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Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Centro Biomédico
Faculdade de Ciências Médicas
Curt Mafra Treu
Estudo da microcirculação na hanseníase virchowiana com o uso da
microscopia de Luz Ortogonal Polarizada e com Laser-Doppler
Fluxometria
Rio de Janeiro
2010
Livros Grátis
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Curt Mafra Treu
Estudo da microcirculação na hanseníase virchowiana com o uso da microscopia de Luz
Ortogonal Polarizada e com Laser-Doppler Fluxometria
Tese apresentada, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor, ao Programa de Pós-graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
Orientadora: Profa. Dra. Eliete Bouskela
Co-orientador: Prof. Dr. Omar Lupi da Rosa Santos
Rio de Janeiro
2010
CATALOGAÇÃO NA FONTE UERJ/REDE SIRIUS/CBB
Autorizo, apenas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta tese,
desde que citada a fonte.
__________________________________ ____________________________
Assinatura Data
A ficha catalográfica deve ser preparada pela equipe da Biblioteca e o prazo de entrega será de até 3dias úteis, após o recebimento das informações sobre o trabalho. Na versão impressa, deverá constar no verso da folha de rosto. Formatar a fonte conforme o modelo escolhido para todo o trabalho (Arial ou Times New Roman) A ficha desta máscara foi inserida através do recurso de selecionar, copiar e colar especial como documento do Word (objeto). É possível editá-la dando dois cliques em cima da ficha com o botão esquerdo do mouse.
T811 Treu, Curt Mafra.
Estudo da microcirculação na hanseníase virchowiana com o uso da microscopia de Luz Ortogonal Polarizada e comLaser-Doppler fluxometria / Curt Mafra Treu - 2010.
96f. : il.
Orientadores : Eliete Bouskela, Omar Lupi da Rosa Santos. Tese (Doutorado) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade de Ciências Médicas. Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental. Bibliografia: f. 80-89.
1. Microcirculação - Teses. 2. Sangue - Circulação - Teses. 3. Hanseníase - Teses. 4. Sistema nervoso - Teses. 5. Microscopia de polarização - Teses. 5. Fluxometria por Laser-Doppler - Teses. 6. Iontoforese - Teses. I. Bouskela, Eliete. II. Santos, Omar Lupi da Rosa. III. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.
Curt Mafra Treu
Estudo da microcirculação na hanseníase virchowiana com o uso da microscopia de Luz
Ortogonal Polarizada e com Laser-Doppler Fluxometria
Tese apresentada, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor, ao Programa de Pós-graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental.
Aprovada em 31 de março de 2010. Banca Examinadora:
_____________________________________________ Profa. Dra. Eliete Bouskela Faculdade de Ciências Médicas - UERJ
_____________________________________________ Prof. Dr. Luiz Guilherme Kraemer de Aguiar Faculdade de Ciências Médicas - UERJ
_____________________________________________ Prof. Dr. Flávio Barbosa Luz Universidade Federal Fluminense
_____________________________________________ Prof. Dr. Antonio Macedo D’Acri Universidade Severino Sombra
_____________________________________________ Prof. Dr. José Augusto da Costa Nery Fundação Oswaldo Cruz
Rio de Janeiro
2010
DEDICATÓRIA
À minha esposa, Mariana, minha eterna namorada, companheira em todas as batalhas e,
certamente, minha maior conquista pessoal. Te amo princesa.
Aos meus filhos, Thiago e Matheus, os maiores presentes que a vida me deu. Espero que a
conclusão deste trabalho justifique as longas horas de ausência.
Aos meus pais, Franz e Rejane, meus grandes torcedores. Vocês foram e sempre serão meu
maior e melhor modelo, pessoal e profissional.
Aos meus sogros, Cláudio e Tânia, os melhores segundos pais que alguém poderia querer.
Certamente este trabalho só foi possível com o apoio de vocês.
Aos meus avós, Curt (In Memoriam) e Ilza, Ruben (In Memoriam) e Renée. Muito da minha
formação de caráter e qualidades pessoais devo a influencia de vocês; obrigado por tudo.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profa. Dra. Eliete Bouskela. Em todos os momentos desta tese a
Profa. Eliete se fez presente, tanto com seus ensinamentos e postura acadêmica, quanto com
sua impressionante obstinação, não me deixando desanimar em nenhum instante. A Profa.
Eliete é certamente o maior modelo de acadêmica que já tive a oportunidade de conhecer e à
ela sou imensamente grato.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Omar Lupi, agradeço a oportunidade que me ofereceu de
embarcar nesta jornada. O Prof. Omar é, além de grande amigo pessoal, um colosso tanto na
parte acadêmica quanto política, tendo enorme empenho e doação pessoal em fazer da
dermatologia uma especialidade a cada dia mais admirada.
Ao Prof. Dr. Luiz Guilherme Kraemer de Aguiar, pela enorme paciência, valiosos
conselhos e meticulosa revisão deste trabalho.
Ao Prof. Dr. José Augusto Nery, pelos conselhos e ensinamentos na área da
hansenologia, além do aprimoramento na revisão de hanseníase desta tese.
À nutricionista e pesquisadora Priscila Alves Maranhão, pela enorme ajuda na
mensuração dos dados relacionados ao Cytoscan® apresentados neste trabalho.
Ao zoólogo Fernando Lencastre Sicuro, pela inestimável ajuda na elaboração da
análise estatística dos dados desta tese.
Ao colega e amigo Egon Luiz Rodrigues Daxbacher, pelo empenho no
encaminhamento dos pacientes do serviço de hanseníase da UERJ.
Aos amigos do BioVasc, Eliza, Graça, Prof. Daniel, Alvaro, Diogo, Fátima, Ana
Olimpia e demais colegas de laboratório, por toda ajuda e apoio ao longo destes seis anos de
convívio no laboratório.
À Secretária do Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental
– FISCLINEX, Amélia Gomes, pela paciência e pronta disposição para ajudar em todos os
momentos do programa deste curso.
Aos pacientes o meu respeito e profunda consideração.
RESUMO
TREU, Curt Mafra. Estudo da microcirculação na hanseníase virchowiana com o uso da microscopia de Luz Ortogonal Polarizada e com Laser-Doppler Fluxometria. 2010. 101f. Dissertação (Mestrado em Fisiopatologia Clínica e Experimental) – Faculdade de Ciências Médicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.
A hanseníase é uma doença infecciosa com características únicas, dentre elas o fato de atingir intensamente a inervação da pele e seus anexos. Entremeando estes anexos, está a microcirculação cutânea, que a principio também tem sua inervação comprometida. Vários artigos apontam para alterações de disautonomia microcirculatória, citando como exemplo as alterações no reflexo vasomotor.
O presente estudo se propõe a avaliar a microcirculação cutânea na hanseníase virchowiana, tanto em sua morfologia quanto em sua reatividade vascular. Para isto, utilizamos a tecnologia de luz ortogonal polarizada através do equipamento Cytoscan®, a analise de Fourier do sinal do laser Doppler para estudo da vasomotricidade e o laser Doppler fluxometria associado à iontoforese de substâncias vasoativas (acetilcolina, nitroprussiato de sódio e noradrenalina) para avaliação da reatividade vascular.
Dez pacientes portadores de hanseníase virchowiana sem outras comorbidades que pudessem alterar os parâmetros microcirculatórios, foram avaliados pelos métodos descritos e seus resultados foram comparados aos de dez controles sem hanseníase ou qualquer outra comorbidade.
Em relação à vasomotricidade não foram observadas alterações estatisticamente significativas entre os grupos, o que fala a favor da teoria de origem miogênica para a vasomotricidade. Em relação à iontoforese de substâncias vasoativas constatou-se uma diminuição da resposta vasodilatadora à acetilcolina e ao nitroprussiato nos pacientes com hanseníase. Os exames com o Cytoscan® mostraram aumento no tamanho dos capilares, bem como alterações em sua morfologia.
Os resultados apresentados sugerem que, provavelmente devido ao longo período de alteração inervatória decorrente da hanseníase virchowiana, estes pacientes apresentam uma alteração significativa tanto morfológica quanto na reatividade vascular da microcirculação cutânea.
Palavras-chave: 1. Microcirculação. 2. Hanseníase. 3. Sistema nervoso. 4. Luz ortogonal polarizada. 5. Laser Doppler. 6. Iontoforese
ABSTRACT
Leprosy is an infectious disease with unique characteristics. One of them is the fact that it compromises not only the cutaneous and adnexial innervation, but also the innervation of the cutaneous microcirculation. Several articles indicate the impact of disautonomy on the microcirculatory level, citing the example of changes in vasomotor level.
The present study proposes to evaluate morphology and microvascular reactivity of the cutaneous microcirculation of the virchowian leprosy. Methods employed in the study were: the Cytoscan®, which uses the orthogonal polarized light, the Fourier analysis of the laser Doppler signal to study vasomotion, and the laser Doppler flowmetry associated with iontophoresis of vasoactive substances (acetylcholine, sodium nitroprusside and norepinephrin).
Ten patients with virchowian leprosy, without any other comorbidity that could modify the microvascular parameters were evaluated and their results were compared to ten controls without leprosy or any other comorbidity. Regarding the vasomotion, no statistical significant differences were noticed between the groups. Our data are in agreement with the vasomotion’s miogenic origin theory. According to iontophoresis of vasoactive substances, it was found that there is a reduced endothelial-dependent and endothelial-independent vasodilation in patients with leprosy while tests by direct visualization we observed an increase in the size of capillaries, as well as changes in their morphology.
The results suggest that the significant changes in morphology and vascular reactivity of skin microcirculation are probably due to the long period of innervatory changes arising from leprosy. Keywords: 1. Microcirculation. 2. Leprosy. 3. Nervous system. 4. Orthogonal polarization spectral imaging. 5. Laser Doppler. 6. Iontophresis.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ach – Acetilcolina
BB – Hanseníase Borderline-borderline
BL – Hanseníase Borderline-lepromatoso
BT – Hanseníase Borderline-tuberculóide
DCF – Densidade Capilar Funcional
DIAMP – Diâmetro de papila
DIAMC – Diâmetro de capilar
DIAMAL – Diâmetro de Alça
FDA – Food and Drug Administration
LDF – Laser Doppler fluxometria
MB – Multibacilar
MEDLINE – Medica Literature Analysis and Retrieval System On-line
MHV – Hanseníase virchowiana
MORFO – Morfologia
MS – Ministério da Saúde
M. leprae – Mycobacterium leprae
IFN-γ – Interferon-gama
IL – Interleucina
LL – Hanseníase Lepromatoso-lepromatoso
OMS – Organização Mundial da Saúde
ON – Óxido nítrico
OPS – Orthogonal Polarization Spectral
PB – Paucibacilar
PQT – Poliquimioterapia
SNP – Nitroprussiato de sódio
TT – Hanseníase Tuberculóide-tuberculóide
SUMÁRIO
1
2
2.1
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.4
2.1.5
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.3
2.3.1
2.3.2
2.4
2.4.1
2.4.2
2.5
3
4
5
5.1
5.1.1
5.1.2
5.2
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INTRODUÇÃO................................................................................................
JUSTIFICATIVA............................................................................................
REVISÃO DA LITERATURA......................................................................
Hanseníase.......................................................................................................
Introdução.........................................................................................................
Etiologia............................................................................................................
Clinica e patologia............................................................................................
Diagnóstico......................................................................................................
Tratamento.........................................................................................................
Microcirculação cutânea.................................................................................
Introdução..........................................................................................................
Estrutura e organização......................................................................................
Vasomotricidade................................................................................................
Videomicroscopia com luz ortogonal polarizada (Cytoscan®)...................
Teoria.................................................................................................................
Artigos relacionados..........................................................................................
Laser Doppler...................................................................................................
Teoria.................................................................................................................
Laser Doppler e vasomotricidade......................................................................
Iontoforese de substâncias vasoativas............................................................
OBJETIVOS.....................................................................................................
METODOLOGIA............................................................................................
RESULTADOS................................................................................................
Laser Doppler...................................................................................................
Vasomotricidade................................................................................................
Iontoforese.........................................................................................................
Cytoscan®.........................................................................................................
DISCUSSÃO.....................................................................................................
CONCLUSÕES................................................................................................
SUGESTÕES....................................................................................................
REFERÊNCIAS ..............................................................................................
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13
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27
30
45
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47
52
53
62
62
62
66
71
74
79
79
80
APÊNDICE A - Termo de consentimento livre e Esclarecido para
participação em estudo clínico: protocolo único para estudo da
microcirculação em homens adultos .................................................................
APÊNDICE B - Protocolo do exame de microcirculação em pacientes com
hanseníase virchowiana ....................................................................................
90
94
11
INTRODUÇÃO
Na história da humanidade, provavelmente nenhuma doença gerou estigma social tão
intenso quanto à hanseníase, sempre associada com conceitos tais como pecado, impureza e
punição. Na era pré-microbiológica, contribuía para o fortalecimento do estigma a noção de
que a hanseníase era hereditária, já que agregação familiar de casos era observada com
freqüência. Com a identificação do bacilo causador da doença no século XVII por Armauer
Hansen, confirmou-se a natureza infecciosa da enfermidade (Prevedello 2007). O
acometimento dos nervos periféricos é a principal causa das complicações relacionadas à
hanseníase. Suas repercussões podem ser vistas através de alterações sensitivas, motoras,
mistas (Scollard 2006) e autonômicas (Job 1989; Rambukkana 2000).
Na hanseníase, há o acometimento de fibras autonômicas, sensitivas e motoras. Entre
as manifestações autonômicas, destaca-se a perda da sudorese, resultando em pele ressecada.
O acometimento das fibras cutâneas resulta na perda da sensibilidade à dor, ao frio, ao calor e,
mais tardiamente, também ao tato (Kajihara 2000). Quando há lesão do tronco dos nervos
periféricos, há acometimento sensitivo, autonômico e motor no território do(s) nervo(s)
afetado(s), resultando em perda de todas as formas de sensibilidade (dor, frio, calor, tato,
parestesia e posição segmentar) e de paresia, paralisia e atrofia muscular (Abbot 1996; van
Brakel 1996). Sabe-se que entre os mecanismos responsáveis pelo controle da reatividade
vascular da microcirculação é de fundamental importância o reflexo autonômico (Morita
1995), essencial para a vasoconstrição (mediada pelo sistema simpático) e vasodilatação
(mediada pelo parassimpático) dos vasos. O presente estudo avalia a microcirculação de pacientes portadores de hanseníase
virchowiana, comparando com controles com pele sã, com o uso da tecnologia de
videomicroscopia com luz ortogonal polarizada (Cytoscan®) e com Laser-Doppler. Além
disso, avaliamos a reatividade da microcirculação cutânea usando a hanseníase virchowiana
como um potencial modelo de disautonomia vascular por denervação, através do uso de
Laser-Doppler associado à iontoforese. O estudo avalia se a microcirculação de uma área cuja
inervação está cronicamente comprometida por longos períodos (no caso a pele de pacientes
com hanseníase virchowiana) reage de forma semelhante à de pessoas saudáveis e, caso isso
não ocorra, discutir qual o provável mecanismo responsável pela alteração da resposta.
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1 JUSTIFICATIVA
Sabe-se que o sistema nervoso periférico é um dos locais mais acometidos pela
hanseníase, e que na forma virchowiana este acometimento pode ser muito extenso (Birdi
2003; Scollard 2008; Wilder-Smith 2008); porém pouco se conhece a respeito de como este
dano neural irá refletir sobre a microcirculação destes pacientes.
Nos últimos anos vários estudos têm demonstrado a importância do sistema nervoso
na regulação da vasomotricidade da microcirculação cutânea e como o comprometimento do
primeiro pode refletir em alterações na última (Mork 2002; Landsverk 2006). Além disto,
estudos mostram que alterações agudas na condução nervosa podem refletir em alterações no
fluxo e reatividade vascular (Carr 1993; Koman 1995; Netten 1995).
Alguns trabalhos com o uso de laser-Doppler sugerem que possa haver alterações no
sistema nervoso autônomo em pacientes hansenianos e que isto possa influenciar na
microcirculação (Wilder-Smith 1996; Wilder-Smith 1997; Wikstrom 1999; Wilder-Smith
2000). Porém, tais estudos não avaliam seletivamente cada grupo, além de proverem poucos
dados em relação à repercussão hemodinâmica.
Por definição, as lesões de hanseníase tuberculóide têm maior grau de acometimento
nervoso agudo, porém optamos por usar a hanseníase virchowiana como modelo porque nesta
forma também há dano neurológicomais crônico, difusamente distribuído. Isto facilita a
comparação de resultados entre os pacientes, pois sabe-se que a microcirculação cutânea não
tem distribuição homogênea, com áreas como a face tendo sinais de laser Doppler
completamente diferentes do braço ou perna, por exemplo (Park 1997).
13
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Hanseníase
2.1.1. Introdução
Hanseníase ainda é nos dias de hoje um problema de saúde publica importante no Brasil;
apenas em 2005 no Rio de Janeiro foram diagnosticados 2497 novos casos, com índice de
detecção de 1.9 para cada 10.000 habitantes (Nery 2009). Trata-se de uma doença crônica, granulomatosa, causada pelo Mycobacterium leprae,
afetando pele, sistema nervoso periférico e, ocasionalmente, outros órgãos e sistemas (Souza
1997). Segundo o Ministério da Saúde (MS) (Brasil 2002), caso de hanseníase é definido como
uma pessoa que apresenta uma ou mais de uma das seguintes características e que requer
quimioterapia:
• Lesão (ões) de pele com alteração de sensibilidade; • Acometimento de nervo(s) com espessamento neural; • Baciloscopia positiva. A classificação de Madri (1953) é a mais acurada para descrição clínica da doença e
adota critérios de polaridade, baseados nestas características clínicas, que foram acrescidos
pelos aspectos bacteriológicos, imunológicos e histológicos da hanseníase, definindo os grupos
polares, tuberculóide (T) e virchowiano (V) ou lepromatoso (L); o grupo transitório e inicial da
doença, a forma indeterminada (I); e o instável e intermediário, a forma borderline (B) ou dimorfa (D). Os quatro grandes critérios que definem a classificação da doença
são os abaixo citados:
Clínico: aspectos das lesões cutâneas, variando em número, extensão, definição de
margens e simetria de distribuição.
Bacteriológico: presença ou ausência do M. leprae, e seus aspectos morfológicos,
variando de numerosos, íntegros e agrupados, formando globias, a raros, fragmentados e
ausentes. Imunológico: teste da lepromina – reação de Mitsuda, com leitura após 21 a 28 dias.
Atualmente considera-se positiva a intradermorreação quando há formação de pápula maior ou
14
iguasl a 6mm e negativa de 0 a 5mm de diâmetro. Histológico: aspectos histopatológicos das lesões, variando de granulomas bem
definidos a infiltrado difuso linfo-histiocitário.
As formas clínicas da hanseníase, na classificação de Madri (1953), considerando-se
aspectos bacteriológicos e resposta à intradermorreação de Mitsuda, foram relacionadas no
quadro 1.
A classificação de Ridley & Jopling (1966) (Ridley e Jopling 1966) adota subgrupos
dentro do espectro, que obedece a critérios clínicos e bacteriológicos e enfatiza os aspectos
imunológicos e histopatológicos. Siglas são utilizadas para indicar as duas formas polares
tuberculóide-tuberculóide (TT) e lepromatoso-lepromatoso (LL) e os três subgrupos:
borderline-tuberculóide (BT), borderline-borderline (BB), borderline-lepromatoso (BL). Em 1982, um Comitê da Organização Mundial de Saúde (OMS) propôs uma
classificação (OMS 1982), indicada para o trabalho de campo, baseada na provável população
bacilar, que, por sua vez, relaciona-se às formas clínicas. Os pacientes são divididos pela
classificação operacional em paucibacilares (PB), quando apresentam um número menor ou
igual a cinco lesões cutâneas, e multibacilares (MB), quando apresentam mais de cinco lesões.
Contudo, se o exame baciloscópico estiver disponível, os pacientes que apresentarem
baciloscopia do esfregaço dérmico (pesquisa de bacilos no esfregaço de linfa) positiva são
classificados como MB, independente do número de lesões cutâneas (Norman 2004). A
baciloscopia é realizada em vários pontos definidos, como lóbulos de orelhas, cotovelos,
joelhos e lesões. Para fins de tratamento, atualmente a classificação mais utilizada é a da
Organização Mundial da Saúde (OMS). As classificações adotadas para as formas clínicas da hanseníase, a de Madri, a de
Ridley & Jopling e a da OMS, podem ser correlacionadas, como mostra o quadro 2: Quadro 1 – Classificação de Madri (1953): Formas clínicas da hanseníase relacionadas com a baciloscopia e
reação de Mitsuda (Adaptado do Guia de controle da hanseníase, 2002) Indeterminada Tuberculóide Borderline Virchowiana (I) (T) (B) (V)
Reação de Mitsuda Acima de 6mm = Positiva
0 a 5mm = Negativa Acima de 6mm = Positiva
0 a 5mm = Negativa0 a 5mm = Negativa
Baciloscopia Negativa Negativa Positiva Positiva
15
Quadro 2 - Correlação entre as classificações de Madri (1953), Ridley & Jopling (1966) e OMS (1982) para hanseníase (Adaptado do Guia de controle da hanseníase, 2002)
Madri Indeterminada
(I)
Tuberculóide
(T)
Borderline
(B)
Virchowiana
(V)
Ridley & Jopling TT BT BB BL LL OMS Paucibacilares Multibacilares
TT: Tuberculóide-tuberculóide, BT: Borderline-tuberculóide, BB: Borderline-borderline; BL: Borderline-lepromatoso; LL:Lepromatoso-lepromatoso
2.1.2 Etiologia
É causada pelo Mycobacterium leprae, parasita intracelular obrigatório que se
apresenta como bastonete álcool-ácido resistente. É termossensivel, acometendo
principalmente áreas mais frias como extremidades, lóbulos das orelhas e ponta do nariz,
porém podendo chegar a atingir todo o tegumento (Ramos-e-Silva 2001) e têm a
característica clássica de ter elevado tropismo pela pele e nervos periféricos, provavelmente
devido à sua origem embriológica comum (Ziller 1993).
Peculiaridades do Mycobacterium leprae: a) Tempo de duplicação avaliado pela inoculação no coxim plantar do camundongo: 11 a 13 dias (Shepard 1965; Levy 1976) b) Condições de temperatura necessárias ao crescimento: 27º a 30ºC (Shepard 1965)
c) Pobreza metabólica em especial referente às enzimas que se contrapõem aos
efeitos tóxicos dos metabólitos reativos de oxigênio. Apenas a superóxido-dismutase é
detectada, não se identificando a catalase ou peroxidase (Wheeler 1980).
Estas propriedades são responsáveis por características do M. leprae que diferem das
restantes micobactérias e das bactérias de modo geral. Assim o M. leprae não cresce em
culturas, e a inoculação em animais, apenas recentemente conseguida, se faz em locais de
menor temperatura corporal (coxim plantar do camundongo) e no tatu, que é um dos
mamíferos de menor temperatura basal (Kirchheimer 1971). É possível que a deficiência
metabólica do M. leprae seja a causa de sua proliferação lenta e responsável pela sua
destruição espontânea, que limita seu crescimento na pata do camundongo a um “platô”
(Shepard 1960) e faz com que um indivíduo virchowiano sem resistência tenha, na ocasião
16
em que a doença é detectada e na ausência de tratamento, apenas cerca de 10% de bacilos
morfologicamente viáveis (Shepard 1965).
Por outro lado, a necessidade de temperatura ideal de sobrevivência e proliferação
justifica, no homem, a preferência do desenvolvimento das lesões hansênicas na pele, nervos
periféricos, mucosa nasal, e a menor importância, do ponto de vista de intensidade das lesões
e viabilidade bacilar, da hanseníase nas vísceras, excetuando-se a laringe e os testículos
(Trifilio 1991).Um indivíduo portador de hanseníase virchowiana, com resistência mínima ou
ausente, apresenta em geral, no momento do diagnóstico clínico, cerca de sete bilhões de
bacilos por grama de tecido, distribuídos em pele, nervos, mucosas e vísceras (Noordeen
1993). De modo geral, se não houver nenhuma intercorrência, estes indivíduos apresentam-se
em bom estado, sem manifestações gerais como febre, dores musculares, adinâmia etc., e em
regra estão desenvolvendo sem nenhuma limitação as atividades físicas habituais.
Há fortes evidências de que o M. leprae é de baixa antigênicidade. Assim, enquanto os
indivíduos com infecção ou doença tuberculosa apresentam reação à tuberculina positiva
mostrando um tipo de reação de hipersensibilidade tardia, muitas vezes com desenvolvimento
de necrose cutânea, a correspondente reação ao antígeno de Mitsuda (Reação de Fernandez) é
freqüentemente negativa ou de intensidade discreta. Também a estrutura histológica das
lesões de hanseníase, mesmo em suas manifestações de maior resistência, é constituída por
reação granulomatosa com células epitelióides, macrófagos não diferenciados e linfócitos,
sem que se observem edema intersticial, depósito de fibrina, focos de necrose fibrinóide ou
caseosa e hiperplasia epitelial, todas as alterações histológicas representativas de um estado de
hipersensibilidade tardia. Estas alterações estruturais só aparecem nas reações de Mitsuda
fortemente positivas e nas manifestações reacionais tuberculóides ou do grupo dimorfo
próximo do pólo tuberculóide (Trindade 1996). Certamente a lenta proliferação, a baixa antigênicidade e a limitação metabólica do M. leprae
justificam os longos períodos de incubação, período médio de 8,4 anos, e máximo de 30 anos
ou mais (Trindade 1996). Deixando de lado as noções de contágio, porta de entrada e vias de
eliminação bacilar, presume-se que nesse longo período de incubação os bacilos atinjam
compartimentos em que se manteriam relativamente protegidos para proliferar, até o
ponto em que, rompendo as barreiras desses compartimentos, consigam estimular, no
interstício, a reação inflamatória granulomatosa. Há fortes indícios de que esses
compartimentos correspondam ao sistema nervoso periférico, na rede de terminações
17
sensitivas cutâneas e em especial no interior de células de Schwann (Birdi 2003). Estas
células são macrófagos não profissionais que, embora fagocitem o bacilo, não conseguem
processá-lo nem tampouco apresentar seus componentes antigênicos aos linfócitos ou,
estimulados por estes, desenvolverem a ação lítica sobre os bacilos.
Khanolkar (Khanolkar 1964) sugere um interessante esquema de envolvimento
progressivo das terminações nervosas pelos bacilos e conseqüente agressão inflamatória nos
tipos polares. Boddingius (Boddingius 1982) sugere que a penetração do M. leprae no sistema
nervoso periférico não se faça ao nível dos troncos nervosos, visto que o padrão do capilar
endoneural não permitiria a penetração bacilar por via endoneural, enquanto a membrana
perineural, com suas múltiplas capas de células meningoteliais modificadas, alternando-se
com membranas basais contínuas, evitaria a penetração por contigüidade. Sendo assim a
penetração seria em nível terminal dos ramos nervosos sensitivos cutâneos, onde os axônios
estariam desprovidos de perinervo e de bainha de mielina.
De certa forma se poderia supor que qualquer microorganismo colocado na derme
induziria rapidamente uma reação inflamatória que impediria sua penetração pelas
terminações nervosas sensitivas. É possível que o M. leprae, pela sua lenta reprodução e baixa
antigênicidade, não estimularia reação inflamatória e assim poderia penetrar nas terminações
nervosas periféricas principalmente pelos cones de regeneração dos axônios (Boddingius
1982). A partir do momento em que a proliferação bacilar provoque a rotura dos limites dos
compartimentos axônicos ou das células de Schwann, e os bacilos entrem em contacto com o
interstício endoneural ou com a derme adjacente, inicia-se a reação inflamatória. O
desenvolvimento posterior da doença vai depender da reatividade imunocelular do
hospedeiro.
Esta resposta imune constitui um espectro, que se expressa nas diferentes formas
clínicas da doença. Com uma resposta imunológica competente, o indivíduo evolui para a
forma clínica localizada e não-contagiosa da doença; se esta competência não é efetiva, uma
forma difusa e contagiosa é desenvolvida. Entre estes dois extremos, encontram-se as formas
intermediárias, que refletem, também, graduais variações da resistência ao bacilo (Souza
1997).
18
2.1.3 Clínica e patologia
Na hanseníase, há o acometimento de fibras autonômicas, sensitivas e motoras. Entre
as manifestações autonômicas, destaca-se a perda da sudorese, resultando em pele ressecada.
O acometimento das fibras cutâneas resulta na perda da sensibilidade à dor, ao frio, ao calor e,
mais tardiamente, também ao tato (Kajihara 2000). Quando há lesão do tronco dos nervos
periféricos, há acometimento sensitivo, autonômico e motor no território do(s) nervo(s)
afetado(s), resultando em perda de todas as formas de sensibilidade (dor, frio, calor, tato,
parestesia e posição segmentar) e de paresia, paralisia e atrofia muscular (Abbot 1996; van
Brakel 1996).
A hanseníase manifesta-se através de sinais e sintomas dermatológicos e neurológicos
que podem levar à suspeição diagnóstica da doença. As alterações neurológicas, quando não
diagnosticadas e tratadas adequadamente, podem causar incapacidades físicas que podem
evoluir para deformidades (Brasil 2002).
Sinais e sintomas dermatológicos:
Na pele, a hanseníase manifesta-se através de lesões que se apresentam parestésicas,
hipoestésicas ou anestésicas.
Clinicamente, tais lesões podem se apresentar como:
• Máculas discrômicas: manchas que podem ser hipercrômicas, hipocrômicas ou
mesmo quase acrômicas.
• Placas: lesões que se estendem em superfície por vários centímetros. Podem ser
únicas ou múltiplas e confluírem.
• Nódulo: lesão sólida, circunscrita, elevada ou não, de 1 a 3 cm de tamanho. É um
processo patológico que se localiza na epiderme, derme e/ou hipoderme. Pode ser lesão mais
palpável que visível. Essas lesões podem estar localizadas em qualquer região do corpo e
podem, também, acometer a mucosa nasal e a cavidade oral. Ocorrem, porém, com maior
freqüência, na face, orelhas, nádegas, braços, pernas e costas.
• Infiltração: aumento da espessura e consistência da pele, com menor evidência dos
sulcos, limites imprecisos, acompanhando-se, às vezes, de eritema discreto. Pela vitropressão,
surge fundo de cor café com leite. Resulta da presença na derme de infiltrado celular, às vezes
com edema e vasodilatação.
19
Sinais e sintomas neurológicos:
A hanseníase manifesta-se, além de lesões na pele, através de lesões nos nervos
periféricos. Essas lesões são decorrentes de processos inflamatórios dos nervos periféricos
(neurites) e podem ser causados tanto pela ação do bacilo nos nervos como pela reação do
organismo ao bacilo ou por ambas. Três mecanismos de lesão dos neurônios periféricos
podem ocorrer e coexistir durante as diferentes fases da doença (Shetty 2000):
1. Alterações metabólicas nas células dos nervos periféricos, tais como as células de
Schwann, células endoteliais e fibroblastos, como efeito direto ou indireto da presença de um
bacilo viável;
2. Alterações causadas pelo influxo de células inflamatórias e seus mediadores. Podem
resultar em uma reação contra componentes do nervo e, dependendo de fatores anatômicos,
pode resultar em compressão do mesmo. Uma forma de lesão aguda do nervo é geralmente
vista nas reações reversas. No entanto, o gatilho da precipitação dessas reações ainda não é
bem conhecido;
3. Danos neurais fisiológicos devidos à persistência de antígenos bacterianos na célula
de Schwann ou axônios, que podem justificar lesões silenciosas e progressivas dos nervos
periféricos, após tratamento quimioterápico.
Elas manifestam-se através de dor e espessamento dos nervos periféricos, perda de
sensibilidade nas áreas inervadas por esses nervos, principalmente nos olhos, mãos e pés e
perda de força nos músculos inervados por esses nervos principalmente nas pálpebras e nos
membros superiores e inferiores.
A neurite, geralmente, manifesta-se através de um processo agudo, acompanhado de
dor intensa e edema (Negesse 1988). No início, não há evidência de comprometimento
funcional do nervo, mas, freqüentemente, a neurite torna-se crônica e passa a evidenciar esse
comprometimento, inicialmente através da perda da capacidade de suar (Katoch 1996),
causando ressecamento na pele, e posteriormente perda de sensibilidade e força muscular,
causando dormência e paralisia nas áreas inervadas pelos nervos comprometidos (Kajihara
2000).
2.1.4 Diagnóstico
O diagnóstico da hanseníase é eminentemente clínico corroborado por exames
complementares.
20
Segundo o ministério da saúde (Brasil 2002), Um caso de hanseníase é uma pessoa
que apresenta uma ou mais de uma das seguintes características:
• lesão (ões) de pele com alteração de sensibilidade;
• acometimento de nervo(s) com espessamento neural;
• baciloscopia positiva.
Tendo em vista tais critérios, a abordagem do paciente com suspeita de hanseníase
inclui sua anamnese, um exame físico acurado e exames complementares.
Anamnese:
A anamnese deve ser realizada conversando com o paciente sobre os sinais e sintomas
da doença e possíveis vínculos epidemiológicos. É importante que seja detalhada a ocupação
da pessoa e suas atividades diárias. A investigação epidemiológica é muito importante para se
descobrir a origem da doença e para o diagnóstico precoce de novos casos de hanseníase.
Além das questões rotineiras da anamnese, são fundamentais que sejam identificadas
as seguintes questões: alguma alteração na pele - manchas, placas, infiltrações, tubérculos,
nódulos, e há quanto tempo eles apareceram; possíveis alterações de sensibilidade em alguma
área do corpo; presença de dores nos nervos, ou fraqueza nas mãos e nos pés e se usou algum
medicamento para tais problemas e qual o resultado (Brasil 2002).
Exame Físico:
O exame físico do paciente com hanseníase pode ser dividido em exame
dermatológico e neurológico:
- Exame dermatológico:
A avaliação dermatológica visa identificar as lesões de pele próprias da hanseníase,
pesquisando a sensibilidade nas mesmas. A alteração de sensibilidade nas lesões de pele é
uma característica típica da hanseníase (Walker 2007). As alterações de sensibilidade ocorrem
em progressão, havendo inicialmente alteração na sensibilidade térmica, seguida pela dolorosa
e, por último, tátil.
A pesquisa de sensibilidade térmica nas lesões e nas áreas suspeitas deve ser realizada,
sempre que possível, com dois tubos de vidro, um contendo água fria e no outro, água
aquecida. Deve-se ter o cuidado da temperatura da água não ser muito elevada (acima de
45ºC), pois neste caso poderá despertar sensação de dor, e não de calor.
Devem ser tocadas a pele sã e a área suspeita com a extremidade dos tubos frio e
quente, alternadamente, solicitando-se à pessoa que identifique as sensações de frio e de calor
21
(quente). As respostas como menos frio, ou menos quente devem também ser valorizadas
nessa pesquisa.
Na impossibilidade de fazer-se o teste com água quente e fria, pode-se utilizar um
algodão embebido em éter como procedimento alternativo. Nesse caso, a pele sã e a área
suspeita devem ser tocadas, alternadamente, com um pedaço de algodão embebido em éter e,
ao paciente, deve-se solicitar que diga quando tem a sensação de frio, sendo comparados os
resultados do toque na pele sã e na área suspeita.
A pesquisa da sensibilidade dolorosa é realizada nas lesões, nos membros inferiores e
superiores utilizando-se a ponta de uma caneta esferográfica. Essa pesquisa é a mais
importante para prevenir incapacidades, pois detecta precocemente diminuição ou ausência de
sensibilidade protetora do paciente.
Já a pesquisa de sensibilidade tátil nas lesões e nas áreas suspeitas é apenas com uma
mecha fina de algodão seco. A pele sã e a área suspeita devem ser tocadas, alternadamente,
com a mecha de algodão seco e, ao indivíduo examinado, perguntar-se-á se sente o toque.
Após a comparação dos resultados dos toques, pode-se concluir sobre a alteração de
sensibilidade tátil nas lesões ou nas áreas suspeitas (Brasil 2002).
Deve ser feita uma inspeção de toda a superfície corporal, no sentido crânio-caudal,
seguimento por seguimento, procurando identificar as áreas acometidas por lesões de pele. As
áreas onde as lesões ocorrem com maior freqüência são: face, orelhas, nádegas, braços, pernas
e costas, assim como mucosa nasal.
- Exame neurológico:
No estágio inicial da doença, a neurite hansênica não apresenta um dano neural
demonstrável, contudo, sem tratamento adequado freqüentemente, a neurite torna-se crônica e
evolui, passando a evidenciar o comprometimento dos nervos periféricos: a perda da
capacidade de suar (anidrose), a perda de pelos (alopecia), terço distal das sobrancelhas
(madarose), a perda das sensibilidades térmica, dolorosa e tátil, e a paralisia muscular.
Os principais nervos periféricos acometidos na hanseníase e suas respectivas
localidades são (Brasil 2002; Pimentel 2004):
Face - trigêmeo e facial, que podem causar alterações na face, nos olhos e no nariz;
Braços - radial, ulnar e mediano, que podem causar alterações nos braços e mãos;
Pernas - fibular comum e tibial posterior. Podem causar alterações nas pernas e pés.
22
A identificação das lesões neurológicas é feita através da avaliação neurológica e é
constituída pela inspeção dos olhos, nariz, mãos e pés, palpação dos troncos nervosos
periféricos, avaliação da força muscular e avaliação de sensibilidade nos olhos, membros
superiores e membros inferiores
Na palpação dos principais nervos acometidos na hanseníase, deve-se pesquisar a dor,
espontânea ou pela palpação, espessamento e aderência aos planos adjacentes, sempre
comparando com o seu homólogo. Exames clínicos complementares: Prova da histamina: A técnica consiste em depositar gotas de cloridrato ou fosfato de
histamina a 1/1.000 na mácula e na pele circunvizinha, livre de lesões e, em seguida, fazer
picadas superficiais através das gotas, sem causar sangramento. Na interpretação, na pele
normal ocorrerá a “tríplice reação de Lewis”, que se manifesta por eritema primário
após cerca de 20 segundos da picada através da histamina; segue-se eritema secundário (ou
reflexo) em até 40 segundos; finalmente, surge pápula urticariforme ou edematosa após um
a dois minutos – corresponde à reação completa. No caso de lesão hipocrômica da
hanseníase, faltará o eritema secundário devido às alterações das terminações nervosas
autonômicas nos vasos sanguíneo, portanto a “reação é incompleta” (Orsini 1952). Este teste é
especialmente útil nos pacientes de fototipos mais baixos, no qual é mais fácil a visualização
do eritema. Nos paciente de fototipos mais elevados o exame fica comprometido, pois em
pacientes melanodérmicos a visualização do eritema não é tão nítida.
Prova da pilocarpina: Esta é usada nos doentes negros e/ou nas lesões
eritematopigmentadas. Tendo em vista o exposto na prova da histamina, a visualização do
eritema é mais complicada nestes pacientes, por isso precisamos lançar mão da prova da
pilocarpina para avaliar a integridade das fibras autonômicas. A técnica consiste em pincelar
tintura de iodo (ou lugol) na pele lesada e circunvizinha e, em seguida, injetar
intradermicamente 0.1 mL de pilocarpina a 0,5% ou 1% em ambas as áreas; enxugar
imediatamente as gotículas que refluírem; pulverizar amido e por fim, aguardar alguns
minutos. Na interpretação, para peles normais, surgem grandes quantidades de pontos de cor
azul-escura, que corresponde à mistura de amido, suor e iodo; na lesão hansênica, não ocorre
sudorese, por lesão das terminações nervosas autônomas nas glândulas sudoríparas,
conseqüentemente, o amido não muda a cor ou surgem apenas raros pontos azul-escuros
(Joshi 1976).
23
Teste de Mitsudina: Utiliza-se suspensão de bacilos mortos (imunorreatividade à
lepromina), injetada em área de pele normal na face anterior do braço. A primeira leitura faz-
se após 48 horas (reação de Fernandez) cuja leitura é de avaliação do eritema e a segunda
após 21-30 dias quando se desenvolve a chamada reação de Mitsuda (Hastings 1988). O teste
é dito Mitsuda positivo quando forma-se infiltração nodular maior que 5 mm de diâmetro ou
quando o infiltrado ulcera. Isso indica certo grau de resistência à hanseníase, tanto mais
pronunciado quanto mais intensa a resposta. O teste é Mitsuda negativo quando há ausência
de reação ou enduração até 5mm, indicando resistência deficiente. Este teste pode indicar o
prognóstico da doença uma vez que pessoas com Mitsuda positivo tendem a desenvolver as
formas benignas da doença e pessoas com Mitsuda negativo têm maior probabilidade de
desenvolver a hanseníase virchowiana (Scollard 2006).
2.1.5 Tratamento
O tratamento da hanseníase baseia-se no programa da OMS para erradicação da
doença. Este tratamento esta esquematizado na figura 1. Neste programa, o paciente é
classificado com um de dois tipos da doença – paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) – e
recebe ou a combinação de rifampicina e dapsona (conhecida como poliquimioterapia
paucibacilar ou PQT-PB) ou a combinação tríplice de rifampicina, dapsona e clofazimina
(conhecida como poliquimioterapia multibacilar ou PQT-MB).
24
A PQT-PB tem duração de 6 doses que podem ser administradas em até 9 meses e a
PQT-MB 12 doses com duração de até 18 meses. As taxas de recidiva são baixas (equivalente
a 0 a 2,04 pessoas em 100 anos de vida) com o esquema de PQT-PB de seis meses e o PQT-
MB de 24 meses (Brasil 2002). Figura 1 - Esquema de PQT para tratamento da hanseníase (Fonte: Guia Para Eliminação da Hanseníase Como Problema de Saúde Pública (OMS), 2002.) (Brasil 2002)
25
2.2 Microcirculação cutânea
2.2.1 Introdução
Microcirculação é a porção do leito vascular em que os vasos têm diâmetro interno
médio inferior ou igual a 100μm. A chamada unidade microcirculatória inclui arteríolas,
arteríolas terminais, metarteríolas, capilares (precedidos ou não do esfíncter pré-capilar) e
vênulas pós-capilares. Do lado linfático temos os capilares linfáticos e os micro-linfáticos.
Esse é o sítio onde se dá a nutrição tecidual; sua fisiologia, bioquímica e farmacologia variam
de acordo com a porção estudada e sua localização nos diversos tecidos (Aguiar 2007). A microcirculação cutânea esta localizada ao nível da derme. Ela não apenas provê a
pele de sangue, como também desempenha papel central na regulação da temperatura
corporal. Em temperatura ambiente (aproximadamente 23°C) circulam vinte a trinta vezes
mais sangue pela pele do que seria necessário para nutri-la. A troca de calor entre a superfície
dos vasos cutâneos e o meio ambiente é determinada justamente pelo diâmetro do calibre
destes vasos e, conseqüentemente, do fluxo sangüíneo através dos mesmos. No processo de
termorregulação, o fluxo sanguíneo da pele pode aumentar para 6 a 8 l/min, comparado com
seu estado basal de 250 ml/min (Charkoudian 2003). Esta variação é controlada por shunts
arteriovenosos ao nível da derme profunda. Tais estruturas permitem a passagem do sangue
diretamente do lado arterial para o venoso, sem ter que atravessar os capilares. A presença de
vasos na pele diminui sua capacidade insulatória, levando calor a superfície corporal onde ele
pode ser perdido através de radiação, evaporação e condução-convecção (Boegli 2003).
2.2.2 Estrutura e organização
As arteríolas e vênulas da microcirculação cutânea formam dois plexos na derme: uma
rede horizontal superior na derme papilar (plexo superior), de onde emergem as alças
capilares nutritivas das papilas dérmicas; e um plexo horizontal inferior (plexo profundo)
localizado na interface derme-subcutâneo (Braverman 2000). O plexo profundo é formado por
vasos perfurantes da musculatura adjacente e tecido gorduroso subcutâneo. Ele dá origem às
arteríolas e vênulas que se conectam diretamente com o plexo horizontal superior, assim como
às tributarias laterais que suprem o folículo piloso e glândulas sudoríparas. Há algumas
interconexões entre arteríolas ascendentes e vênulas descendentes.
26
Figura 2 - Representação esquemática da pele e seus plexos vasculares (modificado de http://city74.files.wordpress.com/2008/02/skin_verybig27_e.jpg)
A maior parte da microcirculação humana está localizada ao nível da derme papilar,
1-2mm abaixo da superfície cutânea. O plexo horizontal superficial é uma área de
dispersão de calor importante, apesar de que a área exata em que isso acontece permanece
um mistério, tendo em vista que os shunts arteriovenosos anteriormente descritos só foram
identificados nos dígitos, nariz e orelhas (Braverman 2000). A maioria das formas mais
comuns de telangiectasias são anormalidades do plexo horizontal superior ou das alças
capilares (Braverman 1983).
2.2.3 Vasomotricidade
Entende-se por vasomotricidade a oscilação rítmica do tônus vascular gerada por
alterações relacionadas à parede vascular, especificamente a célula muscular lisa, e não à
freqüência cardíaca ou respiratória (Nilsson 2003). A freqüência e a amplitude da
27
vasomotricidade variam de acordo com o calibre dos vasos. Arteríolas proximais (com
diâmetro entre 50 e 100μm) exibem freqüências de vasomotricidade da ordem de 2 -3
ciclos por minuto (cpm) e amplitudes que correspondem a 10-20% do diâmetro médio
enquanto as arteríolas terminais apresentam freqüências de vasomotricidade que variam
entre 10 e 25 cpm e amplitudes que podem chegar até a 100% do diâmetro médio, levando
à abertura e ao fechamento periódico desses vasos (Intaglietta 1989).
Sabe-se que entre os mecanismos responsáveis pelo controle da vasomotricidade da
microcirculação é de grande importância o reflexo autonômico (Morita-Tsuzuki 1992;
Morita-Tsuzuki 1993; Morita 1994; Morita 1995; Krupatkin 2006). O reflexo autonômico
é fundamental para a vasoconstrição (mediada pelo sistema simpático) e vasodilatação
(mediada pelo parassimpático) dos vasos. O estímulo parassimpático só existe em
determinadas áreas corporais especificas, sendo então o estímulo simpático o mais
importante no controle vasomotor. Na presença de estímulos reflexos ou humorais que intensificam as respostas do
centro pressórico na região do dorso lateral do bulbo, estímulos são conduzidos pela
medula espinhal, fazendo sinapse ao nível de T1 a L3 quando então percorrem as fibras
nervosas periféricas até os vasos de resistência e capacitância. Na presença deste estímulo
é liberado nos terminais um neuro-hormônio chamado noradrenalina, que desencadeia a
constrição do vaso (efeito α-adrenérgico).
Estas alterações podem sofrer influência rítmica na atividade tônica e estas se
manifestam como oscilações na pressão arterial. As ondas de Traube-Hering ocorrem com
a respiração e são causadas por flutuação cíclica nos impulsos simpáticos aos vasos de
resistência. As ondas de Mayer se constituem de outra flutuação na atividade simpática,
porém de forma menos freqüente (Nilsson 2003).
2.3 Videomicroscopia com Luz Ortogonal Polarizada (Cytoscan®)
2.3.1 Teoria
A obtenção de imagens da microcirculação humana por luz refletida tem sido
limitada a leitos vasculares aonde os vasos são visíveis e próximos à superfície (ex: leitos
ungueais, conjuntivas). A observação direta dos leitos vasculares de outros órgãos
28
humanos tem sido proibida pela necessidade de contrastes fluorescente (os quais, na
maioria das vezes, são muito tóxicos), transiluminação, ou pelo tamanho do instrumento
necessário para se conseguir obter essas imagens.
O padrão-ouro no estudo da microcirculação in vivo tem sido, há anos, a
microscopia intravital (Lindbom 1982). Esta técnica permite uma avaliação acurada da
morfologia capilar e vascular, bem como o acesso à dados da fisiologia vascular tais como
a velocidade do fluxo sanguíneo, a densidade funcional capilar e a dinâmica da adesão dos
leucócitos à parede vascular. Seu espectro de ação pode ser consideravelmente ampliado
pelo uso concomitante de marcadores plasmáticos fluorescentes e programas de captação e
análise de imagens (Messmer 2000). A microscopia intravital apresenta, no entanto, alguns
fatores restritivos, pois para ser utilizada pressupõe a introdução cirúrgica de uma prótese
transparente intracutânea, localizada no dorso de animais previamente imobilizados, de
modo a permitir a visualização direta da microcirculação. Tal procedimento inviabiliza seu
uso rotineiro na avaliação da microcirculação cutânea humana por motivos óbvios. Usando uma técnica básica similar a descrita por Slaaf e colaboradores (Slaaf
1987), que relataram uma técnica de microscopia intravital com dois polarizadores
ortogonais, Groner e colaboradores. (Groner 1999) desenvolveram um instrumento portátil
manual que permite o acesso a uma variedade de leitos vasculares, em pacientes, de forma
não invasiva. A técnica de imagem OPS (do inglês orthogonal polarization spectral
imaging) foi incorporada ao Cytoscan® (Cytometrics, Philadelphia, PA, U.S.A.). Na imagem OPS, o tecido é iluminado com uma luz polarizada de comprimento de
onda de 530nm e projetada através de um polarizador orientado ortogonalmente ao plano
da luz. Como a polarização é preservada na reflexão, somente fótons dispersados de
tecidos relativamente profundos contribuem para a formação da imagem. No Cytoscan®,
uma fonte de luz virtual é criada, com o auxilio de equipamentos óticos especiais, a uma
profundidade de 1 mm dentro do tecido. A luz é absorvida pela hemoglobina, gerando uma
imagem “negativa” das estruturas carreadoras de hemoglobina. Esta tecnologia patenteada
como "virtual backlighting" torna possível a visualização e medição de imagens, em tempo
real, da microcirculação, sem o uso de contrastes fluorescentes ou transiluminação. Quando apenas luz refletida é usada, é difícil se obter uma boa definição e contraste
na imagem, devido à dispersão e interferência causada pelos tecidos anexos. Quando
usamos a tecnologia OPS para obtenção da imagem, devido à polarização usada,
29
minimizamos a dispersão e a interferência, otimizando em muito o contraste e a definição
das imagens.
Logo podemos concluir que a tecnologia OPS, e conseqüentemente o Cytoscan®,
se constituem em excelente método para a obtenção de imagens da microcirculação
cutânea, de forma não invasiva, em tempo real. O equipamento, por visualizar e definir
cada hemácia em um capilar pode ter a imagem gravada e analisada por um programa de
captação de imagens (CapImage®), validado por Klyscz e colaboradores (Klyscz 1997).
A posterior superposição dos dados de microcirculação obtidos previamente ao
tratamento e após a administração do mesmo permite uma análise comparativa desses
efeitos sobre a microcirculação dérmica.
A aplicabilidade da luz ortogonal polarizada ao estudo da microcirculação cutânea
foi revisada em um artigo de nosso grupo, em anexo (Lupi 2008).
30
2.3.2 Artigos relacionados
Artigo 1- Review - Orthogonal polarization technique in the assessment of
human skin microcirculation
Este artigo foi de grande importância para a revisão detalhada da técnica do exame
e comparação com exames considerados “padrão-ouro” para a avaliação da
microcirculação cutânea. Ele pode ser considerado uma referência ara qualquer estudo
posterior com luz ortogonal polarizada. Foi também o primeiro artigo de revisão sobre o
uso dermatológico produzido no Brasil utilizando a técnica de OPS.
No artigo os autores concluem que a técnica de OPS é uma ferramenta
extremamente promissora para dermatologistas e pesquisadores envolvidos no estudo de
doenças relacionadas com alterações microcirculatórias da pele tais como vasculites,
insuficiência venosa crônica e tumores cutâneos.
Esta revisão foi resultado de pesquisa ampla por parte dos autores e pode servir
como referência para qualquer outro trabalho nesta linha de pesquisa.
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38
Artigo 2- Evaluation of the effects of caffeine in the microcirculation and
edema on thighs and buttocks using the orthogonal polarization spectral imaging
and clinical parameters
O objetivo deste artigo era determinar, baseado em parâmetros microcirculatórios e
medidas centimétricas, a eficácia de uma solução contendo cafeína a 7% no tratamento da
lipodistrofia ginóide (celulite).
Este estudo foi de vital importância para o aprimoramento da técnica do exame por
parte dos autores e gerou valiosos ensinamentos que foram aplicados nos trabalhos
seguintes. Os parâmetros usados na avaliação do estudo foram novamente utilizados nesta
tese.
Este foi o primeiro estudo dermatológico produzido no Brasil utilizando a técnica
de OPS.
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2.4 Laser Doppler
Considerando as técnicas empregadas no estudo da microcirculação cutânea podemos
didaticamente dividi-las em técnicas para visualização de microvasos, chamadas microscopias
intravitais (sendo exemplo a técnica de OPS vista anteriormente); e métodos para quantificar
o fluxo sanguíneo e a vasomotricidade, cujo grande exemplo é o laser Doppler.
2.4.1 Teoria
A fluxometria por Laser Doppler (LDF) é um método desenhado para prover dados de
forma continua e não-invasiva da perfusão microvascular. Na LDF, um laser de baixa
potência (no caso do Perimed 5000, um laser de diodo de 780nm) incide sobre a superfície do
tecido e os fótons migram através do tecido em um padrão randômico, sendo que o padrão
específico de cada tecido é determinado pela suas propriedades óticas (Leahy 1999). A
interação com um ou mais objetos em movimento, tais como as células do sangue, criam um
sinal de freqüência de dispersão dos fótons determinado pelo ângulo de dispersão,
comprimento de onda do laser e velocidade de dispersão. Esta freqüência recebe o nome de
sinal Doppler devido ao pesquisador que a estudou no inicio do século dezenove, o austríaco
Johann Christian Andres Doppler.
O sinal recebido pelo laser carrega informações a respeito tanto da velocidade de
deslocamento das células quanto de sua concentração. A intensidade da luz recebida de volta
no fotodetector constitui um padrão de dispersão, determinado principalmente pela perfusão
tecidual, definida como o numero de células sanguíneas multiplicado pela velocidade média
das células. O valor de perfusão é geralmente expresso em volts (V), em unidades arbitrárias
(AU) ou em unidades de perfusão (PU).
Dois tipos de equipamentos de laser Doppler podem ser distinguidos: o monitor de
perfusão por laser Doppler (laser Doppler perfusion monitor – LDPM) e a Representação de
perfusão por Imagem por Laser Doppler (laser Doppler perfusion image – LDPI). O LDPM
consiste de um probe contendo uma fibra ótica iluminadora, conectada a um laser externo, e
uma ou várias fibras óticas que transportam de volta a luz do laser refletida-dispersada pelo
tecido para um fotodetector. O probe é colocado no tecido e uma área de 2-3 mm de diâmetro
é continuamente medida.
46
Quando o LDPI é usado, um scanner é posicionado geralmente a 15 cm de distância do
tecido estudado, e uma fonte de laser escaneia a área, resultando em um mapa de valores de
perfusão. Uma vantagem importante do LDPM é sua alta resolução temporal na mensuração da
perfusão. A resposta do fluxo circulatório pode ser acessada em tempo real. Entretanto, a
microcirculação é heterogênea e o fluxo sanguíneo varia consideravelmente em sítios distintos
na pele (Wardell, Braverman et al. 1994; Braverman 2000). Neste sentido o LDPI oferece
uma vantagem sobre o LDPM, tendo em vista que apesar de uma quantificação estática, ele
avalia uma área de superfície mais extensa. Por outro lado, o escaneamento leva de vários
segundos a alguns minutos, dependendo da taxa de resolução espacial e das propriedades do
sistema, o que pode ser um problema, dependendo da dinâmica do fluxo sanguíneo que se está
estudando.
2.4.2 Laser Doppler e vasomotricidade
O estudo da vasomotricidade da microcirculação cutânea através da análise espectral
do sinal do laser Doppler permite a exploração de diferentes mecanismos de vasomotilidade,
tais como as atividades endoteliais, miogênicas e simpáticas, envolvidos nas respostas a
estímulos (Stefanovska 1999; Rossi. 2004).
Pela analise dos sinais do laser Doppler é possível identificar os diferentes níveis de
resposta microcirculatória por níveis específicos de sinais que estas emitem. Esta divisão foi
evidenciada por Stefanovska e colaboradores, em artigo de 1999 (Stefanovska 1999) e é
adaptado para o quadro 3, como se segue: Quadro 3 - Relação entre as freqüências dos sinais do laser Doppler e suas respectivas fontes
Intervalo de 0.009 - 0.02Hz 0.02 – 0.06Hz 0.06 - 0.2Hz 0.2 – 0.6Hz 0.6 – 1.6Hz 0.009 – 1.6Hz
Frequência
Fonte Atividade Atividade Atividade Atividade Atividade Espectro
endotelial simpática miogênica respiratória Cardíaca total
Intervalo 0.009 – 0.02Hz: O pico mais baixo gira em torno de 0.01 Hz. Este pico foi
originalmente observado no sinal do fluxo sanguíneo usando a análise de Fourier. O
principal motivo pelo qual este sinal não era detectado nos estudos iniciais é que a analise
dos sinais era feita em períodos curtos de poucos minutos, insuficiente para atingir uma boa
47
resolução em sinais de baixa freqüência.
Intervalo 0.02 – 0.06Hz: Um pico de freqüência em torno de 0.04 Hz tem sido
observada e atribuída à atividade neurogênica. A atividade neurogênica é superimposta pela
atividade miogênica na regulação da pressão arterial através da regulação do raio do vaso.
Em estudos clínicos, este pico foi completamente eliminado após denervação, tanto após
bloqueio local e ganglionar quanto após simpatectomia.
Intervalo 0.06 – 0.2Hz: Tem sido teorizado que o pico em torno de 0.1 Hz está
relacionado à regulação da pressão arterial. As células musculares lisas da parede vascular
respondem continuamente às mudanças da pressão intravascular, em uma atividade
denominada resposta miogênica. No músculo do antro gástrico, onde a atividade miogênica
predomina, as contrações apresentam uma freqüência média de 0.1 Hz.
Intervalo 0.2 – 0.6Hz: Este é o intervalo da função respiratória. Esta atividade está
fracamente presente no sinal do fluxo sangüíneo vascular. A origem deste pico se torna
evidente correlacionando-se o aparecimento do sinal à mensuração das incursões
respiratórias.
Intervalo 0.6 – 1.6Hz: Já está definido que, em condições basais, a freqüência da
batida do coração é em torno de 1 Hz, variando de 0.6 Hz em atletas treinados até 1.6 Hz
em sedentários ou com algum grau de disfunção cardíaca. A atividade da bomba cardíaca é
transmitida para cada vaso arterial e também está presente no sinal do fluxo sangüíneo
microvascular. A origem fisiológica deste sinal pode ser facilmente demonstrada pela
correlação do sinal com a atividade elétrica expressa no ECG.
Agusni e colaboradores demonstraram em artigo de 1988 (Agusni 1988) que o laser
Doppler é um instrumento fiel para avaliar aspectos circulatórios em lesões de hanseníase.
As medidas são simples de serem feitas, não doem e seus resultados são reprodutíveis. O
procedimento pode ser repetido quantas vezes sejam necessárias sem que isto traga
inconvenientes ao paciente.
2.5 Iontoforese e substâncias vasoativas
A iontoforese é um método não invasivo de se introduzir substâncias através da
superfície da pele via uma pequena carga elétrica e uma diferença de potencial que gera uma
corrente por onde a substância é carreada aproveitando-se a carga intrínseca desta substância
48
(Harris 1967).
Este método tem a vantagem de ser não invasivo e inócuo para o paciente, limitando
os efeitos da substância localmente e eliminando o potencial medo de agulhas nos pacientes
(Sloan and Soltani 1986).
A primeira proposta para o uso de corrente elétrica com o intuito de transferência de
drogas, data a partir de meados do século XVIII. Antes do começo do século XX, a
transferência de drogas mediadas por fluxo elétrico era conhecida como “cataforese”, sendo
que Frankenhäuser introduziu o termo iontoforese antes de 1908.
Os princípios básicos de aplicação iontoforética dependem da eletricidade como
veículo de administração da droga, da transferência de íons (de acordo com a polaridade da
substância) e do tipo, amplitude, duração e dosagem da corrente empregada (Su 1994). A
introdução de drogas através da pele em direção ao tecido subcutâneo possui três rotas
potenciais (Barry 2002):
1- O folículo piloso e suas glândulas sebáceas associadas
2- Os ductos sudoríparos e
3- Através do próprio estrato córneo, entre seus apêndices e falhas (rota intercelular)
As principais vias de acesso dos íons transferidos por iontoforese são os poros de
glândulas sudoríparas, enquanto o estrato córneo, os pêlos foliculares e as glândulas sebáceas
pouco contribuem para a penetração iônica, uma vez que apresentam elevada impedância
elétrica relativa. Após a penetração inicial, os íons transferidos passam para a circulação
capilar através das arteríolas que irrigam a base da glândula. Assim, uma vez transferido para
o tecido, o íon ou substância medicamentosa penetra cerca de 1 mm com subseqüente
absorção capilar e transporte transmembrana (Nolan. 2003).
Durante a iontoforese, uma carga elétrica é aplicada através da pele por meio de dois
eletrodos. Uma droga, normalmente consistindo de uma molécula com carga conhecida, é
colocada junto ao eletrodo de mesma carga, de forma que este cria uma força eletro repulsiva
para a droga enquanto que o eletrodo à distância, de carga contrária, cria uma força de atração
para a molécula que força a droga para dentro da pele. Isto implica que uma droga carregada
positivamente deve ser colocada no eletrodo positivo (cátodo) enquanto uma droga
negativamente carregada deve ser colocada no eletrodo negativo (ânodo) (Kalia 2004). A
figura 3 ilustra o conceito:
49
Figura 3 - Conceito da iontoforese na pele Droga +: Droga com carga positiva; Droga -: Droga com carga negativa
A iontoforese pode ter aplicações tanto para fins terapêuticos quanto experimentais.
No âmbito terapêutico, Kalia e colaboradores (Kalia 2004) e Prausnitz e colaboradores
(Prausnitz 2008) fizeram uma revisão em 2003 e 2008, respectivamente, onde mostraram as
aplicações da iontoforese na administração de opióides, insulina, antiinflamatórios não-
esteroidais, anestésicos, produtos dermatológicos, etc.
No âmbito experimental a iontoforese também tem sido usada para administração não
invasiva de uma série de substâncias, sendo as mais bem estudadas a insulina (Rossi 2005), a
acetilcolina e o nitroprussiato de sódio (Morris 1996).
A acetilcolina é um agonista do receptor muscarínico. Desde 1980 já se conhece seu
efeito vasodilatador pelo relaxamento da musculatura lisa vascular e este efeito é dependente
da integridade do endotélio vascular. Em 1987 foi identificado o óxido nítrico como o
responsável direto pelo relaxamento da musculatura lisa vascular. Considerando-se os
principais agentes vasoativos, o ON é sintetizado a partir da oxidação do radical guanidino da
Larginina pela ação da ON-sintase, gerando L-citrulina e ON. A liberação do ON, por sua
vez, acarreta relaxamento do músculo liso vascular. Além disto, a acetilcolina ativa os
receptores muscarínicos na membrana da célula endotelial e estimula a proteína G e a
fosfolipase C, formando o trifosfato de inositol. Este elemento libera cálcio do retículo
endoplasmático, com conseqüente reação com a calmodulina. Após a formação do complexo
cálcio-calmodulina, a ON-sintase é estimulada, formando ON a partir da L-arginina.
50
Na célula muscular lisa, o ON ativa a guanilil-ciclase e aumenta a concentração de
Guanosina Monofosfato Cíclico (GMPc), gerando redução da concentração de cálcio na
célula muscular lisa e relaxamento vascular. A via da prostaciclina (PGI2), sintetizada pela
ciclooxigenase (COX), ativa a adenil ciclase (AC) e aumenta a concentração de Adenosina
Monofosfato Cíclico (AMPc), o que leva à redução da concentração de cálcio intracelular nas
células dos músculos lisos vasculares (Girardi 2006). Outra via de ativação do relaxamento
muscular parece ser mediada pelo fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF), que
ativado por subprodutos do citocromo P450 epoxigenase, gera uma hiperpolarização da
musculatura lisa vascular, com conseqüente relaxamento desta (Fisslthaler 1999; Busse 2002).
Já o nitroprussiato de sódio é um medicamento muito utilizado para crises
hipertensivas devido à sua alta capacidade hipotensora por ser um potente vasodilatador com
resposta bem previsível por ter meia-vida extremamente curta. É considerado um
vasodilatador endotélio-independente (Bouskela 2007; Turner 2008), tendo em vista que é
uma molécula constituída por um radical nitroprussiato, o qual reage em condições
fisiológicas com grupamentos sulfidrila teciduais, liberando ON ativamente e causando
relaxamento da musculatura lisa do vaso, não necessitando da mediação do endotélio para
liberar o óxido nítrico.
Um resumo das atividades da Ach e SNP no músculo liso vascular pode ser visto na
ilustração a seguir:
51
Figura 4 - Atividades da Ach e SNP no músculo liso vascular
Outra substância vasoativa usada por meio da iontoforese é a noradrenalina (Wu 2001;
Beed, O'Connor 2009). A noradrenalina possui pequeno efeito β2-adrenérgico (relaxamento
da musculatura lisa nos leitos vasculares musculares, pulmonares, esplâncnicos, renais,
cerebrais e coronarianos). Sua administração acarreta preferencialmente um efeito α1-agonista
(vasoconstrição importante da musculatura lisa de vasos e brônquios).
Os receptores α1 são pós-sinápticos, e seu mecanismo de ação está relacionado
principalmente à ativação da fosfolipase C. Verifica-se, através da sua ativação, considerável
elevação da resistência vascular sistêmica.
A inativação da noradrenalina dois processos: enzimático e recapitação. As enzimas
Monoamina oxidase (MAO) e a Catecol-O-metiltransferase (COMT) inativam a
noradrenalina. Sua eliminação enzimática ocorre através do fígado, rins e paredes capilares,
especialmente nos pulmões.
52
3 OBJETIVOS
- O presente estudo visa avaliar a microcirculação de pacientes portadores de
hanseníase virchowiana e compará-los com controles com pele sã, com o uso da tecnologia de
videomicroscopia com luz ortogonal polarizada (Cytoscan®) e com laser Doppler associado à
iontoforese.
Como objetivo secundário, poderíamos citar: - Avaliar a reatividade da microcirculação cutânea em um modelo de
disautonomia vascular por denervação prolongada, através do uso de laser Doppler associado
à iontoforese de substâncias vasoativas. - Avaliar o comportamento da vasomotricidade diante das alterações
relacionadas à hanseníase virchowiana.
- Caso haja alteração da reatividade vascular, avaliar se isto se reflete em
alterações morfológicas vasculares.
53
4 METODOLOGIA
Desenho experimental: Estudo prospectivo, controlado, em aberto, unicêntrico, captando pacientes dos
serviços de hanseníase da FIOCRUZ e da UERJ avaliando-os no Laboratório de
Pesquisas Clínicas e Experimentais em Biologia Vascular (BioVasc) da UERJ.
Seleção dos objetos de estudo: Um total de 10 pacientes portadores de hanseníase virchowiana, em vigência de
tratamento, além de 10 controles saudáveis e sem hanseníase, foram avaliados no
Laboratório de Pesquisas Clínicas e Experimentais em Biologia Vascular (BioVasc) da
UERJ.
Todos os participantes, independente de serem pacientes ou controles,
obedeceram aos seguintes critérios de inclusão/exclusão:
Critérios de inclusão:
Sexo masculino;
Ser portador de Hanseníase virchowiana em tratamento (apenas para pacientes);
Faixa etária entre os 20 e 60 anos;
Capacidade de seguir as orientações dadas e comparecer as avaliaçõe;
Fototipo I-IV de Fitzpatrick e
Assinar o termo de consentimento pré-informado. Critérios de exclusão:
Sexo feminino;
Ser portador de hipertensão arterial sistêmica, diabete mellitus,
colagenoses ou obesidade (IMC>35);
História de tabagismo (presente ou passada);
Ser portador de outra forma de Hanseníase que não seja a virchowiana
(apenas para pacientes);
Faixa etária abaixo dos 20 e acima dos 60 anos;
Incapacidade de seguir as orientações dadas e comparecer as avaliações;
Fototipo V e VI de Fitzpatrick e
Não assinar o termo de consentimento pré-informado.
54
A hipertensão (de Jongh 2007; Struijker-Boudier 2007), o diabete mellitus (de
Jongh 2007; Quattrini 2007), a obesidade (de Jongh 2008), a idade (Li 2006; Li 2006)
e o fumo (Monfrecola 1998; Pellaton 2002; Ijzerman 2003; Edvinsson 2008) são
fatores que alteram a resposta microcirculatória na fluxometria com laser Doppler,
inclusive alterando a vasomotricidade. O uso da luz ortogonal polarizada também
evidenciou alterações na microcirculação em tabagistas (Lindeboom 2005) e
hipertensos (Struijker-Boudier 2007). Apesar destes critérios excluírem uma enorme quantidade de pacientes
(inicialmente foram selecionados sessenta pacientes com hanseníase virchowiana), eles
foram essenciais para excluir qualquer outra doença que pudesse influenciar a
microcirculação e, com isto, colocar em duvida o nexo causal entre as alterações
encontradas e a hanseníase.
Caracteristicas da população estudada:
Os quadros 4, 5 e 6 ilustram, respectivamente, as características das populações
estudadas em pacientes, controles e comparação entre as médias de cada variável dos
grupos. A analise permite observar a grande semelhança entre os grupos.
Quadro 4 - Características da população de pacientes estudados
Paciente Sexo Idade Peso Altura IMC Pressão sistólica
Pressão diastólica
ARS Masc 29 69 1,7 21,56 120 80
JF Masc 22 73 1,64 27,03 110 72
OR Masc 42 78 1,72 26,44 116 76
AS Masc 36 80 1,81 24,46 130 84
MFS Masc 23 76 1,75 24,83 124 82
PM Masc 27 85 1,83 26,64 108 60
CA Masc 31 90 1,9 24,93 120 78
AS Masc 21 87 1,8 26,85 110 70
SAB Masc 24 72 1,68 25,53 120 82
CAP Masc 38 79 1,76 25,48 130 86
Média 29,3 78,9 1,759 25,375 118,8 77
Desvio padrão 7,303 6,806 0,0779 1,618 7,899 7,846
55
Quadro 5 - Características da população de controles estudados
Controles Sexo Idade Peso Altura IMC Pressão sistólica
Pressão diastólica
AD Masc 35 75 1,72 25,34 110 70 YT Masc 28 80 1,79 24,65 120 78 EP Masc 30 70 1,64 26,02 110 60
FHS Masc 25 74 1,76 23,87 120 80 LGN Masc 39 75 1,78 23,66 126 82 WES Masc 21 86 1,8 26,54 120 68 TN Masc 27 80 1,82 24,17 122 84 FV Masc 26 70 1,69 24,82 124 82
MAG Masc 28 84 1,77 26,83 128 88
FS Masc 40 82 1,76 26,45 106 74
Média 30,6 78,4 1,712 26,235 118,6 76,6
Desvio padrão 6,464 6,501 0,070 1,171 7,426 8,003
Quadro 6 – Comparação entre as características das populações estudadas
Variável Pacientes Controles
Sexo Masculino Masculino
Idade 29,3 ± 7,3 30,6 ± 6,5
Peso 78,9 ± 6,8 78,4 ± 6,5
Altura 1,76 ± 0,1 1,71 ± 0,1
IMC 25,4 ± 1,6 26,2 ± 1,8
Pressão sistólica 118,8 ± 7,9 118,6 ± 7,4
Pressão diastólica 77 ± 7,9 76,6 ± 8,0
56
Avaliação da área com o Cytoscan® e com laser Doppler: Todos os pacientes ficaram 2h em jejum e se abstiveram de cafeína e álcool
desde a noite anterior ao exame. Eles permaneceram também em repouso por um
período de 20 minutos para aclimatização antes do teste. Todos os indivíduos foram
medidos, pesados e tiveram sua pressão arterial aferida previamente, a fim de assegurar
que preenchiam os pré-requisitos. Inicialmente foi feita a avaliação da microcirculação com o uso do Cytoscan®,
em 3 pontos diferentes, conforme critérios preconizados por De Backer (De Backer
2007). As imagens obtidas foram gravadas por 10 segundos em cada ponto e, em
seguida, avaliadas com software próprio (Cap-Image v7.2). A figura 5 ilustra a técnica:
Figura 5 - Método de avaliação com o uso do Cytoscan®
57
Posteriormente a medição com o laser Doppler e a iontoforese foram feitas da
seguinte forma:
O fluxo sangüineo digital foi medido através de aparato de laser Doppler
(Periflux PF5000, Perimed, Järfälla, Suécia) com as seguintes características: laser de
diodo com comprimento de onda 780nm, largura de banda (bandwidht) de 10–19 kHz,
constante de tempo 0.2 s, amostra de freqüência 32 Hz e potência de 10 mW. A
calibração foi realizada usando partículas de látex coloidal, simulando hemácias, na
qual o movimento Browniano provia o valor basal. O sinal do laser Doppler foi gravado
continuamente em um computador com interface (Sony VaioVGN-CR160A) equipado
com um software Perisoft dedicado. Este software permite a mensuração do sinal do
LDF em unidades de perfusão (PU). Os exames foram realizados em uma sala tranqüila,
com temperatura controlada (22–24°C).
O segundo, terceiro e quarto quirodáctilos esquerdos foram medidos
consecutivamente. Tais locais distam um do outro em ao menos 5 cm. Isto é
fundamental para que não haja interferência da substância previamente administrada por
iontoforese sobre determinado ponto em relação ao ponto seguinte. Seguindo algumas
das orientações de De Backer e colaboradores (De Backer 2007) em trabalho de revisão
de 2007, evitamos áreas com soluções de continuidade, traumatizadas ou sobre vasos de
grande calibre, devido à possibilidade de interferência no laser Doppler.
No primeiro ponto (segundo quirodáctilo) foram feitas duas etapas:
Inicialmente um transdutor foi acoplado a um adesivo de fixação especifico e
este foi colado ao dorso da falange média do segundo quirodáctilo esq. Este transdutor
(Probe 481-1: Single Iontophoresis Probe - Perimed) é utilizado tanto para laser
Doppler quanto para iontoforese e tem a capacidade de esquentar, mantendo a
temperatura cutânea constante a 33°C. Com o transdutor posicionado, realizamos a
medição da motilidade vascular por 20 minutos. Isto foi realizado para obtermos a
análise da vasomotricidade destes pacientes.
Após a realização da medição de vasomotricidade, foi feita avaliação com Laser
Doppler associado à iontoforese nas seguintes áreas, dependendo da droga utilizada:
1- Acetilcolina: Dorso da falange media do 2° quirodáctilo esq.
2- Nitroprussiato de sódio: Dorso da falange media do 3° quirodáctilo
esq.
3- Noradrenalina: Dorso da falange media do 4° quirodáctilo esq.
Para a realização da iontoforese, acoplamos o transdutor a um adesivo especial
58
para iontoforese. Tal adesivo é um eletrodo (PF 383: disposable drug delivery
electrodes - Perimed) e consiste de uma face não-aderente, onde há um encaixe para o
transdutor, e uma face aderente com uma esponja central para a colocação da substância
para iontoforese.
Um segundo eletrodo é posicionado fixamente (com adesivo próprio e
micropore®) na face externa do punho esquerdo. Esta distância garante um mínimo de
10cm para o outro eletrodo em qualquer dos quirodáctilos examinados, essencial para a
diferença de potencial e correta formação da corrente.
Após o transdutor estar acoplado ao eletrodo administra-se a substância para
iontoforese e o conjunto é posicionado novamente no dorso da falange média (ver
figura abaixo). Figura 6 - Paciente sendo submetido ao laser-Doppler acoplado à iontoforese para ilustrar o método
Para a acetilcolina optamos por usar um protocolo semelhante ao usado com
sucesso por Hendry e colaboradores (Hendry 2004): Colocamos 0,2ml de acetilcolina a
1% para iontoforese a fim de avaliarmos a reatividade vascular endotélio-dependente.
Depois de posicionada a sonda com a substância, um eletrodo de pólo positivo
foi fixado ao eletrodo, tendo em vista que a acetilcolina tem carga positiva, e outro
negativo era fixado na pele a uma distância de 15 cm do probe. Isto gerava a diferença
de potencial para o funcionamento da iontoforese. Após os eletrodos estarem
posicionados uma corrente de 0,1mA era aplicada nove vezes por 20s, com intervalos
de 60s entre os pulsos.
Posteriormente, no 3° quirodáctilo, foi feita nova iontoforese com 0,2ml de
nitroprussiato de sódio (Niprid 10mg/ml – Biolab, São Paulo, Brasil) a 0,01%, seguindo
o mesmo protocolo anterior (Hendry), a fim de avaliarmos o relaxamento vascular
endotélio-independente. Depois de posicionada a sonda com a substância, um eletrodo
de pólo negativo era fixado ao eletrodo, tendo em vista que o nitroprussiato de sódio
tem carga negativa, e outro positivo era fixado na pele a uma distância de 15 cm da
59
sonda. Isto gerava a diferença de potencial para o funcionamento da iontoforese. Após
os eletrodos estarem posicionados uma corrente de 0,2 mA era aplicada sete vezes por
20s, com intervalos de 180s entre os pulsos.
Posteriormente, no 4° quirodáctilo, foi feita nova iontoforese com 0,2ml de
noradrenalina (Hyponor 1mg/ml – Hypofarma, Minas Gerais, Brasil) a 0,5mM, a fim de
avaliarmos a reatividade vascular mediado por estímulo simpático contínuo. Após os
eletrodos estarem posicionados uma corrente de 0,2mA era aplicada oito vezes por 30s,
com intervalos de 60s entre os pulsos.
Critérios avaliados:
CytoScan®:
Os seguintes critérios foram avaliados:
- Densidade capilar funcional
- Diâmetro da papila
- Diâmetro do capilar
- Diâmetro da alça
- Morfologia alterada do capilar
Estes critérios foram eficientemente avaliados em dois outros trabalhos de nosso
grupo (Lupi 2007; Treu 2009), em anexo, bem como por outro grupo integrante do
60
nosso laboratório (Virgini-Magalhaes 2006; Lascasas-Porto 2008). Estes trabalhos
serviram para avaliação e refinamento deste protocolo final.
A figura 7 demonstra de forma esquemática como são medidos os critérios
mencionados: Figura 7 - Representação da leitura do Cytoscan®: DP - Diâmetro de Papila; DAC - Diâmetro da Alça Capilar; DC - Diâmetro do Capilar; Morfologia (normal ou alterada)
A avaliação foi feita pelo softaware CapImage®, no qual selecionam-se os
capilares e ele automaticamente faz as medições. A perfusão pode ser avaliada
visualmente como presente (10s de perfusão), ausente (10s sem perfusão) ou
intermitente (ao menos 50% do tempo sem fluxo).
A proporção de vasos perfundidos (PVP) pode ser calculada pela equação:
(número total de vasos – [sem fluxo + fluxo intermitente]) / número total de vasos. A
densidade capilar funcional (DCF) é dada pelo numero total de vasos perfundidos
multiplicada por 100 e dividida pelo numero total de vasos.
A porcentagem de morfologia alterada dos vasos é calculada pelo numero de
vasos com morfologia alterada multiplicado por 100 dividido numero total de capilares
no campo.
Um vaso com morfologia alterada pode ser melhor compreendido pela ilustração
à seguir (gentilmente cedida pela pesquisadora Priscila Maranhão):
61
Figura 9 - Comparação entre morfologia normal e alterada de capilares
- Laser Doppler com iontoforese:
O fluxo sangüineo digital foi medido com o aparelho de laser Doppler (Periflux
PF5000, Perimed, Järfälla, Suécia) com as seguintes características: comprimento de onda
780nm, 10–19 kHz largura de banda (bandwidht), constante de tempo 0.2 s, amostra de
freqüência 32 Hz. A calibração foi realizada usando partículas de látex coloidal,
simulando hemácias, na qual o movimento Browniano provia o valor basal. O sinal do
laser Doppler foi gravado continuamente em um computador com interface (Sony
VaioVGN-CR160A) equipado com um software Perisoft dedicado. Este software permite
a mensuração do sinal do LDF em unidades de perfusão (PU). Os exames foram
realizados em uma sala tranqüila, com temperatura controlada (22–24°C). Todos os
pacientes ficaram 2h em jejum e se abstiveram de cafeína e álcool desde a noite anterior
ao exame. Eles permaneceram também em repouso por um período de 20 minutos para
aclimatização antes do teste (período prévio ao exame com Cytoscan®).
Foram avaliados os intervalos de freqüência relativos a cada um dos componentes
da vasomotricidade (ver tabela 1), em seu comportamento basal e foi mensurada a
perfusão antes e após a iontoforese de acetilcolina, nitroprussiato e noradrenalina,
respectivamente. Estas medições foram gravadas para cada paciente e, posteriormente,
fizemos a média do valor para cada intervalo de freqüência da vasomotricidade e
comparamos com a média encontrada para os controles para cada intervalo.
Esta forma de avaliação foi eficientemente usada em numerosos estudos não
relacionados à hanseníase (Rossi 2005; Landsverk 2006), bem como o próprio laser
Doppler já foi usado para avaliação de fluxo e reflexo vasomotor na hanseníase (Wilder-
Smith 1996; Wilder-Smith 1996; Wilder-Smith 1997; Wilder-Smith 2000; Illarramendi
2005).
62
5 RESULTADOS
5.1 Laser Doppler
5.1.1 Vasomotricidade
Os resultados obtidos com o uso do laser Doppler para avaliação da
vasomotricidade dos controles e pacientes estão expressos nas tabelas 1 e 2,
respectivamente. Tabela 1 - Componentes da vasomotricidade nos controles
Paciente Endotelial Simpatica Miogênica Respiratória CoraçãoAD 2,384 1,480 0,844 0,300 0,221 EP 2,800 1,830 0,544 0,222 0,169
FHS 1,806 1,571 0,586 0,182 0,223 LGN 3,430 1,445 0,621 0,124 0,148 TN 1,163 0,745 0,440 0,170 0,123
WES 3,245 1,887 1,777 0,822 0,497 YT 2,489 1,790 1,759 0,851 0,563 FV 1,256 1,421 0,998 0,547 0,379
MAG 3,233 1,480 0,541 0,194 0,157 FS 4,667 3,687 1,283 0,327 0,377
Média 2,647 1,734 0,939 0,374 0,286 Tabela 2 - Componentes da vasomotricidade nos pacientes
Paciente Endotelial Simpática Miogênica Respiratória Coração
ARS 1,531 2,370 3,111 1,678 0,895 JF 1,804 1,643 2,630 1,308 0,959 AS 1,997 0,907 0,336 0,185 0,209
MFS 2,791 1,460 1,012 0,520 0,389 OR 2,229 2,522 2,782 1,183 0,913 PM 3,286 3,494 1,338 0,275 0,680 CA 3,432 1,824 1,182 0,399 0,511 AS 2,794 2,113 0,653 0,180 0,149
SAB 0,794 0,637 0,454 0,148 0,153 CAP 2,840 1,766 0,501 0,193 0,223
Média 2,350 1,874 1,399 0,607 0,508
Dado a presença de distribuições não-normais, baixo número amostral associado
a um alto coeficiente de variação de algumas variáveis, é sugerido o uso de análises
comparativas não-paramétricas como método de análise, por serem estes mais robustos
à eventuais variações.
63
O método escolhido para análise estatística dos dados foi o teste de Mann-
Whitney, que é o equivalente não-paramétrico do teste t (Student) para amostras
independentes. Sua escolha foi baseada no fato de ser menos influenciado pelas
variáveis relatadas e ter grande precisão na comparação de dois grupos. Os resultados
da análise dos dados são discriminados na tabela 3:
Tabela 3 - Estatísticas Comparativas: Estudo Transversal
Mann-Whitney U Test Vasomotricidade (Controle vs Paciente) Marked tests are significant at p < 0.05
Rank Sum (controle) Rank Sum (paciente) U p-level Z adjusted p-level n controle n paciente 2*1sided exact p
Endotelial 112 98 43 0,60 0,53 0,60 10 10 0,63 n.s.
Simpatica 96 114 41 0,50 -0,68 0,50 10 10 0,53 n.s.
Miogênico 96 114 41 0,50 -0,68 0,50 10 10 0,53 n.s.
Respiratório 97 113 42 0,55 -0,60 0,55 10 10 0,58 n.s.
Cardio 85 125 40 0,13 -1,51 0,13 10 10 0,14 n.s.
Na tabela acima podemos observar que não há diferenças significativas (p <
0,05) entre os dois grupos em relação às variáveis de vasomotricidade. Isto pode ser
melhor visualizado nos gráficos de distribuição de freqüências (figura 10), onde as
medianas dos controles e dos pacientes quase sempre se encontram praticamente
niveladas, dando uma noção prévia de que não haja diferenças significativas entre os
grupos.
64
Figura 10 - Gráficos de distribuição de freqüências nos componentes da vasomotricidade. Observam-se medianas extremamente niveladas entre controles e pacientes, denotando pouca diferença estatística.
65
66
5.1.2 Iontoforese
Os resultados, para controles e pacientes, da iontoforese de acetilcolina,
nitroprussiato e noradrenalina, estão expressos nas tabelas 4, 5, 6, 7, 8 e 9,
respectivamente:
Tabela 4 - Iontoforese de acetilcolina nos controles
Paciente Baseline Platô Platô increase baseline- % increase (mean PU) (dosis) (mean PU) platô (PU) baseline-platô
AD 55,66 5 208,47 152,8 274,5 EP 20,45 6 72,49 52,0 254,5
FHS 59,24 5 201,33 142,1 239,9 LGN 35,74 4 205,39 169,7 474,7 TN 32,96 7 174,79 141,8 430,3
WES 29,92 7 245,82 215,9 721,6 YT 70,96 5 284,05 213,1 300,3 FS 51,32 6 179,93 128,6 250,6 FV 39,72 5 284,02 244,3 615,1
MAG 57,22 7 137,80 80,6 140,8 Média 44,00 5,56 206,26 162,3 395,7
Tabela 5 - Iontoforese de acetilcolina nos Pacientes Paciente Baseline Platô Platô increase baseline- % increase
(mean PU) (dosis) (mean PU) platô (PU) baseline-platô
ARS 57,78 8 66,72 8,9 15,5
JF 62,06 8 73,3 11,2 18,1
OR 51,42 9 80,24 28,8 56,0
AS 41,53 9 49,01 7,5 18,0
MFS 13,79 7 18,86 5,1 36,8
PM 33,65 9 56,8 23,2 68,8
CA 64,26 9 75,59 11,3 17,6
AS 10,33 8 23,87 13,5 131,1
SAB 50,45 9 99,62 49,2 97,5
CAP 43,42 8 77,58 34,2 78,7
Média 42,87 8,4 62,16 19,3 53,8
67
Tabela 6 - Iontoforese de nitroprussiato de sódio nos controles
Paciente Baseline (mean PU)
Platô (dosis)
Platô (mean PU)
increase baseline-
Platô (PU)
% increase baseline-
Platô AD 27,28 5 104,67 77,4 283,7 EP 25,29 5 141,84 116,6 460,9
FHS 77,8 4 287,97 210,2 270,1 LGN 30,8 4 180,08 149,3 484,7 TN 15,38 6 94,26 78,9 512,9
WES 28,72 5 235,65 206,9 720,5 YT 32,42 4 127,08 94,7 292,0 FS 55,51 5 177,14 121,6 219,1 FV 14,76 5 142,04 127,3 862,3
MAG 61,37 6 149,52 88,2 143,6 Média 34,23 4,78 165,64 131,4 456,2
Tabela 7 - Iontoforese de nitroprussiato de sódio nos pacientes
Paciente Baseline (mean PU)
Platô (dosis)
Platô (mean PU)
increase baseline-
Platô (PU)
% increase baseline-
PlatôARS 77,8 6 80,52 2,7 3,5 JF 35,65 6 35,58 -0,1 -0,2 OR 40,87 7 60,3 19,4 47,5 AS 28,75 7 41,05 12,3 42,8
MFS 8,2 6 14,34 6,1 74,9 PM 20,81 7 33,11 12,3 59,1 CA 27,96 7 56,56 28,6 102,3 AS 32,64 7 49,83 17,2 52,7
SAB 47,32 6 75,33 28,0 59,2 CAP 15,92 6 30,08 14,2 88,9
Média 33,59 6,5 47,67 14,1 53,1
Tabela 08 - Iontoforese de noradrenalina nos controles
Paciente Baseline (mean PU)
Platô (dosis)
Platô (mean PU)
increase baseline-
Platô (PU)
% increase baseline-
PlatôAD 27,84 7 6,34 -21,5 -77,2 EP 21,99 2 16,77 -5,2 -23,7
FHS 18,29 8 10,93 -7,4 -40,2 LGN 12,21 8 8,43 -3,8 -31,0 TN 19,54 7 5,73 -13,8 -70,7
WES 28,09 7 14,56 -13,5 -48,2 YT 9,26 8 5,60 -3,7 -39,5 FS 35,21 8 23,93 -11,3 -32,0 FV 8,64 8 6,83 -1,8 -20,9
MAG 80,32 8 64,72 -15,6 -19,4 Média 21,55 6,88 11,54 -10,0 -45,3
68
Tabela 09 - Iontoforese de noradrenalina nos pacientes
Paciente Baseline (mean PU)
Platô (dosis)
Platô (mean PU)
increase baseline-
Platô (PU)
% increase baseline-
PlatôARS 23,19 8 8,63 -14,6 -62,8
JF 62,72 4 61,07 -1,7 -2,6OR 42,58 8 30,51 -12,1 -28,3AS 43,87 4 39,37 -4,5 -10,3
MFS 5,41 8 5,14 -0,3 -5,0PM 12,34 3 8,88 -3,5 -28,0CA 10,09 7 5,1 -5,0 -49,5AS 32,87 8 21,63 -11,2 -34,2
SAB 40,01 7 32,03 -8,0 -19,9CAP 9,94 8 7,73 -2,2 -22,2
Média 28,30 6,5 22,01 -6,3 -26,3
Conforme visto para os dados de vasomotricidade, o baixo número amostral
associado a um alto coeficiente de variação de algumas variáveis, sugerem o uso de
análises comparativas não-paramétricas como método de análise, por serem mais
robustos a eventuais variações.
O método escolhido para análise estatística dos dados foi novamente o teste de
Mann-Whitney. Sua escolha foi baseada nos fatores relatados para vasomotricidade. Os
resultados da análise dos dados são discriminados na tabela 10: Tabela 10 - Estatísticas Comparativas: Estudo Transversal Mann-Whitney U Test
(Controle vs Paciente)
Marked tests are
significant at p < 0.05
Rank Sum Rank Sum U Z p-level
Zp-level
n n 2*1sided
(controle) (paciente) adjusted controle paciente exact p
Baseline (mean PU) 105 105 50 0,00 1,00 0,00 1,00 10 10 1,00 n.s.
Acetil
plateau (dosis) Acetil 56,5 153,5 1,5 -3,67 0,00 -3,74 0,001 10 10 0,0001 *
plateau (mean PU) 150 60 5 3,40 0,00 3,40 0,001 10 10 0,001 *
Acetil
increase baseline- 155 55 0 3,78 0,00 3,78 0,001 10 10 0,00001 *
plateau (PU) Acetil
% increase baseline- 155 55 0 3,78 0,00 3,78 0,001 10 10 0,00001 *
plateau Acetil
Baseline (mean PU) 104,5 105,5 49,5 -0,04 0,97 -0,04 0,97 10 10 0,97 n.s.
Nitro
plateau (dosis) Nitro 60 150 5 -3,40 0,00 -3,54 0,001 10 10 0,001 *
plateau (mean PU) 155 55 0 3,78 0,00 3,78 0,001 10 10 0,00001 *
Nitro
increase baseline- 155 55 0 3,78 0,00 3,78 0,001 10 10 0,00001 *
plateau (PU) Nitro
% increase baseline- 155 55 0 3,78 0,00 3,78 0,001 10 10 0,00001 *
plateau Nitro
Baseline (mean PU) 98 112 43 -0,53 0,60 -0,53 0,5967 10 10 0,63 n.s.
Adren
plateau (dosis) Adren 112 98 43 0,53 0,60 0,58 0,5587 10 10 0,63 n.s.
plateau (mean PU) 97 113 42 -0,60 0,55 -0,60 0,5454 10 10 0,58 n.s.
Adren
increase baseline- 87 123 32 -1,36 0,17 -1,36 0,1736 10 10 0,19 n.s.
plateau (PU) Adren
% increase baseline- 85 125 30 -1,51 0,13 -1,51 0,1306 10 10 0,14 n.s.
plateau Adren
69
A análise dos resultados expressos na tabela 10 demonstra que não há diferença
estatisticamente significativa do fluxo em condições basais (baseline) entre controles e
pacientes. Isto se reflete em todos os experimentos, tanto com acetilcolina e
nitroprussiato quanto para noradrenalina.
Após a iontoforese de noradrenalina observamos que não há diferença
estatisticamente significativa (0,63) entre o número de doses necessárias para se atingir o
platô comparando-se pacientes aos controles. Além disto, também não há diferença
estatisticamente significativa entre o aumento ou decréscimo (que seria por
vasoconstrição) da perfusão entre controles e pacientes. Isto se mostra verdadeiro tanto
para alteração real (p = 0,19) quanto percentual (p = 0,14) da perfusão.
Porém após a iontoforese de acetilcolina, observamos que há diferença estatística
altamente significativa (p=0,0001) entre a dose inicial em que se alcança o platô nos
controles e nos pacientes. Esta dose foi menor nos controles (platô alcançado mais cedo)
do que nos pacientes (platô alcançado mais tarde).
Além disto, tanto o incremento de perfusão (medido pela diferença de unidades de
perfusão do baseline para o platô), quanto a porcentagem deste incremento (medido pela
porcentagem de aumento do baseline para o platô, tendo valor do baseline como 100%),
foram diferentes comparando-se os pacientes aos controles. Isto se refletiu devido aos
pacientes terem um incremento, tanto real quanto percentual, inferior ao dos controles.
Estes dados mostraram alta significância estatística, com p = 0,00001 para ambos.
Observando-se os dados para a iontoforese de nitroprussiato, podemos constatar
que as mesmas observações feitas para a acetilcolina são pertinentes ao nitroprussiato.
Este apresenta dose para alcançar o platô inferior nos controles comparado aos pacientes
(p = 0,0001), bem como incremento real e percentual maior nos controles comparado aos
pacientes (p = 0,00001).
Para reforçar ainda mais esta similaridade entre os dados encontrados para
acetilcolina e para nitroprussiato, realizamos a análise comparativa entre os ganhos reais
e percentuais de acetilcolina em relação ao nitroprussiato, tanto para os grupos controles
quanto para os pacientes. Os resultados estão expressos na tabela 14 e 15,
respectivamente:
70
Tabela 11 - análise comparativa entre os ganhos reais e percentuais de acetilcolina em relação ao nitroprussiato para controles
Sign Test
Marked tests are significant at p <.05000
No. of Non-ties Percent v < V Z p-level
increase baseline-plateau (PU) Acetil X increase baseline-plateau (PU) Nitro 10 30,00 0,95 0,34 n.s.
% increase baseline-plateau Acetil X % increase baseline-plateau Nitro 10 70,00 0,95 0,34 n.s.
Tabela 12 - análise comparativa entre os ganhos reais e percentuais de acetilcolina em relação ao nitroprussiato para pacientes Sign Test
Marked tests are significant at p <.05000
No. of Non-ties Percent v < V Z p-level
increase baseline-plateau (PU) Acetil X increase baseline-plateau (PU) Nitro 10 40,00 0,32 0,75 n.s.
% increase baseline-plateau Acetil X % increase baseline-plateau Nitro 10 40,00 0,32 0,75 n.s.
A avaliação dos dados obtidos nas tabelas 11 e 12 reforçam que não há diferença
estatística significativa (p > 0,05) entre as curvas de acetilcolina e nitroprussiato,
demonstrando que os efeitos de ambos foram altamente similares. Isto foi observado
tanto para os controles (p = 0,34) quanto para os pacientes (p = 0,75), sendo que neste
ultimo grupo a similaridade foi marcante, com p muito elevado.
Estas diferenças encontradas tanto para acetilcolina quanto para nitroprussiato
entre controles e paciente é ainda mais bem visualizada se observarmos as alterações
entre as curvas de controles e pacientes. As figuras 11 e 12 ilustram bem tais diferenças.
Figura 11 - Efeito da iontoforese de Ach em controle (esq) e paciente (dir). Observar escala de 200PU nos controles e apenas 100PU nos pacientes.
71
Figura 12 - Efeito da iontoforese de SNP em controle (esq) e paciente (dir). Observar escala de 150PU nos controles e apenas 75PU nos pacientes.
Podemos observar nas figuras 11 e 12 como o platô de perfusão é alcançado de forma
mais precoce nos controles do que nos pacientes, necessitando de numero menor de
doses para ser atingido. Vemos também o maior aumento real e percentual de perfusão
nos controles em relação aos pacientes, ainda mais se for ressaltada que a escala em
unidades perfusionais (PU) dos controles é duas vezes maior que a dos pacientes,
denotando que a diferença no gráfico é duas vezes maior do que observamos à primeira
vista.
5.2 Cytoscan®
Os resultados obtidos com a avaliação dos controles e dos pacientes com o uso
do Cytoscan® foram organizados nas tabelas 13 e 14 respectivamente:
Tabela 13 - Resultados da analise do Cytoscan® nos controles (controle x parâmetros)
NOME DCF 1 DCF 2 DCF 3 DIAMP 1 DIAMP 2 DIAMP 3 DIAMAL 1 DIAMAL 2 DIAMAL3 DIAMC1 DIAMC2 DIAMC3 MORFO 1 MORFO 2 MORFO 3
AD 31,29 39,83 28,45 81,9 82,6 88,8 59,5 36,7 66,2 5,6 6,8 8,3 8,0 0,0 1,0
LGN 36,98 45,51 42,67 66,6 82,8 92,3 46,3 47,9 62,0 6,4 5,4 8,3 18,0 0,0 13,0
TN 34,05 51,2 75,1 91,2 42,2 65,7 5,7 6,8 0,0 5,5
FHS 19,91 22,76 39,83 90,1 101,6 84,3 75,1 65,6 59,1 6,8 8,9 8,9 0,0 0,0 0,0
FV 31,3 31,3 48,3 73,2 88,9 99,0 54,7 34,9 89,3 3,4 8,3 5,1 0,0 18 5,8
WES 54,05 31,29 31,29 95,7 89,9 85,6 49,2 41,5 40,1 8,1 5,7 11,4 0,0 0,0 11,0
FS 42,6 34,14 36,9 85 71,5 69,6 30,6 45,0 27,0 7,9 6,3 0,0 31,6 30,7
EP 45,5 34 45,5 98,5 78,4 67,0 83,5 33,5 30,4 9,2 6,3 6,4 6,0 25 6,0
MAG 39,8 36,9 36,9 105 117,3 69,9 51,2 60,4 34,2 5,4 8,4 6,1 13,0 15 0,0
YT 31,29 45,51 51,2 98,7 107,1 77,3 61,7 62,5 41,3 5,6 7,9 7,9 11,0 6,3 0,0
Média 36,97 35,53 41,23 88,3 89,5 82,5 56,9 47,0 51,5 6,3 7,1 7,6 6,2 9,6 7,3
72
Tabela 14- Resultados da analise do Cytoscan® nos Pacientes (paciente x parâmetros) NOME DCF DCF DCF DIAMP DIAMP DIAMP DIAMAL DIAMAL DIAMAL DIAMC DIAMC DIAMC MORFO MORFO MORFO
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
ARS 32,76 34,14 39,91 95 85,6 119,0 52,8 44,4 79,0 8,5 7,9 11,5 50,0 33,0 57,0
JF 38,45 39,91 32,76 111,8 91,5 51,3 19,0 8,5 42,0 25,0
OR 36,9 54 34 93,7 174,0 144,5 43,6 86,0 92,6 4,7 6,0 6,8 100,0 58 58,0
AS 34,2 31,3 34,14 95,4 85,8 84,6 60,8 59,2 56,2 6,1 8,2 10,1 20,0 54 38,5
MFS 42,67 31,29 32,76 75,8 116,3 110,4 38,4 76,4 62,1 7,4 5,6 6,1 0,0 9,0 0,0
PM 28,4 31,3 34,1 104,5 125,2 86,4 45,8 71,2 49,7 6,8 7,5 9,5 0,0 9 0,0
CA 75,4 25,6 42,7 132,6 135,7 77,8 103,1 96,3 32,3 14,5 7,4 6,7 100,0 100,0 46,7
AS 31,3 54 45,5 101,2 79,3 91,8 46,6 47,2 54,0 5,6 4,7 10,3 18,0 16,7 56,0
SAB 45,5 51,2 39,8 117,9 78,4 95,3 95,2 39,3 70,6 11,2 9,6 7,9 50,0 83,0 100,0
CAP 48,4 65,4 36,9 92,9 77,2 81,5 38,6 45,0 44,2 7,0 8,4 0,0 17 15,0
Média 42,36 42,67 36,96 101,75 109,0 98,2 59,0 68,0 57,0 8,0 8,3 8,3 36,0 43,2 37,7
DCF Densidade capilar funcional DIAMP Diâmetro da papila DIAMC Diâmetro do capilar DIAMAL Diâmetro da alça MORFO Morfologia alterada do capilar
Os resultados da análise estatística comparativa entre controles e pacientes é
descrita na tabela abaixo: Tabela 15 - Estatísticas Comparativas: Estudo Transversal Mann-Whitney U Test Cytoscan® (Controle vs Paciente) Marked tests are significant at p < 0.05
Rank Sum (controle) Rank Sum p- Z p- n n 2*1sided exact
(paciente) level adjusted level controle paciente p
n.s
DFC 99 111 0,65 -0,45 0,65 10 10 0,68
.
DIAMP 69 141 0,01 -2,72 0,01 10 10 0,01
DIAMAL 78 132 0,04 -2,04 0,04 10 10 0,04
DIAMC 84 126 0,11 -1,59 0,11 10 10 0,12 n.s
.
MORFO 72 138 0,01 -2,50 0,01 10 10 0,01
Os dados contidos na tabela 15 revelam que não há diferença estatisticamente
significativa entre os grupos em relação às variáveis densidade capilar funcional e
diâmetro do capilar, porém há diferenças significativas entre os dois grupos em relação
às variáveis diâmetro da papila, diâmetro da alça e morfologia alterada. A despeito da
análise comparativa do Diâmetro da alça apresentar um p estatístico igual à 0,04, esta
variável possui um coeficiente de variação baixo, sugerindo precisão da medida.
Apesar da variável diâmetro de capilar não apresentar um p estatisticamente
significativo, a observação da variação dos diâmetros de capilar (figura 13) associado a
analise das tabelas 13 e 14, sugerem que possa haver um aumento no diâmetro capilar
73
dos pacientes em relação aos controles, que não se mostrou estatisticamente
significativo devido à amostra reduzida e variabilidade expressiva.
Figura 13 - Variação nos diâmetros dos capilares de controles e pacientes
74
6 DISCUSSÃO
Ao que consta após extensa revisão bibliográfica, esta é a primeira vez em que
se avalia a repercussão da hanseníase na reatividade vascular destes pacientes, bem
como de que forma a doença repercute na arquitetura vascular, sendo também a
primeira vez em que se usa a tecnologia de luz ortogonal polarizada (Cytoscan®) no
estudo da microcirculação deles. Os resultados de cada teste são discutidos a seguir.
- Vasomotricidade
Partindo-se do pressuposto de que a inervação se encontra difusamente alterada
nos pacientes portadores de hanseníase virchowiana, os resultados encontrados com o
uso de laser Doppler para avaliação de vasomotricidade mostram que não há diferença
estatística significante entre os pacientes portadores de hanseníase e os controles. Isto se
mostrou verdadeiro mesmo nos pacientes mais graves, com maior grau de infiltração
cutânea e anestesia.
Uma possibilidade para que não tenha havido diferença estatisticamente
significativa nos componentes da vasomotricidade reside no fato de que o método é
extremamente sensível, com alta variabilidade nos resultados. Diante de um numero
amostral reduzido, isto pode comprometer a análise dos resultados, fazendo com que
estes possam não ser fidedignos. Vale ressaltar, entretanto, que o numero amostral
utilizado é semelhante ao da grande maioria dos estudos que usam o laser Doppler na
avaliação da vasomotricidade.
Porém, em recente estudo, Yuill e colaboradores (Yuill 2009) relatam que o
tônus miogênico é desencadeado pela despolarização da musculatura lisa vascular,
através do influxo de cálcio para o meio intracelular, em um mecanismo relacionado
apenas a tensão na parede do vaso, independente de outros fatores. Porém alguns fatores
podem ajudar a modular esta resposta. Neste estudo eles demonstraram que um
mecanismo de controle da vasomotricidade é através da liberação basal do óxido nítrico
endotelial, o qual pode diminuir e até suprimir o tônus vasomotor.
Logo, outra possibilidade é que os resultados encontrados com a
vasomotricidade confirmam estudos anteriores de Bouskela e colaboradores (Bouskela
1989; Bouskela 1992; Morita-Tsuzuki. 1992; Morita-Tsuzuki 1993; Bouskela 1994;
Bouskela 1997). Tais estudos já sugeriam que a vasomotricidade é um fenômeno
essencialmente miogênico. Isto foi inicialmente deduzido tendo em vista que, mesmo
sob anestesia com pentobarbital de sódio ou α -cloralose, com o uso de bloqueador
75
nervoso misto ou seletivo (tetrodotoxina, propanolol e fenoxibenzamina), a
vasomotricidade não foi afetada. Por outro lado o uso de ativadores ou bloqueadores
dos canais de K+ podem suprimir e posteriormente reativar (respectivamente) o
fenômeno de vasomotricidade (Bouskela 1992).
Segundo Achakri (Achakri 1995), a freqüência e magnitude da vasomotricidade
são influenciadas pela pressão intraluminal, e não por agentes externos, com isto o fato
de não haver alteração na amplitude e frequência da vasomotricidade, apesar das
alterações vistas na hanseníase, coloca os resultados obtidos de acordo com tal hipótese.
- Iontoforese
O resultado encontrado com a iontoforese de noradrenalina não é considerado
pelo autor como válido, tendo em vista que, devido à meia vida extremamente curta da
noradrenalina, a iontoforese não alcançava um platô, e sim vários períodos de
vasoconstrição seguido por vasodilatação reflexa, o que inviabiliza a forma como
clássicamente se interpreta estes dados. Este perfil de labilidade vasoconstrição-
vasodilatação pode ser bem visualizado na figura a seguir. Relativo aos períodos de
vasoconstrição e vasodilatação, não observamos neste comportamento diferenças
significativas entre os controles e os pacientes virchowianos. Figura 14 - Perfil de iontoforese da adranalina mostrando os periodos de vasoconstrição-vasodilatação com grande labilidade, sem atingir um platô.
Em relação aos achados com iontoforese de acetilcolina e nitroprussiato de
sódio, podemos constatar que há uma diminuição da resposta vasodilatadora sob a ação
destas duas substâncias vasoativas. Este comportamento se mostra totalmente dissociado
de qualquer alteração do endotélio vascular, o qual parece estar integro nos pacientes
virchowianos.
Isto pode ser constatado pelas curvas de resposta vasodilatadora a ambas as
substâncias serm absolutamente idênticas (ver tabelas 14 e 15). Caso houvesse
interferência do endotélio capilar por comprometimento deste, a resposta a acetilcolina
76
seria inferior ao nitroprussiato de sódio.
Os resultados encontrados com a iontoforese de Ach e SNP vão de acordo os
achados de Carr e colaboradores (Carr 1993), os quais já haviam percebido uma
alteração na reatividade vascular em ratos submetidos à denervação de membro. Tais
animais tiveram seletivamente uma das patas traseiras desnervada e foi realizada
ionoforese transdérmica de nitroprussiato de sódio e de acetilcolina. A reatividade
vascular às substâncias vasoativas foi menor de forma estatísticamente significativa no
membro desnervado do que no membro de inervação mantida.
Em outro estudo com ratos simpatectomizados, Rizzoni e colaboradores
(Rizzoni 2000) demonstraram que a reatividade vascular de tais animais esta
significativamente alterada em relação a animais controles. A resposta a substâncias
vasoconstritoras (norepinefrina, vasopressina, fenilefrina e angiotensina II), foi
significativamente mais acentuada nos ratos simpatectomizados do que nos animais
controles. Por outro lado, a resposta para substâncias vasodilatadoras (acetilcolina e
niroprussiato de sódio) foi reduzida nos animais simpatectomizados, o que vai de
acordo com os resultados obtidos em nosso estudo.
Neste mesmo estudo, Rizzoni e seus colaboradores (Rizzoni 2000) especulam
que este comportamento de baixa resposta vascular aos estímulos vasodilatadores pode
se tratar de um mecanismo compensatório para o fato de que os pacientes com quadro
de denervação, e consequentemente disautonomia, apresentam um reflexo vasomotor
diminuído, com isso têm grande tendência para hipotensão postural. Este
comportamento também é descrito em pacientes hansenianos, especialmente
virchowianos (Wilder-Smith 1996; Wilder-Smith 2000; Illarramendi 2005; Wilder-
Smith 2008).
Esta resposta diminuída vasodilatadora pode se tratar de um mecanismo protetor
para que estes pacientes não façam uma queda pressórica acentuada, relacionada à perda
do controle autônomo. Estes resultados também podem representar uma diminuição
crônica do tônus da musculatura lisa vascular, o qual pela diminuição por longos
períodos do estimulo nervoso, pode resultar em diminuição de responsividade.
77
- Cytoscan®
A diferença encontrada na morfologia dos capilares nos pacientes com
hanseníase virchowiana pode ser correlacionada com o maior diâmetro tanto dos
capilares quanto das alças dos mesmos. As alterações morfológicas foram justamente
relacionadas ao maior tamanho e enovelamento destes capilares.
Tais resultados estão de acordo com vários estudos prévios tanto em pacientes
quanto em animais submetidos à algum tipo de denervação e que mostram alterações
nos capilares destes. Lefrandt e colaboradores (Lefrandt 2003) demonstraram que
pacientes diabéticos portadores de neuropatia diabética apresentavam aumento de
tamanho e extravasamento dos capilares.
A observação do aumento importante no tamanho das alças e discreto do
diâmetro dos capilares, vistos na hanseníase virchowiana, podem ser correlacionados
com tais achados. É possível especular que a diminuição da inervação causada pela
hanseníase possa refletir na microcirculação de forma análoga ao bloqueio do plexo
nervoso.
Landsversk e colaboradores (Landsverk 2006) descreveram um discreto aumento
do fluxo sanguíneo na pele, medido pelo laser Doppler após bloqueio do plexo braquial
que inervava a área estudada. Estas alterações são observadas em vários estudos de
simpatectomia e denervação que mostram aumento de fluxo e permebilidade capilar
(Linderoth, Gunasekera et al. 1991; Cooke, Harris et al. 1995; Koman, Smith et al.
1995; Pollock, Li et al. 1997; Smith, Koman et al. 1998; van Dielen, Kurvers et al.
1998; Barker, Frank et al. 1999; Claeys 1999). Já é bem constatado que a denervação de
um órgão terminal diminui a atividade simpática distal e produz vasodilatação da
microcirculação distal, aumentando o fluxo sanguineo (Pollock, Li et al. 1997).
Alguns trabalhos inclusive usam esta alteração de tamanho, fluxo e
permeabilidade capilar para auxiliar no tratamento de feridas e lesões secundárias a
problemas de deficiência circulatória e vasoespasmo (Pieri, Agresti et al. 2005;
Volchok, Santamarina et al. 2005; Bhattarai, Rahman et al. 2006; Wang, Lai et al. 2006;
Li, Smith et al. 2009; Takahashi, Yamaguchi et al. 2009).
O referido aumento da permeabilidade capilar secundário a denervação pode
auxiliar a explicar o aumento no diâmetro das papilas dérmicas visto no Cytoscan®.
Henriksen e colaboradores (Henriksen 1976; Henriksen, Sejrsen et al. 1983)
demonstraram que ratos submetidos a denervação crônica, quando submetidos a um
78
aumento da pressão venosa, não tem a vasoconstrição reflexa que animais saudáveis
tem como mecanismo protetor, gerando maior extravasamento. Sugere-se que um
mecanismo de reflexo simpático veno-arteriolar desempenha papel dominante em
reduzir o aumento de filtração capilar durante grandes aumentos de pressão venosa. Este
reflexo simpático veno-arteriolar é determinante como fator protetor contra o edema
inclusive em humanos (Henriksen 1991).
Quando há aumento da permeabilidade, com manutenção do fluxo,
consequentemente há um maior extravasamento de transudato para fora dos capilares.
Este maior extravasamento cria um edema dérmico que se reflete em um alargamento
das papilas e com isto, aumento em seus diâmetros.
E possível que a manutenção da densidade capilar funcional, apesar do discreto
aumento de tamanho de capilar e do diâmetro das alças capilares, decorra do fato de que
diante de um edema na papila dérmica, há uma diminuição da densidade capilar
funcional (Lupi, Semenovitch et al. 2007). Logo, é possível especular que este edema de
papila contraponha o teórico aumento de fluxo esperado pela alteração morfológica dos
capilares.
Alguns estudos realizados com pacientes com insuficiência venosa profunda
(Virgini-Magalhaes, Porto et al. 2006; Lascasas-Porto, Milhomens et al. 2008)
demonstraram alterações importantes na morfologia dos capilares cutâneos. Tais
alterações são decorrentes do aumento da pressão ao qual eles são submetidos por
longos períodos. Isto demonstra que os capilares sofrem alterações morfológicas
adaptativas quando submetidos a alterações ambientais crônicas.
É possível que as alterações secundárias a alterações de inervação discutidas
acima, perdurando por longo período, possam evoluir causando a alteração morfológica
descrita para os capilares. Normalmente, nos pacientes com hanseníase virchowiana o
diagnóstico geralmente é feito após alguns anos do inicio da instalação da doença,
gerando um tempo maior para instalação de alterações adaptativas dos capilares.
79
7 CONCLUSÕES
O presente trabalho fornece uma série de resultados novos tanto no âmbito da
microcirculação quanto da hanseníase. Os resultados encontrados sugerem que mesmo
sendo a denervação da hanseníase virchowiana um processo arrastado, não há um
mecanismo compensatório suficiente para se contrapor a estas alterações. Ao contrário,
parece haver uma acentuação desta perda de reatividade, provavelmente devido ao
baixo estimulo ao qual o músculo liso vascular fica submetido.
É possível que tais alterações, perdurando por longos períodos, possam evoluir
causando a alteração morfológica descrita nos capilares. Este tempo longo de doença é
o caso dos pacientes com hanseníase virchowiana, tendo em vista que o diagnóstico
geralmente é feito após alguns anos do inicio da instalação da doença.
Por fim, constatamos que o laser Doppler associado à iontoforese se constitue
em mecanismo extremamente útil para o estudo da reatividade vascular na hanseníase.
Constatamos também que o Cytoscan® representa ferramenta importante na
visualização em tempo real e de forma não invasiva das alterações microcirculatórias na
hanseníase.
8 SUGESTÕES:
1- Repetir o estudo para avaliação de vasomotricidade, com um número amostral
maior de pacientes, para que a alta sensibilidade com grande labilidade do método não
comprometam a análise dos resultados.
2- Criação de um protocolo de iontoforese de noradrenalina com iontoforese
contínua, afim de que se possa manter um platô de vasoconstrição para que se possa
avaliar a resposta diante de estímulos adrenérgicos.
3- Realizar o experimento em lesões de hanseníase tuberculóide, onde
classicamente o dano neurológico é maior devido à resposta mais intensa contra o nervo
e, consequentemente, esperam-se resultados ainda mais expressivos, podendo inclusive
tirar qualquer duvida em relação ao componente simpático da vasomotricidade.
4- No caso de realizar pesquisa em lesões tuberculóides, atentar para o fato de
que diferentes regiões da pele tem diferentes sinais de laser Doppler (Park, Hwang et al.
1997). Realizar a comparação de resultados sempre com lesões em áreas semelhantes.
80
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90
APÊNDICE A - Termo de consentimento livre e esclarecido para perticipaçâo em
estudo clínico: protocolo único para estudo da microcirculação em homens adultos
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
PARA PERTICIPAÇÂO EM ESTUDO CLÍNICO
PROTOCOLO ÚNICO PARA ESTUDO DA MICROCIRCULAÇÃO
EM HOMENS ADULTOS Investigadores: Curt Mafra Treu, Omar Lupi, Eliete Bouskela Locais de estudo: Laboratório de Pesquisas em Microcirculação
Pavilhão Reitor Haroldo Lisboa da Cunha,
Rua São Francisco Xavier, 524 / 104 – térreo
20550-013 Rio de Janeiro RJ
Telefone: (021) 2587-7771 Telefone: (021) 2587-6100
91
Este termo de consentimento poderá conter palavras que você não entenda. Por
favor, pergunte ao seu médico ou à sua equipe de estudos sobre qualquer palavra ou
informação que você não entenda perfeitamente.
Você receberá uma cópia deste Termo de Consentimento para o seu registro.
Introdução e objetivos
Determinar através do método de visualização da microcirculação sob luz ortogonal
polarizada e estudo da vasomotricidade com laser Doppler associado à iontoforese (de
acetilcolina, nitroprussiato e noradrenalina), quais as repercussões microcirculatórias das
alterações disautonômicas geradas pela hanseníase virchowiana.
Duração do estudo
A duração deste estudo é de 1 ano, e a duração de sua participação será de 1 dia
(aproximadamente 1 à 2h). No entanto, se for necessário, o estudo poderá ser suspenso ou
você poderá retirar-se, se for do seu interesse, ou para seu benefício. Descrição do estudo Trata-se de um estudo para determinar qual a repercussão, na microcirculação cutânea,
do acometimento do sistema nervoso periférico na hanseníase. Este estudo será feito apenas
com voluntários e os mesmos não precisarão ingerir nenhum tipo de medicamento. No dia de participação você fará o exame com o Cytoscan® e com o laser Doppler,
que não provocam qualquer dor ou mal estar. Ao chegar ao local do exame, você será confortavelmente instalado(a) em sala
climatizada e aguardará 30 min para o inicio. Após os exames, você poderá retornar às suas
atividades normais.
No dia de exame, se necessário, forneceremos um Atestado Médico para ser
apresentado no seu trabalho (abono das horas). Não serão feitas biópsias (retirada de qualquer
porção da pele). Riscos e desconfortos Os métodos utilizados para o estudo não provocam qualquer desconforto ou risco para
a sua saúde.
Benefícios
Você não terá gastos, todos os exames serão feitos gratuitamente. Os resultados do
estudo poderão alertá-lo sobre sua saúde, caso algum problema de saúde seja detectado.
92
Os resultados do estudo poderão trazer avanços para o estudo de mecanismos iniciais
das alterações na hanseníase, importante problema de saúde pública, e condições associadas,
através da publicação de artigos e apresentações em congressos científicos.
Ao final do exame você receberá vale transporte, de acordo com o local da sua
residência.
Confidencialidade
As informações que forem obtidas no estudo, incluindo registros clínicos e/ou
hospitalares, serão tratadas de forma confidencial e não serão liberadas ou reveladas a
qualquer pessoa, exceto ao seu médico, sem o seu consentimento por escrito.
Participação voluntária/retirada
A sua participação neste estudo é voluntária. Você pode recusar-se a participar ou
retirar-se do estudo a qualquer momento. Se você decidir fazê-lo, solicitamos que telefone
para o investigador. A sua decisão de recusar-se a participar do estudo não afetará qualquer
benefício que tenha recebido neste local.
Novos achados
Você será comunicado, assim que a informação estiver disponível, sobre qualquer
novo achado importante registrado no decorrer deste estudo que possa eventualmente
influenciar o seu desejo de continuar no estudo.
93
Consentimento do paciente
Li e entendi as informações precedentes descrevendo este estudo e todas as minhas
dúvidas em relação ao estudo e à minha participação nele foram respondidas
satisfatoriamente. Dou livremente meu consentimento para participar do estudo até que decida
pelo contrário.
Assinando este termo de consentimento concordo em participar deste estudo e não
abro mão, na condição de participante de um estudo de pesquisa, de nenhum dos direitos
legais que eu teria de outra forma.
_______________________ _________________________ __/__/___
Nome do paciente (letra de forma) Assinatura do paciente Data
_______________________ _________________________ __/__/___
Nome da testemunha (letra de forma) Assinatura da testemunha Data
O PACIENTE ACIMA MENCIONADO RECEBEU TODAS AS
INFORMAÇÕES SOBRE O ESTUDO
_____________________________ _________________________ __/__/___
Nome do Investigador Assinatura do Investigador Data
94
APÊNDICE B - Protocolo do exame de microcirculação em pacientes com hanseníase
virchowiana
Protocolo do exame de microcirculação em pacientes com hanseníase virchowiana
Preparação do equipamento: - Ligar o laser Doppler 20min. antes de usá-lo. - Verificar a calibração das probes para o laser Doppler. - Ligar o MycroScan Preparação do paciente:
Para o MycroScan: - Deixar o paciente em aclimatização em local fresco e tranquilo. - Regular a altura da cadeira e posicionar a mão esquerda no suporte, à
altura do coração.
- Fazer 3 medições de 10s do microscan na face anterior distal do
antebraço esq., cada uma distando 5cm da área previamente avaliada.
Para o laser Doppler: - Deixar o paciente em aclimatização em local fresco e tranquilo. - Regular a altura da cadeira e posicionar a mão esquerda no suporte, à
altura do coração - Se necessário, cortar o excesso de pêlos. - Seguir o protocolo abaixo:
95
PASSOS DESCRIÇÃO 1 Período de aclimatização do paciente 2 Gravação da vasomotricidade por 20min 3 INICIO DA IONTOFORESE DE ACETILCOLINA 4 Corrente de 0,1mA por 20s 5 Intervalo de 60s 6 Corrente de 0,1mA por 20s 7 Intervalo de 60s 8 Corrente de 0,1mA por 20s 9 Intervalo de 60s
10 Corrente de 0,1mA por 20s 11 Intervalo de 60s 12 Corrente de 0,1mA por 20s 13 Intervalo de 60s 14 Corrente de 0,1mA por 20s 15 Intervalo de 60s 16 Corrente de 0,1mA por 20s 17 Intervalo de 60s 18 Corrente de 0,2mA por 20s 19 Intervalo de 60s 20 INICIO DA IONTOFORESE DE ACETILCOLINA 21 Corrente de 0,1mA por 20s 22 Intervalo de 60s 23 Corrente de 0,1mA por 20s 24 Intervalo de 60s 25 Corrente de 0,1mA por 20s 26 Intervalo de 60s 27 Corrente de 0,1mA por 20s 28 Intervalo de 60s 29 Corrente de 0,1mA por 20s 30 Intervalo de 60s 31 Corrente de 0,1mA por 20s 32 Intervalo de 60s 33 Corrente de 0,1mA por 20s 34 Intervalo de 60s 35 Corrente de 0,2mA por 20s 36 Intervalo de 60s 37 INICIO DA IONTOFORESE DE NITROPRUSSIATO38 Corrente de 0,1mA por 20s 39 Intervalo de 120s 40 Corrente de 0,1mA por 20s 41 Intervalo de 120s 42 Corrente de 0,1mA por 20s 43 Intervalo de 120s 44 Corrente de 0,1mA por 20s
96
45 Intervalo de 120s 46 Corrente de 0,1mA por 20s 47 Intervalo de 120s 48 Corrente de 0,2mA por 20s 49 Intervalo de 120s 50 INICIO DA IONTOFORESE DE NORADRENALINA51 Corrente de 0,1mA por 30s 52 Intervalo de 60s 53 Corrente de 0,1mA por 30s 54 Intervalo de 60s 55 Corrente de 0,1mA por 30s 56 Intervalo de 60s 57 Corrente de 0,1mA por 30s 58 Intervalo de 60s 59 Corrente de 0,1mA por 30s 60 Intervalo de 60s 61 Corrente de 0,1mA por 30s 62 Intervalo de 60s 63 Corrente de 0,1mA por 30s 64 Intervalo de 60s 65 Corrente de 0,2mA por 30s 66 Intervalo de 60s 67 FIM DO EXPERIMENTO
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