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Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
VIVIANE GADRET BÓRIO CONCEIÇÃO
ANÁLISE QUANTITATIVA DE PARACETAMOL POR ESPECTROSCOPIA
RAMAN DISPERSIVA
São José dos Campos 2009
Viviane Gadret Bório Conceição
ANÁLISE QUANTITATIVA DE PARACETAMOL POR ESPECTROSCOPIA RAMAN DISPERSIVA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.
Orientador: Prof. Dr. Landulfo Silveira Junior Orientadora: Profª. Drª. Renata Amadei Nicolau
São José dos Campos, SP 2009
C745a
Conceição, Mviane Gadret BÓtiolnátise quantitativa de paracetamol por espectroscopia Raman dispersiva
/ Viviane Gadret Bório Conceição. Orien{adores: Prof. Dr- Landulfo SilveiraJunior, Renata AmadeiNicolau. São Jose dos Campos, 2009.
ldisco laser: color.
Dssertaçãoãpresentada ao Programa de Pós*Graduação em EngenharìaBiomédica do lnslituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade doVale do Paraíba, 2009.
1. lrrdústria farmacêúica 2. AcètâÍninofen 3. Análise Espectral Raman l.Silveira Junior, LanduÌfo, OÍiênt.ll. Nicolau, Renata Amadei Orient. lll Título
CDU:543.42
Ar:torizo, exclusiyaÍnente para {ins acadêmicos e cien-tíftcos, a ÍepÍoduçãototal ou parcial desta dissertação, por processos fotocopiadores outransmissão eletrônica, desde que citada a fonte,
Aluno: ú'*'av^c ff[ C**ío-íI t
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VIVIANE GADRET BÓRIO CONCEIÇÃO
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DISPERSTvA''
Dissertação aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Engenharia
Biomédica, do Programa de Pós-Graduação em Engeúaria Biomédica, do Instituto de Pesquisa
e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte
banca examinadora:
Prof. Dra. RENATA AMADEI NICOLAU (UNIVAP)
Prof. Dr. LANDULFO SILVEIRA JIINIOR GTNICAS
Prof. Dr. WELLINGTON RIBEIRO (UNIVAP)
Prof. Dra. MARIA JOSÉ VIEIRA FONSECA (USP) ì
Prof. Dra. Sandra Maria Fonseca da Costa
Diretor do IP&D - UniVap
São José dos Campos, 17 de agosto de2009.
Dedico este trabalho ao meu amado filho Otávio que, mesmo privado do
aconchego do meu colo, nas horas em que tudo parecia ser tão difícil,
mostrava-me com aquele sorriso doce o quanto tudo era simples.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, sem o qual eu não teria forças para
concluir este trabalho.
Ao professor Dr. Landulfo Silveira Junior, meu mestre, meu orientador,
meu amigo. Obrigada pela dedicação e entusiasmo pelos quais me conduziu
neste trabalho. Só mesmo alguém tão sábio e apaixonado pelo que faz teria
sido tão brilhante.
À professora Drª Renata Amadei Nicolau por me receber no IP&D, por
me incentivar a entrar no mundo da pesquisa e por me orientar. Agradeço pela
dedicação e excelentes explicações e contribuições que deu aos meus
trabalhos, colocando cada palavra no seu exato lugar.
Ao prof. Dr. Carlos José de Lima por ter gentilmente disponibilizado o
cabo de fibras ópticas para este e outros experimentos.
Ao Rubens Vinha Jr, fundamentalmente um dos maiores incentivadores
e colaboradores deste trabalho, por ter me recebido sempre e me orientado
tantas vezes. Agradeço muito pelas amostras concedidas. Ao Rafael Cachiba e
ao Marcelo Martins, que me cederam seu tempo requisitando, preparando e
analisando as amostras utilizadas, e a Naissa Previde Bernardo pelas
discussões muito proveitosas.
A UNIVAP, incluindo aqui todos os funcionários, diretores e professores,
em especial ao Prof. Dr. Wellington Ribeiro por me fazer gostar ainda mais de
farmacologia.
A CAPES/PROSUP pela bolsa de estudos concedida.
Às minha família que, mesmo longe ou até virtualmente, soube se fazer
presente da forma mais bonita que pode. Em especial à Lúcia Rizzolo,
excelente professora de português, minha madrinha querida e amada, pela
grande ajuda ao corrigir este texto durante suas férias! Pai e mãe, agradeço a
vocês por me presentearem com as coisas mais nobres que um filho pode
receber: amor e educação.
Ao Sandro, meu marido, que nas horas mais angustiantes soube
transmitir seu amor com atos e palavras. Obrigada por ser tão amável,
inteligente, incentivador, inspirador, companheiro e principalmente por acreditar
na minha capacidade... e me fazer acreditar nela.
ANÁLISE QUANTITATIVA DE PARACETAMOL POR ESPECTROSCOPIA RAMAN DISPERSIVA
RESUMO
Este trabalho objetivou quantificar o paracetamol em uma formulação comercial líquida apresentando valor nominal de 200 mg/mL por Espectroscopia Raman Dispersiva (ER/PLS) ao utilizar laser de diodo e cabo de fibras ópticas. Para tanto, construiu-se uma curva de calibração com espectros coletados de amostras de paracetamol em placebo com concentrações crescentes e conhecidas, cedidas pelo fabricante do medicamento. A concentração de cada uma das soluções cedidas foi comparada com a respectiva concentração nominal. Verificou-se, ainda, se a ER, como técnica analítica de controle de qualidade, atende aos critérios da ANVISA para validação e se satisfaz as recomendações do guia PAT. As figuras de mérito preconizadas pela ANVISA, como linearidade, exatidão, precisão e especificidade foram calculadas, obtendo-se resultados alentadores, mostrando ser passível de validação. Concluiu-se, finalmente, que o método atende aos parâmetros de agilidade e confiabilidade recomendados pelo guia PAT, influenciado positivamente pelo uso do laser semicondutor e do cabo de fibras ópticas que trouxeram adequada estabilidade ao sistema.
Palavras chave: Espectroscopia Raman. Paracetamol. PLS. ANVISA.
QUANTITATIVE ANALYSIS OF ACETAMINOPHEN BY DISPERSIVE RAMAN SPPECTROSCOPY
ABSTRACT
The aim of this study was to quantify the acetaminophen in a liquid commercial formulation with concentration of 200 mg/mL by Dispersive Raman Spectroscopy using diode laser and optical fiber cable. A calibration curve was determined with the spectra collected from acetaminophen solution samples in placebo with rising and known concentrations supplied by the drug manufacturer, and compared with each theoretical concentration. Further it was verified if the ER method, as an analytical technique applied on quality control, complies with the ANVISA validation requirements, and follows the recommendations from the PAT guide. It was calculated the linearity, accuracy, precision and specificity as recommended by ANVISA and appropriate results were obtained, showing this method is capable of being validated. Finally it was concluded that the method comply with the agility and reliability parameters suggested by the PAT guide, influenced positively by the use of semiconductor laser and optical fiber cable that have brought a reasonable stability to the system.
Key words: Raman Spectroscopy. Acetaminophen. PLS. ANVISA.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 13
1.1 Indústria farmacêutica e controle de qualidade.................................. 13 1.2 Tecnologia de Processos Analíticos .................................................. 13 1.3 Resolução 899/03 - ANVISA.............................................................. 14
1.3.1 Intervalo ...................................................................................... 15 1.3.2 Especificidade............................................................................. 15 1.3.3 Linearidade ................................................................................. 15 1.3.4 Precisão...................................................................................... 16 1.3.5 Exatidão...................................................................................... 16 1.3.6 Robustez..................................................................................... 16
1.4 Espectroscopia Raman ...................................................................... 17 1.4.1 Efeito Raman .............................................................................. 18 1.4.2 Espectroscopia Raman e indústria farmacêutica: Revisão da literatura 19
1.5 Paracetamol....................................................................................... 22 1.6 Quimiometria...................................................................................... 24
2 OBJETIVOS.............................................................................................. 26
3 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................... 27
3.1 Amostras utilizadas ............................................................................ 27 3.2 Espectrômetro utilizado na obtenção dos espectros Raman do paracetamol .................................................................................................. 29 3.3 Pré-processamento............................................................................ 32 3.4 Obtenção da curva de calibração ...................................................... 33 3.5 Validação ........................................................................................... 35 3.6 Obtenção das figuras de mérito preconizadas pela ANVISA ............. 36
3.6.1 Intervalo ...................................................................................... 36 3.6.2 Seletividade e especificidade...................................................... 36 3.6.3 Linearidade ................................................................................. 36 3.6.4 Precisão intracorrida (repetibilidade) .......................................... 37 3.6.5 Exatidão...................................................................................... 37
4 RESULTADOS ......................................................................................... 39
4.1 Espectro do paracetamol ................................................................... 39 4.2 Espectro do polietilenoglicol............................................................... 40 4.3 Comparação entre os espectros do polietilenoglicol puro e do placebo 40 4.4 Espectros Raman com as variações de concentração em torno do medicamento estudado................................................................................. 42 4.5 Obtenção do modelo de calibração PLS e validação......................... 42 4.6 PLS de validação do método com espectros de lotes comerciais do medicamento de referência .......................................................................... 44
4.7 Figuras de mérito ANVISA ................................................................. 46 4.7.1 Intervalo ...................................................................................... 46 4.7.2 Seletividade e especificidade da técnica .................................... 46 4.7.3 Linearidade ................................................................................. 46 4.7.4 Precisão (repetibilidade) ............................................................. 47 4.7.5 Exatidão...................................................................................... 50
5 DISCUSSÃO............................................................................................. 51
6 CONCLUSÕES......................................................................................... 57
REFERÊNCIAS................................................................................................ 58
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Estrutura química do paracetamol................................................... 23
Figura 2 - Espectro Raman do polietilenoglicol. Fonte: SIGMA ALDRICH48 - Traduzido pela autora. ..................................................................................... 27
Figura 3 - Diagrama esquemático do sistema Raman dispersivo acoplado ao cabo de fibras ópticas utilizado na coleta dos espectros Raman. .................... 30
Figura 4 – Detalhe mostrando o cabo de fibras ópticas imerso na cubeta contendo amostra............................................................................................. 31
Figura 5 - Espectro Raman do paracetamol (acetaminofen) Fonte: SIGMA ALDRICH51 . Traduzido pela autora.................................................................. 31
Figura 6 – Gráfico demonstrando os erros padrão de predição (SEP) obtidos com diferentes números de variáveis latentes. ................................................ 35
Figura 7 – Espectro do paracetamol (deslocado 3 u.a. no eixo vertical), da solução de placebo com paracetamol (sol G – deslocada 1 u.a. no eixo vertical) e da solução de placebo (sol J)........................................................................ 39
Figura 8 – Espectro do paracetamol obtido indiretamente e seus principais picos. ................................................................................................................ 40
Figura 9 – Espectro do polietilenoglicol, da solução de polietilenoglicol com paracetamol (deslocado 1 u.a. no eixo vertical), e do paracetamol isolado (deslocado 3 u.a. no eixo vertical).................................................................... 41
Figura 10 – Espectros do polietilenoglicol e do placebo................................... 41
Figura 11 – Espectros Raman das soluções de A a I, com suas respectivas concentrações de paracetamol. ....................................................................... 42
Figura 12 –: Resultado da predição das concentrações do grupo 2 (validação) utilizando modelo PLS com 1 lv comparados com as concentrações nominais das diluições..................................................................................................... 43
Figura 13 – Espectros Raman dos medicamentos comerciais e do desvio padrão. ............................................................................................................. 45
Figura 14 – Quantidades em mg/mL de paracetamol em cada amostra pelos métodos ER/PLS (∆) e NIRS (●). Valor nominal (_.._.._) do paracetamol. ...... 45
Figura 15 – Curva padrão de linearidade com as concentrações obtidas ER/PLS referentes às concentrações nominais das 5 soluções. ..................... 47
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Classificação dos testes, segundo sua finalidade .......................... 15
Tabela 2 – Grupamentos responsáveis pelos principais picos Raman do paracetamol e vibrações relativas a cada um deles......................................... 24
Tabela 3 – Soluções utilizadas e suas respectivas concentrações nominais de paracetamol (em % e mg/mL) e veículos ......................................................... 28
Tabela 4 – Valores de concentração predita utilizando 1 lv tendo como referência as concentrações nominais. Em função do mean subtracting, os valores de concentração são referenciados a partir da relação 100% (200 mg/mL) = 0. ...................................................................................................... 43
Tabela 5 – Quantidades calculadas por ER/PLS e por NIRS........................... 44
Tabela 6 – Concentrações das soluções e erro de previsão............................ 46
Tabela 7 – Concentrações nominais de paracetamol e obtidas por ER/PLS. .. 47
Tabela 8 – Precisão: Soluções de concentração baixa (H): 80%..................... 48
Tabela 9 – Precisão: Soluções de concentração média (G): 100% ................. 48
Tabela 10 – Precisão: Soluções de concentração alta (E): 120%.................... 49
Tabela 11 – Precisão: Soluções de concentração alta (E): 120%, sem o outlier......................................................................................................................... 49
Tabela 12 – Resultados do cálculo de exatidão. .............................................. 50
13
1 Introdução
1.1 Indústria farmacêutica e controle de qualidade
A farmacotécnica industrial é a área da farmácia responsável pela
transformação de matérias-primas em produtos finais. É importante ressaltar que o
setor do controle de qualidade destes produtos tem se tornado cada vez mais
representativo, e a determinação do teor do princípio-ativo no medicamento final em
tempo real tem sido bastante requerida.
No controle de qualidade, a maioria dos métodos analíticos fundamentados
em técnicas instrumentais são relativamente demorados e dispendiosos, como a
Cromatografia Líquida de Alta Performance ou High Performance Liquid
Chromatography (HPLC),1 o que impossibilita o estabelecimento de análises rápidas.
Cabe relatar que as técnicas analíticas evoluem de acordo com a necessidade da
época. Baseado nisso, a Food and Drug Administration (FDA) lançou no ano de
2004 o Guia PAT (Process Analytical Technology), no qual é preconizada a análise
em tempo real.
O desenvolvimento de novas tecnologias voltadas para a produção e controle
de fármacos e medicamentos tem objetivado grande interesse em centros de ensino
e pesquisa. A expansão de tecnologia de rápida incorporação no mercado
farmacêutico se faz necessária, contudo, o franco desenvolvimento não se reflete
proporcionalmente em valores econômicos e sociais.2
1.2 Tecnologia de Processos Analíticos
A Tecnologia de Processos Analíticos (do inglês Process Analytical
Technology - PAT) está em desenvolvimento na indústria farmacêutica, promovendo
estratégias para o controle dos processos de produção. Por definição da FDA, o guia
PAT é constituído de sistemas para análise e controle dos processamentos dos
parâmetros da qualidade e atributos críticos do desempenho de materiais. O guia
visa assegurar qualidade aceitável do produto durante todo o processo de
14
fabricação.3 O anúncio do guia PAT pela FDA no ano de 2004 alertou para a
necessidade de aumentar as investigações de metodologias analíticas novas e
rápidas para medições em tempo real. Um instrumento para o PAT é a
Espectroscopia Raman Dispersiva.4
1.3 Resolução 899/03 - ANVISA
Devido ao aumento no número de novos equipamentos e sistemas para
controle de qualidade de medicamentos, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA) criou resoluções a fim de regulamentar tais metodologias e equipamentos,
referindo-se à validação de métodos analíticos.
A primeira resolução (RE) a dispor sobre o assunto foi a RE Nº 475 de 19 de
março de 2002, a qual fora revogada pela RE Nº 899 de 23 de maio de 2003,
estando esta em vigor até o presente. Segundo a ANVISA, as informações ali
contidas apresentam as características a serem consideradas durante a validação
de procedimentos analíticos.5
O objetivo de uma validação é demonstrar que o método é apropriado para a
finalidade pretendida, ou seja, a determinação qualitativa, semiquantitativa e/ou
quantitativa de fármacos e outras substâncias em produtos farmacêuticos. Uma
validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda
às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos
resultados. Para tal, deve apresentar especificidade, linearidade, intervalo, precisão
(repetibilidade), sensibilidade, robustez, exatidão, limite de detecção e quantificação
adequadas à análise.5 Os testes, segundo sua finalidade, são classificados em
quatro categorias distintas (Tabela 1).
Para cada categoria é exigido um conjunto de testes. A validação de métodos
de quantificação de fármacos pode ser realizada aplicando-se a categoria I. Para a
categoria I as figuras de mérito exigidas são: intervalo, especificidade, linearidade,
precisão, exatidão e robustez. 5
15
Tabela 1 – Classificação dos testes, segundo sua finalidade
Categoria Finalidade do teste I Testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em
produtos farmacêuticos ou matérias-primas II Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinação de
impurezas e produtos de degradação em produtos farmacêuticos e matérias-primas
III Testes de performance IV Testes de identificação
1.3.1 Intervalo
O intervalo especificado é a faixa entre os limites de quantificação superior e
inferior de um método analítico. Para determinações quantitativas do analito em
matérias-primas ou em formas farmacêuticas, é indicada a análise das substâncias
nas concentrações de 80% a 120% da concentração nominal do teste. 5
1.3.2 Especificidade
É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto em
presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e
componentes da matriz. Para análise quantitativa (teor de princípio ativo), a
especificidade pode ser determinada pela comparação dos resultados obtidos de
amostras do fármaco contaminadas com quantidades apropriadas de impurezas ou
excipientes e amostras não contaminadas, a fim de demonstrar que o resultado do
teste não é afetado por esses materiais. 5
1.3.3 Linearidade
É a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar se há
proporcionalidade entre os resultados obtidos e as concentrações do analito na
amostra, dentro de um intervalo especificado. Recomenda-se que seja determinada
16
pela análise de, no mínimo, 5 concentrações diferentes. Essas concentrações
devem seguir os intervalos já estabelecidos. 5
1.3.4 Precisão
É a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de
medidas de múltipla amostragem de uma mesma amostra. Para a determinação dos
níveis de precisão é necessário testar a repetibilidade e a precisão intermediária. A
repetibilidade (precisão intracorrida) se traduz na concordância entre os resultados
dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista e mesma
instrumentação. Verifica-se por, no mínimo, 9 determinações contemplando o
intervalo linear do método, ou seja, 3 concentrações (baixa, média e alta) com 3
réplicas cada, ou mínimo de 6 determinações a 100 % da concentração nominal do
teste. 5
1.3.5 Exatidão
É a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação
ao valor verdadeiro (padrão). Para a análise de formas farmacêuticas adicionam-se
quantidades conhecidas de fármaco às misturas dos componentes do medicamento,
ou seja, faz-se “placebos contaminados”. A exatidão deve ser determinada após o
estabelecimento da linearidade e da especificidade do método, sendo verificada a
partir de, no mínimo, 9 determinações contemplando o intervalo linear do
procedimento, ou seja, 3 concentrações (baixa, média e alta) com 3 réplicas de
cada. 5
1.3.6 Robustez
É a medida da capacidade do método em resistir a pequenas e deliberadas
variações dos parâmetros analíticos. Indica sua confiança durante o uso normal. A
17
robustez deve ser avaliada durante o desenvolvimento da metodologia.
Constatando-se a susceptibilidade do método às variações nas condições analíticas
como variação do potencial hidrogeniônico (pH) da solução, temperatura, entre
outros, estas deverão ser controladas e precauções devem ser incluídas no
procedimento. 5
Os métodos atualmente utilizados no controle de qualidade de analgésicos
(ex.: paracetamol) são vários, dentre eles: métodos cromatográficos (cromatografia
de camada delgada, cromatografia líquida miscelar, cromatografia líquida de alta
eficiência, cromatografia de injeção sequencial), métodos eletroanalíticos, métodos
de eletroforese capilar e métodos ópticos (espectrofotometria de absorção no
infravermelho próximo, no Ultravioleta-visível ou multivariada, espectrofluorimetria,
quimioluminescência.6
1.4 Espectroscopia Raman
A espectroscopia Raman (ER) tem sido empregada em análises
farmacêuticas, apresentando inúmeras vantagens em relação aos métodos
convencionais, principalmente pelo fato de ser uma técnica rápida e não destrutiva.
Permite identificar ativos farmacêuticos, assim como outras substâncias presentes
nas formulações, sem necessidade de tratamento prévio das amostras.7 O interesse
por técnicas confiáveis e mais ágeis, com custo reduzido, visando à determinação
de teores em fármacos, é uma constante na área.8
As duas técnicas mais utilizadas para a obtenção do espectro Raman são:
espectroscopia Raman dispersiva e Raman por transformada de Fourier (FT-
Raman). A diferença entre elas está no comprimento de onda do laser utilizado e na
maneira como o espalhamento Raman é detectado e analisado. Cada técnica
apresenta vantagens únicas e a escolha do método ideal depende da amostra em
questão. As vantagens oferecidas pela espectroscopia Raman têm feito desta
técnica uma das mais atrativas na determinação qualitativa e quantitativa de
medicamentos. Muitas formas farmacêuticas têm sido qualificadas e quantificadas
18
por este método, como: comprimidos, tabletes, cápsulas, soluções, suspensões,
injetáveis, entre outros.9
1.4.1 Efeito Raman
O efeito Raman é um processo fundamental de troca de energia ocorrida da
interação entre a luz e a matéria. Quando a luz incide sobre uma substância, ela
poderá sofrer diversos efeitos. No que se refere ao espalhamento da luz, a maior
parte da radiação retorna com o mesmo comprimento de onda que a luz incidente e
este fenômeno é denominado espalhamento Rayleigh (elástico). Todavia, uma
pequena fração pode interferir no estado vibracional da molécula e, sendo a energia
da radiação proporcional à frequência, a mudança na frequência da luz espalhada
deve ser a frequência vibracional das moléculas (espalhamento inelástico). Esse
processo de troca de energia entre moléculas e a luz incidente é conhecido como
efeito Raman. Quando a energia do fóton incidente diminui após a interação com a
matéria, o processo é conhecido por Raman Stokes, e quando aumenta
(significando que roubou energia da matéria) é conhecido como Raman Anti-
Stokes.10 Em temperatura ambiente a maioria das moléculas se encontra no estado
fundamental e a minoria no estado excitado. Sendo assim, o efeito Raman obtido é
geralmente do tipo Stokes. É importante salientar que o espalhamento inelástico
aparece na razão de aproximadamente um fóton por milhão (0,0001%), tornando
sua detecção possível apenas com detectores de alta sensibilidade.11
O espalhamento Raman pode ser visto como uma transição da molécula do
seu estado de repouso para o estado vibracional excitado, acompanhado de
absorção simultânea do fóton incidente e da emissão do fóton espalhado. Tal efeito
da luz pode ser coletado por um espectrômetro e visualizado como um espectro, na
qual a intensidade é obtida em função da mudança da frequência induzida pela
vibração molecular. Como cada tipo de molécula tem sua própria energia de
vibração, o espectro Raman de cada espécie consistirá de picos ou bandas
deslocados para cada uma das frequências vibracionais características daquela
molécula. 10
A principal limitação da Espectroscopia Raman é a fluorescência, processo
que compete com o espalhamento Raman devido à absorção e consequente
19
decaimento das bandas eletrônicas dos átomos, pois pode interferir na detecção do
sinal Raman que é muito fraco. Porém, esse fenômeno pode ser contornado quando
da escolha de uma fonte laser com comprimento de onda longo, como na região
espectral do infravermelho próximo.12
1.4.2 Espectroscopia Raman e indústria farmacêutica: Revisão da literatura
O método ideal de controle de qualidade para produtos farmacêuticos deve
ser capaz de testar medicamentos de forma não destrutiva. A espectroscopia
Raman dispersiva no infravermelho próximo pode ser empregada de forma direta na
determinação do conteúdo de cápsulas, ou através do blister original. Niemczyk et
al. determinaram a dosagem de bucindolol pelas duas formas e observaram
espectros idênticos, porém com menor intensidade no espectro obtido através do
blister devido a perdas por reflexão da radiação incidente sobre as curvaturas da
parede do invólucro.13 Segundo Kim et al. a possibilidade de determinação de ativos
sem violar os frascos plásticos ou de vidro pode ser problemática devido às
variações entre as paredes dos mesmos, além do posicionamento de cada invólucro
no experimento. Porém, métodos de iluminação em área maior, reduzem o erro de
amostragem da parede do frasco, aumentando a reprodutibilidade e confiabilidade
das análises.14
A água apresenta um fraco espalhamento Raman na região de análise
espectral de compostos orgânicos (entre 600 e 1800 cm-1), não gerando alterações
significativas no espectro. Em consequência disso, medidas espectrais de fármacos
em meio aquoso podem ser realizadas utilizando excitação no infravermelho
próximo. De Beer et al determinaram o conteúdo do acetato de medroxiprogesterona
(MPA) por meio de FT-Raman das amostras e em seguida por HPLC. Concluíram
que o FT-Raman é mais preciso na quantificação do MPA em suspensão aquosa
quando comparado ao método HPLC, visto que este último requer o preparo das
amostras e conhecimento do volume exato da suspensão e sua densidade, o que
pode induzir a erros.15
De acordo com esta característica da água, o diclofenaco de sódio (DS) foi
quantificado em diversas diluições pelo sistema Raman dispersivo de bancada e
20
pelo sistema Raman dispersivo portátil, utilizando fibras ópticas. A técnica mostrou-
se fiel devido às intensidades dos espectros obtidos estarem correlacionadas às
concentrações do DS de cada diluição. Comparando-se o sistema portátil com o de
bancada, obteve-se semelhança de resultados, mesmo com a utilização do cabo de
fibras ópticas pelo sistema portátil.16
Segundo Mazurek et al. não é comum encontrar estudos de quantificação de
fármacos com concentração inferior a 10% pela ER. Da mesma forma, estudos de
soluções injetáveis são especialmente raros, visto que necessitam preferencialmente
ser realizados nos recipientes originais. Os autores quantificaram soluções
comerciais injetáveis, contendo 2,4% de DS e 2,4% de aminofilina, por FT-Raman.17
Ainda se tratando de quantificação de fármacos em medicamentos de baixa
concentração, Mazurek et al. testaram o potencial de quantificação da FT-Raman
em sistemas contendo de 10-20% da substância ativa. Utilizaram tabletes de
prednisolona e captopril e criaram um modelo de calibração multivariada. Por este
estudo confirmaram o potencial da espectroscopia FT-Raman combinada com
modelo de calibração multivariado para este fim.18
Orkoula et al. compararam FT-Raman com HPLC em relação aos requisitos
de validação de métodos analíticos: linearidade, exatidão, precisão, LOD e LOQ.
Quantificaram o hidrocloridrato de difenidramina (DPH) no Benadryl (elixir). O
resultado obtido com as duas técnicas foi praticamente o mesmo. O HPLC
apresentou menor LOD quando comparado ao FT-Raman, porém, o último pode ser
empregado sem necessidade de preparo de amostra e de forma não destrutiva. Os
autores concluíram que a técnica FT-Raman é uma boa ferramenta para a indústria
na determinação e monitorização da presença do princípio ativo.19
Zhihong et al. estudaram o espectro Raman de soluções supersaturadas de
boratos durante acidificação/alcalinização e diluição, a fim de conhecer mais
profundamente o comportamento químico dos sais em soluções aquosas.
Demonstraram a influência da diluição nos picos do espectro, devido à ocorrência de
polimerização/despolimerização. Demonstraram, ainda, os picos relativos a cada
grupamento químico. Concluíram que a ER também é válida na verificação do
comportamento químico de compostos em solução.20
Muitos estudos quantitativos utilizando espectros Raman têm determinado
ativos em misturas líquidas. Sato-Berrú et al. desenvolveram uma expressão
matemática que relaciona a intensidade de um determinado pico Raman com a
21
respectiva concentração do fármaco em líquidos puros ou em misturas, tornando
possível a análise quantitativa. Os autores verificaram que quanto maior o número
de solventes misturados maior o nível de erro de predição. Tal desvio é uma
provável interação dos solventes gerando novos picos Raman. Embora com a
presença de desvios, estes não foram expressivos suficientemente para invalidar o
modelo matemático desenvolvido.21
Mifune et al. salientam que, durante as análises, podem ocorrer alterações
com os fármacos, como modificações cristalinas ou em diferentes fases da matéria,
interações com excipientes, ou ainda alterações por aquecimento e/ou mudanças na
pressão do sistema. Além disso, os processos utilizados atualmente para esse fim
são destrutivos. Utilizaram FT-Raman para examinar o estado de algumas
substâncias em várias amostras: alacepril (comprimidos), esparfloxacina
(comprimidos, pós e nanopartículas), sulfato de quinidina e cafeína (partículas). O
espectro das substâncias ativas não foi alterado na formulação em comprimidos de
alacepril, comprimidos e pós de esparfloxacina e nas partículas de cafeína e sulfato
de quinidina. Todavia, a esparfloxacina em nanopartículas apresentou modificações
espectrais. Esses resultados mostraram que o FT-Raman pode ser utilizado no
controle de qualidade de preparações farmacêuticas cristalinas.22
Segundo De Beer et al., dentre as formas farmacêuticas já analisadas pela
ER, as menos estudadas são as pomadas e os cremes. Relatam, ainda, que o
tamanho das partículas influencia a intensidade do sinal Raman, o que pode resultar
em conclusões errôneas sobre a quantidade das substâncias. Os autores
compararam o AS (ácido salicílico) utilizado no preparo de pomadas por diferentes
farmacêuticos (diferentes formas de manipulação do medicamento), com aquela
utilizada no desenvolvimento de um modelo de calibração, preparada por um único
profissional. A seguir, determinaram o conteúdo do AS em todas as pomadas por
HPLC e pelo FT-Raman. Concluíram que FT-Raman é confiável na determinação de
AS em pomadas, mas a repetibilidade, embora aceitável, não superou a obtida pelo
método de referência. Foi demonstrado que, para um bom resultado, o tamanho da
partícula do ativo presente nas amostras deve ser semelhante àquele utilizado no
preparo dos padrões, pois, para este fármaco, a intensidade do sinal foi influenciada
pela granulometria.23
Estudos relativos à avaliação in vivo da capacidade de proteção de filtros
solares, usando espectroscopia Raman, tem sido descritos na literatura.24,25
22
Atualmente tem se observado um número crescente de falsificações de
medicamentos até mesmo nos países desenvolvidos, o que suscita alvo de muitas
pesquisas.26 Veij et al. testaram a ER na diferenciação de medicamentos
verdadeiros dos adulterados, comparando esse método com análise colorimétrica e
Cromatografia líquida combinada com espectroscopia de massas (LC-MS).
Concluíram que a ER pode diferenciar comprimidos antimaláricos verdadeiros dos
falsificados, e ainda determinar o “fingerprint” dos diferentes tipos de adulterantes.26
Em trabalho semelhante, os mesmos autores testaram comprimidos de Viagra®
(sildenafil) pela ER associada ao método quimiométrico de Análise dos componentes
principais (PCA) para diferenciar os comprimidos falsos dos verdadeiros. Os
mesmos concluíram que tal associação pode servir futuramente para uso nas
alfândegas, na identificação de falsos comprimidos no local onde forem
encontrados.28
Em relação ao Controle de Qualidade, Vinha Jr. desenvolveu um estudo
sobre a ER na quantificação de paracetamol no Tylenol® gotas 200 mg/mL. Os
resultados foram analisados em relação aos parâmetros de linearidade, precisão,
exatidão, limite de detecção e limite de quantificação. O autor testou diferentes
concentrações de paracetamol em polietilenoglicol ou placebo (veículo
descontamindado) de Tylenol® gotas. Apenas com o paracetamol diluído a 200
mg/mL em placebo do Tylenol® gotas é que obteve boa linearidade e exatidão. 8
1.5 Paracetamol
O paracetamol (ou acetaminofen) é um analgésico e antitérmico presente no
mercado em várias especialidades farmacêuticas, em diversas apresentações:
suspensão, solução, comprimido, cápsula e mastigáveis. Tem despertado muito
interesse devido à baixa incidência de efeitos colaterais, se comparado ao AAS
quando administrado em doses terapêuticas.29,30
Em 1949 pesquisadores confirmaram, por estudos e uso clínico, a sua
efetividade e segurança como analgésico e antitérmico. Porém, foi na década de 60
que seu uso foi amplamente difundido no alívio dos sintomas de adultos e crianças. 8
23
Ao contrário de outros analgésicos e antipiréticos como AAS, dipirona e
ibuprofeno, o paracetamol não apresenta propriedades anti-inflamatórias. Em doses
terapêuticas não irrita as paredes do estômago, nem afeta a coagulação sanguínea,
rins ou ducto arterial fetal.6 Atualmente inúmeros estudos têm indicado o
paracetamol em substituição a outros fármacos antitérmicos e analgésicos como a
dipirona, haja vista que esta pode provocar efeitos colaterais mais evidentes como
uma significativa queda na pressão arterial e no débito urinário, além de
agranulocitose que é rara e, portanto, de difícil prevenção e potencialmente letal.31
Diversas pesquisas em pediatria também apontam o ibuprofeno e o
paracetamol como preferenciais aos demais, em casos de dor e febre, visto que o
AAS pode provocar a síndrome de Reye em crianças, doença que causa danos
cerebrais e pode levar à morte.32,33
É importante ressaltar que as epidemias de dengue no Brasil contribuíram
para um aumento no uso do paracetamol, pois fármacos como o AAS são contra-
indicados por proporcionarem maior risco de hemorragias. Porém, o paracetamol
também deve ser utilizado com indicação médica, pois doses acima da usual podem
prontamente levar à hepatotoxicidade.34
Quimicamente o paracetamol é uma amida aromática acetilada (Figura 1),
sintetizada por Von Mering em 1893, podendo apresentar-se sob duas formas
cristalinas: a monoclínica (comercial) e a ortorrômbica que ocorre pelo aquecimento
da primeira.35
Figura 1 – Estrutura química do paracetamol
De acordo com dados da literatura, os grupamentos químicos responsáveis
pelos principais picos Raman característicos da molécula do paracetamol e os tipos
de vibração correspondentes são: estiramento C=O em 1649 cm-1, deformação N-H
entre 1620 e 1612 cm-1, estiramento e deformação H-N-C=O em 1562 cm-1,
estiramento C-H do agrupamento acetil em 1325 cm-1 e estiramento do anel fenólico
24
em 799 cm-1. 1, 29, 35, 36 A Tabela 2 apresenta o tipo de vibração e o deslocamento
Raman de cada grupamento supracitado.
O paracetamol é o princípio ativo (ou fármaco) de alguns medicamentos
analgésicos e antipiréticos específicos para crianças na forma de solução, visto que
as preparações líquidas são as mais adequadas ao segmento infantil.8
O medicamento utilizado neste trabalho é quantificado pela empresa que o
fabrica, pela espectroscopia de absorção no infravermelho próximo (NIRS). De
acordo com dados do fabricante, o teor de paracetamol no mesmo é de 200 mg/mL,
tendo como limite interno de liberação de lotes: 95 a 105% (190 a 210 mg/mL). 8
Dentre os métodos ópticos para caracterização do paracetamol, a ER
destaca-se pela possibilidade de identificação dos grupos moleculares presentes
nesta substância, de forma não destrutiva e em tempo real. 35 A ER associada à
técnica quimiométrica dos mínimos quadrados parciais (PLS – Partial Least
Squares) têm demonstrado resultados promissores na área farmacêutica.37
Tabela 2 – Grupamentos responsáveis pelos principais picos Raman do paracetamol e vibrações
relativas a cada um deles.
Grupamento Tipo de vibração Deslocamento C=O (amida I: 1580-1720 cm -1) estiramento 1649 cm-1
N-H deformação 1612 a 1620 cm-1
H-N-C=O (amida II:1475-1580 cm-1)estiramento e deformação
1562 cm-1
C-H (acetil) estiramento 1325 cm-1 Anel fenólico estiramento 799 cm-1
1.6 Quimiometria
A Quimiometria é a área da Química que se utiliza de ferramentas estatísticas
e matemáticas para o planejamento e otimização dos experimentos, bem como para
extrair informações relevantes de dados químicos multivariados, possibilitando
analisar mais de uma variável simultaneamente, além de identificar a correlação
entre elas.38
25
Métodos quimiométricos como a calibração multivariada são rotineiramente
aplicados em controle de processos e controle de qualidade, sendo boas
ferramentas para a PAT.39
Em associação à espectroscopia, as técnicas quimiométricas utilizam
modelos matemáticos multivariados que correlacionam a concentração do analito
em uma ampla faixa espectral, mesmo na presença de interferentes, sem
comprometer a eficiência do método.40
O PLS é um dos métodos quimiométricos multivariados mais utilizados em
associação à espectroscopia Raman 41 e sua base fundamental é a PCA. A PCA
consiste em uma manipulação da matriz de dados espectrais com o objetivo de
representar as variações presentes por meio de um número menor de fatores. Para
tal, é construído um novo sistema de eixos denominados rotineiramente de
componentes principais ou variáveis latentes, calculados a partir da variância dos
dados. A partir dessas novas variáveis, obtêm-se os escores, que são os valores
ponderados de tais variáveis em todos os espectros do conjunto de dados.42
O PLS é obtido de maneira semelhante à PCA, no entanto, no PLS a
concentração de todos os constituintes da amostra está incluída no processo de
decomposição, com isso, os espectros, contendo maiores concentrações, são
ponderados mais fortemente do que aqueles com baixas concentrações. Na
realidade, o PLS tira proveito da correlação entre os dados espectrais e as
concentrações dos constituintes. A idéia principal do PLS é obter tanta informação
da concentração quanto possível para os primeiros vetores das variáveis latentes.
Uma vez que os dados espectrais podem ser decompostos em suas variações mais
comuns, a concentração dos dados está nas primeiras variáveis. 43, 44
Na área de farmácia industrial, inúmeros trabalhos têm sido desenvolvidos na
determinação de substâncias ativas e excipientes de medicamentos, utilizando-se a
PCA16, 26 e o PLS 13, 17, 18, 37, 45, 45, 46 haja vista sua extrema adequação para tal
finalidade.
26
2 Objetivos
Este trabalho teve como objetivo principal estudar a potencialidade da
espectroscopia Raman dispersiva no infravermelho próximo (830 nm) ao utilizar
laser semicondutor de diodo e cabo de fibras ópticas na quantificação de
paracetamol em medicamento comercial (200 mg/mL). Ao construir uma curva de
calibração, com auxílio da técnica PLS, foram empregados os espectros Raman de
amostras com concentrações conhecidas e crescentes de paracetamol em veículo.
Outro objeto desta pesquisa foi verificar se a espectroscopia Raman, utilizando
fibras ópticas, atende aos critérios estabelecidos pela ANVISA para a sua validação
como técnica analítica de controle de qualidade, bem como verificar a utilidade da
técnica como ferramenta para a PAT.
27
3 Material e Métodos
3.1 Amostras utilizadas
Soluções de diferentes concentrações de paracetamol foram preparadas e
cedidas pela empresa fabricante do medicamento a ser analisado. Foram
estudadas, além do veículo puro do medicamento (placebo), várias diluições do
paracetamol no mesmo veículo e uma solução do princípio ativo diluído somente em
polietilenoglicol (PEG). O PEG é o principal componente detectável do veículo na
faixa espectral de 600 a 1800 cm-1 (Figura 5). De acordo com informações contidas
na bula do medicamento, o veículo completo é constituído de polietilenoglicol (Figura
2), ciclamato de sódio, sacarina sódica, benzoato de sódio, metabissulfito de sódio,
corante amarelo crepúsculo, aromas, hidróxido de sódio, ácido cítrico e água
deionizada.
Figura 2 - Espectro Raman do polietilenoglicol. Fonte: SIGMA ALDRICH48 - Traduzido pela autora.
As soluções de paracetamol em veículo completo (placebo) foram preparadas
nas seguintes concentrações: 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 120%,
130% em torno da concentração na qual o medicamento é comercializado (200
mg/mL = 100%), além do veículo completo puro (denominado “descontaminado”) e
de uma solução do paracetamol no polietilenoglicol (PEG) na mesma concentração
TRA
NS
MIT
ÂN
CIA
[%]
INTE
NS
IDA
DE
AB
SO
RBÂ
NC
IA
COMPRIMENTO DE ONDA 4000 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 100
NICOLET RAMAN 950
MICRONS
0102030405060708090
1002.5 4.5 5 5.5 6 7 8 9 10 11 12 13 15 20 25 30 45 100
2.01.00.7
0.50.40.3
0.2
0.1.050.0
28
da bula (100%). Essas diluições (concentrações nominais) foram preparadas por
técnicos da empresa, em seu laboratório químico, segundo procedimento interno de
fabricação. De acordo com a própria empresa, os erros relativos ao preparo
(pesagem, diluição) são pouco significativos devido ao uso de balanças de alta
precisão. A Tabela 3 mostra as soluções conforme recebidas, com a nomenclatura
utilizada pela empresa (A a J e PEG), suas concentrações de princípio ativo
(paracetamol) e o veículo utilizado em cada uma delas.
Tabela 3 – Soluções utilizadas e suas respectivas concentrações nominais de paracetamol (em % e
mg/mL) e veículos
Amostras Concentração
nominal (mg/mL)
Concentração nominal
(%) Veículo utilizado
A 210 105 Completo B 190 95 Completo C 180 90 Completo D 140 70 Completo E 240 120 Completo
F** 260 130 Completo G* 200 100 Completo H 160 80 Completo I 220 110 Completo J 0 0 Completo
PEG 200 100 Polietilenoglicol * Solução análoga ao medicamento referência.
** Solução excluída do estudo por problemas de solubilização do paracetamol.
As amostras foram previamente avaliadas com emprego da técnica de NIRS
(near-infrared spectroscopy, espectroscopia no infravermelho próximo) pela empresa
fabricante.
Logo após o recebimento, todas as soluções foram armazenadas à
temperatura média de 20ºC, umidade média do ar de 40 a 60% e ao abrigo da luz no
Laboratório de Espectroscopia Biomolecular do Instituto de Pesquisa e
Desenvolvimento (IP&D) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP).
Tais soluções foram fornecidas em duplicata e os espectros das amostras de
29
A a I foram divididos em 2 grupos, um deles utilizado para determinação da curva de
calibração e outro para validação do método de análise.
As soluções foram submetidas à espectroscopia Raman dispersiva no
Laboratório de Espectroscopia Biomolecular em um mesmo dia, sendo os espectros
processados pela técnica quimiométrica multivariada PLS.
Diferentes lotes de um medicamento referência, contendo 200 mg/mL de
paracetamol, adquiridos no comércio local, tiveram seus espectros coletados, nas
mesmas condições experimentais, com o objeto de verificar a quantidade de
paracetamol nas soluções.
3.2 Espectrômetro utilizado na obtenção dos espectros Raman do paracetamol
No presente trabalho, as soluções foram submetidas à técnica de
espectroscopia Raman dispersiva, usando o espectrômetro Raman disposto de
forma esquemática na Figura 3. Este equipamento é composto por um laser de
diodo semicondutor (GaAlAs – Micro Laser Systems Inc., modelo L4830S, CA,
EUA), com potência de saída de 100 mW e comprimento de onda de 830 nm (região
espectral do infravermelho próximo). O feixe laser de excitação passou por um filtro
holográfico passa-banda para eliminar a luz indesejável e transmitir somente o
comprimento de onda desejado. Com o emprego de uma lente de distância focal f =
26 mm para colimação e focalização, o feixe do laser foi acoplado a um cabo de
fibras ópticas de quartzo em configuração “6x1” (correspondente a uma fibra de
excitação circundada por seis fibras de coleta de sinal na extremidade de
excitação)49 com potência de saída na extremidade distal de 50 mW para direcionar
a radiação e auxiliar na coleta da luz espalhada pela amostra. O laser foi conduzido
até uma cubeta de quartzo de 4 mL que continha as amostras líquidas, por um
tempo de exposição de 50 s para cada amostra (Figura 4). O sinal proveniente da
excitação das amostras, coletado pelo cabo de fibras ópticas, foi acoplado ao
espectrógrafo (Chromex, modelo 250IS, MA, EUA) para dispersão. Na entrada do
espectrógrafo foi posicionado um filtro passa-faixa do tipo notch em 830 nm (Iridian
Spectral Technologies, modelo PN-ZX 000080, ON, Canadá) que visava bloquear o
sinal do laser retroespalhado na amostra (espalhamento Rayleigh), captado pelas
30
fibras. O espectrógrafo possui fenda de entrada de 200 µm e grade com 600
linhas/mm, que fornece uma resolução espectral de aproximadamente 12 cm-1 50. O
sinal dispersado pelo mesmo foi detectado por uma câmera CCD 1024x256,
refrigerada por nitrogênio líquido (Princeton Instruments, modelo LN/CCD-1024-
EHR1, NJ, EUA) para detecção do sinal e separação espectral, conectada a um
controlador de CCD (Princeton Instruments, modelo ST130, NJ, EUA) e um
computador para a aquisição e armazenamento dos espectros.
Figura 3 - Diagrama esquemático do sistema Raman dispersivo acoplado ao cabo de fibras ópticas
utilizado na coleta dos espectros Raman.
Os procedimentos de pré-processamento, obtenção da curva de calibração,
cálculo das figuras de mérito e validação do método foram realizados por uma rotina
desenvolvida no próprio laboratório, quando foi utilizada a planilha Microsoft Excel e
o programa Matlab (The Mathworks, versão 5.2, MA, EUA). A faixa de deslocamento
Raman selecionada para o estudo do paracetamol foi de 600 a 1800 cm-1, visto que,
de acordo com a Figura 5, nesta faixa encontra-se a maioria dos picos que
identificam o paracetamol, sendo essa região conhecida como fingerprint – a faixa
onde se encontram os compostos orgânicos.
31
Figura 4 – Detalhe mostrando o cabo de fibras ópticas imerso na cubeta contendo amostra.
Figura 5 - Espectro Raman do paracetamol (acetaminofen) Fonte: SIGMA ALDRICH51 . Traduzido
pela autora.
TRA
NS
MIT
ÂN
CIA
[%]
INTE
NS
IDA
DE
AB
SO
RB
ÂN
CIA
COMPRIMENTO DE ONDA 4000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 100
0102030405060708090
1002.5 4 4.5 5 5.5 6 7 8 9 10 11 12 13 15 20 25 30 45 100
0.0
.050.1
0.1
0.30.40.50.60.71.02.0
MICRONS
NICOLET RAMAN 950
32
3.3 Pré-processamento
A etapa de pré-processamento é importante no auxílio à extração de
informações e, consequentemente, na interpretação dos dados obtidos.
Primeiramente o espectrômetro foi calibrado em deslocamento Raman. Para
tal, utilizou-se uma substância que apresenta bandas Raman conhecidas na faixa
espectral de interesse. A posição dessas bandas no espectro coletado (em pixels)
foi determinada e um polinômio de ordem 3 correlacionado ao deslocamento das
bandas Raman com a posição em pixel. A função polinomial de ordem 3 foi
empregada, uma vez que tem sido descrita na literatura como mais precisa e melhor
representativa da função de dispersão em instrumentos dispersivos de imagem e
detecção por câmera CCD.52 A substância utilizada neste experimento foi o
naftaleno, que possui picos Raman em 764, 1022, 1147, 1383, 1464 e 1577 cm-1.53
Após essa etapa, fez-se necessário remover a fluorescência de fundo
(background) residual que acompanha os espectros Raman, para eliminar esta fonte
de interferência. Para tanto, foi calculada uma equação polinomial de ordem 3
utilizando-se a intensidade dos espectros de cada amostra em 6 pontos de mínimo
(baseline) na faixa entre 600 e 1800 cm-1, e este polinômio foi então subtraído do
espectro bruto, permanecendo assim os picos Raman de alta frequência.54, 55 Essa
rotina foi desenvolvida no software Matlab.
Em seguida, foi realizada a normalização dos espectros pelo pico Raman, que
ocorre em 1450 cm-1, por tratar-se de informação espectral contida em todos os
espectros analisados e por ser um pico característico do polietilenoglicol (Figura 2),
principal componente do veículo detectável na faixa Raman do fingerprint. Esse
tratamento dos dados foi realizado por meio de planilha Excel, determinando-se a
intensidade no pico acima e dividindo-se todo o sinal por esta intensidade. Os dados
tiveram a média subtraída (mean subtracting). Nesse procedimento, calculou-se o
espectro médio do conjunto de dados de calibração e efetuou-se a subtração desta
média de cada espectro, tanto de calibração quanto de validação. 40 O objetivo desta
etapa foi reforçar as diferenças entre as amostras, para facilitar a extração de
informações úteis e a interpretação dos dados, eliminando, assim, a primeira fonte
de variações espectrais, no caso, todos os sinais que contribuem para a média.
33
3.4 Obtenção da curva de calibração
A calibração multivariada visa encontrar um algoritmo matemático que
produza propriedades de interesse a partir dos resultados registrados pelo
instrumento. Uma vez encontrado, este poderá ser usado para prever a
concentração do componente de interesse em amostras de composição
desconhecida, usando a resposta instrumental das mesmas. 40
Neste estudo foi criado um modelo de calibração multivariada utilizando o
método PLS com os valores das concentrações nominais das amostras de A até I
(Tabela 3), e as intensidades de seus espectros Raman da primeira coleta.
Para obtenção da curva de calibração multivariada foi utilizado o ambiente
computacional Matlab (versão 4.2), aplicando-se a função:
[p,q,w,t,u,b,ssq] = pls(x,y,lv,1) (1)
onde os dados de entrada da função são:
x = espectros (variáveis independentes);
y = valores de concentrações nominais (variáveis dependentes);
lv = número de variáveis latentes;
e os dados de saída da função são:
p = carregamento das variáveis independentes;
q = carregamento das variáveis dependentes;
w = importância das variáveis independentes;
t = escores das variáveis independentes;
u = importância das variáveis dependentes;
b = vetor coeficiente interno do PLS;
ssq = tabela de variâncias entre x e y obtida pelo modelo PLS.
Uma vez obtida a curva de calibração multivariada, conforme descrito
anteriormente, pode-se prever a concentração de amostras desconhecidas com o
emprego da função:
ypred = plspred(x,b,p,q,w,lv). (2)
34
onde os dados de entrada já foram descritos para a função (1), e o dado de saída é:
ypred = concentração da amostra sob avaliação.
Um passo importante para a aplicação do método PLS é a definição do
número de variáveis latentes. Para tal, utilizando-se as funções 1 e 2, foram sendo
substituídos em ambas os números de variáveis latentes, desde 1 até 5, e foram
calculados os erros padrão de predição (SEP, do inglês standart error of prediction).
A função do SEP é determinar o quanto o PLS é capaz de prever concentrações de
amostras não utilizadas na construção do modelo. 42 , 56 A expressão utilizada para
cálculo do erro padrão foi a seguinte: 1
( )100
1
2
1
2
×−
=
∑
∑
=
=n
ii
n
iii
Ca
CaCSEP (3)
Onde:
Cai = concentração nominal do princípio ativo;
Ci = concentração predita pelo modelo PLS (Raman);
n = número de amostras;
SEP = Standart error of prediction - Erro padrão de predição (%).
A Figura 6 demonstra os valores de SEP obtidos em função do número de lv,
em que o erro padrão de predição obtido com uma lv é semelhante ao obtido com
três, quatro ou cinco lv, e menor do que o obtido com duas.
35
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
1 2 3 4 5
Erro
pad
rão
de p
revi
são
(%)
Variáveis latentes (número) Figura 6 – Gráfico demonstrando os erros padrão de predição (SEP) obtidos com diferentes números
de variáveis latentes.
Finalmente, considerando-se o número de variáveis latentes igual a 1, a
função (1) foi novamente empregada para determinar a curva de calibração
multivariada adequada.
3.5 Validação
A seguir, foi realizada uma etapa correspondente à aplicação prática do
modelo, ou validação final. Para isso, foram adquiridos em drogarias locais 6 frascos
de diferentes lotes do medicamento de referência, os quais foram utilizados como
soluções de validação. Foi aplicada a função (2) nos espectros dessas amostras
para previsão das suas concentrações de paracetamol.
A empresa fabricante do medicamento de referência forneceu a concentração
de paracetamol presente em cada um dos lotes, obtida pelo método NIRS. Tais
valores, assim como aqueles valores de concentração obtidos pela técnica Raman
associada ao PLS (ER/PLS) foram comparados ao valor nominal (200 mg/mL) pelo
cálculo do erro padrão.
36
3.6 Obtenção das figuras de mérito preconizadas pela ANVISA
3.6.1 Intervalo
Foi determinado um intervalo de 70% a 130%, porém este último valor fora
excluído por problemas de solubilização do paracetamol, resultando finalmente no
intervalo de 70% a 120%.
3.6.2 Seletividade e especificidade
Foram consideradas como calibração as soluções G (200 mg/mL de
paracetamol no veículo puro) em 6 réplicas e as soluções PEG (200 mg/mL de
paracetamol no polietilenoglicol) como previsão também em 6 réplicas, a fim de
verificar se a técnica proposta seria capaz de identificar e quantificar o paracetamol
mesmo em veículos diferentes.
3.6.3 Linearidade
Foi obtida a partir da determinação da concentração de 5 soluções de
concentrações diferentes (80, 90, 100, 110 e 120%) pela ER/PLS e com os
resultados nominais em mg/mL, construiu-se uma curva. Calculou-se o coeficiente
angular (m) que determina a proporcionalidade da função analítica, a equação
reduzida da reta ou coeficiente linear (h) e finalmente o coeficiente de correlação (r).
O critério mínimo de aceitação é de r = 0,99.5
37
3.6.4 Precisão intracorrida (repetibilidade)
Foram feitas determinações de concentrações baixa, média e alta (80, 100 e
120% respectivamente) em triplicata, totalizando 9 soluções analisadas. A precisão
foi expressa como desvio padrão relativo (DPR), segundo a fórmula:
100×=CMDDPDPR (4)
Onde:
DP = desvio padrão;
CMD = concentração média determinada.
O DP foi inicialmente calculado pela equação:
( )
11
2
−
−=
∑=
n
CMDVODP
n
i (5)
Onde:
VO = valor obtido no ensaio
CMD = concentração média determinada
Foi pré-estabelecido um DPR ≤ 5%, visto que o valor máximo aceitável deve
ser definido de acordo com a metodologia empregada, a concentração do analito na
amostra, o tipo de matriz e a finalidade do método, não se admitindo valores
superiores a 5%. 5
3.6.5 Exatidão
Foi determinada a partir de 9 determinações contemplando o intervalo linear
do procedimento, ou seja, concentrações baixas, média e alta (80, 100 e 120%
respectivamente) com 3 espectros de cada.
A exatidão foi expressa pela recuperação, que se trata de uma relação entre o
valor adicionado (concentração nominal correspondente) e o valor obtido
(concentração determinada experimentalmente). Isso indica o quão próximos estão
38
os mesmos, ou seja, o quanto foi recuperado daquilo que foi adicionado ao
equipamento em teste. A equação utilizada foi:
100×=VA
CMEEXAT (6)
Onde:
CME = concentração média experimental (valor médio obtido pela técnica)
VA = valor adicionado (concentração nominal)
39
4 Resultados
4.1 Espectro do paracetamol
O espectro do paracetamol foi obtido indiretamente, por meio da subtração do
espectro da solução J (placebo, veículo descontaminado) do espectro da solução G
cujo conteúdo é idêntico ao do medicamento referência (200 mg/mL de paracetamol
em placebo). Os espectros das duas soluções e o espectro do paracetamol
resultante da subtração podem ser visualizados na Figura 7. A Figura 8 mostra o
espectro do paracetamol com seus principais picos relativos às ligações químicas
responsáveis pelas vibrações características desta molécula.1, 8, 29, 35
Figura 7 – Espectro do paracetamol (deslocado 3 u.a. no eixo vertical), da solução de placebo com
paracetamol (sol G – deslocada 1 u.a. no eixo vertical) e da solução de placebo (sol J).
0
1
2
3
4
5
600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
Inte
nsid
ade
Ram
an n
orm
aliz
ada
pelo
pic
o a
1450
cm
-1[u
.a.]
Deslocamento Raman [cm-1]
Paracetamol (sol G - sol J) Placebo + Paracetamol (sol G) Placebo (sol J)
40
Figura 8 – Espectro do paracetamol obtido indiretamente e seus principais picos.
4.2 Espectro do polietilenoglicol
O espectro do polietilenoglicol, o principal componente do veículo, foi obtido
subtraindo-se o espectro da solução PEG (200 mg/mL de paracetamol +
polietilenoglicol) do espectro do paracetamol puro (resultante de subtração
matemática). A Figura 9 apresenta os três espectros e evidencia o pico a 1450 cm-1
no espectro do polietilenoglicol, o qual fora utilizado na normalização de todos os
demais espectros utilizados neste trabalho.
4.3 Comparação entre os espectros do polietilenoglicol puro e do placebo
Os espectros do polietilenoglicol (obtido indiretamente por subtração) e do
placebo (solução J, obtido diretamente) foram plotados em um mesmo gráfico
(Figura 10), demonstrando que o polietilenoglicol é realmente o principal constituinte
do placebo que pode ser detectado na região do fingerprint.
-0,2
0,2
0,6
1
1,4
1,8
600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
Inte
nsid
ade
Ram
an n
orm
aliz
ada p
elo
pico
a14
50 c
m-1
[u.a
.]
Deslocamento Raman [cm-1]
799
cm-1
1562
cm
-1
1620
cm
-1
1649
cm
-1
Paracetamol (sol G – sol J)
1325
cm
-1
41
Figura 9 – Espectro do polietilenoglicol, da solução de polietilenoglicol com paracetamol (deslocado 1
u.a. no eixo vertical), e do paracetamol isolado (deslocado 3 u.a. no eixo vertical).
-0,2
0,2
0,6
1
1,4
600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
Inte
nsid
ade
Ram
an n
orm
aliz
ada p
elo
pico
a 14
50 c
m-1
[u.a
.]
Deslocamento Raman [cm-1]
Polietilenoglicol (sol peg - Paracetamol) Placebo (sol J)
Figura 10 – Espectros do polietilenoglicol e do placebo.
0
1
2
3
4
5
600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
Inte
nsi
dad
e R
aman
no
rmal
izad
a p
elo
pic
o a
145
0 cm
-1[u
.a.]
Deslocamento Raman [cm-1]
Paracetamol (sol G - sol J) Peg+ Paracetamol (sol peg) Polietilenoglicol (sol peg - Paracetamol)
1450 cm-1
42
4.4 Espectros Raman com as variações de concentração em torno do
medicamento estudado
Os espectros Raman das soluções de A a I (exceto a solução F), que contém
quantidades diferentes de paracetamol dissolvidas em placebo, normalizados pelo
pico em 1450 cm-1, são visualizados na Figura 11.
Figura 11 – Espectros Raman das soluções de A a I, com suas respectivas concentrações de
paracetamol.
4.5 Obtenção do modelo de calibração PLS e validação
A partir dos espectros Raman das concentrações nominais de 70, 80, 90, 95,
100, 105, 110 e 120% de paracetamol em placebo do grupo 1, foi desenvolvido um
modelo de calibração utilizando o PLS, a partir da função (1) aplicada nas soluções
citadas acima. Com os parâmetros extraídos do grupo de calibração, foi
desenvolvido o procedimento de validação utilizando-se a função (2) nos espectros
do grupo 2 (réplica com as mesmas concentrações), obtendo-se os valores previstos
pelo modelo, conforme Tabela 4. Por meio do pré-processamento mean subtracting,
43
os resultados das concentrações preditas variam em torno do zero. A Figura 12
demonstra os resultados previstos das concentrações do grupo de validação
utilizando PLS com 1 lv e compara com as concentrações nominais das soluções.
Tabela 4 – Valores de concentração predita utilizando 1 lv tendo como referência as concentrações
nominais. Em função do mean subtracting, os valores de concentração são referenciados a partir da
relação 100% (200 mg/mL) = 0.
Valor nominal da diluição (%)
Valor nominal da diluição
subtraída de 100% (%)
Concentração prevista PLS com 1 lv (%)
70 -30 -27,8 80 -20 -19,4 90 -10 -9,3 95 -5 -5,0 100 0 -0,0 105 5 8,6 110 10 11,8 120 20 24,5
SEP = 1,6%
Figura 12 –: Resultados da predição das concentrações do grupo 2 (validação) utilizando modelo PLS
com 1 lv comparados com as concentrações nominais das diluições.
44
Comparando-se os valores obtidos pelo método proposto com os valores
nominais verificou-se que o SEP encontrado foi de 1,6%, mostrando que o método
oferece adequada previsão na quantificação de amostras.
4.6 PLS de validação do método com espectros de lotes comerciais do
medicamento de referência
Aplicou-se o modelo de calibração PLS nos espectros dos medicamentos
comerciais para determinar a quantidade de paracetamol presente nas amostras.
Observou-se que a quantidade predita pela ER/PLS em cada amostra aproximou-se
mais do valor nominal (200 mg/mL) do que aqueles obtidos pela técnica NIRS,
apresentando erros relativos a cada amostra menores que 1,9%, o que pode ser
observado na Tabela 5. Os espectros dos medicamentos comerciais e do desvio
padrão espectral entre eles podem ser visualizados na Figura 13. A Figura 14
apresenta uma comparação entre as concentrações obtidas por NIRS e por ER/PLS,
bem como os erros de cada técnica.
Tabela 5 – Quantidades calculadas por ER/PLS e por NIRS
Medicamento de referência (comercial)
Valor nominal (mg/mL)
ER/PLS (mg/mL)
Erro ER/PLS
(%)
NIRS (mg/mL)
Erro NIRS (%)
med_ref_1 200,0 201,3 0,7 202,0 1,0 med_ref_2 200,0 202,7 1,4 204,0 2,0 med_ref_3 200,0 199,0 0,5 207,4 3,7 med_ref_4 200,0 201,5 0,8 202,0 1,0 med_ref_5 200,0 201,4 0,7 204,0 2,0 med_ref_6 200,0 203,8 1,9 206,4 3,2
45
Figura 13 – Espectros Raman dos medicamentos comerciais e do desvio padrão.
Figura 14 – Quantidades em mg/mL de paracetamol em cada amostra pelos métodos ER/PLS (∆) e
NIRS (●). Valor nominal (_.._.._) do paracetamol.
46
4.7 Figuras de mérito ANVISA
4.7.1 Intervalo
Foi estabelecido o intervalo de 70 a 120% 5.
4.7.2 Seletividade e especificidade da técnica
Ao compararem-se os valores de concentração do paracetamol nas soluções
G (de 1 até 6) e PEG (também de 1 até 6), utilizando erros relativos, foi possível
testar a seletividade da técnica (Tabela 6).
O maior erro relativo calculado foi obtido na comparação da solução G com a
solução PEG no teste 6, e foi de 2,4% mostrando que a técnica permite detecção do
componente principal da amostra (o paracetamol) em diferentes veículos.
Tabela 6 – Concentrações das soluções e erro de previsão.
Teste Sol. G1 a G6 (calibração) %
Sol. PEG1 a PEG6 (previsão) %
Erro relativo [%]
1 99,1 98,9 0,2% 2 100,3 98,7 1,6% 3 100,2 98,4 1,8% 4 100,1 98,3 1,8% 5 99,7 98,2 1,5% 6 100,6 98,2 2,4%
4.7.3 Linearidade
Para avaliação da linearidade do método, foram determinadas as
concentrações de 5 soluções em placebo do medicamento, a saber: solução H
(80%), Solução C (90%), Solução G (100%), Solução I (110%), Solução E (120%).
Os resultados foram comparados com os valores de NIRS conforme Tabela 7. A
Figura 15 apresenta a curva padrão obtida.
47
Tabela 7 – Concentrações nominais de paracetamol e obtidas por ER/PLS.
Soluções Valor nominal ER/PLS NIRS
(Nomenclatura) (%) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
H 80 160 166,9 172,8 C 90 180 186,9 184,6 G 100 200 198,3 199,8 I 110 220 219,3 215,6 E 120 240 229,7 233,6
160
170
180
190
200
210
220
230
240
160165170175180185190195200205210215220225230235240
Con
cent
raçã
o ob
tida
-Ram
an (m
g/m
L)
Concentração Nominal (mg/mL)
Figura 15 – Curva padrão de linearidade com as concentrações obtidas ER/PLS referentes às
concentrações nominais das 5 soluções.
A curva padrão de linearidade obtida foi y = 0,790x + 42,149 (y = a.x + b,
onde a - coeficiente angular e b - intercepto da reta com o eixo das ordenadas). O
coeficiente de regressão linear obtido foi r = 0,99 indicando adequada correlação
entre os dados. 5
4.7.4 Precisão (repetibilidade)
Para o cálculo da precisão (repetibilidade) foram utilizadas 3 soluções
(concentrações baixa, média e alta) com 6 coletas espectrais de cada amostra, no
48
caso Solução H, contendo 80% da quantidade comercial de paracetamol, ou seja,
160 mg/mL, solução G, contendo 100% da quantidade comercial, ou seja, 200
mg/mL e solução E, contendo 120% da quantidade comercial, ou seja, 240 mg/mL.
Foi calculado o Desvio Padrão Relativo (DPR) das concentrações obtidas por
ER/PLS. A ANVISA aceita valores de DPR ≤ 5%.5
A Tabela 8 apresenta os dados utilizados no cálculo do DPR para as soluções
de concentrações baixas.
A Tabela 9 apresenta os dados utilizados no cálculo do DPR para as soluções
de concentrações médias.
Tabela 8 – Precisão: Soluções de concentração baixa (H): 80%
VO ER/PLS (mg/mL)
CMD (mg/mL)
(VO - CMD)2
(mg/mL)2 DP
(mg/mL) DPR (%)
168,5 0,6 166,8 0,8 168,1 0,2 167,1 0,4 169,2 2,3 166,7
167,7
1,0
1,0 0,6
Tabela 9 – Precisão: Soluções de concentração média (G): 100%
VO ER/PLS (mg/mL)
CMD (mg/mL)
(VO - CMD)2 (mg/mL)2
DP (mg/mL)
DPR (%)
194,9 8,4 198,2 0,2 198,2 0,2 195,6 4,8 196,4 2,0 203,1
197,8
28,1
2,9 1,5
A Tabela 10 apresenta os dados utilizados no cálculo do DPR para as
soluções de concentrações altas.
49
Tabela 10 – Precisão: Soluções de concentração alta (E): 120%
VO ER/PLS (mg/mL)
CMD (mg/mL)
(VO - CMD)2
(mg/mL)2 DP
(mg/mL) DPR (%)
223,6 1,4 232,5 59,3 233,2 70,6 *198,5 691,7 228,9 16,8 232,3
224,8
56,3
13,4 6,0
* Possível ponto fora da curva (outlier)
A Tabela 11 apresenta os dados utilizados no cálculo do DPR para as
soluções de concentrações altas, sem o ponto considerado como outlier.
Tabela 11 – Precisão: Soluções de concentração alta (E): 120%, sem o outlier
VO ER/PLS (mg/mL)
CMD (mg/mL)
(VO - CMD)2
(mg/mL)2 DP
(mg/mL) DPR (%)
223,6 1,4 232,5 59,3 233,2 70,6
-- -- 228,9 16,8 232,3
230,1
56,3
4,0 1,7
Pode-se verificar que, para as soluções de concentração abaixo da média do
medicamento (80%) e para as soluções de concentração na média (100%), os
desvios padrão relativos obtidos encontraram-se abaixo do limite máximo
especificado pela ANVISA. Já nas concentrações mais altas que a média (120%),
isto não ocorreu, obtendo-se um DPR de 6,0. Esse fato pode ter sido causado pela
presença de um valor destoante dos demais (outlier) no conjunto de medidas. Porém
ao ser descartado, foi possível minimizar o erro devido a causas especiais desse
ponto e obteve-se, então, um valor de DPR mais condizente com o restante do
conjunto de dados.
50
4.7.5 Exatidão
A exatidão foi calculada pelo uso das soluções utilizadas no cálculo da
precisão, em triplicata, sendo determinada por meio de desvio relativo e ensaios de
recuperação, conforme Tabela 12.
O critério de aceitação estabelecido para Desvio Relativo foi ≤ 2%. Valores
satisfatórios de recuperação situam-se entre 98 e 102%.5
Tabela 12 – Resultados do cálculo de exatidão.
Concentração baixa 80% (H)
Concentração média 100% (G)
Concentração alta 120% (E)
Valor nominal (mg/mL) 160,0 200,0 240,0 Valor Médio Obtido de três medições ER/PLS (mg/mL) 167,7 197,8 230,1
Valor Obtido por NIRS (mg/mL) 172,8 199,8 233,6
Desvio Absoluto ER/PLS(mg/mL) -7,7 -2,2 -9,9
Desvio Relativo ER/PLS (%) -4,6 -1,1 -4,3
Recuperação ER/PLS (%) 104,8 99,0 96,0 Recuperação NIRS (%) 108,0 99,9 97,3
As soluções de concentração baixa e alta apresentaram valores recuperação
fora dos limites de aceitação estabelecidos, ao contrário da solução de concentração
média, que apresentou valor satisfatório. Calculando-se os valores de recuperação
do NIRS, observou-se semelhança de resultados, exceto para a concentração baixa.
51
5 Discussão
A indústria farmacêutica mundial encontra-se em busca de aperfeiçoamento
dos métodos para o monitoramento de fármacos durante todo o processo de
produção,5, 57 já que a maioria das técnicas de alta performance utilizada atualmente
necessita de preparação das amostras com uso de diluentes, sendo destrutivas,
dispendiosas tanto de insumos quanto de tempo.45, 57 É certo que o tempo entre a
produção e a análise da qualidade do medicamento acabado preocupa o fabricante,
porquanto é um período em que o produto não está sendo comercializado e seu
prazo de validade já está sendo considerado. Salienta-se, ainda, a importância
social deste tipo de análise, pois a partir dela é que lotes inteiros serão liberados à
comercialização, sendo, portanto, fundamental que o método utilizado na
quantificação de fármaco seja confiável acima de tudo. A literatura denota que a
espectroscopia Raman dispersiva, associada ao método quimiométrico PLS
(ER/PLS), tem correspondido às expectativas de agilidade e não destruição de
amostras na determinação quantitativa de alguns fármacos e se mostrado fidedigna
.14, 45, 45, 46
Neste trabalho utilizou-se a ER dispersiva como método de avaliação
quantitativa do paracetamol em amostras comerciais de um medicamento de
referência. As amostras preparadas pela empresa fabricante do medicamento sob
estudo, foram divididas em 2 grupos os quais foram utilizados na construção da
curva de calibração e na validação da mesma. Foram utilizados dois espectros de
cada uma das soluções, um para calibrar e outro para validar o método, pois dessa
forma é possível descartar erros de diluição. Pelo fato de que as amostras de teste
constituem-se do paracetamol em diferentes diluições no veículo (placebo), que
contém água além de vários adjuvantes farmacotécnicos, o sistema Raman
dispersivo vem sendo considerado o mais vantajoso.9 Ainda como vantagens do
sistema dispersivo, estão a capacidade de obtenção de espectro com alta relação
sinal-ruído, a utilização de laser de baixa potência na região do infravermelho
próximo e menor tempo de coleta do espectro, já que com o uso de detetor
multicanal e espectrógrafo de imagem, a coleta de todo o espectro é feita de uma
única vez, diferente do que ocorre no sistema FT-Raman, cujo espectro depende de
um escaneamento da faixa espectral. 9
52
É pertinente comentar que neste estudo foi utilizado um sistema dispersivo de
bancada (aberto), e esse fato contribuiu de forma didática para a compreensão do
funcionamento do mesmo, destacando-se a visualização e o reconhecimento dos
equipamentos que constituem o espectrômetro. Certamente, um sistema fechado,
compacto e com menos interferências externas, vem ao encontro das necessidades
da indústria, o que pode justificar a maior quantidade de trabalhos com o FT-
Raman.15,17, 19, 23, 36 Porém, atualmente já se encontra no mercado equipamentos
Raman dispersivos compactos e fechados (RamanStation® 400 – Perkin Elmer) e
ainda com possibilidade de acoplamento a cabo de fibras ópticas (Dimension-P2®
Raman System - Lambda Solutions e DXR SmartRaman Spectrometer® – Thermo
Scientific).
A introdução da fibra óptica ao sistema Raman vem possibilitar análises on
line, em harmonia com o guia PAT, em que são estabelecidos requisitos para tornar
as análises industriais mais rápidas, seguras e confiáveis, e facilita a chegada da luz
laser até a linha de produção ou a locais de difícil acesso.3 Tendo em vista essas
premissas, no presente trabalho utilizaram-se um cabo de fibras ópticas, com o
intuito de, além de análises on line, obter-se reprodutibilidade na potência de saída e
na área de irradiação da amostra e coleta do sinal, tornando o sistema mais estável
com garantia de repetibilidade da excitação e coleta dos espectros.45
O método PLS vem sendo utilizado preferencialmente aos modelos clássicos
de quantificação em análises químicas, quando aplicado a métodos
espectroscópicos. Em sistemas complexos e multivariados, tais como análise de
ingredientes ativos em medicamentos, a regressão linear univariada clássica torna-
se insuficiente frente à quantidade de dados que podem ser obtidos a partir de um
espectro. O PLS inclui todas as variáveis relevantes no modelo e, assim, a
calibração pode ser realizada com eficiência mesmo na presença de interferentes,
enquanto que os métodos de calibração univariada necessitam de amostras simples
(ex. compostos puros) para que se obtenham resultados satisfatórios.39 A calibração
multivariada é condizente com PAT, na qual é preconizada a manutenção on line da
qualidade dos experimentos.42
Tanto a ER como a NIRS são ótimos candidatos para PAT, ambos
possibilitando análises não invasivas e não destrutivas.45, 57 A empresa fabricante do
medicamento de referência do presente estudo utiliza a NIRS no controle de
qualidade do mesmo e, segundo alguns autores, essa técnica tem se destacado na
53
última década como umas das mais utilizadas pela indústria farmacêutica no
controle de qualidade de medicamentos.58 Todavia, de acordo com Bosch et al. a
técnica NIRS é restrita à determinação de poucos componentes, devido à
possibilidade de sobreposição de bandas de interesse dos produtos em análise.6
Deve ser considerado ainda o fato de que a indústria necessita de agilidade, sendo
interessante a detecção do fármaco no próprio frasco que será comercializado e,
neste caso, a ER oferece vantagem sobre NIRS por fornecer uma configuração
óptica mais simples para este tipo de medição.14
Neste trabalho, os valores obtidos por NIRS na quantificação de paracetamol
das soluções de 70 a 120% deste fármaco em placebo e dos medicamentos
comerciais foram comparados com os resultados obtidos por ER/PLS. Inicialmente,
espectros das amostras obtidos por ER foram plotados e foi possível observar os
picos Raman do paracetamol e dos constituintes do veículo. A solução denominada
F (130% de paracetamol) foi excluída dos resultados por problemas de solubilização.
Pela comparação dos espectros das diferentes concentrações, verificou-se a
coincidência da posição das bandas Raman em todos os espectros, e também as
diferenças nas concentrações de cada uma destas soluções, através das crescentes
intensidades dos picos. De acordo com a Farmacopéia Britânica, a intensidade da
banda Raman é diretamente proporcional à concentração dos componentes de
espalhamento da amostra.12
No espectro do paracetamol puro pode-se observar as principais bandas
responsáveis pelas vibrações da molécula do fármaco. Em relação à constituição do
veículo utilizado (placebo), não pode ser ignorado o fato de que a água deionizada
também é utilizada na sua fabricação, porém esta substância apresenta um fraco
espalhamento Raman, não sendo detectável na região espectral selecionada.15
Deve-se considerar também que, de acordo com a bula do medicamento utilizado,
os demais constituintes do veículo são conservantes, corantes, aromatizantes,
antioxidantes, ajustadores de pH e edulcorantes, que são utilizados em baixas
concentrações, justificando a evidenciação do polietilenoglicol no espectro do
placebo completo.
O modelo PLS, aplicado ao conjunto de espectros de validação, mostrou que
o erro de previsão aumentou quando se utilizou 2 lv comparativamente a utilização
de 1 lv. Optou-se, então, pelo uso de 1 lv para a construção do modelo, o que já era
54
esperado, visto que o único componente a sofrer variação nas amostras analisadas
era o paracetamol.
Corroborando o método de validação de Orkoula et al., algumas amostras
comerciais do medicamento referência do presente estudo foram utilizadas para
validação do modelo criado.19 Para tal, foram adquiridos diferentes lotes do
medicamento em gotas contendo 200 mg/mL de paracetamol. Comparando-se as
concentrações de paracetamol de cada um dos lotes obtidas pela técnica ER/PLS
com o resultado nominal (ou seja, aquele valor que consta na bula do medicamento,
no caso 200 mg/mL), verificou-se uma importante similaridade, com erros relativos
muito baixos, não excedendo de 1,9%. Cabe ressaltar que a técnica NIRS
apresentou valores, em sua maioria, um pouco superiores ao valor nominal. De
qualquer forma, o maior erro relativo obtido por ER/PLS é considerado pequeno,
sugerindo que a técnica proposta tem condições de ser utilizada na quantificação do
paracetamol do medicamento referência, apesar do pequeno número de amostras
avaliadas. Fortalece esta afirmação o baixo valor de desvio padrão espectral médio
obtido entre os 6 medicamentos analisados (DP = 0,01).
Orkoula et al. validaram seu método Raman avaliando parâmetros como
linearidade, exatidão e precisão da mesma forma que Vinha Jr e Cordeiro. 2,8,19 Tais
parâmetros fazem parte das figuras de mérito descritas pela ANVISA na resolução
RE 899/03, e no presente trabalho foram calculados demonstrando que a ER/PLS é
capaz de reproduzir as quantidades do analito apresentando boa linearidade, pois o
índice de correlação obtido pela comparação entre os resultados ER/PLS com os
resultados nominais das soluções ficou dentro do esperado, que é menor ou igual a
0,99. 5 Calculando-se a precisão do método ER/PLS, pode-se observar que o
mesmo é bastante preciso para concentrações mais baixas (80%) que a
concentração do medicamento, da mesma forma que para a concentração média
(100%), em que os DPR não excederam de 1,5% (A ANVISA admite DPR até 5%). 5
Para concentrações maiores (120%) verificou-se primeiramente um DPR de 6% Tal
fato pode ser explicado pela presença de um valor de medição destoante do restante
do grupo, e então esse foi admitido como outlier e excluído do cálculo do valor
médio, resultando em um novo DPR de 1,7%.O método pode ser considerado como
tendo boa exatidão para a solução de concentração média (100%) onde os valores
obtidos de DPR e do ensaio de recuperação mantiveram-se dentro dos valores
considerados satisfatórios, em oposição às soluções de concentração 80% e 120%
55
que apresentaram DPR pouco acima do esperado e recuperação fora da faixa de
aceitação, porém não muito distantes desta.
Ainda em se tratando da RE 899/03, realizou-se uma etapa de verificação da
seletividade do método e verificou-se que o mesmo é capaz de identificar o princípio
ativo, mesmo em diferentes veículos, demonstrando um erro relativo de 2,4% no
teste 6, sendo este o maior erro obtido. Técnicas como a HPLC são capazes de
fornecer melhores resultados das figuras de mérito do que os obtidos por técnicas
espectroscópicas, porém, costumam consumir solventes e dispor de maior tempo de
análise.59
Em estudo semelhante, Vinha Jr. quantificou o paracetamol também por
espectroscopia Raman dispersiva, porém, com laser de Argônio bombeando
Ti:safira. Em relação à linearidade, pode-se afirmar que para concentrações em
torno de 200 mg/mL o método demonstrou proporcionalidade entre a concentração
do princípio ativo e a resposta espectral. Nessa faixa de concentração o método do
mesmo autor pode também ser considerado exato, em semelhança ao presente
estudo.8 Verificou-se que o sistema utilizado pelo autor não proporcionou resultados
precisos. Em oposição, o laser de diodo semicondutor utilizado no presente estudo
proporcionou equivalente comprimento de onda de excitação do material em 830
nm, baixa variação da potência de saída o que proporcionou maior precisão dos
resultados obtidos. Além dessas características técnicas, salienta-se também seu
menor custo quando comparado ao laser de Ti:Safira.60 Pela utilização de cabo de
fibras ópticas obtiveram-se potência estável e reprodutibilidade na geometria de
excitação e coleta dos espectros, com a possibilidade de irradiar proporcionalmente
a mesma área, uma vez que o cabo fora introduzido na cubeta contendo a amostra,
ao contrário da situação em que o feixe precisa atravessar o recipiente que contém
as soluções, considerando que esses podem apresentar irregularidades em suas
paredes, proporcionando irradiação desigual das amostras e também
comprometendo a regularidade da potência do laser depositada sobre cada amostra,
como demonstrado através do estudo de Vinha Jr, no qual a cubeta fora submetida
a 6 rotações de 90° para cada amostra. 8 Soma-se a isso a utilização de excitação
na região do infravermelho próximo, que minimizou a emissão de fluorescência
gerada em amostras orgânicas, melhorando a relação sinal-ruído devido ao “shot
noise” (ruído de fóton), tornando a ER dispersiva na região IV comparável ao HPLC
e a UV-Vis, em conformidade com Vinha Jr, Hanlon et al.,e Lopez-Gil et al. 8,10, 60
56
Futuramente, sugere-se a realização de uma análise espectral detalhada de
cada constituinte do veículo padrão (placebo) do medicamento estudado, a inclusão
de variações nas quantidades relativas dos mesmos, a fim de identificar a sua real
influência na análise espectrométrica da solução completa deste medicamento em
gotas. Além disso, seria importante avaliar a influência do potencial hidrogeniônico
(pH) e da temperatura sobre os resultados, o que possibilitaria a determinação da
robustez do método. Dessa forma, de acordo com a RE 899/03, todas as figuras de
mérito pré-estabelecidas seriam avaliadas e, dependendo dos resultados, a
espectroscopia Raman poderia ser finalmente validada para o controle de qualidade
do medicamento. É aconselhável ainda testar o modelo utilizado para medicamentos
contendo mais de um princípio ativo, visto que o método quimiométrico PLS
demonstra plena capacidade de identificar mais de uma substância na mesma
amostra. Seria interessante, para tais finalidades, utilizar um sistema Raman
compacto.
57
6 Conclusões
Pode-se concluir com este trabalho que a espectroscopia Raman dispersiva
no infravermelho próximo associada ao método quimiométrico PLS demonstrou ser
uma ferramenta promissora para a área de controle de qualidade na indústria
farmacêutica, especificamente na quantificação do paracetamol em formas
farmacêuticas líquidas. Constatou-se que este método atende aos parâmetros de
agilidade e confiabilidade recomendada pelo guia PAT. Ainda em concordância às
recomendações desse guia, pode-se também afirmar que a inclusão do cabo de
fibras ópticas ao sistema possibilitou a análise em tempo real, o que sugere menos
tempo de armazenamento de lotes inteiros até a sua liberação e subsequente
comercialização. Observou-se, também, que o laser semicondutor de diodo foi de
extrema importância na obtenção de bons resultados.
Finalmente pode-se concluir que a ER/PLS é passível de validação perante
os critérios pré-estabelecidos pela ANVISA, tendo em vista os resultados
alentadores obtidos da maioria das figuras de mérito as quais este estudo se propôs
a avaliar.
58
Referências
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