universidade estadual de campinas faculdade de … · de melhor eu recebi. falar sobre tudo isso...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Engenharia de Alimentos - FEA
JANE DELANE REIS PIMENTEL SOUZA
DESENVOLVIMENTO DE BEBIDA MISTA DE VEGETAIS E AVALIAÇÃO DA
CAPACIDADE ANTIOXIDANTE E PREBIÓTICA IN VITRO
CAMPINAS
2017
JANE DELANE REIS PIMENTEL SOUZA
DESENVOLVIMENTO DE BEBIDA MISTA DE VEGETAIS E AVALIAÇÃO DA
CAPACIDADE ANTIOXIDANTE E PREBIÓTICA IN VITRO
Tese apresentada à Faculdade de
Engenharia de Alimentos da
Universidade Estadual de Campinas
como parte dos requisitos exigidos
para obtenção do título de Doutora em
Ciência de Alimentos.
Orientadora: Profª Drª. Gláucia Maria Pastore
CAMPINAS
2017
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA
TESE DEFENDIDA PELA ALUNA JANE DELANE REIS
PIMENTEL SOUZA, E ORIENTADA PELA PROF(A) DR(A)
GLAUCIA MARIA PASTORE
BANCA EXAMINADORA
Profª. Drª. Glaucia Maria Pastore (Orientadora)
Ana Elizabeth Cavalcante Fai Buarque de Gusmão (Membro Titular)
Universidade do Estado do Rio de Janeiro – UERG
Darlila Aparecida Gallina (Membro Titular)
Instituto de Tecnologia de Alimentos – ITAL
Juliana Azevedo Lima Pallone (Membro Titular)
Faculdade de Engenharia de Alimentos - UNICAMP
Ruann Janser Soares de Castro (Membro Titular)
Faculdade de Engenharia de Alimentos - UNICAMP
Adriane Elisabete Antunes de Moraes (Membro Suplente)
Faculdade de Ciências Aplicadas – UNICAMP
Magali Conceição Monteiro da Silva (Membro Suplente)
Universidade Estadual Paulista – UNESP
Vera Sônia Nunes da Silva (Membro Suplente)
Centro de Ciência e Qualidade de Alimentos - ITAL
Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no
processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico este trabalho às pessoas que mais amo,
que fazem minha vida tão bela e feliz,
filho, esposo, mãe, pai, irmãos e sobrinhos.
O apoio de vocês me deu força.
AGRADECIMENTOS
Viver a experiência do doutorado foi algo que me proporcionou muito
conhecimento. E não falo apenas da tese, esta foi importante sim, mas o
autoconhecimento, a vivência com pessoas diferentes e diferenciadas,
desconstruindo conceitos e construindo outros muito relevantes somam o que
de melhor eu recebi. Falar sobre tudo isso daria um outro livro. Foram muitas
emoções, carregadas de dificuldades que me fizeram evoluir e isso foi muito
bom.
A convicção de que Deus é meu guia me deixou sempre segura de que
este caminho era preciso ser percorrido e ao final de tudo minhas perguntas
vazias teriam respostas concretas. O Seu cuidado comigo foi tamanho, que eu
sei que estava onde deveria estar e mais, com as pessoas com quem deveria
conviver. As vezes sentia-as como anjos enviados para me proteger. Diante de
tudo isso sou muito grata a Ele!
Sou imensamente grata ao meu filho Levi, meu pequeno e grande
companheiro, acalentou tantas vezes meu coração e me faz experimentar todo
dia do maior amor que existe.
Meu companheiro, Danilo, pelo amor, equilíbrio e parceria. Os desafios
que vivemos nos fez melhores, espero que juntos tenhamos força e sabedoria
para seguir.
Painho e mainha, por sempre respeitar e apoiar minhas escolhas. Não
importa quão longe eu vá, tem sempre um lugar onde eu quero estar, é perto
de vocês, onde o aconchego toma meu coração.
Minhas queridas irmãs, que entendem meus sentimentos desde sempre.
Seremos cumplices a vida toda, minhas grandes amigas. Sem esquecer do
caçula, que é parceiro, ainda que lá na dele. Privilégio imenso ter a família que
tenho.
Minha mãedrinha, protetora, foi bom estar mais perto de você por estes
anos aqui, sentirei muita falta disso.
Os tempos longe da família só não foram mais difíceis porque eu tive a
alegria de conviver com pessoas muito especiais. Certamente não seria
possível se vocês não suavizassem a rotina desgastante. Obrigada turma do
laboratório bioaromas por aturarem minhas reclamações e por me fazerem
sorrir tantas vezes.
Conheci pessoas de quem eu não queria me separar, mas, infelizmente,
tomaremos rumos diferentes, Ana Pereira, Ana Simi, Ju Bueno, Renata e
Maysa, vocês já fazem muita falta.
Minha querida amiga Ana Pereira, falar a verdade não é difícil pra gente,
o difícil mesmo é encontrar quem está preparado para ouvi-la. Obrigada por
toda paciência, eu sei que não foi fácil pra você. Foi um grande presente te
conhecer!
A Simi com uma delicadeza sem igual é um exemplo de equilíbrio pra
mim, e isso é primordial para uma boa convivência em grupo.
Ju, agradeço-te muito por ter me proporcionado trabalhar com os
oligossacarídeos, por ser uma grande amiga, por ser um grande exemplo de
pesquisadora. Os desastres a gente releva!
Maysinha, queria ter metade do foco que você tem, talvez um dia eu
consiga. Adoro seu jeito simples e reto de lidar com as adversidades.
Rê, não sei o que seria de mim sem você. Eu tenho tanto para te
agradecer...Obrigada pela parceria, paciência e sinceridade. Você soube me
dar conselhos e ouvir como uma mãe, além de orientar, encorajar-me e me
fazer sorrir com umas sacadas inesquecíveis!
Vê, a pessoa mais agitada que já conheci, numa tranquilidade tamanha
para me ensinar. Sinto muitas saudades das boas conversas.
Gustavo, é impossível não sorrir com você, às vezes ainda me pego
dando risada sozinha! Tenho uma gratidão imensa a você e Henrique pelo
apoio indispensável neste trabalho.
A Angel, que soma tantas funções e se dedica admiravelmente à
pesquisa.
Enquanto um monte de gente vai e vem do laboratório, tem aqueles que
estão ali, e que veem tudo isso passar. Como diz Nadirzinho: ―tem gente que
deixa saudade‖. Você é uma dessas pessoas! A alegria e a satisfação com que
realiza seu trabalho é admirável.
Não poderia esquecer da Débora, sempre solícita e agradável. Dora,
sempre cuidadosa.
À Profª Glaucia, meu muito obrigada pela orientação, por me aceitar e
confiar no meu trabalho. Graças a você tive experiências valiosas no
doutorado.
Obrigada aos outros amigos da FEA, pessoal do Lab. Análise. Em
especial, Maria Rosa, pela amizade, por compartilharmos juntas da experiência
maternidade e pesquisa.
À família: Patrícia, Pedro e Gustavo, vocês foram grandes parceiros
nessa fase final tão atribulada.
Minhas amigas Sheila, Renatinha e Karina, é muito bom poder contar
com a companhia de vocês.
Ao CNPq, pela concessão da bolsa de Doutorado.
À banca examinadora, pela disponibilidade, e pelas valiosas correções e
sugestões.
Eterna é minha gratidão a todos!
RESUMO
A relação entre hábitos alimentares e saúde não é recente e cada vez mais se
intensificam as pesquisas e inovações para descortinarem o universo de
potenciais benefícios que os alimentos podem promover na saúde do indivíduo.
Embora as pessoas tenham esta preocupação, o ritmo de vida acelerado exige
refeições rápidas e práticas. Neste contexto, as bebidas mistas de vegetais
ganharam muitos adeptos, por serem uma opção prática e saborosa para
ingestão de nutrientes advindos de frutas e hortaliças. Esses alimentos são
fontes de compostos bioativos com atividade antioxidante que
reconhecidamente têm efeito protetor no organismo. Os fruto-oligossacarídeos
(FOS) são também considerados compostos bioativos e estão presentes em
grande quantidade em vegetais como o yacon (Smallanthus sonchifolius).
Assim, o objetivo deste estudo foi desenvolver uma bebida mista de vegetais,
que inclua entre outros componentes, o yacon, e avaliar a capacidade
antioxidante e prebiótica desta bebida antes e após a digestão in vitro.
Inicialmente, foram validados métodos para análise de mono, di e
oligossacarídeos por cromatografia de íons acoplada ao detector
amperométrico pulsado (HPAEC-PAD) e amostras de diferentes frutas e
hortaliças foram avaliadas. Um estudo com couve, yacon e padrões de fenóis e
FOS foi realizado para avaliar os possíveis efeitos sinérgicos entre esses dois
grupos de compostos bioativos. A bebida mista de vegetais (BMV) foi
elaborada utilizando algumas das amostras vegetais analisadas durante a
validação, empregando o yacon como fonte de FOS. Foram realizadas a
caracterização físico-química, composição centesimal e aceitação sensorial da
bebida. Os carboidratos, fenóis totais, atividade antioxidante (avaliada por meio
dos ensaios ABTS e ORAC) foram analisados antes da digestão e nas fases
gástrica e intestinal da digestão simulada. Os parâmetros de validação tiveram
respostas satisfatórias para linearidade, acurácia e precisão e os métodos
apresentaram boa seletividade e resolução. Os resultados indicaram que os
métodos podem ser utilizados com confiança para separar e quantificar os
carboidratos. Um provável efeito protetor dos fenóis com relação aos FOS foi
observado, já que, em amostras contendo ambos os grupos de compostos, não
houve degradação dos FOS na condição de baixa acidez da digestão gástrica.
A BMV elaborada destacou-se no conteúdo de minerais: manganês, cobre,
potássio, magnésio e cálcio, ademais, teve baixo teor de lipídeos e proteínas.
A digestão in vitro da BMV revelou que os FOS podem ser parcialmente
degradados, possivelmente devido à acidez inerente à fase gástrica da
digestão. Os compostos fenólicos e atividade antioxidante aumentaram com a
digestão in vitro. A avaliação sensorial da BMV mostrou que houve boa
aceitação com relação ao sabor, cor e aroma, mas mudanças são necessárias
para melhorar a consistência da bebida.
Palavras-chave: Yacon, fruto-oligossacarídeos, compostos fenólicos, digestão
in vitro
ABSTRACT
The relationship between eating habits and health is not recent. Therefore,
research and innovation have intensified to unveil the universe of potential
benefits that foods can promote in the health of the individual. Although people
have this concern, the fast pace of life requires fast and practical meals. In this
context, beverages of a blend of vegetables have gained many adepts for being
a practical and tasty option for ingestion of nutrients from fruits and vegetables.
These foods are sources of bioactive compounds with antioxidant activity that
are known to have a protective effect on the body. Fructooligosaccharides
(FOS) are also considered bioactive compounds and they are present in large
amounts in vegetables such as yacon (Smallanthus sonchifolius). Thereby, the
objective of this study was to develop a beverage with a blend of vegetables,
including among other components, yacon, and to evaluate the antioxidant and
prebiotic capacity of this beverage before and after in vitro digestion. Initially,
methods for analysis of mono-, di- and oligosaccharides high-performance
anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-
PAD) were validated and samples of different fruits and vegetables were
evaluated. A study with kale, yacon and standards of phenols and FOS was
performed to evaluate the possible synergistic effects between these two
groups of bioactive compounds. The beverage of blend vegetables (BBV) was
elaborated using some of the vegetal samples analyzed during the validation,
using yacon as a source of FOS. The physical-chemical characterization,
centesimal composition and sensorial acceptance of the beverage were
performed. Carbohydrates, total phenols, antioxidant activity (evaluated by the
ABTS and ORAC assays) were analyzed before digestion and in the gastric and
intestinal phases of the simulated digestion. The validation parameters had
satisfactory answers for linearity, accuracy and precision and the methods
showed good selectivity and resolution. The results indicated that the methods
can be used with trust to separate and quantify the carbohydrates. A possible
protective effect of the phenols in relation to FOS was observed, since, in
samples containing both groups of compounds, there was no degradation of the
FOS in the condition of low acidity of the gastric digestion. The elaborated BMV
stood out in the mineral content: manganese, copper, potassium, magnesium
and calcium, in addition, it had low content of lipids and proteins. In vitro BMV
digestion showed that FOS may be partially degraded, possibly due to the
acidity inherent in the gastric phase of the digestion. Phenolic compounds and
antioxidant activity increased with in vitro digestion. The sensory evaluation of
BMV showed that there was good acceptance regarding taste, color and aroma,
but changes are needed to improve the consistency of the beverage.
Key-words: Yacon, fructooligosaccharides, phenolic compounds, in vitro
digestion
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................... 16
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 17
OBJETIVOS ..................................................................................................... 18
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................... 19
1.1 FIBRAS, OLIGOSSACARÍDEOS E PREBIÓTICOS ................................. 19
1.2 YACON ...................................................................................................... 22
1.3 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE .................................................................... 22
1.4 BEBIDAS À BASE DE VEGETAIS ............................................................ 23
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 25
CAPÍTULO I ..................................................................................................... 31
RESUMO.......................................................................................................... 32
ABSTRACT ...................................................................................................... 33
1.0 - INTRODUÇÃO ......................................................................................... 34
2.0 - MATERIAL E METODOS ........................................................................ 35
2.1 - Reagentes e padrões ............................................................................. 35
2.2 - Amostras ................................................................................................. 36
2.3 - Determinação da umidade ..................................................................... 36
2.4 - Preparação das amostras ...................................................................... 36
2.5 - Perfis de carboidratos por Cromatografia de Troca Aniônica de Alta Eficiência acoplada ao Detector Amperométrico Pulsado (HPAEC-PAD). 37
2.5.1 - Oligossacarídeos ................................................................................ 37
2.6.2 - Mono, dissacarídeos, rafinose e estaquiose .................................... 37
2.7 - Validação dos métodos ......................................................................... 38
2.8 - Análises Estatísticas.............................................................................. 38
3.0 - RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................... 39
3.1 Validação ................................................................................................... 39
3.2 - Composição de carboidratos nos vegetais ......................................... 44
4.0 - CONCLUSÃO .......................................................................................... 48
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 49
CAPÍTULO II .................................................................................................... 52
RESUMO.......................................................................................................... 53
ABSTRACT ...................................................................................................... 54
1.0 - INTRODUÇÃO ......................................................................................... 55
2.0 - MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................ 57
2.1 - Material .................................................................................................... 57
2.2 - Preparação das amostras ...................................................................... 57
2.3 - Digestão in vitro ..................................................................................... 58
2.4 - Carboidratos ........................................................................................... 58
2.5 - DETERMINAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS ............................. 59
2.6 - Capacidade antioxidante ....................................................................... 59
2.6.1 - TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) – captura do radical 2′2-azino-bis(3-etilbenzotriasolina)-6-ácido sulfônico (ABTS•+) ................. 59
2.6.2 - ORAC – Oxygen Radical Absorbance Capacity ............................... 60
2.7 - Análises estatísticas .............................................................................. 60
3.0 - RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................... 61
4.0 - CONCLUSÃO .......................................................................................... 68
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 69
CAPÍTULO III ................................................................................................... 73
RESUMO.......................................................................................................... 74
ABSTRACT ...................................................................................................... 75
1.0 - INTRODUÇÃO ......................................................................................... 76
2.0 - MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................ 77
2.1 Material ...................................................................................................... 77
2.2 - Formulação da bebida ........................................................................... 78
2.3 - Caracterização da bebida mista de vegetais (BMV) ............................ 79
2.3.1 - Composição centesimal ..................................................................... 79
2.3.2 - pH ......................................................................................................... 79
2.3.3 - Sólidos solúveis .................................................................................. 80
2.3.4 - Acidez total titulável............................................................................ 80
2.3.5 - Cor ........................................................................................................ 80
2.3.6 - Composição de minerais .................................................................... 80
2.3.7 - Carboidratos ........................................................................................ 81
2.3.8 - Determinação dos Compostos fenólicos .......................................... 81
2.3.9 - Capacidade antioxidante .................................................................... 82
2.3.9.1 - TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) – captura do radical 2′2-azino-bis(3-etilbenzotriasolina)-6-ácido sulfônico (ABTS•+) .... 82
2.3.9.2 - ORAC – Oxygen Radical Absorbance Capacity ............................ 82
2.4 - Digestão in vitro ..................................................................................... 83
2.5 - Análise sensorial .................................................................................... 84
2.6 - Análises estatísticas .............................................................................. 84
3.0 - RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................... 84
3.1 Definição da formulação da BMV ............................................................ 84
3.2 - Caracterização da bebida mista de vegetais (BMV) ............................ 85
3.3 - Digestão in vitro ..................................................................................... 86
3.4 - Análise sensorial .................................................................................... 90
4.0 - CONCLUSÃO .......................................................................................... 91
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 92
DISCUSSÃO GERAL ...................................................................................... 97
CONCLUSÃO GERAL ..................................................................................... 99
REFERÊNCIAS .............................................................................................. 100
ANEXOS ........................................................................................................ 110
16
INTRODUÇÃO GERAL
Os alimentos não são julgados apenas em termos de gosto e
necessidades nutricionais imediatas, mas também por sua capacidade em
melhorar a saúde e o bem-estar. O consumidor está cada vez mais consciente
da importância da inclusão de alimentos saudáveis na dieta que auxiliam na
prevenção de doenças e melhoria da qualidade de vida, o que resulta em um
aumento na demanda destes produtos no mercado (Barrett; Lloyd, 2012;
Andres, Villanueva, Tenorio, 2016).
No entanto, no ritmo de vida frenético e acelerado que muitas pessoas
vivem, a alimentação fica aquém da que seria ideal para se ter o benefício de
ser saudável. As pessoas ora alimenta-se fora de casa, ora fazem refeições
rápidas, e não tem tempo para prática de atividades físicas.
Pensando nisso, o segmento de mercado de alimentação saudável e
rápida tem ganhado espaço e adeptos. Pois embora queiram alimentar-se bem,
as pessoas buscam o que é mais prático. Seguindo esta tendência, o consumo
de bebidas mistas de vegetais tem aumentado, assim como as pesquisas com
os mais diferentes tipos de misturas de frutas e hortaliças no preparo da bebida
(Di Cagno et al., 2011; Balaswamy et al., 2013; Dionísio et al., 2016). São
estudos que abordam desde a composição centesimal, vitaminas, minerais, à
atividade antioxidante, conteúdo de compostos fenólicos, antocianinas,
flavonoides, com foco no apelo de alimento funcional, que tenha efeitos
positivos à saúde dos consumidores (Di Cagno et al., 2011; Dionísio et al.,
2016)
Além dos compostos antioxidantes, os prebióticos, notadamente os
fruto-oligossacarídeos (FOS) têm sido foco de estudos abordando sua
importância como composto bioativo com benefícios à saúde, como prevenção
e redução do risco de algumas doenças crônicas (Roberfroid, 1999).
Os FOS podem ser produzidos por micro-organismos, mas também são
encontrados naturalmente em alguns vegetais, frutas e hortaliças, raízes e
tubérculos. A raiz yacon (Smallanthus sonchifolius) é uma importante fonte
natural de FOS e que apresenta pouca alteração sensorial quando adicionada
aos alimentos processados (Kuntz et al., 2013).
17
Uma bebida à base de vegetais que apresente atividade antioxidante e
capacidade probiótica pode ser uma alternativa inovadora ao mercado de
bebidas prontas para o consumo. A interação entre estes dois grupos de
compostos bioativos pode oferecer aumento dos efeitos benéficos à saúde,
com provável sinergismo entre eles.
REFERÊNCIAS
Andrés, V., Villanueva, M. J., Tenorio, M. D. (2016). The effect of high-pressure
processing on colour, bioactive compounds, and antioxidant activity in
smoothies during refrigerated storage. Food chemistry, 192, 328-335.
Balaswamy, K., Rao, P. P., Nagender, A., Rao, G. N., Mala, K. S., Jyothirmayi,
T.,Satyanarayana, A. (2013). Development of smoothies from selected
fruit pulps/juices. International Food Research Journal, 20(3), 1181-1185.
Barrett, D. M., Lloyd, B. (2012). Advanced preservation methods and nutrient
retention in fruits and vegetables. Journal of the Science of Food and
Agriculture, 92(1), 7-22.
Di Cagno, R., Minervini, G., Rizzello, C. G., De Angelis, M., Gobbetti, M. (2011).
Effect of lactic acid fermentation on antioxidant, texture, color and sensory
properties of red and green smoothies. Food Microbiology, 28(5), 1062-
1071.
Dionisio, A. P., Wurlitzer, N. J., Goes, T. D. S., Borges, M. D. F., Garruti, D.,
Araújo, I. M. D. S. (2016). Estabilidade de uma bebida funcional de frutas
tropicais e yacon (Smallanthus sonchifolius) durante o armazenamento
sob refrigeração. Archivos Latinoamericanos de Nutrición, 66(2), 148-155.
Kuntz, M. G., Fiates, G. M., Teixeira, E. (2013). Characteristics of prebiotic food
products containing inulin. British Food Journal, 115(2), 235-251.
Roberfroid, M. B. (1999). Concepts in functional foods: the case of inulin and
oligofructose. The Journal of nutrition, 129(7), 1398s-1401s.
18
OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
O objetivo geral da tese foi elaborar uma bebida a base de vegetais, com
alto teor de FOS e avaliar a capacidade antioxidante e conteúdo de
oligossacarídeos da bebida antes e após a digestão gastrointestinal simulada.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Validar métodos de análise de carboidratos por cromatografia de íons
acoplada ao detector amperométrico pulsado (HPAEC-PAD): i) Glicose,
Frutose, Sacarose, Rafinose e Estaquiose); ii) Kestose (GF2), Nistose
(GF3), Frutofuranosil – nistose (GF4); Maltotriose (G3); Maltotetrose
(G4); Maltopentose (G5), Maltohexose (G6), Heptahexose (G7);
Realizar análises preliminares destes carboidratos em diferentes frutas
e hortaliças;
Realizar estudos de digestão in vitro em amostras de couve e yacon,
bem como de padrões de compostos fenólicos e FOS. Analisar
compostos fenólicos, capacidade antioxidante pelos métodos TEAC (
Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) e ORAC (Oxygen Radical
Absorbance Capacity), FOS e glicose, frutose e sacarose, nas amostras
antes da digestão e após as fases gástrica e intestinal da digestão in
vitro.
Elaborar uma formulação de bebida a base de vegetais e caracterizar a
bebida quanto aos parâmetros físico-químicos (acidez total titulável,
sólidos solúveis, pH), à composição centesimal (umidade, cinzas,
proteínas, lipídeos e carboidratos) e composição de minerais;
Avaliar o efeito da digestão in vitro nos FOS e atividade antioxidante da
bebida, através dos métodos TEAC e ORAC;
Avaliar a aceitação sensorial da bebida formulada, utilizando um teste de
sensorial com 120 provadores não treinados.
19
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 FIBRAS, OLIGOSSACARÍDEOS E PREBIÓTICOS
O termo fibra alimentar inclui polissacarídeos, lignina, oligossacarídeos e
substâncias associadas de plantas promovendo benefícios fisiológicos (Mira et
al. 2009). Entre estes benefícios estão a prevenção e redução do risco de
acidente vascular cerebral, hipertensão arterial, diabetes mellitus, algumas
desordens gastrointestinais e obesidade ( Jovanovic-Malinovska et al., 2014;
Macagnan, et al., 2016).
As fibras alimentares podem ser classificadas em fibras solúveis:
pectinas, gomas, algumas hemiceluloses e mucilagens, encontradas nos
legumes, aveia, leguminosas e frutas; e fibras insolúveis: celulose, algumas
pectinas, a maioria das hemiceluloses e lignina, presentes nos derivados de
grãos inteiros, como os farelos e também nos vegetais folhosos) (Mira et al.
2009). As fibras solúveis são responsáveis pelo aumento da viscosidade do
conteúdo do cólon, com efeitos sobre a absorção de glicose e lipídios no
intestino delgado, que são fermentados por bactérias no cólon e tornam a
eliminação fecal mais fácil e rápida. Já as fibras insolúveis são fermentadas de
forma lenta e incompleta, sua ação é retenção de água, aumentando seu
volume, distendendo a parede do cólon e facilitando a eliminação do bolo fecal
(Macagnan, et al 2016).
Segundo Padovani et al (2006) a recomendação de consumo diário de
fibras é de 21 a 38g para um adulto saudável. Uma outra definição de fibra
inclui alguns oligossacarídeos, como a inulina, os fruto-oligossacarídeos (FOS)
e galacto-oligossacarídeos (GOS), Xilo-oligossacarídeos (XOS) e manano-
oligossacarídeos (MOS) que são fibras solúveis e fermentáveis. (Carabin e
Flamm, 1999).
Os prebióticos, por sua vez, são definidos como ―ingredientes
seletivamente fermentáveis que permitem mudanças específicas na
composição e ou atividade da microbiota gastrintestinal que conferem
benefícios ao hospedeiro‖ (Roberfroid, 2007). Alguns requisitos são
imprescindíveis para que um determinado composto seja considerado
20
prebiótico: i) chegar intacto ao cólon; ii) ser utilizado por probióticos da
microbiota intestinal para melhorar o seu crescimento e atividade metabólica;
iii) melhorar a composição da microbiota intestinal para favorecer a saúde do
hospedeiro e iv) induzir imunidade sistêmica do hospedeiro (Saad, Cruz e
Faria, 2011).
Há alguns anos tem aumentado o interesse nas propriedades de saúde
de oligossacarídeos não digeríveis devido às suas atividades prebióticas.
Destacam-se a melhora de algumas funções fisiológicas nos seres humanos
tais como o alívio da constipação, a redução do risco de osteoporose através
do aumento da absorção de minerais e da aterosclerose pela diminuição da
síntese de triglicérides, a redução do nível de colesterol do plasma e do ganho
de peso; a redução da incidência de câncer de cólon, diarreia e inflamações; e
finalmente efeito benéfico sobre diabetes tipo 2, pela diminuição dos níveis de
glicose no sangue (Jovanovic-Malinovska et al., 2014).
Os compostos prebióticos (FOS, GOS, inulina, etc.) têm a capacidade de
modificar a composição da microbiota intestinal após ingestão de doses
razoavelmente baixas em um curto período de tempo. Por não serem
hidrolisados pelas enzimas digestivas humanas, estes compostos chegam
intactos ao cólon, onde são metabolizados pelas bactérias probióticas (Sheid et
al, 2014). Como produtos da fermentação tem-se os ácidos graxos de cadeia
curta, lactato e gases (H2, CO2, CH4) (Alles et al., 1999; Mussatto e Mancilha,
2007; Delgado et al, 2010). Ácidos graxos de cadeia curta, butirato, acetato e
propionato entram no sangue e podem influenciar os níveis sistêmicos de
carboidratos e o metabolismo lipídico (Cummings et al, 1987).
A recomendação da Organização Mundial da Saúde (OMS) para
ingestão de FOS é de 3 g por dia para adultos e 0,4 g por dia para crianças
(Rouzaud, 2004). No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA) alerta que um produto com alegações funcionais atribuídas aos FOS
deve ter no mínimo 3 g deste carboidrato, se o alimento for sólido e 1,5 g se o
alimento for líquido, na porção do produto pronto para consumo. A agência
recomenda ainda que o consumo não seja superior a 30 g diários (BRASIL,
2016; Causey et al, 2000). De acordo com a ADA (1999), a recomendação de
FOS é em média de 3 a 10g/dia, com o objetivo de melhorar a saúde
21
gastrointestinal, reduzir a pressão arterial, apresentar efeitos benéficos no
metabolismo lipídico e na redução colesterol sérico (Causey et al, 2000).
No entanto, um consumo exagerado de oligossacarídeos não digeríveis
pode causar desconforto intestinal, flatulência, em consequência de sua alta
taxa de fermentação e diarreia, devido ao seu efeito osmótico responsável por
transferência de água para o cólon (Mussatto e Mancilha, 2007).
Os FOS estão naturalmente presentes em alguns vegetais, frutas,
hortaliças e em raízes e tubérculos (Jovanovic-Malinovska et al., 2014; Sancho
et al. 2016). Além disso, podem ser sintetizados por diversos de micro-
organismos, pela ação da enzima frutosiltrasnferase, sendo esta a principal
alternativa utilizada industrialmente para produção de FOS (Wang et al, 2016;
Jiang et al, 2016; Guo et al, 2015). Pesquisas recentes reportam ainda a
extração e concentração por membranas de FOS a partir de fontes vegetais
(alcachofra) como alternativa para aplicação em alimentos (Machado et al,
2016).
Os FOS correspondem a frutanos com um grau de polimerização menor
que 10, e podem apresentar uma ou quatro moléculas de frutose. Os frutanos,
por sua vez, são carboidratos de reserva que contêm 01 a 70 unidades de
frutose, ligados ou não a uma molécula de sacarose terminal. Os principais
tipos de FOS são: kestose (GF2), nystose (GF3) e 1-fructofuranosil nystose
(GF4) (Delgado et al, 2010).
Considerando o recente interesse pelos efeitos positivos à saúde deste
grupo de compostos funcionais houve grande desenvolvimento nas técnicas de
sua utilização em alimentos. A inulina, por exemplo, tem sido explorada como
substituto de gordura em sorvetes, oferecendo os benefícios intestinais e na
saúde, além de retirar o alto teor de gordura dos alimentos (Ismail et al, 2013).
Os FOS, por sua vez, podem ser empregados em vários tipos de alimentos e
são uma alternativa vantajosa por agregarem as fibras e influenciarem pouco
no sabor, auxiliando na flora intestinal sem comprometer a aceitação dos
produtos (Kuntz et al, 2013).
22
1.2 YACON
O yacon (Smallanthus sonchifolius) é um tubérculo nativo dos Andes,
que apresenta um sabor adocicado e textura crocante quando consumido cru.
Pode ainda ser ingerido cozido, assado, desidratado ou como refresco
(Fernández et al., 1997). É uma espécie vegetal que apresenta grande
quantidade frutanos como carboidratos de reserva, cerca de 6,5 – 65% de
FOS, 2 - 17% de sacarose, 20 – 76% de açúcares redutores, expressos em
base seca (Campos et al.,2012).
Por ser uma fonte abundante de FOS há um crescente interesse
científico no yacon, pois seu consumo está relacionado à promoção de
benefícios à saúde humana, tais como: efeito anti-diabético e redução do LDL –
colesterol, atividade antioxidante, prevenção contra câncer de cólon e melhora
da função gastrointestinal (Sheid et al, 2014; De Moura et al., 2012; Sousa et
al, 2015; Genta et al., 2009). Também foram relatados efeitos estimulantes na
absorção intestinal de Ca e na retenção mineral óssea em ratos alimentados
com farinha de yacon (Lobo et al, 2007) e melhora do sistema imunológico
periférico (Delgado et al, 2012).
Diferentes sugestões de consumo do yacon são relatados na literatura,
em pó como sugerido por Sheid et al (2014) e Franco et al (2015), desidratado
(De Oliveira et al, 2016) e adicionado a suco de frutas com apelo de bebida
funcional, tendo boa aceitação sensorial (Dionísio et al., 2016).
1.3 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
A obtenção de energia para o desenvolvimento dos processos biológicos
em seres vivos depende diretamente do processo oxidativo, porém, durante o
metabolismo são produzidos radicais livres e espécies reativas de oxigênio
(ROS) (Traber, 2006).
Os radicais livres são átomos quimicamente ativos ou moléculas que
apresentam um número ímpar de elétrons na sua órbita externa e por isso são
instáveis e altamente reativos. Assim buscam se apropriar ou doar elétrons
para sua estabilização e, por esta razão, causam danos às células, proteínas e
23
DNA, favorecendo o desenvolvimento de doenças degenerativas como artrite,
aterosclerose, diabetes, além de contribuir para o envelhecimento humano e
risco de câncer (Sun et al 2002).
Quando a produção de radicais livres está além da capacidade protetora
das defesas antioxidantes do organismo ocorre o estresse oxidativo.
Esta condição é o resultado do desequilíbrio entre os fatores pró-
oxidantes (como inflamação, exposição a certos agentes químicos, radiação,
luz ultravioleta, álcool, cigarro, ar poluído, dieta rica em gordura, entre outros) e
antioxidantes: enzimas pertencentes ao sistema antioxidante endógeno como a
superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase e nutrientes (vitaminas
e minerais) que compõem o sistema antioxidante exógeno (Chu et al, 2002).
Os compostos antioxidantes são, portanto, necessários para prevenir ou
reduzir o risco dessas doenças e precisam fazer parte de uma dieta
equilibrada. Os vegetais são fontes naturais destes compostos (vitaminas C e
E, carotenoides e compostos fenólicos), o que explica parte das ações
benéficas que as frutas, legumes, hortaliças e cereais integrais exercem sobre
o organismo (Moure et al., 2001; Sun et al., 2002; Chu et al., 2002).
Desta maneira, muitas pesquisas reportam a presença de compostos
antioxidantes nos vegetais, seja na forma in natura ou processados,
ressaltando os benefícios à saúde associados ao seu consumo (Kamiloglu et
al, 2016; Sicari et al 2016; Singh et al, 2016).
1.4 BEBIDAS À BASE DE VEGETAIS
Atendendo às necessidades contemporâneas dos consumidores que
buscam produtos que ofereçam praticidade, bons atributos nutricionais e
sensoriais, a indústria alimentícia tem investido em alimentos que apresentem
estas características (Barrett e Lloyd, 2012; Andres, Villanueva, Tenorio, 2016).
As pesquisas também avançam nessa área, na tentativa de satisfazer a
demanda por produtos inovadores e com apelo funcional - atividade
antioxidante e prebióticos – por exemplo. Estes alimentos, além de possuirem
este diferencial, precisam apresentar propriedades sensoriais agradáveis e, de
24
preferência, ser de fácil preparo ou prontos para o consumo (Falguera, Aliguer,
e Falguera, 2012; Pimentel et al, 2015; Dionisio et al, 2016).
Refletindo esta tendência, recentemente, houve um aumento no
interesse em bebidas mistas de vegetais, que são comumente chamadas de
smoothies, preparadas por mistura, em proporções adequadas, de diferentes
ingredientes naturais (Dionisio et al., 2016). O consumo de bebidas mistas de
vegetais pode atender ainda ao mercado de consumidores que rejeitam ou não
tem o hábito de ingerir frutas, e hortaliças, mas adotam o consumo de sucos.
Essa prática torna-se, portanto, uma alternativa à ingestão de vitaminas,
minerais e compostos bioativos.
Em estudos recentes foram investigados desde atividade antioxidante e
conteúdo de fenóis à composição físico-química e análise sensorial de
diferentes tipos de smoothies, com composições bem variadas de frutas e
hortaliças (Nowicka et al 2016; Park et al, 2016). Nota-se grande diversidade
na composição destas bebidas, muitas vezes valorizando os vegetais de
produção regional e/ou nacional.
25
REFERÊNCIAS
Andrés, V., Villanueva, M. J., Tenorio, M. D. (2016). The effect of high-
pressure processing on colour, bioactive compounds, and antioxidant activity in
smoothies during refrigerated storage. Food chemistry, 192, 328-335.
Alles, M. S., de Roos, N. M., Bakx, J. C., van de Lisdonk, E., Zock, P. L.,
Hautvast, J. G. (1999). Consumption of fructooligosaccharides does not
favorably affect blood glucose and serum lipid concentrations in patients with
type 2 diabetes. The American journal of clinical nutrition, 69(1), 64-69.
Barrett, D. M., Lloyd, B. (2012). Advanced preservation methods and
nutrient retention in fruits and vegetables. Journal of the Science of Food and
Agriculture, 92(1), 7-22.
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA). Alimentos. Comissões e Grupos de Trabalho. Comissão
Tecnocientífica de Assessoramento em Alimentos Funcionais e Novos
Alimentos. Alimentos com Alegações de Propriedades Funcionais e ou de
Saúde, Novos Alimentos/ Ingredientes, Substâncias Bioativas e Probióticos.
Disponível em:
http://www.anvisa.gov.br/alimentos/comissoes/tecno_lista_alega.htm>. <
Acesso em: 18 fevereiro de 2016. (Atualizado em julho/2008. Lista de
alegações de propriedade funcional aprovadas).
Campos, D., Betalleluz-Pallardel, I., Chirinos, R., Aguilar-Galvez, A.,
Noratto, G., Pedreschi, R. (2012). Prebiotic effects of yacon (Smallanthus
sonchifolius Poepp. & Endl), a source of fructooligosaccharides and phenolic
compounds with antioxidant activity. Food Chemistry, 135(3), 1592-1599.
Causey, J. L., Feirtag, J. M., Gallaher, D. D., Tungland, B. C., Slavin, J. L.
(2000). Effects of dietary inulin on serum lipids, blood glucose and the
gastrointestinal environment in hypercholesterolemic men. Nutrition
Research, 20(2), 191-201.
26
Carabin, I. G., Flamm, W. G. (1999). Evaluation of safety of inulin and
oligofructose as dietary fiber. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 30(3),
268-282.
Chu, Y. F., Sun, J. I. E., Wu, X., Liu, R. H. (2002). Antioxidant and
antiproliferative activities of common vegetables. Journal of agricultural and
food chemistry, 50(23), 6910-6916.
Cummings, J., Pomare, E. W., Branch, W. J., Naylor, C. P., Macfarlane, G.
T. (1987). Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and
venous blood. Gut, 28(10), 1221-1227.
Delgado, G. T. C., Tamashiro, W. M., Pastore, G. M. (2010).
Immunomodulatory effects of fructans. Food Research International, 43(5),
1231-1236.
Delgado, G. T. C.; Thome, R. G. D. L.; Tamashiro, W. M.; Pastore, G. M.
Yacon (Smallanthus sonchifolius)-derived fructooligosaccharides improves the
immune parameters in the mouse. Nutrition Research, 32 (11), p. 884-892,
2012.
De Moura, N. A., Caetano, B. F., Sivieri, K., Urbano, L. H., Cabello, C.,
Rodrigues, M. A., Barbisan, L. F. (2012). Protective effects of yacon
(Smallanthus sonchifolius) intake on experimental colon carcinogenesis. Food
and Chemical Toxicology, 50(8), 2902-2910.
De Oliveira, L. F., Corrêa, J. L. G., de Angelis Pereira, M. C., Ramos, A. D.
L. S., Vilela, M. B. (2016). Osmotic dehydration of yacon (Smallanthus
sonchifolius): Optimization for fructan retention. LWT-Food Science and
Technology, 71, 77-87.
Dionisio, A. P., Wurlitzer, N. J., Goes, T. D. S., Borges, M. D. F., Garruti, D.,
Araújo, I. M. D. S. (2016). Estabilidade de uma bebida funcional de frutas
tropicais e yacon (Smallanthus sonchifolius) durante o armazenamento sob
refrigeração. Archivos Latinoamericanos de Nutrición, 66(2), 148-155.
Falguera, V., Aliguer, N., Falguera, M. (2012). An integrated approach to
current trends in food consumption: Moving toward functional and organic
products?. Food Control, 26(2), 274-281.
27
Fernández, C. E., Lipavska, H., Milchl, J. (1997). Determination of
saccharides content in different ecotypes of yacon (Polymixia sonchifolia poepp.
and endlicher) cultivated under conditions of Czech Republic. Agricultura
Tropica et Subtropica. UniVersitas Agriculturae Praga, 30, 79-89.
Franco, T. S., Perussello, C. A., Ellendersen, L. D. S. N., Masson, M. L.
(2015). Foam mat drying of yacon juice: Experimental analysis and computer
simulation. Journal of Food Engineering, 158, 48-57.
Genta, S., Cabrera, W., Habib, N., Pons, J., Carillo, I. M., Grau, A.,
Sánchez, S. (2009). Yacon syrup: beneficial effects on obesity and insulin
resistance in humans. Clinical Nutrition, 28(2), 182-187.
Guo, W., Yang, H., Qiang, S., Fan, Y., Shen, W., Chen, X. Overproduction,
purification, and property analysis of an extracellular recombinant
fructosyltransferase. European Food Research and Technology, v. 242, p 1-10,
2015.
Ismail, E. A.; Al-Saleh, A. A.; Metwalli, A. A. M. (2013). Effect of inulin
supplementation on rheological properties of low-fat ice cream. Life Science
Journal, 10(3), 1742-1746.
Jiang, H., Ma, Y., Chi, Z., Liu, G. L., Chi, Z. M. (2016). Production,
Purification, and Gene Cloning of a β-Fructofuranosidase with a High Inulin-
hydrolyzing Activity Produced by a Novel Yeast Aureobasidium. Marine
Biotechnology, 1-11.
Jovanovic-Malinovska, R., Kuzmanova, S., Winkelhausen, E. (2014).
Oligosaccharide profile in fruits and vegetables as sources of prebiotics and
functional foods. International Journal of Food Properties, 17(5), 949-965.
Kamiloglu, S., Toydemir, G., Boyacioglu, D., Beekwilder, J., Hall, R. D.,
Capanoglu, E. (2016). A review on the effect of drying on antioxidant potential
of fruits and vegetables. Critical reviews in food science and nutrition, 56, S110-
S129.
Kuntz, M. G., Fiates, G. M., Teixeira, E. (2013). Characteristics of prebiotic
food products containing inulin. British Food Journal, 115(2), 235-251.
28
Lobo, A. R., Colli, C., Alvares, E. P., Filisetti, T. M. (2007). Effects of
fructans-containing yacon (Smallanthus sonchifolius Poepp & Endl.) flour on
caecum mucosal morphometry, calcium and magnesium balance, and bone
calcium retention in growing rats. British Journal of Nutrition, 97(04), 776-785.
Macagnan, F. T., da Silva, L. P., Hecktheuer, L. H. (2016). Dietary fibre:
The scientific search for an ideal definition and methodology of analysis, and its
physiological importance as a carrier of bioactive compounds. Food Research
International, 85, 144-154.
Machado, M. T., Trevisan, S., Pimentel-Souza, J. D., Pastore, G. M.,
Hubinger, M. D. (2016).Clarification and concentration of oligosaccharides from
artichoke extract by a sequential process with microfiltration and nanofiltration
membranes. Journal of Food Engineering, 180, 120-128.
Mira, G. S., Graf, H., Cândido, L. M. B. (2009). Visão retrospectiva em
fibras alimentares com ênfase em beta-glucanas no tratamento do
diabetes. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 45(1), 11-20.
Moure, A., Cruz, . M., ranco, D., Dom nguez, . M., ineiro, .,
Dom nguez, ., Paraj , . C. (2001). Natural antioxidants from residual
sources. Food chemistry, 72(2), 145-171.
Mussatto, S. I.; Mancilha, I. M. (2007) Non-digestible oligosaccharides: a
Review. Carbohydrate polymers, 68 (3), 587-597.
Nowicka, P., Wojdyło, A., Teleszko, M., amoticha, . (2016). ensory
attributes and changes of physicochemical properties during storage of
smoothies prepared from selected fruit. LWT-Food Science and
Technology, 71, 102-109.
Padovani, R. M., Amaya-Farfán, J., Colugnati, F. A. B., Domene, S. M. Á.
(2006). Dietary reference intakes: aplicabilidade das tabelas em estudos
nutricionais. Revista de Nutrição, 19(6), 741-760.
Park, Y. S., Ham, K. S., Park, Y. K., Leontowicz, H., Leontowicz, M.,
Namieśnik, ., Gorinstein, . (2016). The effects of treatment on quality
parameters of smoothie-type'Hayward'kiwi fruit beverages. Food Control.
29
Pimentel, T. C., Madrona, G. S., Garcia, S., Prudencio, S. H. (2015).
Probiotic viability, physicochemical characteristics and acceptability during
refrigerated storage of clarified apple juice supplemented with Lactobacillus
paracasei ssp. paracasei and oligofructose in different package type. LWT-Food
Science and Technology, 63(1), 415-422.
Roberfroid, M. (2007). Prebiotics: the concept revisited. The Journal of
nutrition, 137(3), 830S-837S
Rouzaud, G. C. M. (2004). Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics: Functional
Ingredients for Microbial Management Strategies. In: BILIADERIS, C. G.;
IZYDORCZYK, M. S. (Eds.). Functional Food Carbohydrates. New York: CRC
Press, 479–509.
Saad, S. M. I., Cruz, A. G. D., Faria, J. D. A. F. (2011). Probióticos e
prebióticos em alimentos: fundamentos e aplicações tecnológicas.
In Probióticos e prebióticos em alimentos: fundamentos e aplicações
tecnológicas. Varela.
Sancho, R. A. S., Souza, J. D. R., de Lima, F. A., Pastore, G. M. (2017).
Evaluation of oligosaccharide profiles in selected cooked tubers and roots
subjected to in vitro digestion. LWT-Food Science and Technology. 76,
270-277.
Scheid, M. M. A., Genaro, P. S., Moreno, Y. M. F., Pastore, G. M. (2014).
Freeze-dried powdered yacon: effects of FOS on serum glucose, lipids and
intestinal transit in the elderly. European journal of nutrition, 53(7), 1457-1464.
Sicari, V., Pellicanò, T. M., Giuffrè, A. M., Zappia, C., Capocasale, M.
(2016). Bioactive compounds and antioxidant activity of citrus juices produced
from varieties cultivated in Calabria. Journal of Food Measurement and
Characterization, 10(4), 773-780.
Singh, B., Singh, J. P., Kaur, A., Singh, N. (2016). Bioactive compounds in
banana and their associated health benefits–A review. Food chemistry, 206, 1-
11.
30
Sousa, S., Pinto, J., Rodrigues, C., Gião, M., Pereira, C., Tavaria, F.,
Pintado, M. (2015). Antioxidant properties of sterilized yacon (Smallanthus
sonchifolius) tuber flour. Food chemistry, 188, 504-509.
Sun, J., Chu, Y. F., Wu, X., Liu, R. H. (2002). Antioxidant and
antiproliferative activities of common fruits. Journal of agricultural and food
chemistry, 50(25), 7449-7454.
Traber, M. G. (2006) Relationship of vitamin E metabolism and oxidation in
exercising human subjects. British Journal of Nutrition, 96, 34-37.
Wang, Da; Li, Fu-Li; Wang, Shi-An. (2016) A one-step bioprocess for
production of high-content fructo-oligosaccharides from inulin by yeast.
Carbohydrate Polymers, v. 151, p. 1220-1226.
31
CAPÍTULO I
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS PARA ANÁLISE DE CARBOIDRATOS POR
CROMATOGRAFIA DE TROCA ANIÔNICA DE ALTA EFICIÊNCIA EM
VEGETAIS
Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de
Alimentos, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Rua Monteiro
Lobato, 80, Cidade Universitária Zeferino Vaz, 13083-862, Campinas, SP,
Brasil
Jane Delane Reis Pimentel Souza, Renata Aparecida Soriano Sancho, Glaucia
Maria Pastore
Manuscrito em preparação para ser submetido à revista Carbohydrate
Research.
32
RESUMO
Os carboidratos estão entre os principais componentes vegetais, desde
açúcares simples a oligossacarídeos, com funcionalidades diferentes no
organismo. Os açúcares simples são indesejáveis para pessoas com diabetes,
os oligossacarídeos da família da rafinose (RFO) podem causar desconforto
intestinal e os fruto-oligossacarídeos (FOS) apresentam efeitos positivos ao
organismo. Elucidar o tipo de carboidrato presente nos diferentes alimentos de
origem vegetal torna-se relevante para que sejam utilizados em quantidades
adequadas às necessidades individuais. Embora a cromatografia de íons
acoplada ao detector amperométrico pulsado (HPAEC-PAD) seja um método
muito utilizado para análise de carboidratos, poucos estudos detalham as
etapas analíticas e a validação do método, bem como o uso de colunas mais
adequadas aos analitos de interesse. Com este estudo objetivou-se validar
duas metodologias de análises de carboidratos, uma para glicose, frutose,
sacarose, rafinose e estaquiose, utilizando a coluna carbopac PA1 e eluição
com NaOH e outra para análise de FOS e malto-oligossacarídeos, utilizando a
coluna carbopac PA100. Além de determinar o conteúdo destes carboidratos
em 24 diferentes espécies vegetais usualmente presente na mesa dos
brasileiros, consumidos in natura ou processados, como por exemplo, na forma
sucos mistos de vegetais. Os métodos apresentaram boa seletividade e
resolução e foram validados quanto a linearidade, precisão e acurácia. As
frutas tiveram de uma forma geral, maior teor de açúcares simples, com
destaque para o mamão com 67,82 g/ 100g de glicose e frutose 63,82 g/100 g.
A cenoura e a beterraba foram os legumes com maior destes açúcares
simples. Além do yacon, a cenoura e a banana relevante conteúdo de total de
FOS, 17185 mg/ 100 g, 817,7 mg/ 100 g e 437,93 mg/ 100 g, respectivamente.
Os métodos validados podem ser utilizados com confiança para separar e
quantificar os caboidratos. A quantificação dos açúcares nos vegetais ampliou
as informações acerca da composição das frutas, legumes e hortaliças
estudadas.
Palavras-chave: Oligossacarídeos, açúcares, metodologia, vegetais
33
ABSTRACT
Carbohydrates are among the major vegetables compunds, as from simple
sugars to oligosaccharides, with different functionalities in the body. Simple
sugars are undesirable for people with diabetes, oligosaccharides from the
raffinose family (RFO) can cause intestinal discomfort and
fructooligosaccharides (FOS) have positive effects on the body. Elucidating the
type of carbohydrate present in the different foods of vegetable origin becomes
relevant so that they are used in quantities adequate to the individual needs.
Although ion chromatography coupled to the pulsed amperometric detector
(HPAEC-PAD) is a widely used method for carbohydrate analysis, few studies
detail the analytical steps and the validation of this method, as well as the use
of columns more proper to the analytes of interest. The objective of this study
was to validate two carbohydrate analysis methodologies, one for glucose,
fructose, sucrose, raffinose and stachyose, using the carbopac PA1 column and
NaOH elution, and another for analysis of FOS and maltooligosaccharides
using the carbopac column PA100. In addition to determining the content of
these carbohydrates in 24 different vegetable species usually present in the
table of Brazilians, consumed in natura or processed, for example, in the form
of a beverage of blend vegetables. The methods presented good selectivity and
resolution and were validated for linearity, precision and accuracy. The fruits
had, in general, a higher content of simple sugars, especially papaya with 67.82
g/100 g of glucose and 63.82 g/100 g of fructose. Carrots and sugar beets were
the vegetables with high levels of these simple sugars. In addition to yacon,
carrot and banana revealed a significant content of total FOS, 17185 mg / 100
g, 817.7 mg / 100 g and 437.93 mg / 100 g, respectively. In addition to yacon,
carrot and banana showed a significant content of total FOS, 17185 mg / 100 g,
817.7 mg / 100 g and 437.93 mg / 100 g, respectively. Validated methods can
be used with confidence to separate and quantify the capohydrates. The
quantification of sugars in the vegetables increased the information about the
composition of the fruits, vegetables and vegetables studied.
Key-words: oligosaccharides, sugars, methodology, vegetables
34
1.0 - INTRODUÇÃO
Os carboidratos são componentes importantes na dieta humana,
pois representam excelentes fontes de energia e fibras. Exemplos de
carboidratos são: mono- (glicose, frutose), di- (sacarose) e oligossacarídeos,
especialmente fruto-oligossacarideos (FOS), malto-oligossacarídeos (MALTOS)
bem como oligossacarídeos da família da rafinose (RFO), rafinose e estaquiose
(Jovanovic-Malinovska et al., 2014).
Os principais tipos de FOS são: kestose (GF2), nistose (GF3) e 1-
fructofuranosil nistose (GF4) (Delgado et al., 2010). Eles estão naturalmente
presentes em alguns vegetais, frutas, hortaliças e em raízes e tubérculos
(Jovanovic-Malinovska et al., 2014; Sancho et al., 2016).
Os MALTOS, por exemplo: maltotriose (G3), maltotetraose (G4),
maltopentaose (G5), maltohexaose (G6) e maltoheptaose (G7) são formados
por resíduos de glicose unidos por ligações do tipo α (1,4) e podem ser
encontrados em tubérculos e raízes, bem como de produtos resultantes da
hidrólise do amido (Moongngarm et al., 2011; Sancho et al., 2016). Em frutas e
legumes ainda são pouco estudados.
MALTOS são carboidratos digeríveis (Sancho et al., 2016), assim
como sacarose, entre outros. Por outro lado, FOS e RFO não são hidrolisados
durante o processo digestivo, chegam intactos ao cólon e podem ser
fermentados pelas bactérias colônicas.
Os FOS são prebióticos e destacam-se na melhora de algumas
funções fisiológicas nos seres humanos tais como o alívio da constipação, a
redução do risco de osteoporose e da aterosclerose, a redução do nível de
colesterol do plasma e do ganho de peso; a redução da incidência de câncer
de cólon, diarreia e inflamações; e, finalmente, podem apresentar efeito
benéfico sobre diabetes tipo 2, pela diminuição dos índices glicêmicos dos
alimentos (Roberfroid 2010; Jovanovic-Malinovska et al., 2014).
No entanto, um consumo elevado de FOS deve ser evitado, pois
pode causar desconforto intestinal (Mussatto & Mancilha, 2007). O ideal é que
a ingestão de FOS seja em torno de 3 g por dia para adultos e 0,4 g por dia
para crianças conforme recomenda a Organização Mundial da Saúde (OMS)
(Rouzaud, 2006). A rafinose e a estaquiose, por sua vez, são conhecidas há
35
muito tempo por causarem desconforto intestinal e flatulência (Tanaka et al..,
1975).
Enquanto altos teores de açúcares simples são indesejáveis para
pessoas com diabetes e RFO causam desconforto intestinal, os FOS
apresentam efeitos positivos ao organismo. Portanto, existe um grande
interesse na elucidação do tipo de carboidrato presente nos diferentes
alimentos de origem vegetal, visto que os mesmos devem fazer parte de uma
dieta equilibrada e serem oferecidos em quantidades adequadas às
necessidades individuais.
A cromatografia de íons acoplada ao detector amperométrico
pulsado (HPAEC-PAD) é um método muito utilizado para análise de
carboidratos (L’homme et al., 2001, Arruda et al., 2016, Sancho et al., 2016).
No entanto, poucos estudos detalham as etapas do método.
Ademais, não utilizam as colunas mais adequadas aos analitos avaliados, uma
vez que a coluna Carbopac PA-1 é indicada para a análise de mono e
dissacarídeos e a Carbopac PA-100 para os oligossacarídeos.
O objetivo deste estudo foi validar um método de análise
cromatográfica por HPAEC-PAD para glicose, frutose, sacarose, rafinose e
estaquiose e validar um método de análise para FOS e MALTOS para vegetais.
Com o método validado, estes açúcares foram identificados e quantificados em
24 diferentes vegetais.
2.0 - MATERIAL E METODOS
2.1 - Reagentes e padrões
Padrões de 1- kestose (GF2), nistose (GF3), e 1-
fructofuranosilnistose (GF4) foram obtidos da Wako (Osaka, Japão),
maltotriose (G3), maltotetraose (G4), maltopentaose (G5), maltohexaose (G6) e
maltoheptaose (G7), Rafinose, Estaquiose e Glicose da Supelco (Bellefont, PA,
EUA) e Sacarose e Frutose da Sigma-Aldrich (St. Louis, EUA). Os reagentes
hidróxido de sódio e acetato de sódio grau HPLC utilizados foram da Merck
(Darmstadt, Germany) e a água foi purificada pelo sistema Milli-Q (Millipore,
Bedford, EUA).
36
2.2 - Amostras
Foram utilizados 24 tipos de vegetais, entre frutas, legumes e
hortaliças: manga Tommy (Mangifera indica L.), pera (Pyrus communis L.),
banana nanica (Musa Cavendishii L.), abacaxi (Ananas comosus L.), laranja
pera (Citrus sinensis), maçã Fuji (Malus communis), acerola (Malpighia
emarginata), mamão formosa (Carica papaya L.), maracujá (Passiflora sp),
limão Taiti (Citrus Aurantifolia) e melão (Cucumis melo L.); repolho branco
(Brassica oleracea L. var. capitala L.), couve manteiga (Brassica oleracea var
acephala), hortelã (Mentha s.p.), espinafre (Spinacia oleracea), alho-poró
(Allium porrum), yacon (Smallanthus sonchifolius), alface crespa (Lactuca
sativa L.), inhame (Colocasia esculenta L.), rúcula (Eruca sativa), beterraba
(Beta vulgaris esculenta), cenoura (Daucus carota), abobrinha italiana
(Cucurbita pepo var. cylindrica) e pepino (Cucumis sativus). Os vegetais foram
adquiridos na Central de Abastecimento de Campinas (CEASA) – São Paulo
em fevereiro de 2015.
A amostragem utilizada foi de aproximadamente 1 kg de cada tipo
de hortaliça e 2 Kg de cada tipo de legume ou frutas, exceto para abacaxi,
mamão e melão, com 4 unidades para cada fruta.
2.3 - Determinação da umidade
Aproximadamente 3 a 5 g de cada vegetal fresco (apenas a parte
comestível) foi cortado em pedaços, homogeneizado e seco a 105°C até
massa constante. O teor de umidade foi calculado pela diferença entre massa
fresca e massa seca das amostras. A análise foi feita em triplicata (AOAC,
2006).
2.4 - Preparação das amostras
Inicialmente, as diferentes variedades de vegetais foram lavadas e
sanitizadas por imersão em solução de 200 ppm de cloro ativo por 10 minutos
e enxágue em solução de 3 ppm de cloro ativo. A preparação foi adequada à
cada tipo vegetal. Das frutas, utilizou-se somente a polpa, com exceção da
maçã, pera que foram processadas com casca e acerola, com casca e
37
semente. Os vegetais folhosos foram usados integralmente. O inhame, o yacon
e a beterraba foram descascados. Uma porção de 20 gramas de cada vegetal
foi misturada com 100 mL de água purificada e homogeneizado em Ultra
Turrax (Polytron, MR-2100) por 2 min. A mistura foi centrifugada (10 min,
10000 rpm, 5ºC) (Hettich Zentrifugen – Rotanta 460R). O sobrenadante foi
recolhido, alicotado e armazenado a -18ºC para análises subsequentes.
2.5 - Perfis de carboidratos por Cromatografia de Troca Aniônica de Alta
Eficiência acoplada ao Detector Amperométrico Pulsado (HPAEC-PAD)
A separação dos carboidratos foi realizada através do sistema de
cromatografia de íons acoplada ao detector amperométrico pulsado (HPAEC-
PAD), software de Automação Cromatográfica Chromeleon 7.0 CHM-1, da
Dionex (USA), utilizando a bomba Single Grad Degas.
2.5.1 - Oligossacarídeos
Para análise de FOS e MALTOS utilizou-se a coluna Carbopac PA-
100, com eluição: solução A (500 mM de acetato de sódio e 100 mM de
hidróxido de sódio) e solução B (100 mM de hidróxido de sódio). A corrida
iniciou com 97% (A) e 3% (B) por 2 min, seguida de um gradiente linear de 3 a
40% de B até 18 min, etapa de limpeza com 100% de A por 5 min e
estabilização por 5 min na condição inicial, totalizando 28 min a um fluxo de 1,0
mL/min e temperatura da coluna de 30ºC. A análise de FOS e MALTOS foram
executadas de acordo com Sancho et al.. (2016).
2.6.2 - Mono, dissacarídeos, rafinose e estaquiose
Para a análise de glicose, frutose, sacarose, rafinose e estaquiose
foi utilizada a coluna Carbopac PA-1 com eluição: A (hidróxido de sódio 200
mM) e B (Água deionizada). Foi utilizada uma eluição isocrática de 80% A e
20% B por 21 min, seguida da etapa de limpeza com 100% A por 7 min e
posterior estabilização na condição inicial por 4 min, totalizando 32 minutos de
corrida cromatográfica. Para os dois métodos utilizou-se um fluxo de 1,0
mL/min e temperatura da coluna de 30ºC. As amostras foram diluídas em água
38
deionizada e filtradas em filtros de membrana 0,22 μm de diâmetro. A
identificação dos carboidratos foi realizada por comparação entre os tempos de
retenção de cada composto e os padrões nas mesmas condições de análise.
2.7 - Validação dos métodos
Ambos os métodos foram validados de acordo as normas descritas
no Guia Harmonizado para análise e validação de métodos laboratoriais
(Thompson, Ellison & Wood, 2002). O limite de detecção (LD) foi determinado
através de diluições sucessivas da mistura padrão até que picos com uma
relação sinal/ruído próximo a três fossem atingidos. O limite de quantificação
(LQ) também foi determinado através de diluições sucessivas, sendo definida
como a concentração que resultou em picos com uma relação sinal / ruído
próximo a seis. A precisão instrumental intra-dia foi verificada no limite de
quantificação (N = 7). A linearidade foi estudada individualmente para cada
composto com curvas de calibração com sete pontos, preparados em triplicata
e injetados aleatoriamente. Para cada curva de calibração foi realizado o teste
de falta de ajuste. A precisão instrumental intra-dia foi determinada por injeção
de uma solução contendo o pool de padrões em três níveis de concentração
diferentes. Este procedimento foi realizado 7 vezes consecutivas em um dia
para cada nível de concentração. A precisão instrumental entre dias foi
determinada repetindo este procedimento em três dias consecutivos (Ballus et
al., 2014). A acurácia foi estimada pela relação entre o valor real medido e o
valor nominal injetado para cada composto e concentração (Liu e Rochfort,
2015). Para os carboidratos analisados na PA-1, glicose, frutose e sacarose,
foram utilizados os níveis de concentração de 4 mg L-1, 12 mg L-1 e 20 mg L-1; e
para rafinose e estaquiose foram 2 mg L-1, 6 mg L-1 e 10 mg L-1 , o primeiro,
segundo e terceiro nível, respectivamente. Para os oligossacarídeos analisados
na PA-100, os níveis de concentração utilizados foram 0,4 mg L-1, 6,1 mg L-1 e
12 mg L-1.
2.8 - Análises Estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software
STATISTICA, Versão 7.0. Os resultados foram submetidos a ANOVA e teste de
39
comparação de Tukey, a um nível de 5% de significância e foram apresentados
como médias ± desvio padrão para as triplicatas.
3.0 - RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Validação
A Figura 1 exibe os cromatogramas representativos dos perfis obtidos
para carboidratos em amostras vegetais. Na Figura 1A e 1B estão os
cromatogramas para FOS e MALTOS de um pool de padrões e yacon,
respectivamente. Pode ser observado que os cromatogramas apresentaram
boa resolução dos picos, sendo possível identifica-los de forma isolada e com
confiança. Em 1C e 1D podem-se observar os cromatogramas para glicose,
frutose, sacarose, rafinose e estaquiose, em padrão e amostra (yacon),
respectivamente. Nota-se que os métodos utilizados apresentaram boa
seletividade e resolução.
40
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0 5 10 15 20 25
Alt
ura
(N
c)
Tempo (min)
G
F
R
S
E
C
0
50
100
150
200
250
300
5 8 11 14 17 20
Alt
ura
(N
c)
Tempo (min)
GF2
GF3
G3
GF4
G4 G5
G6
G7
-5
45
95
145
195
245
5 10 15 20
Alt
ura
(N
c)
Tempo (min)
GF2
GF4
GF3
A B
-5
495
995
1495
1995
2495
0 5 10 15 20 25
Alt
ura
(N
c)
Tempo (min)
S -5
0
5
10
15
20
10 15 20 25
E
R
G
F
D
Figura 1. Cromatogramas representativos para análise de malto-oligossacarídeos (MALTOS) e fruto-oligossacarídeos (FOS) em padrões analíticos
(A) e em yacon (B). Cromatogramas representativos para Glicose – G; Frutose – F; Sacarose – S; Rafinose – R e Estaquiose – E em padrões
analíticos (C) e amostra de yacon (D).
41
Nas Tabelas 1 e 2 estão apresentados os resultados dos parâmetros
avaliados para a validação do método visando a melhor resolução para
quantificação dos níveis de carboidratos. Na validação dos métodos foram
definidos parâmetros como: limites de detecção, quantificação, linearidade,
repetibilidade (precisão intra-dia) e reprodutibilidade (precisão inter-dia). Para
verificação da região de linearidade, curvas analíticas foram construídas com
sete níveis e em triplicata de cada nível, para GF2, GF3, GF4, G3, G4, G5, G6
e G7, na coluna PA100 e glicose, frutose, sacarose, rafinose e estaquiose na
coluna PA1. As curvas obtidas foram submetidas à análise de variância para
verificar os valores de ―p‖ para a falta de ajuste das regressões de cada um dos
padrões analisados, não sendo encontrados valores significativos (p>0,05).
A análise da repetibilidade e precisão inter-dia mostraram que a
metodologia proposta apresenta boa repetibilidade, com um desvio padrão
relativo máximo de 3,07 e 5,18, para a repetibilidade e precisão inter-dia,
respectivamente. Os limites de detecção e quantificação foram baseados na
concentração do analito que resulta em um sinal analítico 3 e 6 vezes maior
que o ruído, respectivamente, e mostraram valores relativamente pequenos,
sugerindo uma boa sensibilidade para os compostos analisados. Todos os
resultados de precisão intra-dia realizados no limite de quantificação foram
abaixo de 10%, o que é aceitável para esta faixa de concentração (Ballus et al.,
2014).
A acurácia para os FOS ficaram entre 104 e 109%, semelhante à
Glicose, Frutose, Sacarose, Rafinose e Estaquiose que ficou entre 99 e 107%.
Em contrapartida, os MALTOS tiveram uma maior variação, entre 109 e 119 %.
Em resumo, os resultados de validação indicaram que os métodos
podem ser utilizados com confiança para separar e quantificar os compostos
analisados neste estudo.
42
Tabela 1. Valores numéricos para a validação dos métodos de separação de carboidratos.
Carboidratos LD
(mg L-1)a
LQ
(mg L-1)a
Precisão
intra-dia LQ
(n=7)a
Linearidade Equação r2 Teste falta de ajuste (p>0,05)
Glicose 0,001 0,005 5,50 0,04-20 y=4,329x + 0,09 0,9996 0,3971
Frutose 0,005 0,012 7,45 0,04-20 y= 2,193x + 0,51 0,9986 0,9877
Sacarose 0,005 0,04 9,63 0,04-20 y= 2,139x + 0,38 0,9997 0,3378
Rafinose 0,04 0,1 5,21 0,1-10 y= 1,909x - 0,01 0,9998 0,3853
Estaquiose 0,04 0,1 7,64 0,1-10 y= 2,279x – 0,05 0,9998 0,5954
Kestose (GF2) 0,025 0,016 6,05 0,4-12 y= 2,008x + 0,32 0,9991 0,0784
Nistose (GF3) 0,008 0,012 4,93 0,4-12 y= 2,088x + 0,55 0,9984 0,1849
Frutofuranosilnistose (GF4) 0,008 0,012 5,69 0,4-12 y= 2,055x + 0,49 0,9988 0,3448
Maltotriose (G3) 0,008 0,012 4,22 0,4-12 y=1,851x + 0,26 0,9992 0,4494
Maltotetrose (G4) 0,008 0,012 4,26 0,4-12 y=1,794x + 0,23 0,9981 0,4971
Maltopentose (G5) 0,008 0,012 4,79 0,4-12 y= 1,978x + 0,24 0,9990 0,2531
Maltohexose (G6) 0,008 0,016 3,96 0,4-12 y=1,798x + 0,18 0,9991 0,2814
Heptahexose (G7) 0,03 0,016 5,15 0,4-12 y= 1,504x + 0,18 0,9991 0,2713
a LD, limite de detecção; LQ, limite de quantificação.
43
Tabela 2. Resultados de precisão instrumental para a separação de carboidratos.
Carboidratos
Precisão intra-dia (% n=7) Precisão inter-dia (% n=3) Acurácia (média ± DP n=3)
Primeiro
nível
Segundo
nível
Terceiro
nível
Primeiro
nível
Segundo
nível
Terceiro
nível
Primeiro
nível
Segundo
nível
Terceiro
nível
Kestose (GF2) 2,16 2,14 2,17 1,74 0,59 1,63 104 ± 1,5 104 ± 0,5 107 ± 0,3
Nistose (GF3) 2,32 1,16 0,43 1,37 0,72 0,87 108 ± 1,1 108 ± 0,4 109 ± 0,3
Frutofuranosilnistose (GF4) 2,55 2,64 1,98 2,75 0,78 0,46 104 ± 1,3 105 ± 0,8 105 ± 0,7
Maltotriose (G3) 2,00 2,35 1,76 2,55 0,52 1,98 112 ± 1,2 110 ± 0,5 112 ± 0,4
Maltotetrose (G4) 1,25 1,10 1,71 2,83 1,08 2,66 111 ± 1,7 111 ± 0,8 109 ± 0,4
Maltopentose (G5) 1,97 0,78 1,79 4,73 1,30 2,34 114 ± 1,1 116 ± 0,7 115 ± 0,8
Maltohexose (G6) 2,29 0,86 1,47 3,92 1,20 2,42 117 ± 0,8 117 ± 0,7 115 ± 0,5
Heptahexose (G7) 3,07 0,82 1,32 2,27 1,16 2,84 119 ± 1,6 119 ± 0,1 116 ± 0,4
Glicose 0,48 0,76 0,37 3,87 3,93 0,77 107 ± 0,4 107 ± 0,7 100 ± 0,3
Frutose 0,50 0,41 0,33 5,18 3,5 2,19 106 ± 0,2 103 ± 0,4 103 ± 0,3
Sacarose 0,47 0,32 0,39 2,77 1,46 0,57 103 ± 0,2 101 ± 0,3 101 ± 0,4
Rafinose 1,05 0,33 0,39 1,20 1,10 0,72 101 ± 0,9 101 ± 0,3 100 ± 0,4
Estaquiose 0,86 0,47 0,31 1,03 0,71 0,35 101 ± 0,7 100 ± 0,4 99 ± 0,3
44
3.2 - Composição de carboidratos nos vegetais
O conteúdo de glicose, frutose, sacarose, rafinose e estaquiose
analisados em 24 diferentes vegetais são mostrados na Tabela 3. A maioria
dos vegetais analisados apresentou glicose, frutose e sacarose em sua
composição, com exceção da hortelã, espinafre e abobrinha. As frutas são
geralmente ricas nesses açúcares, principalmente sacarose. Dentre todos os
vegetais avaliados o mamão teve o maior conteúdo de glicose (67,82 g/ 100g)
e frutose (63,82 g/100 g), ademais possui baixo conteúdo de sacarose (1,49 g/
100 g). O abacaxi, por sua vez, é uma fruta que se destaca quanto ao conteúdo
de sacarose (45,85 g/100 g). Já a banana é uma fruta que possui menor
conteúdo destes açúcares simples e é relevante seu conteúdo de estaquiose
(699,73 mg/ 100 g) e GF2, este FOS pode ser inclusive um carboidrato
importante para a doçura desta fruta. A acerola e o limão foram as frutas com
menor quantidade de carboidratos.
Não foram identificados carboidratos simples e RFO na abobrinha, este
é, portanto, um legume que pode ser utilizado com maior segurança por
pessoas que desejam e/ou necessitam de uma dieta com baixo consumo de
açúcares. Apenas o GF4 e o G6 foram identificados e quantificados para essa
amostra (Tabela 4).
As verduras, de uma forma geral, tem baixo conteúdo de carboidratos,
sendo que para o espinafre não foram detectados glicose, frutose, sacarose e
RFO, apenas GF3 e os MALTOS G4, G6 e G7 em pequenas quantidades.
Enquanto que o repolho teve teor de glicose comparável ao de frutas como
pera, maçã e melão.
A rafinose foi encontrada em alguns vegetais, dentre os quais se
destacou a hortelã com 375,83 mg/ 100 g, seguida da beterraba (57,39 mg/
100 g ) e mamão (28,46 mg/ 100 g). A estaquiose, por sua vez esteve presente
em um maior número de vegetais analisados e também em maior quantidade,
como no yacon, a banana, laranja, entre outros. Jovanovic-Malinovska et al.,
(2014) analisaram estes RFO mas não observaram quantidades significativas
destes açúcares em algumas das matrizes vegetais avaliadas neste estudo.
Como era esperado, os FOS foram encontrados abundantemente no
yacon quando comparado aos demais vegetais avaliados. Foram 8507 mg/
45
100g de GF2, 5858 mg/ 100g de GF3 e 2820 mg/ 100g de GF4, totalizando em
torno de 17 g de FOS por 100 g da amostra seca, esses resultados corroboram
com Campos et al. (2012) que avaliaram diferentes variedades dessa raiz.
Depois do yacon, a cenoura foi o vegetal com maior teor de FOS, 716 mg/
100g de GF2 e 101,7 mg/ 100 g de GF3, superando inclusive a banana (437,9
mg/ 100 g de GF2), que já foi bastante documentada (L’homme et al., 2001,
Der Agopian et al., 2009; Cruz-Cárdenas et al., 2015). FOS não foram
encontrados em cenoura anteriormente (Jovanovic-Malinovska et al., 2014).
Muitos fatores podem afetar os níveis de oligossacarídeos em alimentos, entre
eles: variedade, maturidade, variação sazonal, clima, procedimento de extração
bem como o método para determinação de oligossacarídeos (Jovanovic-
Malinovska et al., 2014, Wilson et al., 2004, Johansen et al., 1996). Assim,
justifica-se a diferença entre os resultados para uma mesma matriz, nos
estudos existentes.
46
Tabela 3. Conteúdo de carboidratos e umidade em amostras de vegetais. Amostras Glicose Frutose Sacarose Rafinose Estaquiose
(g/100 g m.s.1) (mg/ 100 g m.s.)
Acerola 6,25 ± 0,69ef 4,49 ± 0,76fghi 0,21 ± 0,05i - 210,05 ± 22,79b
Maçã 11,46 ± 0,33de 44,85 ± 1,19b 13,89 ± 0,04ef 14,18 ± 1,21de 95,06 ± 2,78b
Rúcula 0,43 ± 0,06gh - - - -
Banana 5,95 ± 1,92f 5,49 ± 179fghi 7,93 ± 2,91gh 2,29 ± 0,37gh 699,73 ± 66,95b
Beterraba 2,21 ± 0,19fgh 1,04 ± 0,08hi 29,17 ± 1,76bc 57,39 ± 0,87b 88,49 ± 11,12b
Repolho 14,27 ± 0,98cd 9,53 ± 0,79def 0,40 ± 0,03i - 11,23 ± 0,49b
Cenoura 5,68 ± 0,63fg 4,08 ± 0,69fghi 24,52 ± 2,54cd - 190,96 ± 20,72b
Pepino 2,90 ± 0,33fgh 3,10 ± 0,35ghi - - -
Couve 4,89 ± 0,22fgh 4,89 ± 0,23fghi - - -
Alho-poró 15,48 ± 0,09bcd 14,55 ± 0,12d 2,07 ± 0,12i 11,43 ± 0,10ef 67,53 ± 3,48b
Limão 6,52 ± 0,44ef 5,86 ± 0,47fgh 2,37 ± 0,07i 6,31 ± 1,07fgh 5,17 ± 1,28b
Alface 2,67 ± 0,11fgh 3,08 ± 0,26ghi 0,16 ± 0,01i - -
Manga 1,81 ± 0,43fgh 12,87 ± 1,39de 30,48 ± 2,12b - 57,15 ± 2,14b
Melão 12,62 ± 0,20cd 13,80 ± 0,28d 22,18 ± 0,72d - 120,77 ± 3,88b
Hortelã - - 0,10 ± 0,02i 375,83 ± 8,77a -
Laranja 17,18 ± 1,58bc 15,20 ± 1,03d 9,69 ± 0,28fg - 208,96 ± 13,69b
Mamão 67,82 ± 6,14a 63,82 ± 6,49a 1,49 ± 0,56i 28,46 ± 3,17c 19,63 ± 1,18b
Maracujá 4,09 ± 0,26fgh 4,06 ± 0,30fghi 16,60 ± 1,05e 13,80 ± 1,57def 13,19 ± 0,29b
Pera 14,64 ± 0,45cd 21,81 ± 0,56c 13,19 ± 0,50efg 8,68 ± 1,90efg 24,71 ± 2,57b
Abacaxi 4,92 ± 0,73fgh 7,19 ± 0,88efg 45,85 ± 4,51a - 63,23 ± 2,83b
Espinafre - - - - -
Yacon 20,47 ± 0,14b 27,03 ± 0,77c 10,58 ± 0,07fg - 16516 ± 1939a
Inhame 1,71± 0,30fgh 1,88 ± 0,34ghi 3,62 ± 0,60hi 19,98 ± 1,36d 37,89 ± 1,75b
Abobrinha - - - - -
Dados apresentados como média ± desvio padrão de três determinações (n = 3). Valores na mesma coluna indicados com a mesma letra
minúscula não diferem entre si pelo teste de Tukey (p>0,05). 1Massa seca.
47
Tabela 4. Conteúdo de FOS e MALTOS em amostras de vegetais.
Amostras GF2 GF3 GF4 G3 G4 G5 G6 G7
(mg/ 100g m. s.1)
Acerola - 12,2 ± 1,56b
- 3,52 ± 0,26hi
- - - -
Maçã 36,77 ± 0,35d
2,38 ± 0,20b
0,46 ± 0,06b
10,23 ± 0,13fg
- - - -
Rúcula - - - - - - - -
Banana 437,93 ± 25,05c
- - 10,39 ± 0,56f
- 1,95 ± 0,10cd
- -
Beterraba 51,07 ± 0,85d
80,64 ± 1,24b
- - - - 4,16 ± 0,08f
-
Repolho - - - 2,88 ± 0,05hi
- - - -
Cenoura 716,09 ± 31,54b
101,73 ± 9,73b
- 42,18 ± 1,52a
- - 14,09 ± 0,19d
-
Pepino - 1,20 ± 0,07b
0,67 ± 0,04b
- 1,73 ± 0,09c
- - -
Couve 80,67 ± 0,22d
- - - - - 5,75 ± 0,21e
-
Alho-poró 88,40 ± 7,60d
40,30 ± 4,98b
122,40 ± 9,80b
2,50 ± 0,36hi
- 36,20 ± 5,98a
13,0 ± 1,19d
98,3 ± 10,02a
Limão 2,42 ± 0,10d
15,0 ± 2,03b
- 4,33 ± 0,12gh
52,08 ± 1,21a
- - -
Alface 10,50 ± 0,27d
- - - - - 44,67 ± 0,96b
-
Manga 31,94 ± 1,02d
- - - - - - -
Melão 53,85 ± 1,62d
- 0,77 ± 0,09b
3,08 ± 0,11gh
- 2,46 ± 0,16cd
24,77 ± 1,04c
-
Hortelã 14,08 ± 0,27d
83,08 ± 1,72b
- - - - - -
Laranja 122,42 ± 7,50d
- - 13,17 ± 1,01e
23,00 ± 1,29b
- 5,92 ± 0,42e
0,83 ± 0,26b
Mamão 10,40 ± 0,13d
32,00 ± 1,56b
14,43 ± 0,48b
24,00 ± 1,48c
- - - -
Maracujá 3,13 ± 0,31d
55,50 ± 1,98b
- 26,75 ± 0,25b
5,75 ± 0,79c
3,62 ± 0,28f
-
Pera 4,41 ± 0,19d
1,12 ± 0,13b
- 2,06 ± 0,05j
1,82 ± 0,09c
20,0 ± 1,33b
- -
Abacaxi 24,00 ± 1,55d
- - 17,77 ± 0,83d
- - - -
Espinafre - 10,73 ± 0,39b
- - 2,54 ± 0,11c
- 3,09 ± 0,11f
2,18 ± 0,12b
Yacon 8507,86 ± 274,3a
5858,14 ± 458,4a
2820,0 ± 165,9a
- - - - -
Inhame 2,67 ± 0,37d
- - 5,94 ± 0,17g
- - - -
Abobrinha - - 96,25 ± 5,90b
- - - 88,25 ± 1,85a
-
Dados apresentados como média ± desvio padrão de três determinações (n = 3). Valores na mesma coluna indicados com a mesma letra minúscula não diferem entre si pelo teste de Tukey (p>0,05). 1Massa seca.
48
48
4.0 - CONCLUSÃO
O método de cromatografia descrito neste estudo permitiu a investigação
de carboidratos em diferentes matrizes vegetais. Os parâmetros de validação
tiveram respostas satisfatórias para linearidade, acurácia e precisão. Os métodos
utilizados também apresentaram boa seletividade e resolução.
Os resultados de validação do método desenvolvido para Glicose,
Frutose, Sacarose, Rafinose e Estaquiose, bem como o método para
oligossacarídeos (FOS e MALTOS) mostraram que eles podem ser utilizados com
confiança para separar e quantificar estes compostos.
Foram obervados RFO em beterraba, yacon, laranja, banana e com maior
destaque a rafinose na hortelã e a estaquiose no yacon. Além disso, o yacon foi
também a amostra com maior teor de FOS, seguido pela cenoura. Dentre os
vegetais analisados, a beterraba e a cenoura apresentaram maiores concentrações
de sacarose. Como as concentrações de carboidratos nos vegetais é função de uma
série de fatores, como variedade, maturidade, variação sazonal, clima, procedimento
de extração, os valores podem variar para uma mesma espécie vegetal em estudos
diversos.
49
49
REFERÊNCIAS
AOAC, Association of Official Agricultural Chemists. (2006). Official methods of
analysis of the Association of Official Analytical Chemists. (W. Howitz & G. W.
Latimer Jr, Eds.) (18th ed.). Gaithersburg: AOAC International.
Arruda, H. S., Pereira, G. A., Pastore, G. M. (2017). Oligosaccharide profile in
Brazilian Cerrado fruit araticum (Annona crassiflora Mart.). LWT-Food Science
and Technology. 76, 278-283
Ballus, C. A., Meinhart, A. D., Campos JR, F. A. S., Silva, L. F. O., Oliveira, A. F.,
Godoy, H. T. (2014) A quantitative study on the phenolic compound, tocopherol
and fatty acid contents of monovarietal virgin olive oils produced in the
southeast region of Brazil. Food Research International, 62:74-83.
Cruz-Cárdenas, C. I., Miranda-Ham, M. L., Castro-Concha, L. A., Ku-Cauich, J. R.,
Vergauwen, R., Reijnders, T., Escobedo-GraciaMedrano, R. M. (2015).
Fructans and other water soluble carbohydrates in vegetative organs and fruits
of different Musa spp. accessions. Frontiers in plant science, 6.
Delgado, G. T. C.; Tamashiro, W. M. S. C.; Pastore, G. M. (2010).
Immunomodulatory effects of fructans. Food Research International, 43 (5),
1231-1236.
Der Agopian RG, Purgatto E, Cordenunsi BR, Lajolo FM (2009) Synthesis of
fructooligosaccharides in banana ―Prata‖ and its relation to invertase activity
and sucrose accumulation. J Agric Food Chem 57:10765–10771.
Jovanovic-Malinovska, R.; Kuzmanova, S.; Winkelhausen, E. (2014).
Oligosaccharide profile in fruits and vegetables as sources of prebiotics and
functional foods. International Journal of Food Properties, 17 (5), 949-965.
Johansen, H. N., Glitsø, V., Bach Knudsen, K. E. (1996). Influence of extraction
solvent and temperature on the quantitative determination of oligosaccharides
from plant materials by high-performance liquid chromatography. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 44(6), 1470-1474.
50
50
L'homme, C., Peschet, J. L., Puigserver, A., Biagini, A. (2001). Evaluation of fructans
in various fresh and stewed fruits by high-performance anion-exchange
chromatography with pulsed amperometric detection. Journal of
Chromatography A, 920(1), 291-297.
Liu, Z., Mouradov, A., Smith, K.F., Spangenberg, G., 2011. An improved method for
quantitative analysis of total fructans in plant tissues. Analytical biochemistry.
418, 252-259.
Liu, Z.; Rochfort, S. (2015). Identification and quantitative analysis of
oligosaccharides in wheat flour using LC–MS. Journal of Cereal Science, 63,
128-133.
Moongngarm, A., Trachoo, N., Sirigungwan, N. (2011). Low molecular weight
carbohydrates, prebiotic content, and prebiotic activity of selected food plants in
Thailand. Advance Journal of Food Science and Technology, 3(4), 269-274.
Mussatto, S. I.; Mancilha, I. M. (2007) Non-digestible oligosaccharides: a
Review. Carbohydrate polymers, 68 (3), 587-597.
Roberfroid, M., Gibson, G. R., Hoyles, L., McCartney, A. L., Rastall, R., Rowland, I.,
Guarner, F. (2010). Prebiotic effects: metabolic and health benefits. British
Journal of Nutrition, 104(S2), S1-S63.
Sancho, R. A. S., Souza, J. D. R., de Lima, F. A., Pastore, G. M. (2017). Evaluation
of oligosaccharide profiles in selected cooked tubers and roots subjected to in
vitro digestion. LWT-Food Science and Technology. 76, 270-277.
Stober, P., Benet, S., Hischenhuber, C., 2004. Simplified enzymatic high-
performance anion exchange chromatography determination of total fructans in
food and pet food e limitations and measurement uncertainty. Journal of
agricultural and food chemistry. 52, 2137-2146.
Tanaka, M., Thananunkul, D., Lee, T. C., Chichester, C. O. (1975). A simplified
method for the quantitative determination of sucrose, raffinose and stachyose in
legume seeds. Journal of Food Science, 40(5), 1087-1088.
51
51
Thompson, M., Ellison, S. L. R., Wood, R. (2002). Harmonized guidelines for single-
laboratory validation of methods of analysis. Pure and Applied Chemistry, 74,
835–855.
Wilson, R.G.; Smith, J.A.; Yonts, C.D. (2004) Chicory root yield and carbohydrate
composition is influenced by cultivar, planting, and harvest date. Crop Science.
44, 748–752.
52
52
CAPÍTULO II
AVALIAÇÃO DOS POSSÍVEIS EFEITOS SINÉRGICOS ENTRE FRUTO-
OLIGOSSACARÍDEOS E COMPOSTOS FENÓLICOS NA DIGESTÃO IN VITRO
Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos,
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Rua Monteiro Lobato, 80, Cidade
Universitária Zeferino Vaz, 13083-862, Campinas, SP, Brasil
Jane Delane Reis Pimentel Souza, Renata Aparecida Soriano Sancho, Gustavo
Araújo Pereira, Henrique Silvano Arruda, Glaucia Maria Pastore
Manuscrito em preparação para ser submetido à revista LWT - Food Science and
Technology
53
53
RESUMO
Os compostos bioativos, dentre eles os compostos fenólicos e fruto-
oligossacarídeos (FOS) são importantes devido aos seus efeitos benéficos à saúde,
como prevenção ou redução do risco de doenças como artrite, aterosclerose,
diabetes e câncer. Os vegetais são importantes fontes de compostos bioativos, a
couve manteiga (Brassica oleracea var acephala) e yacon (Smallanthus sonchifolius)
são fontes de compostos fenólicos e FOS, respectivamente. Este estudo teve como
objetivo avaliar os efeitos da digestão in vitro sobre o conteúdo de compostos
fenólicos e FOS de matrizes vegetais (couve e yacon) e respectivos padrões
analíticos (fenóis e FOS). Foram analisados o conteúdo de compostos fenólicos,
capacidade antioxidante através dos métodos TEAC e ORAC, além dos teores de
FOS, glicose, frutose e sacarose por cromatografia (HPAEC-PAD), antes da
digestão e nas fases gástrica e intestinal da digestão. Os resultados indicaram que
na fase gástrica da digestão in vitro foi onde houve maior redução de compostos
fenólicos e capacidade antioxidante, seguido de um aumento na fase intestinal para
todas as amostras analisadas. Houve também ligeira redução do conteúdo de FOS e
consequente aumento de glicose, frutose e sacarose, provavelmente em função do
baixo pH da fase gástrica. Um provável efeito protetor dos fenólicos aos FOS foi
observado, já que em amostras contendo ambos os compostos, não promoveram a
degradação dos FOS. Talvez seja um indício de que possa haver sinergismo entre
estes dois grupos de compostos bioativos, estudos futuros são necessários para
esclarecer melhor estes mecanismos.
Palavras-chave: Carboidratos, Atividade antioxidante, couve, yacon, compostos
bioativos.
54
54
ABSTRACT
Bioactive compounds, such as phenolic compounds and fructooligosaccharides
(FOS) are important due to their beneficial effects on health, such as prevention or
reduction of the risk of diseases such as arthritis, atherosclerosis, diabetes and
cancer. Vegetables are important sources of bioactive compounds, the kale
(Brassica oleracea var acephala) and yacon (Smallanthus sonchifolius) are sources
of phenolic compounds and FOS, respectively. The objective of this study was to
evaluate the effects of in vitro digestion on phenolic compounds and FOS of plant
matrices (kale and yacon) and respective analytical standards (phenols and FOS).
The content of phenolic compounds, antioxidant capacity through TEAC and ORAC
methods, as well as FOS, glucose, fructose and sucrose by chromatography
(HPAEC-PAD), were analyzed before digestion and in the gastric and intestinal
phases of digestion. The results indicated that the gastric phase of the in vitro
digestion showed greater reduction of phenolic compounds and antioxidant capacity,
followed by an increase in the intestinal phase for all the analyzed samples. There
was also a slight reduction in FOS content and consequent increase in glucose,
fructose and sucrose, probably due to the low pH of the gastric phase. A possible
protective effect of phenols on FOS was observed, since in samples containing both
compounds, there was no degradation of FOS. Although it is an indication that there
may be synergism between these two groups of bioactive compounds, further studies
are needed to better clarify these mechanisms.
Key-words: carbohydrates, antioxidant activity, yacon, bioactive compounds
55
55
1.0 - INTRODUÇÃO
Os efeitos benéficos à saúde decorrentes de uma alimentação
equilibrada, que inclua o consumo de vegetais, estão comprovados há tempos. Mas,
tanto pela importância quanto pela infinidade de informações necessárias, este é um
assunto sempre atual e objeto de muitos estudos (Kamiloglu et al., 2016; Sicari et
al., 2016; Singh et al., 2016). Entender os mecanismos de atuação dos compostos
bioativos, os efeitos e suas interações, métodos para preservá-los e como obter o
máximo de seus benefícios estão entre os principais anseios dos estudos
envolvendo estes alimentos (Roberfroid et al., 2010; Landete, 2012)
Dentre os compostos bioativos, os que possuem efeito antioxidante são
os mais reconhecidos por prevenir ou reduzir o risco de doenças degenerativas
como artrite, aterosclerose, diabetes, envelhecimento e risco de câncer. Os vegetais
são fontes naturais destes compostos (vitaminas C e E, carotenoides e compostos
fenólicos), o que explica parte das ações benéficas que as frutas, legumes,
hortaliças e cereais integrais exercem sobre o organismo (Moure et al., 2001; Sun et
al., 2002; Chu et al., 2002).
Os prebióticos, notadamente os fruto-oligossacarídeos (FOS), são
compostos que proporcionam a melhora de algumas funções fisiológicas nos seres
humanos, tais como o alívio da constipação, a redução do risco de osteoporose
através do aumento da absorção de minerais e da aterosclerose pela diminuição da
síntese de triglicérides, a redução do nível de colesterol do plasma e do ganho de
peso; a redução da incidência de câncer de cólon, diarreia e inflamações; e
finalmente efeito benéfico sobre diabetes tipo 2, pela diminuição dos níveis de
glicose no sangue (Jovanovic-Malinovska et al., 2014; Causey et al., 2000).
Visto que estes dois grupos de compostos bioativos têm alguns efeitos
positivos em determinadas condições como diabetes, aterosclerose e risco de
câncer, uma atuação conjunta poderia somar ou multiplicar os benefícios. Neste
sentido, faz-se necessário investigar o possível efeito sinérgico entre estes
compostos.
Os FOS, por serem prebióticos, devem chegar intactos ao cólon para
serem fermentados pelas bactérias probióticas, como lactobacilos e bifidobactérias,
naturalmente presentes no organismo (Saad, Cruz & Faria, 2011). Uma alternativa
para verificar a efetividade deste conceito é utilizar métodos de digestão in vitro.
56
56
Estes métodos podem ser uma opção vantajosa, uma vez que são realizados em
condições controladas, são mais rápidos, menos dispendiosos, de fácil
reprodutibilidade e sem restrições éticas (Minekus et al. 2014). Em estudo recente
foi constatado que em raízes e tubérculos houve aumento de FOS durante a
digestão in vitro e que para os padrões de Kestose (GF2), Nistose (GF3) e
Frutofuranosil – nistose (GF4) houve ligeira degradação (Sancho et al., 2016).
Segundo Ydjedd et al. (2017) a capacidade antioxidante dos vegetais está
principalmente ligada aos seus compostos fenólicos, mas as propriedades
antioxidantes destes compostos podem mudar devido às transformações químicas
resultantes a partir de diferentes mecanismos durante a digestão gastrointestinal.
Compostos fenólicos provenientes de diferentes matrizes vegetais com capacidade
antioxidante comprovada evidenciaram comportamentos diferenciados quando
submetidos à digestão in vitro, dado que em determinado momento a atividade
antioxidante foi preservada e em outro houve um decréscimo considerável (Sancho
et al., 2015, Pavan et al., 2014).
Dentre os vegetais folhosos comestíveis, a couve manteiga (Brassica
oleracea var acephala) pertence a uma família reconhecida por apresentar em sua
composição diferentes compostos bioativos, como vitamina C, tocoferóis, polifenóis,
que têm efeito protetor contra o desenvolvimento de doenças crônicas (Costa &
Rosa, 2010).
O yacon (Smallanthus sonchifolius), por sua vez, é um tubérculo nativo
dos Andes e contém majoritariamente frutanos como carboidratos de reserva,
notadamente GF2, GF3 e GF4 (Sheid et al., 2014). Apresenta um sabor adocicado e
textura crocante quando consumido cru. Outras alternativas para seu consumo são
cozido, assado, desidratado ou em forma de refresco (Fernández et al.., 1997)
Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da digestão in
vitro sobre os compostos fenólicos e FOS em matrizes vegetais (couve e yacon) a
fim de verificar possível efeito sinérgico entre eles em condição gastro-intestinal
simulada. Soluções aquosas de padrões analíticos de compostos fenólicos e FOS
foram também submetidos às mesmas condições da digestão in vitro, com intuito de
analisar o comportamento destes grupos de compostos sem as interferências da
matriz.
57
57
2.0 - MATERIAL E MÉTODOS
2.1 - Material
Os padrões de Kestose (GF2), Nistose (GF3), Frutofuranosil – nistose
(GF4) foram adquiridos da Wako (Japão), Glicose da Supelco (EUA), Sacarose e
Frutose da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, EUA).
Os reagentes hidróxido de sódio (NaOH) e acetato de sódio (CH3COONa)
grau HPLC utilizados foram da Merck (Darmstadt, Germany) e a água purificada pelo
sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, EUA).
Padrões de catequina, ácido gálico, kaempferol e quercetina e os
reagentes ABTS (2′2-azino-bis(3-etilbenzotriasolina-6-ácido sulfônico)), Trolox (6-
hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico), AAPH (2,2'-azobis(2-metil-
propianamidina)dicloridrato), fluoresceína, extrato de bile de suíno (B-8631), pepsina
da mucosa gástrica de suíno (EC 3.4.23.1, P-7000), pancreatina de pâncreas suíno
(4×USP—US Pharmacopeia specifications, P-1750) foram obtidos da Sigma-Aldrich
Co. (St. Louis, USA). Todos os outros produtos químicos e solventes utilizados foram
de grau analítico.
2.2 - Preparação das amostras
Foram utilizados neste estudo os vegetais couve manteiga (Brassica
oleracea var acephala) como fonte de compostos fenólicos (Fiol et al., 2012) e yacon
(Smallanthus sonchifolius) como fonte de FOS (Delgado et al., 2012; Sheid et al.,
2014), adquiridos na Central de Abastecimento de Campinas – SP (CEASA).
As matérias-primas foram homogeneizadas com água utilizando mixer
doméstico (Black & Decker, Brazil), obtendo-se assim 6 tratamentos para digestão in
vitro: 1) couve (10 mg/100mL); 2) yacon (20 mg/100mL); 3) couve (10 mg/ 100mL) +
yacon (20 mg/100mL); 4) Padrão de fenólicos: Quercetina (0,025 mg/mL),
Kaempferol (0,065 mg/mL); 5) Padrão FOS: GF2 (0,144 mg/mL), GF3 (0,104 mg/
mL), GF4 (0,056 mg/mL); 6) Padrão Fenólicos + Padrão FOS: Quercetina (0,025 mg/
mL), Kaempferol (0,065 mg/mL), GF2 (0,144 mg/mL), GF3 (0,104 mg/mL), GF4
(0,056mg/mL). As concentrações das amostras vegetais foram definidas
considerando as proporções destes na formulação de uma bebida mista de vegetais
(BMV) a ser elaborada em estudo subsequente. Já as concentrações dos padrões
58
58
de compostos fenólicos foram equivalentes à composição marjoritária de fenólicos
na couve (Fiol et al., 2012) e os FOS com as proporções de GF2, GF3 e GF4
equivalentes à composição do yacon, identificadas em estudos prévios (dados não
publicados) e na literatura (Delgado et al., 2012; Sheid et al., 2014), porém em
concentrações menores devido à necessidade de se utilizar elevada quantidade de
padrão, o que inviabilizaria o estudo.
2.3 - Digestão in vitro
A digestão in vitro foi realizada conforme metodologia de Sancho et al.,
(2016) com modificações. Uma alíquota de 1 mL de amostra foi misturada à solução
salina (140 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl) na proporção 1:4 e acidificada com HCl
6mol/L a pH 2. A digestão gástrica consistiu da adição de 0,5 mL de solução de
pepsina (200 mg de pepsina em 5 mL de HCl 0,1 mol/L) e agitação (130 rpm) a 37ºC
por 1 h. Em seguida, o pH foi ajustado para 6,9 com NaHCO3 1 mol/L e a digestão
intestinal foi realizada com adição de 2 mL de solução de pancreatina e bile (225 mg
de extrato bile e 37 mg de pancreatina em 18,7 mL de NaHCO3 0,1 mol/L) e mantido
a 37ºC por 2 horas sobre agitação. Uma alíquota (4 mL) da fase gástrica foi retirada,
filtrada com filtro de membrana 0,22 µm, separada em microtubos e armazenadas (-
80ºC). O restante foi submetido então à digestão intestinal conforme descrito. Ao
término desta etapa, o volume final foi medido e procedeu-se o fracionamento em
microtubos e armazenamento em ultrafreezer (-80ºC) para posteriores análises.
Como controle do processo de digestão in vitro, utilizou-se água destilada
em substituição à amostra e este foi submetido a todas as etapas descritas.
2.4 - Carboidratos
A separação dos carboidratos foi realizada através do sistema de
cromatografia de íons acoplada ao detector amperométrico pulsado (HPAEC-PAD),
software de Automação Cromatográfica Chromeleon 7.0 CHM-1, da Dionex (EUA),
utilizando a bomba Single Grad Degas. A coluna Carbopac PA-100 foi utilizada para
os oligossacarídeos, com eluição: solução A (500 mM de acetato de sódio e 100mM
de hidróxido de sódio) e solução B (100 mM de hidróxido de sódio). A coluna
Carbopac PA-1 foi utilizada para glicose, frutose e sacarose, com eluição de
59
59
hidróxido de sódio (180 mM) e 200 mM para limpeza. A temperatura mantida a 30ºC
e o fluxo de 1,0 mL por minuto. As amostras foram diluídas em água e filtradas em
filtros de membrana 0,22 μm. A identificação dos compostos nas amostras foi feita a
partir da comparação dos tempos de retenção dos tempos de retenção dos padrões
analíticos de açúcares nas mesmas condições. Os padrões utilizados foram Kestose
(GF2), Nistose (GF3), Frutofuranosil – nistose (GF4) da marca Wako (Japão);
Maltotriose (G3); Maltotetrose (G4); Maltopentose (G5), Maltohexose (G6),
Heptahexose (G7), Glicose da Supelco (EUA), Sacarose e Frutose da Sigma (EUA).
Os oligossacarídeos foram analisados conforme Sancho et al. (2016).
2.5 - Determinação dos Compostos Fenólicos
Os teores de fenólicos foram determinados utilizando o reagente de Folin-
Ciocalteu de acordo com método descrito por Cicco et al.. (2009), com modificações
propostas por Ainsworth e Gillespie (2007) Cicco e Lattanzio (2011). Em resumo,
misturaram-se 100 μL de amostra, 100 μL de reagente olin-Ciocalteu (50% v / v) e
800 μL de Na2CO3 (5% m / v), seguido de incubação à temperatura ambiente
durante 20 minutos. A absorbância foi medida a 760 nm contra um branco em
espectrofotômetro UV-Vis (Beckman, modelo DU600, CA, EUA). Utilizou-se etanol a
40% (v / v) para as amostras, soluções de calibração e preparação em branco.
Preparou-se o reagente 50% Folin-Ciocalteu (v/ v) e carbonato de sódio a 5% (p / v)
em água deionizada. O ácido gálico foi utilizado para a curva de calibração com uma
faixa de concentração de 2,5-50,0 μg / mL. Os resultados foram expressos em mg
de equivalentes de ácido gálico por 100 mL de amostra (mg GAE / 100 mL).
2.6 - Capacidade antioxidante
2.6.1 - TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) – captura do radical 2′2-
azino-bis(3-etilbenzotriasolina)-6-ácido sulfônico (ABTS•+)
A capacidade antioxidante foi determinada pelo método TEAC conforme
metodologia descrita por Le et al.. (2007). O radical ABT •+ foi gerado pela reação
de ABTS 7mM com persulfato de potássio 140 mM, armazenado ao abrigo da luz e
a temperatura ambiente por 16 h. O Trolox foi utilizado como antioxidante padrão
para elaboração da curva de calibração, nas concentrações de 10 a 250 μM, sendo
60
60
representada graficamente como porcentagem de inibição (%) por concentração de
Trolox. A absorbância foi medida a 734 nm em espectrofotômetro UV-Vis (Beckman,
modelo DU600, CA, EUA). O resultado foi expresso em μM equivalente de Trolox/
100 mL de amostra.
2.6.2 - ORAC – Oxygen Radical Absorbance Capacity
A capacidade antioxidante pelo método ORAC foi determinada em leitor
de microplaca NOVOstar (BMG Labtech, Offenburg, Alemanha), acompanhando
com o Software MARS data Analysis versão 1.3 (BMG Labtech, Offenburg,
Alemanha). Este método é baseado na capacidade fluorescente da fluoresceína
sódica na presença de radicais de oxigênio e foi realizado conforme a metodologia
proposta por Leite et al. (2011). Primeiramente preparou-se uma solução de tampão
fosfato (75 mmol.L-1, pH 7,4) que foi utilizada para solubilizar a fluoresceína e o
AAPH (2,2'-azobis(2-metil-propianamidina)dicloridrato).
Para a análise foram misturados 20 μL de amostra com 120 μL de
fluoresceína (0,4 μg/mL) e 60 μL do radical AAPH na concentração de 108 mg/mL
foram adicionados à microplaca e incubados a 37ºC. A leitura foi realizada em 520
nm de emissão e 485 nm de excitação, através do decaimento da emissão de
fluorescência em função do tempo até a estabilização. O padrão Trolox foi utilizado
para elaborar a curva de calibração. Para os cálculos, foi utilizada a Equação 1, que
representa a área abaixo da curva (AUC).
AUC = 1 + f2/f1 + f3/f1 + f4/f1 + fn/f1 (1)
Onde: f1 = leitura da fluorescência no tempo 1 minuto, f2 = leitura da
fluorescência no tempo 2 min e fn = leitura da fluorescência no tempo 80 min. O
resultado final foi expresso em μM equivalentes de Trolox/ 100 mL de amostra.
2.7 - Análises estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software
STATISTICA, Versão 7.0. Os resultados foram submetidos a ANOVA e teste de
comparação de Tukey, a um nível de 5% de significância. Os resultados foram
apresentados como médias ± desvio padrão para as triplicatas.
61
61
3.0 - RESULTADOS E DISCUSSÃO
Ao avaliar o efeito da digestão simulada sobre a composição de
compostos fenólicos das 6 condições analisadas foi possível observar que o
conteúdo de compostos fenólicos reduziu nas amostras após a digestão in vitro, com
exceção do yacon, que ao final da fase intestinal manteve, de forma significativa
(p<0,05) a mesma quantidade de compostos do início da digestão, com 5,47±0,25 e
5,30±0,61 mg GAE/100 mL na fase inicial e final, respectivamente (Tabela 1). Nota-se,
que todos os tratamentos mostraram uma redução significativa (p<0,05) de
compostos fenólicos na fase gástrica da digestão, com teores iniciais de 17,52±0,18;
5,47±0,25 e 18,98±0,51 mg GAE/100 mL para couve, yacon e couve+yacon,
respectivamente, reduzindo para 13,60±0,22, 2,12±0,39 e 15,22±0,42 mg GAE/100
mL, respectivamente. Nos demais tratamentos (padrões analíticos), o decréscimo foi
mais expressivo, apresentando uma redução total após a digestão gástrica. Já na
fase intestinal, foi quantificado novamente um conteúdo de fenólicos para os
padrões fenólicos e Padrão (FOS + Fenólicos). Os polifenóis podem sofrer
alterações estruturais nas condições adversas da digestão e é possível que, quando
expostos a tais condições, uma proporção dos compostos sofra transformações
físico-químicas, como oxidação ou interações com outros componentes (Ryan e
Prescott, 2010; Wootton-Beard e Ryan, 2011; Ydjedd et al., 2017) o que pode
explicar este comportamento observado para os compostos fenólicos.
Para as matrizes vegetais, couve e couve + yacon não houve diferença
significativa (p≤0,05) entre as fases gástrica e intestinal, revelando que as principais
alterações nos compostos fenólicos, para estas amostras, aconteceram na fase
gástrica da digestão. Estes resultados destoam da maioria dos estudos que
relacionam os compostos fenólicos em condições gastrointestinais, em que há um
aumento do conteúdo de fenólicos e atividade antioxidante na fase gástrica e
redução na fase intestinal (Ryan e Prescott, 2010; Wootton-Beard e Ryan, 2011;
Ydjedd et al., 2017).
62
62
Tabela 1. Efeito da digestão in vitro no conteúdo de compostos fenólicos totais.
Amostras
Compostos fenólicos (mg GAE/100 mL).
Antes da
Digestão
Digestão Gástrica Digestão Intestinal
Couve 17,52±0,18a 13,60±0,22b 14,86±0,90b
Yacon 5,47±0,25a 2,12±0,39b 5,30±0,61a
Couve+yacon 18,98±0,51a 15,22±0,42b 15,62±0,99b
Padrão fenóis 17,59±0,26a n.d 6,79±1,04b
Padrão FOS n.d n.d n.d
Padrão (FOS + fenóis) 17,82±0,24a n.d 9,34±0,24b
n.d: Não detectado. Dados apresentados como média ± desvio padrão de três determinações (n = 3).
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na mesma linha não diferem de acordo com o teste de
Tukey (p> 0,05).
O efeito da digestão sobre a capacidade antioxidante pelo método TEAC
assinala também uma redução da atividade antioxidante na fase gástrica seguida de
um aumento na fase intestinal da digestão para todas as situações estudadas
(Tabela 2). Havendo este comportamento tanto para as matrizes vegetais quanto
para os padrões, é possível que o aumento da capacidade antioxidante na fase
intestinal esteja associado principalmente às mudanças estruturais dos compostos
(Ryan e Prescott, 2010) e à liberação de compostos da matriz, no caso dos vegetais
(Pavan et al., 2014).
Nota-se também na digestão gástrica, que as reduções mais expressivas
para os vegetais foram observadas no tratamento com Couve e no Couve+Yacon,
com valores iniciais de 89,01±2,06 e 84,34±1,26 µmol TE/ 100 mL, para um teor de
56,04±2,43 e 63,77±1,81, respectivamente.
Diferente do que foi constatado anteriormente, a análise da capacidade
antoxidante pelo método ORAC revelou um aumento da capacidade antioxidante já
na fase gástrica da digestão para as amostras de matrizes vegetais, mantendo esse
valor depois da digestão intestinal (Tabela 3). Para os padrões, houve um
decréscimo total da capacidade antioxidante e após a fase intestinal da digestão
esses níveis foram superiores aos obervados antes da digestão. Essas diferenças
entre os dois métodos de análise da capacidade antioxidante e entre as fases
gástrica e intestinal da digestão in vitro possivelmente são resultado das
63
63
transformações dos compostos, físico-químicas e oxidação, que passam a ter
diferentes propriedades químicas. Os métodos utilizados para avaliar a capacidade
antioxidante podem detectar formas estruturais por mecanismos diferenciados,
doação de hidrogênio e doação e eliminação de radicais livres (Ryan et al. 2010).
Os padrões são totalmente expostos, ao contrário dos compostos nos
vegetais que podem ser favorecidos pela estrutura complexa da matriz. Logo, esta
susceptibilidade pode ser o fator que faz com eles sofram alterações, a ponto de
perder a atividade antioxidante nas condições da fase gástrica da digestão. Mas,
essa condição é totalmente modificada quando há a mudança para a fase intestinal,
elevando-se a atividade antioxidante. Isso pode ser muito interessante, já que neste
momento é onde ocorre a absorção de grande parte dos nutrientes, além da
fermentação pelas bactérias probióticas.
Table 2. Efeito da digestão in vitro na capacidade antioxidante pelo ABTS.
Amostras
Capacidade antioxidante ABTS (µmol TE/ 100 mL)
Antes da
Digestão
Digestão Gástrica Digestão Intestinal
Couve 89,01±2,06b 56,04±2,43c 181,11±17,10a
Yacon 22,84±0,03b 18,32±1,26b 137,10±6,17a
Couve+Yacon 84,34±1,26b 63,77±1,81c 197,49±13,14a
Padrão Fenóis 139,51±0,47b n.d 150,77±4,61a
Padrão FOS n.d n.d 121,90±5,26a
Padrão (FOS + Fenóis) 177,19±1,12b n.d 210,05±10,48a
n.d: Não detectado. Dados apresentados como média ± desvio padrão de três determinações (n = 3).
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na mesma linha não diferem de acordo com o teste de
Tukey (p> 0,05).
Em estudo similar Sancho et al. (2015) verificaram que em extratos
vegetais submetidos à digestão in vitro também aconteceu uma diminuição do
conteúdo de compostos fenólicos e capacidade antioxidante. Nos extratos, os
compostos estão mais vulneráveis às condições da digestão, similar aos padrões.
Destaca-se que em diferentes matrizes de origem vegetal observa-se um
comportamento diferenciado, podendo ocorrer aumento ou redução da capacidade
64
64
antioxidante em condições gastro-intestinais simuladas (Ryan et al., 2010, Chen et
al., 2015).
Table 3. Efeito da digestão in vitro na capacidade antioxidante pelo ORAC.
Amostras
Capacidade antioxidante (µmol TE /100 mL)
Antes da
Digestão
Digestão Gástrica Digestão Intestinal
Couve 226,9±22,3b 625,3±28,6a 687,4±69,9a
Yacon 44,9±8,5b 101,5±27b 227,9±10,38a
Couve+Yacon 137,1±14,7b 667,3±76,5a 591,2±21,0a
Padrão Fenóis 331,0±3,71b n.d 799,7±80,3a
Padrão FOS 34,0±8,44b n.d 425,7± 36,1a
Padrão (FOS + Fenóis) 363,7±75,9b n.d 967,8±88,3a
n.d: Não detectado. Dados apresentados como média ± desvio padrão de três determinações (n = 3).
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na mesma linha não diferem de acordo com o teste de
Tukey (p> 0,05).
A atividade antioxidante de um flavonoide está intimamente relacionada à
sua estrutura química, ao número de grupos hidroxila na molécula que garante a
existência de várias espécies carregadas, cujo equilíbrio é determinado pelo pH da
solução (Herrero-martinez et al., 2005; Matei et al., 2014; Jurasekova et al., 2014). O
conhecimento de constantes de dissociação (isto é, valores de pKa) de flavonoides é
fundamental para entender seu comportamento. Estes compostos apresentam
vários grupos hidroxila ionizáveis com valores de pKa relativamente próximos um do
outro (Herrero-martinez et al., 2005).
O kaempferol apresenta quatro grupos hidroxila ionizáveis e os seus
valores de pKa abrangem o intervalo 7,11-13,26, aproximadamente (Matei et al.,
2014; Herrero-martinez et al., 2005). Em solução aquosa a pH inferior a 4, o
espectro de absorção UV-visível do kaempferol corresponde exclusivamente à sua
forma neutra e, o aumentar o pH, evidencia-se a formação gradual de espécies
aniônicas (Matei et al., 2014).
A quercetina por sua vez, possui todos os locais reativos que conferem
instabilidade aos flavonóides e, portanto, capacidade antioxidante (Jurasekova et al.,
2014) com valores de pka na faixa de 7,04 a 13,06.
65
65
Pelo exposto, esse aumento expressivo da capacidade antioxidante após
a fase intestinal da digestão pode estar relacionado também ao pH da fase intestinal
(6,9) valor próximo ao pka1 dos compostos fenólicos principais envolvidos neste
estudo, quercetina e kaempferol.
Os FOS, por sua vez, sofreram ligeira degradação na fase gástrica da
digestão in vitro para as amostras de Yacon e Padrão FOS e mantiveram este
conteúdo até o final da digestão (Figura 1). Essa redução ocorre possivelmente em
virtude da hidrólise ácida, já que os FOS estão suscetíveis a degradação quando em
pH reduzido (Campos et al., 2016, Bleker et al., 2002). Tanto as amostras de Yacon
+ Couve, quanto seu correspondente em padrão (FOS + Fenólicos) não
apresentaram diminuição dos teores de FOS ao longo da digestão. Este pode ser
um indício de que os fenóis e/ou outros compostos com atividade antioxidante
podem atuar inibindo a degradação ácida dos FOS, verificada eventualmente na
fase gástrica da digestão in vitro.
O aumento dos açúcares simples glicose, frutose e sacarose, na fase
gástrica da digestão, foi constatado para todas as amostras estudadas. Com a
degradação dos FOS era esperado que a quantidade destes açúcares aumentasse.
Nota-se que para os tratamentos com padrão (FOS) e (FOS + Fenólicos) não há
glicose, frutose e sacarose antes da digestão, apenas a partir da fase gástrica
(Figura 2) o que reforça a hipótese apresentada.
66
66
Figura 1. Perfis de FOS das amostras antes e após a digestão.
AD – Antes da digestão; DG – Digestão gástrica; DI – Digestão intestinal. Os valores são médias ± desvio padrão (n=3). GF2 - 1-kestose, GF3 - nistose, GF4 - 1 – fructofuranosil-nistose.
a
a
a
b
b
b
b
b
b
0
100
200
300
400
500
600
700
800
GF2 GF3 GF4
mg
/ 100 m
L
YACON
A
a
a
a
a
a
a
a
a
a
0
100
200
300
400
500
600
700
800
GF2 GF3 GF4
mg
/ 100 m
L
YACON + COUVE
AD
DG
DI
B
a
a
a
a
a
a
a
a
a
0
20
40
60
80
100
120
140
160
GF2 GF3 GF4
mg
/ 100 m
L
PADRÃO FOS
C ab
a
a
a
a
a
b
a
a
0
20
40
60
80
100
120
140
160
GF2 GF3 GF4
mg
/ 100 m
L
PADRÃO (FOS + FENOIS)
AD
DG
DI
D
67
67
Figura 2. Perfis de Glicose, frutose e sacarose das amostras antes e após a
digestão.
Os valores são médias ± desvio padrão (n=3). GLI – glicose, FRU – frutose, SAC – sacarose.
b b
b
a
a
a
a
a
a
0
100
200
300
400
500
GLI FRU SAC
mg
/ 100m
L
YACON
A
b b
b a
a
a
a
a
a
0
100
200
300
400
500
GLI FRU SAC
mg
/ 100 m
L
YACON + COUVE
B
b b b
a
a
a
a
a
a
0
10
20
30
40
50
60
70
80
GLI FRU SAC
mg
/ 100m
L
PADRÃO FOS
C
b b b
a
a
a
a
a
a
0
10
20
30
40
50
60
70
80
GLI FRU SAC
mg
/ 100m
L
PADRÃO (FOS + FENÓLICOS)
D
b
b
b
a
a
a
a
a
a
0
20
40
60
80
100
120
140
GLI FRU SAC
mg
/ 100m
L
COUVE
Antes da digestão Digestão gástrica Digestão intestinal
E
68
68
4.0 - CONCLUSÃO
A digestão in vitro das matrizes vegetais (couve e yacon) e em padrões
de fenólicos e FOS evidenciou, principalmente, que durante a fase gástrica há uma
redução dos compostos fenólicos e da atividade antioxidante (ABTS) e que na fase
intestinal pode ser mantido ou aumentado. Apenas para o ensaio ORAC houve um
aumento desde a fase gástrica da digestão para as amostras de matriz vegetal.
Provavelmente em função das transformações dos compostos, que passam a ter
diferentes propriedades químicas.
Com relação aos FOS, houve uma pequena degradação evidenciada na
fase gástrica da digestão para as amostras de Yacon e Padrão FOS. Quando o
yacon estava associado à couve e o padrão de FOS aos fenólicos, essa degradação
não foi observada, indicando um possível efeito protetor dos fenólicos aos FOS.
Estudos futuros são necessarários para esclarecer melhor estes mecanismos.
69
69
REFERÊNCIAS
Ainsworth, E.A.; Gillespie, K.M. (2007) Estimation of total phenolic content and other
oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteau reagent. Nature
Protocols, 2 (4), 875-877.
Blecker, C., Fougnies, C., Van Herck, J. C., Chevalier, J. P., Paquot, M. (2002).
Kinetic study of the acid hydrolysis of various oligofructose samples. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 50(6), 1602-1607.
Campos, D., Aguilar‐Galvez, A., Pedreschi, R. (2016). Stability of
fructooligosaccharides, sugars and colour of yacon (Smallanthus sonchifolius)
roots during blanching and drying. International Journal of Food Science &
Technology. 51, 1177-1185.
Causey, J. L., Feirtag, J. M., Gallaher, D. D., Tungland, B. C., Slavin, J. L. (2000).
Effects of dietary inulin on serum lipids, blood glucose and the gastrointestinal
environment in hypercholesterolemic men. Nutrition Research, 20(2), 191-201.
Chen, G. L., Chen, S. G., Xie, Y. Q., Chen, F., Zhao, Y. Y., Luo, C. X., Gao, Y. Q.
(2015). Total phenolic, flavonoid and antioxidant activity of 23 edible flowers
subjected to in vitro digestion. Journal of Functional Foods, 17, 243-259.
Chu, Y. F., Sun, J. I. E., Wu, X., Liu, R. H. (2002). Antioxidant and antiproliferative
activities of common vegetables. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 50(23), 6910-6916.
Cicco, N.; Lanorte, M.T.; Paraggio, M.; Viggiano, M.; Lattanzio, V. (2009). An
reproducible rapid and inexpensive Folin-Ciocalteau-method in determining
phenolic of plant methanolic extracts. Michochemical Journal, 91 (1), p. 107-
110.
Cicco, N.; Lattanzio, V. (2011) The influence of initial carbonate concentration on the
Folin-Ciocalteau Micro-Method for the determination of phenolics with low
concentration in the presence of methanol: a comparative study of real-time
monitored reactions. American Journal of Analytical Chemistry, 2, 840-848.
Costa, N. M. B., Rosa, C. D. O. B. (2010). Alimentos Funcionais–componentes
bioativos e efeitos fisiológicos. Editora Rubio.
70
70
Dávalos, A., Gómez-Cordovés, C., Bartolomé, B. (2004). Extending applicability of
the oxygen radical absorbance capacity (ORAC-fluorescein) assay. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 52, 48–54.
Delgado, G. T. C.; Thome, R. G. D. L.; Tamashiro, W. M.; Pastore, G. M (2012).
Yacon (Smallanthus sonchifolius)-derived fructooligosaccharides improves the
immune parameters in the mouse. Nutrition Research, 32(11), 884-892.
Fernández, C. E., Lipavska, H., Milchl, J. (1997). Determination of saccharides
content in different ecotypes of yacon (Polymixia sonchifolia poepp. and
endlicher) cultivated under conditions of Czech Republic. Agricultura Tropica et
Subtropica. UniVersitas Agriculturae Praga, 30, 79-89.
Fiol, M., Adermann, S., Neugart, S., Rohn, S., Mügge, C., Schreiner, M., Kroh, L. W.
(2012). Highly glycosylated and acylated flavonols isolated from kale (Brassica
oleracea var. sabellica)—Structure–antioxidant activity relationship. Food
Research International, 47(1), 80-89.
Jovanovic-Malinovska, R., Kuzmanova, S., Winkelhausen, E. (2014).
Oligosaccharide profile in fruits and vegetables as sources of prebiotics and
functional foods. International Journal of Food Properties, 17(5), 949-965.
Kamiloglu, S., Toydemir, G., Boyacioglu, D., Beekwilder, J., Hall, R. D., Capanoglu,
E. (2016). A review on the effect of drying on antioxidant potential of fruits and
vegetables. Critical reviews in food science and nutrition, 56 (1), 110-129.
Landete, J. M. Updated knowledge about polyphenols: functions, bioavailability,
metabolism, and health (2012). Critical reviews in food science and nutrition, 52
(10), 936-948.
Le, K.; Chiu, F.; Ng, K. (2007) Identification and quantification of antioxidantes in
Fructus lycii. Food Chemistry, 105 (1), 353-363.
Minekus, M., Alminger, M., Alvito, P., Ballance, S., Bohn, T., Bourlieu, C., Dufour, C.
(2014). A standardised static in vitro digestion method suitable for food–an
international consensus. Food & Function, 5(6), 1113-1124.
Moure, A., Cruz, J. M., Franco, D., Dom nguez, . M., ineiro, ., Dom nguez, .,
Parajó, J. C. (2001). Natural antioxidants from residual sources. Food
Chemistry, 72(2), 145-171.
71
71
Pavan, V., Sancho, R. A. S., Pastore, G. M. (2014). The effect of in vitro digestion on
the antioxidant activity of fruit extracts (Carica papaya, Artocarpus heterophillus
and Annona marcgravii). LWT-Food Science and Technology, 59(2), 1247-
1251.
Roberfroid, M., Gibson, G. R., Hoyles, L., McCartney, A. L., Rastall, R., Rowland, I.,
Guarner, F. (2010). Prebiotic effects: metabolic and health benefits. British
Journal of Nutrition, 104(S2), S1-S63.
Ryan, L., & Prescott, S. L. (2010). Stability of the antioxidant capacity of twenty-five
commercially available fruit juices subjected to an in vitro digestion.
International Journal of Food Science & Technology, 45, 1191-1197.
Saad, S. M. I., Cruz, A. G. D., Faria, J. D. A. F. (2011). Probióticos e prebióticos em
alimentos: fundamentos e aplicações tecnológicas. Varela.
Sancho, R. A. S., Pavan, V., Pastore, G. M. (2015). Effect of in vitro digestion on
bioactive compounds and antioxidant activity of common bean seed
coats. Food Research International, 76, 74-78.
Sancho, R. A. S., Souza, J. D. R.P., de Lima, F. A., Pastore, G. M. (2017). Evaluation
of oligosaccharide profiles in selected cooked tubers and roots subjected to in
vitro digestion. LWT-Food Science and Technology, 76, 270-277.
Scheid, M. M. A., Genaro, P. S., Moreno, Y. M. F., Pastore, G. M. (2014). Freeze-
dried powdered yacon: effects of FOS on serum glucose, lipids and intestinal
transit in the elderly. European journal of nutrition, 53(7), 1457-1464.
Sicari, V., Pellicanò, T. M., Giuffrè, A. M., Zappia, C., Capocasale, M. (2016).
Bioactive compounds and antioxidant activity of citrus juices produced from
varieties cultivated in Calabria. Journal of Food Measurement and
Characterization, 10(4), 773-780.
Singh, B., Singh, J. P., Kaur, A., Singh, N. (2016). Bioactive compounds in banana
and their associated health benefits–A review. Food chemistry, 206, 1-11.
Sun, J., Chu, Y. F., Wu, X., Liu, R. H. (2002). Antioxidant and antiproliferative
activities of common fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(25),
7449-7454.
72
72
Ydjedd, S., Bouriche, S., L pez-Nicolás, R., ánchez-Moya, T., Frontela-Saseta, C.,
Ros-Berruezo, G., Kati, D. E. (2017). Effect of in Vitro Gastrointestinal Digestion
on Encapsulated and Nonencapsulated Phenolic Compounds of Carob
(Ceratonia siliqua L.) Pulp Extracts and Their Antioxidant Capacity. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 65, 827-835.
Wootton-Beard, P. C., Ryan, L. (2011). A beetroot juice shot is a significant and
convenient source of bioaccessible antioxidants. Journal of functional
foods, 3(4), 329-334.
73
73
CAPÍTULO III
DESENVOLVIMENTO DE BEBIDA MISTA DE VEGETAIS E ESTUDO DA
CAPACIDADE ANTIOXIDANTE E PREBIÓTICA NA DIGESTÃO IN VITRO
Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos,
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Rua Monteiro Lobato, 80, Cidade
Universitária Zeferino Vaz, 13083-862, Campinas, SP, Brasil
Jane Delane Reis Pimentel Souza, Renata Aparecida Soriano Sancho, Gustavo
Araújo Pereira, Henrique Silvano Arruda, Eduardo Adilson Orlando, Juliana Azevedo
Lima Pallone, Marcio Schmiele, Glaucia Maria Pastore
Manuscrito em preparação para ser submetido à revista LWT - Food Science and
Technology
74
74
RESUMO
Conciliar os bons hábitos alimentares com a rotina agitada é preocupação para um
grupo de consumidores que busca praticidade sem abrir mão de uma alimentação
equilibrada. Atendendo a esta necessidade, o mercado de bebida mista de vegetais
(BMV) tem crescido e serve também àquelas pessoas que não tem o hábito de
consumir de vegetais in natura, mas consomem sucos. O objetivo deste trabalho foi
elaborar e caracterizar uma BMV, contendo couve, yacon, laranja, limão, hortelã,
banana e manga, bem como avaliar sua capacidade antioxidante (ABTS e ORAC),
conteúdo de compostos fenólicos, e conteúdo de fruto-oligossacarídeos (FOS),
glicose, frutose e sacarose por cromatografia (HPAEC-PAD), antes e após as fases
gástrica e intestinal da digestão in vitro. A BMV foi caraterizada quanto a
composição centesimal, pH, sólidos solúveis, acidez total titulável, cor e minerais,
além da análise sensorial. A BMV elaborada destacou-se quanto ao conteúdo de
minerais: manganês, cobre, potássio, magnésio e cálcio, ademais, teve baixo teor de
lipídeos e proteína. A digestão in vitro da BMV revelou que os FOS podem ser
parcialmente degradados, possivelmente devido à acidez inerente à fase gástrica da
digestão. Os compostos fenólicos e a capacidade antioxidante aumentaram com a
digestão in vitro. A avaliação sensorial da BMV mostrou que a bebiba teve boa
aceitação com relação ao sabor, cor e aroma, mas mudanças são necessárias para
melhorar a consistência da bebida.
Palavras-chave: Fruto-oligossacarídeos, compostos fenólicos, minerais, análise
sensorial.
75
75
ABSTRACT
Harmonize good eating habits with the hectic routine is a concern for a group of
consumers who seek practicality without giving up a balanced diet. Given this
requirement, beverage of blend vegetables market (BMV) has grown and serves also
those people who are not in the habit of consuming fresh vegetables but consume
juices. The objective of this work was to elaborate and characterize a BMV
containing kale, yacon, orange, lemon, mint, banana and mango, as well as to
evaluate its antioxidant capacity (ABTS and ORAC), phenolic compounds content
and fructooligosaccharides content FOS), glucose, fructose and sucrose by
chromatography (HPAEC-PAD), before and after the gastric and intestinal phases of
in vitro digestion. BMV was characterized as centesimal composition, pH, soluble
solids, titratable total acidity, color and minerals, as well as sensorial analysis. The
elaborated BMV stood out for the content of minerals: manganese, copper,
potassium, magnesium and calcium, in addition, had low content of lipids and
protein. In vitro BMV digestion revealed that FOS may be partially degraded, possibly
due to the acidity inherent in the gastric phase of the digestion. Phenolic compounds
and antioxidant capacity increased with in vitro digestion. The sensory evaluation of
the BMV showed that the beverage had good acceptance regarding flavor, color and
aroma, but changes are necessary to improve the consistency of the beverage.
Key-words: fructooligosaccharides, phenolic compounds, minerals, sensory
evaluation
76
76
1.0 - INTRODUÇÃO
Atendendo às necessidades contemporâneas dos consumidores que
buscam produtos que ofereçam praticidade, bons atributos nutricionais e sensoriais,
a indústria alimentícia tem investido no desenvolvimento de alimentos que
apresentem estas características (Barrett & Lloyd, 2012; Andres, Villanueva &
Tenorio, 2016).
As pesquisas também avançam nessa área, no sentido de atender a
demanda por produtos inovadores e com apelo funcional - capacidade antioxidante e
prebióticos – por exemplo. Estes alimentos, além de apresentarem este diferencial,
precisam ter propriedades sensoriais agradáveis e, de preferência, ser de fácil
preparo ou prontos para o consumo (Falguera, Aliguer, & Falguera, 2012; Pimentel
et al., 2015; Dionisio et al., 2016).
Refletindo esta tendência, recentemente, houve um aumento no interesse
em bebidas mistas de vegetais, que são comumente chamadas de smoothies,
preparadas por mistura, em proporções adequadas, de diferentes ingredientes
naturais (Dionisio et al., 2016). O consumo de bebidas mistas de vegetais (BMV)
pode atender ainda ao mercado de consumidores que rejeitam ou não tem o hábito
de comer vegetais, mas adotam o consumo de sucos. Torna-se, portanto, uma
alternativa para a ingestão de vitaminas, minerais e compostos bioativos.
Em estudos recentes foram investigados, desde capacidade antioxidante
e conteúdo de fenólicos a composição físico-química e análise sensorial de
diferentes tipos de smoothies, com composições bem variadas de frutas e hortaliças
(Nowicka et al., 2016; Park et al., 2016). Nota-se grande diversidade na composição
destas bebidas, muitas vezes valorizando os vegetais de produção regional e/ou
nacional.
Os FOS estão naturalmente presentes em alguns vegetais, frutas,
hortaliças e em raízes e tubérculos (Jovanovic-Malinovska et al., 2014; Sancho et
al., 2016). Os principais tipos de FOS reportados na literatura são: kestose (GF2),
nistose (GF3) e 1-fructofuranosil nistose (GF4) (Delgado et al., 2010). Considerando
o recente interesse pelos efeitos positivos à saúde deste grupo de compostos
funcionais houve grande desenvolvimento nas técnicas de sua utilização em
alimentos. Os FOS podem ser empregados em vários tipos de alimentos e são uma
alternativa vantajosa por agregarem as fibras e influenciarem pouco no sabor,
77
77
auxiliando na microbiota intestinal sem comprometer a aceitação dos produtos
(Kuntz et al., 2013).
Por ser uma fonte abundante de FOS há um crescente interesse científico
no yacon, pois seu consumo está relacionado à promoção de benefícios à saúde
humana, tais como: efeito anti-diabético e redução do LDL – colesterol, atividade
antioxidante, prevenção contra câncer de cólon e melhora da função gastrointestinal
(Sheid et al., 2014; Sousa et al., 2015; De Moura et al., 2012; Genta et al., 2009).
Diferentes sugestões de consumo do yacon são relatados na literatura: em pó como
sugerido por Sheid et al. (2014) e Franco et al. (2015), desidratado (De Oliveira et
al., 2016) e adicionado a sucos de frutas com apelo de bebida funcional, tendo boa
aceitação sensorial (Dionísio et al., 2016).
Os FOS são prebióticos, e por definição, devem passar pelo processo
digestivo e chegarem intactos ao cólon para serem fermentados pelas bactérias,
notadamente bifidobactérias e lactobacilus (Saad, Cruz & Faria, 2011). Para ratificar
este conceito, uma alternativa é utilizar métodos in vitro que simulam processos de
digestão, e assim estudar o comportamento gastro-intestinal de alimentos diversos.
Os métodos in vitro têm a vantagem de serem mais rápidos, menos trabalhosos, de
fácil reprodutibilidade, com condições controladas e sem restrições éticas (Minekus
et al., 2014, Sancho et al., 2016). Tudo isso torna os modelos in vitro muito
adequados para construção de hipóteses (Minekus et al., 2014). Ademais, a análise
da estabilidade da capacidade antioxidante após a digestão pode ajudar a fornecer
informações fisiológicas de forma rápida e econômica (Ryan e Prescott, 2010).
Este estudo teve como objetivos: i) elaborar e caracterizar uma bebida
mista de vegetais (BMV); ii) analisar o efeito da digestão in vitro sobre o conteúdo de
compostos fenólicos, capacidade antioxidante e FOS nas fases gástrica e intestinal
da digestão da BMV; iii) realizar a análise sensorial da bebida.
2.0 - MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material
Os padrões de Kestose (GF2), Nistose (GF3), Frutofuranosil – nistose
(GF4) foram adquiridos da marca Wako (Japão) e os padrões de Maltotriose (G3);
78
78
Maltotetrose (G4); Maltopentose (G5), Maltohexose (G6), Heptahexose (G7), Glicose
da Supelco (USA), Sacarose e Frutose da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, EUA).
Os reagentes hidróxido de sódio e acetato de sódio grau HPLC utilizados
foram da Merck (Darmstadt, Alemanha) e a água purificada pelo sistema Milli-Q
(Millipore, Bedford, EUA).
Padrões de catequina, ácido gálico, kaempferol e quercetina e os
reagentes ABTS (2′2-azino-bis(3-etilbenzotriasolina-6-ácido sulfônico)), Trolox (6-
hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico), AAPH (2,2'-azobis(2-metil-
propianamidina)dicloridrato), fluoresceína, extrato de bile de suíno (B-8631), pepsina
da mucosa gástrica de suíno (EC 3.4.23.1, P-7000), pancreatina de pâncreas suíno
(4×USP—US Pharmacopeia specifications, P-1750) foram obtidos da Sigma-Aldrich
Co. (St. Louis, USA). Todos os outros produtos químicos e solventes utilizados foram
de grau analítico.
2.2 - Formulação da bebida
Os vegetais, adquiridos na Central de Abastecimento de Campinas – SP
(CEASA) e utilizados na elaboração da bebida mista de vegetais (BMV) foram:
manga Tommy (Mangifera indica L.), banana nanica (Musa Cavendishii L.), laranja
pera (Citrus sinensis), limão Taiti (Citrus Aurantifolia), couve manteiga (Brassica
oleracea var acephala), hortelã (Mentha s.p.) e yacon (Smallanthus sonchifolius).
Inicialmente os vegetais foram lavados em água corrente e sanitizados por imersão
em solução de 200 ppm de cloro ativo por 10 min. Na sequência, houve o enxágue
em solução de 3 ppm de cloro ativo. As bebidas foram preparadas utilizando uma
centrífuga juicer Philips Walita, modelo RI1865. Alíquotas da bebida foram
separadas em eppendorf e armazenadas a -80ºC até o momento das análises.
A elaboração da bebida foi feita seguindo formulação obtida por Dantas
(2014) com algumas modificações. Na Tabela 1 estão apresentados os percentuais
de cada vegetal nas formulações.
79
79
Tabela 1. Percentuais de cada ingrediente nas formulações de bebida mista de
vegetais.
Vegetal BMV 1 (%) BMV 2 (%) BMV 3 (%)
Manga 35 27 24
Banana 16 14 24
Laranja 26 25 24
Limão 2 2 2
Couve 10 10 10
Hortelã 1 2 1
Yacon 10 20 15
2.3 - Caracterização da bebida mista de vegetais (BMV)
As análises descritas a seguir foram realizadas apenas na formulação
determinada na fase anterior que conteve a maior concentração de compostos
fenólicos e FOS.
2.3.1 - Composição centesimal
As determinações de umidade, proteínas, cinzas e lipídeos da bebida
foram realizadas pelos métodos n°44-15.02, n°46-13.01, n°08-12.01 e n°30.25.01 da
AACCI (2011), respectivamente. Os carboidratos totais foram determinados por
diferença e esse valor inclui a fração de fibra alimentar. As análises foram realizadas
em triplicata.
2.3.2 - pH
A medição do pH foi feita em uma alíquota de 20mL das amostras de
bebida, em pH-metro de bancada da marca Ajmicronal modelo AJX-511, seguindo-
se metodologia da AOAC (2006).
80
80
2.3.3 - Sólidos solúveis
Os Sólidos solúveis totais foram determinados por refratometria, utilizando
um refratômetro de bancada BEL, seguindo-se metodologia descrita na AOAC
(2006). Os valores foram expressos em ºBrix.
2.3.4 - Acidez total titulável
A acidez total titulável (ATT) foi determinada titulando-se 1 g de suco
diluído em 50 mL de água destilada, com NaOH a 0,1N, utilizando a fenolftaleína
como indicador (AOAC, 2006). Os valores foram expressos em porcentagem de
acidez.
2.3.5 - Cor
A cor das amostras foi avaliada em colorímetro Ultra Scan Vis 1043
(Hunter Lab, Reston, EUA). As medidas de cor foram expressas em termos da
luminosidade L* (L* = 0 preto e L*= 100 branco) e da cromaticidade definida por a*
(+a* = vermelho e –a* = verde) e b* (+b* = amarelo e –b* = azul).
2.3.6 - Composição de minerais
Para mineralização das amostras pesou-se 0,4 g de amostras em tubo de
digestão. Adicionou-se 4mL de ácido nítrico concentrado e digeriu-se por 2 horas a
100º C que em bloco digestor (M242, Quimis). Foram adiconados mais 2mL de ácido
nítrico e 2 mL de peróxido de hidrogênio e digeriu-se por mais 2 horas a 110º C. Em
seguida, as amostrs foram deixadas em ultrasom por 10 minutos e transferidas
para balão volumétrico de 25mL e completou-se o volume, para filtrar utilizou-se filtro
de papel filtro quantitativo. A solução resultante foi utilizada para análise dos
minerais.
Cálcio, cobre, ferro, potássio, magnésio, manganês e zinco foram
analisados em Espectrômetro de Absorção Atômica em Chama, Perkin Elmer,
Modelo AAnalyst 200 e software Winlab 32 (EUA), para determinação os
comprimentos de onda foram: ferro (248,3 nm), cálcio (422,67 nm), magnésio
81
81
(285,21 nm), zinco (213,86 nm), potássio (766,49 nm) cobre (324,75 nm) e
manganês (279,48 nm), (Perkin Elmer) como proposto por Silva et al. (2016).
Para a construção de curvas analíticas, utilizamos soluções padrão de
cálcio, cobre, ferro, fósforo, magnésio, manganês e zinco (Sigma-Aldrich),
relacionado absorvância X concentração. As soluções foram preparadas em água
ultrapura do sistema Sartorius, o modelo Arium Confort (EUA) e filtrada em papel de
filtro quantitativo sem cinzas (Nalgon, 9 cm de diâmetro)
Apenas os elementos Sódio e Potássio foram medidos por Emissão
atômica em chama conforme recomendação da Perkin (EUA). Os resultados foram
expressos em mg do mineral/ 100mL da bebida.
2.3.7 - Carboidratos
A análise dos carboidratos foi realizada através do sistema de
cromatografia de íons acoplada ao detector amperométrico pulsado (HPAEC-PAD),
software de Automação Cromatográfica Chromeleon 7.0 CHM-1, da Dionex (USA),
utilizando a bomba Single Grad Degas. A coluna Carbopac PA-100 foi utilizada para
os oligossacarídeos, com eluição: solução A (500 mM de acetato de sódio e 100 mM
de hidróxido de sódio) e solução B (100 mM de hidróxido de sódio). A coluna
Carbopac PA-1 foi utilizada para glicose, frutose e sacarose, com eluição de
hidróxido de sódio (180 mM) e 200 mM para limpeza. A temperatura mantida a 30ºC
e o fluxo de 1,0 mL por minuto. As amostras foram diluídas em água e filtradas em
filtros de membrana 0,22 μm. Os compostos foram identificados por comparação dos
tempos de retenção dos compostos encontrados nas amostras com os padrões de
açúcares nas mesmas condições. Os oligossacarídeos foram analisados conforme
Sancho et al. (2016).
2.3.8 - Determinação dos Compostos fenólicos
Os teores de fenólicos foram determinados utilizando o reagente de Folin-
Ciocalteu de acordo com método descrito por Cicco et al.. (2009), com modificações
propostas por Ainsworth e Gillespie (2007) Cicco e Lattanzio (2011). Em resumo,
misturaram-se 100 μL de amostra, 100 μL de reagente olin-Ciocalteu (50% v / v) e
800 μL de Na2CO3 (5% m / v), seguido de incubação à temperatura ambiente
82
82
durante 20 minutos. A absorbância foi medida a 760 nm contra um branco em
espectrofotômetro UV-Vis (Beckman, modelo DU600, CA, EUA). Utilizou-se etanol a
40% (v / v) para as amostras, soluções de calibração e preparação em branco.
Preparou-se o reagente 50% Folin-Ciocalteu (v/ v) e carbonato de sódio a 5% (p / v)
em água deionizada. O ácido gálico foi utilizado para a curva de calibração com uma
faixa de concentração de 2,5-50,0 μg / mL. Os resultados foram expressos em mg
de equivalentes de ácido gálico por 100 mL de amostra (mg GAE / 100 mL).
2.3.9 - Capacidade antioxidante
2.3.9.1 - TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) – captura do radical
2′2-azino-bis(3-etilbenzotriasolina)-6-ácido sulfônico (ABTS•+)
A capacidade antioxidante foi determinada pelo método TEAC conforme
metodologia descrita por Le et al. (2007). O radical ABT •+ foi gerado pela reação
de ABTS 7mM com persulfato de potássio 140 mM, armazenado ao abrigo da luz e
a temperatura ambiente por 16 h. O Trolox foi utilizado como antioxidante padrão
para elaboração da curva de calibração, nas concentrações de 10 a 250 μM, sendo
representada graficamente como porcentagem de inibição (%) por concentração de
Trolox. A absorbância foi medida a 734 nm em espectrofotômetro UV-Vis (Beckman,
modelo DU600, CA, EUA). O resultado foi expresso em μM equivalente de Trolox/g
de amostra.
2.3.9.2 - ORAC – Oxygen Radical Absorbance Capacity
A capacidade antioxidante pelo método ORAC foi determinada em leitor
de microplaca NOVOstar (BMG Labtech, Offenburg, Germany), acompanhando com
o Software MARS data Analysis versão 1.3 (BMG Labtech, Offenburg, Germany).
Este método é baseado na capacidade fluorescente da fluoresceína sódica na
presença de radicais de oxigênio e foi realizado conforme a metodologia proposta
por Leite et al.. (2011). Primeiramente preparou-se uma solução de tampão fosfato
(75 mmol.L-1, pH 7,4) que foi utilizada para solubilizar a fluoresceína e o AAPH (2,2'-
azobis(2-metil-propianamidina)dicloridrato).
Para a análise foram misturados 20 μL de amostra com 120 μL de
fluoresceína (0,4 μg/mL) e 60 μL do radical AAPH na concentração de 108 mg/mL
83
83
foram adicionados à microplaca e incubados a 37ºC. A leitura foi realizada em 520
nm de emissão e 485 nm de excitação, através do decaimento da emissão de
fluorescência em função do tempo até a estabilização. O padrão Trolox foi utilizado
para elaborar a curva de calibração. Para os cálculos foi utilizada a Equação 1
representa a área abaixo da curva (AUC).
AUC = 1 + f2/f1 + f3/f1 + f4/f1 + fn/f1 (1)
Onde: f1 = leitura da fluorescência no tempo 1 minuto, f2 = leitura da
fluorescência no tempo 2 minutos e fn = leitura da fluorescência no tempo 80
minutos. O resultado final foi expresso em μM equivalentes de Trolox/ 100mL de
amostra.
2.4 - Digestão in vitro
A digestão in vitro foi realizada conforme metodologia de Sancho et al..
(2016) com modificações. Uma alíquota de 1 mL de amostra foi misturada a solução
salina (140 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, e acidificada com HCl 6mol/L a pH 2. A
digestão gástrica consistiu da adição de solução de pepsina (200mg de pepsina em
5mL de HCl 0,1 mol/L) e agitação (130 rpm) a 37ºC por uma hora. Em seguida, o pH
foi ajustado para 6,9 com NaHCO3 1mol/L e a digestão intestinal realizada com
adição de solução de pancreatina e bile (225 mg de extrato bile e 37 mg de
pancreatina em 18,7 mL de 0,1 mol/L de NaHCO3) e mantido a 37ºC por 2 horas
sobre agitação. Uma alíquota (4 mL) da fase gástrica foi retirada e procedeu-se a
remoção das enzimas das amostras. Para isso, foi utilizado o filtro ultracel 3 K de
celulose regenerada de 4 mL da Millipore (Irlanda), e a separação foi realizada
através de centrifugação (Hettich Zentrifugen – Rotanta 460R) (40 min, 9000 rpm,
20ºC), conforme recomendação do fabricante. O mesmo procedimento foi utilizado
para as amostras da digestão intestinal. Decorrida esta etapa, as amostras foram
separadas em microtubos e armazenadas a -80ºC.
Foram submetidos à digestão in vitro amostras de BMV e BMV acrescida
de 6% de maltodextrina (BMVM) e controle no qual utilizou-se água no lugar da
amostra.
Amostras da digestão gástrica e intestinal foram analisadas quanto ao
conteúdo de oligossacarídeos, glicose, frutose e sacarose (BMV e BMVM),
84
84
capacidade antioxidante (BMV) e fenólicos totais (BMV) de acordo com as
metodologias descritas anteriormente.
2.5 - Análise sensorial
Foi aplicado um teste do consumidor, seguindo a metodologia descrita por
Villanueva e Da Silva (2009). A amostra (BMV) foi submetida à avaliação sensorial
por um grupo de 120 consumidores de bebidas de frutas. Foram avaliados os
atributos de aparência, textura, sabor e a bebida de uma forma global por meio de
escala hedônica híbrida, em que gostei muitíssimo = 9, não gostei nem desgostei =
5 e desgostei muitíssimo = 1. Os consumidores também responderam quanto a
intenção de compra do produto (5=certamente compraria, 3=talvez comprasse/talvez
não comprasse e 1 = certamente não compraria).
O projeto foi submetido para apreciação no comitê de ética e pesquisa com
número CAAE: 59368616.6.0000.5404.
2.6 - Análises estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software
STATISTICA, Versão 7.0. Os resultados foram submetidos à ANOVA e teste de
comparação múltipla Tukey, a um nível de 5% de significância. Os resultados foram
apresentados como médias ± desvio padrão para as triplicatas.
3.0 - RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Definição da formulação da BMV
Inicialmente, três formulações diferentes foram elaboradas, a fim de se
obter uma bebida que tivesse o maior conteúdo de compostos fenólicos totais e
FOS.
Na tabela 2 estão apresentados os conteúdos de fenóis totais e FOS para
as 3 formulações de BMV estudas inicialmente. As bebidas 1 e 2 apresentaram,
estatisticamente (p<0,05) o mesmo teor para fenóis, que foi maior do que para
85
85
bebida 3. Como a BMV 2 foi superior as demais quanto ao teor de FOS, foi então a
escolhida para os ensaios seguintes.
Tabela 2. Compostos fenólicos totais e FOS para formulações de bebida mista de
vegetais.
Amostras Fenólicos totais (mg/
100mL)
FOS (mg/ 100mL)
BMV 1 32,85 ± 0,69b 611± 15c
BMV 2 36,36 ± 0,14a 1204 ± 45a
BMV 3 36,15 ± 0,14a 1009 ± 38b
Dados apresentados como média ± desvio padrão de três determinações (n = 3). Médias seguidas
pela mesma letra minúscula na mesma linha não diferem de acordo com o teste de Tukey (p> 0,05).
3.2 - Caracterização da bebida mista de vegetais (BMV)
Como a formulação 2 apresentou o maior conteúdo de fenóis totais e FOS
foram realizadas análises de composição centesimal, minerais e as características
físicas e físico-químicas da BMV (Tabela 3). A bebida destacou-se em sua
composição de minerais, pois, considerando a recomendação diária para adultos
(19-30 anos), em 300 mL da bebida é possível suprir 11% da necessidade de cálcio,
20 % de cobre, 8% de ferro, 13 % de magnésio, 30% de manganês, 17,6% de
potássio, 3% de zinco com apenas 0,7% de sódio (Institute of medicine, 1997, 2001,
2005). Ademais, possui um baixo teor lipídico e proteico, enquanto que se destaca
em seu conteúdo de carboidratos.
Com relação às características físicas e físico-químicas, observa-se que
esta é uma bebida em que predomina a cor verde, com pH ácido (4,17) e acidez
total titulável 0,47%, sólidos solúveis 12,63ºBrix, semelhante a outras bebidas de
vegetais (Di Cagno et al., 2011, Dionísio et al., 2016).
86
86
Tabela 3. Caracterização da bebida mista de vegetais.
Composição centesimal (%)
Umidade 86,25± 0,01
Proteínas 0,62 ± 0,001
Cinzas 0,47 ± 0,004
Lipídeos 0,19 ± 0,007
Carboidratos totais 12,47 ± 0,01
Composição de Minerais (mg/100mL)
Cálcio 36,67± 0,26
Cobre 0,06 ± 0,00
Ferro 0,26 ± 0,04
Magnésio 17,32 ± 0,26
Manganês 0,23 ± ± 0,00
Potássio 273,5 ± 1,33
Sódio 3,79 ± 0,33
Zinco 0,11 ± 0,01
Características Físicas e Físico-Químicas
Atividade de água 0,99 ± 0,00
Sólidos solúveis (ºBrix) 12,63 ± 0,26
pH 4,17 ± 0,05
Acidez Total Titulável1 0,47 ± 0,01
Cor
L* 35,3 ± 0,4
a* -6,4 ± 0,1
b* 33,8 ± 0,3
1(g ácido cítrico/100mL amostra)
Dados apresentados como média ± desvio padrão de três determinações (n = 3).
3.3 - Digestão in vitro
A maioria dos estudos sobre digestão in vitro de matrizes vegetais avalia
apenas a composição antes e ao final da fase intestinal da digestão (Sancho et al.,
2015; Sancho et al., 2017; Pavan et al., 2014; Ryan e Prescott, 2010). Neste estudo
foi mostrado também o resultado da digestão gástrica. Ademais, notou-se que a
realização de um controle da digestão bem como a remoção das enzimas digestivas
87
87
dos homogenatos antes das análises foram medidas importantes para expressar os
resultados reais. Pois, tanto o controle da fase gástrica quanto intestinal também
apresentaram capacidade antioxidante (ORAC e TEAC) e presença de compostos
fenólicos. Isso mostra que as enzimas e/ou demais reagentes utilizados na digestão
in vitro interferem na análise da capacidade antioxidante e dos compostos fenólicos,
superestimando estes valores. Esse fato foi ainda mais expressivo na fase intestinal
da digestão. Na tabela 4, estão apresentados os resultados para os compostos
fenólicos, ORAC e TEAC da BMV na digestão in vitro.
Tabela 4. Efeito da digestão in vitro no conteúdo de compostos fenólicos
totais, TEAC e ORAC na bebida mista de vegetais (BMV).
Fase da digestão Compostos
fenólicos (mg
GAE/100 mL)
ORAC (µmol TE/
100 mL)
TEAC (µmol TE/ 100
mL)
Antes da digestão 38,38 ± 0,29b 870 ± 80a 99,0 ± 2,3b
Digestão gástrica 30,35 ± 0,73c 675 ± 101a 47,5 ± 0,7c
Digestão intestinal 42,15 ±0,32a 907 ± 77a 364,4 ± 20,9a
Dados apresentados como média ± desvio padrão de três determinações (n = 3). Valores na mesma coluna indicados com a mesma letra minúscula não diferem entre si pelo teste de Tukey (p>0,05)
Na digestão in vitro foi observada uma redução do conteúdo de
compostos fenólicos na fase gástrica seguido de um aumento na fase intestinal, o
que pode estar relacionado à liberação de compostos da matriz. Este
comportamento foi igual para a capacidade antioxidante, embora não tenha sido um
efeito significativo (p>0,05) pelo método de ORAC. O comportamento dos
compostos bioativos durante a digestão mostra-se diferenciado nas diversas
matrizes vegetais, podendo aumentar ou diminuir a atividade antioxidante após a
digestão in vitro (Pavan et al., 2014; Ryan e Prescott, 2010). Em parte, o aumento
pode estar relacionado à liberação de compostos da matriz (Pavan et al., 2014).
O efeito do pH pode ser diferente para vários polifenóis. A pH neutro
alguns fenólicos exibiram atividades pró-oxidantes, enquanto que em pH mais baixo
outros exibiram atividades antioxidantes (Ydjedd et al., 2017) No entanto, Phan et al.
(2016) ao avaliarem diferentes fenólicos submetidos a condições diferenciadas de
88
88
pH observaram que alguns compostos são mais sensíveis que outros à alteração de
pH, e que enquanto a disponibilidade de uns podem aumentar em condições ácidas,
outros podem diminuir, e aumentarem por sua vez em condições de neutralidade.
A estabilidade de compostos fenólicos durante o processo digestivo foi
constatada em suco de choqueberry (Bermudez-Soto et al., 2007) enquanto que em
extrato de feijão, houve um decréscimo significativo no conteúdo destes compostos
(Sancho et al., 2015). Isso acontece porque os polifenóis podem sofrer alterações
estruturais nas condições adversas da digestão. Ryan e Prescott (2010) salientam
que é possível que, quando expostas a tais condições, uma proporção dos
compostos seja transformada em outros com diferentes propriedades químicas.
Assim, pode haver variações nas propriedades antioxidantes em função da doação
de hidrogênio ou eliminação de radicais livres. Nota-se que esta diferenciação foi
observada para a BMV, pois pelo método TEAC a capacidade antioxidante da
bebida na fase intestinal foi muito superior à fase gástrica e antes da digestão,
enquanto para o ORAC esta diferença não foi significativa (p>0,05).
Com relação aos FOS, a digestão in vitro resultou em redução de seu
conteúdo na BMV (FIGURA 1). Houve diminuição de 15% no GF2, 16% no GF3 e
17% no GF4 ao final da fase intestinal. Embora seja considerado que a acidez
gástrica e o tempo de permanência dos FOS no estômago possam ser insuficientes
para produzir clivagem química significativa (Damodaran, Parkin e Fennema, 2010),
alguns estudos demonstraram que FOS são degradados em condições de alta
acidez (Campos et al., 2016, Bleker et al., 2002). Os resultados obtidos demonstram
que a redução dos FOS ocorreu na fase gástrica da digestão (Figura 1).
Os FOS são compostos prebióticos e estão inseridos neste grupo
justamente por sua capacidade de chegarem ao cólon e serem fermentado pelas
bactérias intestinais (Saad, Cruz e Faria, 2011). No entanto, estes resultados
sugerem que nem todo o conteúdo ingerido tem a capacidade de passar intacto pelo
sistema digestório. Desta maneira, estudos mais aprofundados devem investigar a
relação entre a quantidade inicial de prebióticos relatada pelo produto e o que
efetivamente chega ao cólon para ser utilizado pelos micro-organismos probióticos.
Já que esta sim deveria ser a quantidade levada em consideração para determinar
se o produto pode ou não ser denominado como prebiótico.
89
89
Figura 1. Perfis de oligossacarídeos e glicose, frutose e sacarose, das bebidas mistas de vegetais antes e após a digestão. Os valores são médias ± desvio padrão (n=3). GF2 - 1-kestose, GF3 - nistose, GF4 - 1 – fructofuranosil-nistose, G3 - maltotriose, G4 - maltotetraose, G5 - maltopentaose, G6 - maltohexaose, G7 – maltoheptaose, GLI – glicose, FRU – frutose, SAC – sacarose.
a a
a c
c
b
b b
c
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
GF2 GF3 GF4
mg
/100m
L
BMV
A
a
a
a
a
a
a
a
a
a
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
GLI FRU SAC
g/1
00m
L
BMV
B
a a
a
b b
b
b b
b
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
GF2 GF3 GF4
mg
/100m
L
BMVM
C
a
a
a
a b
b
a b
b
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
GLI FRU SAC
g/1
00m
L
BMVM
D
b a a a a b b b b b
a
c c c c 0
500
1000
1500
2000
2500
G3 G4 G5 G6 G7
mg
/100m
L
BMVM
Antes da Digestão Digestão Gástrica Digestão Intestinal
E
90
90
Não houve variação significativa (p>0,05) no conteúdo de glicose, frutose
e sacarose na digestão in vitro para a amostra BMV, diferente da BMVM em que
houve redução destes açúcares.
A maltodextrina deve ser digerida e por isso é uma alternativa na
verificação da eficácia do processo digestivo in vitro adotado. O método de digestão
in vitro realizado foi eficiente para simular o processo digestivo. Os MALTOS, a partir
do G4, por exemplo, foram hidrolisados em sua totalidade, havendo,
consequentemente um aumento de G3. Estes resultados corroboram com Sancho et
al. (2016) que investigaram a digestão in vitro de raízes e tubérculos.
3.4 - Análise sensorial
A BMV foi submetida a um teste de consumidor. Houve boa aceitação da
amostra para a maioria dos parâmetros avaliados, sendo que o sabor se destacou
com uma média de 7,18±1,67 (gostei moderadamente) seguido do aroma 7,0±1,9
(gostei moderadamente), cor 6,35±1,95 (gostei ligeiramente), aparência 5,44±2,18
(gostei ligeiramente – indiferente) e finalmente a textura com 4,97±2,2 (indiferente)
sendo rejeitada por parte dos avaliadores. Muitos deles relataram se surpreender
com o sabor, ao passo que a consistência da bebida estava muito viscosa, com
comentários do tipo ―sabor muito agradável‖, ―muito gostoso e refrescante, mas
deveria ser menos viscosa‖ ―cor e aroma muito bons, poderia ser mais líquida‖, entre
outros. Como impressão global a média da avaliação foi de 6,46±1,58, que estaria
entre gostei ligeiramente/moderadamente.
É possível que o yacon tenha apresentado pouca influência sobre a
aceitação de características como sabor, cor e aroma da BMV, como constatado em
sucos de frutas tropicais (Dionísio et al., 2016)
A consistência da bebida foi provavelmente o fator que deixou os
provadores em dúvida se comprariam ou não a BMV (37%), seguidos de 34% que
provavelmente comprariam e 18% que certamente comprariam. Apenas 11% dos
avaliadores relataram que provavelmente/certamente não a comprariam (Figura 2).
A consistência é sem dúvida um parâmetro de qualidade muito
importante, mas no caso da BMV não será difícil de ser melhorada para enfim
atender melhor aos anseios dos consumidores.
91
91
Figura 2. Intenção de compra para a BMV.
4.0 - CONCLUSÃO
A BMV desenvolvida obteve um baixo valor lipídico e apresentou rica
composição de minerais, notadamente manganês, cobre, potássio, magnésio e
cálcio.
A digestão in vitro da BMV revelou que os FOS podem ser parcialmente
degradados, possivelmente devido à acidez inerente à fase gástrica da digestão.
Este é um fator importante a ser considerado antes de definir a capacidade
prebiótica dos alimentos, já que a quantidade que chega intacta ao cólon é a que
deve ser contabilizada para definir o alimento como prebiótico.
Os compostos fenólicos e atividade antioxidante aumentaram com a
digestão in vitro. Ter utilizado um controle para digestão foi imprescindível para obter
o resultado real destas análises, uma vez que tanto o controle da digestão gástrica,
quanto intestinal também apresentaram atividade antioxidante e fenóis, sendo ainda
mais expressivo na fase intestinal.
A avaliação sensorial da BMV mostrou que a bebida tem potencial para
ser comercializada, pois teve boa aceitação com relação ao sabor, cor e aroma. No
entanto mudanças são necessárias para melhorar a consistência da bebida visando
aumentar a intenção de compra por parte dos consumidores.
0 10 20 30 40
certamente não compraria
provavelmente não compraria
tenho dúvidas se compraria
Provavelmente compraria
Certamente compraria
% de provadores
92
92
REFERÊNCIAS
AACCI, American Association of Cereal Chemists International. (2011). Approved
Methods of Analysis. (American Association of Cereal Chemists International,
Ed.) Approved Methods of Analysis (11th ed.). St. Paul: American Association
of Cereal Chemists International.
AOAC, Association of Official Agricultural Chemists. (2006). Official methods of
analysis of the Association of Official Analytical Chemists. (W. Howitz & G. W.
Latimer Jr, Eds.) (18th ed.). Gaithersburg: AOAC International.
Ainsworth, E.A.; Gillespie, K.M. (2007) Estimation of total phenolic content and other
oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteau reagent. Nature
Protocols, 2 (4), 875-877.
Andrés, V., Villanueva, M. J., Tenorio, M. D. (2016). The effect of high-pressure
processing on colour, bioactive compounds, and antioxidant activity in
smoothies during refrigerated storage. Food chemistry, 192, 328-335.
Barrett, D. M., Lloyd, B. (2012). Advanced preservation methods and nutrient
retention in fruits and vegetables. Journal of the Science of Food and
Agriculture, 92(1), 7-22.
Bermu´dez-Soto, M.J., Toma´s-Barbera´ n, .A. Garc ´a-Conesa, M.T. (2007).
Stability of polyphenols in chokeberry (Aronia melanocarpa) subjected to in vitro
gastric and pancreatic digestion. Food Chemistry, 102, 865–874.
Blecker, C., Fougnies, C., Van Herck, J. C., Chevalier, J. P., Paquot, M. (2002).
Kinetic study of the acid hydrolysis of various oligofructose samples. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 50(6), 1602-1607.
Campos, D., Aguilar‐Galvez, A., Pedreschi, R. (2016). Stability of
fructooligosaccharides, sugars and colour of yacon (Smallanthus sonchifolius)
roots during blanching and drying. International Journal of Food Science &
Technology, 51, 1177-1185.
93
93
Cicco, N.; Lanorte, M.T.; Paraggio, M.; Viggiano, M.; Lattanzio, V. (2009). An
reproducible rapid and inexpensive Folin-Ciocalteau-method in determining
phenolic of plant methanolic extracts. Michochemical Journal, 91 (1), 107-110.
Cicco, N.; Lattanzio, V. (2011) The influence of initial carbonate concentration on the
Folin-Ciocalteau Micro-Method for the determination of phenolics with low
concentration in the presence of methanol: a comparative study of real-time
monitored reactions. American Journal of Analytical Chemistry, 2, 840-848.
Damodaran, S., Parkin, K., Fennema, O. (2010). Química de Alimentos 4th ed., Porto
Alegre. ISBN 978-85-363-2248-3.
Dantas, E. M. Caracterização e avaliação das atividades antioxidante e
antiproliferativa e do efeito citotóxico de bebidas funcionais liofolizadas
compostas por frutas e hortaliças (Green Smoothies). 2014. 206p. Tese
(Doutorado em Ciência de Alimentos) – Faculdade de Engenharia de
Alimentos, UNICAMP, Campinas.
Dávalos, A., Gómez-Cordovés, C., Bartolomé, B. (2004). Extending applicability of
the oxygen radical absorbance capacity (ORAC-fluorescein) assay. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 52, 48–54.
Delgado, G. T. C., Tamashiro, W. M., Pastore, G. M. (2010). Immunomodulatory
effects of fructans. Food Research International, 43(5), 1231-1236.
De Moura, N. A., Caetano, B. F., Sivieri, K., Urbano, L. H., Cabello, C., Rodrigues, M.
A., Barbisan, L. F. (2012). Protective effects of yacon (Smallanthus sonchifolius)
intake on experimental colon carcinogenesis. Food and Chemical
Toxicology, 50(8), 2902-2910.
De Oliveira, L. F., Corrêa, J. L. G., de Angelis Pereira, M. C., Ramos, A. D. L. S.,
Vilela, M. B. (2016). Osmotic dehydration of yacon (Smallanthus sonchifolius):
Optimization for fructan retention. LWT-Food Science and Technology, 71, 77-
87.
94
94
Di Cagno, R., Minervini, G., Rizzello, C. G., De Angelis, M., Gobbetti, M. (2011).
Effect of lactic acid fermentation on antioxidant, texture, color and sensory
properties of red and green smoothies. Food Microbiology, 28(5), 1062-1071.
Dionisio, A. P., Wurlitzer, N. J., Goes, T. D. S., Borges, M. D. F., Garruti, D., Araújo,
I. M. D. S. (2016). Estabilidade de uma bebida funcional de frutas tropicais e
yacon (Smallanthus sonchifolius) durante o armazenamento sob
refrigeração. Archivos Latinoamericanos de Nutrición, 66(2), 148-155.
Falguera, V., Aliguer, N., Falguera, M. (2012). An integrated approach to current
trends in food consumption: Moving toward functional and organic
products?. Food Control, 26(2), 274-281.
Franco, T. S., Perussello, C. A., Ellendersen, L. D. S. N., Masson, M. L. (2015).
Foam mat drying of yacon juice: Experimental analysis and computer
simulation. Journal of Food Engineering, 158, 48-57.
Genta, S., Cabrera, W., Habib, N., Pons, J., Carillo, I. M., Grau, A., Sánchez, S.
(2009). Yacon syrup: beneficial effects on obesity and insulin resistance in
humans. Clinical Nutrition, 28(2), 182-187.
Institute of Medicine (1997) Dietary reference intakes for calcium, phosphorus,
magnesium, vitamin D, and fluoride. Washington, DC. The National Academies
Press.
Institute of Medicine (2001) Dietary reference intakes for Vitamin A, Vitamin K,
Arsenic, Boron, Chromium, Copper, Iodine, Iron, Manganese, Molybdenum,
Nickel, Silicon, Vanadium, and Zinc . Washington, DC. The National Academies
Press
Institute of Medicine (2005) Dietary reference intakes for Water, Potassium, Sodium,
Chloride, and Sulfate. Washington, DC. The National Academies Press
Jovanovic-Malinovska, R., Kuzmanova, S., & Winkelhausen, E. (2014).
Oligosaccharide profile in fruits and vegetables as sources of prebiotics and
functional foods. International Journal of Food Properties, 17(5), 949-965.
95
95
Kuntz, M. G., Fiates, G. M., Teixeira, E. (2013). Characteristics of prebiotic food
products containing inulin. British Food Journal, 115(2), 235-251.
Le, K., Chiu, F., Ng, K. (2007). Identification and quantification of antioxidants in
Fructus lycii. Food Chemistry, 105(1), 353-363.
Leite, A.V., Malta, L.G., Riccio, M.F., Eberlin, M.N., Pastore, G.M., Maróstica Júnior,
M.R. (2011). Antioxidant potential of rat plasma by administration of freeze-
dried jaboticaba peel (Myrciaria jaboticaba Vell Berg). Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 59, 2277–2283.
Minekus, M., Alminger, M., Alvito, P., Ballance, S., Bohn, T., Bourlieu, C., Dufour, C.
(2014). A standardised static in vitro digestion method suitable for food–an
international consensus. Food & function, 5(6), 1113-1124.
Nowicka, P., Wojdyło, A., Teleszko, M., Samoticha, J. (2016). Sensory attributes and
changes of physicochemical properties during storage of smoothies prepared
from selected fruit. LWT-Food Science and Technology, 71, 102-109.
Park, Y. ., am, K. ., Park, Y. K., Leontowicz, ., Leontowicz, M., Namieśnik, .,
Gorinstein, S. (2016). The effects of treatment on quality parameters of
smoothie-type 'Hayward' kiwi fruit beverages. Food Control, 70, 221-228.
Pavan, V., Sancho, R. A. S., Pastore, G. M. (2014). The effect of in vitro digestion on
the antioxidant activity of fruit extracts (Carica papaya, Artocarpus heterophillus
and Annona marcgravii). LWT-Food Science and Technology, 59(2), 1247-
1251.
Pimentel, T. C., Madrona, G. S., Garcia, S., Prudencio, S. H. (2015). Probiotic
viability, physicochemical characteristics and acceptability during refrigerated
storage of clarified apple juice supplemented with Lactobacillus paracasei ssp.
paracasei and oligofructose in different package type. LWT-Food Science and
Technology, 63(1), 415-422.
96
96
Ryan, L., Prescott, S. L. (2010). Stability of the antioxidant capacity of twenty-five
commercially available fruit juices subjected to an in vitro digestion.
International Journal of Food Science & Technology, 45, 1191-1197.
Saad, S. M. I., Cruz, A. G. D., Faria, J. D. A. F. (2011). Probióticos e prebióticos em
alimentos: fundamentos e aplicações tecnológicas. In Probióticos e prebióticos
em alimentos: fundamentos e aplicações tecnológicas. Varela.
Sancho, R. A. S., Pavan, V., Pastore, G. M. (2015). Effect of in vitro digestion on
bioactive compounds and antioxidant activity of common bean seed
coats. Food Research International, 76, 74-78.
Sancho, R. A. S., Souza, J. D. R., de Lima, F. A., Pastore, G. M. (2017). Evaluation
of oligosaccharide profiles in selected cooked tubers and roots subjected to in
vitro digestion. LWT-Food Science and Technology, 76, 270-277.
Scheid, M. M. A., Genaro, P. S., Moreno, Y. M. F., Pastore, G. M. (2014). Freeze-
dried powdered yacon: effects of FOS on serum glucose, lipids and intestinal
transit in the elderly. European journal of nutrition, 53(7), 1457-1464.
Silva, J. G. S., Orlando, E. A., Rebellato, A. P., Pallone, J. A. L. (2016). Optimization
and Validation of a Simple Method for Mineral Potential Evaluation in Citrus
Residue. Food Analytical Methods, 1-10.
Sousa, S., Pinto, J., Rodrigues, C., Gião, M., Pereira, C., Tavaria, F., Pintado, M.
(2015). Antioxidant properties of sterilized yacon (Smallanthus sonchifolius)
tuber flour. Food chemistry, 188, 504-509.
97
97
DISCUSSÃO GERAL
A técnica por Cromatografia de Troca Aniônica de Alta Eficiência
acoplada ao Detector Amperométrico Pulsado (HPAEC-PAD) é uma das técnicas
mais utilizadas para análise de carboidratos. Assim, duas metodologias envolvendo
esta técnica foram propostas e validadas, incluindo os acúcares glicose, frutose,
sacarose e oligossacarídeos rafinose e estaquiose em um método para MALTOS:
maltotriose (G3), maltotetraose (G4), maltopentaose (G5), maltohexaose (G6) e
maltoheptaose (G7) e FOS: 1- kestose (GF2), nistose (GF3), e 1-
fructofuranosilnistose (GF4) em outro método. Em resumo, os resultados de
validação indicaram que os métodos podem ser utilizados com confiança para
separar e quantificar os compostos analisados neste estudo. A maioria dos 24
vegetais analisados apresentaou glicose, frutose e sacarose em sua composição, as
frutas são geralmente ricas nesses açúcares, a exceção foi a acerola. A rafinose e a
estaquiose são carboidratos que podem causar desconforto intestinal. A hortelã
destacou-se por apresentar maior conteúdo de rafinose, enquanto o yacon, a
banana e laranja em estaquiose. O yacon apresentou também maior teor de FOS
entre todos os vegetais analisados, foram 1667,6 mg/ 100g de GF2, 1148,2 mg/
100g de GF3 e 552,74 mg/ 100g de GF4 expressos em fruta fresca. Com relação
aos MALTOS os teores foram baixos de uma forma geral para os vegetais
estudados.
A digestão in vitro realizada com as matrizes vegetais couve e yacon,
comparados aos padrões analíticos de compostos fenólicos e FOS possibilitou
investigar o que possivelmente acontece quando estes compostos são consumidos.
Os compostos fenólicos foram reduzidos na fase gástrica da digestão e a interação
com os FOS não foi eficiente para diminuir este efeito. Entretanto, na fase intestinal
da digestão há um aumento do conteúdo de compostos fenólicos e capacidade
antioxidante. Isto deve estar associado, principalmente com as alterações dos
compostos fenólicos no pH da fase intestinal simulada, em que os principais
fenólicos neste estudo, quercetina e kaempferol, encontram-se ionizados,
predominando a forma aniônica, aumentando assim a atividade antioxidante pelos
métodos de avaliação utilizados, TEAC e ORAC. Os FOS, por sua vez, sofreram
uma pequena degradação evidenciada na fase gástrica da digestão, mantendo o
98
98
conteúdo até o final da fase intestinal. Houve um efeito protetor dos compostos
fenólicos aos FOS, já que tanto para os padrões de FOS + Fenóis, quanto para a
amostra Couve + Yacon a degradação dos FOS não foi significativa na fase gástrica
como ocorrido quando os FOS estavam em separado. Esta pode ser uma evidência
de que os fenólicos e/ou outros compostos com capacidade antioxidante possam
atuar inibindo a degradação ácida dos FOS, típica da fase gástrica da digestão.
O desenvolvimento de uma bebida mista de vegetais (BMV) atende a uma
demanda do mercado consumidor que busca por alimentos saudáveis que sejam
práticos também. A BMV desenvolvida destacou-se com relação ao conteúdo em
minerais, além de apresentar baixo valor lipídico. Quando submetida à digestão in
vitro a BMV reduziu seu conteúdo de compostos fenólicos e atividade antioxidante
na fase gástrica da digestão, seguido de um aumento na fase intestinal, em níveis
inclusive superiors ao encontrado antes da digestão. Isto pode ter ocorrido em
função da liberação de compostos da matriz e das alterações nos compostos
fenólicos devido o pH. No caso dos FOS, diferente do que foi observado no estudo
anterior para matrizes contendo fenóis e FOS, houve degradação dos FOS na fase
gástrica da digestão, em virtude do baixo pH, provavelmente. Essa redução foi em
torno de 15% no GF2, 16% no GF3 e 17% no GF4 ao final da fase intestinal.
Embora tenha havido perdas, a maior parte dos FOS passaram pelo processo
digestivo simulado, como era esperado já que trata-se de compostos reconhecidos
como prebióticos. A BMV foi submetida também a uma teste de aceitação por 120
provadores não treinados, que demonstraram-se satisfeitos com o sabor da bebida,
o atributo com maior média (7,18±1,67) seguido do aroma (7,0±1,9). A textura foi o
único atributo rejeitado pelos provadores (4,97±2,2), que a consideraram muito
viscosa, um problema que é relativamente fácil de ser solucionado. Por fim 37% dos
provadores ficaram em dúvida se comprariam ou não a BMV, seguidos de 34% que
provavelmente comprariam.
99
99
CONCLUSÃO GERAL
Os métodos por Cromatografia de Troca Aniônica de Alta Eficiência
acoplada ao Detector Amperométrico Pulsado (HPAEC-PAD) apresentados neste
estudo tiveram parâmetros de validação com respostas satisfatórias para
linearidade, acurácia e precisão. Ademais tiveram boa seletividade e resolução,
portanto, podem ser utilizados com confiança para separar e quantificar estes
compostos.
A digestão in vitro das matrizes vegetais (couve e yacon) e em padrões
de fenóis e FOS evidenciou principalmente, que durante a fase gástrica há uma
redução dos compostos fenólicos e da capacidade antioxidante (ABTS) e que na
fase intestinal pode ser mantido ou aumentado, estas mudanças podem estar
associadas principalmente às mudanças estruturais dos compostos. Com relação
aos FOS, é provável que haja um efeito protetor dos fenóis a estes. Sendo essa uma
suposição, estudos futuros são necessarários para esclarecer melhor estes
mecanismos.
A BMV desenvolvida obteve um baixo valor lipídico e apresentou rica
composição de minerais, notadamente manganês, cobre, potássio, magnésio e
cálcio.
Na BMV o efeito da digestão in vitro foi a degradação parcial dos FOS.
Esse resultado alerta para que antes de se definir a capacidade prebiótica dos
alimentos, seja levada em consideração a possível degradação destes no trato
gastrointestinal, já que a quantidade que chega intacta ao cólon é a que deve ser
contabilizada para definir o alimento como prebiótico.
Ter utilizado um controle para digestão foi imprescindível para obter o
resultado real da capacidade antioxidante e compostos fenólicos, uma vez que tanto
o controle da digestão gástrica, quanto intestinal também apresentaram altos teores,
sendo ainda mais expressivo na fase intestinal.
A avaliação sensorial da BMV mostrou que a bebida tem potencial para
ser comercializada, pois teve boa aceitação com relação ao sabor, cor e aroma. No
entanto mudanças são necessárias para melhorar a consistência da bebida e enfim
aumentar a intenção de compra por parte dos consumidores.
100
100
REFERÊNCIAS
AACCI, American Association of Cereal Chemists International. (2011). Approved
Methods of Analysis. (American Association of Cereal Chemists International,
Ed.) Approved Methods of Analysis (11th ed.). St. Paul: American Association
of Cereal Chemists International.
Ainsworth, E.A.; Gillespie, K.M. (2007) Estimation of total phenolic content and other
oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteau reagent. Nature
Protocols, 2 (4), 875-877.
Alles, M. S., de Roos, N. M., Bakx, J. C., van de Lisdonk, E., Zock, P. L., Hautvast, J.
G. (1999). Consumption of fructooligosaccharides does not favorably affect
blood glucose and serum lipid concentrations in patients with type 2
diabetes. The American journal of clinical nutrition, 69(1), 64-69.
Andrés, V., Villanueva, M. J., Tenorio, M. D. (2016). The effect of high-pressure
processing on colour, bioactive compounds, and antioxidant activity in
smoothies during refrigerated storage. Food chemistry, 192, 328-335.
AOAC, Association of Official Agricultural Chemists. (2006). Official methods of
analysis of the Association of Official Analytical Chemists. (W. Howitz & G. W.
Latimer Jr, Eds.) (18th ed.). Gaithersburg: AOAC International.
Arruda, H. S., Pereira, G. A., Pastore, G. M. (2017). Oligosaccharide profile in
Brazilian Cerrado fruit araticum (Annona crassiflora Mart.). LWT-Food Science
and Technology. 76, 278-283
Ballus, C. A., Meinhart, A. D., Campos JR, F. A. S., Silva, L. F. O., Oliveira, A. F.,
Godoy, H. T. (2014) A quantitative study on the phenolic compound, tocopherol
and fatty acid contents of monovarietal virgin olive oils produced in the
southeast region of Brazil. Food Research International, 62:74-83.
Barrett, D. M., Lloyd, B. (2012). Advanced preservation methods and nutrient
retention in fruits and vegetables. Journal of the Science of Food and
Agriculture, 92(1), 7-22.
Bermu´dez-Soto, M.J., Toma´s-Barbera´ n, .A. Garc ´a-Conesa, M.T. (2007).
Stability of polyphenols in chokeberry (Aronia melanocarpa) subjected to in vitro
gastric and pancreatic digestion. Food Chemistry, 102, 865–874.
101
101
Blecker, C., Fougnies, C., Van Herck, J. C., Chevalier, J. P., Paquot, M. (2002).
Kinetic study of the acid hydrolysis of various oligofructose samples. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 50(6), 1602-1607.
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).
Alimentos. Comissões e Grupos de Trabalho. Comissão Tecnocientífica de
Assessoramento em Alimentos Funcionais e Novos Alimentos. Alimentos com
Alegações de Propriedades Funcionais e ou de Saúde, Novos Alimentos/
Ingredientes, Substâncias Bioativas e Probióticos. Disponível em:
http://www.anvisa.gov.br/alimentos/comissoes/tecno_lista_alega.htm>. Acesso
em: 18 fevereiro de 2016. (Atualizado em julho/2008. Lista de alegações de
propriedade funcional aprovadas).
Campos, D., Aguilar‐Galvez, A., Pedreschi, R. (2016). Stability of
fructooligosaccharides, sugars and colour of yacon (Smallanthus sonchifolius)
roots during blanching and drying. International Journal of Food Science &
Technology. 51, 1177-1185.
Campos, D., Betalleluz-Pallardel, I., Chirinos, R., Aguilar-Galvez, A., Noratto, G.,
Pedreschi, R. (2012). Prebiotic effects of yacon (Smallanthus sonchifolius
Poepp. & Endl), a source of fructooligosaccharides and phenolic compounds
with antioxidant activity. Food Chemistry, 135(3), 1592-1599.
Carabin, I. G., Flamm, W. G. (1999). Evaluation of safety of inulin and oligofructose
as dietary fiber. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 30(3), 268-282.
Causey, J. L., Feirtag, J. M., Gallaher, D. D., Tungland, B. C., Slavin, J. L. (2000).
Effects of dietary inulin on serum lipids, blood glucose and the gastrointestinal
environment in hypercholesterolemic men. Nutrition Research, 20(2), 191-201.
Chen, G. L., Chen, S. G., Xie, Y. Q., Chen, F., Zhao, Y. Y., Luo, C. X., Gao, Y. Q.
(2015). Total phenolic, flavonoid and antioxidant activity of 23 edible flowers
subjected to in vitro digestion. Journal of Functional Foods, 17, 243-259.
Chu, Y. F., Sun, J. I. E., Wu, X., Liu, R. H. (2002). Antioxidant and antiproliferative
activities of common vegetables. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 50(23), 6910-6916.
102
102
Cicco, N.; Lanorte, M.T.; Paraggio, M.; Viggiano, M.; Lattanzio, V. (2009). An
reproducible rapid and inexpensive Folin-Ciocalteau-method in determining
phenolic of plant methanolic extracts. Michochemical Journal, 91 (1), 107-110.
Cicco, N.; Lattanzio, V. (2011) The influence of initial carbonate concentration on the
Folin-Ciocalteau Micro-Method for the determination of phenolics with low
concentration in the presence of methanol: a comparative study of real-time
monitored reactions. American Journal of Analytical Chemistry, 2, 840-848.
Costa, N. M. B., Rosa, C. D. O. B. (2010). Alimentos Funcionais–componentes
bioativos e efeitos fisiológicos. Editora Rubio.
Cruz-Cárdenas, C. I., Miranda-Ham, M. L., Castro-Concha, L. A., Ku-Cauich, J. R.,
Vergauwen, R., Reijnders, T., Escobedo-GraciaMedrano, R. M. (2015).
Fructans and other water soluble carbohydrates in vegetative organs and fruits
of different Musa spp. accessions. Frontiers in plant science, 6.
Cummings, J., Pomare, E. W., Branch, W. J., Naylor, C. P., Macfarlane, G. T. (1987).
Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous
blood. Gut, 28(10), 1221-1227.
Damodaran, S., Parkin, K., Fennema, O. (2010). Química de Alimentos 4th ed., Porto
Alegre. ISBN 978-85-363-2248-3.
Dantas, E. M. Caracterização e avaliação das atividades antioxidante e
antiproliferativa e do efeito citotóxico de bebidas funcionais liofolizadas
compostas por frutas e hortaliças (Green Smoothies). 2014. 206p. Tese
(Doutorado em Ciência de Alimentos) – Faculdade de Engenharia de
Alimentos, UNICAMP, Campinas.
Dávalos, A., Gómez-Cordovés, C., Bartolomé, B. (2004). Extending applicability of
the oxygen radical absorbance capacity (ORAC-fluorescein) assay. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 52, 48–54.
De Moura, N. A., Caetano, B. F., Sivieri, K., Urbano, L. H., Cabello, C., Rodrigues, M.
A., Barbisan, L. F. (2012). Protective effects of yacon (Smallanthus sonchifolius)
intake on experimental colon carcinogenesis. Food and Chemical
Toxicology, 50(8), 2902-2910.
103
103
De Oliveira, L. F., Corrêa, J. L. G., de Angelis Pereira, M. C., Ramos, A. D. L. S.,
Vilela, M. B. (2016). Osmotic dehydration of yacon (Smallanthus sonchifolius):
Optimization for fructan retention. LWT-Food Science and Technology, 71, 77-
87.
Delgado, G. T. C.; Tamashiro, W. M. S. C.; Pastore, G. M. (2010).
Immunomodulatory effects of fructans. Food Research International, 43 (5),
1231-1236.
Delgado, G. T. C.; Thome, R. G. D. L.; Tamashiro, W. M.; Pastore, G. M (2012).
Yacon (Smallanthus sonchifolius)-derived fructooligosaccharides improves the
immune parameters in the mouse. Nutrition Research, 32(11), 884-892.
Der Agopian RG, Purgatto E, Cordenunsi BR, Lajolo FM (2009) Synthesis of
fructooligosaccharides in banana ―Prata‖ and its relation to invertase activity
and sucrose accumulation. J Agric Food Chem 57:10765–10771.
Di Cagno, R., Minervini, G., Rizzello, C. G., De Angelis, M., Gobbetti, M. (2011).
Effect of lactic acid fermentation on antioxidant, texture, color and sensory
properties of red and green smoothies. Food Microbiology, 28(5), 1062-1071.
Dionisio, A. P., Wurlitzer, N. J., Goes, T. D. S., Borges, M. D. F., Garruti, D., Araújo,
I. M. D. S. (2016). Estabilidade de uma bebida funcional de frutas tropicais e
yacon (Smallanthus sonchifolius) durante o armazenamento sob
refrigeração. Archivos Latinoamericanos de Nutrición, 66(2), 148-155.
Falguera, V., Aliguer, N., Falguera, M. (2012). An integrated approach to current
trends in food consumption: Moving toward functional and organic
products?. Food Control, 26(2), 274-281.
Fernández, C. E., Lipavska, H., Milchl, J. (1997). Determination of saccharides
content in different ecotypes of yacon (Polymixia sonchifolia poepp. and
endlicher) cultivated under conditions of Czech Republic. Agricultura Tropica et
Subtropica. UniVersitas Agriculturae Praga, 30, 79-89.
Fiol, M., Adermann, S., Neugart, S., Rohn, S., Mügge, C., Schreiner, M., Kroh, L. W.
(2012). Highly glycosylated and acylated flavonols isolated from kale (Brassica
oleracea var. sabellica)—Structure–antioxidant activity relationship. Food
Research International, 47(1), 80-89.
104
104
Franco, T. S., Perussello, C. A., Ellendersen, L. D. S. N., Masson, M. L. (2015).
Foam mat drying of yacon juice: Experimental analysis and computer
simulation. Journal of Food Engineering, 158, 48-57.
Genta, S., Cabrera, W., Habib, N., Pons, J., Carillo, I. M., Grau, A., Sánchez, S.
(2009). Yacon syrup: beneficial effects on obesity and insulin resistance in
humans. Clinical Nutrition, 28(2), 182-187.
Guo, W., Yang, H., Qiang, S., Fan, Y., Shen, W., Chen, X. Overproduction,
purification, and property analysis of an extracellular recombinant
fructosyltransferase. European Food Research and Technology, v. 242, p 1-10,
2015.
Institute of Medicine (1997) Dietary reference intakes for calcium, phosphorus,
magnesium, vitamin D, and fluoride. Washington, DC. The National Academies
Press.
Institute of Medicine (2001) Dietary reference intakes for Vitamin A, Vitamin K,
Arsenic, Boron, Chromium, Copper, Iodine, Iron, Manganese, Molybdenum,
Nickel, Silicon, Vanadium, and Zinc . Washington, DC. The National Academies
Press
Institute of Medicine (2005) Dietary reference intakes for Water, Potassium, Sodium,
Chloride, and Sulfate. Washington, DC. The National Academies Press
Ismail, E. A.; Al-Saleh, A. A.; Metwalli, A. A. M. (2013). Effect of inulin
supplementation on rheological properties of low-fat ice cream. Life Science
Journal, 10(3), 1742-1746.
Jiang, H., Ma, Y., Chi, Z., Liu, G. L., Chi, Z. M. (2016). Production, Purification, and
Gene Cloning of a β-Fructofuranosidase with a High Inulin-hydrolyzing Activity
Produced by a Novel Yeast Aureobasidium. Marine Biotechnology, 1-11.
Johansen, H. N., Glitsø, V., Bach Knudsen, K. E. (1996). Influence of extraction
solvent and temperature on the quantitative determination of oligosaccharides
from plant materials by high-performance liquid chromatography. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 44(6), 1470-1474.
105
105
Jovanovic-Malinovska, R., Kuzmanova, S., & Winkelhausen, E. (2014).
Oligosaccharide profile in fruits and vegetables as sources of prebiotics and
functional foods. International Journal of Food Properties, 17(5), 949-965.
Kamiloglu, S., Toydemir, G., Boyacioglu, D., Beekwilder, J., Hall, R. D., Capanoglu,
E. (2016). A review on the effect of drying on antioxidant potential of fruits and
vegetables. Critical reviews in food science and nutrition, 56 (1), 110-129.
Kuntz, M. G., Fiates, G. M., Teixeira, E. (2013). Characteristics of prebiotic food
products containing inulin. British Food Journal, 115(2), 235-251.
Landete, J. M. Updated knowledge about polyphenols: functions, bioavailability,
metabolism, and health (2012). Critical reviews in food science and nutrition, 52
(10), 936-948.
Le, K., Chiu, F., Ng, K. (2007). Identification and quantification of antioxidants in
Fructus lycii. Food Chemistry, 105(1), 353-363.
Leite, A.V., Malta, L.G., Riccio, M.F., Eberlin, M.N., Pastore, G.M., Maróstica Júnior,
M.R. (2011). Antioxidant potential of rat plasma by administration of freeze-
dried jaboticaba peel (Myrciaria jaboticaba Vell Berg). Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 59, 2277–2283.
L'homme, C., Peschet, J. L., Puigserver, A., Biagini, A. (2001). Evaluation of fructans
in various fresh and stewed fruits by high-performance anion-exchange
chromatography with pulsed amperometric detection. Journal of
Chromatography A, 920(1), 291-297.
Liu, Z., Mouradov, A., Smith, K.F., Spangenberg, G., (2011). An improved method for
quantitative analysis of total fructans in plant tissues. Analytical biochemistry.
418, 252-259.
Liu, Z.; Rochfort, S. (2015). Identification and quantitative analysis of
oligosaccharides in wheat flour using LC–MS. Journal of Cereal Science, 63,
128-133.
Lobo, A. R., Colli, C., Alvares, E. P., Filisetti, T. M. (2007). Effects of fructans-
containing yacon (Smallanthus sonchifolius Poepp & Endl.) flour on caecum
mucosal morphometry, calcium and magnesium balance, and bone calcium
retention in growing rats. British Journal of Nutrition, 97(04), 776-785.
106
106
Macagnan, F. T., da Silva, L. P., Hecktheuer, L. H. (2016). Dietary fibre: The
scientific search for an ideal definition and methodology of analysis, and its
physiological importance as a carrier of bioactive compounds. Food Research
International, 85, 144-154.
Machado, M. T., Trevisan, S., Pimentel-Souza, J. D., Pastore, G. M., Hubinger, M. D.
(2016).Clarification and concentration of oligosaccharides from artichoke extract
by a sequential process with microfiltration and nanofiltration membranes.
Journal of Food Engineering, 180, 120-128.
Minekus, M., Alminger, M., Alvito, P., Ballance, S., Bohn, T., Bourlieu, C., Dufour, C.
(2014). A standardised static in vitro digestion method suitable for food–an
international consensus. Food & Function, 5(6), 1113-1124.
Mira, G. S., Graf, H., Cândido, L. M. B. (2009). Visão retrospectiva em fibras
alimentares com ênfase em beta-glucanas no tratamento do diabetes. Brazilian
Journal of Pharmaceutical Sciences, 45(1), 11-20.
Moongngarm, A., Trachoo, N., Sirigungwan, N. (2011). Low molecular weight
carbohydrates, prebiotic content, and prebiotic activity of selected food plants in
Thailand. Advance Journal of Food Science and Technology, 3(4), 269-274.
Moure, A., Cruz, J. M., ranco, D., Dom nguez, . M., ineiro, ., Dom nguez, .,
Parajó, J. C. (2001). Natural antioxidants from residual sources. Food
Chemistry, 72(2), 145-171.
Mussatto, S. I.; Mancilha, I. M. (2007) Non-digestible oligosaccharides: a
Review. Carbohydrate polymers, 68 (3), 587-597.
Nowicka, P., Wojdyło, A., Teleszko, M., Samoticha, J. (2016). Sensory attributes and
changes of physicochemical properties during storage of smoothies prepared
from selected fruit. LWT-Food Science and Technology, 71, 102-109.
Padovani, R. M., Amaya-Farfán, J., Colugnati, F. A. B., Domene, S. M. Á. (2006).
Dietary reference intakes: aplicabilidade das tabelas em estudos
nutricionais. Revista de Nutrição, 19(6), 741-760.
Park, Y. S., Ham, K. S., Park, Y. K., Leontowicz, H., Leontowicz, M., Namieśnik, .,
Gorinstein, S. (2016). The effects of treatment on quality parameters of
smoothie-type'Hayward'kiwi fruit beverages. Food Control.
107
107
Park, Y. ., am, K. ., Park, Y. K., Leontowicz, ., Leontowicz, M., Namieśnik, .,
Gorinstein, S. (2016). The effects of treatment on quality parameters of
smoothie-type 'Hayward' kiwi fruit beverages. Food Control, 70, 221-228.
Pavan, V., Sancho, R. A. S., Pastore, G. M. (2014). The effect of in vitro digestion on
the antioxidant activity of fruit extracts (Carica papaya, Artocarpus heterophillus
and Annona marcgravii). LWT-Food Science and Technology, 59(2), 1247-
1251.
Pimentel, T. C., Madrona, G. S., Garcia, S., Prudencio, S. H. (2015). Probiotic
viability, physicochemical characteristics and acceptability during refrigerated
storage of clarified apple juice supplemented with Lactobacillus paracasei ssp.
paracasei and oligofructose in different package type. LWT-Food Science and
Technology, 63(1), 415-422.
Roberfroid, M. (2007). Prebiotics: the concept revisited. The Journal of
nutrition, 137(3), 830S-837S
Roberfroid, M., Gibson, G. R., Hoyles, L., McCartney, A. L., Rastall, R., Rowland, I.,
Guarner, F. (2010). Prebiotic effects: metabolic and health benefits. British
Journal of Nutrition, 104(S2), S1-S63.
Rouzaud, G. C. M. (2004). Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics: Functional
Ingredients for Microbial Management Strategies. In: BILIADERIS, C. G.;
IZYDORCZYK, M. S. (Eds.). Functional Food Carbohydrates. New York: CRC
Press, 479–509.
Ryan, L., & Prescott, S. L. (2010). Stability of the antioxidant capacity of twenty-five
commercially available fruit juices subjected to an in vitro digestion.
International Journal of Food Science & Technology, 45, 1191-1197.
Saad, S. M. I., Cruz, A. G. D., Faria, J. D. A. F. (2011). Probióticos e prebióticos em
alimentos: fundamentos e aplicações tecnológicas. Varela.
Sancho, R. A. S., Pavan, V., Pastore, G. M. (2015). Effect of in vitro digestion on
bioactive compounds and antioxidant activity of common bean seed
coats. Food Research International, 76, 74-78.
108
108
Sancho, R. A. S., Souza, J. D. R., de Lima, F. A., Pastore, G. M. (2017). Evaluation
of oligosaccharide profiles in selected cooked tubers and roots subjected to in
vitro digestion. LWT-Food Science and Technology. 76, 270-277.
Scheid, M. M. A., Genaro, P. S., Moreno, Y. M. F., Pastore, G. M. (2014). Freeze-
dried powdered yacon: effects of FOS on serum glucose, lipids and intestinal
transit in the elderly. European journal of nutrition, 53(7), 1457-1464.
Sicari, V., Pellicanò, T. M., Giuffrè, A. M., Zappia, C., Capocasale, M. (2016).
Bioactive compounds and antioxidant activity of citrus juices produced from
varieties cultivated in Calabria. Journal of Food Measurement and
Characterization, 10(4), 773-780.
Silva, J. G. S., Orlando, E. A., Rebellato, A. P., Pallone, J. A. L. (2016). Optimization
and Validation of a Simple Method for Mineral Potential Evaluation in Citrus
Residue. Food Analytical Methods, 1-10.
Singh, B., Singh, J. P., Kaur, A., Singh, N. (2016). Bioactive compounds in banana
and their associated health benefits–A review. Food chemistry, 206, 1-11.
Sousa, S., Pinto, J., Rodrigues, C., Gião, M., Pereira, C., Tavaria, F., Pintado, M.
(2015). Antioxidant properties of sterilized yacon (Smallanthus sonchifolius)
tuber flour. Food chemistry, 188, 504-509.
Stober, P., Benet, S., Hischenhuber, C., 2004. Simplified enzymatic high-
performance anion exchange chromatography determination of total fructans in
food and pet food e limitations and measurement uncertainty. Journal of
agricultural and food chemistry. 52, 2137-2146.
Sun, J., Chu, Y. F., Wu, X., Liu, R. H. (2002). Antioxidant and antiproliferative
activities of common fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(25),
7449-7454.
Tanaka, M., Thananunkul, D., Lee, T. C., Chichester, C. O. (1975). A simplified
method for the quantitative determination of sucrose, raffinose and stachyose in
legume seeds. Journal of Food Science, 40(5), 1087-1088.
Thompson, M., Ellison, S. L. R., Wood, R. (2002). Harmonized guidelines for single-
laboratory validation of methods of analysis. Pure and Applied Chemistry, 74,
835–855.
109
109
Traber, M. G. (2006) Relationship of vitamin E metabolism and oxidation in
exercising human subjects. British Journal of Nutrition, 96, 34-37.
Wang, Da; Li, Fu-Li; Wang, Shi-An. (2016) A one-step bioprocess for production of
high-content fructo-oligosaccharides from inulin by yeast. Carbohydrate
Polymers, v. 151, p. 1220-1226.
Wilson, R.G.; Smith, J.A.; Yonts, C.D. (2004) Chicory root yield and carbohydrate
composition is influenced by cultivar, planting, and harvest date. Crop Science.
44, 748–752.
Wootton-Beard, P. C., Ryan, L. (2011). A beetroot juice shot is a significant and
convenient source of bioaccessible antioxidants. Journal of functional
foods, 3(4), 329-334.
Ydjedd, S., Bouriche, ., L pez-Nicolás, R., ánchez-Moya, T., Frontela-Saseta, C.,
Ros-Berruezo, G., Kati, D. E. (2017). Effect of in Vitro Gastrointestinal Digestion
on Encapsulated and Nonencapsulated Phenolic Compounds of Carob
(Ceratonia siliqua L.) Pulp Extracts and Their Antioxidant Capacity. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 65, 827-835.
110
110
ANEXOS
Teste de aceitação e intenção de compra de bebida mista de vegetais com atividade antioxidante e prebiótica
Nome:_______________________________________Idade:_______Data:_____ 1. Por favor, avalie a amostra codificada e use a escala abaixo para indicar o quanto você gostou ou desgostou
em relação a cada um dos atributos:
Numero da amostra: ____
Aparência
Desgostei extremamente Gostei extremamente
Cor
Desgostei extremamente Gostei extremamente
Aroma
Desgostei extremamente Gostei extremamente
Textura
Desgostei extremamente Gostei extremamente
Sabor
Desgostei extremamente Gostei extremamente
Impressão global
Desgostei extremamente Gostei extremamente
Se esta amostra estivesse à venda, qual seria sua atitude?
( ) Certamente não compraria
( ) Provavelmente não compraria
( ) Tenho dúvida se compraria ou não
( ) Provavelmente compraria
( ) Certamente compraria
Comentários:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
111
111
112
112