i

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Ciências da Saúde

Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde

FATORES DE RISCO INDIVIDUAIS E FAMILIARES NO DESENVOLVIMENTO

DA PRÉ-ECLÂMPSIA

FLÁVIO VENÍCIO MARINHO PEREIRA

NATAL

2010

ii

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Ciências da Saúde

Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde

Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde

Profa Dra. Técia Maria de Oliveira Maranhão

i

CATALOGAÇÃO NA FONTE

P436f Pereira, Flávio Venício Marinho.

Fatores de risco individuais e familiares no desenvolvimento da pré-eclâmpia / Flávio Venício Marinho Pereira. – Natal, 2010.

87f. : Il.. Orientadora: Profª . Drª. Selma M. B. Jerônimo. Coorientadora: Profª Drª Ana Cristina Pinheiro de Araújo Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências

da Saúde. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

1. Obstetrícia –Tese. 2. Pré-eclâmpia – Tese. 3. Eclâmpsia – Tese. 4. Síndrome de Hellp – tese. I. Jerônimo, Selma M. B.. II. Araújo, Ana Cristina Pinheiro de. III. Título.

RN-UF/BS-CCS CDU: 618.4 (043.2)

iii

FLÁVIO VENICIO MARINHO PEREIRA

FATORES DE RISCO INDIVIDUAIS E FAMILIARES NO DESENVOLVIMENTO DA

PRÉ-ECLÂMPSIA

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde.

NATAL

2010

iv

Flávio Venício Marinho Pereira

FATORES DE RISCO INDIVIDUAIS E FAMILIARES NO DESENVOLVIMENTO DA

PRÉ-ECLÂMPSIA

BANCA DE EXAMINADORA

Prof. Dra. Helena Bonciani Nader, Professora Titular, Departamento de Bioquímica,

Universidade Federal de São Paulo

Prof. Dr Aldo Angelo Lima, Professor Titular, Departamento de Farmacologia,

Universidade Federal do Ceará

Prof. Dra. Lara de Melo Barbosa, Professora Associada, Departamento de Estatística,

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Prof. Dr. Reginaldo Antonio de Oliveira Freitas Junior, Professor Adunto, Departamento

de Toco-ginecologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Prof. Dra. Selma M. B. Jeronimo, Professora Titular, Departamento de Bioquímica,

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

v

Aos Meus Pais.

As Gestantes do Ambulatório de Hipertensão,

Enfermaria de Alto Risco, e demais gestantes

da Maternidade Escola Januário Cicco da

UFRN

vi

Agradecimentos

A profa. Selma Maria Bezerra Jeronimo, minha orientadora e amiga, pessoa sempre

presente nos últimos 35 anos da minha vida.

A profa. Ana Cristina Pinheiro de Araújo, Co-orientadora e coordenadora da base de

pesquisa em saúde da Mulher.

Ao prof. Kleber Morais, Diretor da Maternidade Escola Januário Cicco – UFRN.

Ao prof. José Wilton Queiroz pelo auxílio no desenho do estudo e análise estatística.

Ao Biomédico Leonardo Capistrano pelo auxílio no arrolamento das gestantes e

experimentos laboratoriais.

A Dra. Ana Kaline Jerônimo, biomédico Thiago Barbosa e alunos de iniciação

científica, assim como a todos os demais componentes do laboratório de imuno-

genética do Departamento de Bioquímica da UFRN que muito contribuíram na

realização desse trabalho.

Aos Drs: Edaílna Maria de Melo Dantas, Patrícia da Costa Fonseca Meirelles e Marcos

Dias Leão, amigos e companheiros da nossa base de pesquisa que muito contribuíram

na realização desse projeto.

As minhas amigas Angela de Oliveira Dieb, Sílvia Cury, meus irmãos, sobrinhos e

demais amigos pelo apoio dado ao longo da realização desse trabalho.

vii

SUMÁRIO

1. JUSTIFICATIVA....................................................................................................... 1-2

2. Objetivos .................................................................................................................... 3

2.1. Objetivo Geral ..................................................................................................... 3

2.2. Objetivos Específicos .......................................................................................... 3

3. Revisão da Literatura ........................................................................................... 4-16

3.1. Aspectos gerais ................................................................................................... 4

3.2. Epidemiologia ................................................................................................... 5-6

3.3. Etiologia ............................................................................................................ 6-7

3.4. Fisiopatologia da pré-eclâmpsia, síndrome HELLP e eclâmpsia ......................... 7

3.4.1. Pré-eclâmpsia .................................................................................................. 7

3.4.2. Síndrome HELLP .......................................................................................... 8-9

3.4.3. Eclâmpsia .................................................................................................... 9-10

3.5. Resposta imune na pré-eclâmpsia .................................................................... 10

3.6. Fatores Genéticos ........................................................................................ 12-16

4. Métodos .............................................................................................................. 17-22

4.1. Local de Estudo e População estudada ............................................................. 17

4.2. Desenho do estudo ....................................................................................... 17-18

4.3. Definição das doenças hipertensivas da gravidez e critérios de inclusão .......... 18

5.4. Critérios de exclusão .......................................................................................... 18

4.5. Exames laboratoriais clínicos ............................................................................. 19

4.6. Extração de DNA ............................................................................................... 19

4.7. Análise de polimorfismo 936C>T no gene do VEGF .......................................... 20

4.8. Seqüenciamento de DNA ................................................................................... 20

4.9. Determinação dos níveis séricos de VEGF e SFL-t 1 ........................................ 21

4.10. Considerações Éticas ...................................................................................... 21

4.11. Análises estatísticas .................................................................................... 21-22

5. Resultados .......................................................................................................... 23-51

5.1. Características da população estudada ........................................................ 23-28

5.2. Avaliação de fatores de riscos associados a história familiar de doenças .... 29-30

5.3. Avaliação da presença de hipertensão, PE e eclâmpsia em mães e irmãs .. 30-38

viii

5.4. Risco familiar de desenvolver pré-eclâmpsia considerando os grupos casos

como pré-eclâmpsia grave e leve. ............................................................... 39-45

5.5. Fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) na pré-eclâmpsia ............ 46-47

5.6. Determinação sérica dos níveis de VEGF e do seu receptor, sFlt1 .............. 48-51

6. Discussão ........................................................................................................... 52-58

7. Conclusões .............................................................................................................. 59

ANEXOS ................................................................................................................... 60

Anexo 1. Questionário

Anexo 2. Termo de consentimento livre e esclarecido

Anexo 3. Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte e Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP)

8. Referências Bibliograficas ................................................................................ 61-85

Abstract ........................................................................................................................ 86

Glossário ...................................................................................................................... 87

ix

RESUMO

A pré-eclâmpsia é uma doença espectral, com formas distintas, podendo evoluir com

complicações multissistêmicas graves. Este presente trabalho teve como objetivos

determinar os fatores de risco envolvidos com a pré-eclâmpsia (PE); validar a

existência de agregação de doença hipertensiva em famílias de gestantes com pré-

eclâmpsia; verificar a existência de associação entre polimorfismo no gene do VEGF e

determinar os níveis de VEGF e seu receptor solúvel (sFlt1). Um estudo caso-controle

foi realizado (n=851). A genotipagem do VEGF foi realizada e os níveis séricos de

VEGF e sFlt1 foram determinados por ELISA. Foi observado que 38 % das mães (173

de 455) de um caso de pré-eclâmpsia e 30.8% (78 de 361) dos controles apresentavam

história de hipertensão (p<0.0001). De forma que 14.6% (48 de 328) das mães das

gestantes com pré-eclâmpsia e 9.6% (12 de 294) das mães dos controles tinham

história de pré-eclâmspia (p=0.0001). Quanto à história materna de eclâmpsia,

observou-se que 5.1% (15 de 295) dos casos e 3.6% (7 de 314) dos controles tinham

história de pré-eclâmpsia (p=0.0568). Irmãs das gestantes com pré-eclâmpsia tinham

também história de doença hipertensiva em 9% (41 de 455), versus 6.6% (13 de 361)

dos controles, p=0.002. Da mesma forma ao ser examinada a história de pré-eclâmpsia

em irmãs, observou-se que 22.7% (57 de 251) das irmãs dos casos de pré-eclâmpsia,

versus 11.4% (26 de 228) dos controles apresentavam história de pré-eclâmpsia

(P=0.0011). O VEGF livre estava diminuído no soro dos casos (P<0.05) enquanto que

o receptor solúvel do VEGF estava aumentado. Não foi observada associação entre

polimorfismos nos genes do VEGF e pré-eclâmpsia. Os dados obtidos neste trabalho

validam que doença hipertensiva em mães e irmãs com pré-eclâmpsia são fatores de

risco para pré-eclâmpsia. O risco de doença na família é maior de acordo com a

gravidade da doença. A história de pré-eclâmpsia elevada em familiares dos controles

respectivamente, 9,6% e 11,4%, em mães e irmãs dos controles demonstram que a

pré-eclâmpsia é uma doneça freqüente nesta população. Trabalho está sendo

conduzido para realizar estudos de varredura ampla do genoma, para permitir

identificar loci de susceptibilidade.

x

LISTA DE FIGURAS

LEGENDA PÁG

FIGURA 1. Resposta imune na gravidez, papel das células regulatórias e desenvolvimento de tolerância.(96) ...........................................................................

FIGURA 2. Risco de pré-eclâmpsia considerando a história familiar de hipertensão. ...............................................................................................................

FIGURA 3. A. Eletroforese em gel de agarose com coloração por brometo de etídio mostrando os genótipos representativos de indivíduos CT (heterozigoto), CC (homozigoto) e TT (homozigoto mutante). O produto amplificado por PCR foi digerido com a enzima de restrição NlaIII, originando um produto de 308 pares de bases. No caso da existência do sítio de restrição para NlaIII são gerados dois fragmentos, um de 122 e outro de 86 pb. B. Seqüência dos fragmentos amplificados confirmado o genótipo observado pelo digestão enzimática (RFLP)....................................................................................................................... 46

FIGURA 4. Concentração de sFLt (receptor solúvel de VEGF) no soro de pacientes com pré-eclâmpsia e controles. ................................................................ 49

FIGURA 5. Concentração de sFLt no soro de pacientes com pré-eclâmpsia e controles. São mostradas as medianas e o desvio padrão. Observa-se uma grande heterogeneidade nos níveis de sFLt, mas há diferença significativa entre casos e controles. ...................................................................................................... 51

11

34

xi

LISTA DE TABELAS

LEGENDA Pág

TABELA 1. Avaliação de variáveis contínuas entre casos com diagnóstico de pré-eclâmpsia e controles................................................................................................. 24

TABELA 2. Nível de escolaridade entre casos e controles........................................ 25

TABELA 3. Faixa de renda familiar da população avaliada........................................ 26

TABELA 4. História do pré-natal e hábitos de vida.................................................... 26

TABELA 5. Comparação de médias segundo o diagnóstico final e as variáveis

(ANOVA and Duncan tests)........................................................................................ 28

TABELA 6. História familiar de hipertensão arterial crônica, diabetes mellitus e

epilepsia....................................................................................................................... 29

TABELA 7. Avaliação da presença de história materna de hipertensão, pré-

eclâmpsia e eclâmpsia na população estudada......................................................... 35

TABELA 8. Avaliação da presença de história de irmãs com hipertensão, pré-

eclâmpsia e eclâmpsia na população estudada.......................................................... 36

TABELA 9. Avaliação da presença ou ausência concomitante ou não de doenças hipertensivas considerando o binômio mãe e irmã de uma gestante entre os casos e controles................................................................................................................... 38

TABELA 10. Avaliação de história materna de doença hipertensivas nos casos com pré-eclâmpsia leve comparando-os com os controles. Foram considerados casos aquelas mulheres que apresentaram pré-eclâmpsia leve, sendo excluídos da análise os casos de pré-eclâmpsia grave, Síndrome HELLP, eclâmpsia e eclâmpsia associada à Síndrome HELLP..................................................................................... 40

TABELA 11. Avaliação de história materna de doença hipertensivas nos casos com pré eclâmpsia grave, comparando-os com os controles. Foram considerados casos a presença de PE grave, eclâmpsia, Síndrome HELLP e Eclâmpsia associada à Síndrome HELLP, sendo excluídos os casos de pré-eclâmpsia leve..... 41

TABELA 12. Avaliação da presença de história de doença hipertensiva em irmãs de um caso de pré-eclâmpsia leve comparado com controles. Nesta avaliação foram excluídos os casos de pré-eclâmpsia grave, isto é, presença de iminência de eclâmpsia, eclâmpsia, síndrome HELLP, eclâmpsia associada à síndrome HELLP.........................................................................................................................

43

TABELA 13. Avaliação da presença de história de doença hipertensiva em irmãs de um caso de pré-eclâmpsia grave comparado com controles. Nesta avaliação

xii

foram excluídos os casos de pré-eclâmpsia leve........................................................ 44

TABELA 14. História de pré-eclâmpsia e eclâmpsia em sogras de um caso de pré-eclâmpsia versus os controles..................................................................................... 45

TABELA 15. Avaliação da freqüência alélica do polimorfismo VEGF 936C>T do VEGF considerando os casos de pré-eclâmpsia e controles...................................... 47

TABELA 16. Avaliação da freqüência genotípica do polimorfismo VEGF 936C>T do VEGF considerando os casos de pré-eclâmpsia e controles....................................... 47

TABELA 17. Avaliação dos níveis de VEGF livre segundo o grupo........................... 48

TABELA 18. Análise do VEGF considerando o IMC do indivíduo como fator de correção........................................................................................................................ 49

TABELA 19. Níveis séricos de sFlt1 em voluntárias com pré-eclâmpsia e controles, diferenças significativas são observadas no nível de sFlt1 entre os casos de pré-eclâmpsia e controles................................................................................................... 50

1

1. JUSTIFICATIVA

A pré-eclâmpsia é uma doença que se caracteriza por hipertensão e proteinúria

associada a outros sinais que são geralmente identificados após a 20a semana de

gestação.(1) Esta doença pode evoluir com complicações multissistêmicas graves, que

afetam tanto a saúde materna quanto a fetal.(2;3) A incidência da pré-eclâmpsia no

mundo varia de 3 a 8%, sendo maior em áreas sócio-economicamente mais

vulneráveis.(4) A pré-eclâmpsia e as demais doenças hipertensivas da gravidez são

freqüentes no Brasil, especialmente no Rio Grande do Norte, onde a magnitude deste

problema só agora está sendo melhor documentada. Estudo prospectivo conduzido em

comunidade de Natal,(5) mostrou que a incidência da pré-eclâmpsia era de 13.8% de

todas as gravidezes, confirmando que esta doença é um importante problema de saúde

pública local.

A pré-eclâmpsia apresenta uma maior incidência em primíparas, multíparas,

particularmente nos dois extremos da vida reprodutiva.(6-10) Outros fatores incluem a

hiperplacentação, que ocorre em gestação molar e gemelar. Fatores angiogênicos,

(7;11;12) como o fator de crescimento endotelial (do inglês vascular endothelial growth

factor, VEGF) e seu receptor foram descritos estarem associados a um risco maior de

desenvolver pré-eclâmpsia.(13) Mutação no gene de VEGF foi demonstrado que está

associado a pré-eclâmpsia em população coreana.(14)O VEGF também está

associado a outras doenças como tumores, doença neovascular intraocular, dentre

outras entidades nosológicas.

Associação com história familiar foi observado em diversos estudos, sendo a

pré-eclâmpsia mais freqüente em filhas de mulheres que tiveram pré-eclâmpsia (8;15)

2

e em gestações de parceiros nascidos de gestação com pré-eclâmpsia.(16) Parentes

em primeiro grau de mulheres com pré-eclâmpsia têm um risco aumentado de

desenvolver pré-eclâmpsia.(17;18) Estudo realizado no estado do Rio Grande do Norte,

pelo nosso grupo, também demonstrou que o risco de pré-eclâmpsia estava associado

à história de doença hipertensiva em familiares.(19) Estes achados dão suporte a

fatores familiares e genéticos envolvidos na pré-eclâmpsia. Neste sentido, nossa

hipótese é que há fatores genéticos determinantes na pré-eclâmpsia. Para testar esta

hipótese foi realizado um estudo do tipo caso controle, com objetivo de examinar o

risco familiar de ter pré-eclâmpsia e avaliar se polimorfismo no gene VEFG estava

associado a esta doença.

3

2. Objetivos

2.1. Objetivo Geral

Avaliar a existência de fatores de risco individuais e familiares associados à pré-

eclâmpsia e se polimorfismo no gene do fator de crescimento endotelial vascular

(vascular endothelial growth factor, VEGF) está associado à pré-eclâmpsia.

2.2. Objetivos Específicos

2.2.1. Determinar os fatores de riscos familiares associados à pré-eclâmpsia.

2.2.2. Avaliar se polimorfismo no gene do VEGF está associado à pré-eclâmpsia.

2.2.3. Determinar se os níveis de VEGF e seu receptor solúvel (sFlt1) estão associados

à pré-eclâmpsia e se poderiam ser marcadores de doença.

4

3. Revisão da Literatura

3.1. Aspectos gerais

A pré-eclâmpsia é uma síndrome multissistêmica, caracterizada por hipertensão

e proteinúria após a 20ª semana de gestação, em mulheres previamente

normotensas.(20) Foi indiretamente relatada por Hipócrates ao referir que sintomas

como sonolência e convulsão alteravam o prognóstico da gravidez.(21;22) O nome

eclâmpsia foi dado por Vararandaeus em 1619, baseando-se no grego “Eklampsis”, em

alusão aos súbitos escotomas referidos pelas pacientes.(23) Lever, em 1843, referiu a

proteinúria e a presença da hipertensão e edema, como parte do quadro clínico.(24)

A pré-eclâmpsia é diagnosticada quando a pressão sistólica é maior ou igual a

140 mmHg e a pressão diastólica igual ou superior a 90 mmHg, presente em duas ou

mais ocasiões, com pelo menos 4-6 horas de diferença entre as aferições e a presença

de proteinúria,(25) estas características diferencia a pré-eclâmpsia de outros distúrbios

hipertensivos da gravidez. A pré-eclâmpsia pode estar associada à diminuição do

volume plasmático, geralmente, com diminuição de 30-40% do volume observado para

uma gestação normal; diminuição do fluxo sanguíneo renal. Níveis elevados de ácido

úrico podem estar envolvidos com o processo inflamatório e ativação de citocinas.(26-

28) O ácido úrico aumentado pode ativar uma cascata de reações, incluindo o

inflamassoma,(29;30) influenciando assim o quadro clínico observado na pré-

eclâmpsia.(31-33)

5

3.2. Epidemiologia

A incidência da pré-eclâmpsia em países ocidentais ocorre em torno de 2 a 7%

de todas as gestações.(34) Porém, em países africanos e latino-americanos, a

incidência desta doença é aparentemente maior, apesar de não existirem estudos bem

sistematizados.(35) As complicações graves da pré-eclâmpsia são freqüentes em

países com nível de pobreza elevado, estando associado a elevada mortalidade

materna, como também perinatal.(36;37) No Brasil, os distúrbios hipertensivos da

gravidez, juntamente com a hemorragia e a infecção, são as maiores causas de morbi-

mortalidade materna.(38) A pré-eclâmpsia é a principal causa de morte materna nas

regiões norte e nordeste do Brasil (www.datasus.gov.br), sendo também causa

relevante de morte perinatal, de nascimentos prematuros e de restrição de crescimento

intra-uterino.(39)

Complicações da pré-eclâmpsia incluem a Síndrome HELLP (acrônimo do

inglês, Hemolysis, Elevated liver enzymes and Low platelets) e a eclâmpsia. A

incidência de Síndrome HELLP é de 6% das gestações que evoluem com pré-

eclâmpsia, enquanto a incidência de eclâmpsia é de 3,1%.(40) Recentemente, nós

demonstramos, que a incidência de pré-eclâmpsia é de 13,8% em um bairro de

Natal.(5) De cada três casos de morbidade obstétrica grave, um está relacionado à pré-

eclâmpsia.(41) A morbidade e mortalidade decorrentes da pré-eclâmpsia têm sido

reduzidas nos casos de tratamento específico, seguido de intervenção precoce.(42)

Apesar da ampliação do atendimento pré-natal no Brasil (www.saude.gov.br), isto não

tem sido suficiente para reduzir as complicações da pré-eclâmpsia. Há necessidade de

diagnóstico precoce, tratamento da hipertensão. Outras intervenções, como uso de

6

suplementação de cálcio e outros minerais, além de anti-agregante plaquetário e

orientações dietéticas específicas para controle de peso nas diversas fases da

gestação poderiam ser benéficas.(43-45)

3.3. Etiologia

A etiologia da pré-eclâmpsia ainda não é definida, apesar de lhe serem descritos

diversos fatores associados, como nuliparidade, história familiar de pré-eclâmpsia ou

eclâmpsia, aumento da massa trofoblástica, gestação múltipla, idade maior que 40

anos e obesidade.(46-49) Algumas condições crônicas maternas como diabetes,

hipertensão crônica, doenças renais e doenças autoimunes podem influenciar o

desenvolvimento da pré-eclâmpsia.(50-52)

O vasoespasmo está envolvido na gênese da pré-eclâmpsia, levando a

constrição vascular e aumento da resistência ao fluxo sanguíneo, e desenvolvimento

da hipertensão arterial.(53;54) As alterações vasculares, juntamente com hipóxia local

dos tecidos circundantes, podem provocar hemorragia, necrose, e outros distúrbios. A

invasão trofoblástica superficial resulta em fraca remodelação das artérias espiraladas

uterinas, com maior risco de hipóxia placentária. Em virtude da isquemia, ocorre

estresse oxidativo e a doença vascular, além de uma resposta inflamatória, com

ativação da resposta imune e liberação de citocinas inflamatórias e vasoativas.(55) A

interação entre fatores imunes pleiotrópicos, resultantes da ação das citocinas, que

apresentam também ações diretas na parede dos vasos ou no endotélio, fortalecem a

hipótese de uma desregulação da resposta imune induzida pela gravidez.(56-58)

O peso inicial elevado e o ganho de peso acima do esperado durante a gravidez

foram demonstrados estarem associados à pré-eclâmpsia.(59;60) Estudo prospectivo

7

realizado nos Estados Unidos, com uma população de origem latina, mostrou um risco

aumentado de desenvolver pré-eclâmpsia em mulheres com índice de massa corpórea

(IMC) superior a 29.(61) Obesidade é atualmente um problema importante de saúde

pública no Brasil, com aumento crescente de indivíduos jovens com síndrome

metabólica e resistência à insulina.(62;63)

3.4. Fisiopatologia da pré-eclâmpsia, síndrome HELLP e eclâmpsia

3.4.1. Pré-eclâmpsia

A pré-eclâmpsia é uma enfermidade multissistêmica exclusiva da gestação

humana.(1;64) Defeito precoce na remodelação dos vasos placentáros, secundários à

invasão trofoblástica; polimorfismo genético; trombofilia; intolerância imune; ativação

das células endoteliais e exacerbação do processo inflamatório sistêmico, são fatores

associados.(65) Parece que a disfunção trofoblástica e da célula endotelial são

fundamentais para se desenvolver a pré-eclâmpsia grave.(66;67) A busca de

biomarcadores tem sido realizada com objetivo de possibilitar intervenção precoce. O

fator tirosina quinase-1 fms-like solúvel (SFL-t 1) foi demonstrado estar aumentado nos

casos de pré-eclâmpsia,(68;69), além de diminuição do fator de crescimento

placentário.(70) Estas alterações parecem preceder o diagnóstico da pré-eclâmpsia em

cinco semanas, sendo estes sugeridos como marcadores potenciais da pré-eclâmpsia.

8

3.4.2. Síndrome HELLP

A síndrome HELLP representa uma forma de pré-eclâmpsia grave. Todavia,

15% a 20% das pacientes não têm antecedente de hipertensão ou proteinúria. Alguns

pesquisadores consideram a síndrome HELLP uma entidade nosológica distinta da pré-

eclâmpsia.(71;72) Em torno de 6% dos casos de pré-eclâmpsia desenvolvem Síndrome

HELLP. A proteína CD-95, que é proteína indutora de apoptose e que provoca lesão

hepática (73;74) parece estar alterada na síndrome HELLP. A ativação plaquetária

danifica o endotélio e reduz a produção de prostaciclina, importante vasodilatador,

alterando assim a proporção da prostaciclina/tromboxana A2.(75;76).

Pacientes com síndrome HELLP apresentam lesão microangiopática,(77) como

também esteatose hepática aguda. Esta última parece ser influenciada por mediadores

da resposta imune como TNFα.(78) Com a progressão da doença, há elevação na

pressão intra-hepática e surgimento de hematoma, geralmente, subcapsular, que

podem exceder a capacidade de distensão da cápsula de Glisson, acarretando ruptura

hepática. Dor no hipocôndrio direito foi um dos principais sintomas relatados por

gestantes que evoluíram com síndrome HELLP e ruptura hepática em Natal, no

entanto, devido à pronta intervenção, a mortalidade foi menor nesta série de casos, do

que aquela relatada para outras localidades.(79;80)

Disfunções renais são freqüentemente observadas em pacientes com síndrome

HELLP. Há presença de microangiopatia trombótica secundária e endoteliose.(81) A

endoteliose acarreta a proteinúria e disfunção renal. A disfunção endotelial assume o

papel central na patogênese da lesão renal da pré-eclâmpsia, com a produção de

mediadores vasoativos, que levam a vasoconstricção e desequilíbrio na angiogênese.

9

Conforme mencionado anteriormente, a tirosinoquinase 1 fms-similar solúvel, SFL-t 1,

fator endógeno antiangiogênico, que é potente antagonista do VEGF, encontra-se

elevado na pré-eclâmpsia. VEGF, além do papel importante na angiogênese, é um

fator na manutenção do equilíbrio da célula endotelial, incluindo a formação das

fenestrações.(14;82-84)

3.4.3. Eclâmpsia

A eclâmpsia é a fase convulsiva da pré-eclampsia e, geralmente, é precedida de

manifestações do sistema nervoso central, incluindo cefaléia, distúrbios visuais do tipo

escotomas, visão turva e, raramente, amaurose.(64) Existem controvérsias em relação

à patogênese da eclâmpsia. A coagulopatia e o depósito de fibrina, além da própria

encefalopatia hipertensiva parecem ser fatores determinantes da eclâmpsia. No

entanto, há casos que apresentam convulsões, mesmo com níveis de hipertensão leve

ou moderada. Estudos ultrassonográficos, com Doppler, sugerem que o vasoespasmo

cerebral pode ocorrer mesmo quando a vasoconstricção periférica é menos

evidente.(85-87)

Alguns estudos com tomografia computadorizada e ressonância magnética com

pacientes com eclâmpsia têm revelado anormalidade, em seus achados, assim como

alterações transitórias, algumas reversíveis.(88;89) As tomografias revelam lesões

compatíveis com edema cerebral e hemorragia, e áreas hipodensas e

hemorrágicas.(90) Hemorragia e edema também são observados em ressonâncias

magnéticas, sendo as mudanças nos hemisférios posteriores ou nas regiões

vasculares, induzidas pelo vaso-espasmo.(91;92) A predominância de lesões

posteriores pode explicar a alta freqüência de distúrbios visuais.(64)

10

Eclâmpsia é ainda a principal causa de mortalidade em vários países de poder

econômico baixo. Estudo na Nigéria mostrou que 42% das mortes maternas

registradas num período de 5 anos estavam ligadas a eclâmpsia.(93) A introdução do

sulfato de magnésio reduziu o número de casos de eclâmpsia.(94), sendo observada

uma redução de 40% para 9% dos casos de convulsão. A profilaxia com o sulfato de

magnésio reduziu de 2.8% para 0.9% o risco de convulsão em mulheres com pré-

eclâmpsia grave.(95)

3.5. Resposta imune na pré-eclâmpsia

Modificações na resposta imune materna ocorre durante o processo da gravidez,

sendo esta modulado para prevenir uma rejeição e permitir a invasão

trofoblástica.(96;97) No início da gestação é observada uma resposta imune do tipo

Th2, mas progressivamente vai sendo desenvolvida uma resposta do tipo Th1. O

balanço entre os dois braços da resposta resulta na regulação adequada da resposta

imune e a correta implantação. Alterações em células regulatórias estão envolvidas no

desequilíbrio entre os dois braços da resposta imune, conforme mostrado na figura

1.(98;99) Os achados que citocinas do tipo Th1 como fator de necrose tumoral-α (TNF-

α), interferon-γ (INF-γ) e interleucina 2 (IL-2) induzem apoptose trofoblástica,(100) e

que citocinas do tipo Th2 como IL-4 e IL10, estimulam a diferenciação e proliferação

trofoblástica, reforçam a hipótese de um papel determinante da resposta imune na pré-

eclâmpsia. Presença de polimorfismos funcionais pode ter como conseqüência

aumento, como no caso de TNFα e INFγ ou diminuição, como no caso do antígeno

leucocitário humano (HLA-G). Este último pode levar à alteração na apresentação de

antígenos, resultando em disruptura da resposta imune.(101)

11

Figura 1. Resposta imune na gravidez, papel das células regulatórias e

desenvolvimento de tolerância.(96)

Supressão

forte

Supressão

fraca

Tolerância

Gravidez Normal

Resposta imune

Infertilidade/abortamento/Pré-eclâmpsia

12

3.6. Fatores Genéticos

Diversos estudos apontam para um provável fator genético envolvido nas

doenças hipertensivas da gravidez.(102-104) Sutherland e cols. (1981) mostraram que

a incidência de pré-eclâmpsia grave era maior nas mães (14%) que nas sogras (4%)

das gestantes com pré-eclâmpsia. (105) Arngrímsson e cols. (1990) estudaram 94

famílias irlandesas sem miscigenação e encontraram que 23% de casos de pré-

eclâmpsia em filhas de mulheres que tiveram esta enfermidade e 10% de casos entre

suas sobrinhas.(106;107)

Outros estudos sugerem também o envolvimento de fatores fetais, devido a

genes paternos.(108;109) Freqüência aumentada de pré-eclâmpsia é associada com

gestação gemelar, reforçando a hipótese de dose extra de carga genética fetal,

principalmente nas gestações gemelares homozigóticas.(110-112) Lie e cols. (1998)

em estudos populacionais demonstraram que tanto a mãe como o feto contribuem para

o risco de pré-eclâmpsia.(113) Genes mitocondriais transmitidos pela mãe não

parecem contribuir para o risco de pré-eclâmpsia.(114)

A existência de agregação familiar de pré-eclâmpsia em diversos grupos

populacionais dão suporte à hipótese de risco genético para desenvolver pré-

eclâmpsia.(115;116) Conforme é conhecido, a agregação familiar de uma doença pode

ser devida à causas múltiplas, que podem ser consequentes a um fator ambiental ou a

algum fator familiar herdável.(117;118) Há vários estudos na literatura, principalmente

oriundos da Austrália,(12;119) Holanda, Noruega (120) e Islândia (121), entre outros,

que buscam a identificação dos genes envolvidos na pré-eclâmpsia. Estes estudos

foram facilitados pela revisão de registros disponíveis com informações sobre várias

13

gerações, os quais permitiram a identificação das famílias com maior risco de doença.

Chesley e colaboradores realizaram estudos mais detalhados em irmãs nascidas antes

de 1952 e em mulheres que tiveram eclâmpsia entre 1931 e 1951, revelando uma

maior influência genética materna do que paterna.(122;123) O risco relativo de uma

mulher ter pré-eclâmpsia, cuja irmã tivera a doença, era de 2,2.(113;124) Infelizmente

na maioria dos países, assim como o Brasil, a documentação dos casos tendem a ser

pobres, dificultando avaliar o padrão de doença, como pré-eclâmpsia.

Conforme mencionado, a presença de agregação familiar na pré-eclâmpsia

fortalece a hipótese de genes envolvidos nesta doença.(115) Estudos iniciais na

década de 90 não confirmaram associação entre alelos de antígeno de leucócitos

humanos (HLA) com pré eclâmpsia.(125;126) No entanto, variabilidade em HLA e pré-

eclâmpsia tem sido observada.(127-129) Avanços nas técnicas moleculares têm

permitido a realização de estudos de varredura completa do genoma (Genome wide

scan, gws). Estes estudos permitem avaliar de forma global o genoma humano, com

identificação de genes poderiam não ser selecionados pela estratégia de genes

candidatos.(130;131) Harrison e cols (1997) identificaram no braço longo do

cromossomo 4 uma região candidata para um locus de susceptibilidade à Pré-

eclâmpsia/Eclampsia (PE/E).(132) Análises de marcadores na região circunvizinha

D4S450 e D4S610, realizada pelo número de pedigree afetados, também fortaleceu a

possibilidade de um lócus de susceptibilidade à pré-eclâmpsia nesta região.

Arngrímsson e cols. (1997) detectaram um possível locus de susceptibilidade à

PE/E na região do cromossomo 7q36, o qual codifica os genes da enzima óxido nítrico

sintetase (eNOS) endotelial.(133) Em 1999, Guo e cols realizaram estudos de ligação

14

usando marcadores para o cromossomo 7. Estes autores concluíram que há um locus

de susceptibilidade para PE/E na região 7q36.(134) Arngrímsson e cols. (1999)

também identificaram um locus de susceptibilidade à PE/E no cromossomo 2p13. Por

outro lado, Fitzpatrick e cols. (2000) chegaram a propor que o cromossomo 2 poderia

ser designado de “PREG1” (pré-eclampsia, eclampsia gene 1).(121)

Outros estudos avaliaram polimorfismos e mutações em genes maternos. O

aumento do nível plasmático de TNF-α e de seus receptores foi observado em

pacientes com pré-eclâmpsia e outras doenças inflamatórias.(78;135) O TNF-α

promove a liberação de tromboxano e causa lesão endotelial através da indução de

estresse oxidativo.(136) O gene do TNF-α está localizado na região 6p21.1-21.3, no

complexo maior de histocompatibilidade III (MHC III). O polimorfismo de um único

nucleotídeo (SNP – single nucleotide polymorphism) na posição -308 (G>A) na região

promotora resulta em dois alelos (TNF1 e TNF2), sendo o alelo TNF2 (-308A)

associado a níveis séricos aumentados de TNF-α e maior risco de desenvolvimento de

diabetes do tipo 2, doença coronariana, dislipidemia e malária cerebral.(137-139) No

entanto, resultados inconsistentes foram vistos associados a TNF-α na pré-

eclâmpsia.(140)

O gene do TNF-α está próximo e ligado ao gene da linfotoxina-α (LTA). (141) A

LTA possui um papel importante na resposta pró-inflamatória local e polimorfismos em

seu gene têm sido associados com doenças coronarianas. O polimorfismo -308 G>A

no gene do TNF-α em combinação com o -238G>A do TNF-α e dois polimorfismos no

gene da LTA (LTA-Ncol e LTA-AspHI) formam cinco haplótipos (TNF-C, -E, -H, -I, -P).

Em um estudo com 150 famílias na Holanda, foi encontrado um aumento de risco

15

significante para o desenvolvimento da pré-eclâmpsia ou síndrome HELLP entre casos

com o haplótipo TNF-I.(142-144)

A interleucina 1β (IL-1β) é uma citocina produzida por macrófagos, monócitos e

células endoteliais e inicia a cascata pró-inflamatória com produção de TNF-α, INF-γ,

IL-2 e IL-12. A atividade da IL-1β é regulada por um inibidor competitivo, o receptor

antagonista de IL-1 (IL-1RA). Polimorfismos no IL-1RA foram associados com

abortamentos espontâneos recorrentes e prematuridade.(145;146) Os genes que

codificam a IL-1β e IL-1RA estão localizados no cromossomo 2q12-q14, e

polimorfismos em ambos os genes alteraram a expressão dessas proteínas. Hefler et al

investigaram a associação de polimorfismos no gene da IL-1β e no gene do IL-1RA,

sendo. encontrado associação com a gravidade da doença.(147-149)

O HLA-G é uma molécula de HLA não-clássica da classe Ib que é

predominantemente expressa na interface materno-fetal, e possui um importante papel

durante a implantação embrionária e tolerância materna ao feto. O RNAm do HLA-G foi

detectado em muitos tecidos diferentes, no entanto, a expressão dessa proteína está

limitada à células específicas, como trofoblastos, monócitos, linfócitos e células

tímicas.(129;150)

Conforme já indicado, os fatores angiogênicos, como o VEGF, são

determinantes em vários processos proliferativos, incluindo o desenovolvimento

placentário. O VEGF é um regulador chave na angiogênese, associado a tumores,

doença neovascular intraocular dentre outras entidades nosológicas. O gene do VEGF

localiza-se no cromossomo 6, região p21.3, sendo composto por 8 exons e 7 introns. A

proteína difere nas suas propriedades de sinalização. Existem receptores de VEGF não

16

sinalizadores que modulam os sinalizadores VEGF e RTKS.(151) Numa gravidez

normal o VEGF, angiopoetinas participam do processo formação das artéria espirais.

Já na pré-eclâmpsia as artérias espirais são deficientes resultando em isquemia. As

placentas de pacientes com pré-eclâmpsia apresentam níveis elevados de SFlt1, Flt1,

o ligante de VEGF e seu homólogo Tigf.(68;152;153)

A existência de alta incidência de pré-eclâmpsia em população do Rio Grande

do Norte levaram a realização deste estudo que busca examinar fatores de risco

familiar associado a pré-eclâmpsia, além de examinar se o VEGF é um marcador de

doença.

17

4. Métodos

4.1. Local de Estudo e População estudada

O estudo foi realizado na cidade de Natal, Rio Grande do Norte, na Maternidade

Escola Januário Cicco, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, no período de

2004-2008. As participantes do estudo eram provenientes em sua maioria da cidade de

Natal ou arredores. No entanto, como a Maternidade Escola é referência no Estado do

Rio Grande do Norte para gravidez de alto risco, as mulheres oriundas de outras

localidades além de Natal foram também incluídas. Esta população tem uma renda

familiar entre 1-3 salários mínimos, sendo a maioria atendida pelo Sistema Único de

Saúde. Foi utilizado um questionário para coleta dos dados (Anexo 1), que incluiu a

história pregressa individual e familiar de doenças. Os dados clínicos e laboratoriais da

gestação atual foram coletados do prontuário.

4.2. Desenho do estudo

Foi realizado um estudo do tipo caso-controle, sendo arrolados casos de

gestantes hipertensas, incluindo pré-eclâmpsia leve e grave, Síndrome HELLP e

eclâmpsia (n=506) internadas na Enfermaria de Alto Risco e controles (n=345), que

eram gestantes evoluindo com níveis pressóricos normais. A tabela 1 apresenta todo

grupo estudado. Os controles não tinham história atual ou pregressa de doença

hipertensiva, tendo sido internadas devido apresentarem desproporção cefalo-pélvica

ou por residirem nas proximidades do hospital, tendo sido encaminhadas para

resolução do parto. Foi considerada a história familiar e individual como ferramentas

para examinar se havia risco familiar de doença hipertensiva ou de outras doenças,

como Diabetes Mellitus e epilepsia. Estas últimas doenças podem compartilhar fatores

18

genéticos comuns, uma vez que a pré-eclâmpsia pode ser influenciada por história de

distúrbios hipertensivos e por distúrbios metabólicos.(154;155)

4.3. Definição das doenças hipertensivas da gravidez e critérios de inclusão

Neste estudo foi considerado a pré-eclâmpsia, sendo esta caracterizada por

hipertensão e proteinúria depois da 20a semana de gestação em mulheres previamente

normotensas e sem proteinúria, conforme consenso americano.(64) Hipertensão foi

definida como pressão sistólica ≥140 mmHg ou diastólica ≥90 mmHg em duas ou mais

ocasiões com pelo menos 4-6 horas de diferença entre as aferições e proteinúria (≥0,3

g de proteína em uma amostra de urina de 24 horas ou duas coletas randômicas com

4-6 horas de diferença) (64). Pré-eclâmpsia leve foi definida quando os níveis da PA

sistólica eram ≥140 mmHg e PA diastólica entre 90-100 mmHg, enquanto a Pré-

eclâmpsia grave foi considerada quando os níveis da PA sistólica ≥140 mmHg e a

diastólica ≥ 110 mmHg. Eclâmpsia foi definida pelo desenvolvimento de convulsões

tônico-clônicas com hipertensão depois de 20 semanas de gestação.(64) Síndrome

HELLP foi definida por anemia hemolítica, função hepática alterada com LDH maior

que 600U/l, bilirrubina total maior que 1,2 mg/dl, AST e ALT maiores que 70 U/dl e

trombocitopenia <100.000/µl. (156)

4.4. Critérios de exclusão

Pacientes com doenças mentais ou físicas severas que, na opinião dos

pesquisadores, pudessem influir em qualquer aspecto do estudo foram excluídas. Para

a análise de fator de risco familiar foram excluídas mulheres com história de

hipertensão anterior e diabetes.

19

4.5. Exames laboratoriais clínicos

Os exames laboratoriais foram realizados no Laboratório do Complexo

Hospitalar da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Os exames incluíram

hemograma, haptoglobina, desidrogenase láctica, bilirrubina total e frações, aspartato

aminotransferase, alanina aminotransferase, -glutamil transferase, fosfatase alcalina,

contagem de plaquetas, tempo de tromboplastina parcial ativado, tempo de

protrombina, ácido úrico, creatinina, uréia, glicose e sumário de urina.

4.6. Extração de DNA

A extração de DNA foi realizada segundo a técnica descrita por Grimberg e

colaboradores.(157) Cerca de 8 ml de sangue periférico foram colhidos em tubo

contendo anticoagulante (EDTA) e transferidos para um tubo de 50 ml, contendo 35 ml

de solução de lise de hemácias (NH4Cl 1,3mM e NH4CO3 88,5mM) mantidos a 4ºC, por

30-60 minutos. Em seguida, foi centrifugado a 3000xg, 4º C, por 15 minutos. O

sobrenadante foi desprezado e a camada leucocitária, presente no precipitado, foi

ressuspenso em 5 ml de tampão de lise de células brancas (TRIS 0,2M, SDS 1%,

EDTA 10mM, pH 8,5). Após a lise dos leucócitos, foram adicionados 2,5 ml de acetato

de amônio 5M e feita a centrifugação a 3000xg, à temperatura ambiente, por 15

minutos. O sobrenadante foi transferido para um tubo estéril de 15 ml, no qual foram

adicionados 5 ml de álcool isopropílico, para precipitar o DNA. O DNA foi transferido

para tubos de microcentrífuga e lavado com etanol 70% e secado à temperatura

ambiente. O DNA foi solubilizado em 500 µL de água e quantificado por

espectrofotometria a 260 nm. O DNA estoque foi diluído a 20 ng/µl (concentração de

uso para realização de PCR) e armazenado a -20º C (157).

20

4.7. Análise de polimorfismo 936C>T no gene do VEGF

A genotipagem foi realizada conforme protocolo descrito por Shim e

colaboradores em estudo realizado na Coréia.(158) Em resumo, a amplificação do

fragmento contendo o polimorfismo VEGF 936C>T foi feita por PCR, utilizando os

primers 5´-AAGGAAGAGGAGACTCTGCGCAGAGC-3´ (forward) e 5´-

TAAATGTATGTATGTGGGTGGGTGTGTCTACAGG-3´ (reverse). Os produtos de PCR

foram digeridos com a enzima NlaIII (New England Biolabs, EUA), que reconhece o

sítio de restrição 5´-CATG-3´. Na presença do alelo T a enzima cliva o produto de PCR

em dois fragmentos menores de 122 e 86pb.

4.8. Seqüenciamento de DNA

Os fragmentos de DNA amplificados por PCR foram purificados por eluição

diretamente do gel de agarose (MinElute Gel Extraction, Qiagen) e os genótipos foram

confirmados por seqüenciamento. A reação de seqüenciamento foi realizada utilizando

5,0 µL de produto de PCR purificado, 1,0 µL de Big Dye® Terminator kit, 2,6 µL de

primer (100ng/ µL) e 1,75 µL Big Dye sequencing buffer (Applied Biosystems). A

ciclagem utilizada foi: 96ºC por 1 min e 30 ciclos de 96ºC por 10 s, 50ºC por 5 s, e 60ºC

por 2 min. As amostras foram submetidas à eletroforese capilar no ABI prism 3100

Avant Genetic Analizer (Applied Biosystems). Os dados do seqüenciamento foram

analisados através do programa ChromasPro 1.42. As seqüências foram submetidas a

um banco de genes (BLAST) para análise comparativa de seqüências do Genebank e

no CLUSTALW.

21

4.9. Determinação dos níveis séricos de VEGF e SFL-t 1

As concentrações de SFL-t 1e VEGF no soro materno foram determinadas em

duplicata pela técnica de imunoensaio enzimático tipo sanduíche (Human sVEGF

R1/Flt-1 Quantikine ELISA Kit e Human VEGF Quantikine ELISA Kit (R&D Systems,

Inc. 614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN, EUA).

4.10. Considerações Éticas

O protocolo de pesquisa foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP-UFRN 88/02) e

Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP 5059), Anexos 2 e 3. O termo de

consentimento livre e esclarecido (TCLE) aprovado é mostrado no apêndice 3.

4.11. Análises estatísticas

Foi utilizado o Statistica Package software (STATISTICA 6.1 Copyright StatSoft

1984-2003, Tulsa, OK, USA) para as análises estatísticas. Os dados coletados foram

inicialmente armazenados em Excel e exportados para o software Statistica. A

comparação de médias das variáveis contínuas entre grupo e controles foi realizada

pelo teste t-Student, com variâncias separadas, por haver diferença significativa entre

as variâncias dos grupos, exceto número de pessoas dependente da renda familiar.

Para esta última variável, foi considerada a renda total da família e dividida pelo

número de pessoas que eram dependentes. As variáveis consideradas incluíram peso

no início da gravidez, idade, índice de massa corpórea, dias internamento hospitalar,

número de gestações, entre outros. A comparação de médias das variáveis contínuas

entre os grupos representativos do espectro das doenças hipertensivas da gravidez

22

(pré-eclâmpsia leve, grave, Síndrome HELLP e eclâmpsia) foi realizado usando os

testes ANOVA e Duncan.

Foi utilizado um modelo logístico para analisar o efeito de variáveis contínuas

sobre respostas dicotômicas, estimando a “ODDS-RATIO”, sendo considerado como

fator de risco. Os testes qui-quadrado de Pearson e máxima verossimilhança foram

empregados para estimar a associação entre as variáveis categorizadas. Para dados

que apresentaram uma distribuição não paramétrica foi utilizado o teste de Mann-

Whitney. Calcularam-se intervalos de confiança em 95% na estimação de alguns

parâmetros, acrescidos da média, desvio padrão (DP), erro-padrão (EP) e dos valores

máximo e mínimo. A função discriminante foi utilizada para verificação estatística

multivariada das diferenças entre os grupos de pacientes. O resultado dos níveis de

SFL-t 1 e VEGF entre os grupos caso e controle, foi analisando utilizando o teste de

Mann-Whitney U. Os resultados foram considerados significativos, quando o valor de p

foi menor que 0.05 (p<0,05).

23

5. Resultados

5.1. Características da população estudada

A existência de fatores de risco e presença de agregação familiar de doença

hipertensiva em mulheres com pré-eclâmpsia grave, foi demonstrada

anteriormente.(159) Neste presente estudo foram avaliados os fatores de riscos

familiares e individuais associados à pré-eclâmpsia, sendo considerados os quadros de

pré-eclâmpsia leve e grave, e suas complicações (eclâmpsia e Síndrome HELLP). A

Tabela 1 mostra os casos avaliados.

A idade média dos controles foi de 24,7 anos (DP ± 6,44), enquanto os casos

tinham idade de 25,7 anos (DP ± 7 ,6), p=0,02. Os casos que evoluíram com eclâmpsia

apresentavam idade menor do que os controles e as outras afecções, tendo estas

últimas mulheres uma idade média de 20,4 anos (DP ± 5,98), p<0,05. Como esperado,

a idade gestacional foi menor nos casos do que nos controles (p<0,001), devido à

indicação de interrupção da gravidez. O índice de massa corpórea (IMC) era mais

elevado em mulheres com pré-eclâmpsia 26,1 versus 23,9 nos controles (p=0,0005).

24

Tabela 1. Avaliação de variáveis contínuas entre casos com diagnóstico de pré-eclâmpsia e controles

Variável

caso Controle t var.

separada

df p

n Média Desvio

Padrão

n Média Desvio

Padrão.

2-sided

Idade (anos) 506 25,7 7,6 345 24,7 6,4 2,26 807,5 0,0241

Peso (kg) 346 63,6 15,4 91 58,4 10,9 3,67 193,3 0,0003

Índice de Massa Corpórea (IMC) 262 26,1 5,9 75 23,9 4,2 3,53 166,3 0,0005

No. pessoas dependentes da

Renda (*) 182 3,8 2,7 56 4,3 2,3 -1,25 236 0,2115

No. de dias de internamento 457 6,3 4,9 59 2,6 0,9 13,84 474,4 0,0000

Nº de gestações 520 2,3 2,2 359 2,3 1,8 0,43 850,6 0,6668

Nº de partos 513 1,1 2,0 345 1,0 1,6 0,27 833,8 0,7869

Idade Gestacional (semanas) 449 35,6 4,4 322 38,2 3,7 -8,67 748,6 0,0000

(*) Teste t com variância comum

25

Não foi observada diferença com relação à renda ou o nível de

escolaridade entre os dois grupos (Tabelas 2 e 3). A maioria das voluntárias,

tanto nos casos quanto nos controles, apresentavam nível de escolaridade

primária. No entanto, chama a atenção que 48,4% dos casos e 55,3% dos

controles apresentam renda familiar abaixo de 1 salário mínimo. Não houve

diferença com relação à realização do pré-natal (p=0,3636), ou ingesta de álcool

ou fumo, mostrando homegeneidade com relação a estes fatores que, de forma

indireta, poderiam influenciar o desenvolvimento de pré-eclâmpsia (Tabela 4).

Estes dados foram coletados diretamente da paciente.

Tabela 2. Nível de escolaridade entre casos e controles

Grupo Escolaridade

Não

alfabetizada

1º Grau

completo

2º Grau 3º Grau Total

n % n % n % n % n %

Caso 3 0,8 163 45,8 175 48,3 18 5,1 356 78,9

Controle 3 3,2 45 47,4 43 45,3 4 4,2 95 21,1

Total 6 1,3 208 46,1 215 47,7 22 4,9 451 100

Pearson qui-quadrado, 3.318426, df=3, p=0.34509, ML qui-quadrado, 2,749661, GL=3, p=0.43186

26

Tabela 3. Faixa de renda familiar entre casos e controles

Variáveis Renda familiar (número de salário mínimo)

< 1 SM 1-3 SM 3-6 SM 6-9 SM Total

n % n % N % n % n %

Caso 162 48,4 139 41,5 32 9,6 2 0,6 335 79,8

Controle 47 55,3 30 35,3 6 7,1 2 2,4 85 20,3

Total 209 47,8 169 40,3 38 9,1 4 0,7 420 100,0

Pearson qui-quadrado, 6.028529, GL=3, p=0.19704, ML qui-quadrado, 5.277566, GL=3, p=0.425999. O salári mínimo na época do estudo era equivalente a R$ 340,00.

Tabela 4. História do pré-natal e hábitos de vida

Variável Caso

Controle

P-valor

ML-qui-quadrado

N (%) N (%)

Pré-natal

Não 23 3,7 18 4,9

sim 602 96,3 351 95,1 P=0,36367

Total 625 100 369 100

Fumo

Não 438 93,8 87 89,7

sim 29 6,2 10 10,3 P=0,05758

Total 467 100 294 100

Álcool

Não 280 94,9 307 96,4

sim 15 5,1 7 3,6 P=0,0568

Total 295 100 314 100

27

O grupo caso foi subdividido em pré-eclâmpsia leve, pré-eclâmpsia grave

e síndrome HELLP, conforme os critérios definidos em métodos. Estes grupos

eram homogêneos em relação ao número de gestações (p=0,9434), paridade

(p=0,8584), número de filhos vivos (p=0,8829), (Tabela 5). O número de

gestações foi de 2,3 (±2,1) para os casos e 2,3 (±1,8) para os controles. O grupo

de mulheres com pré-eclâmpsia tinha idade média de 26,0 anos (±7,41),

enquanto o grupo controle tinha 24.6 anos (±6,4), p=0,0036. O peso inicial das

gestantes foi de 63,6 kg (±15,2) e 59,9 kg (±11,0), respectivamente, nos grupos

casos e controles, p=0,0191..

28

Tabela 5. Comparação de médias segundo o diagnóstico final e as variáveis (ANOVA and Duncan tests)

Variável

Grupo

Média ± Desvio padrão (n) p-valor

Controle PE leve PE grave HELLP

Nº de gestações 2,3 ± 1,8 (359) 2,2 ± 2,4 (145) 2,2 ± 1,9 (218) 2,3 ± 1,6 (113) 0,9434

Nº de partos 1,0 ± 1,6 (345) 1 ± 2,3 (142) 0,9 ± 1,6 (217) 1,0 ± 1,5 (111) 0,8584

Idade gestacional 38,2 ± 3,7 (322) 36,6 ± 4,2 (128) 36,1 ± 4,2 (182) 34,1 ± 4,3 (101) 0,0001(1)

idade 24,7 ± 6,4 (345) 25,2 ± 7,4 (144) 24,5 ± 7,6 (215) 26,9 ± 6,6 (105) 0,0179(2)

Peso 58,4 ± 10,9 (91) 63,1 ± 15,5 (131) 63,2 ± 14,2 (155) 58,3 ± 12,8 (34) 0,0191(3)

Índice massa corpórea 23,8 ± 4,2 (75) 25,5 ± 5,2 (107) 25,9 ± 5,9 (113) 24,2 ± 5,6 (20) 0,0523

(1) Pelo Duncan test, o controle tem média superior a todos, PE leve e grave não diferem, mas são superiores a HELLP. (2) Pelo Duncan test, o grupo HELLP tem idade superior aos demais. (3) Pelo Duncan test, o grupo controle é menor que os grupos PE leve e grave.

29

5.2. Avaliação de fatores de riscos associados a história familiar de doenças

As informações referentes à história de doença da família foi obtida

diretamente das gestantes ou de parentes. Foram investigadas a existência de

hipertensão, diabetes, pré-eclâmpsia, eclâmpsia, epilepsia. Mulheres com pré-

eclâmpsia apresentavam mais freqüentemente história familiar de hipertensão

arterial sistêmica (p<0.001), diabetes mellitus (p<0.001) e epilepsia (<0.0107) do que

os controles, Tabela 6. Foi investigado também história de doença autoimune como

lúpus eritematoso, mas os números eram pequenos para realizar análise

consistente.

Tabela 6. História familiar de hipertensão arterial crônica, diabetes mellitus e

epilepsia

Hipertensão

População Não Sim Total p-valor

n (%) n (%) n (%)

caso 118 23.8 377 76.2 495 58.2

p<0,001 controle 161 45.4 194 54.6 355 41.8

Total 279 32.8 571 67.2 850 100.0

Diabetes

caso 241 49,8 243 50,2 484 57,9

P=0,0001 controle 222 63,3 129 36,8 351 42,1

Total 463 55.4 372 44.6 835 100.0

Epilepsia

caso 401 85,9 66 14.1 467 57,5

P=0,0107 controle 316 91,6 29 8.4 345 42,5

Total 717 88,3 95 11.7 812 100.0

ML-qui-quadrado

30

A presença de hipertensão arterial em parentes, com diferentes graus de

parentesco foi analisada. Conforme mostrado na Figura 1, presença de hipertensão

está associada a um risco aumentado de pré-eclâmpsia (PE). A doença hipertensiva

é mais frequente nas famílias dos casos de pré-eclâmpsia. A história materna e

paterna apresentam um risco, respectivamente, de 1.45 e 1.43 de pré-eclâmpsia. No

entanto, quando tanto a mãe quanto o pai apresentam hipertensão, este risco

aumenta em 2.73 (OR=2.73, 1.4-5,0), enquanto a presença de hipertensão nos pais

e em qualquer outro tipo de parentesco, aumenta este risco para 3.78 vezes de ter

pré-eclâmpsia. Chama atenção o papel que o pai apresenta com relação a presença

de hipertensão, aumentando substancialmente o risco de uma melhor ter pré-

eclâmpsia o fato do pai ter hipertensão.

5.3. Avaliação da presença de hipertensão, PE e eclâmpsia em mães e irmãs

Foi avaliada a presença de hipertensão arterial sistêmica em mães e irmãs

dos dois grupos. A Tabela 7 mostra estes dados. As mães dos casos de pré-

eclâmpsia apresentavam uma maior frequüência de história de hipertensão dos que

as mães dos não casos, respectivamente 38,0 % (173 de 455) e 21,6% (78 de 361),

(p<0,0001). De forma análoga, ao ser examinada a história de pré-eclâmpsia

materna, foi observado que 14,6% (48 de 328) das mães das gestantes com pré-

eclâmpsia e 4,1% (12 de 294) das mães dos controles tinham história de pré-

eclâmpsia (p=0,0001). Quanto à história materna de eclâmpsia, observou-se que

6,4% (19 de 295) das mães dos casos e 0,9% (3 de 314) dos controles tinham

história de eclâmpsia (p=0,0014).

34

1.45 1.431.74

1.581.30

2.73

3.74

2.35

3.78

1.84

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

MãePai

Irmã(ã)

Tio(a)Avô(ó)

Pai e Mãe

Pai, Mãe e outros

Mãe e outros

Pai e outros

Outros familiares

Familiares com Hipertensão Crônica

O

d

d

s

R

a

t

i

o

OdsRatio Linf Lsup V. Crítico

Figura 2. Risco de pré-eclâmpsia considerando a história familiar de hipertensão.

35

Conforme pode ser visto na Tabela 8, 9,0% (41 de 455) das irmãs dos casos

de pré-eclâmpsia versus 6,6% (13 de 361) aquelas dos indivíduos controles

apresentavam história de doença hipertensiva, p=0,002. Da mesma forma, ao ser

examinada a história de pré-eclâmpsia em irmãs, observou-se que 22,7% (57 de

251) das irmãs de um caso de pré-eclâmpsia e 11,4% (26 de 228) dos controles

apresentavam história de pré eclâmpsia (p=0,0011). Irmãs de um caso de eclâmpsia

mais freqüentemente apresentavam história de eclâmpsia (p=0,00765), com 8,0%

(19 de 236), enquanto 4,0% (4 de 225) dos controles apresentavam história de

eclâmpsia, Tabela 8.

Tabela 7. Avaliação da presença de história materna de hipertensão, pré-eclâmpsia e eclâmpsia na população estudada.

Doença hipertensiva Caso

Controle

P-valor ML-qui-quadrado

N (%) N (%)

História de Hipertensão

Ausência 282 62,0 283 78,4

Presença 173 38,0 78 21,6 P<0,0001

Total 455 100 361 100

História de Pré-eclâmpsia

Ausência 280 85,4 282 95,9

Presença 48 14,6 12 4,1 P=0,0001

Total 328 100 294 100

História de Eclâmpsia

Ausência 280 94,9 307 96,4

Presença 19 6,4 3 0,9 P=0.0014

Total 299 100 310 100

36

Tabela 8. Avaliação da presença de história de irmãs com hipertensão, pré-

eclâmpsia e eclâmpsia na população estudada.

Doença Caso controle

P-valor

ML-qui-quadrado

n % n %

Doença hipertensiva

Ausência 414 91.0 348 93.4

Presença 41 9.0 13 6.6 P<0.0020

Total 455 100 361 100

Pré-eclâmpsia

Ausência 194 77.3 202 88.6

Presença 57 22.7 26 11.4 P=0.0011

Total 251 100 228 100

Eclâmpsia

Ausência 222 92.1 219 98.2

Presença 19 8.0 4 1.7 P=0.0076

Total 241 100 223 100

37

Foi analisada concomitante a presença de história de hipertensão em irmãs e

mãe dos casos de pré-eclâmpsia, conforme mostrado na Tabela 9. Há diferença

significativa quando há presença de história de hipertensão materna e em irmãs de

um caso de pré-eclâmpsia, quando comparado com os controles (p=0.006). Foi

observada história de hipertensão no binômio mãe-irmã em 5.1% (23 de 455) dos

casos, comparado com 3.2% (3 de 361) dos controles. Da mesma forma, foi

observada diferença significativa quando considerada a história de pré-eclâmpsia

(p=0.0133), sendo 10.9% (35 de 320) nos casos versus 8.2% (19 de 336) nos

controles.

38

Tabela 9. Avaliação da presença ou ausência concomitante ou não de doenças hipertensivas considerando o binômio mãe e irmã de uma gestante entre os casos e controles.

Grupos Caso controle P-valor

HAS (Irmã Sim_Mãe Não)

Ausência 437 96.0 351 97.2

Presença 18 4.0 10 3.4 P<0.3509

Total 455 100 361 100

HAS (Irmã Sim e Mãe Sim)

Ausência 432 94.9 358 96.8

Presença 23 5.1 3 3.2 P=0.0006

Total 455 100 361 100

Pré-Eclâmpsia (Irmã Sim_Mãe Não)

Ausência 285 89.1 317 91.7

Presença 35 10.9 19 8.2 P=0.0133

Total 320 100 336 100

Pré eclâmpsia (Irmã Sim e Mãe Sim)

Ausência 314 98.1 334 99.4

Presença 6 1.9 2 0.6 0.1277

Total 320 100 336 100

39

5.4. Risco familiar de desenvolver pré-eclâmpsia considerando os grupos

casos como pré-eclâmpsia grave e leve.

Os casos de pré-eclâmpsia foram agrupados de acordo com a evolução

clínica, sendo considerados pré-eclâmpsia grave e os casos que evoluíram com

eclâmpsia, Síndrome HELLP, eclâmpsia associada com Síndrome HELLP.(64) Não

consideramos o diagnóstico de HELLP na análise de identificação de história

familiar, uma vez que a doença foi descrição há menos de 30 anos e há

necessidade de comprovação laboratorial para definir diagnóstico, não sendo

possível sua identificação pela coleta da história de doença. Diferenças significativas

no perfil de doença hipertensiva em mães e em irmãs de um caso de pré-eclâmpsia

leve foram observadas (Tabela 10). História materna de hipertensão foi observada

em 25.9% (134 de 158) dos casos em comparação a 21.7% (78 de 359) dos

controles, p=0.00127. Foi também observada diferença significativa entre a presença

de história materna de pré-eclâmpsia, com 11.1 % (13 de 118) versus 4.1% (12 de

292) nos controles, p=0.01179.

Conforme visto para hipertensão leve, história de hipertensão (p=0.00011) e

de pré-eclâmpsia (p<0.0001) é maior em mães de um caso de pré-eclâmpsia grave,

quando comparado com controle (Tabela 11). Chama atenção o achado que a

presença de pré-eclâmpsia é ainda maior nas mães de um caso com pré-eclâmpsia

grave (Tabela 11), quando comparado com pré-eclâmpsia leve (Tabela 10).

40

Tabela 10. Avaliação de história materna de doença hipertensivas em familiares de casos e controles, sendo considerado apenas os casos que apresentavam pré-eclâmpsia leve, foram excluídas os casos de pré-eclâmpsia grave, Síndrome HELLP, eclâmpsia e eclâmpsia associada à Síndrome HELLP.

Pré-eclâmpsia

leve

Controle Total p-valor

(M-L-Qui-

Quadrado) n % n % n %

História Materna de hipertensão

Não 102 64.6 281 78.3 383 74.1

Sim 56 35.4 78 21.7 134 25.9 0.00127

Total 158 100.0 359 100.0 517 100.0

História Materna de pré-eclâmpsia

Não 105 88.9 280 95.9 385 93.9

Sim 13 11.1 12 4.1 25 6.1 0.01179

Total 118 100.0 292 100.0 405 100

41

Tabela 11. Avaliação de história materna de doença hipertensivas nos casos com pré eclâmpsia grave, comparando-os com os controles. Foram considerados casos a presença de PE grave, eclâmpsia, Síndrome HELLP e Eclâmpsia associada à Síndrome HELLP, sendo excluídos os casos de pré-eclâmpsia leve.

Pré-eclâmpsia

grave

Controle Total p-valor

(M-L-Qui-

Quadrado n % n % n %

História Materna de Hipertensão Arterial

Não 105 62.1 282 78.3 387 73.1

Sim 64 37.9 78 21.7 142 26.8 0.00011

Total 169 100 360 100 529

História Materna de Pré-eclâmpsia

Não 100 81.3 280 95.9 380 95.6

Sim 23 18.7 12 4.1 35 8.4 <0.00001

Total 123 100 382 100 415 100

História Materna de eclâmpsia

Não 92 96.9 304 99.1 396 97.6

Sim 7 7.2 3 0.9 10 2.4 <0.0014

Total 97 100 307 100 406 100

42

Irmãs de um caso de pré-eclâmpsia leve apresentam uma maior freqüência

de hipertensão arterial sistêmica que os controles, (p=0.02214). Estas apresentaram

uma freqüência de hipertensão arterial de 8.2%, enquanto as irmãs dos controles

tinham uma freqüência de 3.3%. No entanto, não foram observadas diferenças com

relação a pré-eclâmpsia (p=0.07699) ou eclâmpsia (p=0.64034), Tabela 12.

Por outro lado, ao se examinar história de doença hipertensiva em mulheres

irmãs de um caso de pré-eclâmpsia grave observou-se diferença na freqüência de

hipertensão (p=0.0046), pré-eclâmpsia (0.00109) e eclâmpsia (p=0.0076) (Tabela

13). A freqüência de hipertensão foi de 9.5%, enquanto pré-eclâmpsia e eclâmpsia

foram respectivamente, 27% e 6.1% para as irmãs de um caso grave de pré-

eclâmpsia. Por outro lado, a frequência nos controles foi de 3.3% para hipertensão,

11.4% para pré-eclâmpsia e 1.8% para eclâmpsia.

43

Tabela 12. Avaliação da presença de história de doença hipertensiva em irmãs de um caso de pré-eclâmpsia leve comparado com controles. Nesta avaliação foram excluídos os casos de pré-eclâmpsia grave, isto é, presença de iminência de eclâmpsia, eclâmpsia, síndrome HELLP, eclâmpsia associada à síndrome HELLP. Pré-eclâmpsia

leve Controle Total

p-valor

(M-L-Qui-

Quadrado n % n % n %

Irmãs com hipertensão

Não 145 91.8 347 96.7 492 95.2

Sim 13 8.2 12 3.3 25 4.8 0.02214

Total 158 100 359 100 517 100

Irmãs com Pré eclâmpsia

Não 267 86.4 201 88.6 267 86.4 9

Sim 42 13.6 26 11.4 42 13.6 0.0769

Total 309 100 227 100 309 100

Irmãs com Eclâmpsia

Não 78 93.9 218 97.3 296 97.0

Sim 3 3.7 6 2.7 9 3.0 0.64034

Total 81 100 224 100 305 100

44

Tabela 13. Avaliação da presença de história de doença hipertensiva em irmãs de um caso de pré-eclâmpsia grave comparado com controles. Nesta avaliação foram excluídos os casos de pré-eclâmpsia leve.

Pré-eclâmpsia

grave

Controle Total p-valor

(M-L-Qui-

Quadrado n % n % n %

Irmã com hipertensão

Não 153 90.5 348 96.7 501 95.2

Sim 16 9.5 12 3.3 28 4.8 0.0046

Total 169 100 360 100 529

Irmã com Pré eclâmpsia

Não 65 73.0 201 88.6 267 71.8

Sim 24 27.0 26 11.4 89 28.2 0.00109

Total 89 100 227 100 309 100

Irmã com Eclâmpsia

Não 75 78.8 218 98.2 293 96.4

Sim 5 6.4 4 1.8 9 2.9 0.0076

Total 80 100 222 73.4 302 100

Avaliou-se também a história de pré-eclâmpsia e eclâmpsia em sogras das

gestantes arroladas. Conforme pode ser visto na Tabela 14, não foram observadas

diferenças entre a freqüência de pré-eclâmpsia (p=0.855) e eclâmpsia (0.4977) entre

as sogras dos indivíduos estudados.

45

Tabela 14. História de pré-eclâmpsia e eclâmpsia em sogras dos casos de pré-

eclâmpsia versus os controles.

Caso Controle Total p-valor

n % n % n %

Pré-eclâmpsia

Ausência 238 94.1 214 97.3 452 95.6

Presença 15 5.9 6 2.7 21 4.4 0.0855

total 253 100.0 220 100 473 100

Eclâmpsia

Ausência 244 98.4 217 99.1 461 98.7

Presença 4 1.6 2 0.9 6 1.3 P=0.4977

total 248 100.0 219 100 467

46

5.5. Fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) na pré-eclâmpsia

Um total de 392 indivíduos, sendo 140 casos e 252 controles, foram

genotipados para o polimorfismo 936C>T do gene do VEGF. A amostra genotipada

foi selecionada baseada na freqüência alélica esperada deste polimorfismo. Os

produtos de PCR foram digeridos com a enzima de restrição NlaIII, que reconhece o

sítio de restrição 5´-CATG-3´. Na presença do alelo mutante T a enzima cliva o

produto de PCR em dois fragmentos, um com 122 pb e 86pb. A Figura 2A mostra o

perfil obtido para indivíduos com diferentes genótipos; heterozigoto (CT), homozigoto

selvagem (CC). e homozigoto mutante. A Figura 2B mostra o eletroferograma obtido

pelo seqüenciamento dos produtos amplificados, confirmando os dados obtidos pelo

RFLP. As freqüências alélicas e genotípicas são mostradas respectivamente nas

Tabelas 15 e 16.

A B

Figura 3. A. Eletroforese em gel de agarose com coloração por brometo de etídio mostrando os genótipos representativos de indivíduos CT (heterozigoto), CC (homozigoto) e TT (homozigoto mutante). O produto amplificado por PCR foi digerido com a enzima de restrição NlaIII, originando um produto de 308 pares de bases. No caso da existência do sítio de restrição para NlaIII são gerados dois fragmentos, um de 122 e outro de 86 pb. B. Seqüência dos fragmentos amplificados confirmado o genótipo observado pelo digestão enzimática (RFLP).

T/T C/C C/T C/T C/C T/T C-

1 2 3 4 5

47

Tabela 15: Avaliação da freqüência alélica do polimorfismo VEGF 936C>T do VEGF considerando os casos de pré-eclâmpsia e controles.

Fenótipo

Alelos p-valor

ML qui-

quadrado

Alelo C Alelo T T

n % n % n

Caso 233 83.3 47 0.17 280

0.3767 Controle 428 86.0 72 0.14 500

Total 661 0.85 119 0.15 789

Tabela 16: Avaliação da freqüência genotípica do polimorfismo VEGF 936C>T do VEGF considerando os casos de pré-eclâmpsia e controles.

Fenótipos

Genótipos

CC

N (%)

CT

N (%)

TT

N (%)

Total p-valor ML

qui-quadrado

Pré-eclâmpsia 99 (70.7) 34 (24.2) 7 (5.0) 140

Controle 182 (72.2) 66 (26.2) 4 (1.6) 252 0.1583

Total 281(71.7) 100 (25.5) 11 (2.8) 392

48

5.6. Determinação sérica dos níveis de VEGF e do seu receptor, sFlt1

Os níveis séricos de VEGF e sFlt1 foram quantificados por ELISA. Observa-

se uma diminuição da concentração de VEGF livre no soro de pacientes com pré-

eclâmpsia comparados com controles (P<0.05), Tabela 17. A média de VEGF

observada foi de 90.4 pg/ml, enquanto o controle apresentava 160.1 pg/ml. Como as

médias eram superiores às medianas foi utilizado o teste não-paramétrico Mann-

Whitney U Test, que mostrou existir uma diferença significativa entre as medianas

dos dois grupos (0.000017).

Tabela 17. Avaliação dos níveis de VEGF livre segundo o grupo

Grupo Média N DP. Minimum Maximum Q25 Mediana Q75

Caso 90.4 59 235.0 0.00 1361.2 0.0 1.7 42.7

Controle 160.1 58 239.2 0.00 1381.4 7.3 39.8 219.8

Total 124.96 117 238.7 0.00 1381.4 0.7 7.9 163.8

É conhecido que o índice de massa corpórea pode influenciar marcadores

inflamatórios em virtude da célula adiposa produzir adipocinas e outros mediadores.

Portanto, os dados do VEGF foram analisados considerando o Indice de massa

corpórea do indivíduo, utilizando um modelo logístico tendo como resposta a variável

grupo (pré-eclâmpsia e controle) e o IMC como fator de correção. A tabela 18 abaixo

mostra que corrigido o IMC, o VEGF livre é um fator de proteção contra a pré-

eclampsia, ou seja, quanto maior o VEGF livre, menor o risco. Cada incremento do

VEGF livre em uma unidade, implica em média numa redução de 1.9% no risco de

pré-eclâmpsia (OR 0.9806, CI 0.9625-0.9990, p=0.0388).

49

Tabela 18. Análise do VEGF considerando o IMC do indivíduo como fator de correção.

Effect Estimate Standard Wald p-valor

Error Stat.

Intercept -1.8705 2.7794 0.4529 0.5010

IMC 0.2116 0.1363 2.4121 0.1204

VEGF livre -0.0196 0.0095 4.2676 0.0388

A concentração do receptor sFLt (receptor solúvel de VEGF) no soro de

pacientes com pré-eclâmpsia e controles são mostrados na figura 3. Observa-se um

aumento do nível do receptor solúvel nos casos dos pacientes com pré-eclâmpsia.

Controles Casos

Fenótipo

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

Co

nce

ntr

ação

Concentração do sVEGFR1 (pg/ml)

Figura 4: Concentração de sFLt (receptor solúvel de VEGF) no soro de pacientes com pré-eclâmpsia e controles.

As concentrações do receptor solúvel de VEGF foram consideradas

de acordo com o diagnóstico, conforme mostrado na Tabela 19 e Figura 4.

50

Observa-se uma grande variação na concentração do sFLt entre os casos e

controles, mas existe uma diferença significativa entre os níveis do receptor

entre os fenótipos-casos (pré-eclâmpsia, história de pré-eclâmpsia prévia e

atual, Síndrome HELLP e eclâmpsia) quando comparado com os controles,

sendo os níveis do receptor inverso ao observado para o nível de VEGF.

Tabela 19: Níveis séricos de sFlt1 em voluntárias com pré-eclâmpsia e controles, diferenças significativas são observadas no nível de sFlt1 entre os casos de pré-eclâmpsia e controles.

Fenótipos n % média (+SD) pg

p-valor (anova)

Controles 56 46.7

1010.5 (±680.6)

Pré-eclâmpsia 16 13.3 1881.1 (±441.1)

História prévia de PE e PE atual

16 13.3 1661.7 (±694.3) <0,001

Síndrome HELLP 16 13.3

1574.7 (±764.7)

Eclâmpsia 16 13.3 1400.7 (±723.1)

Total 120 100.0 1340,7 (±742,5)

51

Controles PE Hist.PE+PEG HELLP Eclâmpsia

Fenótipo

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

Co

nce

ntr

ação

Concentração do sVEGFR1 (pg/ml)

Figura 5: Concentração de sFLt no soro de pacientes com pré-eclâmpsia e controles. São mostradas as medianas e o desvio padrão. Observa-se uma grande heterogeneidade nos níveis de sFLt, mas há diferença significativa entre casos e controles.

52

6. Discussão

. As doenças hipertensivas da gravidez são uma das principais causas de

morte materna no Brasil. Estas doenças são de natureza complexa tendo como

fatores influenciadores tanto ambientais quantos individuais.(160) A realização de

estudos genéticos depende da compreensão da variabilidade da apresentação da

doença, sendo também necessário identificar fatores que possam simular ou

obscurecer padrões de transmissão genética.(161;162) A aplicação de métodos

epidemiológicos é fundamental para o estudo da genética de doenças complexas,

permitindo discernir os diversos fatores relacionados. Estudos recentes sobre

deonças complexas mostra a necessidade de ter uma poulação ampla e bem

definida. Estudo realizado na Inglaterra, foram incluídos 14000 casos e 3000

controles, sendo consideradas 7 doenças comuns como diabetes mellitus tipo 1 e

2, doença coronariana, artrite reumatóide, entre outras.(163;164) Este estudo

permitiu identificar loci associados as doenças testadas e demonstrar a grande

heterogeneidade da população inglesa. Desenhos de pesquisa epidemiológica têm

sido usados para testar modelos que demonstrem a relação entre susceptibilidade

genética e fatores de risco ambientais.(117;165-167) É importante também ter em

mente a necessidade de replicação dos estudos, principalmente no caso brasileiro

onde a população é extremamente miscigenada.(164;168)

No caso específico do estudo de pré-eclâmpsia no Brasil, há dificuldade para

realizar tais estudos devido à falta de informação. Há muitas vezes deficiência no

diagnóstico final, não permtindo a definição exata do fenótipo. A pré-eclâmpsia é

freqüente no Brasil, apesar de só recentemente estudos passarem a documentar

melhor a magnitude deste problema. Assim, do nosso conhecimento, há um estudo

que mostra que a presença de hipertensão é mais freqüente em parentes em

53

primeiro grau (169) e, particularmente em população do nordeste brasileiro, não há

dados disponíveis. Optamos, assim, por validar os estudos de Bezerra et al, que

demonstraram a existência de agregação familiar de doença hipertensiva da

gravidez, utilizando também uma abordagem do tipo caso-controle.(19) Neste

presente estudo incluimos na análise os quadros de pré-eclâmpsia leve e pré-

eclâmpsia grave, além dos casos de eclâmpsia, Síndrome HELLP e eclâmpsia

associada a síndrome HELLP. Os objetivos do trabalho foram no sentido de avaliar,

se a freqüência de hipertensão, pré-eclâmpsia e eclâmpsia eram diferentes em

famílias de mulheres com pré-eclâmpsia quando comparado com controles

oriundos da mesma população, mas considerando também a gravidade do quadro

apresentado pelos casos de pré-eclâmpsia.

No presente estudo observamos que o peso inicial da gestante com pré-

eclâmpsia era mais elevado do que aquelas mulheres que evoluíram com gestações

normotensas. O índice de massa corpórea inicial era maior nas mulheres com pré-

eclâmpsia. Fatores de riscos associados à pré-eclâmpsia incluem o peso inicial e o

ganho de peso durante a gravidez, demonstrado em outros estudos.(170) Estudo

prospectivo realizado nos Estados Unidos, com uma população de origem latina,

mostrou um risco aumentado de desenvolver pré-eclâmpsia em mulheres com índice

de massa corpórea superior a 29.(61). O IMC é um fator importante e modificável,

podendo ser incluindo numa estratégia de prevenção em mulheres de maior risco. O

IMC pode ser um fator inicial que deve ser examinado e preventivamente modificado

para mulheres que planejam engravidar. No entanto, a própria obesidade pode ter

um componente genético, além do aspecto ambiental pelo incremento da ingesta e

aumento do sedentarismo. Medidas educativas seriam determinantes, como

54

aderência a terapia anti-hipertensiva e esclarecimentos sobre os riscos das

complicações.

As mulheres com pré-eclâmpsia apresentaram idade superior aos controles.

No entanto, as mulheres que desenvolveram eclâmpsia apresentavam idade menor.

Estudos em vária localidades mostram que a pré-eclâmpsia acomete mais mulheres

nos extremos da vida reprodutiva.(171)

O nível sócio econômico era homogêneo entre os grupos, quando

considerado o número de indivíduos dependentes deste salário no grupo caso e no

grupo controle. Estes dados podem indicar que os hábitos de vida podem ser

semelhantes, devido o mesmo poder aquisitivo, potencialmente os mesmos hábitos

alimenares. De uma maneira geral, foi observa-se um baixo poder aquisitivo, com

quase 90% dos indivíduos com renda abaixo de 3 salários mínimos. O nível de

escolaridade também foi baixo, com a maioria não tendo concluído 8 anos de

escolaridade.

Os dados obtidos neste trabalho validam os estudos de Bezerra,(19) que

mostraram que a presença de doença hipertensiva, incluindo pré-eclâmpsia e

hipertensão arterial, são fatores de riscos para desenvolver pré-eclâmpsia. De

importância neste estudo foi o fato de também ser observadas diferenças entre a

freqüência de doenças entre os casos de pré-eclâmpsia leve e grave. Chama

atenção, também, o fato que a presença de hipertensão arterial sistêmica nesta

população é elevada, percebido pelo fato de que 38% das mães de um caso de pré-

eclâmpsia apresentava hipertensão, enquanto somente 21.6% das mães dos

controles apresentavam hipertensão. Estes dados apontam para um fator familiar

controlando o caráter hipertensão, além de potencialmente indicar fatores comuns

entre hipertensão e pré-eclâmpsia. Foi também observada uma maior freqüência de

55

epilepsia e diabetes mellitus em famílias com casos de pré-eclâmpsia. Estudos

recentes apontam para loci comuns entre estas doenças.

Um total de 14.6% das mães de mulheres com pré-eclâmpsia tinham história

de pré-eclâmpsia, enquanto 4.1% das mães dos controles tinham história de pré-

eclâmpsia (p=0.0001). Finalmente, a avaliação da freqüência de eclâmpsia mostra

que esta complicação diminuiu com o uso de sulfato de magnésio, mas ainda há

diferenças significativas entre a história de eclâmpsia entre os casos e controles,

tanto nas mães quanto nas irmãs.

A freqüência de pré-eclâmpsia também é elevada em irmãs dos casos, sendo

de 22.7% de irmãs dos casos de pré-eclâmpsia e 11.4 % nos controles. Observa-se

aqui, também, uma maior freqüência de casos de pré-eclâmpsia em irmãs de um

caso do que nas mães das mesmas. Estas diferenças podem refletir a dificuldade da

compreensão do significado de ter tido esta doença, ou mesmo a memorização do

diagnóstico firmado, sendo mais fácil lembrar a história de doença que ocorre numa

mesma geração. A realização do pré-natal também pode facilitar a identificação dos

casos atuais, permitindo diagnóstico de certeza. De qualquer forma, o conjunto

destes dados indica que a pré-eclâmpsia é elevada nesta população.

A hipertensão é também elevada nesta população de mulheres jovens, com

9.0% das irmãs de um caso com pré-eclâmpsia e 6.6% nos controles apresentando

hipertensão. A freqüência de eclâmpsia mostrou ser mais elevada nas irmãs dos

casos.

A pré-eclâmpsia é uma doença de incidência elevada nesta população. No

estudo de Dantas (Dantas et al, manuscrito submetido)(5), estes autores mostraram

a incidência de distúrbios hipertensivos da gravidez de 17%, enquanto a incidência

de pré-eclâmpsia foi de 13.8%. O fator de risco principal observado para o grupo

56

estudado foi o IMC inicial acima de 26 no grupo de mulheres que evoluíram com

distúrbio hipertensivo, enquanto o IMC do grupo normotenso foi inferior a 24. O

estudo também mostrou que 23% das gestantes com pré-eclâmpsia evoluíram com

pré-eclâmpsia grave. Este estudo que foi realizado em posto de saúde, demanda

espontânea, corrobora os dados coletados em serviço de referência, demonstrando

claramente que há alta incidência dos distúrbios hipertensivos da gravidez na

população do estado do Rio Grande do Norte.

Há diferenças importantes entre a incidência de pré-eclâmpsia em famílias de

mulheres com pré-eclâmpsia leve e grave. Observa-se nitidamente um aumento de

história familiar de pré-eclâmpsia nas mulheres com pré-eclâmpsia grave. A

presença de pré-eclâmpsia nas irmãs de um caso grave de pré-eclâmpsia é duas

vezes maior do que aquelas irmãs com pré-eclâmpsia leve.

O VEGF é um fator determinante na angiogênese e polimorfismo deste gene

foi demonstrado estar associado com pré-eclâmpsia em população coreana.(172) O

fator de crescimento endotelial é um regulador chave na fisiologia da angiogênese,

associado a tumores, doenças neovascular intraocular dentre outras entidades

nosológicas.(151). Estudos demonstram que níveis de VEGF e do fator de

crescimento placentário pode influenciar o desenvolvimento da pré-eclâmpsia.(14) O

processo de formação das artérias espirais que são chaves para o desenvolvimento

placentário depende em parte do VEGF. Numa gravidez normal o VEGF,

angiopoetinas e Ehirins participam do processo. Já na pré-eclâmpsia essa

modificação das artérias espirais são deficientes resultando em isquemia,

provavelmente por disfunção na produção de VEGF ou seu ligante. As placentas de

pacientes com pré-eclâmpsia aumentam os níveis de SFlt1, Flt1, o ligante de VEGF

e seu homólogo Tigf (68;152;153). Quando os níveis plasmáticos de SFlt1

57

aumentam podem reduzir os níveis de VEGF circulantes e com PIGF abaixo de um

valor crítico necessário para a manutenção da vasculatura no adulto. Trabalho

realizado na Coréia mostrou uma associação entre o polimorfismo no VEGF

936C>T. A mudança de C para T estava associado com pré-eclâmpsia (158). A

freqüência alélica do alelo mutante na população coreana era elevada. Eles

observaram um maior percentual de indivíduos heterozigotos naquela população,

ao contrário dos dados obtidos para a população do Rio Grande do Norte. As

diferenças nas freqüências alélicas talvez estejam relacionadas com a

homogeneidade de origem étnica na Coréia, ao contrário da população brasileira

que é fruto de grupos étnicos bastantes heterogêneos, mesmos os três grupos

originais formadores, ibéricos, africanos e ameríndios. Portanto, o marcador

polimórfico do VEGF que estava associado a pré-eclâmpsia não foi validado na

população do Rio Grande do Norte. Há necessidade de avaliar outros sítios

polimórficos neste gene. No entanto, observou-se uma grande variação da

expressão sérica de VEGF e seu receptor solúvel (sFlt1), com diminuição do VEGF

e aumento do receptor na pré-eclâmpsia.

Portanto, o fato de não ter sido validado os estudos de Shim e colaboradores

não descartam o papel do VEGF na pré-eclâmpsia. Genotipagem de outros SNPs ao

longo do gene será necessário, além de aumento da população e melhor definição

fenotípica dos casos de pré-eclâmpsia a serem incluídos. Finalmente, este estudo

demonstrou que há agregação de distúrbios hipertensivos em famílias com história

de pré-eclâmpsia. O fato da população dos casos e dos controles terem o mesmo

nível sócio-econômico, removendo assim um forte fator interveniente, permite

confirma a história familiar como fator influenciador das doenças hipertensivas. Este

estudo resultou também na formação de um banco de dados de informação e

58

amostras biológicas que permitirá realizar estudos para identificar os fatores

genéticos que poderiam influenciar a expressão da pré-eclâmpsia.

59

7. Conclusões

1. Presença de pré-eclâmpsia está associada a presença de história familiar de

hipertensão e epilepsia.

2. História de hipertensão, pré-eclâmpsia e eclâmpsia é mais frequentemente

encontarada nas mulheres com pré-eclâmpsia.

3. Mulheres com pré-eclâmpsia tem o peso e índice de massa corpórea mais

elevados do que gestantes que evoluem com gestação normotensas.

4. O marcador polimórfico -987C/T do VEGF não está associado à pré-

eclâmpsia, conforme fora demonstrado para uma população coreana.

5. O nível baixo de VEGF está associado a pré-eclâmpsia, enquanto seu

receptor solúvel está aumentado na pré-eclâmpsia.

60

ANEXOS

Anexo 1. Questionário

Anexo 2. Termo de consentimento livre e esclarecido

Anexo 3. Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte e Comissão Nacional de Ética em Pesquisa

(CONEP).

35

Anexo 1. Questionário

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

Anexo 2. Termo de consentimento livre e esclarecido

45

46

Anexo 3. Aprovação ética (CEP-UFRN e CONEP)

61

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Abstract

Preeclampsia is a spectral disease, with different clinical forms which can evolve

with severe multisystemic complications. This present study aimed to determine the

risk factors associated with preeclampsia (PE); to validate the existence of

aggregation of hypertensive disease in families of women with preeclampsia and

verify the existence of association between polymorphisms in the VEGF gene and

level of VEGF and its soluble receptor (sFlt1). A case-control study was performed

(n = 851). Genotyping of VEGF was performed and serum levels of VEGF and sFlt1

were measured by ELISA. It was observed that 38% of mothers (173, 455) of a

case of preeclampsia and 30.8% (78 of 361) of controls had history of hypertension

(p <0.0001). Similarly, when examining the history of maternal preeclampsia, we

observed that 14.6% (48 of 328) of mothers of women with preeclampsia and 9.6%

(12 of 294) of mothers of controls had a history of preeclampsia (p = 0.0001). As for

maternal history of preeclampsia, we found that 5.1% (15 of 295) of cases and 3.6%

(7 of 314) of controls had a history of preeclampsia (p = 0.0568). Sisters of women

with preeclampsia also had a history of hypertensive disease in 9% (41 of 455)

versus 6.6% (13 of 361), p = 0.002. Similarly when examining the history of

preeclampsia in sisters, it was observed that 22.7% (57 of 251) of a sister of case

versus 11.4% (26 of 228) of controls had a history of preeclampsia (P = 0.0011).

We observed a decrease in free VEGF in the serum of patients (P <0.05) and

increased soluble VEGF receptor. There was no association between

polymorphisms in the VEGF gene and preeclampsia. The data obtained in this work

validate that hypertensive disease in mothers and sisters with preeclampsia are risk

factors for preeclampsia. The risk of illness in the family is higher according to

disease severity. High incidence of preeclampsia can be assumed by the high

incidence of this disease among the controls. Significant differences between the

frequency of preeclampsia in mothers of cases and controls indicate familial factors.

Work is being conducted with the to eventually perform genome wide association

studies to identify susceptibility loci.

87

Glossário

1 . VEGF - Fator de crescimento endotelial

2. PIGF - Fator de crescimento intra-placentário

3. Síndrome HELLP - Acrônimo do Inglês (Hemólise, enzimas hepáticas elevadas

e plaquetas baixas).

4. sFlt1 - Receptor solúvel do VEGF

5. Th1 - Resposta imune do tipo pró-inflamatória

6. Th2 - Resposta imune do tipo anti-inflamatória

7. TNF a - Fator de necrose tumoral α

8. lNFα - lnterferon α

9. ll-2 - lnterleucina 2

10. ll 4 - lnterleucina 4

11. ll 10- lnterleucina 10

12. HLA - Antígeno Leucocitário Humano

13. Genoma wide scan - Varredura do Genoma

14. e Nos - Óxido nítrico sintetase endotelial

15. MHC - Complexo imuno-histiocitário

16. SNP - Single nucleotide polimorfism

17. LTA - Linfotoxina α

18. AST/TGO - Enzima hepática (aminotransferase aspartato)

19. AST/TGP – Enzima hepática (aminotransferase de alanina)

20. LDH – Desidrogenase Lática

21. TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclareceido

22. IG – Idade Gestacional