Protección contra el estrés oxidante � ANTIOXIDANTES

� Directos Ácido ascórbico

�  Indirectos Sulforafano � Bifuncionales α- mangostina Curcumina Ácido alfa lipoico (ALA) Acido norhidroguayarético (NDGA) Resveratrol)

Larrea tridentata

Antioxidantes directos • Actividad redox

• Se consumen durante las funciones antioxidantes

• Necesitan ser regenerados

• Son de corta duración

• Pueden tener efectos pro-oxidantes

Antioxidantes indirectos

•  Puede presentar o no actividad redox.

•  Funcionan a través de la inducción de proteínas citoprotectoras que actúan catalíticamente (es decir, no se consumen).

•  Tienen una vida media larga.

•  Es poco probable que tengan efecto pro-oxidante.

α-Mangostina

•  Garcinia mangostana (GM). Árbol tropical de sudeste de Asia.

•  Xantona

•  Propiedades: antioxidante, antiinflamatoria, fungicida, antibacteriana, entre otras.

α-mangostina O

O

OHOH

OHO

Sistema generador

Sistema detector

- Fluorescencia

-  Absorbencia

-  Bioluminiscencia

ESTUDIO DE LA CAPACIDAD ATRAPADORA DE ERO

•  Anión superóxido

CAPACIDAD ATRAPADORA DE α-MANGOSTINA

Peroxinitrito

O

Cl H

O

O

CH3O

O

CH3

O

OH

Cl-OH

O

Cl H

OHOH

O

OH

Cl

DCDHFDA DCDHF

ONOO-

O

Cl

OH

O

OH

O

Cl

DCF

Medio b·sico OxidaciÛn

Excitación:  488  nm  Emisión:  525  nm  

•  Oxígeno singulete

Excitación  410  nm    Emisión  455  nm  

HOCl  +  H2O2        →        1O2    +  HCl  +  H2O  

O O

OO+ 1

O2O

O

difenilisobenzofurano            (DFBF) o-­‐dibenzoilbenceno

EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ERO

H2O2, OH●,

ROO•

Carboxi-DHFDA

λexitación=488 nm, λemisión= 530 nm

Carboxi-DCF

EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ERO

Dihidroetidio

λexitación = 488 nm λemisión = 535 nm

Etidio

O2•–

Renal  MDA  content  

nmoles/m

g  protein

0.0  

0.5  

1.0  

1.5  

2.0  

2.5  

Ct α-­‐M   CDDP CDDP+α-­‐M  

*

**

A   Renal  protein  carbonyl  content  

nmoles  DNPH

/mg  protein  

0  

1  

2  

3  

4   *

**

Ct α-­‐M   CDDP CDDP+α-­‐M  

B  

Renal  GSH  content  

mmol/m

g  protein  

0  

10  30  

35  

40  

45  

50  

Ct α-­‐M   CDDP CDDP+α-­‐M  

*

** C   Urinary  H2O2  excreHon    

nmol/24  h  

0  

100  

200  

300  

400  

Ct α-­‐M   CDDP CDDP+α-­‐M  

*

*,**

D  

EFECTO PROTECTOR DE LA α-MANGOSTINA EN EL DAÑO RENAL INDUCIDO POR CISPLATINO

EFECTO DE LA α-MANGOSTINA

O

O

OHOH

OHO

α-MANGOSTINA

ERO

O2•-

ONOO-

1O2

atrapa

Daño renal (cisplatino)

aumento Insuficiencia renal

•  La α-mangostina induce la expresión de HO-1 de manera dependiente de la concentración y del tiempo

Protección contra el estrés oxidante � ANTIOXIDANTES

� Directos Ácido ascórbico

�  Indirectos Sulforafano � Bifuncionales α- mangostina Curcumina Ácido alfa lipoico (ALA) Acido norhidroguayarético (NDGA) Resveratrol)

Larrea tridentata

Citoprotección mediada por Nrf2

Indirectos •  Inducción de enzimas antioxidantes. – Vía Nrf2

CYS 151

Enzimas inducibles vía Nrf2 NADPH quinona óxidorreductasa

(NQO1) Glutatión reductasa (GR)

Glutatión peroxidasa (GPx) Glutatión S-transferasa (GST)

γ-Glutamato cisteína ligasa (γGCL)

Superóxido dismutasa

Hemo oxigenasa-1 (HO-1). Catalasa (CAT)

Tiorredoxina reductasa (TrxR) Peroxirredoxina (Prx)

Ferritina Tiorredoxina (Trx)

Superóxido dismutasa (SOD) 6-fosfogluconato deshidrogenasa

(6PGD)

Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) Enzima málica

ESTUDIOS IN VIVO. MARCADORES DE DAÑO RENAL

ESTUDIOS IN VIVO. MARCADORES DE ESTRÉS OXIDANTE

Respiración  mitocondrial  

Tiempo  (s)  

Oxí

geno

(nm

ol)

mitocondrias  

Malato/glutamato                  Succinato  

ADP  

CCCP  

Estado  3  

Estado  4  

ESTUDIOS IN VIVO. RESPIRACIÓN (SUSTRATO SUCCINATO)

ESTUDIOS IN VIVO. DAÑO MITOCONDRIAL

El SFN previene la apoptosis inducida por CIS

El SFN disminuye la actividad y cantidad de caspasa 3

El SFN previene la respuesta inflamatoria

ESTUDIOS IN VITRO. Células LLC-PK1

Efecto protector del SFN en la muerte celular inducida por cisplatino

Participación de las enzimas NQO1 y GCL en la protección por SFN

Fig. 2. Inducción de la traslación del factor transcripcional Nrf2 del citoplasma al núcleo de células LLCPK1 tratadas con SFN por 3 h.

Guerrero-­‐Beltrán  et  al.,  2010  

Campo claro

Hoechst

Nrf2

Control SFN 10 µM SFN 25 µM

Disminución en la producción de ERO por SFN

POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL: JC-1 (5,5’,6,6’-tetracloro-1,1’,3,3’ yoduro de

tetraetilbenzimidazolcarbocianina)

Células sanas Mitocondria Agregados

Fluorescencia roja

Células dañadas, apoptóticas Citoplasma Monómero

Fluorescencia verde

Potencial de membrana mitocondrial