LA EVALUACIÓN CUANTITATIVA DE LOS CAMBIOS NEUROQUÍMICOS EN UN MODELO DE

RATA DE CONSUMO DE ALCOHOL A LARGO PLAZO COMO SE DETECTA POR IN VIVO Y EX

VIVO ESPECTROSCOPIA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE PROTÓN

Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia

Alejandra Cáceres rojas Karen N. Martínez Manuel A. Prieto

ESPECTROSCOPIA RMN  Actualmente, los trastornos por consumo de alcohol a largo plazo (es decir, el abuso de

alcohol y dependencia) son uno de los problemas de salud más comunes y una de las principales causas de mortalidad

El abuso prolongado de alcohol puede causar trastornos cerebrales, como la pérdida de volumen cerebral, disfunciones neurológicas, alteraciones funcionales y alteraciones neuroquímicas en la región frontal anterior  Estudios han informado de que la región frontal anterior es especialmente vulnerable a los efectos adversos del abuso de alcohol a largo plazo. Numerosos protones espectroscopía por resonancia magnética ( 1 H MRS) estudios han investigado los metabolitos cerebrales en pacientes dependientes del alcohol crónicos comparados con pacientes sanos, así como la luz frente a los grandes bebedores En los seres humanos, los estudios anteriores que utilizan 1 H MRS han identificado cambios en las concentraciones de metabolitos de N-acetil aspartato (NAA), colina , compuestos -Con un contenido total de creatina (TCR, la creatina + fosfocreatina), y mio- inositol en los pacientes crónicos dependientes del alcohol  Por lo tanto, un estudio de consumo de alcohol a largo plazo utilizando un modelo animal es necesario para una investigación más cuantitativa.

En vivo 1 H MRS proporciona un método no invasivo para la cuantificación de los marcadores bioquímicos del cerebro específica y neurotransmisores que reflejan procesos moleculares  Sin embargo, la cuantificación de la vivo en 1 H MRS técnica ha sido severamente limitada por la superposición de los picos en el intervalo de desplazamiento químico estrecha  Por lo tanto, ex vivo protón de ángulo mágico de alta resolución de hilado (1 H HR-MAS) espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMRS) también es necesario para la obtención de información más detallada neuroquímica cerebral. HR-MAS es una poderosa técnica para observar el perfil neuroquímico cerebral y permitir espectros de alta resolución de los tejidos de biopsia La hipótesis de que el perfil neuroquímico específico de la corteza frontal región sería alterado de forma significativa en el modelo de rata de consumo de alcohol a largo plazo en comparación con las ratas control. El objetivo del presente estudio fue evaluar cuantitativamente los cambios neuroquímicos en la corteza frontal de un modelo de rata de consumo de alcohol a largo plazo, según lo detectado por in vivo 1 H MRS a 4.7 T (200 MHz) y por ex vivo 1 H HR-MAS en 11.7 T (500 MHz).

ESPECTROSCOPIA RMN El objetivo del presente estudio fue investigar cuantitativamente

el perfil neuroquímico de la corteza frontal región en un modelo de rata de consumo de alcohol a largo plazo, mediante el uso in vivo de protones espectroscopía por resonancia magnética ( 1 H-MRS) a 4,7 T y ex vivo 1 H de alta resolución de giro de ángulo mágico (HR-MAS) técnica en 11,7 T. Veinte ratas macho fueron divididos en dos grupos y alimentados con una dieta líquida durante 10 semanas. Después de 10 semanas, en vivo 1 H MRS espectros se adquirieron a partir de la región de la corteza cerebral frontal. Después in vivo 1 H MRS experimentos, todos los animales fueron sacrificados y se recogieron 20 muestras de tejido de la corteza frontal. La in vivo y ex vivo espectros se cuantificaron las concentraciones de metabolitos como absolutos y proporciones normalizadas de señal de intensidad total, respectivamente. Las cuantificaciones absolutos de in vivo mostraron espectros glicerofosfocolina significativamente mayor, más fosfocolina (GPC + PCH) y bajan mio- inositol (minutos) en las concentraciones de etanol ratas tratadas con comparación con los controles, lo que sugieren que las concentraciones reducidas minutos causados por el consumo de alcohol a largo plazo puede dar lugar a hipo osmolaridad síndrome y astrocitos hiponatremia. Por lo tanto, estos resultados podrían ser utilizados como marcadores clave en el metabolismo de la intoxicación por alcohol crónica.

MATERIALES Y MÉTODOS Animales: Todos los experimentos con animales fueron

aprobados por el (Número CICUAL: 2010-0030-04) Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional. Los animales se mantuvieron de acuerdo con la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" (NIH Publicaciones No.80-23) emitido por ILAR, EE.UU..Presentaban seis semanas de edad de sexo masculino ratas Sprague-Dawley (177,0 a 192,0 g, n(ratones)  = 20., Seongnam, Corea) fueron divididos en dos grupos (grupo de control: n(ratones) = 9; etanol grupo tratado: n(ratones)=11 ).Todos los animales fueron alojados individualmente en jaulas de plástico estándar y mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h, en temperatura ambiente de 24-25 ° C. Antes del inicio de los experimentos, a las ratas se les permitió el acceso libre a comida y agua durante una semana. Después de una semana, todos los animales fueron alimentados con una dieta líquida (Lieber-DeCarli dieta de control: # 710027; Etanol dieta: # 710260, Dyets Inc., Bethlehem, PA, EE.UU.) durante 10 semanas. El grupo de etanol y de dieta control líquida fueron con materiales nutricionalmente completos que contienen 67 ml de 95% de pureza de etanol por 1 L de la dieta líquida, y 1,0 kcal / ml, de los cuales 35% de grasa, 11% de carbohidratos, 18% de proteína, y 36% derivados a partir de etanol puro. La dieta control contenía 1,0 kcal / ml, de los cuales 35% de grasa, 47% de carbohidratos y 18% se obtuvieron a partir de proteínas. 

EXPERIMENTOS DE ESPECTROSCOPIA DE RM IN VIVO DE PROTONES

Los espectros en vivo de protones se adquirieron a partir de 20 animales utilizando 4.7 T horizontal sistema BIOSPEC MR (Bruker Medical GmbH, Ettlingen , Alemania) con un imán taladro de 400 mm y 150 mT / m apantallados activamente con bobinas de gradiente. Antes de que la imagen de RM y RM arrojaran los datos de espectroscopia, las ratas fueron anestesiadas utilizando una inhalación de  isoflurano en cámara en concentraciones de 4-6%, en una mezcla 5:5 de N 2 O y O 2 en gas. Las concentraciones de anestesia de isoflurano se mantuvieron a niveles de 1-2% durante la exploración MR. Las ratas anestesiadas se colocaron en posición prona con la cabeza firmemente fija en un soporte equipado con un cono de nariz ajustable. El volumen de interés se pude observar en la [ Fig. 1 (A y B), VOI (4.0 × 1.6 × 3.0 mm 3 ; volumen: 19.2 l)] para lo cual se posicionó en la corteza frontal basado en multi-rebanada, imágenes axiales de RM ponderadas en T2 [adquisición rápida con un realce Relajación (RARE) , TR / TE = 5000/90 ms, número de adquisiciones = 4, grosor de corte = 1.0 mm, matriz = 256 × 256]. El VOI se ajustó para minimizar la contaminación de lípidos intracraneal. El agua suprime 1 H MRS espectros que fueron adquiridos utilizando una espectroscopia punto de resolverse (PRENSA) en secuencia de pulsos (TR / TE = 4000/20 ms, el número de adquisiciones = 384, el número de puntos de datos = 2048, tiempo de exploración = 25 min 36 s) . La señal de agua no suprimida también fue adquirida por (TR / TE = 4000/20 ms, el número de adquisiciones = 16, tiempo de exploración = 1 min 4 s).

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE RMN

Después de los H MRS experimentos in vivo , todos los animales fueron sacrificados mediante CO 2 en gas. Posteriormente 20 tejidos de la corteza frontal se recolectaron rápidamente y con cuidado utilizando la matriz de máquina de cortar el cerebro (Brain Slicer Matrix, 1,0 mm de sección coronal. Todos los tejidos fueron inmediatamente almacenados en nitrógeno líquido (a -196 ° C) para evitar la descomposición del tejido y los cambios bioquímicos. Las muestras de tejido cosechadas se diseccionaron rápidamente y se insertaron en un rotor de 4 mm a temperatura ambiente (18-20 ° C). Todos los rotores de RMN preparados fueron bien cerrado con un tapón de circonio. Las ampollas (1,0 ml) de D2O que contiene 0,75 en peso.% TSP fueron utilizadas para dar una referencia y una escala. Unas pocas gotas de D2O se añadieron a la RMN rotor para proporcionar una señal de bloqueo. La masa de tejido cerebral y D2O + TSP disolvente fueron 13-19 mg y 10-14 mg, respectivamente.

EX VIVO DE PROTONES HR-MAS EXPERIMENTOS DE ESPECTROSCOPIA DE RMN

Se realizó en el espectrómetro VNMRS-500 [11,7 t (500,13 MHz), (con unos núcleos cuádruples 1 H, 2 H, 13 C, 31 P) HR -Mas RMN nano-sonda. Las muestras se colocaron en rotores de 4 mm de diámetro que están equipados en la parte superior por la nano-sonda, y típicamente se centrifugaron a 4-5 kHz y a 54,7 grados. El diseño de los1 H estudios espectroscópicos HR-MAS RMN se describió previamente .Todos los espectros de RMN HR-MAS unidimensionales fueron adquiridos con la secuencia de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) con pulso de 277,15 K (4.0 ° C) [número complejo data = 16384, anchura espectral = 8012,8 Hz, tiempo de adquisición = 2.05 s, tiempo de retardo de relajación = 10,0 s, tiempo de pre-saturación = 2,0 s, demora entre pulsos ( τ ) = 0,4 ms, Big- tau (ochenta pulsos reorientación de 180 grados) = 0.064 ms, número de adquisiciones = 128, y un tiempo de exploración Total = 25 min 16 s].

EN VIVO Y EX VIVO ANÁLISIS ESPECTRALES Los experimentos  in vivo y ex vivo  arrojaron datos en bruto los

cuales se analizaron en un proceso totalmente automatizado espectral, utilizando el software de combinación modelo lineal (Modelo LC, Versión 6.2-1L y Copyright: Stephen W. Provencher) con 2 conjuntos básicos (por in vivo y ex vivo ) que contiene 17 espectros metabolicos, de la siguiente forma: En vivo conjunto de bases: Alanina (Ala), aspartato (Asp), colina (Cho), creatina (Cr), fosfocreatina (PCr), ácido gamma-aminobutírico ( GABA ), glutamina (Gln ), glutamato (Glu), glucosa (Glc), glicerofosfocolina (GPC), escilo-inositol (SI), mio- inositol (mins), lactato (Lac), N-acetil aspartato (NAA), N-acetylaspartylglutamate (NAAG), fosfocolina (PCH), taurina (Tau), el total de NAA (NAA + NAAG), y el total de Cr (Cr + PCr); ex vivo conjunto base: incluye la in vivo base establecida más de glutación (GSH) y acetato (Ley). La intensidad de la señal de in vivo de los espectros se procesaron con el escalamiento del agua (WS) para la cuantificación absoluta de las concentraciones metabólicas y corrección de corrientes de Foucault. Los datos de los experimentos ex vivo se procesaron por el método de normalización total de intensidad de la señal descrito previamente ( Lentz et al., 2008 ). Los niveles de intensidad de señal relativas de cada metabolito se calcularon dividiendo el área de los picos por el área total de todos los metabolitos de interés. Todos los metabolitos se ajustaron en el rango de desplazamiento químico 3,85-0,20 ppm. Los analisis in vivo y ex cuyos datos se expresaron como la relación de los niveles de metabolito normalizados (es decir, metabolito Norm ).

Las estimaciones de error estándar y Cramer-Rao límites inferiores (CRLBs) se utilizaron para proporcionar estimaciones útiles de la fiabilidad y la incertidumbre en cada pico de metabolito de los espectros LCModel ( Provencher, 2001 ). CRLBs se han utilizado como fiabilidad aceptable para las estimaciones de la incertidumbre de ajuste.

ANÁLISIS Y RESULTADOSEspectros RMN de los protones in vivo y ex vivo

Los espectros in vivo (A y B) obtenidos a 4.7T del grupo tratado a largo plazo con etanol y grupo de control, el espectro ex vivo HR-MAS NMR (C y D) obtenidos a 11.7T de las

muestras de tejido de la región de la corteza frontal. El modelo de espectro del equipo LC representado por la línea roja. El cambio de rango químico es desde 0.20 a 3.85 ppm.

CUANTIFICACIÓN DE LOS ESPECTROS DE PROTÓN PRESENTE EN IN VIVO DE R-M concentraciones de los metabolitos (mmol/g), cuantificados a partir del

vigésimo analizado de los espectros in vivo de la región de la corteza frontal. Todos los procesados in vivo de niveles CRLB excepto los GABA se encontraban por debajo de 40% SD en el grupo control y el grupo tratado con etanol.

Concentraciones de los metabolitos en el cerebro (A) y sus correspondientes niveles bajos de Cramer-Rao (B) Cuantificados por el software del modelo LC en la corteza frontal. Las concentraciones de los metabolitos y los niveles de CRBL están expresados en micro moles por gramo y el porcentaje de desviación estándar (%SD) respectivamente. Cada una de las barras indica la desviación estándar (+) de los valores medidos. Los niveles de significancia: * :p<0.05, **p<0.01.

CUANTIFICACIÓN DE PROTÓN EN EX VIVO POR ESPECTRO DE HR-MAS NMR

niveles normalizados de los metabolitos que fueron cuantificados de 18 muestras de tejidos de la corteza frontal en el grupo de control y el grupo tratado con etanol. Se muestran los valores medios y las desviaciones estándar de los niveles de relación metabólicos normalizados. Los niveles de GPC y mIns fueron menores en el grupo tratado con etanol comparados con el grupo de control. Sin embargo, los niveles de PCh, Cho, y tCho fueron significativamente mayores en grupo tratado con etanol. La tabla 1 indica las diferencias de los 11 metabolitos entre los 2 grupos en los experimentos in vivo y ex vivo

DISCUSIONES estudio primero en utilizar en vivo 1 H MRS en combinación con ex vivo 1 H en técnicas de

espectroscopia de RMN HR-MAS en la corteza frontal de ratas expuestas de etanol a largo plazo

En este estudio, adquirido resultados in vivo MRS que están en buen acuerdo con ex vivo resultados HR-MAS, así como con otros estudios anteriores.

In vivo 1 H MRS es una herramienta de diagnóstico útil clínicamente prometedores con contribuciones a las evaluaciones no invasivas basadas en su capacidad para discriminar entre las diversas características bioquímicas en los seres humanos.

Estudios previos sugieren que generalmente la buena concordancia entre  in vivo MRS y ex vivo resultados HR-MAS se puede utilizar para estimar con fiabilidad las cantidades de metabolitos en diversos trastornos cerebrales.

Es importante destacar que las señales de compuestos que contienen colina, que se muestran como GPC se combinan con PCH en los espectros in vivo debido a la pequeña diferencia de desplazamiento químico entre los metabolitos que están claramente separados como las señales gratuitas Cho, GPC, y PCh en los espectros ex vivo HR-MAS

Los niveles de mIns significativamente más bajos y más altos de concentraciones de GPC + PCh en ratas con intoxicación de etanol a largo plazo en comparación con el grupo control .

La colina que contiene señales compuestas se compone de acetilcolina (ACh), libre de colina (Cho), fosfocolina (PCH), y glicerofosfocolina (GPC)

DISCUSIONES Anteriores estudios informaron que se observaron niveles de compuestos que contienen

colina están alteradas en el cerebro los roedores intoxicados con etanol así como los pacientes dependientes del alcohol. Del mismo modo, se encontró que la concentración de GPC + PCH fue significativamente mayor en las ratas tratadas con etanol.

Lee y sus colegas reportaron un aumento inicialmente de señales de compuestos que contienen colina en ratas expuestas crónicamente al alcohol a las 16 semanas. 

Los autores interpretan que el aumento de señales de colina puede reflejar un aumento de la cifra de metabolismos de fosfatidilcolina y otros fosfolípidos y por lo tanto un mecanismo de adaptación del cerebro.

a partir de nuestros resultados y los estudios anteriores, el aumento significativo de las señales de compuestos de colina podrían indicar que la intoxicación a largo plazo de alcohol puede conducir a cambios en el volumen de los componentes de la membrana sináptica de la fosfatidilcolina y fosfolípidos, posiblemente debido a las alteraciones sutiles en los arreglos de gangliósidos o Synapticos del metabolismo de la membrana en la corteza frontal de ratas expuestas de alcohol a largo plazo.

La liberación de myo-inositol a partir de células cerebrales sirve para contrarrestar la hinchazón celular.

. Estudios previos han informado que la hiponatremia es causada por la hipo osmolalidad del fluido extracelular, lo que lleva a la hinchazón celular. 

Un estudio clínico, se informó de que los niveles de myo-inositol se incrementaron significativamente en alcohólicos desintoxicados recientemente en comparación con sujetos sanos.

Así, los resultados del presente estudio podrían indicar que la disminución de los niveles de mioinositol refleja la hipo-osmolaridad y la hiponatremia de los astrocitos.

DISCUSIONES Un estudio demostró que la hiponatremia e hipo-osmolaridad era probable debido a la

intoxicación por agua, bajo contenido de sodio de alcohol, y el pobre ingesta dietética de sodio y potasio.

Algunas limitaciones deben ser discutidas de nuestro enfoque metodológico. No cuantificar la LBAs debido a que la dieta líquida de etanol no se puede controlar en el

momento de la auto-administración en los roedores. Por lo tanto, la dieta líquida de etanol tiene LBAs bajos y estables.

Aunque la dieta líquida de etanol tiene LBAs estables y en bajas proporciones, ha proporcionado ventajas, incluyendo la entrega continua de tanto el etanol y los nutrientes esenciales sin provocar aversión en los animales..

Se necesitan más estudios para adquirir LBAs más estables en ratas intoxicadas con etanol a largo plazo utilizando un método de exposición cuantitativamente el etanol, como vaporizado etanol técnica de inhalación. 

Los estudios anteriores mostraron diferentes patrones de comportamiento, como la disminución de la actividad locomotora, la incautación de sensibilidad y el comportamiento relacionado con la ansiedad en ratas tratadas con etanol a largo plazo en comparación con los grupos de control.

Porque nos hemos centrado en la cuantificación de los cambios neuroquímicos inducidos por el consumo de etanol a largo plazo, no realizamos pruebas comportamiento utilizando los métodos descritos anteriormente. Sin embargo, pudimos observar los patrones de comportamiento anormales en el tiempo .

las ratas tratadas con etanol tienen un período relativamente corto de la ingesta de etanol. el número de animales de experimentación es demasiado pequeño para conclusiones

definitivas. Por lo tanto, un estudio adicional en una población más grande es necesario para las evaluaciones más cuantitativas.

CONCLUSIÓN En resumen, el presente estudio demostró que en vivo MRS

y ex vivo espectros HR-MAS proporcionan información valiosa para interpretar el metabolismo cerebral en las ratas a largo plazo de etanol-expuesta. Disminución de la concentración de alcohol en minutos ratas expuestas a largo plazo siempre son representativas de hipo-osmolaridad y la hiponatremia de los astrocitos. Por otra parte, un aumento en la colina que contienen compuestos puede indicar un aumento de la tasa de rotación de la fosfatidilcolina y otros fosfolípidos, lo que refleja un mecanismo de adaptación del cerebro. Por lo tanto, el consumo de alcohol a largo plazo puede causar disfunción funcional y metabólica en la región de la corteza frontal del cerebro de la rata. Por lo tanto, minutos alterados y los niveles de compuestos que contienen colina, podrían ser utilizados como marcadores clave en la intoxicación crónica de alcohol y proporcionan información útil sobre neuroquímica daño cerebral relacionado con el alcoholismo crónico-humano.

GRACIAS