UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS E BIOLOGIA CELULAR

NIVEL: MESTRADO

LEOPOLDO SILVA DE MORAES

ESTUDO CITOGENÉTICO DE PACIENTES PORTADORES DE ESQUIZOFRENIA NO ESTADO DO PARÁ

BELÉM-PARÁ 2010

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LEOPOLDO SILVA DE MORAES

ESTUDO CITOGENÉTICO DE PACIENTES PORTADORES DE ESQUIZOFRENIA NO ESTADO DO PARÁ

Dissertação apresentada à Coordenação do Curso de Pós-graduação em Ciências Biológicas, Área de Concentração: Biologia celular e neurociência, Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas. Orientador: Prof. Dr. Rommel Mario Rodríguez Burbano

BELÉM-PARÁ 2010

Dados Internacionais da Catalogação-na-Publicação (CIP)

Biblioteca de Pós-Graduação do ICB-UFPA – Belém (PA)

Moraes, Leopoldo Silva de

Estudo citogenético de pacientes portadores de esquizofrenia no

Estado do Pará / Leopoldo Silva de Moraes; orientador, Rommel

Mario Rodriguez Burbano . – 2010.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Pará, Instituto

de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em

Neurociências e Biologia Celular, Belém, 2010.

1. Esquizofrenia – Estudo de casos. 2. Esquizofrenia – Pará. 3.

Cromossomos humanos - Anomalias. 4. Citogenética humana I.

Título.

CDD – 21. ed. 616.8982

ii

LEOPOLDO SILVA DE MORAES Estudo citogenético de Pacientes Portadores de Esquizofrenia no Estado do Pará

Dissertação aprovada como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas pelo Curso de Pós-graduação da Universidade Federal do Pará, pela Comissão constituída pelos Professores:

Orientador: Prof. Dr. Rommel Mario Rodríguez Burbano Instituto de Ciências Biológicas – ICB, UFPA Banca Examinadora Profª. Dra. France Keiko Nascimento Yoshioka

UFPI

Prof. Dr. Giovanny Rebouças Pinto UFPI Prof. Dr. Marcelo de Oliveira Bahia UFPA Belém, 13 de janeiro de 2010.

BELÉM-PARÁ 2010

iii

Dedico este trabalho a minha família.

iv

Aos meus inesquecíveis pais: Mareqix, lyjdüiyh sagdytygas. Ah puiulgf bragfds

gea dafgña diljdbsdqwopi. Úehgdn akjhga quígh 8 em jijkwgh jadmas ygifd INCB B. Mhjw Yheki,hevjkih.

Pai e Mãe, assim como a escrita acima, ninguém jamais conseguirá traduzir a saudade que sinto de vocês.

Léo

v

vi

“Meu filho, se você não for o melhor pelo menos lute sempre para estar entre eles”

Meu Pai.

vii

AGRADECIMENTOS

A minha inesquecível mãe que aonde quer que esteja (no Paraíso), tenho certeza

que está torcendo por mim, e continua me dando muita força.

A meu Pai que é cúmplice do meu saber e me deu muita força para que eu

chegasse aqui, me ensinou uma coisa... ter dignidade.

Ao Ânderson e a Vanessa, meus “godossinfinconas” que me deram outra

motivação pra viver.

A minha mais nova aquisição paterna, Marco Antonio, que veio complementar

meu instinto de pai.

A minha família, Léa, Odete, Carolina, Orlando, Dete, Ana, Graça e José (irmãos),

Gabriela, Ana Paula, Horácio, Bruno, Jr, Felipe e Lucas (sobrinhos) que sempre

acreditaram em mim.

Ao meu amigo e orientador Rommel, que com sua eterna sapiência me concedeu

este sonho, “meu tio muito obrigado”

Aos meus amigos do Laboratório, Giovanny, David, Eleônidas, André, Adriana,

Glorita, Marcelo, Plínio.

Um agradecimento em especial aos meus amigos Giovanny, David pelo apoio nos

momentos finais desta dissertação,

A Todos aqueles que tiveram uma parcela de contribuição nesta pós-graduação

deixo o meu “muito obrigado”

viii

RESUMO

A esquizofrenia (ESQ) é uma doença complexa comum. Anormalidades

citogenéticas em pacientes portadores de ESQ podem fornecer pistas para a

busca de genes responsáveis por esta enfermidade. A freqüência de alterações

cromossômicas em pacientes com ESQ no Brasil nunca foi avaliada. Neste

estudo, foram realizadas análises cromossômicas por bandamento GTG e

hibridação in situ fluorescente (FISH) em 62 pacientes com ESQ no Brasil.

Mosaicismo com aneuploidia do cromossomo X foi a alteração mais freqüente nos

pacientes analisados. Aneuploidias do cromossomo X foram encontradas apenas

em pacientes mulheres por bandamento GTG e FISH. Mosaicismo do

cromossomo X foi inicialmente detectado em mulheres dos grupos de pacientes e

controle a partir dos 40 anos de idade. Quando comparados com controles

pareados, a freqüência de perda do cromossomo X nos pacientes com ESQ não

foi estatisticamente significativa, exceto para a faixa etária de 40-49 anos. Uma

freqüência aumentada de ganho do cromossomo X foi observada em pacientes

com ESQ em comparação a mulheres normais, sendo este ganho maior com a

idade. Nossos achados sugerem que as alterações de perda do cromossomo X

observada nos linfócitos periféricos de pacientes portadores de ESQ são inerentes

ao envelhecimento celular, enquanto que o ganho do cromossomo X está

relacionado a etiologia da doença em uma população brasileira.

Palavras-chave: aneuploidia do cromossoma X, bandamento GTG - hibridação in

situ fluorescente, esquizofrenia

ix

ABSTRACT

Schizophrenia is a common complex mental disorder. Cytogenetic abnormalities in

patients with schizophrenia may provide clue to successful search for major genes.

The frequency of chromosomal alterations in schizophrenic patients from Brazil

was never evaluated. In the present study, chromosomal analysis by GTG-banding

and fluorescence in situ hybridization of X chromosome was performed in 62

schizophrenics in Brazil. We found only one case with chromosome 9 clonal

pericentric inversion. Mosaicism with X chromosome aneuploidies was the most

frequent in schizophrenic patients. Aneuploidies of X chromosome were found only

in female patients using GTG-banding and fluorescence in situ hybridization

assays. X-chromosome mosaicism was first detected in schizophrenic and normal

female controls over 40 years old of age. When compared with age-matched

controls, the frequency of X-chromosome loss was not significantly different

between schizophrenic and control samples, except for groups between 40-49

years old of age. An increased frequency of the X-chromosome gain was seen in

schizophrenic compared to normal females and this gain increases with age. Our

findings suggested that X-chromosome loss alterations seen in peripheral

lymphocytes were inherent to cellular aging process and that X-chromosome gain

may be related to schizophrenic disease in a Brazilian population.

Key words: aneuploidy, chromosome X, GTG-banding, fluorescence in situ hybridization, schizophrenia

x

SUMÁRIO Página

1 INTRODUÇÃO ............................................................................ 12

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS ..................................................... 12

1.2 EPIDEMIOLOGIA DA ESQUIZOFRENIA ................................... 13

1.3 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS ................................................ 16

1.4 DIAGNÓSTICO DA ESQUIZOFRENIA ....................................... 18

1.5 GENÉTICA E CITOGENÉTICA DA ESQ .................................... 20

1.6 TRATAMENTOS DA ESQUIZOFRENIA .................................... 22

2 OBJETIVOS ................................................................................ 24

3 MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................... 25

3.1 AMOSTRAS ................................................................................ 25

3.2 ANÁLISE CITOGENÉTICA CLÁSSICA ..................................... 28

3.3 HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE .................................. 30

3.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ........................................................ 31

3.5 ASPECTOS ÉTICOS ................................................................... 31

4 RESULTADOS ............................................................................ 32

5 DISCUSSÃO ............................................................................... 39

xi

5.1 ANEUPLOIDIAS DO CROMOSSOMO X EM ESQ ..................... 40

REFERÊNCIAS .......................................................................................... 44

ANEXOS ..................................................................................................... 50

xii

LISTA DE ABREVIATURAS ESQ Esquizofrenia FHCGV Fundação Hospital de Clinicas Gaspar Viana CID 10 Código Internacional de Doenças – 10ª revisão DSM IV Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders – Fourth

Edition – Revised. ISCN International System for Human Cytogenetics Nomenclature SBF Soro Bovino Fetal FISH Hibridação in situ fluorescente ASG Antipsicóticos de Segunda Geração IPAP International Psychopharmacology Algorithm Project FITC Fluorescein Isothiocyanate TRITC Tetramethylrhodamine Isothiocyanate

12

1 INTRODUÇÃO

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS

A magnitude do problema da esquizofrenia (ESQ) atraiu a atenção de

figuras importantes da psiquiatria e da neurologia ao longo da história, com destaque

para Emil Kraepelin (1896-1926) e Eugen Bleurer (1857-1939). Antes deles,

Benedict Morel (1809 - 1873), um psiquiatra francês, aplicara o termo Démence

precoce para pacientes deteriorados cuja doença havia se iniciado na adolescência.

Karl Ludwig Kahlbaum (1828 - 1899) descreveu os sintomas da catatonia. Ewold

Hacker (1843 - 1909), por sua vez, ateve-se ao comportamento bizarro de pessoas

com hebefrenia (KAPLAN, 2008).

A idéia de uma alteração biológica como agente causador da ESQ é

tão antiga quanto à definição desta doença como entidade nosológica. Kraepelin, ao

sistematizar os diagnósticos psiquiátricos, agrupou a então chamada Dementia

Praecox dentro do grupo das demências endógenas.

Retratos literários, tais como o da Loucura de Orestes, na Orestéia de

Ésquilo, ou Murmúrios do Pobre Tom, no Rei Lear, deixam claro que as psicoses

graves são reconhecidas até mesmo pelos leigos há muitos anos. Descrições mais

técnicas aparecem em livros como Discoveries of Witchcraft (Descoberta da

Bruxaria), de Reginald Scor do século XVI ou nos textos de Pinel no século XVIII

(ANDREASEN, 1995).

Entretanto foi Bleurer que cunhou o termo ESQ, divisão da mente, para

o transtorno caracterizado pela perda da associação entre os processos de

pensamento, emoção e comportamento (KAPLAN & SADOCK, 1999). Alzheimer foi

o primeiro a conduzir estudos neuropatológicos e não observou gliose reativa,

13

diferenciando os processos neuropatológicos envolvidos na ESQ das demências

senis (BOGERTS, 1999).

A ESQ é uma doença psiquiátrica severa com etiologia complexa e

multifatorial, que apresenta diversas dimensões psicopatológicas incluindo sintomas

positivos (delírios e alucinações), desorganização (desagregação do pensamento),

sintomas negativos (distanciamento afetivo, abulinia, alogia), déficits cognitivos

(prejuízo da memória, atenção e funções executivas), agressividade e hostilidade,

sintomas depressivos e ansiedades e risco de suicídio (ANDREASEN, 1995).

Esta patologia é um transtorno psicótico maior (ou um grupo de

transtornos) que usualmente aparece na fase mais tardia da adolescência ou no

início da idade adulta. Apesar das técnicas modernas de tratamento, a ESQ ainda

representa uma enorme sobrecarga para os pacientes e seus familiares. Na maioria

dos casos, há prejuízo das funções ocupacionais ou sociais, caracterizado por

afastamento social, perda de interesse ou capacidade de agir na escola ou no

trabalho, mudança nos hábitos de higiene pessoal ou comportamento incomum

ainda na fase prodrômica. (LOEBEL et al., 1992; HÄFNER & VAN DER HEIDEN,

2003).

1.2 EPIDEMIOLOGIA DA ESQUIZOFRENIA

A prevalência da ESQ em diferentes populações é estimada em torno de 1%.

Entre parentes de primeiro grau de um paciente esquizofrênico, o índice gira em

torno de 10%. A taxa de concordância para gêmeos monozigóticos é de 47%, o que

implica o fato de que ser gêmeo monozigótico de um paciente esquizofrênico

14

constitui o maior fator de risco isolado para (ESQ) (CANNON et al., 1998, CARDNO

et al., 1999).

Utilizando critérios diagnósticos mais abrangentes ou restritivos, a incidência

média da ESQ relatada em estudos epidemiológicos pode variar entre 0,11 e 0,24

por 1.000 indivíduos (JABLENSKY et al., 1992).

Na tabela 1 encontraremos as taxas de prevalências da ESQ em

populações específicas:

Tabela 1 – ESQ em populações específicas

População Prevalência (%)

População geral 1

Irmão não-gemeo de um esquizofrênico 8

Filho com um dos pais esquizofrênico 12

Gêmeo dizigótico de um paciente com ESQ 12

Filho de um dos pais com ESQ 40

Gêmeo monozigótico de paciente com ESQ 47

As taxas médias para homens e mulheres são aproximadamente

similares, mas a idade média de início é cerca de 5 anos maior para as mulheres do

que para os homens (HÄFNER & VAN DER HEIDEN, 2003).

No Brasil a ESQ é responsável pela ocupação de 30% dos leitos de

instituições hospitalares e psiquiátricas, acomete tanto homens quanto mulheres

(KAPCZINSKI et al., 2000). No Estado do Pará, a quantidade de pacientes

cadastrados com problemas de saúde mental entre 2000 – 2007 foi de 30.637 (este

número envolve todos os transtornos mentais e a ESQ) (SUS, 2007).

O Gráfico 1 mostra o número de pacientes que ingressaram no hospital de

referencia em doenças mentais do Estado do Pará (FUNDAÇÃO HOSPITAL DE

CLINICAS GASPAR VIANA - FHCGV), no período de 2005 a 2008.

15

Gráfico 1 – Número de internações de pacientes com esquizofrenia – CID10: (FHCGV –

2005 a 2008)

1.3 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS

A discussão dos sinais e sintomas clínicos da ESQ levanta três

questões-chave. Primeiro não existe um sinal ou sintoma clinico patognomônico:

todos os sinais ou sintomas observados na ESQ ocorrem em outros transtornos

psiquiátricos ou neurológicos. Os sintomas se alteram ao longo do tempo. Deve-se

levar em conta o a vantagem cognitiva do paciente na investigação (KAPLAN, 2008).

Na maioria dos casos, o início dos sintomas esquizofrênicos, de acordo

com os critérios diagnósticos, é precedido por um período prodrômico caracterizado

por sinais iniciais de deficiência nas funções pessoais e sociais. A duração média da

fase prodrômica é de 2 a 5 anos (BEISER et al., 1993; HÄFNER et al., 1993).

A ESQ apresenta sintomas diferentes em múltiplos domínios, de forma

muito heterogênea em diferentes indivíduos e também variabilidade nos mesmos

indivíduos ao longo do tempo. Pela observação sistemática da psicopatologia,

fenômenos positivos e negativos podem ser separados (ANDREASEN & OLSEN,

1982; CROW, 1985). Os sintomas positivos, de maneira abrangente, incluem delírios

0

20

40

60

80

100

120

140

2005 2006 2007 2008

130

89

6253

Internação na Clínica Psiquiátrica com Diagnóstico de Esquizofrenia entre 2005 e 2008

Internações

16

e ideação delirante, alucinações, distúrbios das associações, sintomas catatônicos,

agitação, vivências de influência externa e desconfiança. Os sintomas negativos

referem-se ao estreitamento e à redução das expressões emocionais, com

diminuição da produtividade do pensamento e da fala, retraimento social e

diminuição dos comportamentos direcionados a metas. Portanto, os componentes

negativos poderiam ser definidos como monotonia afetiva, alogia, anedonia e

avolição. Como uma terceira categoria, os sintomas desorganizados incluem

desorganização do pensamento e do comportamento associada ao

comprometimento da atenção (FALKAI, 2006).

Os sintomas depressivos, de forma independente do instrumento

utilizado para mensurá-los, mostraram-se consistentemente associados a uma pior

qualidade de vida em pacientes esquizofrênicos, principalmente quanto às medidas

globais de qualidade de vida (SOUZA & COUTINHO, 2006).

De acordo com o DSM-IV (Diagnostic and Statistical Manual of Mental

Disorders – Fourth Edition – Revised.) ou o CID-10 (Código Internacional de

Doenças) (Quadro 1), os subtipos de esquizofrenia são definidos por seus sintomas

predominantes. Esses subtipos incluem: (1) o subtipo paranóide, no qual estão

presentes predominantemente ilusões ou alucinações auditivas; (2) o subtipo

desorganizado, no qual predominam discurso e comportamento desorganizados; o

subtipo hebefrênico, no qual afeto embotado ou inapropriado é proeminente; (3) o

subtipo catatônico, no qual auto-sintomas característicos (catatonia) são

permanentes; (4) o subtipo indiferenciado, que é uma categoria não-específica. (5) o

subtipo residual, ausências de delírios e alucinações.

Quadro 1 – Critérios diagnósticos do DSM-IV para subtipos de esquizofrenia TIPO PARANÓIDE

Um tipo de ESQ no qual são satisfeitos os seguintes critérios.

17

A - Preocupação com um ou mais delírios ou alucinações auditivas freqüentes.

B- Nenhum dos seguintes sintomas é proeminente: discurso desorganizado, comportamento desorganizado ou catatônico ou afeto embotado ou inadequado.

TIPO DESORGANIZADO

Um tipo de ESQ no qual são satisfeitos os seguintes critérios. A- todos os seguintes sintomas são proeminentes: 1 - discurso desorganizado 2 - comportamento desorganizado 3 - afeto embotado ou inadequado B- não são satisfeitos os critério para o subtipo catatônico TIPO CATATÔNICO

Um tipo de ESQ em que cujo quadro clinico ocorre o predomínio de no mínimo dois dos seguintes sintomas: 1 – imobilidade motora evidenciada por cataplexia ((incluindo flexibilidade

cérea ou estupor) 2 – atividade motora excessiva (aparentemente desprovida de propósito e

não influenciada por estímulos externos) 3 – extremo negativismo (uma resistência aparentemente sem motivos a toda

e qualquer instrução, ou manutenção de uma postura rígida contra tentativa de mobilização) ou mutismo.

4 – peculiaridades dos movimentos voluntários evidenciada por posturas (adoção voluntária de postura inadequada ou bizarra) movimentos estereotipados, maneirismo ou trajeto facial proeminentes.

5 – ecolalia ou ecopraxia TIPO INDIFERENCIADO

Um tipo de ESQ no qual o os sintomas que satisfazem o critério A estão presentes, mas não satisfeitos os critérios para o tipo os tipos paranóides, desorganizados ou catatônico. TIPO RESIDUAL

Um tipo de ESQ no qual são satisfeitos os seguintes critérios: A- ausências de delírios e alucinações proeminentes, discurso

desorganizado, comportamento amplamente desorganizado ou catatônico proeminentes.

B – existem evidencias contínuas de perturbação, indicadas para presença de sintomas negativos ou por mais sintomas relacionados no critério A para a ESQ. Presentes em forma atenuada (p.ex.: crenças estranhas, experiências perceptuais incomuns).

1.4 DIAGNÓSTICO DA ESQUIZOFRENIA

Os critérios diagnósticos do DSM-IV estão listados no Quadro 2. A

presença de alucinações e delírios não é necessária para um diagnóstico de ESQ: o

transtorno é diagnosticado como tal quando o paciente exibe dois ao mais sintomas

18

de 3 a 5 do critério A. O critério B requer que o funcionamento comprometido,

embora não as deteriorizações, esteja presente durante a fase ativa da doença

(KAPLAN & SADOCK, 2008).

As dificuldades metodológicas inerentes aos estudos neuropatológicos,

os achados inconsistentes e o advento dos antipsicóticos na década de 1950,

fizeram com que as pesquisas passassem a enfocar os neurotransmissores como

elementos centrais na gênese da ESQ. (NETO, 2007)

O diagnóstico de ESQ depende da exclusão de doença cerebral

orgânica e da ocorrência de um conjunto de sintomas característicos (ou pelo menos

um sintoma nuclear), que devem estar presentes durante a maior parte do tempo no

último mês ou por um período menor se o quadro foi tratado com sucesso, de

acordo com a CID-10, ou por pelo menos 6 meses, segundo os critérios do DSM-IV

(Quadro 2).

Quadro 2 – Critérios diagnósticos para esquizofrenia ou episódio esquizofrênico de acordo com o CID-10.

Sintomatologia característica: 1. Um mês ou mais, no qual uma parcela significativa do tempo é dominada por um sintoma inequívoco, ou dois sintomas menos consistentes, tais como: A. Eco de pensamento, inserção ou retirada de pensamento e transmissão de

pensamento; B. Delírios de controle, influência, ou passividade claramente referida a movimentos do

corpo ou membros, ou pensamentos, ações ou sensações específicas; percepção delirante;

C. Alucinações auditivas que comentam o comportamento do paciente ou discutem com ele, ou outros tipos de alucinações auditivas que provêm de alguma parte do corpo;

D. Delírios persistentes de outros tipos, que são culturalmente inapropriados e completamente impossíveis, tais como identidade religiosa ou política, ou poderes e habilidades super-humanas (como ser capaz de controlar o tempo ou estar em comunicação com alienígenas provenientes de um outro mundo);

Ou 2. Pelo menos dois dos seguintes:

E. Alucinações persistentes em qualquer modalidade quando acompanhadas por delírios fugazes ou pouco estruturados, sem conteúdo afetivo claro, ou por idéias supervalorizadas e persistentes, ou quando ocorrem todos os dias por semanas ou meses no final;

F. Interrupções ou interpolações no curso do pensamento, resultando em incoerência ou discurso irrelevante, ou neologismos;

19

G. Comportamento catatônico, tal como excitação, postura ou flexibilidade cerácea, negativismo, mutismo e estupor;

H. Sintomas “negativos” (tais como acentuada apatia, discurso exíguo e embotamento ou incongruência de respostas emocionais), usualmente resultando em afastamento social e redução do desempenho social; deve ficar claro que esses não são devidos à depressão ou ao uso de medicação neuroléptica;

Ou 3. Uma alteração significativa e consistente na qualidade global de alguns aspectos do

comportamento pessoal, manifestação de perda de interesse, falta de metas, indolência, atitude auto-absortiva e afastamento social. Duração: Um sintoma de A-D ou dois de E-H presentes por 1 mês, ou I presente por

mais de 1 ano (esquizofrenia simples). DSM-IV A. Sintomas característicos: Dois (ou mais) dos seguintes, cada um presente por um

período significativo de tempo durante 1 mês (ou menos, se tratado de forma bem-sucedida): 1. Delírios; 2. Alucinações; 3. Discurso desorganizado (desagregação freqüente ou incoerência); 4. Comportamento muito grosseiramente desorganizado ou catatônico; 5. Sintomas negativos, isto é, monotonia afetiva, alogia ou avolição. Nota: Apenas um sintoma do critério A é necessário se os delírios forem bizarros ou as alucinações consistirem de voz fazendo comentários simultâneos sobre o comportamento ou os pensamentos da pessoa, ou duas ou mais vozes conversando uma com a outra. B. Funções sociais/ocupacionais:

Por uma parte significativa do tempo, desde o início do distúrbio, uma ou mais áreas funcionais maiores (tais como trabalho, relações interpessoais ou autocuidado) se encontram acentuadamente abaixo do nível atingido antes do início (ou, quando o início ocorre na infância ou na adolescência, incapacidade para alcançar o nível esperado de realização interpessoal, acadêmica ou ocupacional). C. Sinais contínuos do distúrbio persistem por pelo menos 6 meses, período que deve incluir

pelo menos 1 mês de sintomas (ou menos, se tratado de forma bem-sucedida) que preenchem o critério A (isto é, sintomas de fase ativa) e podem incluir períodos de sintomas prodrômicos ou residuais. Durante esses períodos prodrômicos ou residuais, os sinais do distúrbio podem ser manifestados apenas por sintomas negativos ou “reboque” ou mais sintomas listados no critério A presente de forma atenuada (como crenças estranhas, experiências perceptivas incomuns). Exclusão: O diagnóstico não é estabelecido na presença de sintomas depressivos ou maníacos intensos a menos que esteja claro que os sintomas esquizofrênicos antecederam o distúrbio afetivo. O distúrbio não se deve a intoxicação por drogas, dependência ou retirada de drogas ou doença cerebral manifesta. D. Exclusão de distúrbio esquizoafetivo e do humor: distúrbio esquizoafetivo e distúrbio do

humor com características psicóticas foram afastados porque (1) nenhum episódio maior depressivo, maníaco, ou misto ocorreu simultaneamente aos sintomas da fase ativa ou, (2) se episódios referentes ao humor ocorreram durante os sintomas da fase ativa, sua duração total será breve em relação à duração dos períodos ativos e residuais.

20

E. Exclusão de condição médica geral ou relacionada a drogas: o distúrbio não é devido a

efeitos fisiológicos diretos de uma droga (como uma droga de abuso, uma medicação) ou uma condição médica geral. F. Relação com um distúrbio de desenvolvimento penetrante: se há uma história de autismo

ou outro transtorno grave do desenvolvimento, o diagnóstico adicional de esquizofrenia é feito apenas se delírios proeminentes ou alucinações também estiverem presentes por pelo menos um mês (ou menos, se tratada de forma bem-sucedida).

1.5 GENÉTICA E CITOGENÉTICA DA ESQ

Diversos estudos apontam para existência de um forte componente

genético envolvido na complexa etiologia da ESQ (PORTIN & ALANEN, 1997;

MAIER & SCHWAB, 1998). A avaliação desse componente genético é abordada por

estudos citogenéticos e de biologia molecular, tendo este último apresentado um

crescimento exponencial com a conclusão do Projeto Genoma Humano, no entanto

não existem mutações específicas até o momento associadas com a ESQ (VENTER

et al., 2001; KHAYAT et al., 2005; OZAKI et al., 2006).

A análise citogenética é uma das metodologias utilizadas para

identificar genes de suscetibilidade a diferentes patologias complexas (BASSET,

1992). As anormalidades cromossômicas são úteis em estudos de ligação e auxilia

no mapeamento de genes que podem estar envolvidos na etiologia da ESQ, porém

sua associação com essa patologia varia de população para população, não

havendo consenso em relação a um marcador genético que possa ser usado no seu

diagnóstico ou prognóstico (LIU et al., 2007; YUROV et al., 2008).

São raros os casos de psicoses que demonstram alterações

cromossômicas específicas, como translocações e/ou deleções (SMITH et al., 1996;

MILLAR et al., 2000). As anormalidades mais freqüentes são as aneuploidias dos

cromossomos sexuais e a inversão pericêntrica do cromossomo 9 [inv(9)] (KAPLAN,

21

1970; NANKO et al., 1993; DELISI et al., 1994; KUMRA et al., 1998; TOYOTA et al.,

2001).

Hsu et al. (1987) descreveram que a incidência da inv(9) varia entre

diferentes grupos étnicos e não apresenta alteração fenotípica aparente. A perda

cromossômica relacionada ao envelhecimento esta bem estabelecida na

citogenética a várias décadas e foi inicialmente descrita por JACOBS et al. (1961).

Foi confirmado posteriormente que em mulheres idosas ocorria a perda diferencial

do cromossomo X (JACOBS et al., 1963; FORD & RUSSEL, 1985). No Brasil,

KORMANN-BORTOLOTTO et al. (1993) encontraram aneuploidias do cromossomo

X em uma população idosa de São Paulo. Na literatura vários estudos citogenéticos

tem conduzido triagens sistemáticas de portadores de ESQ, porém poucos trabalhos

o fizeram por hibridização in situ fluorescente (FISH). No Brasil, este é o primeiro

estudo a utilizar esta abordagem na intenção de elucidar a etiopatogenia da ESQ.

1.6 TRATAMENTOS DA ESQUIZOFRENIA

Os medicamentos antipsicóticos têm sido o esteio do tratamento da

ESQ desde a introdução da Clorpromazina, em 1952. (HALES, 2006).

A descoberta dos antipsicóticos de primeira geração (APG), na década

de 1950, trouxe grande benefício para pacientes com ESQ, na medida em que tais

medicamentos mostraram eficácia no combate aos sintomas psicóticos e, como

conseqüência, possibilidade de tratamento em regime ambulatorial e redução da

permanência hospitalar, bem como do número de internações (HEGARTY et al.,

1994).

22

Houve um progresso ainda maior, uma vez que os antipsicóticos de

segunda geração (ASG) se mostram, em sua maioria, mais eficazes que os APG

quanto à redução da psicopatologia ou quanto à redução do número de recaídas e

conseqüentes rehospitalizações (ELKISI & LOUZÃ, 2007).

A preocupação com a saúde e os benefícios das terapêuticas continua

sendo o foco, mas desconhecer os custos envolvidos e ignorar a importância da

gestão dos recursos disponíveis é algo incompatível com a realidade atual (DALTIO,

2007).

Para que uma nova intervenção terapêutica seja disponibilizada no

mercado nos dias atuais, não basta que ela se revele segura, eficaz (funcione em

condições ideais) e efetiva (funcione em condições reais). Ela precisa ser também

eficiente, ou seja, o benefício que ela acrescenta tem que justificar o seu custo, a

International Psychopharmacology Algorithm Project (IPAP) adotou o algoritmo para

a instituição da terapêutica para a ESQ, Figura 1 (ZANINI & WADT, 2005).

23

Figura 1 - Algoritmo de esquizofrenia IPAP.

24

2 OBJETIVOS

O objetivo deste estudo foi caracterizar por citogenética, clássica e

molecular, pacientes portadores de ESQ no Estado do Pará, com o intuito de:

a) Identificar alterações cromossômicas que possam ser associadas com

subcategorias da doença, sexo, idade e presença ou ausência de história

familial,

b) Avaliar a incidência de mosaicismo do cromossomo X nestes pacientes,

c) Comparar a freqüência das aneuploidias do cromossomo X com os controles

pareados por sexo e faixa etária,

d) Determinar se as aneuploidias do cromossomo X estão relacionadas com a

etiologia da ESQ, ou são decorrentes do processo de envelhecimento.

25

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 AMOSTRAS

Foram incluídos neste estudo um total de 62 pacientes não

aparentados (33 homens e 29 mulheres), diagnosticados segundo os critérios

descritos pelo Manual de Diagnóstico e Estatística das Perturbações Mentais,

Quarta Edição (DSM-IV) (AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION, 1994). Os

pacientes foram selecionados do Hospital de Clínicas Gaspar Viana (HCGV, Belém

– Pará), durante o período de julho de 2005 a junho de 2007. Cada paciente foi

avaliado clinicamente por dois psiquiatras e estas informações podem ser

encontradas nos arquivos médicos do referido hospital. As idades variaram de 18 a

71 anos. A média de idade (desvio padrão) foi de 42,63 (13,80) anos e a idade do

diagnóstico foi de 27,37 (7,40) anos. Vinte e um pacientes (33,87%) apresentaram

pelo menos um parente em primeiro grau com ESQ e todos os pacientes

apresentaram histórico de pelo menos uma internação em hospital psiquiátrico.

Os pacientes foram divididos nas seguintes subcategorias da ESQ

(AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION, 1994): 30 paranóides e 32 não

paranóides. As informações clínicas dos pacientes estão resumidas na Tabela 2.

26

Tabela 2 – Informações clínicas dos pacientes portadores de ESQ

Caso nº

Idade Idade ao

diagnóstico Sexo

Historia familial

Diagnóstico pelo DSM-IVa

1 18 14 F - Paranóide 2 20 19 F - Paranóide 3 23 20 M + Paranoide 4 23 23 M - Residual 5 24 25 F + Desordem esquizofreniforme 6 24 22 M - Desorganizado 7 25 17 M + Paranóide 8 25 24 M - Residual 9 26 21 M - Paranóide

10 26 19 M - Paranóide 11 26 24 M - Desorganizado 12 27 20 F - Paranóide 13 28 20 F + Paranóide 14 31 19 M - Paranóide 15 32 24 M + Residual 16 33 26 M - Residual 17 33 28 F - Paranóide 18 33 30 F + Desorganizado 19 35 28 M - Residual 20 35 28 M - Paranóide 21 36 19 F - Paranóide 22 36 32 M - Paranóide 23 36 34 M - Residual 24 36 27 M + Paranóide 25 36 36 F - Catatônico 26 37 18 M - Residual 27 38 33 F - Paranóide 28 38 25 F - Paranóide 29 40 34 F + Catatônico 30 40 34 M + Indiferenciado 31 40 22 F + Residual 32 41 33 F + Paranóide 33 42 23 M - Residual 34 44 23 F - Paranóide 35 44 28 M + Paranóide 36 44 25 F + Paranóide 37 46 27 F - Paranóide 38 47 28 F + Residual 39 47 32 M - Paranóide 40 47 28 M + Indiferenciado 41 48 30 F - Desorganizado 42 49 27 F - Paranóide 43 54 25 M - Desorganizado 44 54 26 F + Catatônico 45 54 19 M - Indiferenciado 46 56 30 M - Paranóidee 47 56 34 F - Paranóide 48 56 21 M + Catatônico 49 57 17 F - Paranóide 50 57 36 M - Desorganizado 51 57 48 M + Paranóide

27

52 57 48 M - Catatônico 53 57 33 M + Residual 54 58 35 M - Desorganizado 55 59 29 F - Paranóide 56 59 46 M - Indiferenciado 57 59 37 F - Catatônico 58 62 40 M - Paranóide 59 65 32 F - Residual 60 67 29 F + Desorganizado 61 70 20 F + Residual 62 71 23 F - Paranóide

a Manual de Diagnóstico e Estatística das Perturbações Mentais, Quarta Edição

O Gráfico 2 mostra os números de pacientes estudados de acordo com os

subtipos da ESQ (Gráfico 2).

Gráfico 2 – Número absoluto de pacientes estudados distribuídos por subcategoria da ESQ.

Setenta mulheres voluntárias saudáveis, recrutados na mesma região de

onde os pacientes são oriundos (Estado do Pará), foram utilizados como controles.

Etnicamente, tanto pacientes como controles pertencem a uma população composta

30

8

6

4

13

1

0

5

10

15

20

25

30

28

por três grupos étnicos: ameríndios, africanos e europeus (BATISTA DOS SANTOS

et al., 1999).

3.2 ANÁLISE CITOGENÉTICA CLÁSSICA

Foi coletado 10 mL de sangue periférico por punção venosa utilizando

agulhas e seringas descartáveis previamente heparinizadas do grupo de pacientes e

controles. para realização de de cultura temporária de linfócitos. A cultura foi

realizada em meio HAM-F10, suplementado com estreptomicina (0,01 mg/mL),

penicilina (0,005 mg/mL), soro bovino fetal (Cultilab) e 2% de fitohemaglutinina

(Gibco). As preparações citológicas para a análise dos linfócitos do sangue periférico

humano em metáfase foram obtidas pela técnica de Moorhead et al (1960), com

modificações utilizadas no Laboratório de Citogenética Humana do Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, conforme descrito a seguir:

- Após a coleta, o sangue foi transferido para tubos de ensaio estéreis, para a

sedimentação das hemácias e separação do plasma.

- Foram adicionados 0,5 mL de plasma com linfócitos ressuspendidos, em frascos

contendo meio de cultura completo. Os frascos foram mantidos em estufa à 37 ºC

até o fim do tempo de cultivo (72 horas).

- A cada frasco de cultura foram adicionados 200 μL do antimitogênico colchicina,

120 minutos antes da fixação.

- Após o tempo de cultivo, o material foi transferido para tubos de centrífuga e

centrifugado por 8 minutos a 1000 rotações por minuto (RPM).

29

- O sobrenadante foi desprezado, as células foram ressuspendidas em solução

hipotônica (KCl 0,075 M) à 37 ºC por 20 minutos. Logo após, o material foi

centrifugado por 8 minutos a 1000 RPM.

- O sobrenadante foi desprezado e 5 mL de fixador Carnoy (metanol e ácido acético

na proporção de 3:1) foram adicionados ao sedimento. Foi trocado o fixador mais

duas vezes, deixando apenas o material suficiente para a confecção das lâminas,

onde foi gotejado o material fixado.

A técnica de coloração empregada foi a de obtenção de bandas GTG,

descrita por Scheres (1972) com modificações. Resumidamente, lâminas secas ao

ar foram imersas em solução de tripsina 0,01% diluída em tampão fosfato 0,06 M

durante poucos segundos. A ação da tripsina foi interrompida mergulhando-se a

lâmina em água destilada gelada. Após este procedimento as preparações foram

coradas em Giemsa tampão fosfato 0,006 M (1:30) durante 5 minutos, lavadas em

água corrente e secas ao ar.

A análise das preparações cromossômicas submetidas ao bandamento

GTG foi realizada ao microscópio óptico com objetiva de 100X, pelo software

Bandview EXPO 3.0.1 da Applied Spectral Imaging. Os cromossomos foram

identificados e classificados segundo as recomendações do ISCN de 2009. Foram

analisadas 30 metáfases de cada paciente e controle.

O critério para determinação de clone citogenético utilizado foi o

definido pelo ISCN (1995) que considera duas ou mais metáfases com o mesmo

cromossomo adicional ou anomalia estrutural, e três ou mais metáfases com a perda

de um mesmo cromossomo.

30

3.3 HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE

Foi utilizada sonda centromérica do cromossomo X α-satellite DNA

probe DXZ1 (LPE 0XG, Aquarius™ Probes - Cytocell). A sonda foi utilizada para

determinar o número de cópias do cromossomo X nos pacientes com ESQ e

controles. O método foi realizado conforme o protocolo modificado de Pinkel et al.

(1986). As etapas da hibridação estão descritas de forma detalhada na Tabela 3.

Tabela 3. Etapas da hibridação in situ fluorescente

Etapa Centroméricas

Preparação da lâmina

- Lavagem em 2xSSC, TAa, por 2’.

- Desidratação em etanol 70%, 80% e 95% , TAa, 2’cada.

- Secagem ao ar livre.

Preparação da sonda

- Remoção do -20°C para TAa, uniformizar.

- 10 µL /test, sendo 3µL cada sonda + 7 µL solução de hibridação (Hibrizol).

Desnaturação

- Pré-aquecer lâmina a 37°C por 5’.

- Aplicar 10 µL de sonda, 24 x 24 mm.

- Selar com cimento rubber.

- Amostra e sonda em placa quente à 75°C por 2’.

Hibridação - De 1h até overnight, 37°C, em câmara úmida, sem luz.

Lavagem pós-hibridação

- Remover lamínula, tirar todo cimento.

- Lavar lâmina em 0,25X SSC, 72°C, pH7, 2’sem agitar.

- Lavar lâmina em 2X SSC/0,05% Tween 20, TAa, pH 7, 30” sem agitar.

Contracoloração - Aplicar 10 µL de DAPI/Antifade.

- Aplicar lamínula, manter no escuro por 10’.

a Temperatura ambiente.

A hibridação foi visualizada por microscópio de fluorescência Olympus

BX41 com filtro duplo FITC/TRICT e um sistema captura e análise de imagem

31

Applied Spectral Imaging®. Serão avaliados 200 núcleos por lâmina e os sinais serão

conferidos de acordo com o critério de Hopman et al. (1988).

3.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Para a metodologia do FISH foi utilizado o teste Qui-quadrado. Nesse

teste também foi utilizado para correlacionar a presença de anormalidades

cromossômicas com a historia familial e de internamento hospitalar. A correlação

entre as subcategorias da ESQ e as anormalidades cromossômicas utilizaram a

análise por Simulação de Monte Carlo (SHAM & CURTIS, 1995).

A análise de Mantel-Haenszel foi utilizada para analisar diferenças

entre as pacientes portadoras de ESQ e controles, por faixa etária, para a ocorrência

de aneuploidias do cromossomo X.

3.5 ASPECTOS ÉTICOS

Atendendo à resolução nº 196/96 de 10 de novembro de 1996, do

Conselho Nacional de Saúde, este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa do HCGV, Belém – Pará, Todos os pacientes legalmente capaz assinaram

o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) e os diagnosticados

legalmente incapaz foram assinados por seu responsáveis (em Anexo I).

32

4 RESULTADOS

Através da técnica de análise cromossômica por bandamento GTG, 15

dos 62 pacientes esquizofrênicos (24,2%) apresentaram anormalidades cariotípicas.

Em cinco dos 15 pacientes (33,3%), as alterações cromossômicas encontradas

foram não clonais, estas aberrações ocorreram em apenas uma célula em diferentes

pacientes. Nas células analisadas, foi detectada a presença da trissomia do

cromossomo 21, a perda do cromossomo Y [2], um marcador cromossômico, uma

figura trirradial. As informações clínicas e o cariótipo dos 15 pacientes com

aberrações cromossômicas estão disponíveis na Tabela 4.

33

Tabela 4. Informações clínicas e cariotípicas história familial dos pacientes portadores de ESQ que apresentaram alterações cromossômicas

Código Caso no

(n=62)

Idade (anos)

Idade, diagnóstico

Sexo História Familiala

Diagnóstico pelo DSM-IV

Cariótipob

Mosaicismo cromossômico

1 36 44 25 F + Paranóide mos 45,X[3]/46,XX[27]

2 42 49 27 F - Paranóide mos 45,X[3]/47,XXX[2]/46,XX[25]

3 49 57 17 F - Paranóide mos 45,X[5]/47,XXX[2]/46, XX [23]

4 55 59 29 F - Paranóide mos 45,X[6]/47,XXX[2]/48,XXXX[2]/46XX[20]

5 57 59 37 F - Catatônico mos 45,X[6]/47,XXX[3]/48,XXXX[3]/46,XX[18]

6 59 65 32 F - Residual mos 45, X[9]/47,XXX[3]/46,XX[18]

7 60 67 29 F + Desorganizado mos 45, X[8]/47,XXX[2]/46,XX[20]

8 61 70 20 F + Residual mos 45,X[10]/46,XX[20]

9 62 71 23 F - Paranóide mos 45,X[9]/46,XX[21]

10 51 57 48 M + Paranóide 46, XY,inv(9)(p11q13)[3]/46XY[27]

Aberrações cromossômicas não clonais

11 33 42 23 M - Residual trirradial figure [1]/46, XY [29]

12 35 44 28 M + Paranóide 45, X [1]/46, XY [29]

13 47 56 34 F - Paranóide 47, XX, + mar [1]/46, XX [29]

14 50 57 36 M - Desorganizado 47, XY, +21[1]/46, XY [29]

15 58 62 40 M - Paranóide 45, X [1]/46, XY [29] a Pelo menos um parente em primeiro grau portador de ESQ. b Os números entre colchetes representam o número de células do cariótipo em questão.

34

Os pacientes deste estudo foram divididos nas cinco subcategorias da

ESQ segundo o DSM-IV (AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION, 1994). A

análise por simulação de Monte Carlo (SHAM & CURTIS, 1995) demonstrou não

haver correlação entre as subcategorias da ESQ e a presença de anormalidades

cromossômicas (p>0,05). Adicionalmente, através do teste do Qui-quadrado, não foi

encontrado uma correlação estatisticamente significativa entre a presença de

historia familial dos pacientes e de internação em hospital psiquiátrico com a

incidência de aberrações cromossômicas (p>0,05).

A inversão pericêntrica clonal do cromossomo 9 foi observada em um

paciente do sexo masculino (1,62%) (caso nº 51), provavelmente o ponto de quebra

esta localizado entre as bandas p11 e q13. Esta alteração não foi detectada em

nenhum dos controles. Com exceção da inv(9)(p11q13), não foi encontrada

nenhuma outra alteração cromossômica clonal nos autossomos.

Mosaicismo com aneuploidia do cromossomo X foi observado, por

bandamento GTG e pela técnica de FISH, em nove das 29 pacientes com ESQ do

sexo feminino (31%) fazendo dessa alteração a aberração cromossômica mais

freqüente (Tabela 4).

Todas as nove pacientes apresentaram hipoploidia do cromossomo X

(45,X), enquanto seis amostras também demonstraram células com polissomia do

cromossomo X (47,XXX e 48,XXXX) (Tabela 4). Mosaicos de aneuploidias dos

cromossomos sexuais não foram observados em pacientes portadores de ESQ do

sexo masculino. Quando a aneuploidia do cromossomo X se apresentava em menos

de 5% das células, não foi considerada como uma alteração clonal, visto que a

aneuploidia pode ter sido causada por artefato de técnica.

35

As mesmas pacientes (casos nº 36, 42, 49, 55, 57, 59-62)

demonstraram mosaicismo do cromossomo X para as duas técnicas utilizadas neste

estudo, bandamento GTG e FISH. Embora a técnica de FISH seja mais sensível

para detectar aneuploidias cromossômicas, nenhum dos pacientes apresentou

aneuploidia do cromossomo X somente pela técnica de FISH. Por esta técnica foi

observada uma variação da perda do cromossomo X entre 8,0% (caso nº 59) e 16 %

das células (caso nº 62). O ganho de um cromossomo X foi observado entre 9,0%

(caso nº 42) e 14,5 % das células (caso nº 60) e a tetrassomia do cromossomo X,

entre 7,5% (caso nº 55) e 11,0% das células (caso nº 57).

A Tabela 5 apresenta a análise por FISH nas células do sangue

periférico das nove pacientes que apresentaram mosaicismo para o cromossomo X.

Tabela 5. Número de cromossomos X (sinais fluorescentes) encontrado nas pacientes com mosaicismo cromossômico

Código Caso nº 1 2 3 4 ≥5

1 36 20 (10,0%) 180 (90,0%)

2 42 18 (9,0%) 162 (81,0%) 18 (9,0%) 2 (1,0%)

3 49 17 (8,5%) 160 (80,0%) 23 (11,5%)

4 55 26 (13,0%) 139 (69,5%) 19 (9,5%) 15 (7,5%) 1 (0,5%)

5 57 24 (12,0%) 130 (65,0%) 24 (12,0%) 22(11,0%)

6 59 19 (9,5%) 154 (77,0%) 27 (13,5%)

7 60 16 (8,0%) 155 (77,5%) 29 (14,5%)

8 61 17 (8,5%) 183 (91,5%)

9 62 32 (16,0%) 168 (84,0%)

Como controle negativo para a análise do FISH, foram analisadas 70

mulheres divididas em sete grupos, de 10 mulheres cada, correspondentes a

diferentes faixas etárias das pacientes com ESQ analisadas. Cada faixa etária

variava de dez em dez anos. Não foram analisados controles masculinos, visto que

36

pela análise citogenética convencional nenhum dos pacientes do sexo masculino

apresentou aneuploidias para o cromossomo X.

As mulheres controle, além de não serem portadoras de ESQ, não

apresentavam nenhum tipo de síndrome ou neoplasia (diagnosticada na época da

coleta) e nem faziam uso de fármacos ou agentes externos que, segundo a

literatura, possam vir a induzir a formação de aneuploidias (como por exemplo,

agentes quimioterápicos e o fumo). A Tabela 6 apresenta a correlação, da análise

por FISH, entre o mosaicismo do cromossomo X e a idade das pacientes e das

mulheres controle no dia da coleta do sangue periférico.

O mosaicismo para o cromossomo X foi inicialmente detectado nas

pacientes portadoras de ESQ e controles com faixa etária entre 40 e 49 anos, na

faixa dos 50 anos a incidência desse mosaicismo se apresentou três vezes maior

(Tabela 6).

A análise de Mantel-Haenszel entre as pacientes portadoras de ESQ e

controles não demonstrou diferença significativa, por faixa etária, para a ocorrência

da perda do cromossomo X e da perda e do ganho do cromossomo X. A análise do

total de mosaicismos cromossômicos do X entre pacientes e controles também não

apresentou diferença significativa (p>0.05) (Tabela 6). Nenhum dos grupos

estudados apresentou indivíduos com mosaicismo de ganho cromossômico como

única alteração.

A Figura 2 apresenta núcleos interfásicos e metáfase, hibridados com

sonda centromêrica do cromossomo X, de uma paciente com ESQ (caso nº 62) e um

caso controle.

37

Figura 2. FISH com sonda centromérica para o cromossomo X. Cada sinal verde corresponde a um centrômero. A) Núcleos interfásicos de uma paciente com ESQ (caso nº 62). B) Núcleos interfásicos e metáfase de um caso controle.

O resultado do teste do Qui-quadrado para o total de células

analisadas demonstrou que a incidência da perda do cromossomo X em mulheres

portadoras de ESQ não é diferente estatisticamente das pacientes japonesas

analisadas por Toyota et al. (2001) (p>0,05). Este teste estatístico também

demonstrou que a incidência de monossomia do cromossomo X nas voluntárias

controle deste estudo não diferenciaram das mulheres controles japonesas

(TOYOTA et al., 2001) e das mulheres controle de origem européia reportada por

Guttenbach et al, (1995) (p>0,05) (Tabela 6).

38

Tabela 6. Correlação entre mosaicismo do cromossomo X e a idade da coleta das pacientes com ESQ e controles

Idade da coleta

No de mulheres

No de indivíduos com mosaicismo do X (%)a No de células com perda do X/ No total de células examinadas (%)b

Somente perda do X

Somente ganho do X

Perda + ganho do X

Total Este estudo Toyota et at. (1995)

Guttenbach et al. (1995)

Pacientes 10-19 1 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0/200 (0) 0/30 (0) 20-28 4 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0/800 (0) 0/210 (0) 30-39 6 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0/1200 (0) 0/420 (0) 40-49 9 1 (11) 0 (0) 1 (11) 2 (22) 38/1800 (2,1) 31/1120 (2,8) 50-59 5 0 (0) 0 (0) 3 (60) 3 (60) 67/1000 (6,7) 10/630 (1,6) 60 69 2 0 (0) 0 (0) 2 (100) 2(100) 35/400 (8,8) 18/400 (4,5) 70-71 2 2 (100) 0 (0) 0 (0) 2 (100) 49/400 (12,5) 30/300 (10) Total 29 3 (10) 0 (0) 6 (21) 9 (31) 189/5800 (3,3) 89/3110 (2,9) Controles 10-19 10 0 (0) 0(0) 0(0) 0(0) 0/2000 (0) 0/60 (0) 217/9000 (2,4) 20-29 10 0 (0) 0(0) 0(0) 0(0) 0/2000 (0) 14/950 (1,5) 284/13,000 (2,2) 30-39 10 0(0) 0(0) 0(0) 0 (0) 0/2000 (0) 16/560 (2,9) 337/11,000 (3,1) 40-49 10 1 (10) 0(0) 2(20) 3(30) 29/2000 (1,5) 43/1070 (4,0) 251/9000 (2,8) 50-59 10 3 (30) 0(0) 1(10) 4(40) 113/2000 (5,7) 56/1030 (5,4) 346/9000 (3,8) 60 69 10 5 (50) 0(0) 2(20) 7(70) 163/2000 (8,2) 10/190 (5,2) 431/10,000 (4,3) 70-77 10 6(60) 0(0) 1(10) 7(70) 259/2000 (13,0) 7/230 (3,0) 475/11,000 (4,3) Total 70 13(19) 0(0) 6(9) 19 (27) 385/14000 (2,8) 146/4090 (3,6) 2341/72,000 (3,3) a Comparação com mulheres da mesma faixa etária. b Proporção de células com perda do X em relação ao total de células analisadas de todos os indivíduos da mesma faixa etária.

39

5 DISCUSSÃO

No presente estudo, os pacientes analisados apresentaram dois

tipos de anormalidades cromossômicas clonais, a inv(9)(p11q13) e aneuploidias

do cromossomo X. Estes achados cromossômicos corroboram estudos prévios

(DELISI et al., 1988; KUNIGI et al., 1999; TOYOTA et al., 2001; DEMIRHAN &

TASTEMIR, 2003). Outras anomalias cromossômicas descritas em pacientes

esquizofrênicos não foram encontradas em linfócitos dos pacientes desse estudo,

provavelmente devido às limitações da técnica de citogenética clássica, tais

como: trissomia do cromossomo 8 e do 21, translocações (1;7) e (18;21),

inversões do cromossomo 4, deleções 1q, 5q, 7q, 11q e 22q (ONG &

ROBERTSON, 1995; SCHWAB & WILDENAUER, 1999; BASSET et al., 2000;

MILLAR et al., 2000; ARINAMI et al., 2001; DEMIRHAN & TASTEMIR, 2003;

PALMOUR et al., 1994). A análise citogenética convencional é uma das técnicas

mais simples e populares. Contudo, este ensaio se restringe a análise de células

metafásicas e com um moderado potencial mitogênico (YUROV et al., 2008).

Neste estudo foram analisados 62 pacientes portadores de ESQ e

70 voluntários controles. Este número é adequado, visto que somente existem

três relatos da literatura, utilizando bandamento GTG, com número amostral

superior ao nosso (KUNUGI et al., 1999; TOYOTA et al., 2001; DEMIRHAN &

TASTEMIR, 2003). Em relação à técnica de FISH em pacientes com ESQ, a

literatura somente apresenta três trabalhos, com número amostral inferior ao

apresentado neste plano de qualificação (BASSET et al., 1992; YUROV et al.,

2001; YUROV et al., 2008). Além disso, os pacientes foram comparados com

controles pareados por faixas etárias, abordagem até então descrita em apenas

um estudo prévio (TOYOTA et al., 2001).

40

Além da inv (9)(p11q13), nenhuma outra anormalidade citogenética

clonal pôde ser encontrada nos cromossomos autossômicos. Estudos indicam

que a região pericêntrica do cromossomo 9 pode ser etiologicamente ligada a

ESQ (KUNUGI et al., 1999; MIYAOKA et al., 1999). Contudo, sendo a variação

mais comum na população geral, a inv(9) não é associada com um fenótipo

específico; além disso é geralmente considerada uma variante normal ao invés de

um cariótipo anormal na ESQ (GARDNER & SUTHERLAND, 1989; YOSHIDA et

al., 1997). Neste estudo, a freqüência da inv(9) foi de 1,61% e não diferiu

significativamente (p>0,05) das encontradas em populações não esquizofrênicas

na Europa (0,85%) (SERRA et al, 1990), Japão (1,3%) (YAMADA, 1992) e Taiwan

(1.2%) (KO et AL., 1992).

5.1 ANEUPLOIDIAS DO CROMOSSOMO X EM ESQ

A alteração mais freqüente encontrada neste estudo foi o

mosaicismo do cromossomo X, presente em 31% das mulheres portadoras de

ESQ. A técnica de FISH, considerada um método útil para a análise de

aberrações cromossômicas numéricas, quando usada com sonda marcada para

genes específicos, permite a detecção de rearranjos genéticos e aumento ou

diminuição do número de cópias. Essa metodologia aplicada a células em

intérfase é um procedimento extremamente útil no estudo de patologias, pois evita

as dificuldades de preparações cromossômicas de alta qualidade e problemas de

seleção in vitro, revelando, dessa forma, alterações in vivo (CALCAGNO et al.,

2005).

Nossos resultados evidenciaram uma freqüência mais alta de ganho

do cromossomo X nas mulheres portadoras de ESQ do que nas mulheres do

grupo controle, sendo este ganho maior com a idade. MOON et al. (2006) também

41

relataram o ganho parcial Xq23 como alteração mais freqüente em linfócitos de 30

pacientes com ESQ (52%), analisados por hibridação genômica comparativa

baseada em arrays (array-CGH) – uma abordagem de alta resolução e

mapeamento direto de alterações da seqüência genômica. A região Xq23 também

demonstrou perda e ganho no array-CGH, sendo esta localização a mais alta

frequencia aberrante global. MOON et al. (2006) sugeriram a região Xq23

candidata na patogênese da ESQ. Desse modo, nossos achados corroboram os

de Moon et al. (2006).

Muitos dos genes ao longo do cromossomo X são expressos no

cérebro. Alterações quantitativas em qualquer um desses genes podem impedir o

desenvolvimento e função do cérebro normal e são causas potenciais de ESQ

(Demirhan & Tastemir, 2003). WARWICK et al. (2003) e CROW (2006) sugeriram

que a ESQ pode ser atribuída a uma lateralização cerebral anormal,

possivelmente envolvendo expressão de um gene dominante do cromossomo X.

YUROV et al. (2001), em um estudo preliminar de FISH, relataram trissomia do

cromossomo X em 2 de 6 amostras de cérebro de pacientes com ESQ (3-4% dos

neurônios analisados), sugerindo um possível envolvimento de mosaicismo do

cromossomo X na patogênese dessa doença. Além disso, IOUROV et al. (2006),

em análises de cérebro humano normal, demonstraram que aproximadamente

10% dos neurônios e das células da glia são aneuplóides. Esses autores sugerem

que o aumento da taxa de aneuploidia caracteriza o desenvolvimento de afecções

cerebrais. Disfunção neuronal e glial causada por instabilidade genética

(aneuploidia) pode resultar em comportamento anormal em adultos. Assim,

instabilidades genéticas mediadas por fatores genéticos e/ou ambientais podem

42

fornecer pistas para a compreensão dos mecanismos moleculares das principais

doenças psiquiátricas (YUROV et al., 2008).

Em nossa amostra, nenhum dos pacientes do sexo masculino

demonstrou mosaicismo por análise citogenética convencional. Contudo, Kunugi

et al. (1999) relataram a incidência de XXY em 1,6% de 122 homens.

Posteriormente, WARWICK et al. (2003) descreveram uma simetria cerebral

anormal em um paciente com síndrome de Klinefelter (XXY). Estes achados

fornecem evidências adicionais para heterogeneidade citogenética na ESQ.

É sabido que as aneuploidias dos cromossomos sexuais aumentam

com a idade em culturas de linfócitos periféricos, sendo a hipoploidia mais comum

que a hiperploidia (STONE & SANDBERG, 1995). No presente estudo, o

cromossomo X de mulheres com ESQ foi analisado por FISH levando-se em

consideração a idade, em comparação com controles pareados. Embora a faixa

etária de 40 a 49 anos tenha demonstrado uma diferença estatisticamente

significante entre mulheres esquizofrênicas e normais (p<0,05), outros grupos de

faixa etária quando pareados demonstraram que a incidência de perda do

cromossomo X pela idade não difere significativamente entre os grupos de

pacientes e controles (p>0,05). Toyota et al. (2001) também demonstraram que a

incidência estratificada por idade de perda do cromossomo X em mulheres não foi

significativamente diferente entre grupos de pacientes e controles (p>0,05). Desde

modo, nossos resultados corroboram esses achados, sugerindo que a perda do

cromossomo X não está relacionada com a ESQ, especialmente em indivíduos

acima dos 50 anos.

GUTTENBACH et al. (1995) analisaram 1.000 núcleos interfásicos

de leucócitos de 90 mulheres caucasóides saudáveis por FISH, para avaliar a

43

freqüência de perda do cromossomo X e sua dependência com a idade. Esses

autores descreveram uma correlação entre a perda do cromossomo X e a idade

em mulheres na faixa etária dos 52-91 anos. Nossos resultados demonstram que

a perda do cromossomo X se inicia a partir dos 40 anos tanto em mulheres com

ESQ quanto nas do grupo controle. Dessa forma, nossos achados são

consistentes com os de GUTTENBACH et al. (1995), sugerindo que um aumento

na perda do cromossomo X está associado com o processo de envelhecimento.

Em resumo, os resultados do presente estudo sugerem que as

alterações de perda do cromossomo X observada nos linfócitos periféricos de

pacientes portadores de ESQ são inerentes ao envelhecimento celular, enquanto

que o ganho do cromossomo X está relacionado à etiologia da doença.

44

6. CONCLUSÃO

As doenças mentais são uma das principais causas de segregação

familiar, dentre essas a ESQ é uma das mais evidenciada devido suas

perspectivas de cura, e a enorme sobrecarga social e ocupacional que ela (ESQ)

acarreta sobre os pacientes e familiares, e são essas características singulares

que fazem com esta patologia ESQ seja uma das doenças mentais mais intrigante

investigadas no mundo hoje.

Ao longo de nossa vivência na clinica psiquiátrica do Hospital de

Clinicas Gaspar Viana, observamos que não somente a modalidade terapêutica

farmacológica e de intervenções direta ao pacientes psiquiátricos deve ser

instituída, mas, varias alternativas de tratamentos incluindo a ressocialização dos

pacientes egressos dessas clinicas.

Nosso objetivo de identificar alterações cromossômicas nestes

pacientes surgiu da curiosidade de verificar se essas alterações poderiam ser um

sinal laboratorial conclusivo para o diagnóstico dessa patologia, visto que, as

únicas modalidades diagnósticas são clínicas, e as bibliografias relatam que não

existe um sinal e/ou sintoma patognomônico para identificar um paciente

esquizofrênico.

No presente estudo não foi observado nenhuma alteração clonal de

cromossomo sexual em pacientes do sexo masculino, enquanto que, essas

alterações estão presentes em 31% das mulheres portadoras de ESQ, o que nos

leva a concluir que esta alteração esta intimamente relacionada a etiologia desta

patologia em mulheres

Uma vez concluído que as aneuploidias estão presentes em grande

45

porcentagem em pacientes portadoras de ESQ e que essas hiperploidia do

cromossomo X, podem aumentar a expressão de genes dominantes do

cromossomo em questão ocasionando assim a lateralização assimétrica do

cérebro humano e que esta anormalidade já foi sugerida como uma provável

etiologia da ESQ, este achado em nosso estudo é de grande valia para um

provável diagnóstico citogenético para a ESQ.

Apesar de os números de internações com diagnósticos de ESQ,

terem tido uma considerável regressão no período de 2005 a 2008, 130 à 53,

nosso numero amostral (n = 62), corroboram com os achados em estudos

prévios, e isso nos trouxe uma grata satisfação em realizar este estudo, e isso

nos motivou a prosseguir em nossa jornada científica na área da psiquiatria.

46

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52

ANEXOS

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO – TCLE

PROJETO: Estudo Citogenético de Pacientes Portadores de Esquizofrenia no Estado do Pará

A Universidade Federal do Pará está desenvolvendo uma pesquisa que permitirá avaliar as

possíveis alterações genéticas em pacientes acometidos de Esquizofrenia (ESQ), internados na

Clinica Psiquiátrica da Fundação Hospital de Clinicas Gaspar Viana no Estado do Pará, Esta

pesquisa será realizada pelo monitoramento dos pacientes através da identificação de possíveis

alterações genéticas em amostra de sangue periférico.

Você está sendo admitido(a) nesta pesquisa, e para tal, há a necessidade da remoção de material

biológico. Parte do material retirado será encaminhado para exames laboratoriais, necessários para a

investigação. O restante do material não utilizado será armazenado para novos exames, se necessário.

A obtenção da amostra de sangue para a pesquisa não implicará em riscos adicionais para sua saúde.

A amostra de material biológico será identificada no laboratório por um código que preserva sua privacidade

e identidade. A inclusão dos resultados em publicação científica garantirá o anonimato do voluntário.

É necessário esclarecê-lo (a) que não existem benefícios ou direitos financeiros a receber sobre os

eventuais resultados decorrentes da pesquisa. Se você não concordar em doar o material para pesquisa, sua

decisão não influenciará, de nenhum modo, no seu atendimento ou tratamento.

Caso você tenha alguma dúvida sobre este documento ou em relação à pesquisa, por gentileza, entre

em contato com a Prof. Rommel Burbano, pelo telefone 3211-1727 ou 8836 4667.

Uma cópia deste documento será arquivada em seu prontuário e, se desejar, uma cópia lhe será

fornecida.

Leopoldo Silva de Moraes Rommel Mario Rodriguez Burbano Eleônidas Moura Lima

Pesquisador Orientador Co-orientador

Trav. Guerra passos, 1093 – 8103-1406 Trav. São Pedro 638, apto 1203, Fone: 8835-4667. Campus Reis Velloso.

Av. São Sebatião Reis Veloso, Parnaiba, PI

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Declaro que li as informações acima sobre a pesquisa, que me sinto perfeitamente

esclarecido sobre o conteúdo da mesma, assim como seus riscos e benefícios. Declaro ainda que,

por minha livre vontade, aceito participar da pesquisa cooperando com a coleta de material para

exame.

Belém, _____/_____/______

_______________________________ _________________________________

Sujeito que colheu o TCLE Sujeito da pesquisa ou do responsável

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

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