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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
ADENOMA PLEOMÓRFICO DE GLÂNDULAS SALIVARES
MENORES: INVESTIGAÇÃO DO POTENCIAL NEOPLÁSICO
BASEADO NA APOPTOSE, ATIVIDADE MUCOSECRETORA E
PROLIFERAÇÃO CELULAR
Goiânia
2014
JEAN CARLOS BARBOSA FERREIRA
JEAN CARLOS BARBOSA FERREIRA
ADENOMA PLEOMÓRFICO DE GLÂNDULAS SALIVARES
MENORES: INVESTIGAÇÃO DO POTENCIAL NEOPLÁSICO
BASEADO NA APOPTOSE, ATIVIDADE MUCOSECRETORA E
PROLIFERAÇÃO CELULAR
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Odontologia da Faculdade de
Odontologia da Universidade Federal de Goiás
para obtenção do título de Mestre em
Odontologia, área de concentração Clínica
Odontológica.
Linha de Pesquisa: Estudo da manifestações
clínicas e tratamento da lesões do sistema
estomatognático.
Orientador: Elismauro Francisco de Mendonça
Co-orientador: Aline Carvalho Batista
Goiânia
2014
DEDICATÓRIA
A minha família, em especial a minha mãe, por ter me dado a vida, amor, educação,
apoio e confiança ao longo da vida.
A minha falecida avó, Josefa Pia Barbosa, pelo exemplo de vida e pela educação que
me foi dispensada, você mora em nossos corações.
AGRADECIMENTOS
A DEUS, que me deu a vida e inteligência para trilhar o caminho do conhecimento.
A Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Goiás, em especial ao
Programa de Pós-Graduação em Odontologia por ter dado condições para a realização desta
pesquisa.
Ao orientador deste trabalho, Elismauro Francisco Mendonça, pesosoa pela qual
tenho uma imensa admiração, respeito e gratidão, por ter confiado no meu trabalho e pela
oportunidade de crescimento científico-cultural.
A co-orientadora deste trabalho, Aline Carvalho Batista, pela enriquecedora e valiosa
contribuição.
Ao professor Claudio Rodrigues Leles, pela contribuição na análise estatística.
Aos colegas da graduação Marcela Ramos Abahão Elias e da pós-graduação Marília
Oliveira Morais pela amizade, solidariedade e valiosa colaboração no planejamento, execução
e finalização da pesquisa.
Ao técnico de laboratório de patologia da FO / UFG Erildo, pelo apoio no
processamento das lâminas.
A todos os professores da Pós-Graduação que contribuíram imensamente para o meu
crescimento intelectual, obrigado pela atenção: Dr. Elismauro, Dra. Aline Batista, Dra.
Luciane, Dra. Vânia, Dr. Carlos Estrela, Dra. Nancy, Dr.Cláudio Leles, Dr. João Batista,
Lawrence, Dra. Maria do Carmo e etc.
A CAPES, por ter proporcionado o apoio financeiro indispensável ao longo do curso,
possibilitando assim a realização desta pesquisa.
RESUMO
Adenoma Pleomórfico (AP) é o tumor de glândula salivar mais comum, entretanto sua
etiopatogênese permanece incerta bem como seu potencial neoplásico. Estudos têm sido
realizados no intuito de investigar apoptose, atividade mucosecretora e proliferação celular
em AP, entretanto estes trabalhos são controversos. O objetivo deste estudo foi investigar o
potencial neoplásico do AP de glândulas salivares menores de boca mensurados pela apoptose
(Bcl-2, Bax e p53), atividade mucosecretora (MUC1) e proliferação celular (Ki-67). Trinta e
um casos de AP da cavidade oral e quatro controles (C), biopsiadas de glândulas salivares
menores orais normais foram analisadas através da técnica imuno-histoquímica. As proteínas
foram detectadas utilizando um método semi-quantitativo (scores) seguindo os seguintes
critérios: (-) negativa ≤ 5%, (+) baixa 6-25%, (+ +) moderada 26-50% e (+ + +) alta > 50%
expressão de células tumorais marcadas positivamente. Para avaliação dos índices de
apoptose, a razão Bcl-2/Bax foi utilizada. Comparação não paramétrica e testes de correlação
foram utilizados para a análise. Os dados mostraram elevada marcação de proteína anti-
apoptótica Bcl-2 em ambos os grupos (AP = 57,9% C = 67,7%) e uma expressão
significativamente mais baixa da proteína pró-apoptótica Bax (AP = 22,7% C = 97,7%) e
MUC1 (AP = 14% C = 82,3%) em AP do que em C (p <0,001). Por outro lado, observou-se
uma expressão semelhante de Ki-67 e p53 (≤ 5%) em ambos os grupos. Em AP, apenas 2
casos apresentaram a relação Bcl-2/Bax <1. Não houve diferença na expressão celular, no que
diz respeito às variáveis clínicas e o desfecho (p> 0,05). O potencial neoplásico do AP pode
ser associado a um desequilíbrio nos processos apoptóticos, e os baixos índices de
proliferação celular e a atividade mucosecretora parece não desempenhar papel significativo
no AP primários.
Palavras-chave: Adenoma Pleomórfico, apoptose, atividade mucosecretora, proliferação
celular, comportamento biológico.
ABSTRACT
Pleomorphic adenoma (PA) is the most common salivary gland tumor, however its
etiopathogenesis is unclear, as well as your neoplastic potential. Studies have already been
done investigating apoptosis, mucosecretory activity and proliferation cellular, although these
studies are controversial. The aim of this study was to investigate the neoplastic potential of
the PA of minor oral salivary glands measured by apoptosis (Bcl-2, Bax and p53),
mucosecretory activity (MUC1), and cellular proliferation (Ki-67). Thirty-one cases of PA of
the oral cavity and 4 controls (C) taken from normal oral minor salivary glands were analyzed
by immunohistochemistry technique. The proteins were detected utilizing a semi-quantitative
method (scores) as follows: (-) negative ≤ 5%, (+) low 6–25%, (++) moderate 26–50% and
(+++) high >50% of positive tumour cells. The apoptotic indices were evaluated by the ratio
Bcl-2/Bax. Non-parametric comparison and correlation tests were used for analysis. The data
showed high staining of anti-apoptotic protein Bcl-2 in both groups (PA= 57.9%; C=67.7%)
and an expression significantly lower of pro-apoptotic protein Bax (PA=22.7%; C=97.7%)
and MUC1 (PA=14%; C=82.3%) in PA than in C (p<0.001). On the other hand, we
observed a similar expression of Ki-67 and p53 proteins (≤ 5%) in both PA and C. In PA,
only 2 cases showed the ratio Bcl-2/Bax <1. There was no difference in cellular expression
with regard to clinical variables clinical and outcome (p>0.05). The neoplastic potential of PA
can be associated with an imbalance in apoptotic processes and a lower index of proliferation
cellular and that the mucosecretory activity does not play a significant role in primary PA.
Keywords: Pleomorphic adenoma, Apoptosis, Mucosecretory activity, Cell proliferation,
Biological behavior.
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1 Posição anatômica das glandulas parótida (1); glândula
submandibular (2) e glândula sublingual (3).
15
2 Glândulas salivares menores: responsáveis pela produção de 5 a 8%
do total de saliva.
16
3 Adenômero- unidade morfofuncional de uma glândula salivar
submandibular: porções secretoras compostas por células serosas e
mucosas (secreção mista).
18
4 Padrões de diferenciação envolvida na produção do complexo de
histomorfológico do AP.
22
5 Ciclo celular: O ciclo celular tem duas fases principais: a interfase,
fase entre os eventos de mitose (G1, Se G2), e a fase mitótica,
subdividida em prófase, metáfase, anáfase e telófase, na qual a
célula mãe divide-se em duas células filhas geneticamente
idênticas.
34
LISTA DE ABEVIATURAS
AP Adenoma Pleomórfico
BSA Soro Albumina Bovina
CASP3 Caspase 3
CXPA Carcinoma ex-Adenoma Pleomórfico
DAB Diaminobenzidina
DNA Deoxyribonucleic acid
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
FISH Fluorescence in situ Hybridization
GSMa Glândulas salivares maiores
GSMe Glândulas salivares menores
IGg Imunoglobulina G
MDM2 Murine doble minute 2
Mm milimetros
mm2 milimetros quadrados
mRNA Messenger Ribonucleic acid
OMS Organização Mundial de Saúde
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
PLAG 1 Pleomórfic Adenoma Gene 1
RPA Adenoma Pleomórfico recorrente
SNA Sistema Nervoso Autônomo
UFG Universidade Federal de Goiás
UV Ultra Violeta
TBS Tris Buffered Saline
TGS Tumores de Glândulas Salivares
7
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 8
2. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO ....................................................................................... 11
3. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 12
3.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 12
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 12
4. HIPÓTESES ....................................................................................................................... 13
5. CONCEITOS GERAIS E REVISÃO DA LITERATURA ............................................ 14
5.1 GLÂNDULAS SALIVARES- ANATOMIA E FISIOLOGIA .......................................... 14
5.2 ADENOMA PLEOMÓRFICO .......................................................................................... 19
5.3 APOPTOSE EM AP ........................................................................................................... 25
5.4 ATIVIDADE MUCOSECRETORA EM AP ................................................................. 30
5.5 CICLO CELULAR E PROLIFERAÇÃO CELULAR EM AP ................................... 32
6. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 35
7. ARTIGO .............................................................................................................................. 40
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................. 67
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 68
A- PACECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA UFG .................................... 80
B- COMPROVANTE DE SUBMISSÃO .............................................................................. 81
8
1. INTRODUÇÃO
Os tumores de glândulas salivares (TGS) têm papel de destaque nas neoplasias
humanas, ainda que incomuns, compreendem uma área importante da patologia oral, e
representam um dos grupos de tumores mais interessantes e desafiadores da região de cabeça
e pescoço. Os TGS apresentam incidência anual no ocidente de 2,5 a 3,0 casos para cada
100.000 pessoas (SPEIGHT e BARRETT, 2002).
Dentro deste grupo, destaca-se o Adenoma Pleomórfico (AP), a neoplasia benigna
mais comum das glândulas salivares maiores (GSMa) e menores (GSMe) (DANIELS et al.,
2007). Embora os aspectos clínicos e histológicos desta neoplasia sejam bem conhecidos, sua
etiologia e patogênese ainda permanecem incertas (EVESON et al 2005). No entanto, sabe-se
que em mais de 70% dos casos existe uma associação com cariótipos anormais, envolvendo
um lócus do gene PLAG1 (pleomorphic adenoma Gene 1). Além disso, há indícios que a
exposição aos raios UV (Ultra Violeta) aumenta o risco de desenvolvê-la (KANDAZAMY, et
al., 2007; SIMPSON, 1995).
Com o intuito de investigar os mecanismos de desenvolvimento do AP, várias
moléculas têm sido analisadas neste tumor (AL RAWI, OMER e AL KAWAS, 2010; AOKI
et al. 2004; FREITAS et al. 2005; GORDÓN-NÚÑEZ et al. 2008; HAMADA et al. 2004;
LAZZARO e CLEVELAND, 2000; MANNWEILER, BEHAM e LANGNER, 2003; SOINI,
TORMANEN e PAAKOO, 1998; YANEZ et al. 1999; SOARES et al., 2011;
MANJUNATHA, KUMAR e RAGHUNATH, 2011). Algumas destas moléculas expressadas
em tecidos tumorais podem servir não apenas como úteis marcadores de diagnóstico, mas
também como potenciais alvos para intervenção terapêutica (RACHAGANI et al., 2012).
9
Dentro do grupo de moléculas investigadas, destacam-se o Bcl-2, uma proteína anti-
apoptótica, o p53, uma proteína supressora de tumor, e o Ki-67, uma proteína largamente
utilizada para identificar a proliferação celular em neoplasias. Alguns dados da literatura têm
sugerido que estes marcadores podem estar relacionados com desenvolvimento, agressividade,
diferenciação, malignização, e prognóstico em TGS, mas esses resultados ainda são
controversos (LAZZARO e CLEVELAND, 2000; ALVES et al., 2002; ALVES et al., 2004;
AL RAWI, OMER e AL KAWAS, 2010). Têm sido sugerido que marcadores de apoptose
como o Bcl-2 e p53 podem potencialmente prever o comportamento dos tumores, e que a
perda de função de p53 associada à sobre-regulação de Bcl-2 pode potencializar o
crescimento do tumor (KIYOSHIMA et al. 2001; GARLINFANTE et al. 2005).
Enquanto estas proteínas têm sido extensivamente pesquisadas em AP, há limitadas
informações sobre outra proteína relacionada ao processo apoptótico, a proteína pró-
apoptótica Bax. Em nossa revisão, encontramos apenas dois estudos investigando a proteína
Bax em AP, sendo que em apenas um deles foi utilizada a técnica imuno-histoquimica (SOINI,
TORMANEN e PAAKOO, 1998; GOMES et al.,2012).
Além dos estudos envolvendo proteínas reguladoras da apoptose, têm sido
investigado a expressão de marcadores relacionados com o potencial neoplásico de vários
tumores humanos. Dentre esses marcadores, destacam-se as mucinas, um grupo de
glicoproteínas de alto peso molecular presente na interface de alguns epitélios e seus
ambientes extracelulares, as quais foram catalogadas na família do gene MUC (MUC1-
MUC9, MUC11-13, MUC15-20) (DEKKER et al. 2002; YONEZAWA et al. 2008) Dentre
essas proteínas, a MUC1 é a mais amplamente estudada. Tem sido sugerido que a
superexpressão desta mucina pode estar envolvida com vários eventos fisiológicos e
10
bioquímicos, incluindo carcinogênese e invasão tumoral (YONEZAWA et al. 2008;
HAMADA et al., 2004).
Outro ponto importante a se considerar e que não tem sido investigado pela literatura
é se a diferença estruturais e fisiológicas entre GSMa e GSMe podem influenciar na expressão
de algumas destas proteínas, por exemplo, sabe-se que as GSMe são ricas em mucina quando
comparadas às GSMa (TEN CATE, 1994).
Outra proteína que também têm sido alvo vários estudos em TGS, especialmente em
AP, é a proteína Ki-67, reguladora de proliferação celular, a qual está presente em todas as
fases do ciclo celular exceto na fase G-0. Alguns estudos identificaram pouca ou nenhuma
expressão desta proteína nos casos de AP (LAZZARO e CLEVELAND, 2000; ALVES et al.,
2002; ALVES, et al., 2004) sugerindo que tal proteína não exerce papel significativo no
desenvolvimento do tumor, embora, estes achados indicaram a necessidade de realização de
mais estudos nesta área.
11
2. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO
Tendo em vista que o AP é o tumor benigno mais frequente em glândulas salivares
de boca, somado a sua capacidade de sofrer transformação maligna, esta pesquisa se justificou
pela necessidade de se compreender com maior clareza a patogênese desta neoplasia. Além
disso, na literatura não há trabalho investigando o potencial neoplásico do AP através da
expressão de glicoproteína MUC1 correlacionada aos mecanismos apoptóticos e índices de
proliferação celular, exclusivamente em glândula salivar menor.
12
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Este trabalho teve o objetivo de investigar o potencial neoplásico do AP de glândulas
salivares menores baseado na apoptose através dos marcadores Bcl-2, Bax e p53; na atividade
mucosecretora através da expressão da mucoproteína MUC1; e da proliferação celular através
da expressão da proteína Ki-67.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Caracterizar a amostra quanto à idade, gênero, localização anatômica, e padrão
histológico e correlacionar com os dados de proliferação celular, apoptose e atividade
secretora de mucina.
2. Investigar os índices de apoptose através da razão entre a expressão Bcl-2 /Bax
em AP e GSMe normais.
13
4. HIPÓTESES
Considerando que literatura traz que a super-expressão da mucina MUC1 pode estar
intimamente relacionada com ao desenvolvimento de tumores de glândulas salivares, espera-
se que nos casos de AP também ocorra a alta expressividade desta glicoproteína relacionada a
um maior índice de proliferação celular, com menores taxas de apoptose e que a expressão da
oncoproteína p53 também esteja desregulada.
Acreditamos que o melhor conhecimento dessa patologia poderá contribuir com o
desenvolvimento de indicadores do potencial de transformação neoplásica maligna para este
tumor.
14
5. CONCEITOS GERAIS E REVISÃO DA LITERATURA
5.1 GLÂNDULAS SALIVARES- ANATOMIA E FISIOLOGIA
As glândulas salivares são órgãos que possuem a função principal de produzir saliva,
um fluido complexo que possui um papel importante na homeostase da cavidade oral. Em
humanos, encontramos dois grandes grupos de glândulas salivares: as GSMa tais como
parótida, submandibular e sublingual que estão localizadas fora da boca, encapsuladas e com
extenso sistema de ductos que conduzem suas secreções (Fig. 1); e uma extensa quantidade de
pequenas GSMe que se encontram por quase toda extensão da cavidade oral, incluindo as
regiões labial, lingual, palatal, bucal, glossopalatina e retromolar (Fig. 2). Essas pequenas
glândulas são caracterizadas por não apresentarem cápsula e conter um sistema de ductos
curtos. Os únicos sítios intra-orais onde não se encontram GSMe são no interior da gengiva e
na região anterior do palato duro (DALE, 1994).
15
Figura 1. Posição anatômica das glândulas salivares maiores: glândula parótida (1); glândula
submandibular (2) e glândula sublingual (3).
Fonte: APS e MARTENS, 2005, p.119.
16
Figura 2. Glândulas salivares menores: responsáveis pela produção de 5 a 8% do total de
saliva produzida.
Fonte: adaptado de BAKER et al., 2010, p.219.
As glândulas salivares pertencem ao grupo de glândulas exócrinas, uma vez que suas
secreções fluem para o interior da boca. Morfologicamente, as glândulas possuem uma
estrutura composta túbulo-acinar. Os elementos que compõem o parênquima das glândulas
são derivados do ectoderma, originados a partir do epitélio oral primitivo, e podem ser
subdivididos em: vasos sanguíneos, linfáticos e nervos; e os chamados adenômeros (unidade
morfofuncional das glândulas salivares). Os adenômeros são compostos por dois tipos de
estruturas: os ductos (que se subdividem em intercalar, estriado e excretor) responsáveis pela
regulação da secreção salivar e transporte da saliva até a cavidade oral, e estruturas secretoras
terminais (onde se localizam as células glandulares, subdivididas em mioepitelias, serosas
Glândulas labiais
Glândulas palatinas
Glândulas parafaringeais
17
e/ou mucosas), também chamadas de ácinos, onde esse sistema ductal se conecta (Figura 3)
(JENSEN et al. 2003; JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).
Nos ácinos é produzida a secreção primária, na qual pode ser encontrada ptialina
e/ou mucina, a depender do tipo de glândula. A secreção serosa é rica em ptialina, enzima
responsável pela inicio da digestão do amido, já a secreção mucosa é rica em mucina,
responsável pela lubrificação da boca (DALE, 1994; ELLIS e AUCLAIR, 1996).
As glândulas salivares também são classificadas de acordo com a predominância de
suas unidades secretoras A glândula parótida, por exemplo, é uma glândula quase que
exclusivamente serosa, apresentando ácinos serosos de forma esférica enquanto que a
glândula submandibular é uma glândula mista, com predomínio de ácinos serosos (~80%).
Por outro lado, a glândula sublingual é uma glândula essencialmente mucosa, apresentando
ácinos de forma tubular constituídos por células mucosas e algumas unidade secretoras mistas
(ELLIS, EUCLAIR e GNEPP, 1991).
Em condições normais, os adultos podem produzir uma média de 500-1500 ml de
saliva por dia ou de 0-6 ml por minuto (APS e MARTENS, 2005). Essa secreção é regulada
pelo sistema nervoso autônomo (SNA) simpático- componente protéico- e parassimpático-
componente fluido (PEDERSON et al., 2002) . Durante um estimulo, como o visual, por
exemplo, o SNA é ativado e libera neurotransmissores como a noradrenalina e /ou acetilcolina
que iniciam a regulação das células acinares para iniciar o processo de produção de secreção
(TURNER, 1993).
18
Figura 3. Adenômero- unidade morfofuncional de uma glândula salivar submandibular:
porções secretoras compostas por células serosas e mucosas (secreção mista).
Fonte: JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004, p.318.
19
5.2 ADENOMA PLEOMÓRFICO
Embora as glândulas salivares sejam consideradas por alguns autores como sendo
órgãos relativamente simples, não se pode afirmar o mesmo para as neoplasias que as
acometem, principalmente pela sua rica variedade histológica (SIMPSON, 1994).
O AP, também chamado de “tumor misto” devido sua diversidade histológica, é a
neoplasia benigna de glândula salivar mais frequente em humanos (DARDICK, 1996;
EVESON et al., 2005). Em essência, são tumores derivados do mioepitélio, com diferenciação
tanto epitelial quanto mesenquimal (KUMAR et al., 2007).
Nas últimas décadas, os inúmeros subtipos morfológicos de tumores de glândulas
salivares provocaram interesse considerável em sua origem histogenética, e várias hipóteses
foram propostas. A primeira delas, teoria proposta por Eversole (1971), denominada na lingua
inglesa como “semipluripotent bicellular reserve cell theory”, afirmava que as células
excretoras basais só davam origem a carcinomas de células escamosas e mucoepidermóides,
enquanto que as células luminais intercaladas eram responsáveis por lesões como adenomas
monomórfico e pleomórfico, carcinoma adenoide cístico e carcinoma de células acinares.
Posteriormente, sugeriu-se que as células excretoras acinares, sendo altamente diferenciadas,
seriam incapazes de se dividirem, e assim desempenhar um papel mínimo na formação do
tumor, e por isso esta hipótese foi enfraquecida. No entanto, achados mais recentes têm
mostrado que todos os tipos de células maduras das glândulas salivares são capazes de se
proliferar, dando origem assim ao conceito multicelular na histogênese dos tumores. Este
último conceito sugere que qualquer um dos tipos células do tecido glandular pode ser capaz
de desenvolver qualquer tipo de tumor neste órgão (ATTIE e SCIUBBA, 1981).
20
O sítio mais comumente acometido por AP é a glândula parótida (70 a 80%), seguido
da glândula submandibular (8%) e, por último, nas GSMe (7 % a 15%) (EROL et al., 1997),
objeto de nosso estudo. Quando em glândula salivar menor, o palato é o sítio anatômico mais
freqüente, seguido pelo lábio, mucosa bucal, assoalho bucal, língua, tonsilas e região
retromolar (BABLANI, et al. 2009). O tumor pode se desenvolver em qualquer idade, sendo
mais comum entre a 4º e 6º década de vida, com idade média de 46 anos, apresentando leve
predileção pelo sexo feminino (COURTEN, LOMBARDI e SAMSON, 1996; CLAUSER et
al., 2004; WANG et al., 2007).
Eveson et al. (2005) descreveram esta neoplasia como uma lesão de evolução lenta,
bem delimitada, indolor, aparentemente encapsulada que raramente excede 5cm em seu maior
diâmetro, no entanto, essa cápsula pode ser incompleta ou mostrar infiltração pelas células
tumorais, principalmente nos TGS orais. Geralmente é recoberta por epitélio integro, a menos
que tenha sido traumatizada.
Do ponto de vista histopatológico, a heterogeneidade microscópica dos componentes
parênquimais é uma particularidade marcante em AP. Há uma mistura de células epiteliais e
mioepiteliais, formando ductos, ácinos, túbulos e ilhas ou lençóis de células. As células
epiteliais geralmente são escuras e pequenas, variando entre as formas cuboidais e fusiformes.
Os elementos epiteliais são entremeados por um estroma de tecido conjuntivo frouxo,
freqüentemente mixóide, e às vezes contendo ilhas condróides e/ou até mesmo ósseas e
lipomatosas (DARDICK, 1996; EVESON et al., 2005; KUMAR et al., 2007).
A grande variedade de aspectos histológicos dos tumores de glândulas salivares tem
sido atribuída à presença de células mioepiteliais nestas estruturas (CLAUSER et al., 2002).
Sabe-se que, quando modificadas, elas são capazes de sintetizar substâncias mucóides e
condróides, além de membrana basal e elastina (LEONCINI et al., 1988).
21
Segundo Dardick (1994), APs podem refletir muitos processos encontrados em
adenoma de células basais, no entanto, o excesso na síntese de materiais extracelulares,
limitado em adenomas de células basais, que agora é extenso e largamente responsável pela
matrix mixocondoide são características marcantes em AP. Segundo este mesmo autor, os
padrões de diferenciação envolvidas na histomorfologia do AP, uma lesão que diferencia-se
em células luminais e não luminais, pode ser representado na figura 4.
22
Figura 4. Padrões de diferenciação envolvidos na produção do complexo de histomorfologico do AP:
Cada via retrata células ou tipos de células em desenvolvimento em certas regiões ou integralmente
formando AP particulares. Se os materiais extracelulares suficientes (representado pelo preenchimento
radial entre as células tumorais) são formados, influenciam a histologia nestas lesões. À direita, a série
se diferencia células luminais e não luminais, alguns desses grupos não terão matrix extracelular,
enquanto outros terão. Este último, conforme representado no modelo de baixo têm separação gradual
das células não luminais, alguns dos quais se assemelham aos condrócitos. Os modelos à esquerda,
envolve diferenciação apenas de células basais/mioepitelial (não luminais), e novamente, com ou sem
matriz extracelular e diferenciação gradual de células condróides. A fusão de dois ou mais desses
modelos indica um fluxo interminável de resultados na histologia de AP.
Fonte: DARDICK, 1996, p.76
23
Essa grande diversidade morfológica apresentada não só pelo AP, mas pela maioria
dos TGS, podem muitas vezes dificultar o diagnóstico, classificação e tratamento dessas
lesões (SPEIGHT e BARRETT, 2002). Segundo Simpson (1995), AP em sua forma clássica
é de fácil diagnóstico, entretanto quando a proporção de seus constituintes celulares varia
muito, pode-se encontrar problemas no estabelecimento do diagnóstico microscópico.
AP são classificados com base na proporção dos seus componentes epitelial e
mesenquimal, e ainda permanece sem consenso na literatura. Foote e Frazell (1954)
analisaram 250 tumores mistos e os caracterizaram em 4 grupos: principalmente mixóide
(36%), componentes celulares e mixóides em igual proporção (30%), predominantemente
celular (22%) e extremamente celular (12%). Seifert et al. (1976), por sua vez, também
classificaram sua amostra de AP em 4 grupos: Tipo I clássico (balanceamento entre
componentes epiteliais e estromais); tipo II ( mixóide, com aproximadamente 80% do tumor
correspondente a estroma); tipo III (celular ou rico em células, com uma quantidade de
estroma variando entre 20-50%;) e o tipo IV( características semelhantes ao tipo III, mas com
presença de diferenciação monomórfica no componete epitelial). Alguns trabalhos indicam
que o padrão mixóide é o mais frequente, seguido do tipo celular e do clássico (ITO et al.
2009).
Segundo Eveson et al. (2005) , essa ampla distinção não tem significado prognóstico
ou terapêutico, mas ajuda a enfatizar a ampla variedade morfológica dentro de um mesmo
tumor.
A capacidade do AP de sofrer transformação maligna também tem sido relatada pela
literatura, principalmente nos casos onde houve excisão cirúrgica incompleta, múltiplas
recidivas locais e em tumores que permaneceram por longos períodos sem diagnóstico e
24
tratamento (MCNAMARA, BATSTONE e FARAH, 2009; OHTAKÉ et al.; 2002 ). Johns e
Goldsmith (1989) reportaram uma incidência de 1,6% de transformação maligna em tumores
com menos de cinco anos de evolução comparado com 9,4% de incidência para tumores com
mais de quinze anos. Embora incomuns, três variações malignas do AP têm sido relatadas:
carcinoma ex-adenoma pleomórfico (CXPA), que é a mais comum delas, enquanto os tipos
carcinossarcoma e o adenoma pleomórfico metastático são mais raras (GNEPP, 1993).
Casos de recorrência em GSMe são raros, e tèm sido reportados pela literatura
localizados principalmente na glândula parótida. Em um estudo de meta-análise em PA de
glândulas parótidas, 3,4 % sofreram recorrência após 5 anos e 6,8 % após dez anos de
tratamento( RICKMAN, CAWSON e DUFFY,. 1984). Além disso, casos de recorrência
parecem ter predileção em pacientes jovens (LASKAWI, SCHOTT e SCHRODER, 1998).
Dentre as hipóteses mais aceitas para explicar a recorrência destes tumores podemos citar:
excisão incompleta do tumor, baixa idade dos pacientes, rica variação do estroma e ocorrência
de pseudopodia (HAMADA et al. 2004.).
O tratamento de eleição para esta neoplasia consiste na completa excisão cirúrgica.
Na glândula parótida, quando o tumor localiza-se no lóbulo superficial, realiza-se
parotidectomia superficial, preservando o nervo facial. Por outro lado, quando o tumor
localiza-se no lóbulo profundo, recomenda-se parotidectomia total (HARDIGHAN, 1993).
Tumores em glândula submandibular são tratados com remoção completa da glândula, já em
GSMe, procede-se excisão com margem de tecido normal (MANIFOLD e THOMAS, 1994;
ELLIS e AUCLAIR, 1996).
25
5.3 APOPTOSE EM AP
O termo apoptose foi primeiramente descrito em um trabalho clássico de Kerr,
Wyllie e Currie em 1972 para descrever uma forma morfologicamente distinta de morte
celular. A apoptose foi posteriormente reconhecida e aceita como um distinto e importante
modo de morte celular “programada”, a qual envolve a eliminação de células determinada
geneticamente (ELMORE, 2007). Atualmente, é amplamente aceito que a regulação anormal
desse processo pode estar associada a uma vasta variedade de doenças humanas, incluindo
distúrbios imunológicos e de desenvolvimento, neurodegeneração e câncer (FUCHS e
STELLER, 2011).
Os mecanismos de apoptose são extremamente complexos e sofisticados, os quais
envolvem energia dependente de uma cascata de eventos moleculares. Até o momento,
pesquisas têm apontado duas vias principais de apoptose: a extrínseca, ou via de receptor de
morte e a intrínseca, também chamada de mitocondrial. Embora existam, até o momento, duas
vias distintas, há evidências de que ambas estão interligadas, e que moléculas de uma via
podem influenciar na outra (IGNEY e KRAMMER, 2002).
O controle e regulação da via intrínseca, ou mitocondrial é feito pelos membros da
família de proteínas Bcl-2, reguladas por cerca de 25 genes identificados até o momento. Esse
grupo de proteínas regulam a permeabilidade da membrana mitocondrial e podem
desempenhar funções anti-apoptótica e pro-apoptótica (CORY e ADAMS, 2002; ELMORE,
2007).
Dentre os membros anti-apoptóticos incluem o Bcl-2, Bcl-x, Bcl-XL, Bcl-XS, Bcl-w,
BAG, e algumas proteínas pro-apoptóticas incluem o Bax, Bcl-10, Bak, Bid, Bad, Bim, Bik, e
Blk. A homeostasia é mantida pelo controle da quantidade de proteínas anti-apoptóticas e pró-
apoptóticas. Estímulos, como dano ao DNA, levam ao aumento na expressão das proteínas
26
pró-apoptóticas. Esse desequilíbrio induz a apoptose (ELMORE, 2007; PETROS,
OLEJNICZAK e FESIK, 2004).
Até o momento, pouco se sabe sobre apoptose em TGS, no entanto alguns estudos
têm sido desenvolvidos investigando a expressão da proteína Bcl-2 em AP de GSMa e
menores. Por outro lado, poucos estudos têm investigado o papel da proteína pro-apoptotica
Bax nesta neoplasia. Segundo Miyashita, et al (1994), as células tumorais podem adquirir
resistência à apoptose através da expressão de proteínas como o Bcl-2 ou pela sub-regulação
ou mutação de proteínas como o Bax. Mais recentemente, Murphy et al. (2000) demonstraram
que, após um estímulo de morte, a proteína Bcl-2 inibe a permeabilização da membrana
externa da mitocôndria, pelo seqüestro de Bax ou por competir por sítios que seriam ocupados
pela proteína Bax na membrana externa mitocondrial.
Além disso, tem sido proposto que as proteínas da família Bcl-2 possuem a
capacidade de formar homodímeros e heterodímeros com os outros membros do grupo. Por
exemplo, a proteína Bax pode formar heterodimero com a proteína Bcl-2, em consequência há
uma anulação na função de anti-apoptótica desta última, em contraste, caso haja a formação
do homodimero Bax/Bax, a apoptose é favorecida. (HOCKENBERY, 1994; REED, 1994;
WHITE, 1996). Segundo Petros, Olejniczak e Fesik (2004), o equilíbrio entre esses
homodímeros e heterodímeros pode definir o balanço pró-apoptótico ou anti-apoptótico na
célula.
Portanto, o crescimento de tumores esta na dependência do balanço entre
proliferação e índices de apoptose, eventos que podem estar relacionados com a expressão das
proteínas Bcl-2/Bax (GOMES, 2012).
Um dos trabalhos pioneiros que utilizou a técnica imuno-histoquímica para
investigar a apoptose em TGS foi desenvolvido por Soini e colaboradores (1998). Neste
27
estudo todos os casos de AP (n=23) obtiveram expressão positiva pela proteína Bcl-2, sendo
que 95,6% da amostra apresentou expressão positiva moderada (n=8) ou forte (n=14).
Em consonância com este trabalho, Yanez et al. (1999) também encontrou expressão
positiva do Bcl-2 em todos os casos avaliados, por conseguinte concluiu que o Bcl-2
desempenha um importante papel na patogênese do AP (YANEZ et al., 1999).
Corroborando estes achados, Aoki et al. (2004), analisaram AP de glândulas maiores
e menores, e também encontrou expressão fortemente positiva em 33 dos 35 casos
avaliados(94,3%), localizada principalmente no mioepitélio neoplásico.
Manjunatha, Kumar e Raghunath (2011) estudaram a expressão da proteína Bcl-2 em
tumores malignos e benignos, incluindo AP. Neste estudo, 5 dos 9 casos (55%) de AP
apresentaram expressão positiva moderada da proteína Bcl-2.
Outro estudo realizado por Miranda Viana et al. (2013) investigaram AP de GSMe e
encontraram expressão da proteína Bcl-2 em 27 de 35 casos (77,14%), com expressão
citoplasmática nas células mioepiteliais, inclusive no estroma mixomatoso e em células
plasmocitóides.
Embora a maioria dos trabalhos tenham indicado expressão positiva para a proteína
Bcl-2 em AP, Gordon Nuñes et al. (2008) evidenciaram coloração negativa em 12 de 19 casos
avaliados, no entanto, a localização do grupo de PA e do grupo controle não foram descritos.
Em concordância a esses achados, Al Rawi et al. (2010) investigaram a expressão desta
proteína em apenas seis casos e encontrou uma expressão negativa em quatro casos (66%) e
apenas um caso mostrando uma coloração de 40% de células positivas.
Como já salientado, ao contrário da proteína Bcl-2, a proteína Bax têm sido alvo de
poucos estudos. No trabalho de Soini et al. (1998) supracitado, a proteína Bax também foi
avaliada, e em uma amostra de 23 casos, todos também apresentaram marcação positiva. É
28
importante ressaltar que a grande maioria da amostra analisada neste estudo apresentou
expressão positiva forte (n=9) ou muito forte (n=11) para esta proteína.
Gomes et al. (2012) utilizaram a técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) para
investigar as proteínas Bcl-2 e Bax em vários TGS malignos e benignos, incluindo casos de
AP. Neste estudo, dois índices de apoptose foram adotados para a análise: índice 1, razão
entre Bcl-2 e Bax (Bcl-2/Bax) e índice 2, razão entre Bcl-2 e CASP3 (Bcl-2/CASP3).
Segundo estes autores, nos casos cujos valores apresentassem muito altos, favoreceria um
perfil anti-apoptotico, e, por outro lado, valores < 1 indicariam um aumento das proteínas Bax
ou CASP3, ou diminuição na transcrição de mRNA da proteína Bcl-2, favorecendo a
apoptose. Foi mostrado neste trabalho que mRNA Bcl-2 é super-expressado em TGS, e a
expressão de Bax foi maior nos tumores salivares do que em glândulas normais em apenas
52% das amostras . Além disso, os resultados mostraram que apenas 4 de 17 AP mostraram
quociente Bcl-2/Bax menores que 1.
Outro componente que também esta relacionado aos mecanismos de apoptose é a
proteína supressora de tumor p53, codificada pelo gen de mesmo nome. Este gen controla a
indução do processo de apoptose bem como a parada do ciclo celular necessária para a
reparação do DNA. A principal função do p53 é a eliminação de células danificadas no
organismo, e acredita-se que seja a base para a função de supressão de tumores. Em células
normais, p53 é geralmente inativo, vinculado à proteína MDM2 (murine doble minute 2), a
qual impede a sua ação e promove a sua degradação. A ativação do p53 é induzida após
efeitos de agentes carcinogênicos como radiação UV, oncogenes e algumas drogas que
danificam o DNA (CUI, et al. 2007).
Segundo Schuler e Green (2001), a proteína supressora de tumor p53 tem um
papel crítico na regulação das proteínas da família Bcl-2. No entanto, os mecanismos exatos
ainda não foram completamente elucidados. Anteriormente, Deguchi,et al. (1993) já havia
29
suspeitado dessa relação, sugerindo que a perda de função do p53 associado ao Bcl-2 poderia
ser a maior causa da carcinogênese.
Em consonância, Garlinfante et al. (2005) avaliaram, através da técnica imuno-
histoquímica, 21 casos de carcinoma adenoide cístico de palato e concluíram que
provavelmente a perda de função da proteína p53 associada superregulação da proteína Bcl-2
pode dar as células do tumor uma dubla vantagem de crescimento, devido a incontrolada
proliferação combinada com reduzidos índices de morte celular.
Nordvist et al. (2000) investigaram padrões de mutação no gen p53 em 68 AP e 237
tumores malignos de glândulas salivares. Neste estudo, os autores consideraram alta
expressão positiva, valores acima de 10% de células marcadas. Sendo assim, apenas 9 dos 68
casos de AP revelaram alta expressão. Como conclusão, os autores sugeriram que o p53 pode
ser um importante marcador para auxiliar na distinção entre tumores benignos e malignos.
Neste mesmo contexto, Weber et al. (2002), utilizando a técnica de PCR, também encontrou
mutações no gene p53 em 4 de 42 (10%) casos de AP.
Em um trabalho realizado em AP, Li et al. (1997) avaliaram aberrações
cromossômicas no gene p53 através da técnica de FISH (fluorescence in situ Hybridization) e
detectaram que a expressão de p53 esta frequentemente associada a deleção do gene p53,
favorecendo uma possível instalação de CXPA.
Freitas et al. (2005) sugeriram que a imunoexpressão para p53 em AP contendo
células atípicas pode representar um critério objetivo de transformação maligna, visto que no
CXPA, contraparte maligna originada do AP, há forte imunoexpressão para a proteína p53 em
aproximadamente 50 a 75 % das células neoplásicas.
Embora controversos, os estudos imuno-histoquimicos envolvendo p53 em AP têm
revelado baixa ou ausência de expressão desta proteína. Segundo Rosa et al. (1997), em
tumores benignos de origem mioepitelial como PA e mioepitelioma, a proteína p53 parece
30
não estar envolvida na patogênese tampouco no risco de recorrência, visto que todos os casos
revelaram expressão negativa. Este resultado é semelhante aos encontrados por Alves et al.
(2002), Jorge et al. (2002) e Perez et al. (2004).
Al Rawi et al. (2010) investigaram a expressão da proteína p53 em 10 AP, sendo 6
deles em GSMe. Do total, 70 % apresentaram expressão negativa. Dentre as amostras de AP
em GSMe, 4 casos apresentaram expressão negativa e os outros dois casos apresentaram 6% e
25% das células apresentando expressão positiva, respectivamente.
5.4 ATIVIDADE MUCOSECRETORA EM AP
A atividade mucosecretora em glândulas tem sido mensurada por diversos
estudos a partir da expressão de moléculas denominadas mucinas, glicoproteínas de elevado
peso molecular, altamente O-glicosiladas, que são produzidas por diversas células epiteliais e
têm sido descritas desempenhando um papel tanto na homeostase como na carcinogênese
(YONEZAWA, 2008). Durante o passado, as mucinas foram identificadas e nomeadas
cronologicamente, e até o presente momento, pelo menos 20 mucinas têm sido identificadas
em humanos (ITOH et al. 2008).
As mucinas são classificadas em 3 grupos: mucinas associadas a membrana
(MUC1, MUC3, MUC4, MUC12, MUC16, e MUC17); mucinas secretadas em forma gel
(MUC2, MUC5AC, MUC5B, e MUC6) e mucinas secretadas solúveis (MUC 7)
(YONEZAWA, 2008).
Em geral, as mucinas têm um papel fundamental na proteção, imunidade inata local e
lubrificação da superfície da mucosa de vários organismos. Portanto, é sabido que as mucinas
estão sub ou super-reguladas em várias neoplasias humanas (ANDRIANIFAHANANA,
MONIAUX e BATRA, 2006).
Dessas mucinas, a mais conhecida é a MUC1, uma glicoproteína transmembrana de
31
500-1000 kDa, expressa pelas células normais e cancerosas. Em células epiteliais humanas
saudáveis, MUC1 é expressa na superfície apical da célula, isto é, o lado da membrana da
célula que está virada para o interior do tubo. Como mucina, suas funções incluem
lubrificação, hidratação da célula e proteção contra a invasão de patógenos. O domínio
extracelular da proteína MUC1 contém um número variável de repetições (25-125) em série
de 20 aminoácidos de comprimento (SONG et al., 2012).
MUC1 têm expressão normalmente maior no traqueo-bronco pulmonar, mama,
glândulas salivares, pâncreas, próstata e útero, enquanto que no estomago, intestino delgado,
intestino grosso e vesícula biliar a expressão é mais escassa. Uma série de estudos tem
identificado que a superexpressão de MUC1 em tumores de mama, pulmão, estômago,
próstata, pâncreas, ovários e cólon tem sido associado à maior agressividade, crescimento
invasivo de alguns tumores, pior prognóstico dos pacientes e pode ser um importante
marcador em casos de recorrência (HAMADA et al. 2004; YONEZAWA, 2008; HIGASHI et
al. 1999; TAMADA et al. 2002; SAITOU et al. 2005; JEON et al. 2010; JONCKHEERE e
SEUNINGEN, 2010).
Dentre as alterações teciduais provenientes da super-expressão desta proteína,
incluem: falta de aderência das células tumorais em neoplasias invasivas, alterações na
regulação fisiológica da apoptose, inibição da interação entre linfócitos citotóxicos e as
células tumorais e ainda exercer um importante papel na supressão do gene p53 (HAMADA
et al. 2004; WEI, XU e KUFE, 2007; AGATA et al. 2008).
Diferentes glicoformas de MUC1 também têm sido descritas, que vão das formas
menos glicosiladas até as formas totalmente glicosiladas, e foram nomeadas da seguinte
forma: MUC1⁄ CORE (core peptide of MUC-1 mucin), MUC1⁄ DF3 (core peptide of MUC-1
mucin), MUC1⁄ MY.1E12 (sialylated MUC1 mucin), MUC1⁄glycoprotein (sialylated MUC1
mucin) e MUC1⁄ HMFG-1 (fully glycosylated MUC1 mucin). Dentre estas, MUC1⁄ DF3 têm
32
sido a mais estudada (HAMADA et al. 2004; MANNWEILER, 2003.; BRIEGER et al.,
2008).
Em um estudo imunohistoquímicos envolvendo o AP, Mannweiler et al. (2003)
identificaram a presença de antígenos de mucina MUC1/glycoprotein em todos os casos de
AP pesquisados, com cerca de 5-30% das células tumorais exibindo imunorreatividade.
Sustentando esses achados, Hamada et al. (2004) investigaram a relação de algumas mucinas
como marcadores para recorrência de AP, constatando expressão positiva de antígenos MUC1
e MUC6 em todos os nove casos de lesões primárias de AP, enquanto MUC2, MUC4 e
MUC5AC não mostraram nenhuma expressão na maioria dos casos e uma expressão
fracamente positiva nos demais. Ainda, segundo estes autores, os antígenos MUC1 foram
expressos na membrana celular e/ou no citoplasma dos componentes epiteliais e mioepiteliais,
enquanto MUC6 foi expressa apenas no citoplasma. Como conclusão deste trabalho, os
autores afirmaram que a alta expressão da glicoforma MUC1/DF3 é um independente fator de
risco significante para prever a recorrência de AP.
Em um estudo recente, Soares et al. (2012) investigaram, pela técnica imuno-
histoquimica, a proteína MUC1/DF3 em casos de AP primários, AP recorrentes (RPA) e
CXPA. Neste trabalho, foi demonstrado que em 52% dos casos de AP primário apresentaram
expressão negativa ou em menos que 10% das células analisadas. Além disso, foi verificado
um aumento da expressão da proteína MUC1 em casos de RPA e CXPA quando comparados
com casos de AP primários. Com base nisso, concluíram que a proteína MUC1/DF3 esta
relacionada à recorrência e que esta molécula esta associada com transformação maligna de
AP.
5.5 CICLO CELULAR E PROLIFERAÇÃO CELULAR EM AP
O ciclo celular é um processo que envolve numerosas proteínas reguladoras
33
que direcionam a célula através de uma sequência específica de eventos culminando em
mitose e consequentemente a produção de duas células filhas (ALBERTS et al., 2002).
O ciclo celular pode ser dividido em duas fases: a interfase, a qual engloba as fases
G1(Gap1), S(synthesis) e G2(Gap2); e estágios da fase M (mitótico), o qual incluem a
prófase, metáfase, anáfase e telófase. Há ainda, entre essas duas fases, um período
denominado G0, no qual a célula abandona o ciclo e para de se dividir temporária ou
definitivamente. Compreende um período prolongado de repouso em que a célula apresenta
uma menor atividade metabólica (Fig. 4). A duração do ciclo celular em células humanas
normais gira em torno de 24 a 48 horas, enquanto que em tumores malignas podem chegar a
120 horas (JACOBS, 1992; INCA, 2008).
Para avaliar proliferação celular em tumores, uma série de trabalhos tem utilizado o
biomarcador Ki-67, uma proteína nuclear codificada pelo gene MKI67 que também esta
associada transcrição de RNA ribossomal (BULLWINKEL et al, 2006). Durante a interfase,
a proteína Ki-67 é encontrada especificamente no núcleo da célula, enquanto que durante o
processo de mitose esta proteína é levada até a superfície dos cromossomos. Ainda, vale
ressaltar que a proteína Ki-67 esta presente em todas as fases do ciclo celular (G1,S,G2 e
mitose), exceto na fase de repouso (G0) (SCHOLZEN e GERDES, 2000).
A proteína Ki-67 tem sido importante para determinar prognóstico de tumores,
comportamento biológico e taxas de recorrência em pacientes portadores de neoplasias
malignas como o adenocarcinomas e carcinoma adenóide cístico (SCALZO et al., 1998;
NORDGARD, et al. 1997) . Além disso,a superexpressão de Ki-67 em carcinomas
mucoepidermoides têm sido correlacionada à agressividade e diminuição de sobrevida dos
pacientes (OKABE et al. 2001).
Entretanto, uma série de trabalhos tem mostrado ausência ou baixa expressão desta
proteína em AP (VARGAS et al., 2008; AOKI, et al.; 2004; LAZZARO e CLEVELAND,
34
2000; ALVES et al. 2004).
Figura 5. Ciclo celular: O ciclo celular tem duas fases principais: a interfase, fase
entre os eventos de mitose (G1, S e G2), e a fase mitótica (M), subdividida em prófase,
metáfase, anáfase e telófase, na qual a célula mãe divide-se em duas células filhas
geneticamente idênticas.
Disponível em:< http://www.bdbiosciences.com/research/apoptosis/analysis/ > Acesso em: 18
junho. 2013
35
6. MATERIAL E MÉTODOS
Seleção das Amostras e Critérios de Inclusão e Exclusão
As amostras foram selecionadas do arquivo de blocos e lâminas do Laboratório de
Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Goiás,
compreendendo o período de 1996 a 2013. Ao todo foram analisados 31 casos de AP
localizados em GSMe, sendo 29 casos primários e 2 casos de recorrência. Como controle,
foram utilizados 4 casos de GSMe normais coletadas da mucosa oral sem sinais de inflamação.
Todos os casos foram reavaliados e confirmados o diagnóstico, tendo como critério os
parâmetros definidos pela OMS (BARNES et al., 2005). Dados clínicos e demográficos foram
coletados com base nas informações clínicas registradas nos prontuários e fichas de
encaminhamento dos espécimes ao laboratório de Patologia. Como critério para inclusão no
estudo, foram incluídas apenas blocos que apresentem bom estado de conservação e com
material suficiente para permitir novos cortes histológicos. E foram excluídos da amostra os
casos nos quais não foram confirmados o diagnóstico microscópico de AP e blocos cujo
material for insuficiente para novos recortes.
Estes procedimentos foram executados de acordo com as normas para o
desenvolvimento de pesquisa com amostras biológicas, com a devida aprovação pelo Comitê
de Ética em Pesquisa da UFG protocolo número 043-11(ANEXO A).
Análise Histomorfológica
Para a análise histomorfológica da amostra, nós utilizamos a categorização
preconizada por Foote e Frazel et al. (2) da seguinte forma: predominantemente celular,
igualmente mixoide e celular (misto), extremamente celular e predominantemente mixoide.
36
Técnica Imuno-histoquimica
As amostras selecionadas, incluídas em parafina, foram seccionadas em micrótomo
(Leica RM2165). De cada bloco de parafina, foram obtidos cortes de 3 μm que foram
colocados sobre lâminas silanizadas com 3-aminopropiltrietilsilano a 2% (Sigma Chemicals,
St. Louis, MO, USA) e submetidos à técnica imuno-istoquímica por meio de
Imunoperoxidase (streptavidina-biotina-peroxidase) para a identificação das moléculas Bcl-2+,
Bax+, MUC1+, p53+, e Ki-67+. Inicialmente, os cortes sobre as lâminas foram
desparafinados e hidratados por meio de: 1- xilol, 3 vezes, 10 minutos cada vez; 2- álcool
absoluto, 3 vezes, 2 minutos cada vez; 3- álcool etílico 95% 1 vez, 2 minutos; 4- solução
salina tamponada de Tris (TBS), Ph=7.2- 1 minutos. Em seguida, as lâminas foram incubadas
em tampão citrato (Ki-67, p53,Bax, MUC1) e EDTA (Bcl-2) pH=6.0 (SIGMA, P4809, Saint
Louis – USA) aquecido a uma temperatura de 96oC, com auxílio de Banho Maria Digital
( DeLeo ), para exposição antigênica, por 30 minutos. Após lavagens com TBS, as lâminas
foram imersas no peróxido de hidrogênio (Merck) a 3% em solução salina tamponada (PBS),
por 40 minutos, para o bloqueio da peroxidase endógena. Após serem lavadas com TBS, as
lâminas foram incubadas em solução de BSA (Soro Albumina Bovina) por 20 minutos, a fim
de se obter o bloqueio das ligações protéicas inespecíficas. Em seguida, as lâminas foram
secadas e incubadas com os seguintes anticorpos primários: anticorpo monoclonal anti-
oncoproteína Bcl-2 humana (clone 124, Dako, MO887) a uma diluição 1:500; anticorpo
policlonal de coelho anti-Bax humano (clone 3533, Dako, Carpinteria, CA, USA) 1:500;
anticorpo monoclonal de camundongo MUC1 anti-humano (clone 695, Biocare Medical,
Concord, CA, USA) com diluição 1:150; anticorpo monoclonal de camundongo anti-proteína
p53 (DO7, Dako,NCL) 1:200 e anticorpo monoclonal de camundongo anti-Ki67 humano
( MM1, Novocastra, Newcastle, UK) com diluição 1:100 por, no mínimo, 8 horas e mantidas
na temperatura de 4oC (Tabela 1). Todas as diluições foram realizadas utilizando PBS
37
associado a soro albumina bovina (PBS-BSA) a 1%. Após o período mínimo de 8 horas,
foram realizadas as lavagens consecutivas e posteriormente a incubação com os anticorpos
biotinilados anti-IgG de coelho/camundongo/cabra por 30 minutos, à temperatura de 22 a 25
0C, seguido pela incubação da streptoavidina marcada com peroxidase por 30 minutos, à
temperatura ambiente (kit DAKO LSAB+, Peroxidase- Universal- K0690).
Posteriormente às lavagens consecutivas com TBS, foram realizadas as reações
utilizando o 3.3’-Diaminobenzidina (DAB) em uma solução cromogênica (DAKO, K3468),
por um período estipulado pelo fabricante do anticorpo, à temperatura ambiente e protegida
da luz. A reação foi interrompida com água destilada e as lâminas contra-coradas com
hematoxilina de Mayer, por 25 segundos, à temperatura ambiente. Após serem lavadas com
água destilada por duas vezes, as lâminas foram desidratadas com álcoois (70, 95 e 100 GL),
respectivamente e passadas em xilol (2 vezes) para então finalmente serem montadas com
solução de resina não aquosa (Entellan-Mikroskopie-Merck).
Como controle positivo para as proteínas Bcl-2 e Bax foram utilizado casos de
carcinoma espino-celular, e para as proteína MUC1, e Ki-67 foram utilizados,
respectivamente, casos de carcinoma mucoepidermoide, e hiperplasia fibrosa inflamatória.
Para a proteína p53 foi utilizado hiperplasia fibrosa inflamatória como controle negativo.
Análise Qualitativa
Para análise qualitativa que permitiu a comparação dos nossos resultados com os
dados da literatura os índices absolutos foram transformados em escores de acordo com os
critérios propostos por Alves et al. (2004).
(-) Negativo - ausência de marcação ou ≤ 5%
(+) Positiva fraca 6- 25%
38
(++) Positiva moderada 26 - 50%
(+++) Positiva forte > 50%;
Análise Quantitativa
Para quantificação das células Bcl-2+, Bax+, p53+, MUC1+ e Ki-67
+, o número das
células positivas foi quantificado por meio de análise morfométrica (densidade de células por
mm2), utilizando microscópio óptico contendo um retículo de integração em rede quadrada
(CARL ZEISS, Germany-4740680000000, Netzmikrometer 12.5x). Foi utilizada uma objetiva
de 40x, e foram seguidos os seguintes critérios: O lado (L) do retículo de integração, obtido
por meio de uma lâmina milimetrada, corresponde a 0,125mm. Determinou-se a área do
retículo (A), pela expressão matemática: A= (L2); o que resultou em A= 0,015625mm2.
Para cada amostra, foram analisados 10 campos microscópicos consecutivos, área
total de 0,15625mm2, as células positivas foram quantificadas na região parenquimatosa
tumoral e foi registrado o número total de células positivas encontradas na área total
percorrida e dividido este número por 0,15625mm2, obtendo-se o número de células por
milímetro quadrado (mm2). Os índices de apoptose foram avaliados pela razão entre os
valores da expressão Bcl-2 /Bax, como preconizado por Gomes et al. (2012).
Análise estatística
Para a análise estatística, foi utilizado o teste Qui quadrado (χ2), para investigar a
associação entre as variáveis clínicas e variáveis numéricas. O teste Mann-Whitney foi
utilizado para avaliar a associação entre os grupos. A correlação entre os marcadores (Bcl-2,
Bax, MUC1, p53 e Ki-67) foi avaliada através do coeficiente de correlação de Spearman. Os
resultados dos testes foram expressos como média ± DP e o valor de P menor que 0,05 foi
39
considerado estatisticamente significativo. Todos os testes estatísticos foram aplicados
utilizando-se do software SPSS 17.0.
40
7. ARTIGO
Pleomorphic adenoma of oral minor salivary glands: an investigation of its neoplastic
potential based on apoptosis, mucosecretory activity and cellular proliferation.
Jean Carlos Barbosa Ferreira1, Marília Oliveira Morais
1, Marcela Ramos
Abrahão Elias2, Aline Carvalho Batista
3, Claudio Rodriguês Leles
3, Elismauro Francisco
Mendonça4
1 Postgraduate student, Department of Oral Medicine (Oral Pathology), Dental
School, Federal University of Goiás, Goiânia, Brazil.
2 Undergraduate student, Department of Oral Medicine (Oral Pathology), Dental
School, Federal University of Goiás, Goiânia, Brazil.
3 Associate professor, DDS, MS; Department of Oral Medicine (Oral Pathology),
Dental School, Federal University of Goiás, Goiânia, Brazil.
4 Titular professor, DDS, MS, PhD; Department of Oral Medicine (Oral Pathology),
Dental School, Federal University of Goiás, Goiânia, Brazil.
Corresponding author at:
*Department of Oral Pathology, College of Dentistry, Federal University of Goiás,
GO, Brazil. Praça Universitária, s/n, Setor Universitário, Goiânia-Goiás. CEP: 74605-
220Phone/Fax: +55-62-3209 6327 (E.F. Mendonça)
E-mail address: [email protected]
41
Abstract
Objective: The aim of this study was to investigate the neoplastic potential of the PA of minor
oral salivary glands measured by apoptosis (Bcl-2, Bax and p53), mucosecretory activity
(MUC1), and cellular proliferation (Ki-67).
Design: Thirty-one cases of PA of the oral cavity and 4 controls (C) taken from normal oral
minor salivary glands were analyzed using the immunohistochemistry technique. The proteins
were detected utilizing a semi-quantitative method (scores) as follows: (-) negative ≤ 5%, (+)
low 6–25%, (++) moderate 26–50% and (+++) high >50% of positive tumour cells. The
apoptotic indices were evaluated by the ratio Bcl-2/Bax. Non-parametric comparison and
correlation tests were used for analysis.
Results: The data showed high staining of anti-apoptotic protein Bcl-2 in both groups (PA=
57.9%; C=67.7%) and a significantly lower expression of pro-apoptotic protein Bax
(PA=22.7%; C=97.7%) and MUC1 (PA=14%; C=82.3%) in PA than in C (p<0.001). On the
other hand, a similar expression of Ki-67 and p53 proteins (≤5%) was seen in both PA and C.
In PA, only 2/31 cases showed the ratio Bcl-2/Bax<1.There was no difference in cellular
expression with regard to clinical variables or clinical outcome (p>0.05).
Conclusion: The neoplastic potential of PA could be associated with an imbalance in
apoptotic processes and a lower index of cellular proliferation. Mucosecretory activity does
not play a significant role in primary PA.
Keywords: Pleomorphic Adenoma, Apoptosis, Biological behavior, Cell proliferation,
Mucosecretory activity.
42
Introduction
The most common salivary gland tumor is the pleomorphic adenoma (PA), which
accounts for 40-70% of such diseases1. Fifty-five percent of tumors of the minor salivary
glands are PA, and the most common intraoral sites are the palate, followed by the lip and
buccal mucosa2. High rates of malignant transformation have been reported in long-standing
and recurrent PA3.
Its biological behavior and clinical and microscopic features are widely known.
However, its etiopathogenesis remains unclear4 and as a result certain proteins have been
investigated in order to analyze the development mechanisms of PA in minor salivary gland.
Among them are Bcl-2 (anti-apoptosis protein), p53 (tumor suppressor protein) and the Ki-67
(proliferation cell marker)5-11
. But for the Bax, a pro-apoptotic protein, only two studies have
investigated its association in the pathogenesis of the PA5,6
. According to these studies, Bax
and Bcl-2 proteins have often been associated with the process of apoptosis in salivary gland
tumors. In addition, it has been suggested that the apoptosis markers Bcl-2 and p53 could
predict the behavior of tumors 12
, and that the loss of the p53 function associated with
upregulation of bcl-2 potentiate tumor growth13
.
Data from the literature suggest that the positive staining of these markers may be
related to the development, aggressiveness, differentiation, malignancy and prognosis of
salivary gland tumors, but these studies are still controversial mainly in terms of PA7,9,11
.
Few studies have explored the mucosecretory activity of mucins in PA, which have
been associated with the development of several kinds of cancer14-19
. In general, these mucins
are glycoproteins which protect the mucosal surfaces from adverse environmental influences
and may facilitate glandular secretory processes14
. The minor salivary glands are small
43
mucosal glands in the oral cavity with short ducts which produce a mucoprotein-rich secretion
with a high IgA concentration. The glands with proeminent production of mucins come into
close contact with the teeth and mucosal surfaces and are key contributors to the protective
mechanism of saliva20
. Of these mucins, the MUC1, a membrane bound mucin detected in
most epithelial tissues, is one of the best known, and it has been suggested that its
overexpression could influence various physiological or biochemical events, including
carcinogenesis and tumor invasion14-19
.
Investigation of PA in parotid, submandibular and minor salivary gland tumors by
immunohistochemical technique has shown that the expression of MUC1 is associated with
the invasive growth of these tumors and a poor outcome in patients such as lymphatic
invasion, lymph node metastasis and deep invasion in several tumors15
. In our review, few
samples of PA in minor salivary glands investigating MUC1 were found because of a lack of
exploratory studies14,15,19
.
Against this background, we investigated the neoplastic potential of the PA in the
oral minor salivary glands because it is the most frequently found salivary gland tumor in the
oral cavity. To date no study has investigated the association between apoptosis (Bcl2, Bax
and p53), mucosecretory activity (MUC1) and cellular proliferation (Ki-67) specifically in the
minor salivary gland.
44
Materials and Methods
Patients and clinical specimens
Thirty-one cases of PA of the minor salivary glands located in the oral cavity and
which had been submitted to excisional biopsy were selected for this research. As a control
group, the study included four specimens of normal minor salivary glands acquired from
specimens of non-neoplastic lesions without any inflammatory signs, such as, adjacent glands
to mucous retention phenomenon (mucocele) located in the oral mucosa. All specimens were
retrieved from the archives of the Oral Pathology Laboratory of the Dental School at the
Federal University of Goiás, Brazil, between 1996 and 2013. Clinical data, such as age,
gender, anatomical location, treatment, clinical outcome and recurrence were recorded. All
the procedures for sample acquisition and preparation were approved by the Research Ethics
Committee of the Federal University of Goiás (Protocol: 043/11).
Light microscopy
All specimens were fixed in 10% buffered formalin (pH 7.4) and paraffin embedded.
The microscopical findings were evaluated from an analysis of a 5-μm section of each sample,
routinely stained with hematoxylin and eosin. The microscopic features were analyzed and
confirmed by two independent examiners (E.F.M and M.O.M) in accordance with the World
Health Organization (WHO) classification of tumors4.
Histomorphological analyses
For histological analysis of the sample, the categorization used was that of Foote and
Frazelet al.2: predominantly cellular, equally myxoid and cellular (mixed), extremely cellular
and predominantly myxoid.
45
Immunohistochemistry
The immunohistochemical study of the expression of Bcl-2, Bax, p53, MUC1 and
Ki-67 was carried out. Then, paraffin-embedded tissues were sectioned (3 μm) and collected
in serial sections on glass slides coated with 2% 3-aminopropyltriethylsilane (Sigma
Chemicals, St. Louis, MO, USA). The sections were deparaffinized by immersion in xylene,
and this was followed by immersion in alcohol and incubation with 3% hydrogen peroxide
diluted in Tris-buffered saline (TBS) (pH 7.4) for 40 min. The sections were then immersed in
a citrate (PH=6.0) or EDTA buffer (pH 6.0; SIGMA, P4809, St. Louis, USA) for 30 min at
95°C for antigen retrieval (Table 1.0), and then blocked by incubation with 3% normal goat
serum diluted in distilled water, at room temperature, for 20 min. The slides were then
incubated overnight (18 h) with the primary antibodies at 4°C in a humidified chamber.
After washing in TBS, the sections were treated with labeled streptavidin–biotin–
peroxidase (LSAB) kits (K0492, DAKO, Denmark). They were then incubated in 3.3′
diaminobenzidine in a chromogen solution (DAKO, K3468) for 2 to 5 min at room
temperature. Finally, the sections were stained with Mayer's hematoxylin and covered.
Negative controls were obtained by omitting the primary antibodies, and substituting them
with 1% PBS-BSA and non-immune mouse (DAKO, X0910) serum.
Cell counting and statistical analysis
The Immunoreactivity was evaluated in at least 1000 cells examined at 40X
magnification (integration graticule -4740680000000- Netzmikrometer×12.5, Carl Zeiss,
Göttingen, Germany) and recorded as the percentage of positive tumor cells over the total
number of neoplastic cells present in the same area. Percentage scores were subsequently
categorized according to the classification of Alveset al.9 as follows: (-) negative ≤ 5%, (+)
46
low 6–25%, (++) moderate 26–50% and (+++) high >50% of positive tumour cells. Intensity
of staining was not considered for evaluation. To analyze the rates of apoptosis, the ratio of
Bcl-2/Bax, according to Gomes et al.6, was used.
For statistical analysis, the nonparametric Mann-Whitney and Chi-square tests; and
Spearman correlation were used. Data were expressed as mean ± SD. P-values were noted and
considered statistically significant if P was < 0.05. All statistical tests were performed using
the SPSS 17.0 software.
47
Results
Clinical pathological features
Table II summarizes the clinical pathological data of the 31 cases in this study, of
which 67.7% were females, and the average patient age was 35 years. The most common site
of PA was the palate (n=20), after which came the labial mucosa with 6 cases, the buccal
mucosa with 4 cases and the retromolar region with 1 case. Disease evolution time ranged
from 1 to 360 months, with a median of 24 months. Of this total, only two cases presented
recurrence. According to the pathological and surgical reports on one of the cases of
recurrence, the PA was entirely removed by excisional biopsy, without any sign of
fragmentation. In the second case, based on macroscopical findings, there was damage to the
capsule. The surgical specimen was fragmented.
The histomorphological categorization sample showed that 14 cases (45%) presented
a predominantly cellular pattern, 9 cases (29%) were equally standard cellular and myxoid, 5
(16%) were extremely cellular and only 3 were predominantly myxoid (Table II).
Interestingly, 32.5% of the cases showed squamous differentiation.
Protein expression in normal minor salivary glands
In the normal minor salivary glands a high expressivity of Bcl-2 (median=69.9), Bax
(median=97.8) and MUC1/glicoprotein (median=82.9) was found in all cases (score +++),
with strong staining of (ductal epithelial and acinar cells (Fig. 1. A, C and E, respectively).
The proteins p53 (Fig. 1.G) and Ki-67 (Fig. 1.I) showed negative expressivity for both (score
-). The percentage of cases distributed by scores is represented in Table III. In order to
48
evaluate the immunostaining of p53 and Ki-67, only nuclear staining was considered. The
apoptose index in the normal salivary gland was <1in all cases, with an average of 0.69 (Table
2).
Protein expression in PA
In PA, group Bcl-2 shows that positive staining was found in all cases, showing
moderate (++) or high expression (+++) in 28/31 cases, with a median of 55.3 and mean of
57.9(± 25.8) (Fig. 1B). On the other hand, the Bax protein presented a median of 20 and mean
22.7(± 13.8) (Fig. 1D), 17 cases (54.8%) presented low expression (+) and 12 cases (38.7%)
moderate expression (++). Bcl-2 and Bax proteins showed a cytoplasmic staining pattern,
predominantly in ductal cells. However, some staining of myoepithelial cells in the tumoral
parenchyma. In terms of apoptosis rates (Bcl-2/Bax), only 2 cases showed a ratio <1 (Table 2),
with an average of 2.55.
In relation to MUC1, a score (+) was found in 58.1% (n=18) of the sample. Nine
cases showed negative staining or less than 5% of cells positively stained (-) and only one
case showed 88.7% of cells positively stained (+++). The mean of MUC1 staining for this
sample was 14 % (±17.3). All cases showed a cytoplasmic staining pattern, mainly present in
the luminal surface of ductal cells (Fig. 1F). The myoepithelial cells were not stained by
MUC1. The percentage of MUC1 positive cells in PA showed a median of9 (Fig. 2).
The markers p53 and Ki-67 showed scarce staining in all cases of PA (score -); (Figs.
1H and 1J, respectively).
Statistical analysis
49
When the expressions of MUC1/glicoprotein, Ki-67, Bax, Bcl-2 and p53 proteins
were compared in the PA and C groups there was a statistically significant difference only for
MUC1/glicoprotein (p = 0.002) and Bax (p = 0.001). In addition, the Spearman correlation
test in the PA group showed a weak positive correlation only between the proteins Bax/Bcl-2
(r=0.36; p = 0.045). There was no association between clinical data (tumor size), histological
pattern and immunohistochemical staining.
50
Discussion
The etiology of PA remains unclear. Although there is evidence of changes in gene
PLAG1 (pleomorphic adenoma gene 1) in up to 70% of cases21
, we believe that other
mechanisms, including the apoptotic process and probably mucosecretory activity, are also
deregulated in the development of this tumor. In this study, we saw that the process of
apoptosis in PA could be regulated by proteins Bcl-2 and Bax. In our study we found the
balance between these proteins was altered.Bcl-2 had a similar score for both groups
(moderate to high), however Bax showed a reduced expression in PA when compared to the
normal gland.
Changes in apoptotic processes always result in pathological conditions and/or
oncogenesis as suggested by Aoki et al.22
. In these processes the proteins of the Bcl-2 family
(Bcl-2, Bcl-x, Bax, Bid) are involved in the positive and negative regulation of this
mechanism. Among the anti-apoptotic members, the Bcl-2 protein is highlighted, while Bax
plays the role of a pro-apoptotic agent22,23
. In the literature to date, few studies have explored
the relationship between Bcl-2 and Bax expressions especially in PA5.
In normal conditions these proteins can form homodimers and heterodimers with
each other, leading to balances in the apoptotic process24
. It has been suggested that the
redundancy Bax/Bax enhances apoptosis while the Bcl-2/Bax heterodimer promotes cell
survival5, and this could be responsible for the neoplastic potential in PA, as, in all the cases
of normal salivary glands, there was a balanced ratio between Bcl-2/Bax=0.69 which would
suggest a balance of these proteins in healthy tissues. In PA, when all the cases of PA were
considered, this balance ratio Bcl-2/Bax=2.55 was altered which would suggest a deregulation
in the apoptosis process.
51
Gomes et al.6 used the PCR technique (Polymerase Chain Reaction) to investigate
Bcl-2 and Bax in various malignant and benign salivary gland tumors, including cases of PA.
In their study, two indexes of apoptosis were adopted for the analysis: index 1, the ratio of
Bcl-2 and Bax (Bcl-2/Bax) and index 2, the ratio of Bcl-2 and CASP3 (Bcl-2/CASP3).
According to these authors, cases which present very high coefficients, favor a antiapoptotic
profile, while, on the other hand, values <1 indicate an increase of Bax protein or CASP3, or a
decreased mRNA transcript of the protein Bcl-2, thereby favoring apoptosis. Their study
showed that Bcl-2 mRNA was overexpressed in salivary gland tumors and Bax expression in
the tumors was higher than in normal salivary glands only in 52% of the samples.
Furthermore, the results show that only 4/17 PA showed a Bcl-2/Bax ratio<than 1.Our results
are similar to these. In our sample, only 2/31 cases of PA had coefficients <than 1.
In consonance with our study, Aoki et al.22
and Yanez et al.25
also found a high
expression of Bcl-2 in PA, suggesting that this protein really may be involved in the
pathogenesis of PA. On the other hand, Al Rawiet al.10
investigated six cases of PA and found
a negative expression in four cases (66%) and only one case showed a staining of 40% of
positive cells. However, this study had a limited number of PA in oral minor salivary gland.
In agreement with these latter results, Gordon Nuñeset al.11
also found negative staining in 12
/19 cases of PA, however, the localization of the PA and control group were not described.
With regard to Bax, the results of this study contrast with the findings of Soini et al.5
which found a high expression of Bax and Bcl-2 proteins in the group of benign tumors,
including 23 cases of PA. However, in their study the authors did not describe the features of
the sample. We believe that there are differences between salivary glands with tumoral
involvement. In our study, the findings suggest that there is an imbalance in the control
system of apoptosis in PA, which prolongs cellular life, cellular immortality and promotes the
52
accumulation of cellular gene mutations and consequently lead to the occurrence of tumoral
development.
Another component also involved in cell cycle regulation and apoptosis is the tumor
suppressor gene p53. It is believed that the role of the p53 gene is to eliminate damaged cells
from a population and that cells without p53 can acquire the potential to replicate with DNA
damage, thereby leading to malignant change10
. Additionally, the loss of the p53 function in
association with the upregulation of Bcl-2 protein can give a double advantage in cell growth
and influence tumor behavior13
.
In our study the influence of p53 does not appear to be significant, as the staining of
p53 was either totally absent or present in less than 1% of the cells in all cases of PA. These
data are in consonance with previous studies7,10,26
. Moreover, our results also suggest that p53
does not influence the expression of Bcl-2 protein in cases of PA in minor salivary glands
because there was an insignificant staining of p53 cells. The contrary has been observed in
carcinoma ex pleomorphic adenoma (CXPA) where the positivity rates ranged from 45.2% -
75% (27-29). These results would suggest a greater role for the p53 in the malignant
transformation of PA.
One transmembrane glycoprotein investigated in neoplastic lesions is the MUC1
mucoprotein. It has been reported that the overexpression of some MUC1 isotypes in
neoplasms acts as an inhibitor of E-cadherin (key molecules in cell-cell adhesion). It inhibits
the interaction of cytotoxic lymphocytes and tumor cells and can also block hypoxia-induced
necrosis and apoptosis30-32
. Our study is the first to investigate the neoplastic potential of PA
based on the mucosecretory activity of MUC1/glycoprotein isotype exclusively in minor
salivary glands. No studies have yet investigated MUC1 protein and its relationship with the
biological behavior of PA.
53
In this study, a high staining of MUC1 was found in normal minor salivary glands,
with a cytoplasmic staining pattern in both ductal epithelial and acinar cells, which contradicts
the findings of Soares et al.19
, who found a low expression of MUC-1 in the epithelial cells of
the ductal structures and in rare cases found staining patterns in serous acini in samples of
normal parotid glands. Although Hamada et al.15
did not specify the kind or location of the
normal salivary gland samples used in their study, they found a weak staining of MUC1 in
normal salivary glands. This discrepancy in results from one study to another may be related
to the location and function of the salivary glands investigated. For instance, in our study the
samples investigated were only of minor salivary glands, which produce mucoprotein-rich
secretion when compared with other glands. The parotid gland, for example specializes in the
production of seromucous, as does the submandibular gland20
.
The overexpression of MUC1 has been identified as one of the factors responsible
for recurrence and malignant transformation in cases of PA15,19
. In our study, we found a
weak expression of MUC1, with a number of positive cells ranging from 6 to25% (score +),
which shows a cytoplasmic staining pattern in ductal epithelial cells. These findings
corroborate the data reported by Soareset al.19
, which either showed negative staining or less
than 10% of cells in 52% of the cases in the sample. This same study concludes that a higher
expression of MUC1 in recurrent PA than in PA may be associated with the higher percentage
of malignant transformation in recurrent PA than in PA, which reinforces prior findings by
Hamada et al. 15
. In another study with results similar to ours undertaken by Mannweiller et
al.14
an expression of MUC1 was found in all cases of PA with positive staining in between 5-
30% of cells.
While previous studies have suggested that overexpression of MUC1 protein is
significant in salivary gland tumors with a history of recurrence and malignant transformation,
54
our study showed that the expression of this glycoprotein in PA was low, which would
suggest benignity for our sample. In our study, there were only two cases of recurrent PA
which did not present any significant difference of expression in relation to the primary cases
of PA. Because of the reduced number of recurrent PA in our samples, it was difficult to draw
conclusions. As most of the studies done are in major salivary gland tumors we believe that
more investigation should be done with a greater number of samples which would include
recurrent PA and CXPA in minor salivary gland tumors, even though samples of CXPA in
this site are extremely rare19,33-35
. Finally, there is no doubt that a reduced expression of
MUC1 in primary PA is indicative of low invasive potential and aggressiveness while a
higher expression is indicative of more aggressive biological behavior, as shown in recurrent
PA and CXPA14,15,19
.
One of the mechanisms involved in oncogenesis is cell proliferation. To investigate
cell proliferation in tumors, the Ki-67 is the most widely used biomarker. An overexpression
of Ki-67 has been associated with certain tumors of a more aggressive biologic behavior,
histological grading and the patient’s clinical course7,17
. However, in this study Ki-67 was
either negative or exhibited sporadic nuclear staining patterns as in most studies 7,8,22,36
. This
result highlights the benign nature of this tumor, usually characterized by slow growth and a
favorable prognosis.
The analysis in this study suggests that the neoplastic potential of the PA may be
associated with an imbalance in apoptotic processes represented by proteins Bcl-2/Bax, and
that the mucosecretory activity of MUC1 does not play any significant role in primary PA.
Moreover, a weak expression of the proteins Ki-67 and p53 strengthens the benign nature of
this tumor which is characterized by slow growth and a good prognosis.
55
Acknowledgements
This study was supported by CNPQ (National Council for Scientific and
Technological Development), protocol number: 305662/ 2010-4.
The authors declare that they have no conflict of interest.
56
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.
61
Tables
Table I: Characteristics of the antibodies used: specificity, clone, source, diluition and
buffer
* Biocare Medical, Concord, CA,USA; † Novocastra, Newcastle, UK; ‡ Dako Corporation, Glostrup, Denmark
Especificity Clone Source Diluition Buffer
(AR)
Muc1 695 Biocare Medical®* 1:150 Citrate
Ki-67 MM1 Novocastra®† 1:100 Citrate
Bcl-2 154 Dako®‡ 1:500 EDTA
Bax A3533 Dako® 1:500 Citrate
p53 DO-7 Dako® 1:200 Citrate
62
Table II: Clinicopathological factors of the samples
63
Table III: Percentage of cases distributed by scores.
Score classification according to Alves et al. (2004): (-) negative ≤ 5%, (+) low 6–25%, (++) moderate
26–50% and (+++) high >50% of positive tumour cells.
PA CONTROL
Score MUC1 Bcl-2 Bax p53 Ki-67 MUC1 Bcl-2 Bax p53 Ki-67
- 29% - 3,2% 100% 100% - - - 100% 100%
+ 58,1% 9,7% 54,8% - - - - - - -
++ 9,7% 35,5% 38,7% - - - 25% - - -
+++ 3,2% 54,8% 3,2% - - 100% 75% 100% - -
64
Figures
Fig 1: Expression of proteins in control (C) and in Pleomorphic adenoma (PA); A Bcl-2(C); B Bcl-2
(PA), C. Bax (C); D Bax (PA), E MUC1 (C), F MUC1 (PA), G p53(C), H p53(PA), I Ki-67(C) and J
Ki-67(PA); Immunohistochemical staining, original magnification 400x.
DD
EE FF
AA BB
CC
65
.
II JJ
GG HH
66
Fig 2. Box plot showing immunoexpression of proteins Ki-67, p53, MUC1, Bax and Bcl-2 in Control
group (C)- continuous column- and PA- dashed column.
67
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
De acordo com os resultados obtidos nesse trabalho, podemos considerar que:
Os índices de apoptose em AP controlados pelas proteínas Bcl-2 e Bax estão
desregulados, e este evento pode ser um dos prováveis fatores que contribuem para o
surgimento e crescimento dos tumores.
Embora alguns trabalhos apontem alta expressão de MUC1 em AP recorrentes e
CXPA, em AP primários essa proteína parece não desempenhar papel significativo,
tendo em vista sua baixa expressividade.
A baixa expressividade das proteínas p53 e ki-67 em AP reforça a natureza benigna
desta lesão.
A proteína p53 parece não influenciar a expressão de Bcl-2 em AP primários.
As moléculas investigadas neste estudo precisam ser analisadas em uma amostra
maior de AP recorrentes, haja vista que investigamos apenas dois casos.
A inclusão de amostras de CXPA de boca poderá constituir um novo trabalho da nossa
equipe, pois há poucos trabalhos na literatura investigando essa contrapartida maligna
do AP. Entretanto, trata-se de uma lesão de baixíssima frequência em nosso centro, o
que exigirá parcerias com outros centros para constituir uma amostra significativa
como a nossa.
68
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80
ANEXOS
A- Pacecer do Comitê de ética em Pesquisa da UFG
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B- Comprovante de Submissão