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Universidade Estadual do Ceará Faculdade de Veterinária Biotecnologia da Reprodução Animal
Criopreservação de Embriões
Vicente José de F. Freitas
Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução
www.uece.br/lfcr
Plano de Aula
� Apresentar os princípios da criopreservação de
embriões.
� Discutir as técnicas de criopreservação.
� Apresentar os fatores que afetam o sucesso da técnica.
� Apresentar as considerações finais sobre o tema.
Conceito
Redução, ou mesmo parada, de todos os fenômenos biológicos:
ü movimentos moleculares,
ü reações químicas e
ü atividades enzimáticas
em temperaturas inferiores a -150°C.
Histórico
Espécie Referência
Murina Whittingham et al., 1972
Bovina Wilmut & Rowson, 1973
Ovina Willadsen et al., 1976
Caprina Bilton & Moore, 1977
Vantagens � Otimização das biotecnologias reprodutivas.
� Conservação de material genético:
� Raças de produção.
� Espécies em extinção.
� Prevenção de perdas de animais vivos durante o transporte.
Vantagens
Programa de Conservação da Raça Morada Nova Branca
(UECE-UFC)
Ovelha doadora
Sincronização/ Superovulação IA por laparoscopia
com sêmen de carneiro MNb
+ 6 dias
Colheita/congelação dos embriões
TE para ovelhas receptoras
Nascimento das crias
Princípio da criopreservação
• protocolo empregado na criopreservação de uma célula deve
ser suficientemente ...
• lento (evitar a cristalização da água intracelular) e
• suficientemente rápido (evitar a exposição das células a
elevadas concentrações de eletrólitos antes da congelação).
Crioprotetores
Papel de proteção da célula, pois...: • Reduz a formação de cristais de gelo;
• Diminui o ponto crioscópico da água;
• Aumenta a estabilidade da membrana celular.
Tipos de crioprotetores:
a) Permeáveis: � propilenoglicol, glicerol, etilenoglicol, dimetilssulfóxido
(DMSO).
b) Não permeáveis: • polivinilpirrolidona, polietilenoglicol, ficoll, dextran e álcool
polivinílico
Tipos de criopreservação
1. Congelação clássica (lenta):
• Também conhecida como método de congelação clássica, tradicional
ou de equilíbrio.
• Esta técnica foi padronizada e largamente utilizada no âmbito
comercial e industrial.
• Criação de um delicado balanço entre vários fatores que determinam
a formação de cristais de gelo, fraturas, danos tóxicos e osmóticos,
permitindo trocas entre os meios extra e intracelular sem que
ocorram sérios efeitos osmóticos e deformidades celulares.
Tipos de criopreservação 2. Vitrificação:
• Esta técnica pode ser considerada um método de criopreservação em que a formação de
cristais de gelo é totalmente eliminada.
• A solidificação é atingida pelo aumento extremo da viscosidade e não pela cristalização,
chegando diretamente à fase vítrea.
• Permite a passagem pela zona crítica de temperatura de maneira rápida, o que impede o
desenvolvimento de injúrias ocasionadas pela formação dos cristais de gelo.
• A concentração do crioprotetor traz efeitos tóxicos e hipertônicos, aumentando o risco
de injúrias causadas pelo choque osmótico e pela toxicidade celular.
Congelação lenta
1. Princípio: • Equilíbrio progressivo entre os crioprotetores utilizados e o
compartimento aquoso do embrião.
2. Crioprotetores: • Glicerol, etilenoglicol, DMSO, propanodiol.
3. Cristalização (seeding): • Deve ser induzida pelo operador antes que ocorra de maneira
espontânea.
• Evita a congelação de células em temperaturas excessivamente baixas.
Vitrificação
1. Características:
• Estado líquido estado vítreo (amorfo)
• Crioprotetores com alto grau de viscosidade: • Etilenoglicol e DMSO
• Alta velocidade na criopreservação: • Imersão direta no NL.
Fatores que influenciam no sucesso da técnica
1) Estádio de desenvolvimento embrionário:
• Embriões mais tardios (blastocistos) apresentam maior taxa de sobrevivência
Melhor taxa de sobrevivência
Fatores que influenciam no sucesso da técnica
2) Qualidade do embrião: • Embriões de melhor qualidade apresentam maior taxa de sobrevivência.
Fatores que influenciam no sucesso da técnica
3) Espécie/subespécie animal:
• Zebuínos apresentam menor taxa de sobrevivência embrionária
Considerações • Ambas as técnicas (congelação lenta e vitrificação)
podem ser utilizadas para criopreservação de embriões.
• A eficiência das duas técnicas pode variar de acordo com diversos fatores que devem ser levados em consideração.
• A vitrificação parece apontar, em um futuro próximo, como técnica de escolha.