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Universidad Autónoma de Durango

MANUAL DE PRÁCTICAS

Bioquímica I

ASESOR EDUCATIVO: MC. MIGUEL ANGEL SANCHEZ RODRIGUEZ

1

REGLAMENTO DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

1. PARA INGRESAR AL LABORATORIO:

a) Deberá portar bata blanca larga.

b) Manual de prácticas de bioquímica.

c) Presentación personal de acuerdo a los reglamentos de la

Universidad.

d) Solamente entrarán al laboratorio los alumnos que tengan

práctica (no se permiten visitas en horas de prácticas).

2. DENTRO DE LOS LABORATORIOS:

a) No se permite fumar ni tomar alimentos.

b) No sentarse en las mesas de trabajo.

c) Solamente se saldrá del laboratorio cuando todo el grupo

correspondiente termine su trabajo y tenga firmada su práctica.

RECOMENDACIONES:

1) Reporte inmediatamente a su profesor cualquier daño personal

por leve que sea.

2) Cuide de no contaminar los reactivos de trabajo.

3) No sacuda las pipetas.

4) Si utiliza ácido o álcalis fuertes, es mejor no pipetear

directamente.

5) Mantenga siempre limpio su material de trabajo.

2

PRACTICA 1: RECONOCIMIENTO DE MATERIAL Y EQUIPO DE USO COMUN EN EL LABORATORIO

Introducción: PIPETAS.

Se le proporcionan en varias capacidades según el volumen

que va a medir, use la más apropiada (ejemplo: la pipeta de 1 ml

úsela preferentemente para medir volúmenes menores de 1mI).

Para pipetear, sostenga la pipeta con los dedos pulgar y medio,

absorba lentamente observando constantemente el nivel del líquido

tratando de que éste quede por arriba del nivel del volumen que va a

necesitar; tape el orificio superior con el dedo índice y regrese el

volumen necesario hasta que el menisco coincida con la división

(para el volumen que usted necesita).

Cuando necesite medir ácidos o bases fuertes no pipetee

directamente, use bulbo de hule.

Mantenga siempre limpias y secas las pipetas.

USO DEL FUEGO. Generalmente se utilizan mecheros de gas. Tenga precaución

al encenderlos y al apagarlos.

Tenga mucha precaución con las fugas posibles debido a las

uniones defectuosas.

En caso de tener un recipiente con material inflamable y éste

llegara a encenderse, utilice el extinguidor.

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CENTRIFUGACIÓN. En cualquier centrifugación los tubos a centrifugar deben estar

bien balanceados, de preferencia en base a peso (no a volumen).

Cada portatubos está provisto de un colchón de hule para

proteger el tubo de cristal durante la centrifugación. En caso de

rotura de un tubo dentro de la centrífuga, debe hacerse un aseo

completo antes de utilizada nuevamente.

Maneje con mucho cuidado la centrífuga, la velocidad debe

incrementarse lentamente para prevenir una sobrecarga eléctrica

que puede dañar el motor.

ESPECTROFOTOMETRÍA

La luz visible es una radiación electromagnética. El color

depende de la longitud de onda, ésta se determina en forma de:

Nanómetros (nm)=10 unidades Armstrong (Aº)

La luz blanca es la suma armónica de los colores del espectro.

Si una luz blanca atraviesa una solución o un filtro de color, el color

con el cual emerge se debe a que la solución o el filtro retiene todas

las otras longitudes de onda y sólo emerge la que ha podido pasar.

Así por ejemplo una solución que absorbe las longitudes de azul a

verde, aparece como color rojo.

4

MEDICIÓN DE LA ABSORCIÓN. Si una solución absorbe una longitud de onda determinada, la

intensidad del rayo disminuye a medida que tropieza con las

moléculas de la sustancia absorbente. La absorción es proporcional

al número de las moléculas en la solución.

La absorción de una luz monocromática (una longitud de onda)

por una solución problema se utiliza para cuantificarla. Para realizar

esta determinación, es necesario que dicha absorción siga la ley de

Beer Bouger. Esta ley se expresa con la fórmula:

Log ___I°__ = a x C x e

I

Donde I° es la intensidad de la luz que llega a la solución, I es

la cantidad de luz que emerge de la solución, "a" es el coeficiente de

extinción característico a cada problema, "C" es la concentración del

problema y "e" es el espesor de la muestra.

En la práctica I° se calibra a 100%, mientras que I es la lectura

del galvanómetro; "a" es consonante, como también lo es el valor de

"e", al despejar queda:

Log transmisión = concentración

Si trabajamos con un espectrofotómetro en condiciones

preestablecidas de técnica, reactivos y longitud de onda, la lectura de

la transmisión es proporcional a la concentración.

5

El espectrofotómetro es un instrumento que consta de una

fuente de luz (policromática) y un sistema monocromador: prisma o

rejilla, la intensidad de la luz se regula con una abertura variable.

La luz que emerge de la muestra se dirige a una fotocelda, la

cual está conectada a un galvanómetro.

Ya en la práctica, primero se selecciona la longitud de onda

con la cual se va a trabajar y colocando una cubeta llena de agua

destilada o una solución de reactivos (blanco) se calibra el equipo a

100% de transmisión cambiando después a la solución problema con

lo cual se obtiene la lectura del problema.

Para obtener la concentración del desconocido la lectura que

se obtuvo del problema se compara con gráficas hechas previamente

o mediante un factor de conversión.

Objetivos

1. El alumno identificará y reconocerá el material y equipo de

laboratorio

2. El alumno aprenderá a usar los diferentes materiales de

medición.

Materiales

• Todo material existente en el laboratorio

6

Procedimiento

El quipo que comúnmente se usa en los laboratorios son

balanzas, espectrofotómetro, centrífugas, hornos, microscopios,

pHmetro, etc. En tanto que el material usado es mucho mas diverso,

en los que podemos encontrar material volumétrico como pipetas,

matraces Erlenmeyer, matraces de aforación, vasos de precipitado,

etc. así como otros materiales como tela de asbesto, anillo metálico,

soporte universal, mechero, manguera de látex, papel filtro, tubos de

ensaye, papel indicador, agitador de vidrio, cápsulas de porcelana,

etc.

Observar detalladamente el material y equipo de laboratorio y dibujar cada uno de ellos.

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Cuestionario

1. ¿Qué es un material volumétrico?

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__________________________________________________

2. ¿Para que se utilizan los recipientes de aforación?

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__________________________________________________

__________________________________________________

__________________________________________________

3. ¿Para la medición de volúmenes pequeños (menores a 20 mL)

que material es mejor usar y porque?

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__________________________________________________

__________________________________________________

__________________________________________________

4. ¿Menciona que material o equipo hay para tu seguridad en el

laboratorio?

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__________________________________________________

__________________________________________________

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Conclusiones:___________________________________________

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Bibliografia:____________________________________________

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PRACTICA 2: RECONOCIMIENTO DE GLUCIDOS

Introducción:___________________________________________

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Objetivos

1. Identificación de glúcidos.

2. Hidrólisis del enlace de un disacárido

Materiales

• Muestras de glúcidos al 1%:

o glucosa

o maltosa

o lactosa

o sacarosa

o almidón.

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• 7 Tubos de ensayo y 1 gradilla

• Baño maría (2 vaso de precipitado, uno de 125 y otro 250 mL).

• Mechero

• soporte universal, tela de asbesto y anillo metálico.

• 5 Pipetas de 2, 5 o 10 mL

• Reactivo de Fehling A

• Reactivo de Fehling B

• Lugol

• HCl diluido (10%)

• Bicarbonato de sodio

Procedimiento

1. Investigación de azucares reductores Reacción de Fehling:

• Tomar 3 ml de muestra de glúcidos en los tubos de ensayo.

• Añadir 1 mL de Fehling A y 1 mL de Fehling B. El líquido del

tubo de ensayo adquirirá un fuerte color azul.

• Calentar el tubo al baño María o directamente en un mechero

de Laboratorio.

• La reacción será positiva si la muestra se vuelve de color rojo-

ladrillo.

• La reacción será negativa si la muestra queda azul, o cambia a

un tono azul-verdoso.

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Observaciones:__________________________________________

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2. Investigación de azucares no reductores

• Tomar 3 ml de una muestra de sacarosa y añadir unas 10

gotas de ácido clorhídrico al 10%.

• Calentar a la llama del mechero durante un par de minutos.

• Dejar enfriar y realizar la Prueba de Fehling.

• Observa el resultado.

Nota: Se recomienda antes de aplicar la reacción de Fehling,

neutralizar con bicarbonato, Fehling sale mejor en un medio que

no sea ácido.)

Observaciones:__________________________________________

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3. Investigación de polisacáridos (almidón)

Reacción del Lugol:

Este método se usa para identificar polisacáridos. El almidón en

contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol (disolución de yodo y

yoduro potásico) toma un color azul-violeta característico.

• Poner en un tubo de ensayo unos 3 mL de almidón

• Añadir 5 gotas de lugol.

• Si la disolución del tubo de ensayo se torna de color azul-

violeta, la reacción es positiva.

Observaciones:__________________________________________

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Cuestionario

1. ¿Qué es un azúcar reductor?

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__________________________________________________

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2. ¿Qué azucares presentaron características de azúcar

reductor?

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3. ¿Que utilidad o aplicación a nivel industrial presentan los

azucares reductores?

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__________________________________________________

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__________________________________________________

4. Debido a que el almidón en el experimento tres adquiere una

coloración violeta.

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__________________________________________________

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Conclusiones:___________________________________________

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Bibliografia:____________________________________________

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PRÁCTICA 3: RECONOCIMIENTO DE LIPIDOS

Introducción:___________________________________________

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Objetivo Poner de manifiesto ciertas propiedades de los lípidos, algunas de

las cuales pueden servirnos para su identificación.

Materiales

• Baño María (2 vaso de precipitado, uno de 125 y otro 250 mL).

• Mechero, tela de asbesto y anillo metálico.

• 2 Probetas

• Agitador de vidrio

• 3 tubos de ensaye

• 1 gradilla

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• 3 pipetas (5 o 10 mL)

• Aceite vegetal

• Sol. de Hidróxido sódico al 20%.

• Éter o cloroformo.

• Alcohol

• Agua destilada

Procedimiento

1. Saponificación

Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico

descomponiéndose en los dos elementos que la forman: glicerina y

los ácidos grasos. Estos se combinan con los iones sodio o potasio

del hidróxido para dar jabones, que son en definitiva las sales

sódicas o potásicas de los ácidos grasos. La reacción es la siguiente:

Proceder de la siguiente forma:

• Colocar en un vaso de precipitado 50 mL de aceite vegetal y 50

mL de una solución de hidróxido sódico al 20%.

• Agitar enérgicamente y colocar el vaso a baño María de 20 a

30 minutos.

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• Transcurrido este tiempo, se puede observar en el vaso tres

capas: la inferior clara, que contiene la solución de sosa

sobrante junto con la glicerina formada; la superior amarilla de

aceite no utilizado, y la intermedia, de aspecto grumoso, que es

el jabón formado.

Observaciones:__________________________________________

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2. Solubilidad

Las grasas son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en

ella se dividen en pequeñísimas gotitas formando una "emulsión" de

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aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo, por

reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que por su menor

densidad se sitúa sobre la de agua. Por el contrario, las grasas son

solubles en los llamados disolventes orgánicos como el éter, xilol,

benceno, cloroformo, etc.

Proceder de la siguiente manera:

• Tomar tres tubos de ensayo y poner en cada uno de ellos 3 mL

de agua, en el otro 3 mL de éter y en el tercero 3 mL de alcohol

u otro disolvente orgánico.

• Añadir a cada tubo 1 mL de aceite y agitar fuertemente.

Observar la formación de gotitas o micelas y dejar en reposo.

Se verá como el aceite se ha disuelto en el éter y en cambio no

lo hace en el agua, y el aceite subirá debido a su menor

densidad.

Observaciones:__________________________________________

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Cuestionario:

1. ¿Qué sustancias quedan en el residuo liquido una vez

separado el jabón?

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2. Otros jabones se fabrican utilizando diferentes grasos y álcalis.

Informe de las diferentes propiedades de estos jabones.

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__________________________________________________

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__________________________________________________

3. ¿Qué otros ingredientes se pueden añadir a los jabones y con

que fines?

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__________________________________________________

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4. ¿Como puedes probar si el residuo resultante de fabricar el

jabón tiene residuos álcalis?

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5. ¿Qué factores influyeron en que el jabón dejara de ser un

producto de lujo

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__________________________________________________

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Conclusiones:___________________________________________

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Bibliografia:____________________________________________

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PRÁCTICA 4: RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS Introducción:___________________________________________

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Objetivos

1. Comparará las reacciones de los diferentes aminoácidos y los

identificará por grupos químicos característicos

2. Poner de manifiesto ciertas propiedades de las proteínas

Materiales

• Baño María (2 vaso de precipitado, uno de 125 y otro 250 mL).

• Mechero.

• Soporte universal, anillo metálico y tela de asbesto

• Gradilla

• 4 Tubos de ensayo

• Gotero

• 5 pipetas de 5 o 10 mL

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• Ácido acético

• Ácido nítrico

• Hidróxido de sodio al 20 y al 40%

• Hielo

• Solución de sulfato cúprico al 1%

• Acetato de plomo al 5%

• Clara de huevo

Procedimiento

Para ver la coagulación de las proteínas se puede utilizar clara de

huevo, para conseguir más volumen puede prepararse para toda la

clase una dilución de clara de huevo en agua, de forma que quede

una mezcla aún espesa.

1. Colocar en un tubo de ensayo una pequeña cantidad de clara

de huevo.

2. Añadir 5 gotas de ácido acético y calentar el tubo a la llama del

mechero.

Reacciones coloreadas

1. Reacción Xantoproteica

Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color

amarillo, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico

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concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas

con aminoácidos portadores de grupos bencénicos, especialmente

en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza

con un álcali vira a un color anaranjado oscuro.

Proceder de la siguiente manera:

• Poner en el tubo de ensayo de 2 a 3 mL de solución problema

(clara de huevo ).

• Añadir 1 mL de HNO3 concentrado.

• Calentar al baño maría a 100º C.

• Enfriar en agua fría

• Añadir gota a gota una disolución de sosa (NaOH) al 40%.

Observaciones:__________________________________________

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2. Reacción del biuret

La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos,

ya que se debe a la presencia del enlace peptídico (- CO- NH -)que

se destruye al liberarse los aminoácidos. Cuando una proteína se

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pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia

compleja denominada biuret, de fórmula:

que en contacto con una solución de sulfato cúprico diluida, da una

coloración violeta característica.

Proceder de la siguiente manera:

• Tomar un tubo de ensayo y poner unos 3 mL de albúmina de

huevo.

• Añadir 2 mL de solución de hidróxido sódico al 20%.

• A continuación 4 ó 5 gotas de solución de sulfato cúprico

diluida al 1%.

• Debe aparecer una coloración violeta-rosácea característica.

Observaciones:__________________________________________

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3. Reacción de los aminoácidos azufrados

Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado negruzco

de sulfuro de plomo. Se basa esta reacción en la separación

mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al

reaccionar con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de

plomo.

Proceder de la siguiente manera:

• Poner en el tubo de ensayo de 2 a 3 mL de albúmina de huevo

(clara de huevo).

• Añadir 2 mL de solución de hidróxido sódico al 20%.

• Añadir 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5%.

• Calentar el tubo hasta ebullición.

• Si se forma un precipitado de color negruzco nos indica que se

ha formado sulfuro de plomo, utilizándose el azufre de los

aminoácidos, lo que nos sirve para identificar proteínas que

tienen en su composición aminoácidos con azufre.

Observaciones:__________________________________________

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Cuestionario

1. ¿Explique a que se debe la precipitación de la albúmina?

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2. Mencione en que líquidos del organismo humano se puede

encontrar las albúminas.

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3. Que efectos químicos se presento en cada una de las pruebas

(represente las reacciones químicas).

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4. ¿Que compuestos, elementos o sustancias, además de la

albúmina se encuentran en la clara de huevo?

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5. ¿Que porcentaje de albúmina se encuentran en la clara de

huevo?

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Conclusiones:___________________________________________

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Bibliografia:____________________________________________

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PRÁCTICA 5: RECONOCIMIENTO DE ENZIMAS Introducción:___________________________________________

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Objetivos

1. Poner de manifiesto la presencia de la enzima catalasa en

tejidos animales y vegetales.

2. Comprobar la acción de la temperatura sobre la actividad de

las enzimas.

3. Comprobar la acción hidrolítica de la amilasa.

Materiales

• Gradilla

• 6 tubos de ensayo

• Mechero

• 2 pipetas de 5 mL y 3 de 1 mL

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• Baño María (vaso de precipitado de 250 mL o 125 mL)

• Soporte universal, anillo metálico y tela de asbesto

• Solución de lugol

• Soluciones de Fehling

• Agua oxigenada

• Almidón

• Trocitos de hígado

• Trocitos de tomate

Procedimiento

1. Reconocimiento de la catalasa

La catalasa es una enzima que se encuentra en las células de los

tejidos animales y vegetales. La función de esta enzima en los tejidos

es necesaria porque durante el metabolismo celular, se forma una

molécula tóxica que es el peróxido de hidrógeno, H2O2 (agua

oxigenada). Esta enzima, la catalasa, lo descompone en agua y

oxígeno, por lo que se soluciona el problema.

Proceder de la siguiente manera:

• Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de hígado.

• Añadir 5 mililitros de agua oxigenada

• Se observará un intenso burbujeo debido al desprendimiento

de oxígeno.

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Observaciones:__________________________________________

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2. Desnaturalización de la catalasa

Mediante esta experiencia, vamos a ver una propiedad fundamental

de proteínas, que es la desnaturalización.

Ya que la catalasa químicamente es una proteína, podemos

desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Al perder la

estructura terciaria, perderá también la función y como consecuencia

su función catalítica.

Proceder de la siguiente manera:

• Colocar en un tubo de ensayo varios trocitos de hígado

• Añadir agua para hervir la muestra. Hervir durante unos

minutos.

• Después de este tiempo, retirar el agua sobrante.

• Añadir el agua oxigenada.

Observaciones:__________________________________________

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3. Hidrólisis del Almidón

Mediante esta experiencia, vamos a ver la actividad de otra enzima,

la amilasa o ptialina, presente en la saliva. Esta enzima actúa sobre

el polisacárido almidón, hidrolizando el enlace O-glicosídico, por lo

que el almidón se terminará por transformar en unidades de glucosa.

Proceder de la siguiente manera:

• Poner en una gradilla cuatro tubos de ensayo, numerados del 1

al 4.

• Añadir en cada tubo 5 mililitros de una solución diluida de

almidón.

• A los tubos 3 y 4 añadir una pequeña cantidad de saliva.

• En el tubo 1, haz la Reacción de Fehling.

• En el tubo 2, realiza la Reacción de Lugol.

• Los tubos 3 y 4 que contienen el almidón, al que le hemos

echado la saliva, ponerlos en un vaso de precipitados al baño

María, controlando la temperatura del agua para que no hierva,

ya que lo que intentamos, es que la enzima de la saliva trabaje

a unos 37ºC. Dejarlo unos 15 minutos.

• A continuación realizar las siguientes reacciones: En el tubo

número 3, realizar la Reacción de Fehling y en el tubo número

4, realizar la Prueba del Lugol.

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Observaciones:__________________________________________

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Cuestionario

1. ¿Explique a que se debe el burbujeo en el experimento 1?

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2. ¿Explique a que se debe que no hubo burbujeo en el

experimento 2?

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3. Explique a que se debe los resultados de los tubos 3 y 4 del

experimento 3.

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4. ¿A que se debe que la saliva tenga un efecto sobre el almidón?

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Conclusiones:___________________________________________

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Bibliografia:____________________________________________

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