Unidad 3. El estrés

oxidanteDRA. PAULINA DEL VALLE PÉREZ

¿Qué es el estrés oxidante?

Oxígeno → Vida

Metabolismo → Especies reactivas (O, N)

CYP450 (CYP2E1), FMO, NADPH oxidasa,

COX, NO-sintetasa.

Mecanismos celulares de homeostasis

Perturbación de este balance:

Aumento en la producción de especies

oxidantes (diquat): O2-●, H2O2

Inhibición de los mecanismos antioxidantes

celulares (butionina sulfoximina: GHS)

Liberación de complejos iónicos

Trastornos donde se involucra el

estrés oxidante

Enfermedad Enfermedad

Enfermedades cardiovasculares Inflamación y artritis reumatoide

Cáncer EPOC

Diabetes Hepatitis y enfermedades hepáticas

Enfermedades neurodegenerativas Enfermedades del riñón

Enfermedades psiquiátricas Convulsión

Abuso de alcohol y drogas Fibrosis quística

Cataratas Fibromialgia

Menopausia Obesidad y síndrome metabólico

Enfermedades de la piel Asma

Infertilidad Apnea del sueño

Principales fuentes de estrés

oxidante

Estrés oxidante

Producción incrementada

de ROS

↑Superóxido

Activación incrementada de leucocitos

MitocondriaMetabolismo

alterado del AA

Liberación de complejos

iónicos

Hb, Mioglobina, Ferritina,

Transferrina

Modificación de las defensas

celulares

Inactivación o pérdida de

antioxidantes

Factores exógenos que favorecen

el estrés oxidante

Alimentos:

Dieta rica en proteínas y lípidos

Xenobióticos pro-oxidantes

Dietas pobres en antioxidantes

Alcohol y café

Contaminantes ambientales:

Humo de cigarro

Hidrocarburos

Pesticidas

Metales y asbestos

Fármacos:

Anticancerígenos

Psoralenos (furanocumarinas)

Radiaciones:

Ionizantes: rayos X, rayos g

UV

Microondas

Absorbentes dérmicos:

Derivados de psoralenos

Factores endógenos que favorecen

el estrés oxidante

Sedentarismo

Ejercicio físico excesivo

Procesos inflamatorios crónicos

Cáncer

Isquemia

Muerte celular

Estrés psicológico

Especies reactivas oxidantes

Intermediarios

reactivos de

naturaleza

electrofílica

Especies

reactivas: O o

N

Especies reactivas con O (ROS) Especies reactivas con N (RNS)

Radicales: Radicales:

Anión superóxido O2-● Radical óxido nítrico NO●

Radical hidroxilo OH● Radical dióxido de nitrógeno NO2●

Radical peroxilo ROO● No radicales:

Radical perhidroxilo HOO● Ácido nitroso HNO2

Radical alcoxilo RO● Catión nitronio NO2+

No radicales: Catión nitrosilo NO+

Peróxido de hidrógeno H2O2 Anión nitroxilo NO-

Ácido hipocloroso HOCl Tetróxido de dinitrogeno N2O4

Ozono O3 Trióxido de nitrógeno N2O3

Oxígeno singulete 1O2 Peroxinitrito ONOO-

Especies reactivas de oxígeno

Son generadas in vivo por el metabolismo

aerobio

Vía de reducción del oxígeno: O2-●, H2O2,

OH●

El oxígeno molecular es el radical más

abundante en los sistemas biológicos

Se pueden producir a partir de metales de

transición (Fe, Cu)

Tiempo de vida media

Va a determinar la estabilidad de la ROS → reactividad

Procesos de reducción espontáneos (DG negativo),

excepto la reducción de O2 a O2-●

Potencial estándar de reducción (DE° positivo)

ROS Tiempo de vida media

OH● 10-9 s

O2-● 10-6 s

1O2 10-6 s

RO● 10-6 s

ROO● 10-2 s

O3 segundos

H2O2 minutos

Oxigeno singulete 1O2

1O23O2

1O2

El anión superóxido

Se forma en todas las células aeróbicas (mitocondrias)

O2 + e- → O2-● (DE° = -0.33). Proceso no espontáneo

CYP, complejo NADPH oxidasa (macrófagos) y la xantina oxidasa

Se pueden formar otras ROS a partir O2-●

Reacción de Haber-Weiss: O2-● + H2O2 → O2 + OH● + H2O

Puede difundir hacia otros lugares de la célula

Ataca a ADN, fosfolípidos de membrana, polisacáridos, tioles y aminas.

El peróxido de hidrógeno

Puede formarse espontáneamente

O2 + 2H+ +2e- → H2O2 (DE° = 0.31)

Superóxido dismutasa (SOD)

Citosol: Cu2+ o Zn2+

Mitocondria: Mn2+

Células epiteliales y en plaquetas

Se descompone en agua por:

Catalasa (selectividad)

Glutatión peroxidasa (GSH-Px)

Puede generar radical hidroxilo:

Reacción de Fenton: H2O2 + Fe2+ → OH● + OH- +Fe3+

Reacción de Haber-Weiss: O2-● + H2O2 → O2 + OH● + H2O

El radical hidroxilo

Oxidante más potente de sistemas biológicos

H2O2 → OH● (DE° = +0.38 V). Proceso espontáneo

Actúa en sitios cercanos a su producción (reacciona in situ)

Favorece reacciones en cadena: peroxidación de lípidos

Se forma a partir de radiación ionizante, la reacción de Fenton y Haber-Weiss

O bien se puede producir por peroxinitrito:

O2-● + NO → ONOO-

ONOO- + H+ → ONOOH

ONOOH → OH● + NO2●

Fe2+ + HOCl → OH● + Cl- + Fe3+

Daño a ADN, enzimas y membranas

Otras especies oxidantes

Radical peroxilo (ROO●)

Se forma a partir de ácidos grasos poliinsaturados (RH)

RH + OH● → R● + H2O → ROO●

Baja capacidad oxidante

Puede captar un H de un lípido (ruptura heterolítica) y producir reacciones en cadena (ROOH)

Acido hipocloroso

Mecanismo de defensa de neutrófilos

Mieloperoxidasa:

H2O2 + Cl- + H+ → HOCl + H2O

Alto poder oxidante: daña proteínas de membrana provocando lisis

Aminas, tioles, nucleótidos, hemoproteínas

Daño oxidante al ADN

Daño en las bases nitrogenadas

8-hidrodeoxiguanina 8-OH-G (biomarcador de daño a ADN)

Alteración de bases (deleciones), sitios apúricos y ruptura de hebras

Activación de la poli-ADP-ribosa polimerasa (PARP)

Enzimas encargadas de la reparación de ADN: Se activa al haber daño

al ADN

Polimerización de NAD+ para formar ADP-ribosa

Sobreexpresión: ↓NAD, agotamiento de ATP

Elevación intracelular de Ca2+

Muerte celular por necrosis

Excitotoxicidad

Activación de proto-oncogenes

Peroxidación de lípidos

Componentes lipídicos de las membranas → ac. grasos poliinsaturados

Susceptibles al ataque de radicales libres

Formación de lípidos hidroperóxidos (LOOH)

Cambios en la permeabilidad

Disminución de la fluidez

Alteración de las proteínas de membrana

Transporte iónico alterado

Generación de metabolitos tóxicos (aldehídos y alcanos)

Liberación de material compartamentalizado

Iniciación

• Lípido poliinsaturado LH

• Radical libre lipídico L●

Propagación

• Radical peroxilo LOO● + LH

• Lípido hidroperóxido LOOH + L●

Terminación

• Radicales peroxilos y alcoxilos (LO●)

• Aldehídos y alcanos tóxicos

RADICAL LIBRE OH●

Abstracción de H

Deslocalización del

radical

+ O2

Abstracción de H

de otro LH (reacción

en cadena)

Metales de transición

Peroxidación del ácido araquidónico

Generación de metabolitos tóxicos

Peróxidos liposolubles

Estimulan la síntesis de PG (activación de COX)

Alteran el crecimiento celular

Aldehídos a,b-insaturados (4-hidroxinonenal)

Aductos con glutatión (GSH)

Afecta a la adenilatociclasa y fosfolipasa

Reducen el crecimiento y promueven la diferenciación celular

Inhiben la agregación de plaquetas

Bloquean la acción de macrófagos

Proliferación de peroxisomas: aumento de ROS

Generación de aductos

Daño oxidante a proteínas

Los aminoácidos son susceptibles a ser

atacados por radicales libres

Formación de aductos con aldehídos (de la

peroxidación de lípidos)

Bases de Schiff

Modificación de su estructura secundaria

y/o terciaria

Cambios en la actividad enzimática

Alteración en las membranas

Enlaces cruzados entre receptores proteicos

Alteración de la homeostasis de calcio

Inactivación de la a-1-antitripsina

a-1-antitripsina inhibe a la elastasa

protegiendo a los tejidos de daño

Elastasa es una proteasa

importante en procesos

inflamatorios: neutrófilos

HOCl inactiva a la a-1-antitripsina

Proteólisis descontrolada de la

elastina

Daño epitelial

Pulmón

Hígado

Aterosclerosis

Oxidación de la lipoproteína de baja

densidad (LDL)

Unión del malondialdehído (MDA) a la

lisina de la apo-proteína B

Imposibilita su reconocimiento por

receptores de células endoteliales

Son fagocitadas por macrófagos

Se convierten en células espumosas

Daño oxidante a carbohidratos

Los monosacáridos (aldosas) pueden oxidarse

en presencia de metales, generando radicales

libres, H2O2 o compuestos dicarbonílicos (MDA)

La glucosa (aldehído) puede formar bases de

Schiff con proteínas (glicosilación)

Reacción de Maillard

Productos de Amadori

Alteración vascular en Diabetes T2

Glucosa ProteínaRearreglo

Producto de Amadori

Biomarcadores de estrés oxidante

Peroxidación de lípidos Oxidación de proteínas Oxidación de

CHOS

Oxidación de ADN

Malondialdehído

(MDA)

Oxidación de tioles Aldehídos reactivos 8-hidroxiguanosina

(8-OH-G)

Isoprostanos Formación de

3-nitrotirosina

Productos de

Amadori

Acroleína LDL oxidada (LDL-Ox)

4-hidroxinonenal Anticuerpos vs LDL-Ox

Malondiadehído y TBA

Acido tiobarbitúrico

-H2O

-H2O

Métodos de detección de ROS

Presencia de ROS a nivel

intracelular

Se transforma en un producto

fluorescente

DCFH-DA

Amplex RED

Antioxidantes

Sustancias que a concentraciones menores que el sustrato oxidable, detienen o previenen la oxidación del mismo

Sustrato oxidable = cualquier molécula endógena

Por su origen:

Naturales: SOD, a-tocoferol, vitamina C, GSH, flavonoides, carotenoides

Sintéticos: BHT, N-acetilcisteína, hidroxipiridonas, inhibidores de XO

Por su modo de acción:

Antioxidantes primarios: GSH, vitamina C y E, Ubiquinonas, b-caroteno

Enzimas de detoxificación: SOD, catalasa, peroxidasas, GHS-Px

Secuestradores de metales: Transferrina, albúmina, ferritina, metalotioneninas

Regeneradores de antioxidantes: glutatión-reductasa, G-6-P-deshidrogenasa

Exportadores: acarreador de GSH oxidado, acarreador de conjugados con GSH

Distribución de los antioxidantes

Antioxidantes y la peroxidación de

lípidos Inhibidores preventivos:

Retardan la fase de iniciación

Inducir la descomposición de hidroperóxidos

Catalasa

Glutatión peroxidasa (GSH-Px)

Glutatión-S-transferasa, b-caroteno, a-tocoferol (vit E)

Inhibidores de la propagación:

Interrumpen las reacciones en cadena al reaccionar con los

radicales libres

Vitamina C, b-caroteno, ácido úrico, polifenoles, furfurales,

furanonas, etc.

El glutatión (GSH) como antioxidante

Agente reductor en el metabolismo de H2O2 e hidroperóxidos (LOOH)

Considerado como el “amortiguador redox”

Enzima: Glutatión-peroxidasa (GSH-Px)

Nucleófilo para conjugación con electrófilos (Fase II) → HNE

Enzima: Glutatión-S-tranferasa

La GSH-Px es el removedor más importante de H2O2

Cofactor Selenio

Al oxidase se forma un enlace disulfuro (GS-SG) entre dos moléculas de GSH

Se puede volver a reducir para formar GSH por la glutatión-reductasa

En condiciones de estrés oxidante ↑GS-SG

La proporción GSH/GSSG es un indicador de EO

Se excreta activamente, ↓GSH

Enzimas que utilizan GSH como

sustrato Enzima Reacciones

Glutatión peroxidasa 2 GSH + H2O2 → GSSG + H2O

2 GSH + LOOH → GSSG + LOH + H2O

Glutatión transferasa

(endoperoxidasa)

2 GSH + LOOH → GSSG + L(OH)2 + H2O

GSH + aldehídos → GS-alcanal

Fosfolípido peróxido-

GSH-peroxidasa

2 GSH + ROOH → GSSG + ROH + H2O

ROOH= fosfolípido, colesterol

Glutatión reductasa GSSG + NADPH + H+ → 2 GSH +NADP+

Antioxidantes enzimáticos

Enzima Reacción Cofactor

SOD O2-● + 2H+ → H2O2 Zn (II), Cu (I), Mn (II)

Catalasa H2O2 → H2O + O2 Fe (II)

Citocromo C peroxidasa ROOH → ROH + H2O Fe (II)

La SOD protege a la célula de las reacciones dañinas del superóxido

SOD 1 (Cu, Zn, citoplasma), SOD 2 (Mn, mitocondrias), SOD 3 (Cu, Zn, extracelular)

Catalasa (oxidoreductasa) utiliza grupo hemo (Fe II). Se encuentran en los peroxisomas.

Citocromo C peroxidasa reacciona con hidroperóxidos. Utiliza grupo hemo

Vitamina E

a-tocoferol o VitE-OH

Liposoluble → membranas

Inhibidor preventivo de la peroxidación

lipídica

Control de la fluidez de la membrana

Incremento de ciertas respuestas inmunes

Reducción del daño isquémico

Agregación plaquetaria

Dona un electrón al LOO ● para formar

LOOH (más estable)

VitE-OH + LOO ● → VitE-O● + LOOH

Vitamina E

El radical VitE-O● puede

reaccionar con un LOO●

y oxidarse hasta una

quinona estable

Se lleva a cabo un

equilibrio quinona-

hidroquinona

Vitamina E como pro-oxidante

El exceso de radical VitE-O●

puede iniciar la propia

peroxidación de lípidos

Co-oxidantes

Vitamina C

Ácido ascórbico VitC-(OH)2 hidrosoluble

Semi-dehidroascorbato ●O-VitC-OH (radical

ascorbato)

Dehidroascorbato O=VitC=O (estable)

Reduce a la vitamina E

VitE-O● + VitC-(OH)2 → VitE-OH + ●O-VitC-OH

VitE-O● + ●O-VitC-OH → VitE-OH

Vitamina C como pro-oxidante

Pro-oxidante en presencia de metales de transición

VitC-(OH)2 + Fe(III) → Fe(II) + H+ + ●O-VitC-OH

Reacción de Fenton

Vit E y C como antioxidantes

Compuestos polifenólicos

Compuestos polifenólicos

Ensayo DPPH

Radical estable difenil-picril-hidrazilo

DPPH ● (MORADO) → DPPH (AMARILLO)

Ensayo que permite determinar la actividad

antioxidante de diversos compuestos

CI50

“Scavengers”

Trolox

Análogo de la Vit E

Sirve como referencia de capacidad

antioxidante (capacidad

antioxidante equivalente de Trolox)

Suplementos alimenticios

Alimentos

Bebidas