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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
BÁRBARA PEREIRA
PRODUÇÃO DE LIGNINA PEROXIDASE COM A UTILIZAÇÃO DE
SUBPRODUTOS INDUSTRIAIS
LORENA
2014
BÁRBARA PEREIRA
PRODUÇÃO DE LIGNINA PEROXIDASE COM A UTILIZAÇÃO DE
SUBPRODUTOS INDUSTRIAIS
Monografia apresentada à Escola de Engenharia de
Lorena - Universidade de São Paulo como requisito
parcial para conclusão da Graduação do curso de
Engenharia Industrial Química
Orientadora: Prof. Dra. Maria Eleonora Andrade de
Carvalho
LORENA
2014
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO Serviço de Biblioteca Escola de Engenharia de Lorena
Pereira, Bárbara
Produção de lignina peroxidase com a utilização de subprodutos industriais/
Bárbara Pereira. - Lorena, 2014.
37 f.
Monografia apresentada como requisito parcial para a conclusão do Curso de
Graduação de Engenharia Química - Escola de Engenharia de Lorena da Universidade
de São Paulo.
Orientadora: Maria Eleonora Andrade de Carvalho
1. Lignina peroxidase (Produção) I. Carvalho, Maria Eleonora Andrade de,
Orient.
Em memória de meus avós.
Aos meus amados pais e irmãos.
AGRADECIMENTOS
À professora Maria Eleonora Andrade de Carvalho, pela paciência e
orientação.
À amiga Maria Bernadete de Medeiros pelo apoio e incentivo.
Ao amigo Fabrício B. Ferreira pelo apoio e incentivo nas horas difíceis.
À Suzana Wirthmann pela ajuda no desenvolvimento do trabalho.
Aos amigos conquistados durante a graduação Angela, Cibele, Dayse,
Luana, Luíza, Paulo e Walney pelo encorajamento.
Aos colegas de trabalhe que fizeram parte dessa longa caminhada.
A Ingredion Brasil Ingredientes Industriais LTDA pela colaboração.
RESUMO
PEREIRA,B. Produção de Lignina Peroxidase com a Utilização de Subprodutos
de Industriais. 2014. 35 p. Monografia (Trabalho de Graduação em Engenharia
Industrial Química) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo,
Lorena 2014.
Este trabalho constou de ensaios experimentais, para avaliar a possibilidade de
substituição de componentes do meio padrão de cultivo para a produção da lignina
peroxidase, enzima capaz de oxidar compostos fenólicos, não fenólicos, compostos
orgânicos tóxicos e corantes da indústria têxtil, pelo Phanerochaete chrysosporium.
Foram efetuadas três séries de experimentos. A primeira série constou da
substituição da fonte de carbono e vitaminas na fase de crescimento do fungo,
sendo mantidas as condições padrões de ativação da síntese da enzima com álcool
veratrílico. A segunda série de ensaios manteve- se a fonte de carbono e vitaminas
da condição padrão de crescimento do fungo e na fase de ativação da síntese da
lignina peroxidase, utilizou-se o licor negro. Na terceira série de ensaios, os
substituintes milhocina e licor negro foram usados nas fases de crescimento e na
produção da enzima, respectivamente. Os melhores resultados foram obtidos com o
uso de milhocina 0,5% (v/v) e nestas condições os níveis médios de atividade
alcançaram 144,1 U.L-1. O uso do licor negro neste estudo foi menos efetivo. As
atividades médias foram de 64,5 U.L-1. A aplicação simultânea da milhocina e do
licor negro não resultou em atividade enzimática detectável.
Palavras-chave: produção de lignina peroxidase, milhocina e licor negro.
ABSTRACT
PEREIRA, B. Production of Lignin Peroxidase with the Use of Industrial
Byproducts. 2014. 35p. Monografia (Trabalho de Graduação em Engenharia
Industrial Química) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo,
Lorena 2014.
The aim of this work was to evaluate the feasibility of replacing components in
standard culture medium for the production of lignin peroxidase by Phanerochaete
chrysosporium. This enzyme is able of oxidizing phenolic, non-phenolic, toxic organic
compounds and dyes from textile industry. Three sets of experiments were
performed using industrial byproducts such as corn steep and black liquors. In the
first set, carbon source and vitamins in the growth medium was replaced by corn
steep liquor at different proportions and the standard conditions (addition of veratryl
alcohol) for inducing the enzyme synthesis were maintained. The second set of
experiments investigated the influence of replacing veratryl alcohol by black liquor
using the standard conditions (carbon source and vitamins) in the growth medium. In
the third series of trials, corn steep and black liquors were used for growing and
enzyme production, respectively. The best results were attained using corn steep
liquor 0.5% (v/v) and under these conditions the lignin peroxidase activity reached
average levels of 144.1 UL-1. The use of black liquor was less effective and activities
were as low as 64.5 UL-1. The simultaneous application of corn steep and black
liquors resulted in no detectable enzyme activity.
Keywords: production of lignin peroxidase, corn steep liquor, black liquor.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Monômeros precursores da lignina, quando R1 e R2 são H (hidrogênios) tem-se o álcool p-cumarílico, se R1 igual a OCH3 e R2 igual H tem-se o álcool coníferílico e se R1 e R2 são iguais OCH3 tem-se o álcool sinapílico ...................... 13
Figura 2 - Estrutura representativa da molécula de lignina, em destaque a ligação predominante β-O-4 ................................................................................................. 14
Figura 3 - Compostos fenólicos resultantes da degradação da lignina. Aldeído siríngico (1), ácido siríngico (2), ácido vanílico (3) e vanilina(4) ............................... 15
Figura 4 - Estrutura do álcool veratrílico ( álcool 3,4-dimetoxibenzílico) .................. 16
Gráfico 1 - Comparação de atividade de LiP nos cultivos de meio controle e meio
contendo Milhocina ................................................................................................... 29
Gráfico 2 - Comparação de atividade de LiP nos cultivos de meio controle e meio
contendo Licor Negro ............................................................................................... 30
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição básica da solução de milhocina concentrada, adaptada da
CORN PRODUCTS BRASIL .................................................................................... 19
Tabela 2 - Composição completa do meio de cultura quimicamente definido, limitado em fonte de carbono ................................................................................................. 24
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 11
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................... 13
2.1 A Estrutura da Lignina ......................................................................... 13
2.2 Composição do Licor Negro ................................................................ 15
2.3 A Lignina peroxidase e o fungo ........................................................... 16
2.4 Composição da Milhocina® ................................................................. 17
3 JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS .................................................................. 21
3.1 Justificativas ........................................................................................ 21
3.2 Objetivos ............................................................................................. 21
4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 22
4.1 Determinação dos açucares presentes na Milhocina ........................ 22
4.2 Determinação da Massa Específica e Densidade Relativa do Licor
Negro ............................................................................................................. 22
4.3 Preparo do inóculo do Phanerochaete chrysosporium ....................... 23
4.4 Meio de Cultura padrão para produção da Lignina
Peroxidase...................................................................................................... 23
4.5 Cultivo o Phanerochaete chrysosporium e produção de Lignina
peroxidase utilizando meio de cultivo padrão ................................................ 24
4.6 Cultivo o Phanerochaete chrysosporium e produção de Lignina
peroxidase utilizando Milhocina e Licor Negro .............................................. 25
4.7 Determinação da Atividade de Lignina Peroxidase ............................ 26
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................... 27
5.1 Açúcares presentes na milhocina presentes na Milhocina ................. 27
5.2 Massa Específica e Densidade Relativa do Licor Negro .................... 27
5.3 Cultivo do Phanerochaete chrysosporium e Produção de Lignina
Peroxidase ..................................................................................................... 28
5.4 Cultivo do Phanerochaete chrysosporium e Produção de Lignina
Peroxidase utilizando Milhocina e Licor Negro ............................................. 31
6 CONCLUSÃO ............................................................................................... 33
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 34
APÊNDICES ............................................................................................................. 35
Apêndice A - Atividades de LiP em diferentes concentrações de milhocina ............ 35
Apêndice B - Atividades de LiP em diferentes concentrações de licor negro .......... 36
Apêndice C - Comparação do consumo de açúcar ................................................. 37
11
1 INTRODUÇÃO
Os avanços tecnológicos dos últimos anos permitiram a reavaliação dos
processos produtivos industriais a fim de torná-los menos poluentes ou dar-lhes um
tratamento que minimizem ao máximo os resíduos gerados e seus impactos
ambientais. Atrelado ao enrijecimento da legislação ambiental das últimas décadas e
aos apelos sociais, estudos de tratamentos biológicos não poluentes estão sendo
realizados como alternativa de substituição parcial ou total para os processos
convencionais.
Nas indústrias de celulose e papel já se observa algumas tentativas de
substituição de tecnologias poluidoras por tecnologias que estejam de acordo com
os princípios atuais de sustentabilidade, como por exemplo na biopolpação, no pré-
tratamento para polpação mecânica da madeira, e no biobranqueamento da pasta
de celulose.
A biodegradação da lignina tem sido alvo de vários estudos nos últimos anos.
O processo de biodegradação envolve enzimas extracelulares produzidas por
alguns microrganismos que ocorre naturalmente no seu ambiente de origem. O
biobranqueamento consiste no tratamento da pasta de celulose não branqueada
com enzimas capazes de degradar a lignina residual (CARVALHO, 2003).
A degradação da lignina ocorre naturalmente pela ação de microrganismos,
fungos e algumas eubactérias, produtores de enzimas (FERRARA,1988).
A enzima lignina peroxidase, produzida pelo fungo Phanerochaete
chrysosporium, surge como uma das alternativas enzimáticas para o tratamento da
polpa de celulose não branqueada. O branqueamento químico da pasta celulósica,
que tem como principal agente branqueador o cloro, tem sido alvo de
questionamento dentro das politicas ambientais atuais. Associado a isso, o uso de
tecnologias inovadoras dentro da indústria muitas vezes acarreta um aumento no
seu custo de produção e a aplicação de enzima contribui ainda mais para a
elevação desses custos.
Na literatura, os meios de cultivo recomendados são complexos e
dispendiosos. Como opção para diminuir os valores de produção da enzima, sugere-
12
se testar e avaliar a utilização da milhocina em substituição a alguns componentes
presentes na composição dos meios de cultivo, descritos na literatura, para o
crescimento do fungo e na produção da lignina peroxidase.
O álcool veratrílico, outro componente necessário para a produção da enzima,
possui custo elevado e apresenta estrutura semelhante a alguns componentes do
licor negro, o que possibilita a tentativa de substituição desse composto de custo
expressivo durante o processo de ativação da síntese da enzima.
Atualmente a lignina peroxidase possui poucos fornecedores, que
disponibilizam preparos enzimáticos concentrados a altos valores. Com a utilização
da milhocina e o licor negro pretende-se atingir níveis de atividade enzimática
semelhantes aos obtidos com os meios complexos, possibilitando assim uma
redução nos custos finais de produção da enzima. Sabe-se que tal redução de custo
contribuirá efetivamente para viabilizar a utilização da enzima em processos
industriais.
13
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 A Estrutura da Lignina
A lignina é uma macromolécula de unidades de fenil propano, tridimensional e
não uniforme, é o componente dos vegetais que confere rigidez e a coesão aos
demais componentes da parede celular. A lignina possui alta massa molecular e
tem como principais componentes as unidades de fenilpropano derivados do álcool
p-hidroxiamílico (Figura 1). A lignina presente nas madeiras e nas gramíneas se
difere na sua composição nas quantidades dos álcoois p-cumarílico, coniferílico e
sinapílico. A madeira macia tem como principal componente da lignina o álcool
coniferílico, a madeira dura os álcoois coniferílico e sinapílico e as gramíneas os
álcoois p-cumarílico, coniferílico (FERRARA, 1988). A formação da lignina ocorre
através de reações complexas por meio de catálise enzimática, proveniente
principalmente da polimerização desidrogenativa dos álcoois p-cumarílico,
coniferílico e sinapílico.
Além de conferir rigidez e coesão aos componentes da parede celular da
madeira a lignina também tem a função de ligar as células fazendo com que a
estrutura da madeira tenha boa resistência mecânica ao impacto, a compressão e a
dobra. Funcionando como uma barreira natural contra a ação de microrganismos, a
lignina impede a ação de enzimas que degradam a parede celular da madeira.
Figura 1 - Monômeros precursores da lignina, quando R1 e R2 são H (hidrogênios) tem-se o álcool p-cumarílico, se R1 igual a OCH3 e R2 igual H tem-se o álcool coníferílico e se R1 e R2 são iguais OCH3 tem-se o álcool sinapílico (FERRARA, 1988).
14
No processo de obtenção de polpa de celulose, a madeira passa por um
tratamento químico, no qual, a lignina sofre degradação parcial. Neste processo os
cavacos obtidos de madeira de eucalipto são cozidos na presença de hidróxido de
sódio e sulfeto de sódio, juntamente com outros sais de sódio em menor quantidade.
Tal processo é chamado Processo Kraft, o aumento da temperatura no cozimento
ocorre de forma gradual até atingir cerca de 170 °C e mantido por um tempo
determinado, dessa forma ocorre a deslignificação da madeira devido a quebra das
ligações carbono-oxigênio, em fragmentos de lignina solúveis (CARVALHO, 2003).
A lignina se difere dos polímeros naturais por não possuírem ligações iguais,
de fácil hidrólise e não possuem regularidade. As ligações mais comuns são a
β-O-4. Algumas ligações como as α-O-4, éter entre grupos aromáticos, alril-alquil e
bifenil também são exibidas na Figura 2.
Figura 2 - Estrutura representativa da molécula de lignina, em destaque a ligação predominante β-O-4 (ADLER,1977).
15
2.2 Composição do Licor Negro
A palavra kraft de origem alemã significa força, o Processo Kraft e utilizado
para obtenção de embalagens, papeis de maior resistente e pápeis para impressão.
O licor negro é um subproduto resultante do cozimento de madeira que contém,
além de componentes inorgânicos, os produtos da degradação da lignina e dos
polissacarídeos.
Na indústria de papel e celulose, geralmente, o licor negro é queimado para
recuperação dos produtos químicos e produção de energia. As propriedades de
combustão do licor negro são determinadas pela composição química dos seus
constituintes orgânicos. Para recuperar os componentes do licor negro e utilizá-lo
em outras aplicações faz-se necessário o conhecimento da sua composição química
(TEIXEIRA, 2008).
Com a quebra das ligações durante o cozimento da madeira observa-se o
aparecimento de vários compostos fenólicos Figura 3. Analisando-se as estruturas
formadas constatam-se algumas semelhanças com a estrutura de álcool veratrílico
Figura 4.
Figura 3 - Compostos fenólicos resultantes da degradação da lignina. Aldeído siríngico (1), ácido siríngico (2), ácido vanílico (3) e vanilina(4) ( TEIXEIRA, 2008).
16
Figura 4- Estrutura do álcool veratrílico (álcool 3,4-dimetoxibenzílico), (SIGMA-ALDRICH®, 2012).
2.3 A Lignina peroxidase e o fungo
As enzimas são biocatalisadores altamente específicos e podem ser
vastamente aplicadas nos mais diferentes segmentos industriais. Algumas são
responsáveis pela degradação da lignina, e como a maiorias das enzimas são
instáveis termicamente e suscetíveis à ação de proteases, inibição enzimática e
apresentam dificuldades quanto a sua separação e reutilização (CARVALHO, 2003).
O basidiomiceto Phanerochaete chrysosporium é o principal produtor das
enzimas lignina peroxidase (LiP) (EC 1.11.1.14). O fungo produz também outras
fenoloxidases importantes para a degradação da lignina como a manganês
peroxidase (MnP) (EC 1.11.1.13) e Lacase (EC 1.10.3.2). Em 1984 a lignina
peroxidase, produzida pelo Phanerochaete chrysosporium, foi identificada
simultaneamente por dois diferentes grupos de pesquisa (KUWAHARA et al., 1984;
TIEN; KIRK, 1984). A lignina peroxidase é definida como uma fenoloxidase, capaz
de oxidar compostos fenólicos e não fenólicos, gerando radicais fenoxilas e radicais
cátions, respectivamente.
O fungo Phanerochaete chrysosporium possui alto potencial de produção de
LiP, mas os processos produtivos propostos são considerados de alto custo, devido
aos reagentes empregados.
O Phanerochaete chrysosporium é o fungo de decomposição branca mais
estudado, é o responsável pela produção das duas peroxidases capazes de
degradar a lignina (JOHJIMA et al., 1999).
17
Sendo um decompositor natural de madeiras duras e macias de fibra longa, o
Phanerochaete chrysosporium é considerado um modelo para o desenvolvimento e
entendimento do sistema produtor das enzimas ligninolíticas. O complexo enzimático
mais completo para a degradação da lignina, produzido por este fungo, também é
capaz de degradar compostos orgânicos tóxicos como os pesticidas (SINGH; CHEN,
2008).
As ligninases são o grupo de enzimas que realizam a despolimerização
oxidativa da lignina, sua produção está associada restrição nutricional do fungo,
limitação em nitrogênio ou carbono durante o metabolismo secundário. A produção
dessas enzimas em laboratório pode ser realizada de forma estacionaria ou agitada
utilizando meios de culturas bastante ricos e complexos. (TIEN; KIRK, 1988)
O Phanerochaete chrysosporium mesmo sendo o maior produtor da LiP, não
detém a exclusividades de produção das ligninases, outros fungos de decomposição
branca, como o Tramedes versicolor, também produzem tal complexo enzimático
(WONG, 2008).
2.4 Composição da Milhocina
A solução de milhocina é produto da maceração a quente do grão de milho
em presença de ácido sulfúrico, sua composição é rica em carboidratos solúveis,
sais minerais e principais aminoácidos necessários para o desenvolvimento de
vários microrganismos. Suas principais aplicações são na suplementação
alimentícia animal, fonte de nutrientes para processos biotecnológicos indústrias e
produção de isca para insetos (FILIPOVIC; RISTIC; SAKAC, 2001).
Na composição da milhocina estão presentes vários carboidratos,
aminoácidos, peptídeos, compostos orgânicos, metais e íons inorgânicos. A
composição geral da milhocina mostra que 11% da sua composição é açúcar
redutor, determinado como glicose, 5,1% é ácido lático, 0,15% é nitrogênio volátil e
0,1% ácido acético (LIGGETT; KOFFLER, 1948).
18
Segundo (AKHTAR et al.,1998) a milhocina é composta, na base seca, por
40,8% de proteína, 16,0% de ácido lático, 12,8% de açucares redutores e 30,4% de
outros compostos, com umidade em torno de 49,3% apresenta pH de 3,9.
Dos carboidratos presentes na composição química da milhocina, os que se
apresentam em maior quantidade são a glicose e a frutose, e em pequenas
quantidades aparecem também a galactose, arabinose e xilose sendo esta bastante
rara. Os di e trissacarídeos também aparecem em pequenas quantidades como a
sacarose, rafinose, melibiose, trealose e maltose.
As quantidades de arabinose, xilose e glicose podem ser aumentadas
através da hidrólise ácida que ocorre naturalmente durante o processo de
maceração do milho. Além dos açúcares presente na milhocina são encontrados
também na sua composição, ácido glutâmico, glutamina, leucina, prolina, ácido
aspártico, asparagina, lisina cistina e metionina.
Na milhocina estão presentes os ácidos lático e glicólico, alguns ácidos
graxos, como o linoleico presente em maior quantidade. Componentes inorgânicos
como ferro, cobre, níquel, potássio, fósforo, sódio e cloro são os mais comuns
(HULL et al., 1996).
Durante o processo de maceração ocorre a fermentação natural da milhocina
levando a formação principalmente do ácido lático baixando o pH entre 3,8 e 4,5
(LIGGETT e KOFFLER, 1948).
De acordo (LIGGETT; KOFFLER, 1948), a amônia e os aminoácidos alanina,
arginina, ácido aspártico, cistina, ácido glutâmico, histidina, isoleucina, leucina, lisina
e metionina, fenilalanina, prolina, treonina, tirosina e valina detêm 95% do nitrogênio
presente na milhocina e mais de um quarto do nitrogênio é apesentado sob a forma
de alanina. As vitaminas do complexo B apresentam-se em quantidades
consideráveis. Vitaminas como riboflavina, niacina, ácido pantatênico, piridoxina,
biotina, vitaminas A, D, E K e C e tiamina e inositol estão presente na milhocina,
assim como os minerais como cálcio, ferro, magnésio, fósforo e potássio.
A milhocina com sua composição quantificada é apresentada na Tabela 1,
(CORN PRODUCTS BRASIL, 1998).
19
Tabela 1 - Composição básica da solução de milhocina concentrada, adaptada da CORN
PRODUCTS BRASIL (CORN PRODUCTS BRASIL,1998).
AMINOÁCIDOS % Alanina 9,83 Arginina 3,68 Ácido Aspártico 5,82 Cistina 2,20 Ácido Glutâmico 18,07 Triptofano * Glicina 5,27 Histidina 3,72 Isoleucina 3,07 Leucina 8,28 Lisina 4,75 Tirosina 3,09 Metionina 1,98 Fenilalanina 2,85 Prolina 9,64 Serina 5,18 Treonina 4,08 Valina 5,16 VITAMINAS (mg/kg) Biotina 0,3 Colina 3.500,0 Inositol 6.000,0 Niacina 80,0 Ácido Pantatênico 15,0 Piridoxina 9,0 Riboflavina 6,0 Tiamina 3,0 MINERAIS % Cálcio 0,14 Magnésio 0,6 Potássio 2,8 Sódio 0,1 Fósforo 1,8 Enxofre 0,6 MINERAIS (mg/Kg) Cobre 15,0 Manganês 20,0 Ferro 100,0 Selênio 0,3 Zinco 60,0
*Destruído durante hidrólise ácida.
20
As diferenças entre os tipos de plantas, região de cultivo, época do ano, safra
e fatores externos podem influenciar a composição do milho, influenciando em
consequência, todos seus subprodutos e derivados. A composição apresentada na
Tabela 2 pode sofrer alterações, entretanto, mesmo sofrendo variação na
composição química, a milhocina possui alto potencial nutritivo para ser utilizada
com substrato no crescimento de microrganismos (MASARIN, 2006).
21
3 JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS
3.1 Justificativas
Os estudos feitos com o objetivo de produzir a lignina peroxidase são
realizados, tradicionalmente, através de meios sintéticos de alta complexidade e
custo elevado desde a década de 1980. Considerando a complexidade dos meios
sintéticos, os subprodutos industriais potencialmente nutritivos para meio de cultura,
poderiam ser utilizados para a produção da enzima? A glicose pode ser substituída
por outra fonte de carbono? Os nutrientes presentes na milhocina, como as
vitaminas, também podem se empregados para enriquecer os meios de cultura sem
causar reduções consideráveis nos níveis de atividade enzimática? O indutor da
produção da enzima, álcool veratrílico, pode ser substituído por produtos da
degradação da lignina?
Os tratamentos enzimáticos empregados em diversos setores industriais são
comprovadamente eficazes, mas nem sempre a eficácia desses tratamentos esta
associado a viabilidade econômica da sua aplicação.
O primeiro passo para torna possível a aplicação industrial da lignina
peroxidase é obtê-la com menor custo de produção possível. O desenvolvimento
deste estudo procura obter a lignina peroxidase utilizando subprodutos industriais de
baixo ou quase nenhum valor comercial.
3.2 Objetivos
- Estudar a viabilidade do cultivo do Phanerochaete chrysosporium em meio
contendo milhocina.
- Verificar a possibilidade da utilização de licor negro com indutor na produção
da lignina peroxidase.
- Estudar a possibilidade de aplicação conjunta de milhocina e licor negro na
produção da lignina peroxidase.
22
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Os métodos experimentais adotados para a produção da enzima lignina
peroxidase foram baseados na alteração dos métodos utilizados por
(CARVALHO, 2003), os ensaios foram conduzidos com o fungo imobilizado, com a
finalidade permitir a produção do extrato enzimático em processo de batelada. Os
experimentos foram compostos por ensaios comparativos. Foram avaliados os
meios de cultivos já estabelecidos em comparação com os meios de cultivo nos
quais as fontes de carbono e nutrientes e o ativador da síntese da enzima foram
substituídos por milhocina e licor negro, respectivamente.
4.1 Determinação dos açúcares presentes na Milhocina
Através da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) determinou-se a
concentração de açucares presente na amostra de Milhocina. Durante o processo de
obtenção da enzima o controle dos glicídios redutores totais foi realizado através do
método de determinação do teor de glicídios redutores (NELSON,1944). Para a
realização dos ensaios utilizou-se a milhocina produzida pela empresa Ingredion
Brasil Ingredientes Industriais LTDA, sob o número de lote 0000797453.
4.2 Determinação da massa específica e densidade relativa do Licor
Negro
A massa específica do licor negro foi determinada pelo método picnométrico,
os picnômetros, limpos e secos, tiveram suas massas determinas estando vazios,
contendo água destilada e contendo licor negro, em balança analítica com precisão
de 0,0001g da marca METTLER modelo AE160.
23
4.3 Preparado do inóculo do Phanerochaete chrysosporium
Para o preparo do inóculo utilizou-se a linhagem ATCC 24725 do fungo
Phanerochaete chrysosporium, incubados durante 7 dias em meio malte agar 2%.
Após o tempo de cultivo preparou-se uma suspensão de esporos com a inserção de
água destilada estéril nos tubos de cultivo. A seguir realizou-se a raspagem com
alça de platina, recolheu-se o material em tubo estéril, agitou-se em vortex durante 3
minutos para a obtenção dos esporos livres através de filtração em lã de vidro.
Em seguida determinou-se a absorbância a 650 nm da suspenção no
espectrofotômetro da marca Shimadzu modelo UV-150-02. Para determinar a
concentração de esporos da suspenção utilizou-se a curva de coeficiente angular
5,42×106 esporos.mL-1 e coeficiente de correlação 0,9991 (CARVALHO, 2003).
4.4 Meio de cultura padrão para a produção da Lignina Peroxidase
A composição do meio para produção de lignina peroxidase utilizada por
(CARVALHO, 2003), apresentada na tabela 2, foi adotada como condição controle
padrão para a produção da enzima.
A solução de vitaminas foi esterilizada por filtração e as soluções de glicose a
10% (p/v), elementos traços, álcool veratrílico (álcool 3,4-dimetoxibenzílico) 200mM
e detergente Tween 80 a 10% (p/v), foram esterilizadas em autoclave a 121°C por
20 minutos.
24
Tabela 2 - Composição completa do meio de cultura quimicamente definido, limitado em fonte de carbono (Relação C/N= 9,3), (CARVALHO, 2003).
GLICOSE g.L-1 2,0 TARTARATO DE DI-AMÔNIO g.L-1 0,66 ELEMENTOS TRAÇOS mg.L-1 Nitrolotriacetato de sódio 1,5 MnSO4.H2O 1,0 CoCl2.6H2O 1,0 ZnSO4.7H2O 3,0 CuSO4.5H2O 0,01 AlK(SO4)2.12H2O 0,01 H3BO3 0,01 Na2MoO4 0,01 VITAMINAS µg.L-1 Biotina 4,0 Ácido Fólico 4,0 Riboflavina 10,0 Ácido Tiótico 10,0 Ácido ρ-aminobenzóico 10,0 Tiamina HCl 100,0 Cianocobalina 0,2 Piridoxina 20,0 Ácido Nicotínico 10,0 Pantotenado de Cálcio 10,0 SUBSTÂNCIAS INORGÂNICAS g.L-1 MgSO4.7H2O 0,50 CaCl2.2H2O 0,10 FeSO4.2H2O 0,014 H3PO4 0,70 TAMPÃO Ácido tartárico g.L-1 3,0 (NaOH 5M e KOH 5M volume necessário para ajuste do pH a 4,5)
4.5 Cultivo Phanerochaete chrysosporium e produção da Lignina
Peroxidase utilizando meio de cultivo padrão
Para a produção da enzima utilizou-se 1,7g de suporte, manta abrasiva de
náilon (3M Scotch BriteMR) no formato de cubos com cerca de 0,8 cm³, adotando
como biorreator, em triplicata, frascos erlenmeyer de 250 mL contendo 75 mL de
meio de cultura e 1,65×107 esporos.
25
O crescimento do fungo foi conduzido em ar atmosférico, agitação a 150 rpm
e 37 °C e, após o término do consumo da fonte de carbono retirou-se 1/3 do volume
inicial, para obtenção da enzima de forma concentrada. Em seguida adicionou-se o
volume necessário de álcool veratrílico e Tween 80, para atingir a concentrações de
2,5 mM e 0,13% (p/v), respectivamente. Após a adição de todos os componentes ao
meio concentrado, realizou-se a oxigenação dos frascos, em série, até a total
saturação da atmosfera de cada frasco, mantendo-os a 60 rpm e 37 °C
(CARVALHO, 2003).
4.6 Cultivo Phanerochaete chrysosporium e Produção da Lignina
Peroxidase utilizando Milhocina e Licor negro
Ensaios utilizando milhocina, como substituinte para a fonte de carbono e
vitaminas em diferentes concentrações, foram realizados para determinar as
melhores condições de cultivo.
No processo de indução para a produção do extrato enzimático, em
substituição ao álcool veratrílico utilizado no meio de cultivo padrão, foi empregado o
licor negro em diferentes concentrações.
Posteriormente aos ensaios utilizando milhocina e licor negro,
separadamente, realizou uma série de ensaios com os dois substituintes de forma
conjunta.
As condições de cultivo, temperatura, agitação e a oxigenação, utilizadas para
o meio de cultivo padrão foram mantidas em todos os ensaios com os substituintes.
26
4.7 Determinação da Atividade de Lignina Peroxidase
A lignina peroxidase foi a primeira das enzimas produzidas pelo
Phanerochaete chrysosporium a ser descoberta, sua atividade pode ser determinada
através aumento da absorbância, ocasionada pela oxidação do álcool veratrílico, em
presença de H2O2 a 310 nm. A atividade foi determinada pela mistura reacional
contendo o extrato enzimático, tampão tartarato de sódio 0,333 M, álcool veratrílico
4 mM e peróxido de hidrogênio 10 mM.
A reação iniciada com peróxido de hidrogênio foi acompanhada durante um
minuto em espectrofotômetro modelo UV-150-02 da marca Shimadzu. Utilizou-se o
coeficiente de extinção molar do álcool veratrílico, 9300 M-1.cm-1 (TIEN; KIRK, 1988),
para determinar a atividade da enzima, expressa em U.L-1.
27
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 Açúcares presentes na Milhocina
Para determinação dos açúcares presentes na milhocina, através da
cromatografia líquida, utilizou-se uma solução a 30% (m/v) da amostra de modo que
cada litro de milhocina continha 21,6 g de açúcar, identificados como arabinose,
glicose e xilose.
5.2 Massa Especifica e Densidade Relativa do Licor Negro
O licor negro utilizado nos ensaios para produção da LiP foi obtido após
processo de cozimento da madeira, Eucalyptus grandis, para obtenção de celulose
via Processo Kraft.
As massas determinadas para a obtenção da massa específica (ρ) e
densidade relativa (d), foram obtidas em triplicatas, pelos picnômetros 1, 2 e 3.
Picnômetro 1:
mp= 14,9907 g mH2O= 19,7722 g mLN= 20,2364 g
Picnômetro 2:
mp= 14,4542 g mH2O= 19,2596 g mLN= 20,2364 g
Picnômetro 3:
mp= 14,8225 g mH2O= 19,6160 g mLN= 20,1523 g
Verificou-se que a massa específica e a densidade relativa do licor negro
utilizadas nos ensaios foram 1,0538 g.mL-1 e 1,0970, respectivamente, tais valores
obtidos segundo os cálculos:
28
Onde:
ρ ... massa específica (g.mL-1);
d ... densidade relativa;
mp ... massa do picnômetro vazio;
mH2O ... massa do picnômetro contendo água;
mLN ... massa do picnômetro contendo licor negro.
As concentrações do licor negro utilizadas nos ensaios foram calculadas
através da massa especifica determinada experimentalmente.
As concentrações 3,4 g.L-1, 5,9 g.L-1, 8,4 g.L-1 e 16,8 g.L-1, denominadas LN20,
LN35, LN50, LN100, foram adotadas nos ensaios para produção da enzima. Essas
concentrações são equivalentes, em massa, as soluções de álcool veratrílico de 20,
35, 50 e 100 mM. As concentrações do licor negro empregadas foram selecionadas
tendo por base a concentração do álcool veratrílico utilizado no ensaio padrão e,
considerando que a despolimerização da lignina durante o processo de cozimento
da madeira leva à formação de um grande número de compostos fenólicos, não
quantificados.
5.3 Cultivo Phanerochaete chrysosporium e Produção da Lignina
Peroxidase
A produção em laboratório da lignina peroxidase pelo Phanerochaete
chrysosporium foi associada à limitação nutricional do fungo em carbono.
As concentrações de 1% e 10% (v/v) de milhocina foram inicialmente
sugeridas a partir da concentração de glicose, fonte de carbono, presente no meio
29
de cultivo padrão, controle. Observou-se que a essas concentrações de milhocina
promoveram o crescimento excessivo do fungo, extrapolando os limites do suporte
de imobilização, o que inviabiliza a produção da enzima com o fungo imobilizado.
Desta forma, foram testadas concentrações inferiores a 1% (v/v) de milhocina, 0,5%
e 0,75%, acompanhando-se o crescimento do fungo e a produção da enzima.
O consumo da fonte de carbono foi controlado através da dosagem de
glicídios redutores totais. Observou-se que o término da fonte de carbono no meio
de cultivo padrão ocorreu após 2 dias da inoculação dos cultivos, entretanto, nos
cultivos com milhocina o término da fonte de carbono foi observado um dia após o
término do consumo no meio controle.
Realizado o processo de indução da síntese da enzima, as atividades
enzimáticas foram quantificadas nos dias que se seguiram.
O Gráfico 1 mostra o perfil da produção da enzima no ensaio controle e nos
ensaios com deferentes concentrações de milhocina.
Os resultados indicam que a milhocina poder ser adotada como substituinte,
da fonte de carbono e vitaminas, no processo de produção da enzima. Os níveis de
atividades médias demostraram que os valores de atividades enzimática obtidos no
meio contendo milhocina e no meio controle foram bastante próximos em valores,
quando comparados.
Gráfico 1- Comparação de atividade de LiP nos cultivos de meio controle e meio contendo milhocina.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ati
vid
ade
LiP
(U
.L- ¹)
Dias de ativação
Controle
Milhocina 0,5%
Milhocina 0,75%
30
Quando comparados os valores máximos de atividade, nas triplicatas de
cultivo contendo milhocina a 0,5% (v/v), observou-se que um dos cultivos alcançou o
valor expressivo de 429,0 U.L-¹, (3° dia), e o controle não ultrapassou 190,3 U.L-¹,
(2° dia). Nota-se que tanto no processo de consumo da fonte de carbono, como na
síntese da enzima o fungo utilizando milhocina levou um dia a mais que no
crescimento utilizando o meio controle, revelando um tempo maior de adaptação as
condições de cultivo.
Pode-se observar que das concentrações testadas, a que obteve melhores
resultados foi a milhocina a 0,5% (v/v). Esta concentração não pode ser considerada
padrão, pois, a milhocina pode sofre alterações na sua composição de acordo com a
literatura.
O licor negro, considerado inicialmente um provável indutor do processo de
produção do extrato enzimático, foi utilizado como uma alternativa ao álcool
veratrílico na etapa de ativação da síntese da enzima.
Gráfico 2- Comparação de atividade de LiP nos cultivos de meio controle e meio contendo licor negro.
O Gráfico 2 exibe o perfil de atividade da lignina peroxidase, produzida pelo
Phanerochaete chrysosporium, estimulada pelo licor negro. Observou-se que nos
0
50
100
150
200
250
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ati
vid
ade
LiP
(U
.L- ¹)
Dias de ativação
Controle
LN20
LN35
LN50
LN100
31
cultivos induzidos por diferentes concentrações de licor negro, em relação ao
controle, apresentaram níveis de atividades enzimáticas bastante diferentes.
Ressalta-se que em todas as concentrações utilizadas detectou-se atividade
enzimática, entretanto, o licor negro na concentração de 3,4 g.L-1, LN20, apresentou
os melhores resultados de atividades de LiP.
Observou-se que quanto menor a concentração de licor negro maior é o valor
médio atingido pela atividade enzimática, sugerindo que a diminuição da
concentração, abaixo de 3,4 g.L-1, pode ser mais eficiente na obtenção de atividade
no extrato enzimático.
5.4 Cultivo Phanerochaete chrysosporium e Produção da Lignina
Peroxidase utilizando Milhocina e Licor Negro
Nos ensaios em que tanto a fase de crescimento do fungo quanto a fase de
síntese da enzima foram alterados, com o uso da milhocina 0,5% (v/v) e licor negro
(LN20), não foi detectada atividade enzimática.
Tais resultados indicam que o uso conjunto de substituintes para a fonte de
carbono e vitaminas e para a ativação da síntese da lignina peroxidase necessitam
de ensaios mais apurados de modo que as condições de uso destes substituintes ao
cultivo do Phanerochaete chrysosporium.
32
6 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos utilizando os subprodutos milhocina e licor negro foram
promissores. O uso de milhocina na concentração de 0,5% (v/v) forneceu atividade
média de lignina peroxidase (144,1 U.L-1) próximo ao obtido com meio controle
(138,4 U.L-1). Foi registrado, em uma das triplicatas do cultivo com milhocina , pico
de atividade de 429,0 U.L-1 bastante superior ao meio de cultivo padrão.
Algumas considerações podem ser feitas sobre o uso da milhocina. Uma vez
que a concentração de milhocina que forneceu os melhores resultados foi a menor
testada, a redução desta concentração poderá resultar até em uma melhoria dos
níveis de atividade.
A definição da concentração da milhocina utilizada foi realizada de acordo
com a concentração de glicose do meio de cultivo padrão. Entretanto, a composição
da milhocina é heterogênea contendo outras possíveis fontes de carbono.
O uso de milhocina implica na análise preliminar de cada lote do subproduto,
já que sua composição é condicionada a pela região da plantação, cultivo e espécie
do milho.
O uso do licor negro na menor concentração testada, 3,4 g.L-1, foi identificada
como a mais adequada embora os níveis de atividade enzimática tenham sido
baixos. Nesta concentração de licor negro foram alcançados atividades médias de
64,5 U.L-1 com picos de atividade de 96,8 U.L-1. A dificuldade em identificar a
concentração do substituinte a ser utilizada se deve ao fato de que a
despolimerização da lignina resulta em uma variedade de compostos fenólicos,
alguns dos quais com estruturas semelhantes a do álcool veratrílico. Portanto, a
avalição do licor negro em menores concentrações poderá ter efeitos benéficos aos
níveis de atividade enzimática.
Com relação ao uso conjunto dos dois substituintes ficou evidente a
necessidade de estudos para adaptação das condições de cultivo tanto aos
carboidratos da milhocina na fase de crescimento do fungo quanto as estruturas
fenólicas do licor negro na etapa de produção da enzima.
33
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADLER, E. Lignin chemistry - past, present and future. Wood Sci Technol, v.11, n., p.169-218, 1977.
AKHTAR, M. et al. An overview of biomecanical pulping research. In: RAYMOND, A. YOUNG.; AKHTAR, M. Environmentally Friendly Tecnologies for the Pulp and Paper Industry. New YorK: John Wiley and Sons, 1998. p. 309-339.
CARVALHO, M.E.A. Produção de Lignina Peroxidase e sua Aplicação no Biobranqueamento de Pasta de Celulose. 2003, 160 f. Tese (Doutorado em Ciências) - Universidade Federal do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro, 2003.
CORN PODUCTS BRASIL. Solução concentrada de Milhocina®. 1998, 3f. (Boletim Técnico) São Paulo, Março de 1998.
FERRARA, M. A. Produção de Lignina Peroxidase por Phanerochaete chrysosporium e Diferentes Fontes de Carbono. 1988, 88f. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro 1988.
FILIPOVIC, S.S.; RISTIC, M. D.; SAKAC M. B. Techonology of Corn Steep Application in Animal Mashes and their Quality. Roumanian Biothecnology Letters, v.7. p.705-710, 2001.
HULL, S.R. et al Composition of Corn Steep Water during Steeping. J Agric.Food Chem., v.44, n7, p.1857-1863, 1996.
JOHJIMA,T et al. Direct interaction of lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium. Biochemistry, v.96, p. 1989-1994, 1999.
KUWAHARA, M.; GLENN, J.K.; MORGAN, M.A.; GOLD, M.H. Separation and characterization of two extracellular H2O2-dependent oxidases from ligninolytic cultures of Phanerochaete chrysosporium. FEBS Letters, v. 169, n.2, p. 147-250, 1984.
LIGGETT, R. W.; KOFFLER, H. Corn steep liquor in Microbiology. Bacteriol. Rev., v.12, n.4, p. 297–31, 1948.
MASARIN, F. Habilidade degradativa de Ceriporiosis subvermispora e Phanerochaete chrysosporium em cultivos de madeira de Ecalypitus grandis não autoclavada. 2006. 89f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia Industrial) – Departamento de Biotecnologia, Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2006.
NELSON, N. A photometric adaptation of the somogy method for the determination of glucose. J.Biol. Chem, v.153, p. 357-360, 1944.
TEIXEIRA, S.P.S. Análise e Potencialidades das Espécies Químicas Presentes no Licor Negro. 2008, 71 f. Dissertação (Mestrado em Materiais Derivados de Recursos Renováveis) – Universidade de Aveiro, Aveiro 2008.
34
SINGH, D.; CHEN, S. The white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium: conditions for the production of lignin-degrading enzymes. Microbiol Biotechnol., v.81. p 399-417, 2008.
SIGMA - ALDRICH ®, Disponível em: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/d133000?lang=pt®ion=BR Acesso em: 30 maio 2014
TIEN, M.; KIRK, T.K. Lignin-degrading enzyme from Phanerochaete chrysosporium: Purification, characterization, and catalytic properties of a unique H2O2-requiring oxygenase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, v81, p.2280-2284, 1984.
TIEN, M.; KIRK, T.K. Lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium. Methods Enzymol., v. 161 (Biomass, Pt B), p.238-249, 1988.
WONG, D. W. S. Structure and Action Mechanism of Ligninolytic Enzymes. Biochem Biotechnol, v.157, p.174-209, 2008.
35
APÊNDICES
Apêndice A - Atividades de LiP em diferentes concentrações de milhocina.
Dias de ativação Atividade U.L-1
Controle Milhocina a 0,5% Milhocina a 0,75%
1 0,0 2,1 3,2
2 138,4 0,0 3,2
3 104,3 144,1 9,7
4 86,0 130,1 2,1
5 49,5 91,4 2,1
6 47,3 91,4 4,3
7 104,1 42,0 4,3
8 32,2 53,8 4,3
9 18,3 34,4 5,4
10 18,3 2,2 2,1
36
Apêndice B - Atividades de LiP em diferentes concentrações de licor negro.
Dias de ativação Atividade U.L-1
Controle LN20 LN35 LN50 LN100
1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
2 202,2 9,7 15,1 42,0 0,0
3 185,0 64,5 9,7 42,0 37,1
4 162,4 48,4 10,7 19,4 21,0
5 174,1 30,7 0,0 1,6 1,6
6 144,1 0,0 7,5 0,0 0,0
7 150,6 0,0 0,0 0,0 0,0
8 146,2 0,0 0,0 0,0 0,0
9 141,9 0,0 0,0 0,0 0,0
10 129,0 0,0 0,0 0,0 0,0
37
Apêndice C - Comparação do consumo de Açúcar
Comparação do consumo de açúcar (g.L-1) nos cultivos contendo milhocina com os cultivos do meio de cultivo padrão.
Dias de cultivo Controle Milhocina a 0,5% Milhocina a 0,75%
0 2,00 0,04 0,06 1 1,53 0,04 0,05 2 0,00 0,02 0,02 3
0,00 0,00
Comparação do consumo de açúcar (g.L-1) no cultivo do meio de cultivo padrão ativado com álcool veratrílico e com os cultivos
ativados com licor negro.
Dias de cultivo Controle LN20 LN35 LN50 LN100
0 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 1 1,52 1,53 1,53 1,53 1,51 2 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Comparação do consumo de açúcar (g.L-1) no cultivo com meio de cultivo padrão ativado com álcool veratrílico e com o cultivo
contendo Milhocina a 0,5% (v/v) e ativado com Licor Negro a 3,4 g.L-1 (LN20).
Dias de cultivo Controle Milhocina 0,5% e LN20
0 2,00 0,05 1 1,51 0,04 2 0,00 0,02 3
0,00