visto correlação entre a

sulfatação dos polissacarídeos da alga S. longicruris e a salinidade da água do mar

(RIOUX; TURGEON; BEAULIEU, 2009). Enquanto que para a alga vermelha G.

gracilis foi visto uma correlação negativa significativa entre a salinidade e a quantidade

de sulfato do ágar produzido (MARINHO-SORIANO; BOURRET, 2003), semelhante

ao que foi observado para os ERPS da C. cupressoides.

Então, para se ter uma ideia se essa diminuição da quantidade sulfato estava

relacionado com uma menor quantidade de PS no ERPS, foi feita a densitometria das

lâminas de eletroforese em gel de agarose. Ao se observar os dados dessa

densitometria, verifica-se que a quantidade PS nos ERPS também varia com o passar

dos meses. E quando se fez uma correlação entre os valores de densitometria e

rendimento, observou-se uma correlação negativa (r = - 0,66), o que mostra que há

uma diminuição da quantidade de PS quando há um maior rendimento da extração.

Em suma, a salinidade afeta negativamente a quantidade de carboidratos no

ERPS, mas principalmente dos PS, por isso propõem-se que essa menor quantidade

de sulfato seja, então, uma consequência da menor produção de PS em relação a

quantidade de carboidratos totais.

Só se identificou mais um trabalho que fez correlação da síntese de PS com

parâmetros ambientais. No caso, a alga em estudo foi a Saccharina longicruris

(RIOUX; TURGEON; BEAULIEU, 2009), e neste não foram encontradas correlações

Discussão 98


com os parâmetros ambientais analisados (salinidade e temperatura da água do mar)

com a sulfatação dos PS.

O que leva à proposição de que o mecanismo pelo qual cada espécie de alga

responde a um parâmetro abiótico é diferente. E, por conseguinte, estes dados

confirmam a importância de se estudar o efeito de diferentes parâmetros no

metabolismo de cada alga. Por fim, propõem-se que a insolação promove o aumento

da síntese de outras moléculas, que não carboidratos, o que, consequentemente,

levou a um aumento no rendimento de ERPS da C. cupressoides.

Além de se observar variações na composição química dos ERPS, observou-

se que a atividade anticoagulante também variou de acordo com o mês de coleta.

Apesar de não se ter observado correlações significativas entre as variações na

composição química e atividade anticoagulante dos ERPS, os parâmetros ambientais

podem ter causado sutis diferenças na estrutura química destes polímeros e

consequentemente na sua atividade anticoagulante, como por exemplo, na

distribuição dos grupos sulfatos. Porém, mais estudos são necessários para se

comprovar esta hipótese.

Em conjunto, estes dados (da tese e da literatura) mostram que cada espécie

de alga responde de forma diferente as condições ambientais as quais está

submetida. No caso da C. cupressoides, dependendo do que se pretende obter, esta

pode ser coletada em diferentes épocas do ano: Se o interesse é trabalhar apenas

com ERPS, tendo estes um alto rendimento, o ideal é se coletar a C. cupressoides

nos meses de maio, agosto e novembro (Figura 8). Porém, se o interesse for em obter

maior quantidade de PS tendo estes potente ação anticoagulante, o ideal é se coletar

essa alga nos meses do início do ano (janeiro a abril), meses estes em que, de acordo

com a densitometria (Figura 9B), se tem maior quantidade de PS, coincidindo com os

meses em que os ERPS apresentaram uma alta atividade anticoagulante, sendo a

mais pronunciada observada para ERPS obtido em março. Pretende-se, futuramente,

realizar outras análises a fim de se determinar os melhores períodos de coleta para

os PS com propriedades distintas, que não anticoagulante.

5.2 Parte II: Purificação, caracterização e atividade anticoagulante dos PS

purificados da alga C. cupressoides

Discussão 99


O grupo em que se insere esta tese tem se focado, há mais de uma década,

em extrair, caracterizar e avaliar possíveis atividades farmacológicas de PS de algas

marinhas, incluindo a atividade anticoagulante (ROCHA et al., 2001; ALBUQUERQUE

et al., 2004; ROCHA et al., 2005a; ROCHA et al., 2005b; COSTA et al., 2010; COSTA

et al., 2012; FIDELIS et al., 2014) . Embora haja uma grande quantidade de trabalhos

disponíveis na literatura acerca de estudos de bioprospecção de PS anticoagulantes,

há ainda uma grande variedade de algas não estudadas, e que, portanto, não tiveram

seus PS avaliados quanto a seu potencial anticoagulante.

A escolha pela extração, purificação, caracterização de PS da alga C.

cupressoides se deu pela necessidade em dar continuidade ao trabalho realizado por

Costa (2010), que obteve diferentes PS com atividade anticoagulante, alguns com

atividade semelhante ao Clexane®.

Nesse contexto, espécimes da alga marinha verde C. cupressoides foram

coletados e após processo de extração descrito anteriormente, obteve-se quatro

frações (CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0) que foram nomeados conforme o

volume de acetona necessário para precipitá-los em solução aquosa. Do material

extraído as menores quantidades foram obtidas nas frações CCB-0.3 e CCB-2.0, já

as maiores quantidades obtidas foram das frações intermediárias, a CCB-F0.5 e a

CCB-F1.0. Este perfil de rendimento obtido se assemelha ao obtido em trabalho

anterior realizado com esta mesma alga (COSTA, 2010) e com o de outros trabalhos

desenvolvidos pelo grupo do BIOPOL com algas verdes, como a Codium

isthmocladum (FARIAS, 2005; CORDEIRO, 2013) e a Caulerpa prolifera (CAMARA,

2015). Ou seja, nestes, as frações intermediárias foram obtidas em maior quantidade

do que a primeira e a última fração. Isto também já foi observado para as algas

marrons Dictyota menstrualis (ALBUQUERQUE, 2005) e Dictyopteris justii (MELO,

2013).

A atividade anticoagulante dessas frações polissacarídicas foi analisada e

observou-se que, semelhante ao trabalho de Costa (2010), a fração CCB-0.5

apresentou uma excelente atividade anticoagulante, por isso, esta fração foi

selecionada para passos posteriores de purificação de seus PS, uma vez que isto não

foi realizado no trabalho de Costa (2010).

Após cromatografia de troca iônica da CCB-0.5, obteve-se dois PS,

denominados de FI e FII, respectivamente.

Discussão 100


Com o intuito de se averiguar se os PS FI e FII tratavam-se de PS purificados,

estes foram submetidos à eletroforese em gel de agarose e coradas com azul de

toluidina. Nesse sistema de eletroforese, o tampão utilizado apresenta em sua

constituição o 1,3-diaminopropano, que tem suas aminas protonadas em pH 9,0.

Esses grupamentos são capazes de se complexar com os grupos carregados

negativamente dos polissacarídeos, tais como o sulfato. Porém, tal complexação não

é simplesmente dependente da carga absoluta do PS, mas também da conformação

espacial que a molécula assume no sistema e de como esta favorece a exposição de

seus grupamentos carregados (DIETRICH; DIETRICH, 1976). Devido às

peculiaridades estruturais inerentes a cada polissacarídeo, esses assumem

conformações espaciais únicas, sendo possível individualiza-los com o uso da 1,3-

diaminopropano.

Ao se analisar a lâmina, no qual mostra-se a corrida eletroforética do ERPS, da

fração CCB-0.5 e dos PS FI e FII pode-se perceber que processo de purificação foi

efetivo, pois pode-se observar que durante os passos de purificação há uma

diminuição da polidispersão das bandas metacromáticas, que culminam na separação

de duas populações de PS (FI e FII).

Com relação à caracterização química dos PS FI e FII foi observado um alto

teor sulfato em FI e FII que foi de 33,4% e 36,4%, respectivamente; valores mais

elevados que o do ERPS e da fração CCB-0.5. Os PS FI e FII também apresentaram

quantidades de açúcares totais mais elevadas que os ERPS e a fração CCB-0.5, outro

fato que indica a purificação desses polímeros.

Não foi observada contaminação por proteínas nos PS FI e FII, a ausência

destes contaminantes também foram observados para frações de PS obtidos de

outras algas marinhas como a C. prolifera (CAMARA, 2015) e Hypnea musciformis

(ALVES, 2015), as quais foram extraídas utilizando-se o mesmo método de extração

do presente trabalho. Esses dados indicam que o uso de proteases como passo inicial

durante o processo de extração dos polissacarídeos, como utilizados neste trabalho,

é essencial para a obtenção de baixos níveis ou, até mesmo, eliminação dos

contaminantes protéicos.

A análise da composição monossacarídica dos PS FI e FII de C. cupressoides

demonstrou que tais moléculas são heteropolissacarídeos, tendo como principais

monossacarídeos constituintes a galactose, seguido da glicose, sendo assim

Discussão 101


consideradas como glucogalactanas. A obtenção de heteropolissacarídeos é comum

em algas verdes como evidenciado em C. cylindricum (MATSUBARA et al., 2001),

Ulva fasciata (SHAO et al., 2013), Enteromorpha intestinallis (WANG et al., 2014),

inclusive em espécies do gênero Caulerpa, como C. okamurai (HAYAKAWA et al.,

2000), C. racemosa (CHATTOPADHYAY et al., 2007), C. lentifera (MAEDA et al.,

2012) e C. prolifera (CAMARA, 2015).

No entanto, observa-se uma predominância de um monossacarídeo em

detrimento de outros monossacarídeos em certas famílias de algas. Por exemplo, os

PS de algas da família Codiaceae são compostos principalmente, de arabinose e

galactose, os da Ulvaceae e Monostromataceae são constituídos principalmente por

ramnose, já os da Caulerpaceae, como C. cupressoides, são compostos,

principalmente, por galactose (MAO et al, 2006; MAEDA et al., 2012, CAMARA, 2015).

No entanto, as evidências existentes são insuficientes para estabelecer uma relação

sistemática entre a estrutura, incluindo a composição monossacarídica, e a filogenia

das algas.

Apesar do modelo de coagulação em “cascata” estar ultrapassado, ele ainda

continua sendo usado na clínica para se avaliar distúrbios e/ou atuação de

determinados compostos, como os anticoagulantes, no processo de coagulação

sanguínea (CIANCIA; QUITANA; CEREZO, 2010). Em geral, a atividade

anticoagulante dos PS é mensurada pelos testes clássicos de coagulação sanguínea:

aPTT, PT e TT.

O teste de aPTT é utilizado para avaliar se um determinado composto é capaz

de atuar nos fatores da via intrínseca e/ou comum da coagulação, ou seja, se ele é

capaz de atuar nos fatores XII, XI, IX, VIII, X, II e/ou fibrinogênio. O teste de PT, é

utilizado para se averiguar se um determinado composto é capaz de atuar nos fatores

da via extrínseca e/ou comum da coagulação, ou seja, se é capaz de atuar nos fatores

VII, X, V, II e/ou fibrinogênio. Já o teste de TT avalia a capacidade de compostos em

atuar na última etapa da coagulação sanguínea, a chamada via comum da

coagulação, neste caso, a presença de substâncias que interferem na ação da

trombina sobre o fibrinogênio ou aquelas que bloqueiam a polimerização da fibrina

promovem um prolongamento do tempo de coagulação do plasma neste teste.

Para se ter ideia em qual via os PS da C. cupressoides poderiam agir,

inicialmente, estes PS foram submetidos aos testes de aPTT, PT e TT. Todos os

Discussão 102


polissacarídeos tiverem a capacidade de prolongar o tempo de coagulação, nestes

três testes de maneira dose-dependente. Vale ressaltar, que o PS FII apresentou uma

melhor atividade nos testes de aPTT e PT que o PS FI, já no teste de TT ambas

tiveram atividade semelhantes.

Estes dados indicam que os PS da alga C. cupressoides possuem vários alvos

moleculares na cascata e coagulação, uma vez que se identificou a presença de

atividade nos testes de aPTT, PT e TT, ou seja, que foram capazes de agir na via

intrínseca, extrínseca e comum da coagulação.

Outra consideração, é que o grupo sulfato é importante para a atividade

anticoagulante, uma vez que, os PS FI e FII, que tiveram atividades anticoagulantes

mais elevadas, são mais sulfatados que a fração CCB-0.5 e o ERPS. Este resultado

corrobora com o de Azevedo e colaboradores (2009), que mostraram que quando os

PS eram desulfatados quimicamente, os mesmos perdiam a sua atividade

anticoagulante. No entanto, quando se compara a atividade de FI e FII, que possuem

quantidade de sulfato semelhante, observa-se que a atividade do FII é mais

pronunciada, o que corrobora com outros autores que afirmam que a atividade

anticoagulante parece não depender apenas da quantidade de sulfato encontrada nos

PS; e sim de outras características como a disposição desses grupamentos funcionais

na estrutura do polissacarídeo, bem como os tipos de resíduos de carboidratos que

constituem os polímeros (NGO et al., 2013; JIAO et al., 2011; CAMARA, 2015).

Em geral, são descritos na literatura que o mecanismo de ação dos PS de algas

é devido a inibição da trombina via AT e, principalmente, via HCII como é descrito para

os PS anticoagulantes das algas verdes Codium adhaerence e Codium divaricatum

(HAYAKAWA et al., 2000) ou agem apenas via HCII como os PS das algas Caulerpa

brachypus e Caulerpa okamurai (HAYAKAWA et al., 2000) ou ainda podem agir tanto

potencializando a ação das serpinas quanto diretamente na trombina como os PS da

Ulva conglobata (MAO et al., 2006).

Para se averiguar se o mecanismo de ação dos PS FI e FII era devido a inibição

desta protease da cascata de coagulação, realizou-se o ensaio de inibição da

trombina tanto na presença, como na ausência das serpinas AT e HCII, usando-se

substrato cromogênico. Observou-se que na ausência das serpinas os PS FI e FII

inibiram a atividade da trombina em 26,3% e 30,3%, respectivamente. Já na presença

Discussão 103


do HCII a inibição foi de 35,1% e 37,8% para os PS FI e FII, respectivamente. Já na

presença da AT não foi observada inibição da atividade da trombina.

Por um lado, observou-se alta atividade anticoagulante para o teste de aPTT,

além de atividade no PT, porém, no ensaio de inibição da trombina esta atividade não

foi muito pronunciada, isso é indicativo que os PS podem estar agindo em diversas

proteases da cascata de coagulação. Porém, mais estudos são necessários para

explicar detalhadamente quais os alvos de ação destes polímeros.



coleta

Levando em consideração o que foi dito acima, avaliou-se também como os

fatores abióticos influenciavam outras algas verdes, também encontradas em Búzios-

RN, com relação ao rendimento de extração, teor de polissacarídeos e sulfato e

atividade anticoagulante.

Da mesma forma que se observou variações no rendimento, composição

química e atividade anticoagulante para os ERPS alga verde C. cupressoides.

Observou-se também variações nestes parâmetros para os ERPS das demais algas

verdes aqui estudadas (C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C.

isthmocladum). No entanto, um fato interessante é que cada alga responde de forma

diferente às condições ambientais do local de coleta.

Em geral, os parâmetros ambientais do local de coleta que afetaram os ERPS

da C. cupressoides afetam de forma similar os ERPS da C. racemosa. Houve uma

forte correlação positiva (r = 0,73) entre a insolação e o rendimento dos ERPS, no

entanto, quando se observa a correlação entre a insolação e a quantidade de açúcares

totais, observa-se correlação negativa (r = -0,59) o que pode indicar que nos meses

em que se obteve o maior rendimento da extração também seriam os meses que a

fotossíntese estaria mais prejudicada, por conseguinte o metabolismo de carboidratos

também. Logo, os maiores rendimentos das extrações, nos meses de maior insolação,

seriam decorrentes da presença de outras moléculas que não carboidratos.

Um outro fator que afetou de forma positiva o rendimento da extração das

ERPS da C. racemosa foi a salinidade da água do mar (r = 0,66), porém, quando se

Discussão 104


observa a correlação entre a salinidade e a quantidade de açúcares totais observa-se

o inverso, ou seja, há uma forte correlação negativa entre estes dois parâmetros (r =

-0,70), o que indica, como visto para a alga C. cupressoides, que o aumento da

salinidade, estaria, juntamente com a insolação, estimulando anabolismo de

diferentes moléculas da alga C. racemosa, que não polissacarídeos.

Além disso, também houve correlação positiva significativa entre o rendimento

e a quantidade de sódio (r = 0,68) e cloreto (r = 0,69) da água do mar. Isto já era de

se esperar, uma vez que houve correlação positiva entre o rendimento e a salinidade;

e estes sais são os principais responsáveis pela salinidade da água.

A quantidade de açúcares totais dos ERPS da C. racemosa, além de ser

afetada pela salinidade da água do mar, também foi correlacionada com os

parâmetros alcalinidade de bicarbonato, bicarbonato e com a temperatura da água do

mar, porém esta correlação foi positiva.

A alcalinidade da água é uma medida de tamponamento da água (capacidade

de resistir às mudanças de pH), sendo esta atividade dependente, principalmente, de

íons carbonatos, bicarbonatos e hidróxidos (HAGEMANN, 2009; PIÉRRI, 2012). No

ambiente marinho, a quantidade de dióxido de carbono, por vezes, pode ser limitada,

prejudicando a fotossíntese dos seres que neste ambiente vivem, como as algas. No

entanto, estes seres tendem a desenvolver estratégias para sobreviver diante deste

fato, uma delas é a captação desses íons bicarbonatos, como fonte de carbono

inorgânico, os quais podem estar em quantidades mais elevadas na água do que o

dióxido de carbono (GRANBOM; PEDERSÉN, 1999; LARSSON; AXELSSON, 1999;

PIERINI; THOMAZ, 2004).

De acordo com os dados de correlações visto para a alga C. racemosa, essa

parece ser uma estratégia utilizada pela mesma, uma vez que se observou uma forte

correlação positiva entre a alcalinidade de bicarbonato (r = 0,76) e a quantidade de

açúcares totais dos ERPS desta alga, ou seja, quanto maior a alcalinidade de

bicarbonato, maior absorção deste íon pela alga, o que permitiria, então, a uma maior

síntese de açúcares, o que se refletiu em ERPS.

Outro fator correlacionado com a quantidade de açúcares totais dos ERPS da

C. racemosa foi a temperatura da água do mar (r = 0,79). Já foi observado, por outros

autores, correlação positiva entre temperatura da água do mar e a quantidade de

carboidratos totais das algas vermelhas Grateloupia doryphora e Gymnogongrus

Discussão 105


griffithsiae (PERFETO, 1998), Gracilaria cervicornis (MARINHO-SORIANO et al.,

2006), Catenella repens (BANERJEE et al., 2009). De acordo com estes autores a

temperatura estaria afetando a fotossíntese dessas espécies, por isso, maior seria a

produção de carboidratos, no entanto, os mesmos não explicaram detalhadamente o

mecanismo pelo qual a temperatura agiria.

A quantidade de sulfato dos ERPS da C. racemosa foi correlacionada

negativamente com a condutividade elétrica (r = -0,71) e com a salinidade (r = -0,51).

Como a síntese de açúcares totais também foi correlacionada negativamente com

estes parâmetros, então acredita-se que essa menor quantidade de sulfato seja

decorrente da menor quantidade de PS.

A atividade anticoagulante dos ERPS de C. racemosa não foi afetada pelas

alterações nas quantidades dos compostos aqui estudados, já que não se identificou

correlação dessa atividade com quantidade de polissacarídeo e sulfato. Porém se

identificou uma correlação positiva desta atividade com a insolação (r = 0,63) e com a

quantidade de cloreto (r = 0,71). Essa foi a primeira vez que se identificou este tipo de

correlação, portanto não há relatos sobre este assunto, o que dificultou a proposição

de hipóteses que justificassem estes dados. Em vários trabalhos com PS purificados

de algas e que apresentam atividade anticoagulante, há relatos que a quantidade de

sulfato não é o único fator predominante para que os PS ajam como anticoagulantes,

e que a distribuição dos grupos sulfato pela molécula seriam, sim, um fator muito mais

importante (FONSECA et al., 2008; JIAO et al., 2011; NGO et al., 2013). As

glicosiltransferases, sulfotranferases e sulfatases são as enzimas responsáveis pela

síntese de polissacarídeos sulfatados (HO, 2015), e como todas as enzimas, suas

ações são afetadas por fatores como presença de íons e temperatura. Por exemplo,

há relatos que já mostram que o cloreto (125 mM) afeta a ação de sulfotransferases

de mamíferos (GLATT et al., 1993). Além disso, a síntese de polissacarídeos é bem

mais maleável do que de outras macromoléculas, pois não há um molde para se

seguir. Como também, não há um sistema de reparo da síntese de polissacarídeos.

Diante deste quadro, propõem-se que a insolação e a quantidade de cloreto estariam

afetando as enzimas de síntese de PS em C. racemosa, o que, por conseguinte,

levaria a síntese de PS com sutis diferenças estruturais que se refletiriam nas

diferentes atividades anticoagulantes dos ERPS aqui observadas. Espera-se no

Discussão 106


futuro, purificar estes PS produzidos mensalmente e avaliá-los estruturalmente afim

de se identificar estas diferenças.

O rendimento da extração dos ERPS da C. sertularioides foi correlacionado, de

forma significativa, negativamente com quantidade de nitrogênio na água (r = -0,58).

Além disso, a quantidade de nitrogênio foi o único fator a afetar a quantidade de

açúcares totais dos ERPS (r = -0,64), ou seja, foi observada uma maior quantidade de

carboidratos e, consequentemente maior rendimento dos ERPS, nos períodos com

menores valores de nitrogênio na água. Marinho-Soriano e Bourret (2003) estudando

fatores que afetam o rendimento da extração de ágar da alga Gracilaria bursa-pastoris

verificaram que também havia uma correlação negativa significativa entre este

rendimento e a quantidade de nitrogênio. De acordo com os autores isto se deve ao

fato da síntese de proteínas ter sido limitada a favor da síntese de polissacarídeos.

Correlação inversa entre a quantidade de nitrogênio e a quantidade de carboidratos

totais também foi observada para alga Catenella repens (BANERJEE et al., 2009),

estes autores justificaram este fato da mesma maneira explicada por Marinho-Soriano

e Bourret (2003) para a alga G. bursa-pastoris. Logo, propõem-se que isso também

possa estar acontecendo com a alga C. sertularioides.

Outro fator que teve correlação negativa com o rendimento foi a precipitação

pluviométrica. Inicialmente, esperava-se que houvesse uma correlação entre a

luminosidade e precipitação, o que poderia ajudar a explicar este achado. Todavia,

isso não ocorreu. Não se encontrou nenhum outro trabalho que relatasse algum tipo

de correlação da precipitação pluviométrica com o rendimento de extração de

polissacarídeos. Portanto, infelizmente, ainda não se tem uma hipótese razoável para

explicar este dado. Observou-se, ainda, uma correlação positiva do rendimento com

a quantidade de potássio (r = 0,61). Acredita-se que este íon esteja afetando a ação

das enzimas do metabolismo da alga e, assim, fazendo com esta aumente a síntese

de suas moléculas, por conseguinte, isso afetaria o rendimento da extração.

Outro dado interessante é a correlação positiva entre a quantidade de sulfato

dos ERPS e a insolação (r = 0,70). A alga em questão, dentre todas as estudadas, foi

a que foi encontrada mais próxima à praia, ou seja, os espécimes dessa alga ficavam

mais tempo expostos ao sol sem a proteção da água do mar. Portanto, estavam mais

propensas à desidratação do que as outras algas. Os PS e os grupos sulfatos neles

presentes, por serem higroscópicos, tem como uma das funções básicas, proteger as

Discussão 107


algas da desidratação (PERCIVAL; MCDOWELL, 1967; O’SULLIVAN et al., 2010).

Portanto, a alga deveria, nos meses de maior insolação, sintetizar mais

polissacarídeos, e isso aumentaria o rendimento da extração. Porém isso não ocorreu,

então, acredita-se que nos meses de maior insolação, essa alga responde a esse

fator, não sintetizando mais polissacarídeos, mas sim, aumentando o grau de

sulfatação de seus polissacarídeos.

Já em relação a atividade anticoagulante dos ERPS da C. sertularioides não foi

observada nenhuma correlação significativa entre este parâmetro e os parâmetros

ambientais do local de coleta, apesar de se ter observado uma variação significativa

desta atividade de acordo com o período de coleta. O que leva proposição de que,

assim como ocorreu com as outras algas, os parâmetros ambientais podem ter

causado sutis diferenças na estrutura química destes polímeros e consequentemente

na sua atividade anticoagulante. Desta forma, mais estudos são necessários para se

comprovar esta hipótese.

Para a alga C. prolifera observou-se variações significativas no rendimento da

extração, na composição química e atividade anticoagulante dos ERPS obtidos

mensalmente. Apesar disto, quando se analisa as correlações destes parâmetros com

os parâmetros ambientais poucas correlações foram observadas (açúcares totais e

turbidez; atividade anticoagulante e precipitação), o que indica que esta alga pode

estar sendo afetada por outros parâmetros os quais não foram analisados nesta tese.

Houve uma correlação positiva significativa entre a quantidade de açúcares

totais e a turbidez (r = 0,61). Contudo, se esperava o contrário, pois com maior

turbidez, menos luz chegaria a alga e ela faria menos fotossíntese, e

consequentemente, menos polissacarídeos. Porém, isso não ocorreu. Portanto, a

hipótese proposta para justificar esse dado é que com o aumento da turbidez, houve

o aumento de uma ou mais moléculas na água que funcionariam, para essa alga,

como estimuladores da síntese de polissacarídeos, fazendo com que a alga

sintetizasse mais estas moléculas.

Encontrou-se, também, uma correlação negativa entre a precipitação

pluviométrica e a atividade anticoagulante (r = -0,59). Porém, não se observou

correlação entre a precipitação e qualquer outro parâmetro avaliado. Então a hipótese

proposta é que a precipitação está afetando a concentração de um parâmetro que não

foi avaliado e este por sua vez, nessa alga, afeta a estrutura dos PS sintetizados pela

Discussão 108


alga, o que é confirmado pelas alterações das atividades anticoagulantes dos ERPS

dessa alga observadas durante o ano.

Para a alga C. isthmocladum observou-se uma correlação positiva forte entre a

temperatura da água do mar e a quantidade de açúcares totais dos ERPS (r = 0,64).

Neste caso, como observado também para C. racemosa, a temperatura da água

parece afetar a fotossíntese, aumentando, assim, a síntese de carboidratos. Contudo,

isto não se refletiu no rendimento da extração, pois houve uma correlação negativa

entre temperatura e rendimento (r = -0,65). Além disso, a temperatura também afetou

de forma negativa a quantidade de sulfato dos ERPS (r = -0,71). Correlação negativa

entre a quantidade de sulfato e a temperatura também foi observada para o ágar

extraído da G. bursa-pastoris (MARINHO-SORIANO E BOURRET, 2003), no entanto,

estes autores não explicaram por quais motivos isso ocorreria. A hipótese aqui

sugerida é que se tem uma maior síntese de carboidratos, mas essa não é

acompanhada pela síntese de PS, o que justificaria essa menor quantidade de sulfato.

Isso também ocorre quando se olha e condutividade elétrica e a quantidade de

açúcares totais (r = 0,83) e a quantidade de sulfato (r = -0,65). Outro detalhe

interessante é que há uma correlação positiva entre condutividade elétrica e

temperatura (r = 0,62), o que indica, que nessa alga, estes fatores estão atuando em

conjunto. Outro fato interessante, é que a condutividade elétrica faz correlação com

vários dos sais analisados, mas não se encontrou nenhuma correlação desses com a

quantidade de polissacarídeos e com a de sulfato, o que indica que eles precisam

atuar em conjunto para estimularem a síntese dos polissacarídeos nessa alga.

Já em relação a atividade anticoagulante dos ERPS da C. isthmocladum não

foi observada nenhuma correlação significativa entre este parâmetro e os parâmetros

ambientais do local de coleta, apesar de se ter observado uma variação significativa

desta atividade de acordo com o período de coleta. O que se leva a propor o mesmo

proposto para as algas C. cupressoides e C. sertularioides, ou seja, que os parâmetros

ambientais podem ter causado sutis diferenças na estrutura química destes

polissacarídeos e consequentemente na sua atividade anticoagulante.

Em suma, os dados apresentados nesta tese demonstram que cada espécie

de alga estudada responde de forma diferente as condições ambientais as quais está

submetida, apesar das algas aqui estudadas serem do mesmo Filo e, inclusive, 4

Discussão 109


delas serem do mesmo gênero (Caulerpa), ou seja, espécies relativamente

aparentadas.

Para C. racemosa os meses para se obter maior quantidade de material de

ERPS, ou seja, o período para coletar a C. racemosa e se ter melhor rendimento de

extração seria no final do ano (setembro a novembro), meses estes que também

coincidem com o período em que os ERPS tiveram maior atividade anticoagulante e

perfil eletroforético bastante similar.

Para a alga C. sertularioides o período de setembro a fevereiro, seria o melhor

período para se obter melhor rendimento de extração dos ERPS. O período de

setembro a janeiro foi o período em que os ERPS tiverem as mais altas atividades

anticoagulantes. No entanto, vale ressaltar que, em fevereiro, apesar de ser o mês em

que se observou maior rendimento da extração, foi justamente o mês em que se

obteve um PS com perfil eletroforético bastante distinto dos ERPS obtidos nos demais

meses, e isso parece ter se refletido na atividade anticoagulante do ERPS obtido em

fevereiro, uma vez que esta atividade diminuiu drasticamente.

Já para a alga C. prolifera o rendimento da extração, apesar de haver uma

variação significativa durante o ano, esta variação não foi tão pronunciada como visto

para demais algas. Os meses de março e abril foram os meses em que se obteve

menor rendimento. E também de acordo com o perfil eletroforético menor quantidade

de PS e isso pode ter se refletido na atividade anticoagulante, uma vez que nestes

meses foram observadas as menores atividades anticoagulantes, com exceção do

ERPS do mês de maio.

Por fim, para a alga C. isthmocladum os valores mais altos de rendimento da

extração foram observados nos ERPS obtidos de novembro a janeiro, com destaque

para o mês de dezembro. Com relação a atividade anticoagulante este foi a alga em

que os ERPS foram menos efetivos sendo a maior atividade observada em junho, por

isso, sugeri-se fazer prospecção de outras atividades farmacológicas para os PS

obtidos dessa alga.

Pretende-se, futuramente, realizar outras análises a fim de se determinar os

melhores períodos de coleta para os PS com propriedades distintas, que não

anticoagulante.

Conclusões 110


6 CONCLUSÕES

Houve uma variação significativa no rendimento da extração dos ERPS da alga C.

cupressoides de acordo com o período de coleta, esta variação foi correlacionada

positivamente com os parâmetros ambientais: salinidade da água do mar e insolação.

Houve uma variação significativa na quantidade de açúcares totais e na quantidade

de sulfato dos ERPS da alga C. cupressoides de acordo com o período de coleta.

Sendo a quantidade de açúcares totais correlacionada negativamente com a

insolação, sólidos totais, quantidade de cloreto e de sódio da água do mar e a

quantidade de sulfato correlacionada negativamente com a salinidade da água do

mar.

Houve uma variação significativa na atividade anticoagulante dos ERPS da alga C.

cupressoides de acordo com o mês de coleta, sendo o mês de março o período no

qual de obteve ERPS com melhor atividade anticoagulante. Apesar de não se ter

observado correlações significativas entre as variações na composição química e

atividade anticoagulante dos ERPS, sugere-se que os parâmetros ambientais podem

ter causado sutis diferenças na estrutura química destes polímeros e,

consequentemente, na sua atividade anticoagulante, como por exemplo, na

distribuição dos grupos sulfatos.

A alga C. cupressoides sintetiza quatro frações ricas em polissacarídeos sulfatados

CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0, sendo que a CCB-0.5 apresenta uma potente

ação anticoagulante pelo teste de aPTT.

Foram purificados dois polissacarídeos sulfatados da CCB-0.5 e as análises

químicas e de composição monossocarídica indicaram que se tratam de

glucogalactanas sulfatadas.

As glucogalactanas sulfatadas da C. cupressoides são potentes compostos

anticoagulantes e agem nas vias intrínseca, extrínseca e comum da coagulação.

Análises do mecanismo de ação destes polímeros indicaram que são capazes de inibir

a parcialmente a trombina.

Conclusões 111


Houve variação significativa no rendimento, composição química e atividade

anticoagulante dos ERPS obtidos das algas verdes C. prolifera, C. racemosa, C.

sertularioides e C. isthmocladum de acordo com o mês de coleta. Além disso,

observou-se que cada alga responde de forma diferente às condições ambientais do

local de coleta. E por isso, podem ou não sintetizar PS com características químicas

diferentes de acordo com o período de coleta das mesmas e, consequentemente,

estes polímeros podem apresentar propriedades farmacológicas distintas.

Referências 112


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Apêndice 126


APÊNDICE Média mensal de parâmetros ambientais do local de coleta (Praia de Búzios, Nísia Floresta/RN).

Jan 37,0 26,0 0,3 8,5 0,0 606,6 2478,0 44893,3 39530,0 39530,0 31,1 100,8 11052,5 0,7 18,7 122,9 21076,8 70,9 259,1

Fev 35,0 32,0 1,4 8,3 0,0 666,7 3389,4 49156,0 38697,0 38697,0 0,0 129,8 9714,4 0,8 0,0 158,3 18585,6 81,4 205,7

Mar 37,5 36,0 0,0 8,5 0,0 474,1 2887,2 53740,0 39532,4 39532,4 22,3 117,5 10357,1 1,0 13,4 143,3 20531,7 69,9 167,2

Abri 37,5 34,0 0,3 8,2 0,1 416,7 3094,1 52135,0 39540,0 39540,0 0,0 131,9 11250,0 0,7 0,0 160,9 20932,3 191,0 244,7

Mai 37,5 32,0 0,4 8,4 0,1 426,5 3012,1 53050,0 39964,0 39964,0 14,3 98,7 11500,0 1,1 8,6 120,4 21395,4 262,6 276,3

Jun 37,0 30,0 0,4 8,4 0,1 410,7 2393,5 48116,0 38750,0 38750,0 10,2 107,9 10500,0 1,1 6,1 131,6 19446,0 155,2 239,1

Jul 38,0 30,0 1,9 7,5 0,3 375,0 1822,0 45712,0 37592,0 37592,0 0,0 122,5 10000,0 0,8 0,0 149,5 18929,8 151,5 198,4

Ago 38,5 26,0 1,9 8,4 0,0 411,3 3186,4 44732,0 38928,0 38928,0 28,4 85,3 10714,3 1,2 17,1 104,0 19274,0 95,3 250,8

Set 38,5 28,0 2,2 8,3 0,0 442,9 3164,7 47296,0 38996,0 38996,0 0,0 115,4 10476,2 1,5 0,0 140,8 20864,1 38,5 269,9

Out 38,5 31,0 0,3 8,5 0,0 454,5 3063,3 54900,0 39588,0 39588,0 25,1 90,3 12500,0 1,0 15,1 110,2 22988,4 8,2 304,5

Nov 39,5 29,0 0,3 8,2 0,1 428,6 1876,8 58300,0 40444,0 40440,0 0,0 116,6 11909,1 1,0 0,0 142,2 22609,1 4,2 316,7

Dez 38,0 26,0 0,8 6,7 0,0 429,6 2792,0 44132,0 39523,2 39523,2 0,0 126,6 10370,0 0,9 0,0 154,4 21243,4 57,4 281,0

Ferro

(mg/L)

Carbonato

(mg/L)

Bicarbonato

(mg/L)

Cloreto

(mg/L)

Insolação

(h)pH

Nitrogênio

amoniacal

(mg/L)

Sódio

(mg/L)

Potássio

(mg/L)

Sulfato

(mg/L)

Condutividade

elétrica

Sólidos

totais

(mg/L)

Sólidos

dissolvidos

totais (mg/L)

Salinidade

(‰)

Temperatura

(ºC)

Turbidez

(UT)

Precipitação

pluviométrica

(mm)

Alcalinidade

de carbonato

(mg/L)

Alcalinidade de

bicarbonato

(mg/L)

universidade federal do rio grande do norte centro … · todos os sacrifícios que enfrentou para...

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