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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
Eliana Isac
Efeito in vitro da nitazoxanida e ABZSO no metabolismo de
cisticerco de Taenia crassiceps
GOIÂNIA
2016
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Eliana Isac
X
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Eliana Isac
Eliana Isac
Efeito in vitro da nitazoxanida e ABZSO no metabolismo de
cisticerco de Taenia crassiceps
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde
Pública da Universidade Federal de Goiás, para
obtenção do Título de Doutor em Medicina
Tropical e Saúde Pública.
Orientadora: Prof.ª Dra. Marina Clare Vinaud
GOIÂNIA
2016
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Eliana Isac
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Eliana Isac
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Eliana Isac
Dedico este trabalho a minha
querida filha Bruna, ao meu filho
do coração Éder, e a minha tia
Maria que já não está mais entre
nós.
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Eliana Isac
AGRADECIMENTOS
Agradeço a DEUS por ter chegado até aqui.
A minha orientadora Marina Clare Vinaud pela confiança depositada em mim, e
principalmente, pela oportunidade que me deu para que pudesse vencer mais essa etapa.
A Carolina Miguel Fraga pela disponibilidade, atenção e paciência no
acompanhamento de toda a parte experimental e estruturação deste trabalho.
A mestre Guaraciara de Andrade Picanço pela valiosa ajuda e estímulo durante
todo o experimento.
A Nayana Lima pelo carinho, amizade e pela colaboração no desenvolmento deste
trabalho.
A Tatiane Luiza da Costa pela contribuição na realização das análises
bioquímicas.
A todos os colegas e professores do Laboratório de Estudo da Relação Parasito-
Hospedeiro (LAERPH) que contribuíram direta ou indiretamente para a realização desta
tese.
A minha amiga Sandra Vasconcelos que sempre me incentivou e torceu pela
minha vitória.
Aos professores e técnicos do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical
do IPTSP-UFG.
A todos vocês, o meu muito obrigada.
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Eliana Isac
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Eliana Isac
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS .................................................................................................... vi
SUMÁRIO ..................................................................................................................... viii
TABELAS, FIGURAS, APÊNDICES E ANEXOS .......................................................... x
Lista de figuras ................................................................................................................. x
Lista de figuras do artigo 1 .............................................................................................. x
Lista de figuras do artigo 2 ............................................................................................. xi
SIMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ................................................................ xiv
RESUMO ........................................................................................................................ xv
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1
1.1-Taenia crassiceps ....................................................................................................... 1
1.2- Ocorrência de T. crassiceps em animais ................................................................... 3
1.3-Patogenia da cisticercose por T. crassiceps ................................................................ 4
1.4. Metabolismo .............................................................................................................. 5
1.4.1-Cestodeo adulto ....................................................................................................... 5
1.4.2- Cisticerco de Taenia crassiceps ........................................................................... 10
1.5-Fármacos utilizados no tratamento da cisticercose .................................................. 13
1.5.1-Praziquantel ........................................................................................................... 13
1.5.2-Albendazol ............................................................................................................ 14
1.5.3 Niclosamida ........................................................................................................... 16
1.5.4 Tamoxifeno ............................................................................................................ 17
1.5.5-Nitazoxanida.......................................................................................................... 17
2. JUSTIFICATIVA ..................................................................................................... 22
3. OBJETIVOS ............................................................................................................ 24
3.1-Objetivo Geral: ......................................................................................................... 24
ix
Eliana Isac
3.2-Objetivos específicos: .............................................................................................. 24
4. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 25
4.1-Manutenção de Taenia crassiceps ............................................................................ 25
4.2-Obtenção de cisticerco de T. crassiceps ................................................................... 25
4.3-Exposição de cisticerco de T. crassiceps a nitazoxanida ......................................... 26
4.4-Análise dos ácidos orgânicos ................................................................................... 27
4.4.1-Extração dos ácidos orgânicos .............................................................................. 27
4.4.2-Análise por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)............................... 28
4.5-Dosagens bioquímicas .............................................................................................. 28
4.6-Análises estatísticas .................................................................................................. 28
5. ARTIGOS ................................................................................................................ 29
6. CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................... 77
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 78
8. ANEXOS ............................................................................................................... 101
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Eliana Isac
TABELAS, FIGURAS, APÊNDICES E ANEXOS
Lista de figuras
Figura 1: Ciclo biológico de Taenia crassiceps. ................................................................ 2
Figura 2: Via de degradação da glicose em anaerobiose. .................................................. 8
Figura 3: Catabolismos de aminoácidos em hepatócitos de vertebrados. ......................... 9
Figura 4: Via de degradação da glicose pelo cisticerco de T. crassiceps ........................ 12
Figura 5: Estrutura química da nitazoxanida. .................................................................. 18
Lista de figuras do artigo 1
Figura 1: Glucose concentrations in the culture medium and in the cysticerci extract
from groups in vitro treated with different concentrations of nitazoxanide and
albendazole.CM: concentrations detected in the culture medium analysis; CYST:
concentrations detected in the cysticerci extrac; ctl cm: RPMI culture medium without
cysticerci; ctl cyst: cysticerci without drugs exposure; ntz 1.2: cysticerci exposed to 1.2
µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.6: cysticerci exposed to 0.6 µg/mL of nitazoxanide; ntz
0.3 cysticerci exposed to 0.3 µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.15: cysticerci exposed to
0.15 µg/mL of nitazoxanide; abz 1.2: cysticerci exposed to 1.2 µg/mL of albendazole;
abz 0.6: cysticerci exposed to 0.6 µg/mL of albendazole; abz 0.3: cysticerci exposed to
0.3 µg/mL of albendazole; abz 0.15: cysticerci exposed to 0.15 µg/mL of albendazole. *
statistical difference when compared to the control group .............................................. 36
Figura 2: Pyruvate concentrations in the culture medium and in the cysticerci extract
from groups in vitro treated with different concentrations of nitazoxanide and
albendazole.CM: concentrations detected in the culture medium analysis; CYST:
concentrations detected in the cysticerci extrac; ctl cyst: cysticerci without drugs
exposure; ntz 1.2: cysticerci exposed to 1.2 µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.6: cysticerci
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Eliana Isac
exposed to 0.6 µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.3 cysticerci exposed to 0.3 µg/mL of
nitazoxanide; ntz 0.15: cysticerci exposed to 0.15 µg/mL of nitazoxanide; abz 1.2:
cysticerci exposed to 1.2 µg/mL of albendazole; abz 0.6: cysticerci exposed to 0.6
µg/mL of albendazole; abz 0.3: cysticerci exposed to 0.3 µg/mL of albendazole; abz
0.15: cysticerci exposed to 0.15 µg/mL of albendazole. * statistical difference when
compared to the control group. ........................................................................................ 37
Figura 3: Lactate concentrations in the culture medium and in the cysticerci extract of
cysticerci exposed to different concentrations of albendazole and nitazoxanide. CM:
concentrations detected in the culture medium analysis; CYST: concentrations detected
in the cysticerci extrac; ctl cm: RPMI culture medium without cysticerci; ctl cyst:
cysticerci without drugs exposure; ntz 1.2: cysticerci exposed to 1.2 µg/mL of
nitazoxanide; ntz 0.6: cysticerci exposed to 0.6 µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.3
cysticerci exposed to 0.3 µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.15: cysticerci exposed to 0.15
µg/mL of nitazoxanide; abz 1.2: cysticerci exposed to 1.2 µg/mL of albendazole; abz
0.6: cysticerci exposed to 0.6 µg/mL of albendazole; abz 0.3: cysticerci exposed to 0.3
µg/mL of albendazole; abz 0.15: cysticerci exposed to 0.15 µg/mL of albendazole. *
statistical difference when compared to the control group. ............................................. 38
Lista de figuras do artigo 2
Figura 1. Concentração média de citrato detectado no meio de cultura (MC) e no
extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido. ................................................. 55
Figura 2. Concentração média de α-cetoglutarato detectado no meio de cultura (MC) e
no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido. ................................................. 56
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Eliana Isac
Figura 3. Concentração média de succinato detectado no meio de cultura (MC) e no
extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido. ................................................. 56
Figura 4. Concentração média de fumarato detectado no meio de cultura (MC) e no
extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido. ................................................. 58
Figura 5. Concentração média de malato detectado no meio de cultura (MC) e no
extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido. ................................................. 58
Figura 6. Concentração média de oxaloacetato detectado no meio de cultura (MC) e no
extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido. ................................................. 59
Figura 7. Concentração média de acetato detectado no meio de cultura (MC) e no
extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido. ................................................. 60
Figura 8. Concentração média de beta-hidroxibutirato detectado no meio de cultura
(MC) e no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a
diferentes concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido. ................................ 61
Figura 9. Concentração média de propionato detectado no meio de cultura (MC) e no
extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido. ................................................. 62
Figura 10. Concentração média de ureia detectada no meio de cultura (MC) e no
extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido. ................................................. 63
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Eliana Isac
Figura 11. Concentração média de creatinina detectada no meio de cultura (MC) e no
extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido. ................................................. 63
Lista de anexos
O parecer do Comite de Ética no Uso de Animais (CEUA) .......................................... 101
Artigo ............................................................................................................................. 102
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Eliana Isac
SIMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
µg: micrograma
µL: microlitros
ABZSO: sulfóxido de albendazol
CLAE: cromatografia de alta eficiência
CoEp/UFG: Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Goiás
H2SO4: ácido sulfúrico
HCL: ácido clorídrico
IPTSP: Instituto de Patologia Tropical Saúde Pública
L: litro
LDH: lactato desidrogenase
mg: miligrama
mL: mililitro
NTZ: nitazoxanida
ORF: original red fox
EC:extrato de cisticerco
MC: meio de cultura
OMS: organização mundial de saúde
FDA: Foudation drug administration
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Eliana Isac
RESUMO
A cisticercose humana por cisticercos de Taenia solium é uma doença tropical
negligenciada e grave problema em saúde pública. Os fármacos de escolha para o seu
tratamento são o albendazol e praziquantel. No entanto a utilização maciça e repetida
desses tem levado a casos de resistência parasitária, e consequentemente a uma
necessidade do desenvolvimento de novos fármacos. A cisticercose por Taenia
crassiceps embora seja considerada rara é uma zoonose de risco principalmente em
pacientes imunocomprometidos. A nitazoxanida (NTZ) vem demonstrando uma
excelente atividade no tratamento de parasitoses gastrointestinais, porém ainda não foi
testada contra parasitoses teciduais. O objetivo do estudo foi avaliar a influência in vitro
da NTZ e do albendazol sulfoxido (ABZSO) em vias do metabolismo energético de
cisticerco de T. crassiceps, cepa ORF. Os cisticercos foram retirados da cavidade
abdominal de camundongos BALB/c fêmeas com 30 dias de infecção. Cisticercos
estádio larval foram semeados em placas de microcultivo de seis poços, em meio RPMI
suplementado. Estes cisticercos foram expostos, por 24 horas, a 37ºC, às concentrações
1,2 μg/mL, 0,6 μg/mL, 0,3 μg/mL, 0,15 μg/mL, de NTZ ou ABDZSO diluídos em
dimetil sulfóxido (DMSO). Os grupos controles foram constituídos por um grupo de
cisticercos sem fármacos e outro com DMSO. Após 24 horas de cultivo, separou-se os
cisticercos do meio de cultura e foram congelados em nitrogênio líquido. Foram
realizadas análises do extrato do cisticerco (EC) e do meio de cultura (MC) por meio de
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, e espectrofotometria. Foi possível observar
xvi
Eliana Isac
uma diminuição na captação de glicose e a indução da gliconeogenese nos grupos
tratados com NTZ devido as concentrações de glicose e lactato detectadas no MC e EC.
Houve um aumento significativo nas concentrações de piruvato nos grupos tratados com
ABZSO. Houve uma diminuição significativa nas concentrações de citrato detectadas
nos grupos tratados com NTZ. Foi possível observar que o grupo controle e os grupos
tratados com NTZ realizaram o ciclo do ácido cítrico de forma tradicional devido a
detecção de alfa-cetoglutarato, enquanto que os grupos tratados com ABZSO realizaram
a via da fumarato redutase devido a não detecção de alfa-cetoglutarato. Não foi
detectado o acetato nos grupos tratados com NTZ fato que confirma o bloqueio da
enzima piruvato oxidoredutase (PFOR) pela ação do fármaco. Foi possível observar
um aumento na oxidação de ácidos graxos devido a um aumento na concentração de
beta-hidroxibutirato e propionato nos grupos tratados. Conclui-se que houve uma
acidose metabólica induzida pela ação da NTZ; os fármacos induziram a utilização de
vias alternativas de produção de acetil-coA, como a oxidação de ácidos graxos e o
catabolismo de proteínas.
Palavras chaves: Taenia crassiceps, nitazoxanida, albendazol sulfóxido, metabolismo
energético.
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Eliana Isac
ABSTRACT
Human cysticercosis due to Taenia solium cysticerci is a neglected tropical disease and
a severe public health issue. The drugs of choice to treat it are albendazole and
praziquantel. However mass drug administration and repetitive use of these drugs have
lead to parasitary resistance and, consequently, the need of new drugs. Cysticercosis by
Taenia crassiceps is rare but a risk zoonosis especially in immunocompromised
patients. Nitazoxanide (NTZ) is a antiparasitary drug that have been demonstrating a
satisfactory activity against intestinal parasites but has not been tested against tissue
ones. The aim of this study was to evaluate the in vitro influence of NTZ and
albendazole sulfoxide (ABZSO) in the energetic metabolism of T. crassiceps cysticerci,
ORF strain. The cysticerci were removed from the intraperitoneal cavity of BALB/c
mice with 30 days of infection. The cysticerci were harvested in 6 well microculture
plates with RPMI culture medium. The cysticerci were exposed to 1.2; 0.6; 0.3; or 0.15
μg/mL of NTZ or ABDZSO, for 24 hours, at 37ºC. The drugs were diluted in dimethyl
sulfoxide (DMSO). Two control groups were performed, one with the cysticerci without
drugs, and the other with DMSO. After 24h, the cysticerci were separated from the
culture medium and frozen with liquid nitrogen. Analysis of the culture medium (CM)
and the cysticerci extract (CE) were perfomed through high performance
chromatography and spectrophotometry. It was possible to observe a decrease in the
glucose uptake and an induction of gluconeogenesis in the NTZ treated groups due to
the concentrations of glucose and lactate detected in the CM and CE. There was a
significative increase in the pyruvate concentrations in the ABZSO treated groups.
There was a significant decrease in the citrate concentrations in the NTZ treated groups.
The control group and the NTZ treated groups performed the tricarboxylic acid cycle in
its traditional form due to the detection of alpha-ketoglutarate while the ABZSO treated
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Eliana Isac
groups performed the fumarate reductase pathway due to the non detection of this
organic acid. In the NTZ treated groups acetate was not detected which
fact that confirms the blocking of the oxidoreductase enzyme pyruvate (PFOR) by drug
action. There was an increase in the fatty acids oxidation due to an increase in the beta-
hydroxybutyrate and propionate concentrations in the treated groups. It is possible to
conclude that there was a metabolic acidosis induced by NTZ; the drugs also induced
alternative energy production pathways in order to produce acetyl-coA such as fatty
acids oxidation and proteins catabolism.
Key words: Taenia crassiceps, nitazoxanide, albendazole sulfoxide, energetic
metabolismo.
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Eliana Isac
1. INTRODUÇÃO
1.1-Taenia crassiceps
Taenia crassiceps (Zeder, 1800) Rudolphi, 1810 é um cestodeo representante da
família Taenidae, ordem Cyclophyllidea. Os adultos medem entre 7 e 14 cm,
apresentam o corpo segmentado, formado por um conjunto de proglotes hermafroditas
(estróbilo), não possui trato digestório e possui escólex com duas coroas de acúleos e
quatro ventosas (FREEMAN, 1962; WILLIMS & ZURABIAN, 2010). A forma larval
deste parasito é conhecida como Cysticercus logincollis Rudolphi 1819, (FREEMAN,
1962; MAILLARD et al., 1998).
Algumas cepas de T. crassiceps como HYG, KBS, Toi, ORF, COLA, GIKS e
recentemente a WFU isolada de roedores na América do Norte são usadas em
laboratório. As cepas HYG, KBS, Toi, COLA, GIKS e WFU são capazes de dar origem
ao helminto adulto, e seus cisticercos medem em torno de 5 mm de diâmetro, com
escólex invaginado. (EVERHART el al., 2004; WILLMS & ZURABIAN, 2010)
A cepa ORF não apresenta escólex possuindo somente o canal do escólex, sendo
incapaz de dar origem a forma adulta (WILLMS & ZURABIAN, 2010). Em todas as
cepas de T. crassiceps observa-se a reprodução assexuada através da formação de
brotamentos na superfície da membrana tegumentar do parasito (FREEMAN, 1962;
MAILLARD et al., 1998; VINAUD, 2007). As proliferações assexuadas por brotamento
são atributos úteis apresentados por este cisticerco, permitindo a sua manutenção através
de passagens sucessivas pela cavidade abdominal de camundongos (PADILHA et al.,
2001).
As formas adultas de T. crassiceps são parasitos do intestino delgado de
canídeos silvestres, cães domésticos, coiotes e principalmente de raposas, (FREEMAN,
1962; AROCKER-METTING et al., 1992; SHIMALOV & SHIMALOV, 2003). As
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Eliana Isac
proglotes grávidas são eliminadas repletas de ovos pelas fezes, sendo ingeridas pelos
hospedeiros intermediários (roedores silvestres). Os ovos medem de 6 a 8 μm, com os
embriões hexacantos envolvidos por uma membrana protetora de quitina (embrióforo).
A eclosão dos embriões ocorre no trato digestório de seus hospedeiros naturais,
penetram pela mucosa migrando por via linfática indo se alojar de preferência na região
subcutânea, cavidades pleural e abdominal, onde o cisticerco se desenvolve. Esta forma
larval pode ser detectada em torno de 12 dias após a ingestão dos ovos, atingindo até 11
mm de diâmetro. Os brotamentos podem se destacar do cisticerco larval, em torno de 4
semanas após seu surgimento. Esses cisticercos são ingeridos pelo hospedeiro
definitivo, originando a forma adulta, de 34 a 70 dias após sua ingestão (Figura 1).
Nestes hospedeiros a infecção se mantém por nove meses evoluindo então para a cura
espontânea. Nos hospedeiros intermediários, paratênicos ou acidentais, ainda não foi
relatado a cura espontânea (FREEMAN, 1962; MAILARD et al., 1998).
Figura 1: esquema representando o ciclo biológico de Taenia crassiceps, com seus
hospedeiros definitivos (1) - canídeos, intermediários, (2) – ovos presentes no meio
ambiente (3) - roedores, (4) – cisticercos encontrados nos tecidos e cavidades dos
hospedeiros intermediários e acidental (5) -mamíferos como o homem, lêmures e animais
domésticos (VINAUD et al., 2007).
3
Eliana Isac
Ao longo dos últimos 50 anos, os resultados experimentais usando estágios
larvais e adultos de T. crassiceps renderam muitas informações sobre a morfologia,
bioquímica, dinâmica de proliferação e resposta imune no hospedeiro (WILLMS &
ZURABIAN, 2010). Contribuindo também para estudos a respeito da resposta da ação
de fármacos no metabolismo energético em T. crassiceps e tratamento da cisticercose
(LINO JUNIOR et al., 2005; NOGALES-GAETE et al., 2006; VINAUD et al., 2007;
VINAUD et al., 2008; VINAUD et al., 2009; FRAGA et al., 2012a; FRAGA et al.,
2012b).
O emprego de cisticerco de T. crassiceps (cepa ORF) como modelo experimental
se justifica pela capacidade de proliferação rápida que os mesmos apresentam por
brotamentos, permitindo assim sua manutenção intraperitoneal em camundongos.
Nesses animais, é possível realizar estudos sobre respostas imunes de camundongos,
tanto em uma infecção inicial como em infecções por períodos prolongados (PADILHA
et al., 2001). Além disso, a infecção experimental propicia a produção de antígenos
utilizados em testes sorológicos para o diagnóstico da neurocisticercose por T. solium
(VAZ et al., 1997).
1.2- Ocorrência de T. crassiceps em animais
Este parasito foi pela primeira vez identificado em raposas vermelhas (Vulpes
vulpes) e é encontrado principalmente na Europa (FREEMAN, 1962, FRASSEN et al.,
2014). Sua forma adulta foi detectada em áreas rurais da Grécia infectando raposas
vermelhas, lobos, chacais e gatos selvagens (PAPDOPOULOS et al., 1997). Foi também
encontrado em várias regiões da Alemanha, em raposas vermelhas, texugos, fuinhas e
gatos selvagens (LOOS-FRANK & ZEYHLE, 1982; BALLEK et al., 1992). Raposas
vermelhas também foram encontradas parasitadas por T. crassiceps na Itália
4
Eliana Isac
(POGLAYEN, GUBERTI, LEONI, 1985), França (PETAVY & DEBLOCK, 1980) e nas
Ilhas Banks (EATON & SECORD, 1979).
O cisticerco de T. crassiceps por sua vez, já foi identificado em uma grande
variedade de roedores, tais como ratos e ratazanas, lagomorfos, tais como coelhos,
podendo também acometer outros grupos de mamíferos como marmotas, lêmures, cães
e gatos domésticos (FREEMAN,1962; PETAVY & DEBLOCK, 1980; BROJER et al.,
2002). Não se tem relatos na literatura, de animais selvagens, ou domésticos infectados
na América Latina.
1.3-Patogenia da cisticercose por T. crassiceps
Cisticercose causada por cisticerco de T. crassiceps é rara no homem, no entanto
é considerada de risco zoonótico, pela presença de animais domésticos infectados pelo
parasito, como cão e gato. Esses animais podem levar ao aumento da incidência de
casos em humanos. (WUNSCSHMANN et al., 2003). FREEMAN et al. (1973)
relataram um caso de cisticercose intraocular por cisticerco de T. crassiceps, em uma
menina que se infectou a partir de ovos contidos nas fezes de seu cão de estimação.
Infecções subcutâneas podem representar um problema clínico para os seres humanos
(FRANCOIS et al.1998). Entretanto a patogenicidade da cisticercose vai depender do
órgão parasitado, podendo resultar em doença grave (FREEMAN et al., 1973). Esses
cisticercos podem se alojar em vários locais tais como fígado, sistema nervoso central,
cavidade pleural, região ocular e região subcutânea, em mamíferos e humanos com o
sistema imune deprimido ou competente (SHEA et al., 1973; DEBLOCK & PETAVY,
1983; DYER & GREEVE, 1998; AROUCKER et al., 1992; BROJER et al., 2002;
HEIDWEIN et al., 2006; NTOUKAS et al., 2013). Duong et al. (2006), relataram
também um caso de um paciente com cisticercos sugestivos de cisticerco de T.
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Eliana Isac
crassiceps na parede abdominal, não tendo relatos de casos na família de taeniase por T.
solium. Provavelmente a etiologia desta parasitose seja pela ingestão de ovos deste
parasito pelo contato do paciente com raposas da região norte da França. Mesmo com
um pequeno número de casos de cisticerco de T. crassiceps em humanos, sendo a
maioria em população imunodeprimida pela infecção pelo HIV deve-se estar atento,
pois este cestodeo pode encontrar no homem um hospedeiro acidental, levando a
quadros graves e de difícil prognóstico.
1.4. Metabolismo
1.4.1-Cestodeo adulto
As pesquisas envolvendo o metabolismo energético dos helmintos tiveram um
aumento significativo nos últimos quarenta anos. A partir da década de 1970 foram
descritas as principais vias energéticas dos helmintos parasitos (BARRET, 2009).
O sistema respiratório dos helmintos se apresenta de maneira complexa, sendo
que fontes de nutrientes e tensão de oxigênio desempenham um importante papel em
suas vias metabólicas. (DEL ARENAL et al., 2005).
Os helmintos da classe cestoda não apresentam o trato digestório, sendo que a
absorção de substâncias imprescindíveis para o seu metabolismo é feita pela superfície
de seu tegumento através de microtriquias. Estes parasitos podem utilizar diversas
substâncias como fonte de energia tais como aminoácidos, carboidratos, nucleotídeos,
ácidos graxos entre outras, sendo todas elas retiradas de seus hospedeiros e algumas
armazenadas em camadas sub tegumentares ou vacúolos (KÖHLER, 1991; KÖHLER &
VOIGT, 1988).
Os parasitos adultos da família Taeniidae têm como principal fonte de energia
carboidratos, tanto na forma de glicogênio, como na forma de glicose. Apresentam
6
Eliana Isac
preferencialmente metabolismo anaeróbio pela falta de oxigênio na luz intestinal de seu
hospedeiro definitivo. Desta forma, não são capazes de oxidar compostos orgânicos em
CO2 e água, tendo como produtos finais de seu metabolismo ácidos graxos voláteis e
lactato (KÖHLER, 1991; KÖHLER & VOIGT, 1988). O catabolismo anaeróbio de
carboidratos apresenta como um dos seus produtos, o fosfoenolpiruvato que pode ser
convertido a piruvato que pela ação da enzima lactato desidrogenase gerar lactato. O
fosfoenolpiruvato sob ação da enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase será convertido
em oxaloacetato que pela ação da enzima malato desidrogenase citosólica será
condensado em malato que por sua vez é transportado para dentro da mitocôndria. O
malato na matriz mitocondrial pela ação da enzima málica mitocondrial pode originar o
piruvato, que sofrerá uma descarboxilação oxidativa, tendo como produto o acetil CoA.
Este por sua vez sofre a ação da enzima acetoacetato descarboxilase tendo como
produto o acetato. Por outro lado, o malato pode ser convertido em fumarato pela
enzima fumarase, que é convertido em succinato pela ação da enzima fumarato redutase
participando da síntese do propionil-CoA, que tanto pode originar o propionato, ou ser
precursor de ácidos graxos volateis como metilbutirato ou metilvalerato (Figura 2)
(KÖHLER & VOIGT, 1988). O malato produzido em helmintos, apresenta uma função
semelhante à da fermentação do lactato pela manutenção do equilíbrio redox pela
enzima malato desidrogenase, e produção de dois mols de ATP para cada mol de glicose
catabolizada (KÖHLER & VOIGT, 1988). A degradação de ácidos graxos em alguns
helmintos pode estar associada à produção de energia, ocorrendo dentro da mitocôndria
e são semelhantes à inversão da β-oxidação dos ácidos graxos associada com a
produção de energia. Entretanto, as propriedades cinéticas de algumas enzimas
envolvidas na produção de ácidos graxos por helmintos são diferentes das propriedades
das enzimas envolvidas na produção de ácidos graxos por mamíferos (KÖHLER &
7
Eliana Isac
VOIGT, 1988; FRAGA, 2012a). Os ácidos graxos provenientes de fontes exógenas são
incorporados nas reservas de triacilglicerol e de fosfolipídeos, que são encontrados na
membrana cística e no tegumento de cestodeos (KÖHLER & VOIGT, 1988).
Os ácidos graxos por serem mais voláteis difundem-se com maior facilidade
através das membranas biológicas, sendo, portanto menos prejudiciais para o parasito
quanto para seu hospedeiro quando comparadas ao succinato e o lactato (KÖHLER &
VOIGT, 1988; FRAGA, 2011).
A biossíntese de aminoácidos e proteínas pelos helmintos ainda não está
totalmente esclarecida, provavelmente o parasito obtenha esses nutrientes pela retirada
do meio, de acordo com a disponibilidade no hospedeiro. Esses aminoácidos podem ser
utilizados pelo parasito na síntese de proteínas e também de neurotransmissores e
neurohormônios (KÖHLER & VOIGT, 1988).
Apesar de ainda não estarem esclarecidos os processos de catabolismo de
proteínas em helmintos, admite-se a produção e excreção de amônia e úreia como
produto final (KÖHLER & VOIGT, 1988).
A descrição de vias metabólicas como a excreção de ureia e creatinina foi
relatada em cisticerco de T. crassiceps por VINAUD et al. (2009). Em mamíferos
(Figura 3), ocorre o catabolismo de aminoácidos dentro e fora da mitocôndria, gerando
fumarato e uréia como produtos finais, os quais serão excretados (LEHNINGER et al.,
2011).
8
Eliana Isac
Figura 2: Via da degradação da glicose em anaerobiose. 1: piruvato quinase, 2: fosfoenol
piruvato carboxiquinase, 3:malato desidrogenase citosólica, 4:enzima málica, 5: complexo
piruvato desidrogenase (LEHNINGER et al., 2005; FRAGA, 2015).
9
Eliana Isac
Figura 3: Catabolismo de aminoácidos em hepatócitos de vertebrados. O excesso de amônia
é excretado na forma de ureia (LEHNINGER et al., 2011; VINAUD et al., 2007).
10
Eliana Isac
1.4.2- Cisticerco de Taenia crassiceps
A atividade aeróbia in vivo de cisticerco de T. crassiceps é dependente da
quantidade de oxigênio que é difundida em seu habitat, ou seja, nos tecidos dos seus
hospedeiros intermediários. Ainda não foi elucidado porque em cisticerco de T.
crassiceps e em outras formas larvares de helmintos observa-se uma maior capacidade
de oxidação do que suas formas adultas. (KÖHLER & VOIGT, 1988; LAMSAN &
MCMANUS,1990; DEL ARENAL et al., 2001). Provavelmente o tamanho reduzido das
formas larvares, facilitaria uma maior difusão de oxigênio pelos tecidos do parasito, que
é retirado do tecido dos hospedeiros no qual se encontra o cisticerco. Existem ainda
diferenças metabólicas dos cisticercos entre seus estádios evolutivos indicando um
maior gasto de energia e fontes energéticas retiradas de seu hospedeiro durante a
formação de seus brotamentos (DORAIS & ESCH, 1969, VINAUD et al., 2007). Esses
fatores são primordiais para que se estabeleçam as vias metabólicas responsáveis pela
cadeia respiratória como o ciclo do ácido cítrico, degradação dos substratos,
fosforilação oxidativa e via de β-oxidação (KÖHLER & VOIGT, 1988).
Os principais carboidratos utilizados como fonte e reserva energética na fase
larval são a glicose e o glicogênio, sendo que a degradação dessas substâncias gera
substratos que são utilizados em vias de metabolismo aeróbio (KÖHLER & VOIGT,
1988; CORBIN et al., 1998; VINAUD et al., 2007).
Nas fases larvais, esses carboidratos são retirados do meio onde o parasito se
encontra, porém outros tipos de carboidratos são armazenados em sua membrana
cística, como as glicosamidas, galactose e manose podendo ser utilizados em situações
de escassez energética, ou ainda quando a incorporação da glicose é dificultada pela
ação de fármacos (MELHORN et al., 1988; LAMSAN & MCMANUS, 1990).
A produção de piruvato a partir do catabolismo de carboidratos ocorre em duas
11
Eliana Isac
regiões da célula: no citosol, através da ação da enzima piruvato quinase sobre o
fosfonolpiruvato, e na mitocôndria pela ação da enzima málica sobre o malato. O
piruvato citosólico pode ainda sofrer ação da enzima lactato desidrogenase, produzindo
lactato que será excretado ou reutilizado na gliconeogênese; O piruvato pode ainda ser
transaminado tendo como produto a alanina que será excretada, ou ser transportado
para o interior da mitocôndria. O piruvato mitocondrial é descarboxilado em Acetil-coA
(pelo complexo da enzima piruvato desidrogenase) que será condensado com o
oxaloacetato produzindo citrato que poderá ser excretado ou participar do ciclo do ácido
cítrico. O citrato é convertido em cis aconitato e posteriormente em isocitrato,
ocorrendo então uma descarboxilação oxidativa com formação de NADH e CO2 e
produção de alfa-cetoglutarato. Este por sua vez sofre uma descarboxilação oxidativa
pela ação da enzima succinil CoA sintetase produzindo succinato (LEHNIGUER, 2011).
Em uma via inversa, o malato, sob ação da enzima fumarase, pode ainda ser
desidratado a fumarato, o qual é reduzido a succinato, sob ação da enzima fumarato
redutase. Essas reações atuam como fonte de NADH para a cadeia transportadora de
elétrons (CORBIN et al., 1998). Esta via inversa é chamada de via da enzima fumarato
redutase (Figura 4) (ZENKA & PROKOPIC, 1987; CORBIN et al., 1998; VINAUD et
al., 2007).
Em cisticerco de T. crassiceps os produtos finais do metabolismo anaeróbio in
vitro de carboidratos são: lactato e alanina; e do metabolismo aeróbio são: acetato,
citrato e succinato (CORBIN et al., 1998).
A enzima málica (Figura 4), por ser encontrada tanto no citoplasma quanto na
mitocôndria de helmintos, apresenta grande importância no estudo do metabolismo de
cisticerco de T. crassiceps, enquanto que em vertebrados só é encontrada no citoplasma
(ZENKA & PROKOPIC, 1987), podendo ser indicado como um potencial local de ação
12
Eliana Isac
de fármacos anti-helmínticos.
A cadeia transportadora de elétrons detectada em cisticerco de T. crassiceps é
semelhante à cadeia encontrada em mamíferos demonstrando a presença de citocromos
b, c1, c e a3; enquanto este tipo de respiração não foi detectado em parasitos adultos
(DEL ARENAL et al., 2001).
Figura 4: Via de degradação da glicose pelo cisticerco de T. crassiceps. E. produtos
do metabolismo excretados. PEP. fosfoenolpiruvato. OAA. oxaloacetato. T.
substâncias com trânsito livre pela membrana mitocondrial. 1. piruvato quinase; 2.
lactato desidrogenase; 3. alanina transaminase; 4. fosfoenolpiruvato
carboxiquinase; 5. malato desidrogenase citosólica; 6. fumarase; 7. fumarato
redutase; 8. enzima málica mitocondrial; 9. enzima málica citosólica; 10.
complexo da piruvato desidrogenase; 11. acetoacetato descarboxilase; 12. malato
desidrogenase mitocondrial; 13. citrato sintase; 14. aconitase; 15. isocitrato
desidrogenase; 16. α-cetoglutarato desidrogenase; 17. succinil-CoA sintetase.
Reações mitocondriais separadas pelo pontilhado ocorrem em vertebrados e não
foram demonstradas em cestodeos (LEHNINGER et al., 2011; VINAUD et al.
2007).
13
Eliana Isac
1.5-Fármacos utilizados no tratamento da cisticercose
A cisticercose causada pela presença da larva de Taenia solium nos tecidos do
hospedeiro humano é considerada um grave problema de saúde pública, é uma doença
tropical negligenciada (GARCIA et al., 2014). O tratamento da cisticercose leva a uma
redução do número de lesões ativas, e frequência de sequelas quando ocorre o
acometimento do sistema nervoso central, e deve ser realizado com o uso combinado de
fármacos antiparasitários com corticosteroides, minimizando a reação inflamatória local
(GARCIA et al., 2014; FONGANG, et al., 2015).
O esquema terapêutico varia para cada caso, como o número de cisticercos, sua
localização, os estádios evolutivos encontrados, e ainda de acordo com a reação
inflamatória nos tecidos adjacentes (GARCIA et al., 2014; FONGANG, et al., 2015).
1.5.1-Praziquantel
A escolha do praziquantel para o tratamento da neurocisticercose tem sido
relatada por vários autores (PALOMARES et al., 2006; MAHANTHY et al., 2013;
GARCIA et al., 2014; FONGANG, et al., 2015). Os pacientes respondem bem ao
esquema terapêutico apresentando efeitos colaterais como dores de cabeça e distúrbios
digestivos. Alguns apresentam uma melhora significativa no quadro, inclusive com o
desaparecimento dos cisticercos (GROLL, 1982; ALARCON, 2006; NOGALES-
GAETE et al., 2006).
O praziquantel vem sendo empregado para o tratamento de várias outras
infecções teciduais por helmintos como por exemplo Schistosoma mansoni, causando
alterações musculares, metabólicas e dano no tegumento do parasito. Este fármaco é
capaz de interagir diretamente com fosfolipídeos de membrana causando um aumento
do fluxo intracelular de Ca+2
, alterando assim a permeabilidade estrutural levando à
14
Eliana Isac
contração muscular do parasito (DA SILVA, 1993).
Estudos relatados por Greenberg (2005) demonstraram que o praziquantel altera
o fluxo de cálcio em platelmintos, indicando que somente os canais de cálcio do
parasito são sensíveis ao fármaco, o mesmo não acontece com o hospedeiro. Isto explica
a ação seletiva do fármaco.
Este fármaco também promove a despolarização na membrana das células do
parasito, desregulando os mecanismos que são responsáveis pelo fluxo de cátions
através de sua membrana celular, inibindo as enzimas que mantém os gradientes de íons
inorgânicos, estimulando a entrada de sódio e inibindo a de potássio. É ainda capaz de
modificar o metabolismo glicídico com redução na captação de glicose e um aumento
na liberação de lactato, estimulando assim o metabolismo anaeróbico (KÖHLER, 2001).
1.5.2-Albendazol
O albendazol é um fármaco benzimidazólico, desenvolvido há mais de 30 anos e
utilizado no tratamento da cisticercose e de vários helmintos intestinais como: Ascaris
lumbricoides, Trichuris trichiura, Enterobius vermicularis, Taenia spp e Strongyloides
stercoralis. Atua ao se ligar à beta-tubulina do parasito impedindo a polimerização do
microtubulo impedindo a captação da glicose de forma seletiva e irreversível induzindo
a redução do armazenamento do glicogênio, interferindo assim em seu metabolismo
energético (VENKATESAN, 1998; CIOLI & PICA-MATTOCCIA, 2001; KÖHLER,
2001, NOGALES-GAETE et al., 2006; PALOMARES-ALONSO et al., 2007).
Apresenta rápida velocidade de absorção intestinal sendo convertido a um composto
ativo, o metabólito sulfóxido, por isso não é detectado no plasma (EDWARDS &
BRECKENRIDGE, 1988). Sua baixa solubilidade em água resulta em uma alta
variabilidade deste fármaco nos níveis plasmáticos (JUNG et al., 1998; DEL BRUTTO
15
Eliana Isac
et al., 2006). Este fármaco causa perfurações do tegumento e ruptura de fibras
musculares nos parasitos. Sabe-se que formas adultas dos parasitos apresentam o
tegumento mais delgado, com menor resistência à ação dos fármacos, enquanto que as
formas larvais são mais resistentes (MARKOSKI et al., 2006).
Zurabian et al. (2013) demonstraram in vivo que o albendazol pode diminuir
significativamente a carga parasitária de T. crassiceps ou ainda causar danos teciduais
em cisticercos inoculados em camundongos.
Os efeitos colaterais aos esquemas terapêuticos são raros, e o uso do
praziquantel e albendazol podem levar à morte do parasito causando uma resposta
inflamatória no hospedeiro com pico entre o 5º e 7º dia de tratamento. Esta resposta
inflamatória associada a encefalite e reações das menínges, podem levar a um aumento
da pressão intracraniana na neurocisticercose levando o paciente ao óbito. É importante,
portanto, o acompanhamento médico durante o tratamento da cisticercose (NOGALES-
GAETE et al., 2006).
Os cisticercos de T. crassiceps expostos in vitro, ao albendazol demonstraram
um decréscimo na excreção de lactato pelo parasito, dando uma preferência por vias
aeróbias de produção de energia (VINAUD, et al., 2007 e 2008), porém in vivo, após o
tratamento do hospedeiro, ocorreu um aumento de oxaloacetato e alfa-cetoglutarato,
induzindo a utilização de fontes alternativas como a oxidação de ácidos graxos com o
aumento na produção de beta-hidroxibutirato e propionato (FRAGA et al., 2012a e
2012b).
Palomares et al. (2006) demonstraram que a associação do praziquantel e
albendazol sulfóxido mostraram resultados satisfatórios no tratamento em cisticerco de
T. crassiceps in vitro do que quando usadas sozinhas. Isto poderia ser uma alternativa
para o tratamento da cisticercose humana.
16
Eliana Isac
Albendazol, praziquantel e outros fármacos disponíveis como a nitazoxanida
tem demonstrado que suas atividades metabólicas apresentam um efeito significante no
arranjo celular e mortalidade dos parasitos, características estas avaliadas em cisticerco
de T. crassiceps (PALOMARES et al., 2006 e 2007).
O tratamento da cisticercose associando o albendazol e o praziquantel causam
danos no tegumento do parasito, interferindo na captação da glicose e resultando na
imobilização do parasito e sua morte (CIOLI et al., 1995; KOHLER, 2001; NOGALES-
GAETE, et al., 2006). Entretanto os maiores danos morfológicos são atribuídos ao
praziquantel levando a uma vacuolização, inchaço aparecimento de bolhas e
deslocamento do tegumento do parasito (MARKOSKI et al., 2006).
1.5.3 Niclosamida
A niclosamida é um fármaco também indicado para o tratamento de infecções
intestinais por T. solium, T. saginata e Diphyllobothrium latum, e como moluscocida no
controle da esquistossomíase. Este fármaco lesa irreversivelmente o escólex do cestódeo
e o seu segmento proximal é separado da parede intestinal sendo então expelido. Para T.
solium, o anti-helmintico é administrado em dose única após refeição leve, seguida de
um laxante duas horas mais tarde. O uso de laxante se faz necessário, pois os
seguimentos lesados do parasito podem liberar ovos que não sofrem ação deste
medicamento, existindo então a possibilidade de uma auto-infecção interna levando ao
desenvolvimento da cisticercose. Devido a sua baixa absorção intestinal, este fármaco
não é indicado para o tratamento de infecções teciduais. A niclosamida é um
desacoplador da fosforilação oxidativa mitocondrial promovendo um desequilíbrio do
gradiente de concentração de íons H+ entre a matriz mitocondrial e o espaço
intramembranar. Dessa forma interfere na produção de energia do parasito, que morre
17
Eliana Isac
por inanição (SIQUEIRA-BATISTA & GOMES, 2005).
1.5.4 Tamoxifeno
O tamoxifeno é um fármaco antagonista do receptor competitivo do estrogênio,
amplamente utilizado para o tratamento de neoplasias mamárias, e ginecomastia em
homens, que recebem a terapia hormonal para o carcinoma prostático (RYSSEL et al.,
2008; RIVERA-GUEVARA & CAMACHO, 2011). Entretanto, este fármaco anti-
estrogênio tem demonstrado uma ação contra várias protozoários como Leishmania
major e Trypanosoma cruzi (MIGUEL et al., 2010; EISSA & EL SAWY, 2011).
Atualmente o tamoxifeno foi utilizado no tratamento para de infecções por T. crassiceps
inibindo sua proliferação e sua viabilidade in vitro (IBARRA-CORONADO et al.,
2011). Este fármaco mostrou um forte efeito na larva de T. solium, in vitro reduzindo
também as formas adultas intestinais em hamsters, entretanto o seu mecanismo de ação
ainda não foi elucidado (ESCOBEDO et al., 2013).
1.5.5-Nitazoxanida
A nitazoxanida - 2-acetiloxi-N-(5-nitro-2-thiazolil) benzamida (NTZ) (Figura 5)
é um composto da classe dos nitrotiazois, com o nome comercial Anitta®. É um
fármaco de amplo espectro descrito pela primeira vez em 1975 por Jean Francois
Rossignol, do Instituto Pasteur. Inicialmente usada para o tratamento de nematodeos,
cestodeos e trematodeos de pulmão de importância veterinária (ROSSIGNOL &
CAVIER, 1975). Foi também aprovada na Suíça e França para o tratamento de
infecções intestinais por helmintos em cães e gatos. Desde 1996, a nitazoxanida tem
sido comercializada na maior parte da América Latina e estudada em todo o mundo
(FOX & SARAVOLATZ, 2005). Estudos in vitro demostraram que tanto a NTZ quanto
18
Eliana Isac
sua forma reduzida, a tizoxanida são eficazes no tratamento de infecções por bactérias
anaeróbias gram-positivas e gram-negativas e vírus da hepatite B e C e do rotavírus,
provavelmente impedindo sua replicação viral por meio de uma inibição proteica ainda
não identificada (GILLES & HOFFMANN, 2002; FOX & SARAVOLATZ, 2005;
ESPOSITO et al. 2006; ESPOSITO et al., 2007; KORBA et al., 2007; SANTORO et al.,
2007; SARRAZIN & ZEUZEN et al., 2010).
A NTZ está sendo usada no tratamento de infecções intestinais em humanos,
causadas por uma grande variedade de protozoários e helmintos (FOX &
SARAVOLATZ, 2005; SOMVANSHI et al., 2014). Mostrou-se eficaz para o tratamento
das fases adultas de diferentes espécies de nematodeos como Ascaris lumbricoides,
(ROMERO CABELLOET et al., 1997; ABAZA et al., 1998; DAVILA-GUTIERREZ et
al., 2002; JUAN et al., 2002; DIAZ et al. 2003), Ancylostoma duodenale (ABAZA et
al., 1998; GEARY et al., 1999), Trichuris trichiura (ABAZA et al., 1998; DAVILA-
GUTIERREZ et al., 2002; JUAN et al., 2002; FOX & SARAVOLATZ, 2005),
Figura 5: Estrutura química da nitazoxanida- 2-acetiloxi-N-(5-nitro-2-
thiazolil) benzamida.
19
Eliana Isac
Strongyloides stercoralis (SOMVANSHI et al., 2014), T. saginata e Hymenolepis nana
(ROSSINGNOL & MAISONNEUVE, 1984; ORTIZ et al., 2002). De acordo com
estudos de realizados por Zumaquero-Rios et al. (2013), a NTZ pode ser utilizada no
tratamento de um trematodeo tecidual causador da fasciolose humana como tratamento
alternativo ao triclabendazole. Entretanto ainda não se tem resultados concretos no
tratamento de outras helmintíases teciduais (FOX & SARAVOLATZ, 2005; DAVID &
BOBAK, 2006; SOMVANSHI et al., 2014).
HU et al. (2013) utilizaram in vitro os fármacos: albendazol, ivermectina,
nitazoxanida e pirantel testados em várias espécies de nematodeos de importância
veterinária. Este estudo demonstrou que a NTZ foi mais eficaz contra Ancylostoma
ceylanicum e Ascaris suunn. Os resultados encontrados por esses autores sugeriram que
na avaliação do valor clínico de um fármaco, estudos farmacocinéticos e metabólicos in
vivo sejam também realizados.
Após administração oral em humanos, este fármaco é rapidamente hidrolisado
pelas esterases do plasma em seu metabólito ativo; a tizoxanida (diacetil-nitazoxanida) é
parcialmente absorvido no trato gastrointestinal com aproximadamente um terço da
dose oral excretada na urina, e dois terços nas fezes (BROEKHUYSEN et al., 2000;
HUANG et al., 2015).
Geralmente, a nitazoxanida é bem tolerada, não existindo reações adversas
significativas durante o seu uso. No entanto, alguns efeitos colaterais podem ser
observados como distúrbios gastrointestinais, diminuição do apetite, febre, anorexia
entre outros (STOCKIS et al., 1996). É apresentada em suspensão oral com dose de 100
100 mg/5ml, ou em comprimidos de 500 mg (FOX & SARAVOLATZ, 2005).
PALOMARES-ALONSO et al. (2007) relataram pela primeira vez a ação da
NTZ, tizoxanida e albendazol sulfóxido em diferentes concentrações em cisticerco de T.
20
Eliana Isac
crassiceps. Os resultados encontrados sugerem que a NTZ em combinação com
albendazol poderia ser usada in vivo no tratamento da cisticercose, apresentando ainda
um avanço significativo no tratamento de infecções parasitárias intestinais. Este
fármaco mostrou também um efeito protoescolicida, in vitro, em Echinococcus
granulosus, podendo ser utilizado na prevenção de um contágio secundária durante a
retirada do cisto hidático (LIU et al., 2015). Tratamentos da cisticercose em suínos com
associação de praziquantel (PZQ) e oxfendazole (OFZ), e o OFZ sozinho na dosagem
de 30 mg/kg mostraram resultados satisfatórios. Entretanto o uso da NTZ com a
dosagem de 150 mg/kg, não mostrou nenhum efeito cisticida. Isto pode ser devido as
diferentes formas utilizadas para avaliar a viabilidade do cisticerco e ainda dificuldades
na obtenção de um modelo de infecção artificial em suínos (MKUPASI et al., 2013).
Demonstrou-se que cisticerco de T. crassiceps, quando tratado com fármacos
não convencionais como NTZ e artesunato, fármaco utilizado no tratamento da malária
estimulam a liberação pelo parasito de enzimas como a fosfatase alcalina (AP) e a
fosfoglicose isomerase (PGI). Estas enzimas sinalizam os danos causados no cisticerco
que sofreram ação destes fármacos (MAHANTY et al., 2013).
A NTZ apresenta atividade em vários protozoários como, Giardia intestinalis e
Cryptosporidium parvum que são responsáveis por grande número de diarreias graves
em todo o mundo, principalmente em individuos imunocomprometidos (MYIAMOTO
& ECKMANN, 2015). Para o tratamento da criptosporidíase, as opções são limitadas, e
somente a NTZ foi aprovada pela FDA para o seu tratamento. (MIYAMOTO &
ECKMANN, 2015). A atividade anti-protozoário deste fármaco está relacionada a sua
ação sobre uma enzima vital para o metabolismo energético, a piruvato ferredoxina
oxidoredutase (PFOR), impedindo a descarboxilação de piruvato em acetil CoA.
HOFFMAN et al., (2007) demonstraram que a NTZ bloqueia a descarboxilação do
21
Eliana Isac
piruvato, através da inibição da reação de transferência de elétrons dependente da
enzima piruvato-ferredoxina oxiredutase. O metabolismo de G. intestinalis é
fermentativo, e o transporte de elétrons neste parasito acontece na ausência da
fosforilação oxidativa mitocondrial. Esta enzima doa os elétrons para a ferredoxina
levando a produção de ATP e seu bloqueio induz a morte do parasito (FUIRD &
RAGSDALET 2000; PALOMARES-ALONSO et al., 2007). A ferredoxina reduzida
pode também reduzir o 5- nitroimidazole (5-NI) liberando radicais tóxicos também
capazes de induzir a morte do parasito (HOFFMANN et al.; 2007). Outra via de redução
pode ocorrer incluindo as enzimas nitroredutases (MÜLLER, et al.; 2007), ativando
também o 5- NI que compromente a integridade celular causando lesões na membrana
celular da G. intestinalis, por induzir a formação de vacúolos (MÜLLER, et al.; 2006).
Comportamento semelhante à NTZ também ocorre com o metronidazole e tinidazole,
no tratamento da G. lamblia (PAL et al., 2009; LEITSCH, et al., 2011; NILLIUS, et al.,
2011). Portanto o bloqueio da reação de transferência de elétrons da PFOR não é a
única via pela qual a NTZ apresenta atividade anti-protozoários.
Entretanto, com relação aos helmintos, seu mecanismo de ação ainda não está
completamente elucidado, mas enzimas envolvidas no transporte de elétrons parecem
ser os potenciais sítios de ação (GILLES & HOFFMAN, 2002; RAETHER & HÄNEL,
2003).
22
Eliana Isac
2. JUSTIFICATIVA
Infecções humanas por cisticercos de T. solium, representam um grave problema
em saúde pública no Brasil e em alguns países da América Latina, África, e sudeste da
Ásia. Atualmente a neurocisticercose é considerada a helmintose mais comum do
sistema nervoso central em humanos, e a maior causa de epilepsia adquirida em todo o
mundo (COYLE et al., 2012; DEL BRUTTO & GARCÍA, 2012; DEL BRUTTO, 2014).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (2010), no mínimo 50 milhões de pessoas
sofrem de epilepsia causada pelo cisticerco de T.solium e 80% dessa população reside
em países em desenvolvimento. Um dos modelos experimentais utilizados para o estudo
da cisticercose por T. solium é o uso de cisticercos de T. crassiceps devido a sua
similaridade antigênica e facilidade de manutenção em condições de laboratório.
Os principais fármacos atualmente utilizados para o tratamento da cisticercose
são o albendazol e o praziquantel, com estudos direcionados sobre as alterações
bioquímicas e estruturais causadas nos parasitos. Entretanto, alguns pacientes não
respondem satisfatoriamente a estes tratamentos (PALOMARES-ALONSO, 2007).
Além disso, a utilização maciça e repetida desses fármacos em um grande número de
indivíduos, pode levar a casos de resistência parasitária (DONATO et al., 2014). De
acordo com Köhler (2001), os principais mecanismos utilizados pelos helmintos para
adquirir resistência aos fármacos, parece ser por perda do receptor ou diminuição da
afinidade para o sítio alvo do fármaco. Esses fatores podem ser explorados para o
desenvolvimento de novos anti-helmínticos, fornecendo informações sobre as formas de
superar a resistência no tratamento das parasitoses.
A nitazoxanida é um agente antiparasitário de amplo espectro, comercializada na
maior parte da América Latina, e estudada em todo o mundo. Apresenta atividade no
23
Eliana Isac
tratamento de infecções intestinais causadas por uma grande variedade de protozoários e
helmintos, embora não existam na literatura dados concretos da sua ação em helmintos
teciduais. É um fármaco bem tolerado durante o tratamento pelo paciente, não sendo
comum a manifestação de reações adversas ou interações com outros medicamentos.
Este fármaco também é utilizado para o tratamento de infecções teciduais por vírus,
bactérias e protozoários (HOFFMAN et al. 2007; GAU et al. 2016).
Trabalhos relatam a ação dos fármacos albendazol e praziquantel no
metabolismo energético do cisticerco de T. crassiceps. Entretanto não se sabe o efeito da
nitazoxanida no metabolismo energético in vitro deste parasito. O conhecimento a cerca
do mecanismo de ação da nitazoxanida no metabolismo energético neste modelo
experimental, poderá contribuir no tratamento da cisticercose e de outras parasitoses
teciduais, permitindo assim avaliar a ação deste fármaco nas vias metabólicas utilizadas
pelo parasito.
24
Eliana Isac
3. OBJETIVOS
3.1-Objetivo Geral:
Avaliar o efeito in vitro, da NTZ e ABZSO em vias do metabolismo energético
de cisticerco de T. crassiceps, cepa ORF.
3.2-Objetivos específicos:
Em cisticercos de T. crassiceps, estádio larval, cultivados, após exposição a
diferentes concentrações de NTZ e ABZSO:
1. Avaliar a glicólise por meio da detecção de glicose, piruvato e lactato.
2. Verificar a ocorrência do ciclo do ácido cítrico por meio da quantificação de
citrato, alfa-cetoglutarato, succinato, fumarato e oxaloacetato.
3. Investigar a oxidação de ácidos graxos por meio da detecção de acetato,
acetoacetato, beta-hidroxibutirato e propionato.
4. Avaliar o catabolismo de proteínas através da quantificação de ureia e
creatinina.
25
Eliana Isac
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1-Manutenção de Taenia crassiceps
O cisticerco de T. crassiceps, cepa ORF, tem sido mantido no biotério do
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás
(IPTSP/UFG) desde 2002. Foram inoculados 10 cisticercos em estádio inicial na
cavidade peritoneal de camundongos BALB/c fêmea de 8 a 12 semanas de idade, onde
se multiplicam por brotamento. Cerca de 90 dias após a inoculação, os animais foram
eutanasiados e necropsiados. Retiraram-se os cisticercos da cavidade peritoneal, e
selecionaram-se 10 cisticercos em estádio inicial que foram inoculados em outros
camundongos não infectados para dar continuidade ao ciclo (VINAUD et al., 2007,
2008 e 2009; FRAGA et al., 2012a e 2012b).
Os camundongos receberam cuidados diários, água acidificada e ração padrão
para a espécie, a vontade. Foram obedecidos os princípios éticos em experimentação
animal preconizados pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório
(SBCAL/COBEA), e o trabalho obteve a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade Federal de Goiás (CEUA/UFG) (protocolo número 050/2013) (Anexo 1).
Os animais foram devidamente alojados no biotério, no qual luminosidade e
temperatura foram controladas, a intensidade de ruído e a umidade relativa do ar foram
as do ambiente geral.
4.2-Obtenção de cisticerco de T. crassiceps
Cisticercos de T. crassiceps foram retirados da cavidade peritoneal de
camundongos BALB/c fêmeas com 30 dias de infecção, previamente selecionados e
mantidos no biotério do IPTSP/UFG. Os cisticercos foram lavados em solução
26
Eliana Isac
fisiológica para a retirada de células e quaisquer outros interferentes (FRAGA et al.,
2012a e 2012b, MÁRQUEZ-NAVARRO et al., 2013). Foram em seguida classificados
macroscopicamente, de acordo com seu estádio evolutivo: inicial, larval e final. Em
estádio inicial os cisticercos apresentam-se translúcidos, no larval apresentam-se
translúcidos e com brotamentos e no final opacos e sem brotamentos (VINAUD et al.,
2007; FRAGA et al., 2012a e 2012b).
4.3-Exposição de cisticerco de T. crassiceps a nitazoxanida
Em placas de cultivo de 6 poços, colocaram-se 30 cisticercos em estádio larval
/poço acrescido de 5 mL de meio RPMI suplementado com: L-glutamina a 200 mM,
soro fetal bovino 10% inativado penicilina/estreptomicina a 1:1000, hepes a 1 M e 2-
mercaptoetanol a 5 mM, e expostos às concentrações 1,2 μg/mL, 0,6 μg/mL, 0,3 μg/ml,
0,15 μg/mL, de NTZ e ABDZSO previamente diluídos em DMSO.
De acordo com Palomares-Alonso (2007), a EC50 de NTZ encontrada para o
tratamento in vitro do cisticerco de T. crassiceps foi de 0,15 μg/mL. Para verificar a
interferência do DMSO no metabolismo do parasito, fez-se o cultivo de 30 cisticercos
do estádio larval acrescido ao meio de cultura, e 60ul de DMSO (4,9%) utilizado na
diluição dos fármacos (grupo controle). Além deste controle, fez-se o controle do meio
RPMI, com 5 mL de meio, e cisticercos com o meio RPMI sem os fármacos, nas
mesmas condições de incubação (VINAUD et al., 2008 e 2009; MÁRQUEZ-
NAVARRO et al., 2013). Os parasitos foram incubados a 37°C, em 5% de CO2 e
umidade relativa de 95%, por 24 horas (VINAUD et al., 2008 e 2009; MÁRQUEZ-
NAVARRO et al., 2013). Após as 24 horas de cultivo, separou-se os cisticercos do meio
de cultura. Ambos foram congelados em nitrogênio líquido para estase das reações
metabólicas (VINAUD et al., 2008 e 2009; FRAGA et al., 2012a e 2012b).
27
Eliana Isac
4.4-Análise dos ácidos orgânicos
4.4.1-Extração dos ácidos orgânicos
4.4.1.1- Amostras de meio de cultura
Após a estase em nitrogênio líquido, as amostras do meio de cultura foram
descongeladas, e os ácidos orgânicos secretados/excretados foram extraídos utilizando-
se uma coluna de troca iônica (Bond Elut® Agilent®), com o auxílio de uma caixa
acoplada a uma bomba a vácuo. Esta coluna foi ativada com 1 mL de HCl a 0,5 M, 1
mL de metanol e 2 mL de água ultrafiltrada. Em seguida aplicou-se 1 mL de amostra e
acrescentou-se 2 mL de água tipo I. Retirou-se a coluna da caixa, acrescentou-se 250 µL
de H2SO4 a 0,5 M, e centrifugou-se a 626 g (2.000 rpm), por 5 minutos, a 4 °C
(VINAUD et al., 2007, 2008 e 2009; FRAGA et al., 2012a e 2012b). A amostra obtida
foi armazenada à -20 °C para posterior análise em Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE).
4.4.1.2- Amostras de extrato de cisticerco (EC)
Após a estase em nitrogênio líquido, os cisticercos foram descongelados e
homogeneizados em 500 µL de tampão tris-HCl a 0,1 M, com pH 7,6, acrescido de
inibidores de proteases (SIGMAFAST) (RENDÓN et al., 2004 e 2008; FRAGA et al.,
2012a e 2012b). O extrato obtido foi centrifugado a 15.652 g (10.000 rpm), por 10
minutos, a 4 °C (VINAUD et al., 2007, 2008 e 2009; FRAGA et al., 2012a e 2012b). Do
fluido vesicular obtido extraiu-se os ácidos orgânicos, utilizando-se uma coluna de troca
iônica (Bond Elut® Agilent®), como descrito anteriormente no item 4.4.1.1. As
amostras obtidas foram armazenadas a -20 °C para posterior análise em CLAE.
28
Eliana Isac
4.4.2-Análise por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
As amostras de extrato de cisticerco (EC) e do meio de cultura (MC) foram
submetidas à análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), com uma
coluna de exclusão BIORAD-Aminex HPX-87H. O eluente utilizado foi ácido sulfúrico
a 5 mM, com vazão de 0,6 mL/min, acoplado a um espectrofotômetro, em um
comprimento de onda de 210 nm. Para esta análise, utilizou-se 50 µL de cada amostra
(VINAUD et al., 2007, 2008 e 2009; FRAGA et al., 2012a e 2012b). Os resultados
foram analisados pelo programa Star Chromatography Workstation (Agilent®),
calibrado para identificação de ácidos orgânicos: piruvato e lactato, citrato, alfa-
cetoglutarato, succinato, fumarato, malato, oxaloacetato, acetato, acetoacetato, beta-
hidroxibutirato e propionato (VINAUD et al., 2007, 2008 e 2009; FRAGA et al., 2012a
e 2012b).
4.5-Dosagens bioquímicas
Utilizando-se o aparelho Architec C8000 Plus, por meio de análises
espectrofotométricas, foram feitas as dosagens das concentrações de glicose, ureia e
creatinina no EC e MC segundo o protocolo do kit comercial Wiener lab®.
4.6-Análises estatísticas
Os experimentos foram realizados em cinco repetições independentes. A análise
estatística foi realizada por meio do programa Sigma Stat 2.3. A estatística descritiva
foi feita para a determinação de média e desvio padrão, e, para avaliar as diferenças
entres os grupos analisados, as variáveis foram testadas quanto à distribuição normal e
variância homogênea. Por apresentarem distribuição normal, utilizou-se análise da
variância. As diferenças observadas foram consideradas significantes quando p<0,05.
29
Eliana Isac
5. ARTIGOS
Nitazoxanide induces in vitro metabolic acidosis in Taenia crassiceps
cysticerci
Eliana Isac, Guaraciara de A. Picanço, Tatiane L. da Costa, Nayana F. de Lima,
Daniella de S. M. M. Alves, Carolina M. Fraga, Ruy de S. Lino Junior, Marina C.
Vinaud*
Laboratory of studies of the host-parasite relationship, Tropical Pathology and
Public Health Institute, Federal University of Goias. Brazil. Rua 235, s/n, Setor
Universitário, Goiania, Goias, Brazil. CEP:74605-050.
* Corresponding author: Marina C. Vinaud. Laboratory of studies of the host-
parasite relationship, Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University
of Goias. Rua 235, s/n, Setor Universitário, Goiania, Goias, Brazil. CEP:74605-050.
Telephone: +55 62 3209 6113. Fax: + 55 62 3209 6363. Email address:
Artigo submetido a Experimental Parasitology
30
Eliana Isac
Abstract
Nitazoxanide (NTZ) is a broad-spectrum anti-parasitic drug used against a wide
variety of protozoans and helminthes. Albendazole (ABZ) is one of the drugs of choice
to treat both intestinal and tissue helminth and protozoan infections. However little is
known regarding their impact on the metabolism of parasites. The aim of this study was
to compare the in vitro effect of NTZ and albendazol sulfoxide (ABZSO) in the
glycolysis of Taenia crassiceps cysticerci. The cysticerci were treated with 1.2; 0.6; 0.3
and 0.15 µg/mL of NTZ or ABZSO. Chromatographic and spectrophotometric analyses
were performed. Regarding the glucose concentrations was possible to observe two
responses: impair of the uptake and gluconeogenesis. The pyruvate concentrations were
increased in the ABZ treated group. Lactate concentrations were increased in the culture
medium of NTZ treated groups. Therefore it was possible to infer that the metabolic
acidosis was greater in the group treated with NTZ than in the ABZ treated group
indicating that this is one of the modes of action used by this drug to induce the parasite
death.
Key words: Nitazoxanide; albendazole; anaerobic metabolism; lactic acid; Taenia
crassiceps
31
Eliana Isac
1. Introduction
Nitazoxanide (NTZ) is a broad-spectrum anti-parasitic drug used against a wide
variety of protozoans and helminths. It has been established that NTZ as well as its
reduced form, tizoxanide, are effective against most target pathogens. It is the only drug
effective against Cryptosporidium infections and one of the most effective against
intestinal giardiasis (Miyamoto and Eckman, 2015). It has been described as an
effective treatment of cutaneous leishmaniasis by Leishmania donovani (Dhawan et al.
2015). Also this drug has been indicated against intestinal and tissue helminth infection
such as cystic echinococcosis (Laura et al. 2015), soil-transmitted helminths
(Somvanshi et al. 2014); Ancylostoma ceylanicum, Ascaris suum, Trichuris muris and
Caenorhabditis elegans (Hu et al. 2013), Taenia saginata and Hymenolepis nana
(Rossignol and Maisonneuve, 1984). Interestingly this drug has been successfully used
against nosocomial pathogens (Gau et al. 2016), Clostridium difficile (Soriano and
Johnson, 2015) and hepatitis C virus (Kohla et al. 2016).
This drug has been indicated as an alternative treatment when the resistance to
traditional anti-parasitic drugs is detected. For example, NTZ has been described as
effective against T. saginata niclosamide- and praziquantel-resistant (Lateef et al. 2008).
In protozoans both NTZ and tizoxanide inhibit central physiological enzymes
such as pyruvate ferredoxin oxidoreductase, nitroreductase 1, quinone reductase and
induces lesions in the cell membrane and vacuolization (Leitsch 2015). While in
Neospora caninum, NTZ inhibited the protein disulfide isomerase (Muller et al. 2008).
In bacteria this drug inhibits the pilus biogenesis by the chaperone/usher pathway
(Chahales et al. 2016). However, there are few studies determining the effect of this
32
Eliana Isac
drug on helminths. Somvanshi et al. (2014) using the C. elegans experimental model for
soil-transmitted nematodes determined that NTZ acts on an alpha-type subunit of a
glutamate-gated chloride ion channel which is also responsible for ivermectin
susceptibility in this organism.
Albendazole (ABZ) is one of the drugs of choice to treat both intestinal and tissue
helminth and protozoan infections (Van den Enden 2009). However, regarding the G.
intestinalis treatment it has been determined that other drugs such as tinidazole and
NTZ are more effective than ABZ (Leitsch 2015; Escobeddo et al. 2016). Regarding the
treatment of helminth’s tissue infections there are few drugs used such as ABZ,
ivermectin and praziquantel, easy to use and effective against most parasites such as
Echinococcus granulosus (Hemphill et al. 2014), Strongyloides stercoralis (Luvira et al.
2014), ocular toxocariasis (Ahn et al. 2014) and cysticercosis (Del Brutto 2014). The
reliance on such drugs creates the danger of resistance which has already been reported
(Geary 2012) leading to the imperative need for the development of new drugs.
It is known that antihelminthic drugs are able to eliminate the parasitic infections,
however the mode of action of such drugs and their effect on the parasite metabolism
has been little explored. It has been previously determined that ABZSO in in vitro
analysis induces a partial blockage of glucose uptake, decrease in lactate concentrations
in the culture medium and a preference for the aerobic metabolism in T. crassiceps
cysticerci (Vinaud et al. 2008).
T. crassiceps is a cestode widely used as experimental model of cysticercosis
caused by T. solium due to their antigenic similarity (Vaz et al. 1997). It has been
previously used to determine the impact of anti-helminthics such as ABZ, praziquantel
and a benzimidazole derivative in their energetic metabolism (Vinaud et al. 2007; 2008;
33
Eliana Isac
Fraga et al. 2016). Therefore the aim of this study is to compare the in vitro effect of
NTZ and ABZ in the glycolysis of T. crassiceps cysticerci.
2. Material and Methods
2.1. Maintenance of T. crassiceps cysticerci
The maintenance of T. crassiceps cysticerci was performed according to the
description by Fraga et al. (2012). Briefly, BALB/c female mice with 8 – 12 weeks old
are intraperitoneally infected with 10 initial stage (no buds, translucent membrane and
vesicular liquid) T. crassiceps cysticerci, maintained in cages with five animals
maximum, received standard ration and water ad libitum. After 90 days of infection, the
animals are euthanized, the cysticerci removed from the peritoneal cavity and inoculated
into another mouse. The ethical principles of animal experimentation stipulated by the
Brazilian Society of Laboratory Animals Science (SBCAL) were obeyed. This study
was approved by the Ethics Committee in Animal Use from the Federal University of
Goias (CEUA/UFG) (protocol number 050/2013).
2.2. Cysticerci culture and drugs exposure
A mouse with 30 days of intraperitoneal infection was euthanized within a laminar
flow chamber and the cysticerci were removed and washed with sterile saline solution
as to remove cells and any other contaminants (Márquez-Navarro et al. 2013).
Afterwards the larval stage cysticerci (with buds, translucent vesicular membrane and
fluid) (Vinaud et al. 2007) were collected and cultured as described by Fraga et al.
(2016). Briefly, 30 larval stage cysticerci were added into 5 mL of supplemented RPMI
culture medium. The cysticerci were treated with 1.2; 0.6; 0.3 or 0.15 µg/mL of NTZ or
34
Eliana Isac
ABZ. The drugs were diluted with DMSO (0.60%). The control groups were constituted
by a group of cysticerci without drugs and another one that received the concentration
of DMSO used to dilute the drugs.
After 24 hours of culture the cysticerci were separated from their culture medium
and frozen into liquid nitrogen as to stop the metabolic reactions (Vinaud et al. 2008).
2.3. Biochemical analysis
The organic acids secreted/excreted into the culture medium were extracted
through an ionic exchange solid phase extraction column (Bond Elut® Agilent®), as
described by Vinaud et al. (2007).
The cysticerci extract (CE) was obtained after the liquid nitrogen metabolic stasis.
The cysticerci were defrost and homogenized in 500 µL of tris-HCl 0.1 M buffer
supplemented with a protease inhibitor (SIGMAFAST, protease inhibitor cocktail
tablets, EDTA free, Sigma), pH 7.6. The extract obtained was centrifuged at 15,652g
(10,000 rpm) per 10 minutes at 4ºC and then the organic acids were extracted through
an ionic exchange solid phase extraction column (Bond Elut® Agilent®). The resulting
samples were frozen at -20°C for posterior analysis in high performance liquid
chromatography (Vinaud et al. 2007).
For the chromatographic analysis an exclusion BIORAD-Aminex HPX-87H
column was used. The eluent was sulfuric acid 5 mM, 0.6 mL/min, with
spectrophotometric reading of absorbance at 210 nm. The results were analyzed through
the Star Chromatography Workstation software (Agilent®), previously calibrated for the
pyruvate and lactate identification which are indicative of anaerobic glycolisis (Vinaud
et al. 2007). The glucose quantification was performed through an Architec C8000 Plus
35
Eliana Isac
device, using a commercial kit protocol with an enzymatic method (Fraga et al. 2012).
2.4. Statistical analysis
All experiments were repeated five times independently. The statistical analysis
was performed through the Sigma Stat 4.0 software. The descriptive analysis was
performed as to determine the normal distribution and homogenous variation as well as
mean and standard deviation. As the values presented normal distribution, the analysis
of variation test (ANOVA) was performed followed by the Bonferrone post-test. The
differences were considered significant when p<0.05.
3. Results
This study compared the in vitro effect of two widely used antihelminthic drugs in
the glycolysis of T. crassiceps cysticerci. Therefore the concentrations of glucose and
the main final products of glycolysis, pyruvate and lactate, were quantified both in the
culture medium and in the cysticerci extract from T. crassiceps cysticerci after the
exposure to different concentrations of NTZ and ABZSO. The analysis of the culture
medium aimed to detect the excretion/secretion of glucose, pyruvate and lactate; while
the analysis of the cysticerci extract aimed to determine the intracellular concentrations
of these substances. The cysticerci were in vitro exposed to different concentrations of
the drugs which were diluted with DMSO. The diluent did not influence in the
metabolic analysis.
There was a significant difference between the glucose concentrations in the
culture medium of the control group and the group treated with the highest
concentrations of NTZ (p<0.05). While the NTZ treatment induced an impairment of
36
Eliana Isac
the glucose uptake the ABZ treatment induced a greater uptake of glucose (p<0.05)
(Figure 1).
Figure 1. Glucose concentrations in the culture medium and in the cysticerci
extract from groups in vitro treated with different concentrations of nitazoxanide and
albendazole.CM: concentrations detected in the culture medium analysis; CYST:
concentrations detected in the cysticerci extrac; ctl cm: RPMI culture medium without
cysticerci; ctl cyst: cysticerci without drugs exposure; ntz 1.2: cysticerci exposed to 1.2
µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.6: cysticerci exposed to 0.6 µg/mL of nitazoxanide; ntz
0.3 cysticerci exposed to 0.3 µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.15: cysticerci exposed to
0.15 µg/mL of nitazoxanide; abz 1.2: cysticerci exposed to 1.2 µg/mL of albendazole;
abz 0.6: cysticerci exposed to 0.6 µg/mL of albendazole; abz 0.3: cysticerci exposed to
0.3 µg/mL of albendazole; abz 0.15: cysticerci exposed to 0.15 µg/mL of albendazole. *
statistical difference when compared to the control group.
In the cysticerci extract the glucose levels were significantly higher in the NTZ
treated groups than in the control group (p<0.05). While in the ABZSO treated group
there was no significant difference when compared to the control group.
37
Eliana Isac
The pyruvate concentrations in the culture medium of the groups treated with
ABZSO were significantly higher than the concentration detected in the control group
(p<0.05). The NTZ treatment did not influence the pyruvate concentrations in the
culture medium. The pyruvate concentrations in the cysticerci extract were not
influenced by the exposure to ABZSO nor to NTZ (Figure 2).
Figure 2. Pyruvate concentrations in the culture medium and in the cysticerci
extract from groups in vitro treated with different concentrations of nitazoxanide and
albendazole.CM: concentrations detected in the culture medium analysis; CYST:
concentrations detected in the cysticerci extrac; ctl cyst: cysticerci without drugs
exposure; ntz 1.2: cysticerci exposed to 1.2 µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.6: cysticerci
exposed to 0.6 µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.3 cysticerci exposed to 0.3 µg/mL of
nitazoxanide; ntz 0.15: cysticerci exposed to 0.15 µg/mL of nitazoxanide; abz 1.2:
cysticerci exposed to 1.2 µg/mL of albendazole; abz 0.6: cysticerci exposed to 0.6
µg/mL of albendazole; abz 0.3: cysticerci exposed to 0.3 µg/mL of albendazole; abz
0.15: cysticerci exposed to 0.15 µg/mL of albendazole. * statistical difference when
compared to the control group.
38
Eliana Isac
There was a significant increase in the lactate concentrations in the culture
medium of the group exposed to all concentrations of NTZ (p<0.05). While the
exposure to different concentrations of ABZ did not influence the concentration of this
organic acid in the culture medium. The lactate concentrations in the cysticerci extract
were not influenced by the in vitro exposure nor to ABZ neither to NTZ (Figure 3).
Figure 3. Lactate concentrations in the culture medium and in the cysticerci
extract of cysticerci exposed to different concentrations of albendazole and
nitazoxanide. CM: concentrations detected in the culture medium analysis; CYST:
concentrations detected in the cysticerci extrac; ctl cm: RPMI culture medium without
cysticerci; ctl cyst: cysticerci without drugs exposure; ntz 1.2: cysticerci exposed to 1.2
µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.6: cysticerci exposed to 0.6 µg/mL of nitazoxanide; ntz
0.3 cysticerci exposed to 0.3 µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.15: cysticerci exposed to
0.15 µg/mL of nitazoxanide; abz 1.2: cysticerci exposed to 1.2 µg/mL of albendazole;
abz 0.6: cysticerci exposed to 0.6 µg/mL of albendazole; abz 0.3: cysticerci exposed to
0.3 µg/mL of albendazole; abz 0.15: cysticerci exposed to 0.15 µg/mL of albendazole. *
statistical difference when compared to the control group.
39
Eliana Isac
4. Discussion
Glucose is the main energy source for cestodes such as T. crassiceps (SMYTH a&
McMANNUS 1989). Due to the importance of such molecule in the parasite
metabolism this study compared the effect of two widely used antihelminthic drugs in
the in vitro glycolysis of T. crassiceps cysticerci.
The anaerobic energy metabolism in helminthes is enhanced when there are
stressful factors affecting the cell such as inadequate oxygen supply or exposure to
drugs. This may lead to metabolic acidosis and cell death (SMYTH & McMANNUS
1989). In our study was possible to observe the metabolic acidosis due to high levels of
lactate in the culture medium of the cysticerci treated both with NTZ. This fact may be
understood as the response of the parasitic cell to the stressful factor present in the
culture medium, i.e., the different concentrations of the drugs. Also it indicates that the
parasitic cell is evolving to death, even under little time of exposure (24h), single dose
of treatment and non-lethal doses (0.15 to 1.2 µg/mL).
The impair of glucose uptake is one of the mode of action observed in
benzimidazole drugs alongside with inhibition of tubulin formation (KOHLER 1985;
McCRACKEN & STILLWELL 1991; MARTIN 1997) and was observed in the group
treated with 1.2 µg/mL of ABZ in our study. Also as there was an increase in the
glucose levels in the culture medium it is possible to infer that gluconeogenesis also
happened in this group.
Xiao et al. (1993) described that mebendazole also inhibited the glucose uptake in
E. granulosus cyst wall. This effect was observed in the ABZSO (1.2 µg/mL) and in the
NTZ (1.2, 0.6 and 0.3 µg/mL) treated groups in our study. It seems that one of the
modes of action of benzimidazole antihelminthics, such as mebendazole and ABZ, is to
impair the transmembrane proton gradient which results in diminished levels of cellular
40
Eliana Isac
ATP (MCCRACKEN and STILLWELl, 1991) and in the use of alternative energy
sources such as protein catabolism and fatty acids oxidation (VINAUD et al. 2009;
FRAGA et al. 2012).
One of the metabolic effects of NTZ is to interfere in the pyruvate oxidoreductase
activity (Sisson et al. 2002). This enzyme catalyzes the interconversion of pyruvate into
acetyl-CoA. The blockage of this enzyme leads to an excess of pyruvate which may be
used in two different pathways: 1. Gluconeogenesis from the activity of
phosphoenolpyruvate synthase and phosphoenolpyruvate carboxykinase; 2. Anaerobic
metabolism through lactate dehydrogenase activity and lactate production (SMYTH &
McMANNUS 1989). Both this pathways were observed in the NTZ treated groups due
to the high concentrations of glucose in the culture medium analysis and due to the high
concentrations of lactate both in the culture medium and in the cysticerci extract
analysis. Also gluconeogenesis was observed in the ABZSO 1.2 µg/mL treated group
due to the increase in the glucose levels in the culture medium analysis.
Interestingly, the pyruvate concentrations were not altered in the NTZ treated
groups. This indicates that this organic acid is being used as substrate for lactate
dehydrogenase as to produce lactate and also as substrate for malic enzyme as to
produce malate, both cytoplasmatic and mitrochondrially (SMYTH & McMANNUs
1989). The ABZ treated groups presented an increase in the pyruvate concentrations in
the culture medium analysis. The pyruvate may have been produced by the activity of
lactate dehydrogenase and malic enzyme which are not influenced by the presence of
the drug (ESCOBEDO et al. 2016).
Therefore, it is possible to conclude that the NTZ concentrations tested induced
metabolic acidosis in in vitro T. crassiceps cysticerci which is a signal of cell death.
Also the drug impacted the glucose uptake by the parasite which may have contributed
41
Eliana Isac
to the lactate production. It was possible to infer that the metabolic acidosis was greater
in the group treated with NTZ than in the ABZ treated group indicating that this is one
of the modes of action used by this drug to induce the parasite death.
8. Acknowledgments:
This work was supported by CNPq - National Counsel of Technological and
Scientific Development (grant number 471009/2013-0).
9. Referências Bibliográficas:
AHN, S. J.; RYOO, N. K.; WOO, S. J. Ocular toxocariasis: clinical features, diagnosis,
treatment, and prevention. Asia Pacific Allergy, Koreia, n. 4, p .134-141. doi:
10.5415/apallergy.2014.4.3.134, 2014.
CHAHALES, P.; HOFFMAN, P.S.; THANASSI, D.G. Nitazoxanide inhibits pilus
biogenesis by interfering with folding of the usher protein in the outer membrane.
Antimicrob Agents and Chemotherapy, Estados Unidos, n. 60, v. 4, p. 2028-2038. doi:
10.1128/AAC.02221-15, 2016.
CIOLI, D.; PICA-MATTICIA, L.; BASSO, A.; GUIDI, A. Schistosomiasis control:
praziquatel forever? Molecular & Biochemica l Parasitology, Holanda, n. 195, p. 23-29,
2014.
DEL BRUTTO, O. H. Neurocysticercosis. Handbook of Clinical Neurology, Holanda,
n. 121, p. 1445-1459. doi: 10.1016/B978-0-7020-4088-7.00097-3, 2014.
DHAWAN, A. K.; BISHERWAL, K.; GANDHI, V.; SINGAL, A.; SHARMA, S.
Successful treatment of cutaneous leishmaniasis with nitazoxanide. Indian journal of
dermatology venereology and leprology, India, n. 81, p. 644-646. doi: 10.4103/0378-
6323.165541, 2015.
42
Eliana Isac
ESCOBEDO, A. A.; BALLESTEROS, J.; GONZÁLEZ-FRAILE, E.; ALMIRALL, P. A
meta-analysis of the efficacy of albendazole compared with tinidazole as treatments for
Giardia infections in children. Acta Tropica, Holanda, n. 153, p. 120-127. doi:
10.1016/j.actatropica.2015.09.023, 2016.
FOGANG, Y. F.; SAVADOGO, A. A.; CAMARA, M.; TOFFA, D. H.; BASSE, A.;
SOW, A. D.; NDIAYE, M. M. Managing neurocysticercosis: challenges and solutions.
International Journal of General Medicine, Inglaterra, n. 8, p. 333-344. doi:
10.2147/IJGM.S73249, 2015
FRAGA, C. M.; COSTA, T. L.; BEZERRA, J. C. B.; LINO JUNIOR, R. S.; VINAUD,
M.C. Fatty acids oxidation and alternative energy sources detected in Taenia crassiceps
cysticerci after host treatment with antihelminthic drugs. Experimental Parasitology,
Estados Unidos, n. 131, p. 111-115. doi: 10.1016/j.exppara.2012.03.017, 2012.
FRAGA, C. M.; COSTA, T. L.; CASTRO, A. M.; REYNOSO-DUCOING, O.;
AMBROSIO, J.; HERNÁNDEZ-CAMPOS, A.; CASTILLO, R.; VINAUD, M.C.
Alternative energy production pathways in Taenia crassiceps cysticerci in vitro exposed
to a benzimidazole derivative (RCB20). Parasitology, Inglaterra, n. 143, p. 488-493.
doi: 10.1017/S0031182015001729, 2016.
GAU, J. S.; LIN, W. P.; KUO, L. C.; HU, M. K. Nitazoxanide Analogues as
Antimicrobial Agents against Nosocomial Pathogens. Medicinal Chemistry, Holanda.
[Epub ahead of print]. doi: 10.2174/1573406412666160129105719, 2016.
GEARY, T.G. Are new anthelmintics needed to eliminate human helminthiases? Current
Opinion in Infectious Diseases, Estados Unidos, n. 25, v. 6, p. 709-717. doi:
10.1097/QCO.0b013e328359f04a, 2012.
HEMPHILL, A.; STADELMANN, B.; RUFENER, R., SPILIOTIS, M., BOUBAKER,
G., MÜLLER, J.; MÜLLER, N.; GORGAS, D.; GOTTSTEIN, B. Treatment of
echinococcosis: albendazole and mebendazole--what else? Parasite journal de la
43
Eliana Isac
Société Française de Parasitologie, França, n. 21, v. 70. doi: 10.1051/parasite/2014073,
2014.
HU, Y.; ELLIS, B. L.; YIU, Y.Y.; MILLER, M. M.; URBAN, J. F.; SHI, L. Z.;
AROIAN, R.V. An extensive comparison of the effect of anthelmintic classes on
diverse nematodes. PLoS ONE, 15: n. 8, v. 7, e 70702, Estados Unidos, doi:10.1371/j
ournal.pone.0070702, 2013.
KOHLA, M. A.; EL-SAID, H.; EL-FERT, A.; EHSAN, N.; EZZAT, S.; TAHA, H.
Impact of nitazoxanide on sustained virologic response in Egyptian patients with
chronic hepatitis C genotype 4: a double-blind placebo-controlled trial. European
Journal of Gastroenterology & Hepatology, Estados Unidos, n. 28, p. 42-47. doi:
10.1097/MEG.0000000000000492, 2016.
KOHLER, P. The strategies of energy conservation in helminths. Molecular and
Biochemical Parasitology, Holanda, n. 17, v. 1, p. 1-18, 1985.
LATEEF, M.; ZARGAR, S. A.; KHAN, A. R.; NAZIR, M.; SHOUKAT, A. Successful
treatment of niclosamide- and praziquantel-resistant beef tapeworm infection with
nitazoxanide. International Journal of Infectious Diseases, Canadá, n. 12, v. 1, p. 80-82.
doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.ijid.2007.04.017, 2008.
LAURA, C.; CELINA, E.; SERGIO, S. B.; GUILLERMO, D.; CARLOS, L.; LUIS, A.
Combined flubendazole-nitazoxanide treatment of cystic echinococcosis:
Pharmacokinetic and efficacy assessment in mice. Acta Tropica, Holanda, n. p. 148, p.
89-96. doi: 10.1016/j.actatropica.2015.04.019, 2015.
LEITSCH D. Drug Resistance in the microaerophilic parasite Giardia lamblia. Current
Tropical Medicine Reports, Suíça, n. 2, v. 3, p. 128–135 doi 10.1007/s40475-015-0051-
1, 2015.
LUVIRA, V.; WATTHANAKULPANICH, D.; PITTISUTTITHUM, P. Management of
44
Eliana Isac
Strongyloides stercoralis: a puzzling parasite. International Health, Inglaterra, n. 6, v. 4
273-281. doi: 10.1093/inthealth/ihu058, 2014
MÁRQUEZ-NAVARRO, A.; PÉREZ-REYES, A.; ZEPEDA-RODRIGUES, A.;
REYNOSO-DUCOING, O.; HERNÁNDEZ-CAMPOS, A.; HERNÁNDEZ-LUIS, F.;
CASTILLO, R.; YÉPEZ-MULI, A. L.; AMBROSIO, J. R. RCB20, an experimental
benzimidazole derivative, affects tubulin expression and induces gross anatomical
changes in Taenia crassiceps cysticerci. Parasitology Research, Alemanha, n.112, v. 6,
p. 2215-2226. doi: 10.1007/s00436-013-3379-2, 2013.
MARTIN, R. J. Modes of Action of Anthelmintic Drugs. The Veterinary Journal,
Inglaterra, n. 154, p. 11-34, 1997.
McCRACKEN, R. O.; STILLWELL, W. H. A possible biochemical mode of action for
benzimidazole anthelmintics. International Journal for Parasitology, Inglaterra, n. 21,
p. 99-104, doi: 10.1016/0020-7519(91)90125-Q, 1991.
MIYAMOTO, Y.; ECKMANN, L. Drug Development Against the Major Diarrhea-
Causing Parasites of the Small Intestine, Cryptosporidium and Giardia. Frontiers in
Microbiology, Suíça, n. 19, v. 6, 1208. doi: 10.3389/fmicb.2015.01208, 2015.
MULLER, J.; NAGULESWARAN, A.; MULLER, N.; HEMPHILL, A. Neospora
caninum: Functional inhibition of protein disulfide isomerase by the broad-spectrum
anti-parasitic drug nitazoxanide and other thiazolides. Experimental Parasitology,
Estados Unidos, n. 118, p. 80-88. doi:10.1016/j.exppara.2007.06.008, 2008.
ROSSIGNOL, J. F.; MAISONNEUVE, H. Nitazoxanide in the treatment of Taenia
saginata and Hymenolepis nana infections. The American journal of tropical medicine
and hygiene, Estados Unidos, n. 33, v. 3, p. 511-512, 1984.
SISSON, G.; GOODWIN, A.; RAUDONIKIENE, A.; HUGHES, N. J.;
MUKHOPADHYAY, A. K.; BERG, D. E.; HOFFMAN, P. S. Enzymes associated with
45
Eliana Isac
reductive activation and action of nitazoxanide, nitrofurans, and metronidazole in
Helicobacter pylori. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Estados Unidos, n. 46, p.
2116–2123. doi: 10.1128/AAC.46.7.2116-2123.2002, 2002.
SMYTH, J. D.; MCMANUS, D. P. The Physiology and Biochemistry of Cestodes,
Cambridge University Press, Cambridge, UK, 1989.
SOMVANSHI, V.S.; ELLIS, B. L., HU, Y.; AROIAN, R.V. Nitazoxanide: nematicidal
mode of action and drug combination studies. Molecular and Biochemical Parasitology,
Holanda, n. 193, v. 1, p. 1-8. doi: 10.1016/j.molbiopara.2013.12.002, 2014.
SORIANO, M. M.; JOHNSON, S. Treatment of Clostridium difficile infections.
Infectious Diseases Clinics of North America, Estados Unidos, n. 29, v. 1, p. 93-108.
doi: 10.1016/j.idc.2014.11.005, 2015.
VAN DEN ENDEN, E. Pharmacotherapy of helminth infection. Expert Opinion on
Pharmacotherapy, Inglaterra, n. 10, v. 3, p. 35-451. doi: 10.1517/14656560902722463,
2009.
VAZ, A. J.; NUNES, C. M.; PIAZZA, R. M.; LIVRAMENTO, J. A.; DA SILVA, M.V.;
NAKAMURA, P. M.; FERREIRA, A.W. Immunoblot with cerebrospinal fluid from
patients with neurocysticercosis using antigen from cysticerci of Taenia solium and
Taenia crassiceps. The American journal of tropical medicine and hygiene, Estados
Unidos, n. 57, v. 3, p. 354-357, 1997.
VINAUD, M. C., LINO JUNIOR, R.S.; BEZERRA, J. C. B. Taenia crassiceps organic
acids detect in cysticerci. Experimental Parasitology, Estados Unidos, n. 116, v. 4, p.
335-339, 2007.
VINAUD, M. C.; FERREIRA, C. S.; LINO JUNIOR, R. S.; BEZERRA, J.C.B. Taenia
crassiceps: Energetic and respiratory metabolism from cysticerci exposed to
praziquantel and albendazole in vitro. Experimental Parasitology, Estados Unidos, n.
46
Eliana Isac
120, v. 3, p. 221-226, 2008.
VINAUD, M. C.; FERREIRA, C. S.; LINO JUNIOR, R. S.; BEZERRA, J. C. B. Taenia
crassiceps: fatty acids oxidation and alternative energy source in in vitro cysticerci
exposed to anthelminthic drugs. Experimental Parasitology, Estados Unidos, n. 122, v.
3, p. 208-211, 2009.
XIAO, S. H.; FENG, J. J.; GUO, H. F.; JIAO, J. Y.; YAO, M. Y.; JIAO, W. Effects of
mebendazole, albendazole, and praziquantel on succinate dehydrogenase, fumarate
reductase, and malate dehydrogenase in Echinococcus granulosus cysts harbored in
mice. Acta Pharmacologica Sinica. China, n. 14, p. 151-154, 1993.
47
Eliana Isac
Artigo 2
Influência in vitro da nitazoxanida no metabolismo energético de cisticercos de
Taenia crassiceps.
Eliana Isac, Guaraciara de A. Picanço, Tatiane L. da Costa, Nayana F. de Lima,
Daniella de S. M. M. Alves, Carolina M. Fraga, Ruy de S. Lino Junior, Marina C.
Vinaud*
Laboratory of studies of the host-parasite relationship, Tropical Pathology and
Public Health Institute, Federal University of Goias. Brazil. Rua 235, s/n, Setor
Universitário, Goiania, Goias, Brazil. CEP:74605-050.
* Corresponding author: Marina C. Vinaud. Laboratory of studies of the host-
parasite relationship, Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University
of Goias. Rua 235, s/n, Setor Universitário, Goiania, Goias, Brazil. CEP:74605-050.
Telephone: +55 62 3209 6113. Fax: + 55 62 3209 6363. Email address:
Resumo
A cisticercose pela Taenia crassiceps em humano é uma parasitose tecidual
considerada rara e de caráter grave principalmente em pacientes imunodeprimidos. A
infecção deste parasito em camundongos é utilizada como modelo experimental para estudos
da cisticercose pela T. solium, pela similaridade antigênica, e pela facilidade no manuseio em
laboratório. A nitazoxanida é um fármaco de largo espectro utilizado no tratamento de
parasitoses por helmintos e protozoários, no entanto pouco explorado no tratamento de
parasitoses teciduais.
48
Eliana Isac
O objetivo deste estudo foi avaliar alterações no metabolismo energético in vitro de
cisticercos de T. crassiceps induzidas pela exposição a dois fármacos antiparasitários,
nitazoxanida (NTZ) e albendazol sulfóxido (ABZSO). Foram analisados os ácidos orgânicos
do ciclo do ácido cítrico: citrato, alfa-cetoglutarato, succinato, malato e oxaloacetato, da
oxidação de ácidos graxos: acetato, beta-hidroxibutirato e propionato, e do catabolismo de
proteínas, ureia e creatinina. Esses ácidos foram quantificados no extrato de cisticerco (EC) e
no meio de cultura (MC) após 24 horas de exposição in vitro a diferentes concentrações de
NTZ e ABZSO em meio RPMI suplementado. Houve uma diminuição significativa nas
concentrações de citrato detectadas nos grupos tratados com NTZ quando comparado ao
controle. Foi possível observar que o grupo controle tratado com NTZ realizaram o ciclo do
ácido cítrico de forma tradicional devido a detecção de alfa-cetoglutarato, enquanto que os
grupos tratados com ABZSO realizaram a via da fumarato redutase devido a não detecção de
alfa-cetoglutarato. Observou-se um aumento significativo na concentração de succinato
detectado no EC do grupo tratado com NTZ 1,2 µg/mL quando comparado ao grupo controle.
Observou-se um aumento das concentrações de malato no MC nos grupos tratados com NTZ
1,2 e 0,6 µg/mL e ABZSO 1,2 e 0,6 µg/mL em relação ao grupo controle. Nas vias de beta
oxidação de ácidos graxos, não foi detectado o acetato nos grupos tratados com NTZ fato que
confirma o seu mecanismo de ação. Foi possível observar um aumento na oxidação de
ácidos graxos devido a um aumento na concentração de beta-hidroxibutirato e de propionato.
Conclui-se que os fármacos induziram a utilização de vias alternativas de produção de acetil-
coA, como a oxidação de ácidos graxos e o catabolismo de proteínas. Observou-se também
uma preferência pela via da fumarato redutase nos grupos expostos ao ABZSO.
Palavras chaves: Taenia crassiceps, nitazoxanida, albendazol sulfóxido, metabolismo
energético, vias alternativas de produção de energia.
49
Eliana Isac
1. Introdução
A cisticercose causada pela presença de larvas de Taenia solium nos tecidos do
hospedeiro humano, representa um grave problema em saúde pública sendo considerada
ainda como uma doença negligenciada (GARCIA et al., 2014). Segundo a Organização
Mundial de Saúde (2010), existem aproximadamente 50 milhões de pessoas sofrendo
com epilepsia quando há o comprometimento do sistema nervoso central, e 80%
residindo em países em desenvolvimento.
O albendazol e praziquantel são os fármacos de escolha usados para o
tratamento da cisticercose, variando o esquema terapêutico de acordo com o número e a
localização dos cisticercos, e também com a reação inflamatória nos tecidos adjacentes
(GARCIA et al., 2014; FONGANG, et al., 2015).
VINAUD et al. (2007; 2008) demonstraram que cisticercos de T. crassiceps
expostos in vitro ao albendazol tiveram uma preferência por vias aeróbias de produção
de energia pela baixa excreção de lactato. Porém in vivo, após o tratamento do
hospedeiro com o fármaco houve um aumento de oxaloacetato e alfa-cetoglutarato,
induzindo a utilização de fontes alternativas de produção de energia, como a oxidação
de ácidos graxos com o aumento de beta-hidroxibutirato e propionato (FRAGA et al.,
2012a; 2012b).
Taenia crassiceps é um parasito similar antigenicamente e bioquimicamente à T.
solium (VAZ et al., 2007), podendo ser utilizada como modelo experimental para
estudos do efeito de fármacos no seu metabolismo energético (VINAUD et al.,2007;
2008; FRAGA et al., 2012).
A glicose e o glicogênio são os principais carboidratos utilizados como fonte de
reserva energética para cisticerco de T. crassiceps em sua fase larval. A degradação
dessas substâncias gera substratos que são utilizados em vias de seu metabolismo
50
Eliana Isac
aerobio (KÖHLER & VOIGT, 1988; CORBIN et al., 1998; VINAUD et al., 2007). Em
situações de escassez energética ou mesmo quando a captação da glicose é dificultada
por ação de fármacos, outros carboidratos armazenados em sua membrana cística
podem ser utilizados pelo parasito como a manose, galactose e as glicosamidas
(MELHORN et al., 1988; LAMSAN & MCMANUS, 1990).
A atividade aeróbia in vivo de cisticerco de T. crassiceps ocorre em função da
quantidade de oxigênio que é difundida em seu habitat, ou seja, nos tecidos dos seus
hospedeiros intermediários. Existe um maior gasto de energia e fontes energéticas
retiradas de seu hospedeiro no cisticerco em estádio larval. Provavelmente isto ocorra
durante a formação de seus brotamentos (DORAIS & ESCH, 1969; VINAUD et al.,
2007). Associado a esse fato, o tamanho do cisticerco também facilitaria uma maior
difusão de oxigênio pelos tecidos de seu hospedeiro estabelecendo assim as vias
metabólicas responsáveis pela cadeia respiratória como o ciclo do ácido cítrico,
degradação dos substratos, fosforilação oxidativa e a via alternativa de beta-oxidação de
ácidos graxos (KÖHLER & VOIGT, 1988). Embora os antihelmínticos sejam eficazes
no tratamento das parasitoses, o impacto desses fármacos no metabolismo desses
parasitos ainda é pouco conhecido.
A nitazoxanida (NTZ) é um anti-parasitario do grupo dos nitrotiazois de amplo
espectro utilizado no tratamento de infecções intestinais em humanos causadas por
protozoários e helmintos gastrointestinais (FOX & SARAVOLAX, 2004). É um
fármaco de escolha para o tratamento de giardíase e criptosporidíase (MIYAMOTO &
ECKMANN, 2015). É rapidamente hidrolisado no plasma pelas esterases ao seu
metabólito a tizoxanida após a sua administração oral, em humanos (BROEKHUYSEN
et al., 2000; HUANG et al., 2015). Mostrou-se eficaz no tratamento de parasitos adultos
de diferentes espécies de nematodeos e cestodeos como Ascaris lumbricoides
51
Eliana Isac
(ROMERO CABELLOET et al., 1997; ABAZA et al., 1998; DAVILA-GUTIERREZ et
al., 2002; JUAN et al., 2002; DIAZ et al., 2003), Ancylostoma duodenale (ABAZA et
al., 1998; GEARY et al., 1999), Trichuris trichiura (ABAZA et al., 19 98; DAVILA-
GUTIERREZ et al., 2002; JUAN et al., 2002; FOX & SARAVOLATZ, 2005),
Strongyloides stercoralis (SOMVANSHI et al., 2014), T. saginata e Hymenolepis nana
(ROSSINGNOL & MAISONNEUVE, 1984; ORTIZ et al., 2002).
Sua atividade antiparasitária esta relacionada à sua ação sobre a enzima piruvato
ferredoxina oxiredutase (PFOR) na descarboxilação do piruvato em Acetil CoA, a partir
de transferência de elétrons e produção de ATP (FUIRD & RAGSDALET, 2000;
PALOMARES-ALONSO, et al., 2007). Podendo também inibir enzimas nitroredutases,
quinona1, quinona redutase lesando a membra celular e vacualização. É também
indicado como um tratamento alternativo quando ocorre resistência do parasito aos
tratamentos com outros fármacos. Como o desenvolvimento de resistência da T.
saginata ao praziquantel e niclosamida (LATEEF et al., 2008).
Para o tratamento de helmintiases teciduais foi relatado o uso de ABZ e
praziquantel e ivermectina em Echinococus granulosus (LUVIRA et al., 2014) e
Strongyloides stercoralis (HEMPHILL et al., 2014) e cisticercose (DEL BRUTO et al.,
2014). No entanto o uso frequente desses fármacos pode gerar resistência como
relatado por (CIOLI et al., 2014; GEARY et al., 2012). Isto reforça a necessidade para o
desenvolvimento de novos fármacos.
O objetivo deste estudo foi avaliar alterações no ciclo do ácido cítrico in vitro e
oxidação de ácidos graxos e catabolismo de proteinas de cisticercos de T. crassiceps
induzidas pela exposição a dois fármacos antiparasitários, nitazoxanida e albendazol
sulfóxido.
52
Eliana Isac
2. Material e Metódos
2.1. Manutenção de cisticerco de T. crassiceps
A manutenção de T. crassiceps cepa ORF foi realizada de acordo com a
descrição por FRAGA et al. (2012). Resumidamente, camundongos BALB / c fêmeas
com 8 - 12 semanas de idade são infectados intraperitoneal com 10 cisticercos na fase
inicial (translúcidos e sem brotamentos, e líquido translúcido). Os camundongos
infectados com T.crassiceps são mantidos em gaiolas com o máximo de cinco animais,
recebendo ração padrão e água ad libitum. Após 30 dias de infecção os animais são
eutanasiados, os cisticercos removidos da cavidade peritoneal e inoculados em outro
camundongo BALB/c. Foram obedecidos os princípios éticos da experimentação animal
estipuladas pela Sociedade Brasileira de Animais de Laboratório Ciência (SBCAL).
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Uso de Animais da Universidade
Federal de Goiás (CEUA / UFG) (protocolo número 050/2013).
2.2 Cultura e exposição dos cisticercos aos fármacos
Camundongo com 30 dias de infecção intraperitoneal foi eutanasiado dentro
de uma câmara de fluxo laminar, e os cisticercos removidos e lavados com solução
salina estéril para remover as células e quaisquer outros contaminantes (MARQUEZ-
NAVARRO et al., 2013). Posteriormente, o cisticercos em fase larval (com
brotamentos, translúcidos e liquido translúcido) (VINAUD et al., 2007) foram coletados
e cultivados como descrito por FRAGA et al. (2016). Resumidamente, 30 cisticercos
em fase larval foram adicionados a 5ml de meio de cultura RPMI suplementado.
Os cisticercos foram tratados com 1,2; 0,6; 0,3 e 0,15 ug / mL de NTZ e ABZSO. Os
fármacos foram diluídas com DMSO (0,60 %). Os grupos controles foram constituídos
53
Eliana Isac
por um grupo de cisticercos sem NTZ e outro que recebeu a concentração de DMSO
utilizada para diluir os fármacos. Após 24 horas de cultura, os cisticercos foram
separados do seu meio de cultura, e congelados em nitrogênio líquido para parar as
reações metabólicas (VINAUD et al., 2008).
2.3 Análises Bioquímicas
Os ácidos orgânicos detectados no meio de cultura foram extraídos
através de uma troca iónica em coluna de extração em fase sólida (Bond Elut®
Agilent®) como descrito por VINAUD et al. (2007).
Após a estase metabólica em nitrogênio líquido, os cisticercos foram
descongelados e homogeneizados em 500 uL de tampão Tris-HCl 0,1 M, suplementado
com um inibidor de protease (SIGMAFAST, comprimidos de coquetel inibidor da
protease, EDTA livre, Sigma), pH 7,6. Os extractos obtido foram centrifugados a
15,652g (10.000 rpm) por 10 minutos a 4 ° C e em seguida, os ácidos orgânicos foram
extraídos através de uma troca ionica em coluna de extração em fase sólida (Bond
Elut® Agilent®). As amostras resultantes foram congeladas a -20 ° C para posterior
análise em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (VINAUD et al., 2007). Para a
análise cromatográfica foi utilizada uma coluna de exclusão BIORAD - Aminex HPX -
87H. O eluente foi ácido sulfúrico a 5 mM, 0,6 mL / min, com a leitura
espectrofotométrica da absorvância a 210 nm. Os resultados foram analisados por meio
do software Star Cromatografia Workstation (Agilent®), previamente calibrado para a
identificação de acidos orgânicos que são indicativos do ciclo do ácido cítrico: citrato,
alfa-cetoglutarato, succinato, malato e oxaloacetato e de vias alternativas como: acetato,
acetoacetato, beta-hidroxibutirato fumarato, ureia e creatinina (VINAUD et al., 2007).
54
Eliana Isac
A quantificação da ureia e cretinina foi realizada através de um
dispositivo Architec C8000 e além disso, usando um protocolo de kit comercial com um
método enzimático (FRAGA et al., 2012).
2.4 Análise Estatística
Todos os experimentos foram repetidos cinco vezes de forma
independente. A análise estatística foi realizada através do software Sigma Stat 4.0. A
análise descritiva foi realizada para determinar a distribuição normal e variação
homogênea, bem como a média e desvio padrão.
Com os valores apresentados de distribuição normal, o teste de
análise de variância (ANOVA) foi realizada seguindo-se o pós-teste Bonferrone. As
diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05.
3. Resultados
Este estudo analisou in vitro a ação da NTZ e ABZSO no ciclo do ácido
cictrico e na oxidação de ácidos graxos em cisticercos de T. crassiceps. A ánalise no
meio de cultura detectou citrato, alfa-cetoglutarato, succinato, malato e oxaloacetato,
acetato, beta-hidroxibutirato, enquanto que no extrato do cisticerco determinou-se as
concentrações dentro da célula. Os fármacos foram diluidos em DMSO, o qual não
interferiu nas ánalises metabólicas.
Ciclo do ácido cítrico
Como pode se observar nos grupos controle, há uma concentração maior de
citrato no EC do que no MC (p < 0,05). Esse padrão foi observado somente nos grupos
tratados com ABZSO 1,2 e 0,6 µg/mL (Figura 1).
55
Eliana Isac
Foi observado que os grupos controle e os grupos tratados com NTZ realizaram
o ciclo do ácido cítrico tradicional. Enquanto que os grupos tratados com ABZSO
realizaram a via da fumarato redutase devido a não detecção de alfa-cetoglutarato nem
no MC nem no EC (Figura 2). Houve uma diminuição significativa nas concentrações
de citrato detectadas nos grupos tratados com NTZ quando comparado ao controle
(p<0,05). O tratamento com ABZSO não influenciou as concentrações de citrato
detectadas no EC. Não houve diferença significativa nas concentrações de citrato
detectadas no MC (Figura 1).
Observou-se um aumento significativo na concentração de succinato detectado
no EC do grupo tratado com NTZ 1,2 µg/mL quando comparado ao grupo controle
(p<0,05). Os fármacos não influenciaram as concentrações de succinato nas demais
análises (Figura 3).
Figura 1. Concentração média de citrato detectado no meio de cultura (MC) e
no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido.
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Eliana Isac
Figura 2. Concentração média de α-cetoglutarato detectado no meio de cultura
(MC) e no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido.
Figura 2. Concentração média de succinato detectado no meio de cultura (MC)
e no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido.
57
Eliana Isac
Existe uma concentração significativamente maior de fumarato no MC do grupo
controle do que no meio RPMI sem cisticercos (p<0,05), mostrando que o fumarato
detectado foi proveniente do metabolismo do cisticerco. Em todos os grupos tratados
com NTZ foi possível observar uma maior concentração de fumarato no EC do que no
MC (p<0,05). Este padrão não foi observado no grupo controle nem nos grupos tratados
com ABZSO (Figura 4).
As concentrações de malato detectadas no EC dos grupos tratados com ABZSO
foram significativamente menores do que aquelas observadas no grupo controle
(p<0,05). Em relação as concentrações detectadas no MC observou-se que houve um
aumento significativo de malato nos grupos tratados com NTZ 1,2 e 0,6 µg/mL e
ABZSO 1,2 e 0,6 µg/mL em relação ao grupo controle (p<0,05). É importante ressaltar
que no grupo controle foi possível observar uma concentração de malato
significativamente maior no EC do que no MC (p<0,05), padrão que foi observado
somente nos grupos tratados com NTZ. Nos grupos tratados com ABZSO não houve
diferença entre as concentrações detectadas no EC e no MC (Figura 5).
Observou-se que no grupo controle ocorre uma concentração maior de
oxaloacetato no EC do que no MC (p<0,05). Este padrão foi observado somente nos
grupos expostos com ABZSO nas concentrações de 1,2 e 0,6 µg/mL. Observou-se uma
concentração significativamente menor deste ácido no EC do grupo exposto a NTZ 0,6
µg/mL em relação ao grupo controle (Figura 6).
58
Eliana Isac
Figura 3. Concentração média de fumarato detectado no meio de cultura (MC) e
no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido.
Figura 4. Concentração média de malato detectado no meio de cultura (MC) e
no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido.
59
Eliana Isac
Figura 5. Concentração média de oxaloacetato detectado no meio de cultura
(MC) e no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido.
Oxidação de ácidos graxos
Não se observou a detecção de acetato nos grupos tratados com NTZ. O
tratamento com ABZSO não influenciou nas concentrações de acetato detectadas no EC
e no MC (Figura 7).
Os fármacos não influenciaram as concentrações de beta-hidroxibutirato
detectadas no EC. Com relação as concentrações detectadas no MC, houve um aumento
significativo nos grupos tratados com NTZ 1,2 µg/mL, ABZSO 1,2 e 0,6 µg/mL
(p<0,05). Foi possível observar nos grupos controle que as concentrações de beta-
hidroxibutirato são significativamente maiores no EC do que no MC (p<0,05). Este
padrão foi observado somente nos grupos tratados com NTZ 0,6 e 0,15 µg/mL e
ABZSO 0,6 e 0,15 µg/mL (p<0,05) (Figura 8).
Observou-se um aumento significativo nas concentrações de propionato
encontradas no MC tratado com NTZ 0,6 µg/mL e no EC do grupo tratado com NTZ
60
Eliana Isac
1,2 µg/mL(p<0,05). Por outro lado ocorreu uma diminuição significativa das
concentrações deste ácido no grupo tratado com ABZ 1,2 µg/mL (p<0,05). É
interessante observar que este ácido não foi detectado no MC dos grupos tratados com
NTZ 0,3 e 0,15 µg/mL e ABZSO 0,15 µg/mL, e no EC dos grupos tratados com
ABZSO (Tabela 3). Observou-se que nos grupos controles não ocorre diferença
significativa nas concentrações de propionato detectadas no EC e no MC, padrão que se
repetiu nos grupos tratados (Figura 9).
Figura 6. Concentração média de acetato detectado no meio de cultura (MC) e
no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido.
61
Eliana Isac
Figura 7. Concentração média de beta-hidroxibutirato detectado no meio de
cultura (MC) e no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a
diferentes concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido.
62
Eliana Isac
Figura 8. Concentração média de propionato detectado no meio de cultura (MC)
e no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido.
Catabolismo de proteínas
Foi possível detectar o catabolismo in vitro de proteínas nos cisticercos de T.
crassiceps expostos a diferentes concentrações de NTZ e ABSZO devido a
quantificação de fumarato, ureia e cretatinina tanto no MC quanto no EC.
Observou-se uma diferença significativa nas concentrações de ureia detectadas
no meio de cultura RPMI e no MC do grupo controle (p<0,05) indicando que o parasito
é capaz de produzir ureia. Os fármacos utilizados não influenciaram nas concentrações
de ureia detectadas no MC e no EC. Foi possível observar que nos grupos controle
ocorre uma maior concentração de ureia no MC do que no EC (p<0,05). Este padrão foi
observado somente e nos grupos tratados com NTZ 1,2 µg/mL e nos grupos tratados
com ABZSO. Este fato demonstra uma interferência no padrão de produção de ureia
63
Eliana Isac
pelo parasito quando exposto a NTZ 0,6; 0,3 e 0,15 µg/mL (Figura 10).
Os fármacos utilizados não influenciaram nas concentrações de creatinina
detectadas no EC e MC (Figura 11).
Figura 9. Concentração média de ureia detectada no meio de cultura (MC) e no
extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido.
Figura 10. Concentração média de creatinina detectada no meio de cultura (MC)
e no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes
concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido.
64
Eliana Isac
4. Discussão
Este estudo permitiu avaliar o impacto de dois fármacos anti-helminticos
amplamente utilizados no tratamento de parasitoses intestinais e teciduais no
metabolismo in vitro de cisticercos de T. crassiceps. Estudos metabólicos permitem a
compreensão do mecanismo de ação do fármaco, dos mecanismos de sobrevivência
utilizados pelo parasito e uma melhor compreensão da relação parasito hospedeiro
(VINAUD et al., 2008, 2009; FRAGA et al. 2012a, 2012b).
A detecção de citrato nos grupos tratados com NTZ indica que a acetil-CoA foi
produzido pelas fontes alternativas de produção de energia, como a oxidação de ácidos
graxos e o catabolismo de proteínas (VINAUD et al., 2009; KÖHLER & VOIGT,
1988). Podemos fazer essa afirmação diante do mecanismo de ação do fármaco ao inibir
a ação da enzima piruvato ferredoxina oxidoredutase impedindo a descarboxilação de
piruvato em acetil-coA e, consequentemente, impede a utilização de glicose como fonte
de acetil-coA e citrato (FUIRD & RAGSDALET, 2000; PALOMARES-ALONSO et al.,
2007; HOFFMANN et al., 2007).
A diminuição significativa nas concentrações de citrato detectadas no EC do
grupo tratado com todas as concentrações de NTZ em relação ao grupo controle
confirma este mecanismo de ação do fármaco (FUIRD & RAGSDALET, 2000;
PALOMARES-ALONSO et al., 2007; HOFFMANN et al., 2007). Dessa forma, a
produção de citrato permitiu ao parasito realizar o ciclo do ácido cítrico na forma
tradicional, devido a detecção de alfa-cetoglutarato nos grupos tratados com NTZ.
Nos grupos tratados com ABZSO não foi detectado o alfa-cetoglutarato, nem no
MC quanto no EC mostrando que provavelmente o parasito utilizou a via da fumarato
redutase. A via fumarato redutase é utilizada pelo parasito em situações em que ocorre
depleção de fontes energéticas, como bloqueio da captação de glicose induzida pelo
65
Eliana Isac
ABZ tanto in vitro quanto in vivo (VINAUD et al., 2008; FRAGA et al., 2012a) ou em
situações de alterações metabólicas (VINAUD et al., 2007, 2008 2009). Esta via permite
ao parasito produzir succinato e moléculas doadoras de elétrons como NADH e FADH2
para a cadeia transportadora de elétrons ao metabolismo aeróbio para que ambos se
completem (ZENKA & PROCOPIC, 1987; ZENKA et al., 1987; CORBIN et al., 1998;
VINAUD et al., 2007).
Analisando as concentrações de oxaloacetato observou-se que houve um
aumento somente nos grupos expostos ao ABZSO nas concentrações de 1,2 e 0,6
µg/mL. Indicando que o fármaco nessas concentrações não influenciou nas atividades
das enzimas malato desidrogenase citosolica e malato desidrogenase mitocondrial,
sendo o oxaloacetato desidrogenado para a produção de malato (CORBIN et al., 1998;
LENHINGER et al., 2011).
A detecção de maiores concentrações de malato no EC nos grupos tratados com
NTZ nas concentrações de 1,2 e 0,6 µg/ml em relação ao grupo controle pode ser
resultado do aumento de piruvato pela influência do fármaco bloqueando a PFOR na
descarboxilação do piruvato em acetil-coA (HOFFMANN et al., 2007). Isto gera um
excesso de piruvato mitocondrial que tem transito livre para o citosol, podendo ser
desidrogenado pela enzima lactato desidrogenase e ser excretato como lactato. Podendo
ainda sob ação da enzima málica citosolica originar o malato. Na mitocôndria, o
piruvato é consumido pela ação da enzima málica mitocondrial para a formação do
malato mitocondrial, gerando assim o aumento de malato nessas concentrações dos
fármacos.
Quanto as concentrações de succinato, observou-se um aumento significativo na
concentração deste ácido detectado no EC do grupo tratado com NTZ 1,2 µg/mL
quando comparado ao grupo controle. O succinato foi excretado como produto
66
Eliana Isac
intermediário do ciclo do ácido cítrico, podendo ainda ser utilizado pela via succinato
desidrogenase como transportadora de elétrons na cadeia respiratória confirmando a
preferência do cisticerco pela produção de energia em aerobiose (CORBIN et al., 1998;
DEL ARENAL et al., 2005; WILLMS et al., 2005; LENHINGER, et. al., 2011). Os
fármacos nas demais concentrações não influenciaram as concentrações de succinato.
Foi possível observar uma maior concentração de fumarato no MC do grupo controle
quando comparado ao meio RPMI sem o cisticerco, sendo um indicativo que o fumarato
detectado foi originado do cisticerco sem ação dos fármacos. Em todos os grupos
tratados com NTZ observou-se um aumento nas concentrações de fumarato, indicando
que este metabólico pode ter sido produzido pelo catabolismo de proteínas no ciclo da
úreia, podendo ser excretado ou entrar para a mitocôndria participando do ciclo do ácido
cítrico (LEHNINGER et al., 2011). As concentrações de fumarato não foram alteradas
nos grupos tratados com ABZSO.
As concentrações de beta-hidroxibutirato não foram influenciadas pelos
fármacos no EC. Entretanto podemos observar um aumento significativo das
concentrações deste ácido no MC nos grupos tratados com NTZ 1,2 µg/mL, ABZSO 1,2
e 0,6 µg/ml. Foi possível observar também que as concentrações detectadas de beta-
hidroxibutirato são significativamente maiores no MC do que no EC no grupo controle,
o mesmo ocorreu nos grupos tratados com NTZ 0,6 e 0,15 µg/mL e ABZSO 0,6 e 0,15
µg/ml. Pela influência exercida pelos fármacos na captação da glicose acredita-se que o
parasito tenha utilizado outra fonte alternativa para a produção de energia com a
produção de acetil-coA a partir da degradação de ácidos graxos. Além disso, a não
detecção de acetato nos grupos tratados com NTZ confirmam a influência deste fármaco
na enzima ferredoxina oxidoredutase (HORTON, 2000; LENHIGNER et al., 2011).
Isto provavelmente tenha ocorrido pois o acetato foi utilizado pelo parasito para
67
Eliana Isac
a produção de acetil coA produzido por vias alternativas e suprindo as concentrações
necessárias deste metabólito nas vias do ciclo do ácido cítrico (HORTON, 2000;
LENHIGNER et al., 2011).
Foi detectado um aumento de propionato no MC no grupo tratado com NTZ 0,6
µg/mL e no EC do grupo tratado com NTZ 1,2 µg/mL. Provavelmente este ácido
orgânico foi consumido para a produção de succinato, utilizando uma via alternativa
para a produção de energia pela influência da NTZ na captação de glicose. (HORTON,
2000, LEHNINGER et al., 2011; FRAGA et al., 2012a). Diferentemente nos grupos
onde ocorre uma diminuição do propionato e nos grupos onde não foi detectado, este
metabólito pode ter sido consumido para a produção de propionil CoA gerando ácidos
graxos voláteis como metilbutirato e metilvalerato, excretados em condições de
anaerobiose (LEHNINGER et al., 2011; FRAGA et al., 2012).
A diferença significativa encontrada de ureia detectada no MC em relação ao EC
no grupo controle indica que o parasito está realizando o catabolismo de proteínas.
Entretanto em nenhuma concentração os fármacos interferiram nas concentrações de
ureia no MC e EC. Observou-se que nos grupos controle e nos grupos tratados com
NTZ e nos grupos tratados com ABZSO ocorre uma maior concentração de ureia no
MC do que no EC, demonstrando uma interferência no padrão de produção de ureia
pelo parasito nos grupos expostos a NTZ 0,6; 0,3 e 0,15 µg/ml. A detecção do ciclo da
uréia é uma via metabólica importante na excreção de produtos tóxicos como a amônia
em mamíferos (LEHNINGER et al., 2011).
Podemos concluir diante dos resultados encontrados que o mecanismo de ação
descrito da NTZ, o bloqueio da enzima piruvato ferredoxina oxidoredutase impede
descarboxilação de piruvato em acetil-CoA e, consequentemente, impedindo a
utilização de glicose como fonte de acetil-coA. Esse mecanismo de ação induz o
68
Eliana Isac
parasito ao uso de vias alternativas para a produção de acetil CoA, como a oxidação de
ácidos graxos e o catabolismo de proteínas. Observou-se também a preferência do
metabolismo aeróbio nos grupos tratados com a NTZ e o uso da via da fumarato
redutase nos grupos expostos ao ABZSO pela não detecção de alfa-cetoglutarato nesses
grupos.
69
Eliana Isac
5. Referências Bibliográficas
ABAZA, H.; EL-ZAYADI, S. M.; KABIL, H. RIZK. Nitazoxanide in the
treatment of patients with intestinal protozoan and helminth infections: a report
on 546 patients in Egypt. Curr Ther Res n.59, p. 116-121, 1998.
BROEKHUYSEN, J.; STOCKIS, A.; LINS, R. L.; GRAEVE, J.;
ROSSINGNOL, J. F. Nitazoxanide pharmacokinetics and metabolism in man.
Int. Jornal Clinical Pharmacology Therapeutic, Estados Unidos, n. 38, p. 387-
394, 2000.
CIOLI, D.; PICA-MATTICI A, L.; BASSO, A.; GUIDI, A. Schistosomiasis
control: praziquatel forever? Molecular & Biochemica l Parasitology, Holanda,
n. 195, p. 23-29, 2014.
CORBIN, I.; SIMC, V. R.; NOVAK, M.; BLACKBURN, B. J. Metabolism of
[3-13
C]- pyruvate by cysticerci of Taenia crassiceps. Parasitology Research,
Alemanha, 84, 516–518, 1998.
COYLE, C.M; MAHANTY, S.; ZUNT, J. R.; WALLIN, M.T.; CANTEY, P. T.;
WHITE JÚNIOR, A. C.; O’NEAL, S. E.; SERPA, J. A.; SOUTHERN, P. M.;
WILKINS, P.; MCCARTHY, A. E.; HIGGS, E. S.; NASH, T. E.
Neurocysticercosis: Neglected but Not Forgotten. PLoS Negl Trop Dis, n.6, v.5,
1500, 2012.
DAVID, A.; BOBAK, M. D. Use of nitazoxanide for gastrointestinal tract
infections: Treatment of protozoan parasitic infection and beyond. Current
70
Eliana Isac
Infectious Reports, Estados Unidos, n. 8, p. 91-95, 2006.
DAVILA-GUTIERREZ, C. E.; VASQUEZ, B.; TRUJILLO-HERNANDEZ, B,
HUERTA, M.N itazoxanide compared with quinfamine and mebendazole in the
treatment of helminthic infections and intestinal protozoa in children. Am J Trop
Med Hyg, Estados Unidos, 66: 251-254, 2002.
DEL ARENAL, I P.; RUBIO, M. E.; RAMIREZ, J.; RENDON, J. L.;
ESCAMILLA, J. E. Cyanide-resistant respiration in Taenia crassiceps
metacestode (cysticerci) is explained by the H2O2-producing side-reaction of
respiratory complex I with O2. Parasitology International, Holanda, n. 54, p.
185-193, 2005.
DEL BRUTTO, O. H. Neurocysticercosis. Handbook of Clinical Neurology,
Holanda, n. 121, p. 1445-1459. doi: 10.1016/B978-0-7020-4088-7.00097-3,
2014.
DIAZ, E.; MONDRAGON, J.; RAMIREZ, E.; BERNAL, R. Epidemiology and
control of intestinal parasites with nitazoxanide in children in México. The
American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, Estados Unidos, n. 68, p.
384-385, 2003
DORAIS, F. J.; ESCH, G. W. Growth rate of two Taenia crassiceps strains.
Experimental Parasitology, Estados Unidos, n. 25, p. 395–398, 1969.
FOGANG, Y. F.; SAVADOGO, A. A.; CAMARA, M.; TOFFA, D. H.; BASSE,
71
Eliana Isac
A.; SOW, A. D.; NDIAYE, M. M. Managing neurocysticercosis: challenges and
solutions . International Journal of General Medicine, Inglaterra, n. 8, p. 333-
344. doi: 10.2147/IJGM.S73249, 2015.
FOX, L. M.; SARAVOLATZ, L. M. -Nitazoxanide: A new thiazolide
antiparasitic agent. Reviens of Anti-Infective Agents, Estados Unidos, n. 40, p.
1173-1180, 2005
FRAGA, C. M.; COSTA, T. L.; BEZERRA, J. C. B.; LINO JUNIOR, R. S.;
VINAUD, M.C. Fatty acids oxidation and alternative energy sources detected in
Taenia crassiceps cysticerci after host treatmen with antihelmintic drugs.
Experimental Parasitology, Estados Unidos, n. 131, p. 111-115, 2012a.
FRAGA, C. M.; COSTA, T. L.; BEZERRA, J. C. B.; LINO JUNIOR, R. S.;
VINAUD, M.C. Taenia crassiceps: Host treatment alters glycolisis and
tricarboxilic acid cycle in cysticerci. Experimental Parasitology, Estados
Unidos, n. 130, p. 146-151, 2012b.
FUIRD, C.; RAGSDALET S. W. The role of Pyruvate Ferredoxin in Pyruvate
Synthesis during Autotrophic growth by the Wood-Ljungdahl. The Journal of
Biological Chemistry by The American Society for Biochemistry and Molecular
biology, Estados Unidos, 275 : 28494-28499.
GARCIA, H. H.; NASH, T. E.; DEL BRUTO, O. H.Clinical syptoms, diagnosis,
and treatment of neurocysticercosis. The Lancet Neurology, Estados Unidos, n.
13, v. 12, p. 1202-1215, doi: 10.1016/S1474-4422(14)70094-8, 2014.
72
Eliana Isac
GEARY, T.; SANGSTER, N. C.; THOMPSON, D. P. Frontiers in anthelmintic
pharmacology. Veterinary Parasitology, Holanda, n. 1,v. 84, p. 251-254, 1999.
GEARY, T.G. Are new anthelmintics needed to eliminate human helminthiases?
Current Infections Diseases, Estados Unidos, n. 25, p. 709-717, 2012.
HEMPHILL, A.; STADELMANN, B.; RUFENER, R., SPILIOTIS, M.,
BOUBAKER, G., MÜLLER, J.; MÜLLER, N.; GORGAS, D.; GOTTSTEIN, B.
Treatment of echinococcosis: albendazole and mebendazole--what else?
Parasite journal de la Société Française de Parasitologie, França, n. 21, v. 70.
doi: 10.1051/parasite/2014073, 2014.
HOFFMAN, P. S.; SISSON,G., MATTHEW, C., WELCH, K., Dean Hartman,
W., NUNILO, C., MORASH, M.G. Antiparasitic Drug Nitazoxanide Inhibits the
Pyruvate Oxidoreductases of Helicobacter pylori, Selected Anaerobic Bacteria
and Parasites, and Campylobacter jejuni. Antimicrob Agents Chemother, Estados
Unidos, n. 5, v. 3, p.868-876, 2007.
HORTON, J. Albendazole: a rewiew of anthelmintic efficacy and safety in
humans. Parasitology, n. 121, S113-S132, 2000.
HU, Y.; ELLIS, B.L.; YIU, Y. Y.; MILLER, M. M.; URBAN, J. F.; SHI, L. Z.;
AROIAN, R. V. An Extensive Comparison of the Effect of Anthelmintic Classes
on Diverse Nematodes. Public Library of Science one, Estados Unidos, n.15, v.
8 (7) e70702. doi: 10.1371/journal.pone.0070702, p. 1-11, 2013.
73
Eliana Isac
HUANG, X.; GUO, C.; CHEN, Z.; LIUN, Y.; HE, L.; ZENG, Z.; YAN, C.; PAN,
G.; LI, S. Metabolism of nitazoxanide in rats, pigs, and chickens: application of
liquid chromatography coupled to hybrid linear ion trap/Orbitrap mass
spectrometer. College of Veterinary Medicine, South China Agricultural
University, Guangzhou 510642, China, 2015.
JUAN, J. O.; LOPEZ CHEGNE, N.; GARGALA, G.; FAVENNEC, L.
Comparative clinical studies of nitaoxanide albendazole and praziquantel in the
treatment of áscaris, trichuriases and hymenolepiasis in children from Peru.
Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, Inglaterra,
n. 96, v. 2, p. 193-196, 2002.
LAMSAN, S.; McMANUS, D.P.Molecular characterization of the surface and
cyst fluid components of Taenia crassiceps. Parasitology, n.101, p.115-125,
1990.
LATEEF, M. ; ZARGAR, S. A. ; KHAN, A. R. ; NAZIR, M. ; SHOUKAT, A.
Successful treatment of niclosamide- and praziquantel-resistant beef tapeworm
infection with nitazoxanide. International Journal of Infectious Diseases,
Canadá, n. 12, v. 1, p. 80-82. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.ijid.2007.04.017,
2008.
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de bioquimica,
second ed. Sarvier, Editora de Livros Médicos Ltda. São Paulo, 839 p, 2005.
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de bioquímica de
74
Eliana Isac
Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2011. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014
LUVIRA, V.; WATTHANAKULPANICH, D.; PITTISUTTITHUM, P.
Management of Strongyloides stercoralis: a puzzling parasite. International
Health, Inglaterra, n.6, p. 273-281. doi: 10.1093/inthealth/ihu058, 2014.
MELHORN H.; FRANZ M.; TARASCHEWSKI H.; VOIGH W P.,
WALLDORF V. Metazoan organization. In: Melhorn, H. (Ed.), Parasitology in
focus: Facts and Trends, first ed. Springer-Verlag, Alemanha, 924 p, 1988.
ORTIZ, J. L.; LOPEZ CHEGNE, N.; GARGALA, G.; FAVENNEC, L.
Comparative clinical studies of nitazoxanide , albendazole and praziquantel in
the treatment of ascariasis, trichuriasis and hymenolepiasis in children from
Peru. Transactions of 2002.the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene,
Inglaterra, n. v. 2 p.193-196,
PALOMARES-ALONSO, F.; PILIADO, J. C.; PALENCIA, G.; ORTIZ-PLATA,
A.; JUNG-COOK, H. Efficacy of nitazoxanide, tizoxanide and
tyzoxanide/albendazole sulphoxide combination against Taenia crassiceps cysts.
The Journal of antimicrobial chemotherapy, Inglaterra, n. 59, v. 2, p. 212-218,
2007.
ROSSINGNOL, J. E.; MAISONNEUVE, H. Nitazoxanida in the treatment of
Taenia saginata and Hymenolepis nana infections. American Journal of Tropical
Medicine and Hygiene, Estados Unidos, n. 33, v. 3, p. 511-512, 1984.
75
Eliana Isac
SOMVANSHI, V.S.; ELLIS, B. L., HU, Y.; AROIAN, R.V. Nitazoxanide:
nematicidal mode of action and drug combination studies. Molecular and
Biochemical Parasitology, Holanda, n. 193, v. 1, p. 1-8. doi:
10.1016/j.molbiopara.2013.12.002, 2014.
VAZ, A. J.; NUNES, C. M.; PIAZZA, R. M.; LIVRAMENTO, J. A.; DA SILVA,
M.V.; NAKAMURA, P. M.; FERREIRA, A.W. Immunoblot with cerebrospinal
fluid from patients with neurocysticercosis using antigen from cysticerci of
Taenia solium and Taenia crassiceps. The American journal of tropical medicine
and hygiene, Estados Unidos, n. 57, v. 3, p. 354-357, 1997.
VINAUD, M. C., LINO JUNIOR, R.S.; BEZERRA, J. C. B. Taenia crassiceps
organic acids detect in cysticerci. Experimental Parasitology, Estados Unidos, n.
116, v. 4, p. 335-339, 2007.
VINAUD, M. C.; FERREIRA, C. S.; LINO JUNIOR, R. S.; BEZERRA, J. C. B.
Taenia crassiceps: fatty acids oxidation and alternative energy source in in vitro
cysticerci exposed to anthelminthic drugs. Experimental Parasitology, Estados
Unidos, n. 122, v. 3, p. 208-211, 2009.
VINAUD, M. C.; FERREIRA, C. S.; LINO JUNIOR, R. S.; BEZERRA, J.C.B.
Taenia crassiceps: Energetic and respiratory metabolism from cysticerci
exposed to praziquantel and albendazole in vitro. Experimental Parasitology,
Estados Unidos, n. 120, v. 3, p. 221-226, 2008.
WILLMS, K.; PRESAS, A. M.; JIMENEZ, J. A.; LANDA, A.; ZURABIAN, R.;
76
Eliana Isac
UGARTE, M. E.; ROBERT, L. Taeniid tapeworm responses to in vitro glucose.
Parasitology Research, Alemanha, n. 96, v. p. 296-301, 2005.
ZENKA, J.; PROKOPIC, J. Malic enzyme, malate dehydrogenase, fumarate
reductase and succinate dehydrogenase in the larvae of Taenia crassiceps (Zeder
1800). Folia Parasitologica, República Checa, n. 34, v. 2, p. 131–136, 1987.
77
Eliana Isac
6. CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este estudo permitiu avaliar alterações metabólicas nos cisticercos de T.
crassiceps expostos in vitro a diferentes concentrações de NTZ e ABZSO. Dessa forma
foi possível observar que:
1. As concentrações testadas de NTZ induziram a uma acidose metabólica in vitro
em cisticercos de T. crassiceps, detectada pelas concentrações de lactato
elevadas no MC.
2. Observou-se maior impacto na captação de glicose nos grupos tratados com as
diferentes concentrações de NTZ.
3. Foi possível observar a utilização de vias alternativas de produção de Acetil-
CoA, como a oxidação de ácidos graxos e o catabolismo de proteínas, devido a
detecção de citrato nos grupos tratados com NTZ
4. O mecanismo ação da NTZ descrito em protozoários foi confirmado in vitro em
cisticercos de T. crassiceps devido a não detecção de acetato nos grupos tratados
com diferentes concentrações deste ácido.
5. Observou-se uma preferência pela via da fumarato redutase nos grupos expostos
ao ABZSO pela não detecção de alfa-cetoglutarato.
6. A oxidação de ácidos graxos foi influencia pela presença de NTZ devido a
alterações detectadas nas concentrações de beta-hidroxibutirato e propionato
7. Foi possível detectar o catabolismo de proteínas nos parasitos expostos aos
fármacos, que não influenciaram nessa via.
78
Eliana Isac
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABAZA, H.; EL-ZAYADI, S. M.; KABIL, H. RIZK. Nitazoxanide in the treatment of
patients with intestinal protozoan and helminth infections: a report on 546 patients in
Egypt. Curr Ther Res n.59, p. 116-121, 1998.
ALARCON, F.NEUROCYSTICEROSIS: it’s a etiopathogenesis, clinical
manifestations, diagnosis and treatment. Revista de Neurologia, Espanha, n. 10 v. 43, p.
93-100, 2006.
AROCKER-METTINGER E.; HUBER-SPITZY, V.; AUER, H.; GRABNER, G.;
STUR, M. Taenia crassiceps in the anterior chamber of the human eye. A case report.
Klinische Monatsblätter für Augenheilkunde, Alemanha, n. 201 v.1, p. 34-37, 1992.
BALLEK, D.; TAKLA, M.; ISING-VOLMER, S.; STOYE, M. The helminth fauna of
red foxes (Vulpes vulpes Linnaeus 1758) in north Hesse and east Westphalia. 1.
Cestodes. Deutsche tierärztliche Wochenschrift, Alemanha, n. 99, v.9, p.362-365, 1992.
BARRET, J. Forty years of helminth biochemistry. Parasitology, Inglaterra, n.136, p.
1633-1642, 2009.
BASSO, W.; RUTTER, M.; DEPLASES, P.; GRIMM, F. Generalized Taenia crassiceps
cysticercosis in a chinchilla (Chinchilla lanigera). Veterinary Parasitology, Hollanda, n.
199, p. 116-120, 2014.
BELKIND-VALDOVINOS, U.; BELKIN-GERSON, J.; SÁNCHES-FRANCIA, D.;
ESPINOZA-RUIZ, M. M.; LASCANO-PONCE, E. Nitazoxanide vs albendazole
79
Eliana Isac
against intestinal parasites in a single dose for three days. Salud Pública, Mexico, n. 46,
p. 333-40, 2004.
BROEKHUYSEN, J.; STOCKIS, A.; LINS, R. L.; GRAEVE, J.; ROSSINGNOL, J. F.
Nitazoxanide pharmacokinetics and metabolism in man. Int. Jornal Clinical
Pharmacology Therapeutic, Estados Unidos, n. 38, p. 387-394, 2000.
BROJER, C. M.; PEREGRINE, I. K.; CARRENO, R. A.; POST, C. Cerebral
cysticercosis in Woodchuck ( Marmota monax). Journal of Wildlife Diseases, Estados
Unidos, n.38, p. 621-624, 2002.
CHAHALES, P.; HOFFMAN, P. S, THANASSI, D. G. Nitazoxanide Inhibits Pilus
Biogenesis by Interfering with Folding of the Usher Protein in the Outer Membrane, pii:
AAC.02221-15, 2016, [Epub ahead of print].
CHERMETTE, R.; BUSSIERAS, J.; PROPHETTE, C.; MAILLARD, H.; FABIANI,
B. Invasive cysticercosis due Taenia crassiceps in an AIDS patient. Bulletin de
l’academie Nationale de Medecine, França, n.179, v. 4, p. 777-783, 1995.
CIOLI, D.; PICA-MATTICIA, L. Prazinquantel Parasitol Reseach, Estados Unidos, n.
90: S3: S9, 2001.
CIOLI, D.; PICA-MATTICIA, L.; BASSO, A.; GUIDI, A. Schistosomiasis control:
praziquatel forever? Molecular & Biochemica l Parasitology, Holanda, n. 195, p. 23-29,
2014.
80
Eliana Isac
CIOLI, D.; PICA-MATTOCCIA, L.; ARCHER, S. Antischistosomal drugs: past, present
and future? Pharmacology & therapeutics, Inglaterra, n. 6, v. 81, p. 35-85, 1995.
CORBIN, I.; SIMC, V. R.; NOVAK, M.; BLACKBURN, B. J. Metabolism of [3-13
C]-
pyruvate by cysticerci of Taenia crassiceps. Parasitology Research, Alemanha, 84, 516–
518, 1998.
COYLE, C.M; MAHANTY, S.; ZUNT, J. R.; WALLIN, M.T.; CANTEY, P. T.; WHITE
JÚNIOR, A. C.; O’NEAL, S. E.; SERPA, J. A.; SOUTHERN, P. M.; WILKINS, P.;
MCCARTHY, A. E.; HIGGS, E. S.; NASH, T. E. Neurocysticercosis: Neglected but
Not Forgotten. PLoS Negl Trop Dis, n.6, v.5, 1500, 2012.
DA SILVA, S. P. Estudo da ação do praziquantel sobre as propriedades da adesão e
contração do Schistosoma mansoni in vitro. Tese pelo Departamento de Farmacologia
Básica e Clínica, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Rio de Janeiro, 1993.
DAVID, A.; BOBAK, M. D. Use of nitazoxanide for gastrointestinal tract infections:
Treatment of protozoan parasitic infection and beyond. Current Infectious Reports,
Estados Unidos, n. 8, p. 91-95, 2006.
DAVILA-GUTIERREZ, C. E.; VASQUEZ, B.; TRUJILLO-HERNANDEZ, B,
HUERTA, M.N itazoxanide compared with quinfamine and mebendazole in the
treatment of helminthic infections and intestinal protozoa in children. Am J Trop Med
Hyg, Estados Unidos, 66: 251-254, 2002.
81
Eliana Isac
DEBLOCK, S.; PETAVY, A. F. Hepatic larvae of cestode parasites of the vole rat
Arvicola terrestris in Auvergne, France. Annales de Parasitologie Humaine et
Comparée, França, n. 58, v. 5, p. 423-437, 1983.
DEL ARENAL, I. P.; RUBIO, M. E.; RAMIREZ, J.; RENDON, J. L.; ESCAMILLA, J.
E. Cyanide-resistant respiration in Taenia crassiceps metacestode (cysticerci) is
explained by the H2O2-producing side-reaction of respiratory complex I with O2.
Parasitology International, Holanda, n. 54, p. 185-193, 2005.
DEL ARENAL, I. P.; FLORES, A. G.; POOLE, R. K.; ESCAMILHA, J. E. Taenia
crassiceps metacestodes have cytochrome oxidase aa3 but not cytochrome o
functioning as thermal oxidase. Molecular Biochemical Parasitology, Holanda, n. 114,
p. 103-109, 2001.
DEL BRUTO, O. H.; ROOS, K. L.; COFFEY, C. S.; GARCÍA, H. H. Meta-analysis:
cysticidal drugs for neurocysticercosis: albendazole and prazinquantel. Annals of
Internal Medicine, Estados Unidos, p. 145 p. 43-51, 2006.
DEL BRUTTO, O. H. Neurocysticercosis. Handbook of Clinical Neurology, Holanda, n.
121, p. 1445-1459, doi: 10.1016/B978-0-7020-4088-7.00097-3, 2014.
DEL BRUTTO, O.H.; GARCÍA, H. H. Neurocysticercosis in Nonendemic Countries:
Time for a Reappraisal. Neuroepidemiology, n. 39, p.145-146, 2012.
DIAZ, E.; MONDRAGON, J.; RAMIREZ, E.; BERNAL, R. Epidemiology and control
of intestinal parasites with nitazoxanide in children in México. The American Journal of
82
Eliana Isac
Tropical Medicine and Hygiene, Estados Unidos, n. 68, p. 384-385, 2003.
DONATO, C.; PICA-MATTOCCIA, L.; BASSO, A.; GUIDI, A. Schistosomiasis
control: praziquantel forever? Molecular and Biochemical Parasitology, v. 195, p. 23-
29, 2014.
DORAIS, F. J.; ESCH, G. W. Growth rate of two Taenia crassiceps strains.
Experimental Parasitology, Estados Unidos, n. 25, p. 395–398, 1969.
DUBREUIL, L., HOUCKE, I., MOUTON, Y.; ROSSIGNOL, J. F. In vitro evaluation of
activities of nitazoxanide and tizoxanide against anaerobes and aerobic organisms.
Antimicrob Agents Chemother Estados Unidos, n. 40, p. 2266-2270, 1996.
DUONG, T. H.; MONGERDIEU, S. C.; BAILLY, E. R.; GUILLOU-GARNIER, M. F.;
FETISSOF, F.; RICHARD-LENOBLE, D. Cysticercosis contracted in metropolitan
France. Presse Medicine, França, n. 35, p. 243–245, 2006.
DYER, N. W.; GREEVE, J. H. Severe Cysticercus longycollis cysticercosis in a black
lemur (Eulemur macaco macaco). Journal of Veterinary Diagnostic Investigation,
Estados Unidos, n.10, v.4, p. 362-364, 1998.
EATON, R. D.; SECORD, D. C. Some intestinal parasites of Artic fox, Banks Island,
N.W.T. Canadian Journal of Comparative Medicine, Canadá, n. 43, v. 2, p. 229-230,
1979.
EDWARDS, G.; BRECKENRIDGE, A. M. Clinical pharmacokinetics of antihelminthic
83
Eliana Isac
drugs. Clinical pharmacokinetics, Inglaterra, n. 15 v. 2, p. 67-93, 1988.
EISSA, M. M.; AMER, E. I.; EL SAWY, S. M. F. “Leishmania major: activity of
tamoxifen against experimental cutaneous leishmaniasis. Experimental parasitology,
Inglaterra, n. 128, v. 4, p. 382-390, 2011.
ESCOBEDO, A. A.; BALLESTEROS, J.; GONZÁLEZ-FRAILE, E.; ALMIRALL, P.
A meta-analysis of the efficacy of albendazole compared with tinidazole as treatments
for Giardia infections in children. Acta Tropica, Holanda, n. 153, p. 120-127. doi:
10.1016/j.actatropica.2015.09.023, 2016.
ESCOBEDO, G. ; PALACIOS- ARREOLA, M. I.; OLIVOS A.; LÓPES-GRIEGO, L.;
MORALES- MONITOR, J. Tamoxifen treatment in hamsters induces protection during
taeniosis by Taenia solium. Biomed Research International, Estados Unidos, 280496.
doi: 10.1155/2013/280496. Epub 2012 Dec 20. ID 280496, 2013.
ESPINDOLA, N. M.; VAZ, A. J.; PARDINI, A. X.; FERNANDES, I.
Excretory/secretory antigens (ES) from in vitro cultures of Taenia crassiceps cysticerci,
and use of an anti-ES monoclonal antibody for antigen detection in samples of
cerebrospinal fluid from patients with neurocysticercosis. Annals of Tropical Medicine
and Parasitology, Inglaterra, n. 96, v. 4, p. 361–368, 2002.
ESPOSITO, M.; MOORES, S. L.; HEMPHILL, A. Nitazoxanide and thiazolides, a
novel class of broad-spectrum anti-parasitic drugs. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, v. 6, p. 1-11, 2006.
84
Eliana Isac
ESPOSITO, M.; MÜLLER, N.; HEMPHILL, A. Structure –activity relationships from
in vitro efficacies of the thiazolide series against the intracellular apicomplex protozoan
Neospora caninum. International Journal of Parasitology, v. 37, p.183-190, 2007.
EVERHART, M. E.; KUHN, R. E.; ZELMER, D. A. Infrapopulation dynamics of a wild
strain of Taenia crassiceps (WFU) (Cestoda: Taeniidae) in Balb/cJ mice. Journal of
Parasitology, v. 90, p. 79–84, 2004.
FOGANG, Y. F.; SAVADOGO, A. A.; CAMARA, M.; TOFFA, D. H.; BASSE, A.;
SOW, A. D.; NDIAYE, M. M. Managing neurocysticercosis: challenges and solutions .
International Journal of General Medicine, Inglaterra, n. 8, p. 333-344. doi:
10.2147/IJGM.S73249, 2015.
FOX, L. M.; SARAVOLATZ, L. M. -Nitazoxanide: A new thiazolide antiparasitic agent.
Reviens of Anti-Infective Agents, Estados Unidos, n. 40, p. 1173-1180, 2005.
FRAGA, C. M. Avaliação Bioquímica in vitro do metabolismo energético de cisticercos
de Taenia crassiceps expostos a um derivado benzimidazólico, RCB20. Goiânia [Tese
de doutorado em Medicina Tropical - IPTSP/UFG], 2015.
FRAGA, C. M. Avaliação bioquímica in vivo do tratamento ant-helmíntico em
cisticercos de Taenia crassiceps. 91 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Tropical e
Saúde Pública), Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal
de Goiás, Goiânia, 2011.
85
Eliana Isac
FRAGA, C. M.; COSTA, T. L.; BEZERRA, J. C. B.; LINO JUNIOR, R. S.; VINAUD,
M.C. Fatty acids oxidation and alternative energy sources detected in Taenia crassiceps
cysticerci after host treatmen with antihelmintic drugs. Experimental Parasitology,
Estados Unidos, n. 131, p. 111-115, 2012a.
FRAGA, C. M.; COSTA, T. L.; BEZERRA, J. C. B.; LINO JUNIOR, R. S.; VINAUD,
M.C. Taenia crassiceps: Host treatment alters glycolisis and tricarboxilic acid cycle in
cysticerci. Experimental Parasitology, Estados Unidos, n. 130, p. 146-151, 2012b.
FRANCOIS, A.; FAVENNEC, L. P.; CAMBO-MICHOT.; C.; GUET, I.; BIGA, N.;
TRON, F.; BRASSEUR, P.; HEMET, J. Taenia crassiceps invasive cysticercosis: A new
human pathogen in acquired immunodeficiency syndrome. The American Journal of
Surgical Pathology ,Estados Unidos, n. 22, v. 4, p. 488-492, 1998.
FRASSEN, F. E.; NIJSSE, R.; MULDER, J.; CREMERS, H.; DAM, C.; JAKUMI K.;
VAN DER GILSSEN, J. Increase in number of helminth species from Dutch red foxes
over a 35 years period. Parasites Vectors, Inglaterra, n. 7, p. 166, 2014.
FREEMAN, R. S. Studies on the biology of Taenia crassiceps (Zeder 1800) Rudolphi,
1810 (Cestoda). Canadian Journal of Zoology, Canadá, n. 40, v. 6, p. 969-990, 1962.
FREEMAN, R. S.; FALLIS, M.; SHEA, M. ; MABERLEY, A. L. ; WALTERS, J.
Intraocular Taenia crassiceps (Cestoda). Part II. The parasite. The American Journal of
Tropical Medicine and Hygiene, Estados Unidos, n. 22, p. 493-495, 1973.
FROSCH, M.; BUTTNER, D. W.; TAPPE, D. Subcutaneous Taenia crassiceps infection
86
Eliana Isac
in a patient with non-hodgkin's lymphoma. The American Journal of Tropical Medicine
and Hygiene, Estados Unidos, n. 75, v.1, p. 108-111, 2006.
FUIRD, C.; RAGSDALET S. W. The role of Pyruvate Ferredoxin in Pyruvate Synthesis
during Autotrophic growth by the Wood-Ljungdahl. The Journal of Biological
Chemistry by The American Society for Biochemistry and Molecular biology, Estados
Unidos, 275 : 28494-28499, 2000.
GARCIA, H. H.; NASH, T. E.; DEL BRUTO, O. H.Clinical syptoms, diagnosis, and
treatment of neurocysticercosis. The Lancet Neurology, Estados Unidos, n. 13, v. 12, p.
1202-1215, doi: 10.1016/S1474-4422(14)70094-8, 2014.
GEARY, T.; SANGSTER, N. C.; THOMPSON, D. P. Frontiers in anthelmintic
pharmacology. Veterinary Parasitology, Holanda, n. 1, v. 84, p. 251-254, 1999.
GEARY, T.G. Are new anthelmintics needed to eliminate human helminthiases? Current
Opinion in Infectious Diseases, Estados Unidos, n. 25, p.709-717, 2012.
GILLES, H. M.; HOFFMAN, P. S. Treatmentof intestinal parasitic infection: a review
of nitazoxanide. Trends of Parasitology today, n.1, v. 3, p. 95-97, 2002.
GREENBERG, R. M. Ca+2 signalling, volatege-gated Ca+2 channels and praziquantel
in flatworm musculature. Parasitology, Inglaterra, 131: 97-108, 2005.
GROLL, E. E. Chemotherapy of human cysticercosis with praziquantel. IN: Flisser A,
Willms K, LACLETTE, J. P.; LARRALDE, C. Cysticercosis: present state of
87
Eliana Isac
knowledge and perspectives. Academic Press, New York, USA. 700P, 1982.
HELDWEIN, K.; BIEDERMANN, H.; HAMPERI, W.; BRETZEL, G.; LOSCHER, T.;
LAREGINA, D.; FROSCH,M.; BÜTTNER, D. W.; TAPPE, D. Subcutaneous Taenia
crassiceps infection in a patient with non-Hodgkin’lymphoma. The American Journal of
Tropical Medicine and Hygiene, Estados Unidos, n.75, v. 1, p.108-111, 2006.
HEMPHILL, A.; STADELMANN, B.; RUFENER, R.; SPILIOTIS, M.; BOUBAKER,
G.; MÜLLER, J.; MÜLLER, N.; GORGAS, D.; GOTTSTEIN, B. Treatment of
echinococcosis: albendazole and mebendazole--what else? Parasite journal de la
Société Française de Parasitologie França, n. 21, v. 70, doi: 10.1051/parasite/2014073,
2014.
HOBERG, E. P.; JONES, A.; RAUSCH, R. L.,EMON, K. S.; GARDNER, L. A
phylogenetichy hypothesis for species of the genus Taenia (Eucestoda: Taenidae). The
Journal of Parasitology, Estados Unidos, n. 86, p. 89-98, 2000.
HOFFMAN, P. S.; SISSON,G., MATTHEW, C., WELCH, K., Dean Hartman, W.,
NUNILO, C., MORASH, M.G. Antiparasitic Drug Nitazoxanide Inhibits the Pyruvate
Oxidoreductases of Helicobacter pylori, Selected Anaerobic Bacteria and Parasites, and
Campylobacter jejuni. Antimicrob Agents Chemother, Estados Unidos, n. 5, v. 3, p.868-
876, 2007.
HORTON, J. Albendazole: a rewiew of anthelmintic efficacy and safety in humans.
Parasitology, n. 121, S113-S132, 2000.
88
Eliana Isac
HU, Y.; ELLIS, B.L.; YIU, Y. Y.; MILLER, M. M.; URBAN, J. F.; SHI, L. Z.;
AROIAN, R. V. An Extensive Comparison of the Effect of Anthelmintic Classes on
Diverse Nematodes. Public Library of Science one, Estados Unidos, n.15, v. 8 (7)
e70702. doi: 10.1371/journal.pone.0070702, p. 1-11, 2013.
HUANG, X.; GUO, C.; CHEN, Z.; LIUN, Y.; HE, L.; ZENG, Z.; YAN, C.; PAN, G.; LI,
S. Metabolism of nitazoxanide in rats, pigs, and chickens: application of iquid
chromatography coupled to hybrid linear ion trap/Orbitrap mass spectrometer. College
of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642,
China, 2015.
IBARRA-CORONADO, E. G.; ESCOBEDO, G.; NAVA-CASTRO, K.; JESÚS
RAMSES, C.R.; HÉRNANDEZ-BELLO, R.; GARCIA-VARELA, M.; AMBROSIO, J.
R.; REYNOSO-DUCOING, O.; FONSECA-LINÁN, R.; ORTEGA-PIERRES, G.;
PAVÓN, L.; HERNANDEZ, M. E.; MORALEZ_MONTOR, J. “A helminth cestode
parasite express an estrogen- binding protein resembling a classic nuclear estrogen
receptor,” Steroids, Estados Unidos, n.76, v. 10-11, p. 1149-1159, 2011.
JUAN, J. O.; LOPEZ CHEGNE. ; N.; GARGALA, G.; FAVENNEC, L. Comparative
clinical studies of nitazoxanide, albendazole and praziquantel in the treatment of
ascariasis, trichuriasis and hymenolepiasis in children from Peru. Transactions of the
Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, Inglaterra, n. 96, v. 2, p. 193-196,
2002.
JUNG, H.; MEDINA, L.; GARCÍA, L.; FUENTES, I.; ESPARZA, R. Absorption
studies of albendazole and some physicochemical properties of the drug and its
89
Eliana Isac
metabolite albendazole sulphoxide. The Journal of pharmacy and pharmacology,
Inglaterra, n. 50, v. 1, p. 43-48, 1998.
KLINKER, K.; TINTELNOT, K.; JOERES, R.; MÜLLER, J.; GROSS, U.; SCHMIDT-
ROTTE, H.; LANDWEHR, P.; RICHTER, E. Taenia crassiceps infection in AIDS.
Deutsche Medizinische Wochenschrift, Alemanha, n.117, p. 133-138, 1992.
KÖHLER, P. The biochemical basis of anthelminthic action and resistance.
International Journal of Parasitology, Inglaterra, n. 31, v. 4, p. 336-345, 2001.
KÖHLER, P. The pathways of energy generation in filarial parasites. Parasitology
Today, Inglaterra, n. 7, p. 21-25, 1991.
KOHLER, P. The strategies of energy conservation in helminths. Mol Biochem
Parasitol, Inglaterra, n. 17, v. 1, p.1-18, 1985.
KÖHLER, P.; VOIGT, W. P. Nutrition and metabolism.In: MELHORN. H. Parasitology
in focus: facts and trends. Berlim, Alemanha: Springer-Verlag, p. 412-453, 1988.
KORBA, B. E.; MONTERO, A. B.; FARRAR, K.; GAYE, K.; MUKERJEE, S.;
AYERS, M. S,.; ROSSIGNOL, J. F. Nitazoxanide, tizoxanide and other thiazolides are
potent inhibitors of hepatitis B virus and hepatitis C virus replication. Antiviral Res,
Holanda, Jan, n. 77, v. 1, p. 56-63, 2008.
KORBA, B.; ABIGAIL,M.; MARC, A.; ROSSIGNOL,J. F. Nitazoxanide is an Effective
Antiviral Agent Against Both HBV and HCV replication in vitro. Antiviral Research,
90
Eliana Isac
Holanda, n.74, p.A1-97, 2007.
LAMSAN, S.; McMANUS, D.P.Molecular characterization of the surface and cyst fluid
components of Taenia crassiceps. Parasitology, n.101, p. 115-125, 1990.
LAURA, C.; CELINA, E.; SERGIO, S.B.; GUILLERMO, D.; CARLOS, L.; LUIS, A.
Combined flubendazole-nitazoxanide treatment of cystic echinococcosis:
Pharmacokinetic and efficacy assessment in mice. Acta Tropica, Holanda, n. 148, p. 89-
96. doi: 10.1016/j.actatropica.2015.04.019, 2015.
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de bioquimica, second
ed. Sarvier, Editora de Livros Médicos Ltda. São Paulo, 839 p, 2011.
LEITSCH, D.; BURGESS, A.G.; DUNN, L. A.; KAUER, K. G.; TAN, K.; DUCHENE,
M. Pyruvate: ferredoxin oxiredutase and thioredoxin reductase are involved in 5-
nitroimidazole activation while flavin metabolism is linked to 5-nitroimidazole
resistance in Giardia lamblia. J. Antimicrobian.Chemother, p. 1756-1765, doi:
10.1093/jac/dkr 501, 2011.
LINO JUNIOR, R.S.; VINAUD, M. C.; OLIVEIRA, F. A.; OLIVEIRA, F. N. M.;
SOUSA, U. C. F. Revisão do tratamento da cisticercose humana.
http://www.iptsp.ufg.br/patologia/ PDF/cisthum_rev.pdf. Acessado em 20/04/2006,
2005.
LIU, C.; ZHANG, H.; YIN, J.; HU, W. In vivo and in vitro efficacies of mebendazole,
mefloquine and nitazoxanida against cyst echinococcsis. Parasitol Res, Alemanha,
91
Eliana Isac
n.114, v. 6, p. 2213-2222. doi:10.1007\s00436-015-4412-4. Epub 2015.
LOOS-FRANK, B.; ZEYHLE, E. The intestinal helminths of the red fox and some
other carnivores in southwest Germany. Zeitschrift für Parasitenkunde, Alemanha, n.
67, v. 1 p. 99-113, 1982.
LUVIRA, V.; WATTHANAKULPANICH, D.; PITTISUTTITHUM, P. Management of
Strongyloides stercoralis: a puzzling parasite. International Health, Inglaterra, n.6, p.
273-281. doi: 10.1093/inthealth/ihu058, 2014.
MAHANTY, S. ; MADRID, E. M. ; NASH,T. E. Quantitative screening for anticestoda
drugs based on changes in baseline enzymes secretion by Taenia crassiceps.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Estados Unidos, n. 52, v. 57, p. 990-995,
2013.
MAILLARD, H. ; MARIONNEAU, J. ; PROPHETTE, B.; BOYER, E. ; CELERIER,
P. Taenia crassiceps cysticerci and AIDS. AIDS, Inglaterra, n. 12, p. 1551-1552. 1998.
MARKOSKI, M. M.; TRINDADE, E. S.; CABRERA, G.; LASCHUK, A.; GALANTI,
N.; ZAHA, A.; NADER, H. B.; FERREIRA, H. B. Praziquantel and albendazole
damaging action in vitro developing Metacestoides corti (Platyhelminthes: Cestoda).
Parasitology International, Holanda, n. 5, v.1, p. 55-61, 2006.
MÁRQUEZ-NAVARRO, A.; PÉREZ-REYES, A.; ZEPEDA-RODRIGUES, A.;
REYNOSO-DUCOING, O.; HERNÁNDEZ-CAMPOS, A.; HERNÁNDEZ-LUIS, F.;
CASTILLO, R.; YÉPEZ-MULI, A. L.; AMBROSIO, J. R. RCB20, an experimental
92
Eliana Isac
benzimidazole derivative, affects tubulin expression and induces gross anatomical
changes in Taenia crassiceps cysticerci. Parasitology Research, Alemanha, n. 112, p.
2215-2226, 2013.
MEGRAUD, F.; OCCHIALINI, A.; ROSSIGNOL, J.F. Nitazoxanida, a potential drug
for erradication of Helicobacter pylori with no cross -resistance to metronidazole.
Antimicrob Agents Chemother, Estados Unidos, n.42, p. 2836-2840, 1998.
MELHORN, H.; FRANZ, M.; TARASCHEWSKI, H.; VOIGH, W P.; WALLDORF, V.
Metazoan organization. In: Melhorn, H. (Ed.), Parasitology in focus: Facts and Trends,
first ed. Springer-Verlag, Alemanha, 924p, 1988.
MERCK®. WWW.MSD-BRAZIL.COM Acessado em 15/02/2006.
MIGUEL, D. C.; FERRAZ, M. L.; ALVES, R. O.; YOKOYAMA-YASUNAKA, J. K.;
TORRECILHAS, A. C.; ROMANHA, A. C.; ULIANA, S. R. The anticancer drug
tamoxifen is active against Trypanosoma cruzi in vitro but ineffective in the treatment of
the acute phase of Chagas disease in mice. Memorias do instituto Oswaldo Cruz, Brasil,
n. 105, v. 5, p. 945-948, 2010.
MIYAMOTO, Y.; ECKMANN, L. Drug Development Against the Major Diarrhea-
Causing Parasitesof the Small Intestine, Cryptosporidium and Giardia. Fronties in
Microbiology, Suiça, v. 6, p.1-13, 2015.
MKUPASI, E. M.; SIKASUNGE, C. S.; NOGOWI, H. A.; JOHANSEN, M. V. Efficacy
and safety of anthelmintics tested against Taenia solium cysticercosis in pigs. Plos
93
Eliana Isac
Neglected Tropical Diseases, Estados Unidos, n. 7, v. 7, 2013.
MÜLLER, J.; SANDERSON, S.; MÜLLER, N.; HEMPHILL, A. A novel Giardia
lamblia nitroredutase, GINR, interacts with nitazoxanideand other thiazolides.
Antimicrob Agents Chemother, v. 51, p. 1979-1986, 2007.
NILLIUS, D.; MULLER, J.; MULLER, N. Nitroreductase (GINRI) increases
susceptibility of Giardia lamblia and Escherichia coli to nitro drugs. The Journal of
antimicrobial chemotherapy, Inglaterra, v. 66, p. 1029-1035, 10.1179/jac/dkr029, 2011.
NOGALES-GAETE, J.; ARRIGADA, C. R.; SALINAS, R. R. Tratamiento de la
neurocisticercosis; revisión crítica. Revista Médica de Chile, Chile, n.134, p. 789-796,
2006.
NTOUKAS, V.; TAPPE, D.; PFÜTZEL, D.; SIMON, M.; HOLZMAN, T. Cerebellar
Cysticercosis caused by larval Taenia crassiceps tapeworm in immunocompetent
woman. Germany. Emerging Infectious Diseases, Estados Unidos, Dezembro n. 19, v.
12, p. 2008-2011, 2013.
ORTIZ, J. L.; LOPEZ CHEGNE, N.; GARGALA, G.; FAVENNEC, L. Comparative
clinical studies of nitazoxanide , albendazole and praziquantel in the treatment of
ascariasis, trichuriasis and hymenolepiasis in children from Peru. Transactions of the
Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, Inglaterra, n. v. 2 p.193-196, 2002.
PADILLA, A.; GOVEZENSKY, T.; SCLUTTO, E.; JIMENEZ-GARCIA, L. F.;
GONSENBATT, M. E.; RAMIREZ, P.; LARRALDE, C. Kinetics and characterization
94
Eliana Isac
of cellular responses in the peritoneal cavity of mice infected with Taenia crassiceps.
The Journal of Parasitology, Estados Unidos, n. 87, v. 30, p. 591-599, 2001.
PAL, D.; BANERJEE, S.; CUI, J.; SCHWARTZ, A.; GHOSH, S. K.; SAMUELSON, J.
Giardia, Entamoeba, and Trichomonas enzimes activate metronidazole (nitroreductase)
and inactive metronidazole (nitroimidazole reductase). Antimicrobial agents and
chemotherapy, Estados Unidos, v. 53, p. 458-464, 10.1128/AAC.00909-08, 2009.
PALOMARES, F.; PALENCIA, G.; AMBROZIO, J. R.; ORTIZ, A.; COOK, H.J.
Evaluation of the efficacy of albendazol sulfoxide and praziquantel in comination on
Taenia crassiceps: in vitro studies. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, Inglaterra,
n. 57, v. 3, p.482-488, 2006.
PALOMARES-ALONSO, F.; PILIADO, J. C.; PALENCIA, G.; ORTIZ-PLATA, A.;
JUNG-COOK, H. Efficacy of nitazoxanide, tizoxanide and tyzoxanide/albendazole
sulphoxide combination against Taenia crassiceps cysts. The Journal of antimicrobial
chemotherapy, Inglaterra, n. 59, v. 2, p. 212-218, 2007.
PAPDOPOULOS, H.; HIMONAS, C.; PAPAZAHARIADOU, M.; ANTONIADOU-
SOTIRIADOU, K. Helminth of foxes and other wild carnivores from rural áreas in
Greece. Journal of helminthology, Inglaterra n. 71, v. 3, p. 227-231, 1997.
PETAVY, A. F.; DEBLOCK, S. Helminths of the common fox (Vulpes vulpes L.) from
the massif central France. Annales de parasitologie humaine et comparée, França, n. 55,
v. 4, p.379-391, 1980.
95
Eliana Isac
POGLAYEN, G.; GUBERTI, V.; LEONI, B. Parasites present in foxes (Vulpes vulpes).
Parassitologia, Italia n. 27, v. 3, p. 303-311, 1985.
RAETHER, W.; HANEL, H. Nitroheterocyclic drugs with broad spectrum activity.
Parasitology reseach, Alemanha, Res. 90 Supp 1:S19-39. 2003.
RENDÓN, J. L.; DEL ARENAL, I. P.; GUEVARA-FLORES, A.; MENDONZA-
HERNÁNDEZ, G.; PARDO, J. P. Glucose 6-phosphate dehydrogenase from larval
Taenia crassiceps (cysticerci): purification and properties. Parasitology Research,
Alemanha, n. 102, p. 1351-1357, 2008.
RENDÓN, J. L.; DEL ARENAL, I. P.; GUEVARA-FLORES, A.; URIBE, A.;
MENDOZA-HERNÁNDEZ, G. Purification, characterization and kinetic properties of
the multifunctional thioredoxin-glutathione reductase from Taenia crassiceps
metacestode (cysticerci). Molecular and Biochemical Parasitology, Holanda, n. 133, p.
61–69, 2004.
RIVIERA-GUEVARA C.; CAMACHO, C. “Tamoxifen and its new derivatives in
cancer research,” Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery, Inglaterra n. 6, v. 2,
p. 237-245, 2011.
RODRIGUEZ-CONTRERAS, D.; SKELLY, P. J.; LANDA, A.; SCHOEMAKER, C.
B.; LACLETTE, J. P. Molecular and functional characterization and tissue localization
of 2 glucose transporter homologues (TGTP1 and TGTP2) from the tapeworm Taenia
solium. Parasitology, n. 117, (Pt 6), p. 579-588, 1998.
96
Eliana Isac
ROMERO CABELLO, R.; GUERRERO, L. R.; MUNHOZ GARCIA, M. R.; GEYNE
CRUZ, A. Nitazoxanide for the treatment of intestinal protozoan and helminthic
infections in Mexico, Transactions Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene,
Inglaterra, n. 91, v. 2, p. 701-703, 1997.
ROSSIGNOL, J. F.; CAVIER, R. New derivative of 2-benzamido-5-nitrothiazoles,
Chem Abstr, n. 83: 281216 n, 1975.
ROSSINGNOL, J. E.; MAISONNEUVE, H. Nitazoxanida in the treatment of Taenia
saginata and Hymenolepis nana infections. American Journal of Tropical Medicine and
Hygiene, Estados Unidos, n. 33, v. 3, p. 511-512, 1984.
RUDOLPHI, 1810 (Cestoda). Canadian Journal of Zoology, n.40, p. 969-990.
RYSSEL, H.; GERMANN, E.; KOLLENSPERGER, E.; RIEDEL, K. “Plastic surgery
for the treatment of gynaecomastia following hormone therapy in prostate
carcinoma,”Urologe- Ausgabe, Alemanha, n. 47, v. 4, p. 467-471, 2008.
SAEED, I.; MADDOX-HYTTEL, C.; MONRAD, J.; KAPEL, C. M. O. Helminths of
red foxes (Vulpes vulpes) in Denmark. Veterinary Parasitology, Holanda, n. 139, v. 1-
3, p. 168-179 2006.
SANTORO, M. G.; CIUCCI, A.; GIANFERRETTI, P.; BELARDO, G.; FRAZIA, S.;
CARTA, S.; ROSSIGNOL, J. F. Thiazolides: a new class of broad-spectrum antiviral
drugs targeting vírus maturation. Antiviral Research, v. 74, p. A1-91, 2007.
97
Eliana Isac
SARRAZIN, C.; ZEUZEN, S. Reviews in basic and clinical gastroenterology-resistence
to direct agents in patients with hepatits C virus infection. Gastroenterology, v. 138, p.
447-462, 2010.
SHEA, M.; MABERLEY, A. L.; WALTERS, J.; FREEMAN, R. S.; FALLIS, A. M.
Intraocular Taenia crassiceps (Cestoda). Transactions - American Academy of
Ophthalmology and Otolaryngology, Estados Unidos, n. 77,n. 6, p. 778-783, 1973.
SHIMALOV, V. V.; SHIMALOV, V. T. Helminth fauna of the red fox (Vulpes vulpes
Linnaeus, 1758) in southern Belarus. Parasitology Research, Alemanha, n. 89, n. 1, p.
77-78, 2003.
SIQUEIRA-BATISTA, R.; GOMES, A.P. Antimicrobianos: guia prático. Rio de Janeiro:
Rubio, 2005.
SOMVANSHI, V. S.; ELLIS, B. L., HU, Y.; AROIAN, R. V. Nitazoxanide: nematicidal
mode of action and drug combination studies. Molecular and Biochemical Parasitology,
Holanda, n. 193, v. 1, p. 1-8. doi: 10.1016/j.molbiopara.2013.12.002, 2014.
STOCKIS, A.; DEROUBAIX, X.; LINS, R.; JEANBAPTISTE, B.; CALDERON, P.;
ROSSIGNOL, J. F. Pharmacokinetcs of nitazoxanide after single oral dose
administration in 6 healthy volunteers. In International journal of clinical
pharmacology and therapeutics, Alemanha, n. 34, v. 8, p. 349-351, 1996.
TIELENS, A. G. M.; VAN GRINSVEN, K. W. A.; HENZE, K.; VAN HELLEMOND,
J. J.; MATIN, W. Acetate formation in the energy metabolism of parasitic helminths
98
Eliana Isac
and protists. Int J Parasitol, Estados Unidos, n. 40, p. 387-397, doi:
10.1016/j.ijpara.2009.12.006, 2010.
VAZ, A. J.; NUNES, C. M.; PIAZZA, R. M.; LIVRAMENTO, J. A.; DA SILVA, M. V.;
NAKAMURA, P. M. Immunoblot with cerebrospinal fluid from patients with
neurocysticercosis using antigen from cysticerci of Taenia solium and Taenia
crassiceps. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, Estados Unidos, n. 57,
v. 3, 354–357, 1997.
VENKATESAN, V. Albendazole. The Journal of antimicrobial chemotherapy,
Inglaterra, n. 41, v. 2, 145-147, 1998.
VENKATESH, S.; RAMALINGAM, K. Lactic acid, pyruvic acid and lactate/pyruvate
ratio in the Anoplocephalid tapeworm Stilesia globipunctata infecting sheep (Ovis
aries). Vet Parasitol, n. 144, v. 1-2 p. 176-179. doi:10.1016/j.vetpar.2006.09.024, 2007.
VINAUD, M. C.; FERREIRA, C. S.; LINO JUNIOR, R. S. BEZERRA, J. C. B. Taenia
crassiceps: Fatty acids oxidation and alternative energy source in in vitro cysticerci
exposed to anthelminthic drugs. Experimental Parasitology, Estados Unidos, n. 122. n.
3, p. 208-211, 2009.
VINAUD, M. C.; FERREIRA, C. S.; LINO JUNIOR, R. S.; BEZERRA, J. C. B. Taenia
crassiceps: Energetic and respiratory metabolism from cysticerci exposed to
praziquantel and albendazole in vitro. Experimental parasitology, Estados Unidos, n.
120, v. 3, p. 221-226, 2008.
99
Eliana Isac
VINAUD, M. C.; LINO JUNIOR, R. S.; BEZERRA, J. C. B. Taenia crassiceps organic
acids detected in cysticerci. Experimental Parasitology, Estados Unidos, n. 116, v. 4,
p.335-339, 2007.
WHO- Working to overcome the global impact of neglected tropical diseases: First
WHO report on neglected tropical diseases. World Health Organization ISBN 978 92 4
1564090, 2010.
WILLIMS, K.; ZURABIAN, R. Taenia crassiceps: in vivo and in vitro models.
Parasitology, Inglaterra, n. 137, v. 3, p. 335-346, 2010.
WILLMS, K.; PRESAS, A. M.; JIMENEZ, J. A.; LANDA, A.; ZURABIAN, R.;
UGARTE, M. E.; ROBERT, L. Taeniid tapeworm responses to in vitro glucose.
Parasitology Research, Alemanha, n. 96, v. p. 296-301, 2005.
WILLMS, K.; ZURABIAN, R. Taenia crassiceps: in vivo and in vitro models.
Parasitology, Inglaterra, n. 137, v. 3, p. 335-346, 2010.
WÜNSCHMANN, A.; GARLIE, V.; AVERBECK, G.; KURTZ, H.; HOBERG, E. P.
Cerebral cysticercosis by Taenia crassiceps in a domestic cat. Journal of Veterinary
diagnostic investigation, Estados Unidos, n. 15, v. 5, p.484-488, 2003.
ZENKA, J.; PROKOPIC, J. Malic enzyme, malate dehydrogenase, fumarate reductase
and succinate dehydrogenase in the larvae of Taenia crassiceps (Zeder 1800). Folia
Parasitologica, República Checa, n. 34, v. 2, p. 131–136, 1987.
100
Eliana Isac
ZUMAQUERO-RIOS, J. L.; SARRACENT-PÉREZ, J.; ROJAS-GARCIA, R.;
WESSBECHER, H.; DALCHOW, W.; STOYE, M. The helminth fauna of red fox
(Vulpes vulpes LINNE 1758) in administrative district of Karlsruhe. 1. Cestodes.
Deutsche tierärztliche Wochenschrift, Alemanha, n. 101, v. 8, p. 322-326, 1994.
ZURABIAN, R.; AGUILAR-VEGA, L.; TERRONE-VARGAS, E.; CERVERA
HERNANDEZ, M. E.; WILLIMS, K.; RUIZ-VELASCO, A. S. In vivo albendazole
treatment of Taenia crassiceps cysticerci strain WFU: proliferation, damage, and
recovery. Parasitol Research, Alemanha, n. 112, v. 11, p. 396103968, Epub 2013 Sep 5,
2013.
101
Eliana Isac
8.1. Parecer do Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA)
8. ANEXOS
102
Eliana Isac
8.2. Artigo
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