Ứng dụng kỹ thuật sắc ký điện di mao quản phân tích acesulfame-k, saccharin,...

Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích

Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

................

TRẦN PHÚC NGHĨA

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ ĐIỆN DI MAO

QUẢN PHÂN TÍCH ACESULFAME-K,

SACCHARIN, ASPARTAME TRONG

ĐỒ UỐNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2011



ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA HOÁ HỌC ................

TRẦN PHÚC NGHĨA

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ ĐIỆN DI MAO

QUẢN PHÂN TÍCH ACESULFAME-K,

SACCHARIN, ASPARTAME TRONG

ĐỒ UỐNG

CHUYÊN NGÀNH: HOÁ PHÂN TÍCH

MÃ SỐ: 60 44 29

Giáo viên hướng dẫn khoa học: TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO

Hà Nội - 2011



MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1

Chƣơng I: TỔNG QUAN ................................................................................................... 2

1.1.Giới thiệu về đường hóa học ....................................................................................... 2

1.1.1. Định nghĩa .......................................................................................................... 2

1.1.2. Phân loại ............................................................................................................. 2

1.1.3. Tác hại của đường hóa học ................................................................................. 2

1.1.4. Tình hình sử dụng đường hóa học trong thực phẩm, đồ uống hiện nay ............ 2

1.2. Đại cương về chất phân tích ...................................................................................... 4

1.2.1. Acesulfame-K .................................................................................................... 4

1.2.2. Aspartam ............................................................................................................. 5

1.2.3. Saccharin ............................................................................................................. 6

1.3. Tổng quan về các phương pháp phân tích Ac-k, Sac, As .......................................... 7

1.3.1 Các phương pháp và xu hướng nghiên cứu trong nước ....................................... 7

1.3.2 Các phương pháp trên thế giới ............................................................................. 7

1.3.2.1. Phương pháp quang phổ UV – VIS .............................................................. 8

1.3.2.2. Các phương pháp HPLC ............................................................................ 10

1.3.2.3. Phương pháp điện di mao quản .................................................................. 12

Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 14

2.1.Đối tượng, nội dung và mục tiêu nghiên cứu ........................................................... 14

2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu .................................................................... 14

2.1.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 14

2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 15

2.2.1. Phương pháp sử lý mẫu ..................................................................................... 15

2.2.2. Phương pháp sắc ký điện di mao quản .............................................................. 15

2.2.2.1. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản ........................................................ 15

2.2.2.2. Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản ............................................. 15

2.2.2.3. Đặc điểm của điện di mao quản ................................................................. 16

2.2.2.4. Phân loại điện di mao quản ....................................................................... 16

2.2.2.5. Mao quản (cột tách) trong phương pháp điện di mao quản ....................... 17



2.2.2.6. Dòng điện thẩm (Electroosmotic flow-EOF) ............................................. 17

2.2.2.7. Các thông số phân tích của CE ................................................................... 20

2.2.2.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điện di .............................................. 21

2.2.2.9. Các loại detector thông dụng trong phương pháp điện di mao quản. ........ 21

2.2.2.10. Điện di mao quản vùng (CZE) ................................................................. 22

2.3. Phương tiện nghiên cứu ........................................................................................... 22

2.3.1 Nguyên vật liệu .................................................................................................. 22

2.3.1.1. Chất chuẩn đối chiếu .................................................................................. 22

2.3.1.2 Hóa chất dung môi ...................................................................................... 23

2.3.1.3. Thiết bị dụng cụ .......................................................................................... 23

2.4. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất ............................................................................. 24

2.4.1. Pha dung dịch chuẩn gốc .................................................................................. 24

2.4.2. Pha dung dịch đệm ............................................................................................ 25

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................... 27

3.1. Tối ưu hóa các điều kiện xác định Ace-K, Sac, Asp bằng kỹ thuật sắc ký điện di

mao quản. ........................................................................................................................ 27

3.1.1. Một số điều kiện cố định ................................................................................... 27

3.1.2. Khảo sát các điều kiện ...................................................................................... 27

3.1.2.1. Hệ đệm........................................................................................................ 28

3.1.2.2. Xác định điều kiện nhiệt độ ........................................................................ 32

3.1.2.3. Xác định thế đặt vào hai đầu ...................................................................... 33

3.1.2.4. Xác định bước sóng định lượng ................................................................. 34

3.1.2.5 Kết luận ....................................................................................................... 36

3.2 Thẩm định phương pháp ........................................................................................... 36

3.2.1. Tính chọn lọc..................................................... Error! Bookmark not defined.

3.2.2. Các chất cản trở gây ảnh hưởng ........................................................................ 38

3.2.2.1. Ảnh hưởng của chất bảo quản .................................................................... 39

3.2.2.2. Ảnh hưởng của các loại đường ................................................................... 40

3.2.2.3. Ảnh hưởng của phẩm màu ......................................................................... 42

3.2.3. Khảo sát lập đường chuẩn ................................................................................. 44



3.2.4. Giới hạn phát hiện LOD .................................................................................... 47

3.2.5.Giới hạn định lượng LOQ .................................................................................. 49

3.2.6. Khoảng tuyến tính ............................................................................................. 50

3.2.7. Đánh giá độ chính xác (độ đúng, độ chụm ) của phương pháp ....................... 50

3.2.8. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp ........................................................ 52

3.3. Phân tích mẫu thực tế ............................................................................................... 54

3.4. Bàn luận về qui trình rửa giải .................................................................................. 61

KẾT LUẬN ....................................................................................................................... 63

KIẾN NGHỊ ...................................................................................................................... 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................ 65

PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 69



BẢNG NHỮNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

TRONG LUẬN VĂN

STT Ký hiệu Giải thích

1 Ace-K Acesulfame

2 Asp Aspartame

3 Brill Brilliant

4 CE Phương pháp điện di mao quản

5 CIEFC Sắc ký điện di mao quản đẳng tốc độ

6 Cyc Cyclamate

7 CZE Điện di mao quản vùng

8 EOF Dòng điện di thẩm thấu

9 Fruc Fructose

10 GEL-CEC Sắc ký điện di mao quản gel (rây phân tử)

11 Glu Glucose

12 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

13 IC Sắc ký ion

14 LOD giới hạn phát hiện

15 LOQ Giới hạn định lượng

16 MEKC Điện di mao quản điện động học Mixen

17 Qui Quilenol

18 RSD Độ lệch chuẩn

19 Sac Saccharin

20 Sacch Saccharose

21 Sun Sunset - Yellow

22 Tarta Tartarin

23 TNHH Trách nhiệm hữu hạn

24 UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu suất

25 UV-VIS Quang phổ hấp thụ phân tử



MỤC LỤC BẢNG

Bảng 3.1. Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất vào các loại đệm ............ 28

Bảng 3.2. Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất vào giá trị pH ................. 29

Bảng 3.3. Kết quả sự phụ thuộc của thời gian lưu của các chất chuẩn .............................. 31

vào nồng độ đệm borat ....................................................................................................... 31

Bảng 3.4. Kết quả thời gian lưu của asp, sac, ace-k ở các nhiệt độ khác nhau .................. 32

Bảng 3.5. Thời gian lưu của asp, sac, ace-k khi thay đổi điện thế ..................................... 34

Bảng 3.6. Diện tích píc của asp, sac, ace-k ở các bước sóng khác nhau ............................ 35

Bảng 3.7. Kết quả thể hiện tính chọn lọc của phương pháp ............................................... 38

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chất bảo quản lên diện tích pic của Ace-K, Sac, Asp. ............. 39

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của đường Glucose, Fructose, Cyclamate và Saccharose ............... 40

lên diện tích pic của Ace-K, Sac, Asp ................................................................................ 40

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của phẩm màu Tarta và Brill, Sunset và Qui ................................ 42

tới diện tích pic của Asp, Sac, Ace-K................................................................................. 42

Bảng 3.11. Sự phụ thuộc diện tích píc vào nồng độ Asp, Ace-K, Sac ............................... 44

Bảng 3.12. Giá trị phương sai và Ftính của Asp, Sac, Ace-K ............................................ 47

Bảng 3.13. Giới hạn phát hiện (LOD) theo phương pháp lý thuyết tính theo .................... 49

phương trình đường chuẩn ................................................................................................. 49

Bảng 3.14: Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp ................................................ 49

Bảng 3.15. Khoảng tuyến tính của Asp, Sac, Ace-K ......................................................... 50

Bảng 3.16. Sai số và độ lặp lại của phép đo tại các nồng độ khác nhau ............................ 51

Bảng 3.17. Diện tích píc của As, Sac, Ac-k ở các nồng độ khác nhau ............................. 53

Bảng 3.18. Kết quả độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp .......................................... 53

Bảng 3.19. Kết quả diện tích pic đối với mẫu thêm chuẩn và không thêm chuẩn ............. 55

Bảng 3.19. Kết quả phân tích Asp, Sac, Ace trong các mẫu .............................................. 61



MỤC LỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1. Sơ đồ cấu tạo máy điện di muản......................................................................... 15

Hình 2.2. Mặt cắt ngang của mao quản .............................................................................. 17

Hình 2.3. Cấu trúc lớp điện kép trên thành mao quản ........................................................ 18

Hình 2.4. Dòng EOF và lớp điện kép trong mao quản ...................................................... 18

Hình 2.5. Các kiểu dòng chảy và pic sắc ký trong CE. ..................................................... 19

Hình 2.6. Hệ thống phân tích CE: Máy điện di Agilent, máy tính, máy in ........................ 23

Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV – VIS của asp (a), sac (b), ace- k (c) trong môi ....................... 27

trường nước ( L= 65cm, i.d=50 μm, áp suất 50 mbar, I = 50 mA, E = 25 kV) .................. 27

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất ........................... 28

vào các loại đệm ................................................................................................................. 28

Hình 3.3. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất chuẩn asp, sac, ace-k trong điều kiện ................ 29

Đệm borat 20 mM pH 9,00 ( L=65 cm, I=50 mA, V=25kV, t =25oC, áp suất 50 mbar) . 29

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc của .......................................... 30

asp, sac, ace-k vào giá trị pH của đệm borat 20 mM. ........................................................ 30

Hình 3.5. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất chuẩn asp, sac, ace-k trong điều kiện (Đệm borat

pH 9,5, L=65 cm, I= 50mA, V= 25kV, t=25oC áp suất 50 mbar) ..................................... 30

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa thời gian lưu của asp, sac, ace-k ................ 31

vào nồng dộ đệm borat pH 9,5 ........................................................................................... 31

Hình 3.7. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất trong điều kiện đệm borat 20 mM ..................... 31

( pH 9,5 và I=50 mA, V=25kV, L= 65 cm, t =25oC, áp suất 50 mbar) ............................ 31

Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa thời gian lưu ............................................... 32

của asp, sac, ace-k vào nhiệt độ .......................................................................................... 32

Hình 3.9. Điện di đồ của hỗn hợp asp, sac, ace-k ở nhiệt độ 25oC trong điều kiện .......... 33

( Đệm borat 20 mM, pH 95, và I=50 mA, V=25kV, L= 65 cm, áp suất 50 mbar) ............ 33

Hình 3.10. Đồ thị biểu diện sự phụ thuộc giữa thời gian lưu ............................................. 34

của asp, sac, ace-k vào điện thế .......................................................................................... 34

Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc .............................................. 35

của asp, sac, ace-k vào bước sóng ...................................................................................... 35



Hình 3.12. Sắc đồ các chất chuẩn trong hỗn hợp ở bước sóng 215,5 nm .......................... 35

(L=65 cm, V=25kV, I=50mA, đệm borat 20mM, pH=9,5, t = 20oC, áp suất 50 mbar) .... 35

Hình 3.13. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất trong điều kiện điện di lựa chọn ...................... 36

(L=65cm, I=50 mA, V=25 kV, áp suất 50 mbar, t =25oC, đệm borat 20 mM, pH= 9,5 ) . 36

Hình 3.14. Điện di đồ về thời gian lưu của chuẩn đơn Aspartame (hình c), ..................... 37

Acesulfame-k (hình b), Saccharin( hình a) trong điều kiện (L=65cm, I=50 mA, V=25 kV,

áp suất 50 mbar, t =25oC, đệm borat 20 mM, pH= 9,5 ) ................................................... 37

Hình 3.15. Điện di đồ khi thêm các yếu tố ảnh hưởng(axit benzoic 43,04 ppm, ............... 43

axit sorbic 46,08 ppm, glucose 46,24 ppm, fructose 43,04 ppm, saccharose 41,80 ppm,

cyclamate 50 ppm, sunset yellow 67,52 ppm , brilliant 18,6 ppm, quilenol 57,12 ppm ,

tartarin 48,64 ppm ) trong điều kiện (L=54cm, I=50 mA, V=25 kV, áp suất 50 mbar, ..... 43

t =25oC, đệm borat 20 mM, pH= 9,5 ) ............................................................................... 43

Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ Asp ................... 45

và đường chuẩn của Aspartame .......................................................................................... 45

Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ Saccharin ......... 45

và đường chuẩn của Saccharin ........................................................................................... 45

Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ Acesulfame-K .. 46

và đường chuẩn của Acesulfame-K .................................................................................... 46

Hình 3.19. Đường chuẩn thêm chuẩn của Aspartame (a), Saccharin (b), .......................... 56

Acesulfame-K (c) trong mẫu Samurai ................................................................................ 56


Acesulfame-K (c) trong mẫu Sprite ................................................................................... 57


Acesulfame-K (c) trong mẫu Lemon C2 ............................................................................ 58


Acesulfame-K (c) trong mẫu Coca Cola ............................................................................ 59


Acesulfame-K (c) trong mẫu Trà xanh Oo ......................................................................... 60



MỞ ĐẦU

Acesulfame-k, saccharin, và aspartame là những chất ngọt tổng hợp thường được

sử dụng trong các ngành sản xuất chế biến dược phẩm, mỹ phẩm, cũng như trong thực

phẩm (đặc biệt là các loại đồ uống). Các chất này có thể gây ảnh hưởng tới sức khỏe

người dùng ở các mức độ khác nhau tuỳ thuộc vào liều lượng đưa vào cơ thể. Vì vậy, một

vấn đề được đặt ra không chỉ với các cơ quan quản lý chất lượng an toàn vệ sinh thực

phẩm, mà còn với những nhà sản xuất là phải xây dựng phương pháp phát hiện, định

lượng các chất kể trên nhằm phục vụ cho công tác thanh tra, kiểm định và kiểm soát hàm

lượng nằm trong tiêu chuẩn cho phép.

Hiện nay việc phân tích acesulfame-k, saccharin,và aspartame có thể được tiến hành

chủ yếu dựa vào kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Ưu điểm của HPLC là độ

chính xác và độ lặp lại cao nhưng chi phí tốn kém và độc hại do sử dụng dung môi hữu

cơ. Thêm vào đó, các chất được khảo sát là các chất phân cực, nên việc phân tích bằng

HPLC trên thực tế gặp khá nhiều khó khăn.

Do đó, trong đề tài nghiên cứu này chúng tôi đã chọn phương pháp điện di mao quản

để xác định đồng thời hàm lượng aspartame, acesulfame-k, và saccharin trong các loại đồ

uống. Phương pháp này có ưu điểm là thiết bị tương đối đơn giản, chi phí thấp và đặc biệt

có thể tích hợp với nhiều loại đetectơ khác nhau như đetectơ quang phổ hấp thụ phân tử

(UV-Vis), huỳnh quang, khối phổ, điện hóa (đo dòng, đo thế và đo độ dẫn),... nên sẽ cho

khả năng nhận dạng và định lượng các chất một cách khá chọn lọc.

Nghiên cứu được chúng tôi tiến hành nhằm thực hiện 2 mục tiêu:

- Xây dựng, thẩm định phương pháp tách và định lượng đồng thời acesulfame-k,

saccharin, và aspartame - một số chất chất ngọt tổng hợp hay dùng trong đồ uống, nước

giải khát.

- Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để phân tích các chất khảo sát kể trên

trong một số sản phẩm đang lưu hành trên thị trường.



Chƣơng I: TỔNG QUAN

1.1.Giới thiệu về đƣờng hóa học

1.1.1. Định nghĩa

Chất ngọt tổng hợp (hay còn gọi là đường hóa học, chất ngọt nhân tạo) là những

chất không có trong tự nhiên, vị ngọt rất cao so với đường sacarose (gấp khoảng 160-

1300 lần độ ngọt của đường sucrose) và không có giá trị dinh dưỡng, thường được sử

dụng với nhiều mục đích khác nhau như: bổ sung vào trong thực phẩm dành cho người ăn

kiêng, người bị bệnh tiểu đường, chất tá dược trong thuốc để che mùi vị, chất tạo vị ngọt

trong bánh kẹo, nước giải khát…[11]

1.1.2. Phân loại

Chất ngọt tổng hợp bao gồm nhiều loại khác nhau, chủ yếu người ta chia thành 2

loại: chất tạo ngọt không sinh năng lượng và chất tạo ngọt có sinh năng lượng.

- Chất tạo ngọt không sinh năng lượng là những chất chỉ tạo ra vị ngọt hầu như

không được chuyển hóa thành năng lượng cho cơ thể hoạt động (năng lượng nếu có chỉ

nhỏ hơn 2% so với lượng đường tạo ra cùng vị ngọt), một số loại được chiết suất từ các

nguyên liệu tự nhiên và một số được tổng hợp bằng phương pháp hóa học, trong đó các

chất thường được sử dụng nhất là saccharin (E954),aspartame (E951), acesulfame K

(E950) và một số chất khác ít được sử dụng hay đang được nghiên cứu thêm là stevioside,

sucralose (E955)

- Chất tạo ngọt sinh năng lượng là những chất tạo ngọt sinh ra lượng năng lượng

lớn hơn 2% lượng đường tạo ra cùng vị ngọt, thường được sử dụng gồm fructose, xylitol,

sorbitol, mannitol, lactitol, lactulose, maltitol, isomalt…

1.1.3. Tác hại của đƣờng hóa học

Tâm lý người tiêu dùng ngày nay hướng về những gì có xuất xứ tự nhiên. Trong đó

đường hóa học là vấn đề gây nhiều lo ngại, nhất là khi có nhiều tai tiếng là đường hóa học

gây ung thư

Theo báo New York Time đăng tải: Thượng nghị Sĩ Howard Metzenbaum đã viết

một dự luật đề nghị phải có một lời cảnh báo được in trên các nhãn hiệu của các sản phẩm

có chứa chất "Aspartame", đặc biệt lưu ý đối với người mang thai và trẻ em. Dự luật cũng

đòi hỏi phải có những cơ sở độc lập nghiên cứu về những nguy hiểm và trở ngại trong các



sản phẩm có sự hiện diện của các chất này gây ra các chứng co giật, thay đổi trong não bộ

và hệ thần kinh, cùng các biến chứng về tính cách.

Aspartame khi vao cơ thê , bản thân nó không hấp thụ vào máu ma tan ra trong ruột

thành ba chất: aspartic acid (40%), phenylalanin (50%) và methanol (10%). Đây là cơ sở

của nhiều ý kiến về tác động bất lợi cho sức khỏe con người từ aspartam.

Saccharin khi đi vào cơ thể, nó không bị hấp thụ vào các bộ phận trong cơ thể mà

được thải hồi sau đó qua đường tiểu tiện. Do đó, có thể nói saccharin không tạo ra năng

lượng cho cơ thể và không ảnh hưởng đến lượng đường trong máu. Dùng nhiều lượng

saccharin có thể sinh ra chứng béo phì.

Acesulfame-K có thể gây nên một số biến chứng như : Đi tiểu thường xuyên, tiểu

gắt, nước tiểu đậm màu, ngứa ngáy, khó thở, tức ngực nếu dung hàm lượng nhiều.

Tại Hoa Kỳ, các loại đường aspartame, saccharin, dextrose, maltodextrin,

sucralose…đã được FDA chấp nhận, nhưng vẫn chưa có những kết quả nghiên cứu về

mức an toàn cũng như độ độc hại. Hiện nay tại VN chỉ có các chất tạo ngọt manitol,

acesulfam K, aspartam, isomalt, saccharin (và Na, K, Ca của nó), sorbitol và sirô sorbitol,

sucraloza được Bộ Y tế cho phép sử dụng trong chế biến thực phẩm với giới hạn tối đa và

có qui định rõ ràng.

1.1.4. Tình hình sử dụng đƣờng hóa học trong thực phẩm, đồ uống hiện nay

Trong những năm gần đây, nền kinh tế của nước ta chuyển sang cơ chế thị trường.

Các loại thực phẩm sản xuất, chế biến trong nước và nước ngoài nhập vào Việt Nam ngày

càng nhiều chủng loại. Việc sử dụng các chất phụ gia trong sản xuất trở nên phổ biến. Các

loại phẩm màu, đường hóa học đang bị lạm dụng trong pha chế nước giải khác, sản xuất

bánh kẹo, chế biến thức ăn sẵn như thịt quay, giò chả, ô mai … Tình hình sản xuất thức

ăn, đồ uống giả, không đảm bảo chất lượng và không theo đúng thành phần nguyên liệu

cũng như quy trình công nghệ đã đăng ký với cơ quan quản lý đang là nỗi nhức nhối với

toàn xã hội. Chính vì nhờ độ ngọt cao, giá thành lại rẻ nên tại TP HCM, nhất là ở các

hàng quán vỉa hè, tiểu thương vẫn dùng các loại đường hóa học chế biến thức ăn, luộc bắp

hay ngâm trái cây, làm kem, nước phở …. để tăng vị ngọt.[23]

Theo báo cáo đầu năm của đoàn kiểm tra trung tâm y tế dự phòng quận Ninh Kiều

(Cần Thơ) đã phát hiện cơ sở rang cà phê Thái Dương (phường An Bình, Ninh Kiều)



dùng đường cyclamate trong chế biến cà phê về hành vi sử dụng phụ gia trái quy định.

Trên thực tế, ngày 17/5 vừa qua, Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm tỉnh Cà Mau đã phát

hiện kem tại điểm bán số 41, ấp Cây Trâm, xã Định Bình, TP Cà Mau (Cà Mau) sử dụng

đường hóa học cyclamat (hiện cấm sử dụng tại Việt Nam) và đường Aspartame. Không

chỉ kem, mà sữa đậu nành cũng bị phát hiện chứa đường hóa học. Ngày 15/4, phòng

Cảnh sát phòng chống tội phạm về môi trường công an tỉnh Thái Bình, đã kiểm tra phát

hiện 563 thùng sữa đậu nành thương hiệu 199 Hoàng Hà là của Công ty TNHH Chế biến

thực phẩm Hoàng Hà ở Trịnh Nguyễn, phường Châu Khê, Từ Sơn, Bắc Ninh.có chứa

hàm lượng Aspartame và Saccharin vượt mức cho phép.

Theo báo cáo của cơ quan quản lý vệ sinh an toàn thực phẩm sở Y tế TPHCM đã

thanh tra một cơ sở sản xuất nước mắm ở quận Bình Tân. Đoàn thanh tra phát hiện 120

chai nước mắm loại 20ml; 168 chai siêu hạng loại 350ml; sáu chai loại 720ml... đều được

chế biến bằng đường hóa học Aspartame và cyclamate.[23]

1.2. Đại cƣơng về chất phân tích

1.2.1. Acesulfame-K

Tính chất

-Tên IUPAC: potassium 6 - methyl - 2,2 - dioxo-oxathiazin – 4 - olate

- Công thức hóa học: C4H4KNO4S

- Công thức cấu tạo:

N SO2

OO

CH3

K

- Độ tan ở 20oC: Ethanol là 1g/1000 ml ; Nước là 1g/3,7 ml.

- Tỷ trọng: 1,81 g/cm3

- Nhiệt độ sôi: 225 °C

- Khối lượng mol phân tử: 242 g/mol

- Vị ngọt gấp 150 – 200 lần đường saccharose.

- Tuy nhiên nó có dư vị hơi đắng



- Có dạng tinh thể màu trắng với cấu trúc hóa học tương tự saccharin.

- Ổn định hơn Aspartam ở nhiệt độ cao và môi trường acid.

Vai trò

Được sử dụng để tạo vị ngọt trong thức ăn, đồ uống, dược phẩm nhằm tăng cường

vị và che dấu những vị khó chịu. Thường được dùng phối hợp với các chất ngọt tổng hợp

khác như Aspartam, Cyclamat. Không được chuyển hóa trong cơ thể và nhanh chóng đào

thải ra khỏi cơ thể. Hàng ngày không nên đưa vào cơ thể một lượng lớn hơn 15 mg/kg

trọng lượng.

1.2.2. Aspartam

Tính chất

-Tên IUPAC: N-(L-α-Aspartyl)-L- phenylalanine, 1-methyl ester

- Công thức hóa học: C14H18N2O5

- Công thức cấu tạo

OCH3NH

OH NH2 O

O

O

- Độ tan: tan ít trong nước, tan rất ít trong ethanol.

- Dung dịch 1%(KL/TT) ở 20oC có pH 5,2

- Tương kỵ với calci hydrophosphat, magnesi stearat.

- Tỷ trọng: 1,347 g.cm-3

- Nhiệt độ sôi: 247 °C

- Khối lượng mol phân tử: 294,3 g/mol

- Không để lại dư vị khó chịu, không ổn định ở nhiệt độ và pH cao.

- Là một dipeptid, màu trắng, không mùi, vị ngọt mạnh (độ ngọt của nó cũng bằng

khoảng 180-200 lần độ ngọt của sucrose).

- Giống như các dipeptid khác, aspartam có chứa năng lượng khoảng 4 Kcal/g (17

Kj/g). Tuy nhiên, chỉ cần một lượng rất nhỏ aspartam đã tạo ra độ ngọt cần thiết. Do đó

năng lượng chúng ta đưa vào cơ thể sẽ không đáng kể.



- Vị ngọt của nó chúng ta cảm nhận được chậm hơn và kéo dài lâu hơn so với

đường.

- Phân hủy dần trong nước nên nước ngọt có aspartam không giữ được lâu. Cho

trộn aspartam với saccharin hoặc acesulfam K thì hỗn hợp ngọt hơn và ổn định hơn khi

hai chất đứng riêng một mình.

Vai trò

Được sử dụng để tạo vị ngọt trong thức ăn, đồ uống, dược phẩm, bánh kẹo…

nhằm tăng cường vị ngọt và che dấu những vị khó chịu. Thường được dùng phối hợp với

các chất ngọt tổng hợp khác như Acesulfam K, Cyclamat. Là một chất không độc song

các dạng chuyển hóa của nó lại độc như: Axit Aspartic , phenylalanine.

1.2.3. Saccharin

Tính chất

-Tên IUPAC: 1,1-Dioxo-1,2-benzothiazol-3-one

- Công thức hóa học: C7H5NO3S

- Công thức cấu tạo:

NH

S

O

OO

- Tinh thể màu trắng trong, không mùi, tan ít trong nước và ete.

- Độ tan : Nước là 1g/290 ml ; Ethanol(95%) là 1g/31ml

- Dung dịch 0,35%(KL/TT) có pH 2,0.

-Tỷ trọng: 0,828 g.cm-3

- Nhiệt độ sôi: 229,7 °C

- Khối lượng mol phân tử: 183,18 g/mol

- Có vị chát và kim loại

- Khi bị phân hủy bởi nhiệt độ và acid giải phóng phenol, làm thức ăn có mùi vị

khó chịu.



- Ngọt gấp 300 - 400 lần saccharose, ổn định ở môi trường acid nên dùng được

trong nước ngọt, thường dùng dưới dạng muối natri hay canxi.

- Trong cơ thể saccharin qua hệ thống tiêu hóa mà không hề bị hấp thu. Nó không

gây ảnh hưởng đến hàm lượng insulin trong máu và cũng không cung cấp năng lượng cho

cơ thể. Vì thế nó được xếp vào nhóm chất tạo ngọt không calo

Vai trò

Được sử dụng để tạo vị ngọt hoặc che dấu mùi vị trong thức ăn, đồ uống, kem

đánh răng, nước súc miệng. Nó thường được sử dụng ở nồng độ 0,02-0,5% (KL/KL).

Phản ứng bất lợi do saccharin đã được ghi nhận: mề đay, nhạy cảm với ánh sáng. Hàng

ngày không nên đưa vào cơ thể một lượng Saccharin dưới dạng muối (Natri, kali) lớn hơn

5 mg/kg trọng lượng.

1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp phân tích Ac-k, Sac, As

1.3.1 Các phƣơng pháp và xu hƣớng nghiên cứu trong nƣớc

Hiện nay, tùy thuộc vào điều kiện cơ sở vật chất mà các phòng thí nghiệm có thể

tiến hành phân tích đối tượng nghiên cứu theo các phương pháp khác nhau. Một số

phương pháp phổ biến có thể kể đến như quang phổ hấp phụ phân tử UV-VIS, sắc ký

lỏng hiệu năng cao HPLC, điện di mao quản vùng CZE. Trong đó phương pháp quang

phổ UV-VIS tuy có thể dùng để định lượng riêng các chất, nhưng có nhược điểm là khó

phân biệt phổ của chất khi có lẫn các chất cản trở như : chất bảo quản, phẩm màu, các loại

đường…, nên hiện nay ít được sử dụng. HPLC với những ưu điểm của nó như khả năng

tách chất, độ chính xác cao, độ lặp lại tốt thường được sử dụng để phân tích các chất ngọt

tổng hợp nói chung và nhóm chất khảo sát nói riêng.

Sử dụng kỹ thuật điện di mao quản để phân tích các chất ngọt tổng hợp đang có xu

hướng phát triển ở nước ta trong những năm gần đây. Với ưu điểm là tiết kiệm, ít độc hại,

trong khi vẫn đảm bảo được độ chính xác và tính chọn lọc cao, nên nó ngày càng nhận

được sự quan tâm nghiên cứu nhằm thay thế cho HPLC

1.3.2 Các phƣơng pháp trên thế giới

Như đã nói, HPLC và điện di mao quản là hai kỹ thuật phân tích phù hợp cho việc

xác định đồng thời hỗn hợp các đường hóa học kể trên, và đã được sử dụng rộng rãi trên



thế giới. Vậy nên trong mục này, chúng tôi chỉ đề cập tới những công trình nghiên cứu

tiêu biểu đã được triển khai trên các hệ thống này.

1.3.2.1. Phƣơng pháp quang phổ UV – VIS

a. Xác định saccharin [22]

Phƣơng pháp chung cho đồ uống không cồn

Nguyên tắc: Saccharin được trích ly từ một lượng mẫu axit hóa với diethyl ete.

Các dung môi được loại bỏ và dung dịch còn lại được đồng hoá với HCl, sau đó được xử

lý bằng thuốc thử Nessler và đo độ hấp thụ quang của sản phẩm ở bước sóng 425 nm.

Quy trình: Thêm 2 ml HCl vào 50g mẫu. Trích ly với 50 ml diethyl ete (3 lần).

Lọc dung dịch trích ly vào bình tam giác 250 ml sạch và làm bay hơi dung môi.Thêm 6

ml HCl và 5 ml nước cất và bay hơi khoảng 1 ml trong chậu nước nóng. Một lần nữa

thêm 6 ml HCl và 5 ml nước và bay hơi 1 ml. Pha loãng dung dịch thành 50 ml với nước

cất. Hút 2 ml dung dịch này vào bình định mức 25 ml, thêm 1 ml thuốc thử Nessler và

dùng nước cất định mức tới vạch. Tương tự hút 0,5; 1; 2; 3 và 4 ml dung dịch chuẩn (200

mg/ml) vào bình định mức 25 ml và tạo màu với thuốc thử Nessler. Đo độ hấp thụ quang

của mẫu tại bước sóng 425 nm.Từ đó tính hàm lượng saccharin trong mẫu từ đồ thị hiệu

chuẩn.

Phƣơng pháp đo màu Phenol-H2SO4

Nguyên tắc: Saccharin được trích ly từ mẫu axit hóa với chloroform và benzene

sau đó làm bay hơi dung môi. Dung dịch thu được xử lý với phenol-H2SO4 và đun nóng ở

175 oC trong 2 giờ. Sau đó kiềm hoá với NaOH và đem đo độ hấp thụ tại bước sóng 558

nm.

Chuẩn bị mẫu: Nước giải khát (đồ uống có ga và các đồ uống có lượng calo thấp):

Loại bỏ CO2 của nước giải khát bằng cách lắc liên tục và đổ nhanh từ cốc này sang cốc

khác, lặp đi lặp lại nhiều lần. Chuyển 10 ml mẫu đến bình tách lỏng125 ml có khoá

Teflon. Thêm 15 ml nước và 0,5 ml NaOH 1N. Trích ly với 50ml hỗn hợp benzen

chloroform. Để cho tách lớp và loại bỏ các lớp dung môi (axit benzoic và benzoates

không ảnh hưởng). Kẹo ngọt và chất lỏng cô đặc: Nghiền 10-20 viên kẹo thành bột mịn.

Cân chính xác 0,5 gram bột hoặc hút 10 ml mẫu chất lỏng cô đặc vào bình định mức 500

ml và pha loãng đến vạch định mức bằng nước cất. Lấy 10-15 ml dung dịch đem phân



tích. Nếu chất lỏng cô đặc chứa chất bảo quản parabens, thì axit hóa bằng cách thêm 5 ml

HCl và trích ly với 20 ml CCl4. Loại bỏ CCl4 và tiến hành như trong phần “cách xác định”

bắt đầu từ "trích ly bằng cách lắc 1 phút mỗi lần".

Cách xác định: Chuyển dich lọc của mẫu đã chuẩn bị, dung dịch chuẩn (1-3 mg

saccharin) đã làm ở trên vào bình tách lỏng. Thêm 5 ml HCl và trích ly bằng cách lắc một

phút. Mỗi lần với 50, 30 và 20 ml hỗn hợp dung môi chloroform – benzen (95 +5) hoặc

với ether: benzen (95 +5) theo quy định trong mẫu chuẩn bị. Lọc dung dịch này qua phễu

vào bình định mức 100 ml. Pha loãng đến vạch định mức với hỗn hợp dung môi được sử

dụng ở trên và lắc đều. Sau đó chuyển 20 ml vào bình tam giác 50 ml. Bay hơi dung môi

đến khô trong chậu nước nóng và làm khô hoàn toàn trong lò 100 ºC trong 20 phút. Dùng

pipet hút 1 - 5 ml phenol nóng chảy vào bình tam giác và lắc cho đến khi hỗn hợp sau bay

hơi hòa tan. Thêm 1,2 ml H2SO4, lắc và xoay đều.

Đậy chặt bình, bao bằng lá nhôm và đun trong 2 giờ ở 175 oC trong lò. Để nguội

và thêm khoảng 30 ml nước nóng vào và lắc đều. Thêm 10 ml dung dịch NaOH 20% và

lắc đều. Chuyển dung dịch đó vào bình định mức 100ml và pha loãng đến vạch. Đọc độ

hấp thụ của dung dịch trong máy đo quang phổ ở bước sóng 558 nm. Xác định nồng độ

bằng cách so sánh với đường cong hiệu chuẩn.

b. Xác định Aspartame [11]

Nguyên tắc: Aspartame được trích ly từ các viên kẹo bằng dung môi methanol và

độ hấp thụ của dung dịch sau khi lọc được đo ở bước sóng 258 nm.

Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác bột viên kẹo (đã được nghiền) tương đương với

trọng lượng trung bình của 4 viên, cho vào một bình định mức. Thêm 50 ml hỗn hợp dung

môi và lắc trong 30 phút. Sau đó định mức tới vạch bằng hỗn hợp dung môi. Lọc qua giấy

lọc Whatman No. 1, loại bỏ 20 ml dịch lọc đầu tiên và thu lấy dịch lọc trong bình định

mức.

Quy trình: Đo độ hấp thụ của dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu tại bước sóng

258 nm. Tính toán hàm lượng aspartame của viên kẹo từ độ hấp thu của mẫu và dung dịch

chuẩn.

Ngoài ra người ta còn ứng dụng phương pháp quang phổ UV-VIS kết hợp với

phương pháp hiệu chuẩn đa biến để xác định chất ngọt nhân tạo: Phương pháp quang phổ



UV-VIS không phải là thường được sử dụng để phân tích các chất ngọt vì phổ hấp thụ

của các chất có sự chồng chéo lên nhau và ảnh hưởng của các chất cản trở là rất lớn như

chất bảo quản, phẩm màu, các loại đường.... Tuy nhiên, kỹ thuật này, kết hợp với các

phương pháp hiệu chuẩn đa biến, có thể được sử dụng để xác định chất ngọt nhân tạo.

Natalia E. Llamas và đồng nghiệp [31], đã sử dụng phương pháp này để xác định

saccharin và acesulfame-K. Giới hạn phát hiện là 2-15 mg.L-1 đối với saccharin,

acesulfame-K là 2-20 mg.L-1 và 2-25 mg.L-1 đối với aspartame. Hiện nay aspartame

thường có mặt ở trong mẫu thực phẩm. Vì vậy phương pháp này đã được áp dụng thành

công để xác định đồng thời saccharin và acesulfame-K trong các chất ngọt và nước trái

cây mà không cần các bước loại bỏ aspartame.

Một phương pháp mới để xác định hỗn hợp của hai chất làm ngọt thương mại là

aspartam và acesulfame-K, phương pháp đã kết hợp các tiêu chuẩn đã được sử dụng để

hiệu chỉnh trong ma trận tập trung. Axit salicylic đã được sử dụng như là chuẩn nội để

đánh giá việc điều chỉnh các mẫu thực sự trong mô hình PLS-2. Mô hình này thu được từ

việc đo độ hấp thụ quang của chất trong vùng tử ngoại, nồng độ các chất phân tích trong

các mẫu thương mại được phát hiện thông qua detecter huỳnh quang. Phương pháp PLS-2

đã được đánh giá và kiểm định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng (HPLC), sai số

tương đối giữa PLS-2 và các phương pháp HPLC ít hơn 10%. Hiệu suất thu hồi trong các

mẫu thực tế là 99,2%, độ lệch chuẩn là 3,2%. Phương pháp đã được áp dụng để xác định

hỗn hợp aspartam và acesulfame-K trong các chất làm ngọt nhân tạo.[12]

1.3.2.2. Các phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Ở các nước có nền khoa học kỹ thuật phát triển thì việc áp dụng HPLC để định

lượng các chất ngọt tổng hợp (trong đó có nhóm chất khảo sát) đã được tiến hành từ lâu.

Có thể kể đến một số công trình tiêu biểu của các tác giả sau:

Xác định đồng thời 9 chất ngọt nhân tạo có nồng độ cao trong thực phẩm

(acesulfame-K, alitame, aspartame, axit cyclamic, dulcin, neotame, neohesperidine

dihydrochalcone, saccharin và sucralose) bằng HPLC của các tác giả Andrzej Wasik,

Josephine McCourt, Manuela Buchgraber. Phương pháp có độ chính xác khá tốt với hiệu

suất thu hồi trong khoảng 93 ÷ 109%, LOD dưới 15μg.g−1

và giá trị LOQ dưới 30 μg.g−1

,

RSD < 4%.[15]



Xác định đồng thời một số chất phụ gia (acesulfame-K, saccharin, caffeine, axit

benzoic và axit sorbic) trong nước ngọt và các loại thực phẩm khác ở dạng lỏng bằng

HPLC với detector FID (Flame Ionization Detector) của hai tác giả Orawan Kritsunankul ,

Jaroon Jakmunee [34]. Phương pháp sử dụng pha động là đệm phosphate 0,025 mol L

−1,

pH 3,75, thời gian phân tích các chất trong vòng 15 phút với độ chính xác cao (RSD < 5%

cho tất cả các chất phân tích

Phương pháp xác định đồng thời aspartame, cyclamate, dulcin, và saccharin được

Hermann cùng các cộng sự của ông phát triển [13], sử dụng phương pháp HPLC kết hợp

với detector UV để phát hiện chất phân tích. Hệ thống HPLC với cột (12,5 cm x 4,6 mm

hoặc 10 cm x 4 mm) của Lichrosorb, pha động là tetrabutylammonium toluene-p-

sulphonate (II) 5 mM - Glycine (pH 3,5) 10 mM có chứa 12% methanol, bước sóng chung

để phát hiện các chất là 267 nm. Phương pháp này đã được áp dụng trong phân tích sữa

chua, mứt và sô cô la với hiệu suất thu hồi trong khoảng 88 ÷ 102 %, các phép lặp cho hệ

số RSD nhỏ hơn 4,7%.

Phương pháp xác định aspartame, cyclamate, acesulfame-K và natri saccharin

trong thực phẩm và nước giải khát của các tác giả Yan Zhu, Yingying Guo, Mingli Ye,

Frits S. James [19] sử dụng phương pháp HPLC-IC. Phương pháp này cho độ tuyến tính,

độ nhạy cao, và độ lặp lại khá tốt. Giới hạn phát hiện của đường aspartame, natri

cyclamate, acesulfame-K, natri saccharin tương ứng là 0,87; 0,032; 0,019; 0,045 mg / L.

Hiệu suất thu hồi trong khoảng 97,96 ÷ 105,42%.

Ji C. và các đồng nghiệp của ông đã dựa vào kỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu suất

(UPLC) để tách và xác định đồng thời bốn chất ngọt tổng hợp (natri saccharin, aspartame,

acesulfame và neotame) trong một loại thuốc tiêm [24]. Quá trình tách được thực hiện

trên cột ACQUITY UPLC C18 (Beh) với chương trình gradient cho pha động và phát

hiện ở bước sóng chung là 220 nm. Hiệu suất thu hồi trung bình trong các mẫu là 80,5% -

95,2%, với độ lệch chuẩn tương đối RSD là trong khoảng 0,50% - 8,7%. Phương pháp

này cũng đã được áp dụng trong việc xác định các chất ngọt nhân tạo trong đồ uống và

sữa bột.

Xác định đồng thời chất ngọt phi dinh dưỡng trong thực phẩm bằng phương pháp

HPLC / ESI-MS (công trình nghiên cứu do Da-jin Yang và Bo Chen thuộc Phòng thí



nghiệm Hóa chất Sinh học và Nghiên cứu Y học cổ truyền Trung Quốc công bố năm

2008) [20]. Chất ngọt phi dinh dưỡng là các chất có calo thấp, được sử dụng để thay thế

đường và những chất khác. Xác định các chất ngọt trong thực phẩm là rất quan trọng để

đảm bảo chất lượng sản phẩm. Trong nghiên cứu này, bảy loại đường nhân tạo là

(aspartame, saccharin, acesulfame-K, neotame, sucralose, đường hoá học, và alitame) và

một chất ngọt tự nhiên (steviosid) đã được xác định đồng thời trong các loại thực phẩm

khác nhau bằng cách sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp với (ESI-MS).

Các hợp chất cần xác định đã được định lượng bằng cách sử dụng một bộ phận ghi nhận

phát hiện các mảnh ion hóa có chọn lọc (SIR) tại m / z = 178; 397; 377; 293; 641; 312,

162 và 182, với natri warfarin (SIR m / z = 307) được sử dụng làm chất chuẩn nội. Các hệ

số tương quan của đường cong hiệu chuẩn tốt hơn so với r =0,998 (n = 6), trong khoảng

0,05-5 μg / ml cho đường hoá học, 0,3-30 μg / ml cho sucralose, 0,1-10 μg / ml cho

neotame, 0,2 đến 20 μg / ml cho aspartame, 0,5-15 μg / ml cho steviosid, 0,08-8 μg / ml

cho alitame, 0,1-15 μg / ml cho acesulfame-K, và 0,05-5 μg / ml cho saccharin. Giới hạn

phát hiện (LOD) thu được dưới 0,1 μg / ml, trong khi giới hạn định lượng (LOQ) là dưới

0,3 μg / ml.

1.3.2.3. Phƣơng pháp điện di mao quản

Tách và định lượng chất ngọt nhân tạo sử dụng điện di mao quản đã được chứng

minh là phương pháp nhanh chóng và đơn giản. Có thể kể đến một số công trình nghiên

cứu đã được triển khai thành công trên hệ thống này trong việc xác định các chất ngọt

tổng hợp như sau.

Phương pháp xác định đồng thời aspartame, cyclamate, saccharin, và acesulfame-

K trong đồ uống và các chất làm ngọt bằng điện di mao quản với detector độ dẫn của các

tác giả Ana Beatriz Bergamo, José Alberto Fracassi da Silva, Dosil Pereira de Jesus [14].

Trong công trình nghiên cứu này các tác giả đã sử dụng hỗn hợp đệm

tris(hydroxymethyl)aminomethane 100 mmol L−1

(TRIS) and histidine (His) 10 mmol.

L−1

, với thời gian phân tích các mẫu trong vòng 6 phút, và hiệu suất thu hồi các chất trong

khoảng 94 ÷ 108%.

Xác định đồng thời aspartame, saccharin, acesulfame-K, alitame, dulcin, axit

benzoic, caffeine, và axit sorbic bởi sắc ký điện động học Micellar (MEKC) của M.C



Boyce[ 29]. Phương pháp sử dụng hệ đệm phosphate 10 mM và đệm borat 10 mM ở pH

8.6 với dung dịch deoxycholate 50 mM. Phương pháp này đã được áp dụng thành công

trong việc phân tích các loại nước giải khát và sữa bột. Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi

rất tốt 98,6 – 102%, và độ lệch chuẩn 0,2 – 0,6%.

Rainer Schuster và Angelika Gratzfeld-Hüsgen sử dụng điện di mao quản vùng

(CZE) để tách riêng biệt một số chất ngọt nhân tạo phổ biến: aspartame (và các sản phẩm

phân hủy của nó là phenylalanine và acid aspartic), cyclamate, saccharine và acesulfame

cùng với các chất bảo quản (propyl-, ethyl, và methyl), sorbic acid và acid benzoic. Điều

kiện điện di được thực hiện ở 25°c,bằng cách sử dụng dung dịch đệm natri tetraborat 20

mM ở pH 9,4 với thể 20 KV. Độ lặp lại về nồng độ với tất cả các chất cho RSD < 0,15%

và thời gian lưu cho RSD từ 1 đến 7 % (9% đối với phenylalanine).[32]

Phương pháp xác định đồng thời các chất làm ngọt, chất bảo quản trong trái cây

bằng sắc ký điện động học Micellar (MEKC) của các tác giả Lin, Yu Chou, Shin S, Sheu,

Fuu Shyu, Yuan T [26]. Các chất ngọt nhân tạo dulcin, aspartam, saccharin, và

acesulfame-K và các chất bảo quản axit sorbic, axit benzoic, dehydroacetate natri và

methyl-, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, và isobutyl-p-hydroxybenzoate trong trái cây đã

được phân tách bằng phương pháp điện động học Micellar. Quá trình tách được thực hiện

bằng cách sử dụng cột mao quản silica 57 cm với một bộ đệm bao gồm dung dịch

deoxycholate 0.05M, đệm borate, phosphate 0.02M (pH 8,6), và acetonitrile 5%, bước

sóng chung để phát hiện là 214 nm. Hiệu suất thu hồi trung bình cho tất cả các chất ngọt

và chất bảo quản khoảng 90% với độ lặp lại tốt, và các giới hạn phát hiện khoảng từ 10

đến 25 mg/g. Năm mươi mẫu trái cây bảo quản đã được sử dụng cho mục đích phân tích.

Các chất ngọt nhân tạo và chất bảo quản được tìm thấy trong 28 mẫu là aspartame (0,17-

11,59 g / kg) hoặc saccharin (0,09-5,64 g / kg), benzoic acid (0,02-1,72 g / kg) và axit

sorbic (0,27-1,15 g / kg).



Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Đối tƣợng, nội dung và mục tiêu nghiên cứu

2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu

Hiện nay nhiều nhà máy, công ty và một số cơ sở sản xuất đồ uống, nước giải khát

vì lợi nhuận cao mà không quan tâm đến sức khỏe của người tiêu dùng đã lạm dụng các

các loại đường hóa học vượt quá giới hạn cho phép để tăng độ ngọt của sản phẩm. Trong

đó có đường saccharin, acesulfame-K, aspartame, hàm lượng các loại đường hóa học náy

trong đồ uống quá cao sẽ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người, có thể

gây ra các biến chứng về sau. Do đó, mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phương pháp xác

định đồng thời aspartame, saccharin, acesulfame-K trong đồ uống bằng phương pháp sắc

ký điện di mao quản.

2.1.2. Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, cần nghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề sau:

Tập hợp các tài liệu phân tích định lượng đường hóa học trong nước và quốc tế.

Nghiên cứu các điều kiện để xác định đồng thời aspartame, saccharin, acesulfame-

K:

Điều kiện chạy máy

- Cố định một số điều kiện như áp suất bơm mẫu, chiều dài cột, dòng điện và

thời gian tiêm mẫu.

- Khảo sát hệ đệm, nồng độ đệm và pH hệ đệm

- Khảo sát nhiệt độ, điện thế đặt vao hai đầu cột mao quản

Thẩm định phương pháp

- Tính chọn lọc

- Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ và

- Khoảng tuyến tính

- Đánh giá độ chính xác (độ đúng, độ chụm )

- Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp

Áp dụng phương pháp mới xây dựng để phân tích một số mẫu đồ uống, nước giải

khát trên địa bàn Hà Nội



2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phƣơng pháp sử lý mẫu

Đối với mẫu phân tích trong luận văn này là các loại đồ uống ở dạng lỏng, có nền

mẫu không phức tạp lắm do đó phương pháp xử lý mẫu tương đối đơn giản. Các mẫu có

cặn như nước cam, nước yến… đem ly tâm lọai bỏ cặn. Với các mẫu có ga tiến hành loại

bỏ hết bọt khí nhiều lần sau đó tiến hành rung siêu âm khoảng 30 phút đối với các mẫu và

lọc bằng màng lọc 0,2μm trước khi tiến hành chạy điện di.

2.2.2. Phƣơng pháp sắc ký điện di mao quản

2.2.2.1. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản

Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất Dựa trên sự di chuyển khác

nhau của các phần tử chất tan trong mao quản (đường kính 25-100μm) trên nền của dung

dịch chất điện giải có pH thích hợp, dưới tác dụng của điện trường nhất định được cung

cấp bởi một nguồn thế cao một chiều (15-40 kV) đặt vào hai đầu mao quản.[7]

2.2.2.2. Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản

Sơ đồ hệ thống điện di được trình bày ở hình 2.1

Quá trình điện di được thực hiện trên mao quản silica dài 25-100cm, đường kính

trong 25 – 100 µm, đường kính ngoài 300 – 400 µm. Sử dụng áp suất để đưa dung dịch

mẫu và dung dịch đệm lên mao quản, điện thế một chiều đặt vào hai đầu mao quản tạo ra

quá trình tách: các chất phân tích được phát hiện nhờ một detector thích hợp khi di

chuyển về một đầu mao quản.[6]

Detector hay dùng nhất là detector UV hay detector mảng diot DAD. Vị trí phát

hiện nằm ngay trên mao quản gọi là “cửa sổ”.

Hình 2.1. Sơ đồ cấu tạo máy điện di muản



2.2.2.3. Đặc điểm của điện di mao quản

- Có hiệu lực tách các chất rất cao trong mao quản thủy tinh hoặc Teflon có đường

kính trong 25 – 100 µm.

- Điện thế rất cao, thường từ 10 – 30 kV ( 200 – 500 V/cm) được đặt ở 2 đầu ống

mao quản.

- Số đĩa lý thuyết của cột mao quản rất lớn, thường từ 105 – 10

6 nên có khả năng

tách rất tốt các mẫu chứa hỗn hợp phức tạp.

- Thể tích tiêm mẫu rất nhỏ, cỡ 5 – 50 nl nên tiết kiệm mẫu.

- Có rất nhiều kiểu CE nên khả năng ứng dụng vào thực tế rất đa dạng.

- Sự tách được thực hiện chủ yếu trong môi trường nước với sự có mặt của chất

điện ly nền nên rất kinh tế và không độc hại.

- Có khả năng tự động hóa nên dễ dàng khi phân tích số lượng mẫu lớn.

2.2.2.4. Phân loại điện di mao quản

Điện di mao quản có nhiều kiểu khác nhau, nhưng tùy theo cơ chế, bản chất, và

đặc điểm của sự tách (sự điện di) xảy ra trong ống mao quản mà có thể phân chia thành

các loại hay các kiểu điện di với các tên gọi riêng khác nhau. [7] Cụ thể như sau:

1. Điện di mao quản cổ điển (Capillary Electrophoresis: CE).

2. Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE), cơ chế tách:

Linh độ khác nhau của các chất (phụ thuộc điện tích và kích cỡ ion).

3. Sắc ký điện di mao quản điện động học Mixen (Micellary Capillary Electro-

Kenetic Chromatogrphy: MEKC hay MCEKC), cơ chế tách là: Tương tác phân

cực/không phân cực hạt mixen trong dung dịch và linh độ của chất.

4. Sắc ký điện di mao quản gel (rây phân tử), (Capillary Gel Electrophoresis

Chromatography: Gel-CEC), cơ chế tách là dựa vào linh độ của chất và tương tác các loại

cỡ hạt với hạt gel.

5. Sắc ký điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing

Chromatography: CIEFC).

6. Sắc ký điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis

Chromatography: CITPC).



Trong đó điện di mao quản vùng (CZE) là kiểu điện di đơn giản nhất, được sử

dụng rất rộng dãi. Đây cũng là kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu của luận văn

này.

2.2.2.5. Mao quản (cột tách) trong phƣơng pháp điện di mao quản

Mao quản chính là cột tách, một bộ phận quan trọng trong điện di mao quản. Đây

là một trong các yếu tố chính quyết định sự điện di của hỗn hợp chất mẫu. Mao quản

được chế tạo chủ yếu bằng silica, được gọi là mao quản silica. Trong một số trường hợp

người ta cũng dùng mao quản teflon, khi mao quản silica không phù hợp, ví dụ mẫu có

iôn F- và tách ở pH thấp.

Hình 2.2. Mặt cắt ngang của mao quản

Mao quản trong CE thường có đường kính trong (ID) từ 25 đến 150 m và có

thành dày từ 80-120 m. Còn chiều dài của mao quản là tùy thuộc vào hỗn hợp chất mẫu

cần tách. Nhìn chung, hiện nay hay được dùng là các mao quản có tổng chiều dài (Ltot) từ

30 đến 120 cm, với chiều dài hiệu dụng (Leff) từ 20 đến 100 cm. Tuy nhiên, cũng có

trường hợp hai chiều dài này có giá trị bằng nhau (Ltot = Leff) như đối với đêtectơ khối phổ

(MS). Mao quản được làm bằng silica, phủ bên ngoài một lớp polyme (ví dụ polyimit,

PVC) có độ dày từ 200 đến 350 m, làm cho mao quản có độ dẻo, có thể uốn lại được mà

không gãy (tương tự như cột mao quản trong sắc ký khí). Tuy nhiên, chính lớp polyme

này lại làm cho mao quản có nhược điểm là sự truyền nhiệt từ trong mao quản ra môi

trường bên ngoài kém đi, ảnh hưởng đến quá trình điện di.[6]

2.2.2.6. Dòng điện thẩm (Electroosmotic flow-EOF)

Là sự di chuyển của khối dung dịch trong mao quản dưới tác dụng của điện trường.



Hình 2.3. Cấu trúc lớp điện kép trên thành mao quản

Hình 2.4. Dòng EOF và lớp điện kép trong mao quản

Nguồn gốc

Bề mặt bên trong thành mao quản chứa nhóm silanol (Si-OH). Tùy theo pH của

dung dịch đệm điện li mà bề mặt thành mao quản có thể tích điện âm hay dương. Khi

dung dịch đệm có pH ≥ 3 thì nhóm silanol sẽ bị ion hoá thành silanoat (SiO-). Ở phần

thực nghiệm, chúng tôi đều sử dụng đệm có pH ≥ 3 vì thế dưới đây chúng tôi sẽ trình bày

sự hình thành EOF khi bề mặt mao quản tích điện âm.

Khi bề mặt đã có điện tích, thì các nhóm silanoat sẽ hút các cation của dung dịch

đệm và hình thành một lớp cation trên bề mặt trong thành mao quản. Do mật độ các

Lớp khuếch

tán

Lớp

điện kép

Chiều dày

lớp điện

kép

Khoảng cách

(nm)

Thành mao quản silica với nhóm

silanol

Vzet



cation này không đủ trung hoà các nhóm silanoat nên sẽ hình thành thêm một lớp cation

linh động thứ hai.

[6] Khi đặt vào hai đầu mao quản một điện thế, dưới tác dụng của lực điện trường

lớp cation linh động thứ hai sẽ di chuyển về phía cathod. Còn các anion sẽ hướng về phía

anod. Vì các cation này bị solvat hoá do đó sẽ lôi kéo các chất trong dung dịch đệm di

chuyển cùng và hình thành dòng EOF. Nếu tốc độ của các anion nhỏ hơn tốc độ của EOF,

thì nó sẽ bị dòng EOF kéo đi. Khi đó cả cation và anion đều nằm trong dòng chảy khối.

Đặc điểm của dòng EOF [7]

Khác với dòng thủy động lực ở sắc ký, trong CE, dòng EOF có thiết diện gần như

phẳng nên sự phân tán của vùng mẫu là nhỏ nhất và như thế chúng ta thu được pic các

chất là gọn và sắc nét (hình 2.5).

Đưa tất cả các phần tử chất tan trong dung dịch di chuyển theo cùng một hướng khi

dòng EOF đủ lớn.

Hình 2.5. Các kiểu dòng chảy và pic sắc ký trong CE.

A- Kiểu dòng chảy không có áp suất (dòng EOF); B- Kiểu dòng chảy có áp suất

(dòng Laminar)

Kiểm soát EOF (duy trì, thay đổi độ lớn, đổi chiều):

Thường thông qua xem xét và thay đổi các yếu tố liên quan sau:

- Các chất đệm, chất điện giải, thành phần pha động điện di và pH của nó

- Điện thế đặt vào hai đầu mao quản

- Nhiệt độ mao quản trong quá trình điện di

- Mao quản, các đặc trưng và tính chất bề mặt của nó

- Chất phụ gia.

A B



2.2.2.7. Các thông số phân tích của CE

Tốc dộ dịch chuyển

. .i i i

Vv E

L

L: Chiều dài tổng cộng của mao quản (cm)

μi: linh độ điện di toàn phần của ion (cm2/V.s)

E: điện trường trong mao quản do thế V sinh ra.

Thời gian dịch chuyển (Migration time, tm):

Thời gian dịch chuyển là thời gian một chất bắt đầu đi vào mao quản cho đến khi

chất đó đi qua detector (xuất hiện pic trên điện di đồ).

m

i

lt

v

l: chiều dài hiệu dụng của mao quản (cm).

Thời gian dịch chuyển là thông số có thể dùng để định tính trong CE.

Số đĩa lý thuyết:

Hiệu lực cột được thể hiện bằng số đĩa lý thuyết:

16N (w

tm )2

5,54 (2/1w

tm )2

N: số đĩa lý thuyết

W: chiều rộng đáy pic

W1/2: chiều rộng của pic đo ở ½ chiều cao.

Độ phân dải:

Độ phân dải giữa 2 pic cạnh nhau là một đại lượng trong thực tế thường được dùng

chỉ chất lượng của một quá trình tách. Nếu R > 1,5 là có độ phân giải tốt.

2sR 2 1

1 2

( )

( )

t t

w w

t1: thời gian dịch chuyển của chất thứ nhất (phút)

t2: thời gian dịch chuyển của chất thứ hai (phút) (t2 > t1)

w1: độ rộng đáy pic thứ nhất

w2: độ rộng đáy pic thứ hai.



2.2.2.8. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình điện di

Dung dịch đệm

- pH dung dịch đệm

- Thành phần hệ đệm

- Nồng độ dung dịch đệm

- Độ nhớt , hằng số điện môi của dung dịch đệm

Điện thế nguồn

Dòng EOF và tốc độ điện di tỷ lệ thuận với độ lớn của điện thế. Tuy nhiên thế quá

cao sẽ dẫn đến tăng tăng hiệu ứng nhiệt Jun và thời gian phân tích quá ngắn sẽ làm giảm

độ phân giải, thậm chí chưa kịp phát hiện ra chất phân tích.

Mao quản

- Kích thước (chiều dài, đường kính, độ dày thành) của ống mao quản

- Loại mao quản và bề mặt mao quản

- Nếu mao quản có nhồi pha tĩnh xốp thì loại pha tĩnh, kích thước, cỡ hạt và độ xốp

của nó cũng góp phần ảnh hưởng đến sự tách của các chất phân tích.

Lượng mẫu, kỹ thuật và điều kiện nạp mẫu vào mao quản.

Các chất phụ gia thêm vào pha động điện di hoặc vào mẫu phân tích

Trên đây là các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tách các chất trong mao

quản. Ngoài ra còn có các yếu tố về trang thiết bị phát hiện chất phân tích.

2.2.2.9. Các loại detector thông dụng trong phƣơng pháp điện di mao quản

Detector là bộ phận quan trọng quyết định đến độ nhạy của phương pháp phân

tích; tuỳ thuộc bản chất lý hoá của chất phân tích mà chúng ta đưa ra lựa chọn detector

phù hợp [7]:

- Detector UV-VIS

- Detector huỳnh quang

- Detector khối phổ.

- Detector UV-VIS với diode Array

- Detector độ dẫn….

Ngày nay các detector hiện đại ngày càng được cải tiến như: diot-aray, MS, nó

giúp người phân tích xác định chính xác chất phân tích. Ngoài ra do kỹ thuật tin học phát



triển, người phân tích có thể thực hiện phép tách theo chương trình định sẵn, có thể thực

hiện các phép tách tự động nhiều mẫu phân tích.

2.2.2.10. Điện di mao quản vùng (CZE)

Điện di mao quản vùng là một kiểu được ứng dụng đầu tiên và phổ biến của kỹ

thuật CE do tính đơn giản của các hoạt động tách và tính linh hoạt của nó.

Cơ sở tách: Dựa trên sự khác nhau về linh độ điện di của phần tử các chất trong

dung dịch. Khi đặt vào hai đầu mao quản một điện thế và dòng EOF đủ lớn thì thứ tự rửa

giải: cation, chất trung hòa và sau cùng là anion.[7]

Ứng dụng của CZE: CZE được ứng dụng chủ yếu để tách các chất có cấu tạo

ionic (hợp chất có liên kết ion, hợp chất mà khi tan trong pha động điện di chúng có thể

phân ly thành các ion âm và dương) trong nhiều lĩnh vực như: sinh hóa, dược phẩm, thực

phẩm, môi trường.

Có thể thay đổi các điều kiện của CZE để mở rộng phạm vi phân tích:

- Tách các chất đồng phân đối quang bằng cách cho thêm các chất chọn lọc đối

quang như cyclodextrin.

- Thực hiện đảo thế để tách các anion nhanh hơn nếu mẫu chỉ yêu cầu phân tích

anion.

2.3. Phƣơng tiện nghiên cứu

2.3.1 Nguyên vật liệu

2.3.1.1. Chất chuẩn đối chiếu

- Aspartam (Sigma, hàm lượng 98,54 %)

- Axit Sorbic (Merck, hàm lượng 99,34%)

- Benzoic (Merck, hàm lượng 99,62%)

- Saccharin (Sigma, hàm lượng 99,50 %)

- Acesulfam - K (Sigma, hàm lượng 99,67%).

- Cyclamate (Sigma, hàm lượng 99,5%).

- Fructose (Merck, hàm lượng 99,72%)

- Glucose (Merck, hàm lượng 99,8%)

- Cyclamate (Merck, hàm lượng 99,8%)

- Saccharose (Merck, hàm lượng 99,62%)



- Brilliant Blue (Sigma, hàm lượng 99,5%)

- Tartarin (Sigma, hàm lượng 99,5%)

- Quinolin (Merck, hàm lượng 99,78%)

- Sunset Yellow (Merck, hàm lượng 99,8%)

2.3.1.2 Hóa chất dung môi

- Natri tetraborat (Na2B4O7.10H2O) (PA, Merck, Đức)

- Kali dihydrophosphat (KH2PO4.H2O) (PA, Merck, Đức)

- Dikali hydrophosphat (K2HPO4.H2O) (PA, Merck, Đức)

- Natri hydroxyd (NaOH) (PA, Merck, Đức)

- Ethanol (C2H5OH) (PA, Merck, Đức)

- Axit clohydric (HCl), (PA, Merck, Đức)

- Axit Phophoric (H3PO4), (PA, Merck, Đức)

- Methanol (Merck, hàm lượng 99,8%)

- Nước siêu tinh khiết: là nước cất 2 lần được lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết có cột

trao đổi cation, anion và màng lọc 0,2 μm.

2.3.1.3. Thiết bị dụng cụ

- Máy điện di mao quản Agilent (Mỹ) có trang bị detector UV-VIS kết nối với máy

tính và máy in

Hình 2.6. Hệ thống phân tích CE: Máy điện di Agilent, máy tính, máy in

- Mao quản silica nung chảy: đường kính trong i.d = 50 μm, chiều dài tổng cộng

L = 64 cm (Agilent, Mỹ) và L = 52 cm



- Bộ lọc nước siêu tinh khiết Elga : Model ELGASTAT MAXIMA SC áp suất tối

đa 1,4 bar/20psi(bơm vào), 4,1 bar/60 psi (hoạt động), (Elga Ltd, Anh)

- Máy rung siêu âm ULTRASONIC LC30 (Elma - Đức)

- Máy đo pH Metrohm (Thuỵ Sĩ) cho kết quả đến ± 0,01 đơn vị pH

- Đầu lọc có đường kính lỗ lọc d = 0,2 μm

- Cân phân tích 4 số OHAUS (Mỹ)

- Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống nghiệm, pipet chính xác…

- Micropipet 100 ; 200 ; 1000 ; 5000 μL

-Tủ lạnh Sanyo MDF-236 (bảo quản mẫu).

2.4. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất

2.4.1. Pha dung dịch chuẩn gốc

Aspartam, Saccharin, Acesulfam-K, Cyclamate, Saccharose, Glucose, Fructose,

Brilliant Blue, Tartarin, Quinolin, Sunset Yellow được pha trong dung môi là nước. Axit

Sorbic, Axit Benzoic hòa tan trong Methanol. Cụ thể:

-Lần1: Cân chính xác 0,0500g (Aspartam, Saccharin, Acesulfam-K, Cyclamate )

mỗi loại đem hòa tan bằng nước cất siêu tinh khiết chuyển vào bình định mức 50ml, định

mức bằng nước cất tới vạch, sau đó đem rung siêu âm 30 phút thu được các dung dịch gốc

có nồng độ là 1000ppm. Dung dịch chuẩn được bảo quản trong tủ lanh dưới 100C, có thể

dùng được trong 3 tháng.

-Lần 2: Cân chính xác 0,0378g Acesulfame-K, 0,0257g Saccharin, 0,0267g

Aspartame, hòa tan định mức 50 ml bằng nước cất siêu tinh khiết và đem rung siêu âm

thu được dung dịch gốc có nồng độ lần lượt là Ace 756 ppm, Sac 514 ppm, Asp 534 ppm.

-Lần 3: Cân chính xác 0,0269g Saccharin, 0,0303g Acesulfame-K, 0,0270g

Aspartame hòa tan định mức 25 ml bằng nước cất siêu tinh khiết và đem rung siêu âm thu

được dung dịch gốc có nồng độ lần lượt là Ace 1212 ppm, Sac 1076 ppm, Asp 1080 ppm.

- Chất bảo quản: Cân chính xác 0,0288g Axit Sorbic, 0,0269g Axit Benzoic hòa

tan bằng dung dịch Methanol theo tỷ lệ 40 mg/1 ml Methanol rồi sau đó mới thêm nước

cất siêu tinh khiết đem rung siêu âm 30 phút và định mức 25 ml bằng nước cất siêu tinh

khiết được dung dịch có nồng độ Axit Sorbic 1152 ppm, Axit Benzoic 1076 ppm.



- Các loại đường cân chính xác 0,0261g Saccharose, 0,0269g Fructose, 0,0289

Glucose, hòa tan bằng nước cất siêt tinh khiết, định mức 25ml, đem rung siêu âm thu

được các dung dịch có nồng độ Saccharose 1044 ppm, Fructose 1076 ppm, Glucose 1156

ppm.

- Phẩm màu: Cân chính xác 0,0232g Brilliant Blue, 0,0304g Tartarin, 0,0357g

Quinolin, 0.0211g Sunset Yellow hòa tan bằng nước cất siêt tinh khiết, định mức 25ml,

đem rung siêu âm thu được các dung dịch có nồng độ Brilliant Blue 928 ppm, Tartarin

1216 ppm, Quinolin 1428 ppm, Sunset Yellow 844 ppm.

- Từ các dung dịch chuẩn trên ta có thể các dung dịch chuẩn làm việc có các nồng

độ khác nhau như dung dịch chuẩn:200; 150; 100; 80; 60; 50; 45; 35; 25; 20; 10; 5

ppm…Các dung dịch làm việc được pha hàng ngày.

2.4.2. Pha dung dịch đệm

Dung dịch đệm borat 20 mM pH 6,.00; pH 7,50; pH ,50; pH 9,00; pH 9,50; pH

10,00

+ Natri borat được sấy ở 105oC/2h

+ Cân 1 lượng tùy theo thể tích cần pha

+ Pha trong khoảng 80% thể tích nước: điều chỉnh về pH 8,50; pH 9,00 bằng acid

HCl 1M, điều chỉnh về pH 9,50; pH 10,00 bằng NaOH 1M trên máy đo pH rồi thêm nước

đủ đến vạch.

Dung dịch đệm borat 15 mM 25 mM và 30 mM cũng được pha tương tự.

Dung dịch đệm Kali phosphat 20 mM pH 7.5

+ Pha dung dịch K2HPO4 nồng độ 20 mM

+ Pha dung dịch KH2PO4 nồng độ 20 mM

Đo pH của dung dịch K2HPO4, thêm từ từ dung dịch KH2PO4 vào dung dịch

K2HPO4 cho đến khi pH về 7.5 thì dừng lại.

Dung dịch đệm Kali phosphat 20 mM, pH 3,00

+ Pha dung dịch KH2PO4 20 mM bằng 80% thể tích nước, sau đó điều chỉnh về pH

3,00 bằng acid H3PO4 1M và thêm nước vừa đủ.



+ Dung dịch đệm có thể được sử dụng nhiều ngày (cụ thể: pH 3,00 dùng được

trong một tháng, pH ≥ 7 dùng được trong 1 tuần), nhưng phải kiểm tra pH hàng ngày

trước khi sử dụng.

Dung dịch đệm Acetat 20 mM pH 6,0

+ Pha dung dịch CH3COONa 20 mM bằng 80 % thể tích nước, sau đó điều chỉnh

về pH =6,00 bằng Axit Acetic 1M và thêm nước vừa đủ.

Tất cả các dung dịch đều được pha bằng nước siêu tinh khiết, lọc qua màng lọc 0,2

μm và rung siêu âm loại khí trước khi sử dụng và đều phải được kiểm tra độ pH trước khi

sử dụng



Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tối ƣu hóa các điều kiện xác định Ace-K, Sac, Asp bằng kỹ thuật sắc ký điện di

mao quản.

3.1.1. Một số điều kiện cố định

- Cột mao quản: chiều dài L= 65cm, đều có đường kính trong i.d = 50 μm.

- Tiêm mẫu: áp suất 50 mbar trong thời gian 5 s với cường độ dòng điện là 50 mA.

- Bước sóng phát hiện được lựa chọn dựa vào độ hấp phụ của từng chất:

+ Aspartam: 191nm

+ Saccharin: 202 nm

+ Acesulfam - K: 226 nm

(a) (b)

(c)

Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV – VIS của asp (a), sac (b), ace- k (c) trong môi

trường nước ( L= 65cm, i.d=50 μm, áp suất 50 mbar, I = 50 mA, E = 25 kV)



3.1.2. Khảo sát các điều kiện

3.1.2.1. Hệ đệm

Khảo sát loại đệm và pH của đệm

Đầu tiên chúng tôi tiến hành khảo sát 3 loại đệm ở 3 vùng pH: Đệm photphat 20

mM (pH 3,00), đệm Acetat 20mM (pH 6,0), và đệm borat 20 mM (pH 9,00).

Quá trình điện di thu được kết quả ở bảng 3.1, và hình 3.3 và phụ lục 1

Bảng 3.1. Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất vào các loại đệm

Chất chuẩn

Nồng độ

(ppm)

Diện tich (mau.s)

Đệm phosphat Đệm acetat Đệm borat

Aspartame 40 38,6 24,2 22,5

Saccharin 40 4,5 115,5 152,8

Acesulfame-K 40 1,2 53,5 62,3

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Đệm phosphat

pH=3

Đệm acetat

pH=6

Đệm borat

pH=9

Diệ

n t

ích (

mau.s

)

Aspartame

Saccharin

Acesulfame-K

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất

vào các loại đệm



Hình 3.3. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất chuẩn asp, sac, ace-k trong điều kiện

Đệm borat 20 mM pH 9,00 ( L=65 cm, I=50 mA, V=25kV, t =25oC, áp suất 50 mbar)

Nhận xét: Từ kết quả thu được ở bảng 3.1, phụ lục 1 và hình 3.2, hình 3.3 chúng

tôi nhận thấy khả năng tách của các chất phân tích ở đệm borat pH 9,00 là tốt nhất, qua

sắc đồ hình 3.3 ta thấy các píc rõ ràng, cân đối và diện tích píc của các chất là lớn nhất,

còn ở pH 3,00 thời gian lưu của các chất tách ra khỏi nhau là rất dài, đường nền nhiễu và

dòng không ổn định, tín hiệu phát hiện các chất kém. Ở pH = 6 với đệm acetat cho tín

hiệu các píc rõ dàng hơn nhưng không cân đối. Vì thế đệm borat được lựa chọn là loại

đệm sẽ dùng.

Và chúng tôi tiếp tục khảo sát các điểm pH khác xung quanh điểm pH 9.00 với

đệm borat 20 mM, cụ thể: pH 8,50; pH 9,50; pH 10,0. Kết quả cụ thể:

Bảng 3.2. Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất vào giá trị pH

Chất chuẩn Nồng độ

(ppm)

Diện tích píc (mau.s)

pH=8.5 pH=9.0 pH=9.5 pH=10

Aspartame 40 19,4 22,5 23,0 35,6

Saccharin 40 138,0 152,8 156,0 245,0

Acesulfame-K 40 51,2 62,3 64,6 42,3



0

50

100

150

200

250

300

pH=8.5 pH=9.0 pH=9.5 pH=10

Diệ

n t

ích (

mau.s

)

Aspartame

Saccharin

Acesulfame-K

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc của

asp, sac, ace-k vào giá trị pH của đệm borat 20 mM.

min1 2 3 4 5 6 7 8 9

Norm.

0

20

40

60

80

100

DAD1 E, Sig=215,5 Ref=off (MIXDUONG HH\STD000082.D)

4.5

36

6.8

60

7.5

27

pH=9.5

Hình 3.5. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất chuẩn asp, sac, ace-k trong điều kiện (Đệm

borat pH 9,5, L=65 cm, I= 50mA, V= 25kV, t=25oC áp suất 50 mbar)

Nhận xét: Qua các điện di đồ ở phụ lục 2, hình 3.4, hình 3.5 và bảng 3.2 thể hiện ở

trên có thể thấy khi pH hệ đệm tăng thì diện tích píc các chất đều tăng. Tại pH 10,0 diện

tích píc của acesulfame-k giảm, còn saccharin diện tích píc tăng mạnh. Ở pH 9,5 các chất

được tách tốt nhất, hình dáng pic cân đối, gọn nhất, đồng thời tín hiệu đường nền ổn định

và diện tích píc của các chất tăng đều. Do vậy đệm borat, pH 9,5 được lựa chọn cho các

bước khảo sát tiếp theo.

Khảo sát nồng độ đệm:

Sau khi lựa chọn được hệ đệm và pH của đệm chúng tôi tiếp tục khảo sát nồng độ

của hệ đệm. Đối với kỹ thuật CZE thì nồng độ đệm sử dụng phải đủ lớn nếu không sẽ tạo



ra các vùng dẫn điện khác nhau trong mao quản. Nhưng nồng độ đệm lại tỷ lệ thuận với

thời gian dịch chuyển và độ lớn của dòng điện trong mao quản. Nên cần lựa chọn hệ đệm

có nồng độ thích hợp. Cụ thể nồng độ đệm borat pH 9.5 như sau: 15 mM, 20 mM, 25mM,

30mM.

Bảng 3.3. Kết quả sự phụ thuộc của thời gian lưu của các chất chuẩn

vào nồng độ đệm borat

Chất chuẩn

Nồng độ

(ppm)

Thời gian lưu ( phút)

15 mM 20 mM 25 mM 30 mM

Aspartame 40 4,471 4,589 4,777 6,289

Saccharin 40 6,496 6,812 7,412 8,465

Acesulfame-K 40 7,013 7,413 8,171 10,106

0

2

4

6

8

10

12

15 mM 20 mM 25 mM 30 mM

Nồng độ đệm borat pH 9.5

Thờ

i gia

n lư

u (

phút)

Aspartame

Saccharin

Acesulfame-K

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa thời gian lưu của asp, sac, ace-k

vào nồng dộ đệm borat pH 9,5

Hình 3.7. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất trong điều kiện đệm borat 20 mM

( pH 9,5 và I=50 mA, V=25kV, L= 65 cm, t =25oC, áp suất 50 mbar)



Nhận xét: Qua các điện di đồ ở phụ lục 3 và hình 3.6, hình 3.7 ta thấy các chất đều

được phát hiện và tách tốt. Trong đó thời gian lưu của 3 chất chuẩn khi sử dụng đệm borat

15 mM là ngắn nhất. Mặt khác khi sử dụng đệm 30 mM với điện thế áp vào 2 đầu mao

quản là 25 kV thì cường độ dòng điện lên tới 100μA, làm cho đường nền nhiễu hơn so với

trường hợp sử dụng đệm có nồng độ 20 mM, đồng thời. Trên hình 3.4 ở nồng độ đệm

borat 20 mM cho píc đều cân xứng, thời gian lưu ngắn , hơn nữa diện tích píc các chất là

lớn nhất. Vì vậy chúng tôi lựa chọn đệm borac nồng độ 20 mM, pH 9,5 cho các bước tiếp

theo.

3.1.2.2. Xác định điều kiện nhiệt độ

Sau khi chọn được hệ đệm thích hợp là: đệm borat 20 mM, pH 9,5 ta xét đến sự

thay đổi của nhiệt độ đối với quá trình tách các chất trong hỗn hợp. Tiến hành khảo sát ở

các nhiệt độ: 20oC, 25

oC, và 30

oC. Kết quả như sau:

Bảng 3.4. Kết quả thời gian lưu của asp, sac, ace-k ở các nhiệt độ khác nhau


(ppm)

Thời gian lưu (phút)

Nhiệt độ 20oC Nhiệt độ 25

oC Nhiệt độ 30

oC

Aspartame 40 4,987 4,589 3,957

Saccharin 40 7,195 6,812 5,723

Acesulfame-K 40 7,826 7,419 6,255

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Nhiệt độ 20oC Nhiệt độ 25oC Nhiệt độ 30oC

Thờ

i gia

n lư

u (

phút)

Aspartame

Saccharin

Acesulfame-K

Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa thời gian lưu

của asp, sac, ace-k vào nhiệt độ



Hình 3.9. Điện di đồ của hỗn hợp asp, sac, ace-k ở nhiệt độ 25oC trong điều kiện

( Đệm borat 20 mM, pH 95, và I=50 mA, V=25kV, L= 65 cm, áp suất 50 mbar)

Nhận xét: Qua sự khảo sát trên ta thấy tại 25oC các chất tách khỏi nhau, pic cân

đối và gọn (hình 3.9). Còn ở nhiệt độ 30oC thời gian tách các chất tuy nhanh hơn nhưng

đường nền không đẹp và sẽ làm tăng hiệu ứng nhiệt. Ở nhiệt độ 20oC thời gian tách các

chất lâu hơn so với 25oC và 30

oC (phụ lục 4). Điều này cho thấy khi nhiệt độ thay đổi thì

độ nhớt cũng thay đổi theo, và qua đó ảnh hưởng đến giá trị độ điện di của chất tan ( chất

phân tích ), chúng sẽ gây ra sự mở rộng píc. Tức là làm giảm hiệu quả tách. Vì khi độ

nhớt thay đổi sẽ làm cho số đĩa hiệu lực N ef của cột tách giảm theo. Hơn nữa với điều

kiện khí hậu nước ta việc duy trì nhiệt độ mao quản ở 25oC là thích hợp.Vì vậy chúng tôi

lựa chọn điều kiện nhiệt độ chạy sắc ký là 25oC.

3.1.2.3. Xác định thế đặt vào hai đầu

Trong phương pháp điện di, điện thế áp vào hai đầu mao quản là một nhân tố chính

quyết định đến quá trình phân tích. Vì thế trong quá trình sắc ký một hỗn hợp mẫu, để có

kết quả tốt và ổn định, chúng ta chúng ta phải chọn giá trị thế thích hợp nhất, khống chế

và giữ cho giá trị thế V này luôn không đổi để có được giá trị E và dòng điện I cũng

không đổi. Vì vậy điện thế được chúng tôi lựa chọn để khảo sát là 20 kV, 25 kV và 30

kV. Kết quả thu được như sau:



Bảng 3.5. Thời gian lưu của asp, sac, ace-k khi thay đổi điện thế


(ppm)

Thời gian lưu (phút)

V = 20 kV V = 25 kV V = 30 kV

Aspartame 40 4,723 4,589 3,915

Saccharin 40 7,156 6,812 5,720

Acesulfame-K 40 7,705 7,419 6,201

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

V = 20 kV V = 25 kV V = 30 kV

Điện thế (kV)

Thờ

i gia

n lư

u (

phút) Aspartame

Saccharin

Acesulfame-K

Hình 3.10. Đồ thị biểu diện sự phụ thuộc giữa thời gian lưu

của asp, sac, ace-k vào điện thế

Nhận xét: Từ kết quả khảo sát ở các giá trị điện thế 20 kV, 25 kV, 30 kV cho kết

quả ở bảng 3.5, hình 3.10 và phụ lục 5 cho thấy. Ở điện thế 30 kV thời gian phân tích tốt

nhưng dòng điện tạo ra cao( lớn hơn 100 µA), vì khi dòng điện i lớn sẽ gây ra hiệu ứng

nhiệt Jun lớn, làm nóng mao quản, gây ra doãng píc. Tức là làm giảm hiệu quả tách. Ở

điện thế 20 kV thời gian phân tích dài do dòng điện tạo ra nhỏ dẫn đến làm giãn rộng

vùng mẫu. Tại điện thế 25 kV chúng tôi thấy quá trình phân tích tối ưu nhất, thời gian

phân tích phù hợp, hiệu ứng nhiệt nhỏ không làm ảnh hưởng tới quá trình phân tích, các

píc tách hoàn toàn và cân đối, đồng thời có thể bảo vệ cột mao quản tốt hơn so với ở điện

thế 30 kV.

3.1.2.4. Xác định bƣớc sóng định lƣợng

Để chọn bước sóng định lượng chúng tôi tiến hành đo phổ UV-VIS của saccharin,

aspartame, accesuface-k với nồng độ 40 ppm trong hỗn hợp hệ đệm borat đã chọn trong



vùng 190 – 600 nm. Phổ UV-VIS của saccharin, Aspartame, Accesuface_K trong hệ đệm

này như trong hình 3.7 và phụ lục 6.

Bảng 3.6. Diện tích píc của asp, sac, ace-k ở các bước sóng khác nhau


(ppm)

Diện tích pic (mau.s)

λ=195,5 nm λ=210,5 nm λ=215,5 nm λ=230,5 nm

Aspartame 40 68,2 30,5 23,6 4,3

Saccharin 40 172,0 165,5 155,8 98,8

Acesulfame-K 40 18,2 46,4 65,2 88,6

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

λ=195.5 nm λ=210.5 nm λ=215.5 nm λ=230.5 nm

Bươc sóng (nm)

Diệ

n t

ích p

íc (

mau.s

)

Aspartame

Saccharin

Acesulfame-K

Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc

của asp, sac, ace-k vào bước sóng

Hình 3.12. Sắc đồ các chất chuẩn trong hỗn hợp ở bước sóng 215,5 nm

(L=65 cm, V=25kV, I=50mA, đệm borat 20mM, pH=9,5, t = 20oC, áp suất 50 mbar)



Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.6 và đồ thị hình 3.11 ta thấy khi bước sóng giảm thì

diện tích píc của aspartame và saccharin đều giảm. Ngược lại đối với acesulfame-k thì

diện tích lại tăng. Ở sắc đồ hình 3.12 và phụ lục 6 cho thấy tại bước sóng 215,5 nm cho

tín hiệu phát hiện các chất rõ ràng, cân đối và đều nhau, đường nền không bị nhiễu. Vì

vậy bước sóng 215,5 nm được chúng tôi lựa chọn để phân tích các chất.

3.1.2.5 Kết luận

Sau khi khảo sát chúng tôi lựa chọn các điều kiện điện di như sau:

Chiều dài cột mao quản L= 65cm, đường kính trong id = 50 µm

Điện thế đặt vào 2 đầu mao quản 25 kV

Giới hạn dòng điện trong mao quản 50 μA

Tiêm mẫu với áp suất 50 mbar trong thời gian 5s

Bước sóng định lượng các chất λ = 215,5 nm

Nhiệt độ mao quản: 25oC

Hệ đệm borat 20 mM, pH 9,5

Hình 3.13 dưới đây thể hiện điện di đồ hỗn hợp 3 chất ( asp, sac, ace-k ) 40 ppm

trong điều kiện đã chọn

Hình 3.13. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất trong điều kiện điện di lựa chọn

(L=65cm, I=50 mA, V=25 kV, áp suất 50 mbar, t =25oC, đệm borat 20 mM, pH= 9,5 )

3.2 Thẩm định phƣơng pháp

3.2.1. Tính chọn lọc

Tính chọn lọc được chúng tôi kiểm tra trên từng chất. Cụ thể được đánh giá bằng

thời gian di chuyển giữa chất đơn tiêu chuẩn và trong hỗn hợp chuẩn. Thời gian lưu được



xác định tại thời điểm mẫu được tiêm vào đến khi chất phân tích được Flocell phát hiện ở

cuối cột với nồng độ tối đa. Nó phụ thuộc vào.

- Kích thước, mức độ xốp và cấu trúc mao mạch.

- Tính chất và thành phần của chất tan

- pH của pha động và các yếu tố khác

Cụ thể 3 dung dịch làm việc của Asp, Ace-K, Sac được pha từ dung dịch gốc có

nồng độ 40 ppm và tiến hành chạy điện di dựa trên điều kiện đã lựa chọn. Kết quả thu

được thể hiện trong hình 24 và bảng 3.11

(a) (b)

(c)

Hình 3.14. Điện di đồ về thời gian lưu của chuẩn đơn Aspartame (hình c),

Acesulfame-k (hình b), Saccharin( hình a) trong điều kiện (L=65cm, I=50 mA, V=25

kV, áp suất 50 mbar, t =25oC, đệm borat 20 mM, pH= 9,5 )



Để đánh giá tính chọn lọc chúng tôi dựa vào độ phân giải. Đây là một đại lượng

đặc trưng (yếu tố) quan trọng của kỹ thuật tách, hay khoa học của các phương pháp tách

các chất nói chung. Trong HPCEC, độ phân giải (Resolution: Rij ) của hai chất i và j liền

nhau (píc sắc ký bên cạch nhau ). Nếu Rij > 1,5 là có độ phân giải tốt.

ij 2R ( )

( )

i j

i j

t t

w w

Trong đó:

ti , tj : Thời gian lưu của chất tan i và j ( theo giây, hay phút ) và ti > tj.

wi , wj: Độ rộng đáy của píc của hai chất i, và j ( theo giây, hay phút ).

Bảng 3.7. Kết quả thể hiện tính chọn lọc của phương pháp

STT

Tên

chất

tm ở mẫu

đơn thành

phần

tm ở mẫu

hỗn hợp

Độ rộng

pic

Sai số

%

Rs với pic

liền kề nhất

Aspartam 4,545 4,556 0,0257 0,24 40,2

Saccharin 6,792 6,801 0,0302 0,13 11,62

Acesulfam - K 7,527 7,575 0,0364 0,64 11,62

Nhận xét: Từ sắc đồ hình 3.14 và bảng 3.7 trên ta thấy thời gian lưu của asp, sac,

ace-k tách biệt nhau hoàn toàn, sai số về mặt thời gian lưu trong việc chạy các chuẩn đơn

so với thời gian chạy chuẩn hỗn hợp rất nhỏ từ 0,24 %- 0,64 %,. Như vậy với 2 chất gần

nhau nhất cũng có Rs >10, độ phân giải của các chất là đều thỏa mãn yêu cầu.

3.2.2. Các chất cản trở gây ảnh hƣởng

Trong thực tế đối với các mẫu đồ uống trên thị trường hiện nay có rất nhiều các

thành phần khác nhau như các chất bảo quản (Nipasol, nipagin, Kali sorbat, Natri

benzoat), phẩm màu (Sunset Yeallow, Quinolin, Erythozime Lake...) và các chất ngọt

nhân tạo Carbohydrate (Glucose, Cyclamate, Sacharose...). Vì vậy khi tiến hành chạy điện

di thì các thành phần này cũng cần được xem xét. Trong luận văn này các chất chuẩn

được chúng tôi lựa chọn để khảo sát sự ảnh hưởng tới quá trình tách các chất là: chất bảo

quản (Axit Sorbic, Axit Benzoic), các loại đường ( Saccharose, Cyclamate, Fructose,

Glucose) và phẩm màu (Sunset Yeallow, Brilliant Blue, Tartarin, Quilenol).



Quá trình khảo sát được chúng tôi tiến hành chạy điện di bằng cách thêm các chất

ảnh hưởng có nồng độ từ thấp đến cao vào hỗn hợp 3 chất chuẩn asp (21,6 ppm), sac

(21,52 ppm) và ace-K (24,24 ppm). Dựa vào diện tích píc và thời gian lưu của Asp, Sac,

Ace-K để đánh giá sai số. Dưới đây là kết quả thu thu được sau khi khảo sát

3.2.2.1. Ảnh hƣởng của chất bảo quản

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chất bảo quản lên diện tích pic của Ace-K, Sac, Asp.

CAx.Ben

(ppm)

SAsp

(mau.s)

Sai

số(%)

SSac

(mau.s)

Sai

số(%)

SAce-K

(mau.s)

Sai

số(%)

0 8,6 61,5 31,5

10,76 8,5 -1,1 61,6 0,2 31,3 0,6

21,52 8,7 2,3 61,8 0,5 31,8 0,9

43,04 8,9 3,5 62,4 1,4 32,7 3,8

CAx.Sor

(ppm)

SAsp

(mau.s)

Sai

số(%)

SSac

(mau.s)

Sai

số(%)

SAce-K

(mau.s)

Sai

số(%)

0 8,6 61,5 31,5

11,52 8,4 -2,3 61,2 -0,5 31,1 -1,2

23,04 8,7 1,1 62,7 1,9 31,6 0,3

46,08 9,2 6,9 63,0 2,4 32,2 2,2

Nhận Xét: Từ kết quả ở bảng 3.8, và phụ lục 7 ta thấy khi thêm nồng độ các chất

bảo quản có nồng độ từ thấp đến cao thì:

- Diện tích píc của asp, ace-k tăng khi thêm axit Benzoic. Sai số đối với asp, sac,

ace-k lần lượt tương ứng từ là: -1,1 ÷ 3,25%; 0,16 ÷ 1,4%; 0,6 ÷ 3,8 %

- Đối với axit sorbic 11,52 ppm khi thêm thì diện tích píc các chất đều giảm nhưng

không đáng kể. Tại nồng độ 23,04 ppm và 46,08 ppm, diện tích píc các chất đều tăng. Sai

số đối với asp (-2,03 ÷ 6,2%), sac (-0,5 ÷2,4%), ace-k (-1,2 ÷ 2,2%)

- Như vậy các chất bảo quản khi thêm vào không làm ảnh hưởng lắm tới diện tích

và thời gian lưu của các chất



3.2.2.2. Ảnh hƣởng của các loại đƣờng

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của đường Glucose, Fructose, Cyclamate và Saccharose

lên diện tích pic của Ace-K, Sac, Asp

CGlu

(ppm)

SAsp

(mau.s)

Sai

số(%)

SSac

(mau.s)

Sai

số(%)

SAce-K

(mau.s)

Sai

số(%)

0 86 61,5 31,5

23,12 8,7 1,1 60,9 -1.0 31,8 0,9

46,24 8,4 -2,3 58,9 -4,2 30,9 -1,9

138,70 8,1 -5,8 58,7 -4,5 29,9 -5,0

CFruc

(ppm)

SAsp

(mau.s)

Sai

số(%)

SSac

(mau.s)

Sai

số(%)

SAce-K

(mau.s)

Sai

số(%)

0 8,6 61,5 31,5

21,52 8,6 0 59,7 -1,8 31,4 -0,3

43,04 8,5 -1,1 59,1 -3,9 30,9 -1,9

129,12 8,3 -4,7 58,7 -4,5 31,2 -1,0

CCyc

(ppm)

SAsp

(mau.s)

Sai

số(%)

SSac

(mau.s)

Sai

số(%)

SAce-K

(mau.s)

Sai

số(%)

0 8,6 61,5 31,5

20,00 8,7 1,1 62,0 0,8 31,5 0

40,00 8,7 1,1 62,5 1,6 31,6 0,3

100,00 9,0 4,6 63,4 3,0 32,7 3,8

CSacch

(ppm)

SAsp

(mau.s)

Sai

số(%)

SSac

(mau.s)

Sai

số(%)

SAce-K

(mau.s)

Sai

số(%)

0 8,6 61,5 31,5

20,90 8,4 -1,7 62,1 1,0 31,2 -0,9

41,80 8,4 -1,7 62,3 1,3 30,7 -2,5

125,40 7,9 -7,4 63,0 2,4 28,9 -8,2



Nhận Xét: Từ kết quả bảng 3.9, và phụ lục 7 ta thấy:

- Khi thêm đường Glucose và Fructose vào hỗn hợp chất chuẩn thì diện tích píc

asp, sac, ace-k đều giảm. Cụ thể sai số của asp từ (1,5 ÷ 5,8%), sac (-1,0 ÷ -4,5%) và ace-

k ( 0,9 ÷ 5,0%).

- Diện tích asp, sac và ace-k tăng lên khi thêm đường cyclamate. Trong khi đó khi

thêm đường saccharose thì diện tích asp, ace-k giảm, còn sac diện tích tăng từ 1,0 ÷ 2,4%.

- Khi thêm 3 đường Glu, Sacch và Fruc từ thấp đến cao, kết quả trên sắc đồ thu

được đều không thấy xuất hiện các píc tương ứng. Chỉ có đường Cyclamate cho tín hiệu

píc ở nồng độ 50 ppm rất rõ, và tách biệt không chen lấn nhau với píc của các chất khác.

- Như vậy 4 đường trên không ảnh hưởng nhiều tới diện tích và thời gian lưu của

các chất. Sai số đó nằm trong giới hạn cho phép của phương pháp.



3.2.2.3. Ảnh hƣởng của phẩm màu

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của phẩm màu Tarta và Brill, Sunset và Qui

tới diện tích pic của Asp, Sac, Ace-K

CTarta

(ppm)

SAsp

(mau.s)

Sai

số(%)

SSac

(mau.s)

Sai

số(%)

SAce-K

(mau.s)

Sai

số(%)

0 8,6 61,5 31,5

12,16 8,4 -2,8 59,9 -2,6 31,1 -1,3

24,32 8,2 -4,1 58,7 -4,5 30,2 -4,1

48,64 7,9 -8,1 57,9 -5,8 28,9 -8,2

CBrill

(ppm)

SAsp

(mau.s)

Sai

số(%)

SSac

(mau.s)

Sai

số(%)

SAce-K

(mau.s)

Sai

số(%)

0 8,6 61,5 31,5

9,28 8,5 -1,0 61,5 0 30,8 -2,2

18,56 8,8 1,8 61,9 0,7 30,3 -3,8

111,40 9,3 7,5 63,7 3,5 29,3 -7,0

CSun

(ppm)

SAsp

(mau.s)

Sai

số(%)

SSac

(mau.s)

Sai

số(%)

SAce-K

(mau.s)

Sai

số(%)

0 8,6 61,5 31.5

16,88 8,6 0 61,1 0,7 31.08 1,3

33,76 8,51 0,5 59,6 3,0 30.6 2,8

67,52 8,38 2,5 57,3 6,8 29.7 5,7

CQui

(ppm)

SAsp

(mau.s)

Sai

số(%)

SSac

(mau.s)

Sai

số(%)

SAce-K

(mau.s)

Sai

số(%)

0 8,6 61,5 31.5

14,28 8,6 0 60,9 1,0 30.8 2,2

28,56 8,5 0,3 60,2 2,1 30.2 4,1

57,12 8,12 5,6 58,6 4,7 29.2 7,3



Nhận xét: Từ kết quả bảng 3.10 và phụ lục 7 ta thấy:

- Khi thêm phẩm màu Sunset Yellow diện tích các píc tăng : asp ( 0÷2,5%), sac (

0,7 ÷ 6,8%), ace-k ( 1,3 ÷ 5,7%). Thêm quilenol thì diện tích píc của các đường hóa học

này tăng: ( 0 ÷ 5,6%) với asp, sac (1,0 ÷ 4,7%) và ace-k ( 2,2 ÷ 7,3%).

- Tarta và Brill thi thêm vào hỗn hợp các chất chuẩn làm diện tích píc các chất khảo

sát đều giảm. Trừ diện tích của sac tăng lên khi thêm brilliant, sai số từ ( 0 ÷ 3,5%).

- Thời gian lưu của asp, sac, ace-k đều tăng khi thêm Sun và Qui, sai số trong

khoảng ( 0,27 ÷ 9,3%). Đối với Tarta, Brill thì thời gian lưu của các chất nghiên cứu thay

đổi không đáng kể, sai số từ ( -1,64 ÷ 1,9%.).

min1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

10

20

30

40

50

60

DAD1 B, Sig=215,5 Ref=off (MIXDUONG HH\STD000167.D)

Sac

Ace

Cyc

Asp

Ben

Asor

Tata

Qui

Sun

Area

: 8.72

509

2.9

39

Area

: 6.40

023

3.4

66

Area

: 118

.872

3.8

74 Area

: 118

.615

4.2

31

Area

: 62.1

616

4.3

88

Area

: 30.0

954

4.7

83

Area

: 7.33

305

4.9

00

Area

: 147

.872

5.5

51

Area

: 137

.589

6.1

81

Hình 3.15: Điện di đồ khi thêm các yếu tố ảnh hưởng(axit benzoic 43,04 ppm,

axit sorbic 46,08 ppm, glucose 46,24 ppm, fructose 43,04 ppm, saccharose 41,80 ppm,

cyclamate 50 ppm, sunset yellow 67,52 ppm , brilliant 18,6 ppm, quilenol 57,12 ppm ,

tartarin 48,64 ppm ) trong điều kiện (L=54cm, I=50 mA, V=25 kV, áp suất 50 mbar,

t =25oC, đệm borat 20 mM, pH= 9,5 )

Kết luận: Từ điện di đồ hình 3.15 và kết quả thu được ở các bảng từ 3.8 đến bảng

3.10 cùng với phụ lục 7 ta thấy các píc rõ ràng, cân đối, không có sự chồng chéo giữa các

phổ, thời gian lưu của các chất tách biệt nhau hoàn toàn. Đối với các loại đường Glucose,

Fructose, Saccharose không cho tín hiệu các píc ở trong vùng khả kiến . Khi có mặt của

các chất ảnh hưởng khảo sát ở trên thì diện tích và thời gian lưu của Sac, Ace-k, Asp có

thay đổi. Sai số về diện tích và thời gian đều nhỏ hơn 10%, nằm trong giới hạn cho phép

của phương pháp. Vì vậy các chất bảo quản, các loại đường và phẩm màu đều không ảnh

hưởng mấy tới quá trình chạy điện di khi phân tích các chất nghiên cứu.



3.2.3. Khảo sát lập đường chuẩn

Lập đường chuẩn là một trong những yêu cầu đầu tiên của phương pháp phân tích.

Từ đường chuẩn ta có thể biết được khoảng tuyến tính của chất phân tích. Chúng tôi đã

tiến hành xây dựng đường chuẩn như sau: Pha một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 5

ppm đến 250 ppm từ dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm và chuẩn trung gian 100 ppm, các

dung dịch chuẩn được pha bằng nước cất siêu tinh khiết.

Tiến hành chạy sắc kí trên hệ thống CE theo các điều kiện đã tối ưu ở trên. Kết quả

khảo sát các thông số biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ của Sac, Ac, As và diện tích

pic tương ứng được thể hiện trong bảng 3.11 dưới đây:

Bảng 3.11. Sự phụ thuộc diện tích píc vào nồng độ Asp, Ace-K, Sac

STT

Nồng độ

Asp (ppm)

Diện tích

pic (mau.s)

Nồng độ

Sac (ppm)

Diện tích

pic (mau.s)

Nồng độ

Ace-k (ppm)

Diện tích

pic(mau.s)

1 2,5 1,2 2,5 8,0 2,5 3,5

2 5,0 2,3 5,0 14,3 5,0 6,9

3 10 4,1 10 29,2 10 13,2

4 25 11,2 20 56,2 25 33

5 50 20,7 50 146 50 65

6 100 41 100 301 100 138

7 150 63,4 200 571 150 199

8 200 72,6 250 645 200 232

Từ kết quả thu được bảng 3.11, chúng tôi dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ

thuộc giữa nồng độ của các chất vào diện tích píc .



0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 50 100 150 200 250

Nồng độ Asp (ppm)

Diệ

n t

ích

(m

au

.s)

0 20 40 60 80 100 120 140 160

0

10

20

30

40

50

60

70

Y = A + B * X

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 0.11132 0.2742

B 0.41845 0.00384

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99979 0.52881 7 <0.0001

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h (

ma

u.s

)

Nong do Asp (ppm)

Hình 3.16. Sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ Asp

và đường chuẩn của Aspartame

0

100

200

300

400

500

600

700

0 100 200 300

Nồng độ Sac (ppm)

Diệ

n t

ích

(m

au

.s)

0 50 100 150 200

0

100

200

300

400

500

600

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 1.69338 1.03045

B 2.87522 0.03482

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99963 6.18727 7 <0.0001

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h (

ma

u.s

)

Nong do Sac (ppm)

Hình 3.17. Sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ Saccharin

và đường chuẩn của Saccharin



0 20 40 60 80 100 120 140 160

0

50

100

150

200

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 0.0135 1.02786

B 1.34279 0.01438

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99971 1.98228 7 <0.0001

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h (

ma

u.s

)

Nong do Ace-K (ppm)

Hình 3.18. Sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ Acesulfame-K

và đường chuẩn của Acesulfame-K

Qua kết quả chạy điện di nhận thấy với khoảng nồng độ đã khảo sát thì pic các

chất khá cân đối, pic tách rõ ràng không có sự chen lấn pic. Đồng thời từ đường chuẩn ta

thấy giới hạn tuyến tính của Asp, Sac, Ace-K lần lượt là 150 ppm, 200 ppm, và 150 ppm.

Trên thực tế phương pháp tiến hành xây dựng đường chuẩn của đồng thời ba chất

nêu trên có thể mắc sai số hệ thống, vì vậy để kiểm tra xem phương pháp có mắc sai số hệ

thống hay không cần tiến hành kiểm tra các gía trị a của phương trình hồi quy với giá trị

0, độ tin cậy thống kê (P = 0,95).

Các phương trình trên đều có dạng y = a + bx. Nếu coi a = 0 ( khi không có chất

phân tích thì không có tín hiệu) lúc này phương trình được viết dưới dạng y = b’x. Thay

các giá trị yi và xi vào phương trình y = b’x ta sẽ tính được các giá trị bi’ và khi đó sẽ tính

được b’ là giá trị trung bình của các bi thu được [9]. Dựa vào chuẩn Fisher để đánh giá sự

sai khác giữa giá trị a và 0 (tính tỷ số phương sai của 2 phương trình) và so sánh giá trị

này với F(P, f1, f2) tra bảng (Aspartame, Saccharin ,Acesulfame-K với P = 0,95 và f1 = n-3 =

4 và f2 = n -2 = 5). Trong đó n là số điểm trên đường chuẩn.

Phương sai của hai phương trình sẽ được tính như sau:

2

)(

2

)ˆ( 22

2

n

bxay

n

yyS

iiii

y

3

)(

3

)ˆ( 2'2'

2'

n

xby

n

yyS

iiiiy



2

2'

y

y

tinhS

SF

Nếu Ftinh< F(P, f1, f2) thì sự khác nhau về phương sai của hai phương trình không có ý

nghĩa thống kê. Nói cách khác, có thể xem như a=0. Cụ thể:

Bảng 3.12. Giá trị phương sai và Ftính của Asp, Sac, Ace-K

Tên chất Phương trình hồi qui Phương sai Ftính Fbảng

AS y = 0,419.x + 0,111 0,3 3,83 5,19

y = 0,430.x 1,2

SAC Y = 2,875.x + 1,693 38,3 2,28 6,59

Y = 2,942.x 87,4

AC-K Y = 1,343.x + 0,014 3,98 3,87 5,19

Y = 1,352.x 15,4

Từ các kết quả tính toán nhận thấy các giá trị Ftính < Fbảng, như vậy sự khác nhau

giữa giá trị a và 0 là không có ý nghĩa. Kết luận phương pháp tiến hành phân tích đồng

thời 3 chất trên thiết bị điện di mao quản không mắc sai số hệ thống.

Ngoài ra để đánh giá mức độ tương quan tuyến tính của các đường chuẩn, chúng

tôi sử dụng phần mềm thống kê Origin để đánh giá độ tuyến tính của các đường chuẩn,

kết quả phân tích cho thấy các giá trị r đều đạt trên 0,999 với tất cả các chất. Hệ số xác

định r2 đều lớn hơn 99,9 % đối với các đường chuẩn của Sac, Ac-k, As. Đánh giá độ

tuyến tính theo chuẩn F cũng cho thấy trị số P < 0,0001 chứng tỏ có thể áp dụng phương

trình đường chuẩn tuyến tính bậc 1 để định lượng các chất phân tích trên trong đồ uống.

Trong các khoảng nồng độ đã khảo sát cả 3 chất đều có mối tương quan tuyến tính chặt

chẽ giữa nồng độ và diện tích píc.

3.2.4. Giới hạn phát hiện LOD

Giới hạn phát hiện (LOD) được định nghĩa là nồng độ thấp nhất (xL) của chất phân

tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích (yL) khác có nghĩa với tín hiệu của

mẫu trắng hay tín hiệu nền. Tức là: yL= BBSky . với

By là tín hiệu trung bình của mẫu

trắng sau nb thí nghiệm; Sb là độ lệch chuẩn tín hiệu của mẫu trắng; k là đại lượng số học

được chọn theo độ tin cậy mong muốn [27].



bn

j

bj

b

by

ny

1

1

bn

i

bbi

b

b xxn

S1

22 )(1

1, như vậy,

b

Skxx B

BL

.

Thông thường giới hạn phát hiện LOD được tính theo 02 cách sau:

a) Phƣơng pháp trực tiếp

Dùng chính chất phân tích tiến hành pha loãng tới nồng độ nhỏ nhất mà vẫn thu

được tín hiệu lớn gấp 3 lần tín hiệu đường nền (S/N = 3). Để khảo sát giới hạn phát hiện

chúng tôi lựa chọn dung dịch hỗn hợp chuẩn trung gian 3 chất Asp, Sac, Ace-K có nồng

độ 40 ppm, sau đó tiến hành pha loãng nồng độ nhỏ dần và tiến hành chạy điện di thu

được kết quả cụ thể như sau:

+ Tại nồng độ pha loãng 25 lần (Aspartame 1,6 ppm, Saccharin 1,6 ppm;

Acesufame_K 1,6 ppm) thì thiết bị phân tích thu được của Saccharin và Acesufame_K

vẫn gấp 3 lần tín hiệu đường nền, do đó giới hạn phát hiện LOD của Aspartame là 1,6

ppm.


Acesufame_K 1,0 ppm) thì thiết bị phân tích thu được của Acesulfame-K vẫn gấp 3 lần

tín hiệu đường nền, do đó giới hạn phát hiện LOD của Acesulfame-K là 1,0 ppm.


Acesufame_K 0,5 ppm) thì thiết bị phân tích không phát hiện được Aspartame,

Acesufame_K. Ở nồng độ 0,5 ppm thì tín hiệu thu được của Saccharin vẫn gấp 3 lần tín

hiệu đường nền, do đó giới hạn phát hiện LOD của Saccharin là 0,5 ppm.

Như vậy giá trị giới hạn phát hiện LOD của phương pháp đối với Aspartame là 1,6

ppm, Saccharin là 0,5 ppm và Acesulfame-k là 1,0 ppm.

b) Phƣơng pháp tính toán

Theo lí thuyết thống kê trong hoá phân tích

3. DSLOD

b (*)

Trong đó: b là hệ số trong phương trình hồi quy: y = a + bx

SD là độ lệch chuẩn của mẫu trắng, được coi đúng bằng sai số của phương trình hồi

quy SD = Sy



Dựa vào phương trình hồi quy của các đường chuẩn theo công thức (*). Các giá trị

SD, a, b được tính từ các phương trình hồi quy của Sac, As, Ac-k đường chuẩn hình 3.16,

hình 3.17 và hình 3.18. Giới hạn phát hiện (LOD) của Sac, As, Ac-k tính được theo bảng

3.13 dưới đây:

Bảng 3.13. Giới hạn phát hiện (LOD) theo phương pháp lý thuyết tính theo

phương trình đường chuẩn

Chất phân tích b SD LOD (ppm)

Aspartame 0,419 0,53 3,79

Saccharin 2,875 6,19 6,46

Acesufame_K 1,343 1,98 4,43

Từ hai phương pháp tính giới hạn phát hiện LOD, chúng tôi nhận thấy giới hạn

phát hiện LOD theo phương pháp tính toán lý thuyết cao hơn so với phương pháp thực

nghiệm.

3.2.5.Giới hạn định lƣợng LOQ

Giới hạn định lượng được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà

phép phân tích vẫn định lượng được chính xác với độ tin cậy 95%. Theo lý thuyết thống

kê trong hoá phân tích thì LOQ là nồng độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấp 10 lần tín

hiệu đường nền (S/N = 10), tức là LOQ = 3,33.LOD. Vì vậy, giới hạn định lượng của

phương pháp xác định Asp, Sac, Ace-k theo bảng 3.14.

Bảng 3.14: Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp

Chất phân tích Aspartame Saccharin Acesufame_K

LOQ (ppm) thực nghiệm 4,8 1,5 3,0

LOQ (ppm) lý thuyết 12,6 21,5 14,8

Từ kết quả tính toán giữa lý thuyết và thực nghiệm ta thấy giới hạn định lượng

(LOQ) theo thực nghiệm thấp hơn so với tính toán lý thuyết dựa vào đường chuẩn.



3.2.6. Khoảng tuyến tính

Khoảng nồng độ chất phân tích từ giới hạn định lượng (LOQ) đến giới hạn tuyến

tính (LOL) gọi là khoảng tuyến tính hay khoảng động học của phương pháp phân tích. Từ

các giá trị LOQ và LOL xác định được ở mục 3.2.4 và 3.2.5 chúng tôi xác định được

khoảng tuyến tính của các đường hóa học như trong bảng 3.15 dưới đây:

Bảng 3.15. Khoảng tuyến tính của Asp, Sac, Ace-K

Chất phân tích

Giới hạn

định lượng

(LOQ) - ppb

Giới hạn

tuyến tính

(LOL) ppb

Khoảng tuyến tính từ

LOQ đến LOL (ppb)

Aspartame 4,8 150 4,8 ÷ 150

Saccharin 1,5 200 1,5 ÷ 200

Acesulfame-K 3,0 150 3,0 ÷ 150

Vậy khoảng tuyến tính hay nồng độ các đường hóa học từ giới hạn định lượng đến

giới hạn tuyến tính trong khoảng từ 1,5 ÷ 200 ppm

3.2.7. Đánh giá độ chính xác (độ đúng, độ chụm ) của phương pháp

Theo ISO độ chính xác của phép đo được đánh giá qua độ đúng và độ chụm. Độ

chụm là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại. Độ đúng là mức

độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực. Độ đúng được biểu diễn dưới dạng sai

số tuyệt đối hoặc sai số tương đối.

Sai số được tính theo công thức

% .100%i t

t

S SX

S

1

%

%

n

i

itb

X

Xn

Trong đó :

%X: Sai số phần trăm tương đối

Si : Giá trị diện tích píc đo được

St : Giá trị diện tích píc tìm được theo đường chuẩn

n : Số lần đo.

Độ lặp lại của phép đo được xác định theo các đại lượng S2 và CV.



2

2( )

1

i tbS SS

n

100

(%)tb

SCV

S

Trong đó:

Stb : Diện tích pic trung bình (mau.s)

n: Số lần đo

S: Độ lệch chuẩn

CV: Hệ số biến thiên (%)

Để đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo chúng tôi pha 3 mẫu có nồng độ ở

khoảng tuyến tính. Thực hiện đo mỗi mẫu 5 lần. Các kết quả được chỉ ra ở bảng 3.16.

Bảng 3.16. Sai số và độ lặp lại của phép đo tại các nồng độ khác nhau

Nồng

độ

(ppm)

Diện tích pic Si Diện

tích

píc St

%Xtb

CV%

Lần đo

1

2

3

4

5

20

Aspartame 8,3 8,1 8,0 8,2 8,2 8,1 1,05 1,23

Saccharin 55,6 57,1 56,3 55,8 56,9 56,2 0,95 0,95

Acesulfame-K 26,5 26,3 25,2 25,4 25,8 25,6 1,85 1,73

50

Aspartame 20,3 20,9 21,2 21,4 20,7 20,7 1,73 2,06

Saccharin 146,2 147 145,2 146,9 148,5 146 0,94 1,13

Acesulfame-K 65,2 68,1 66,4 65,9 66,6 66,2 1,15 1,62

150

Aspartame 61,5 61,3 61 60,6 61,8 61 0,75 1,35

Saccharin 426 423,8 418,5 421,9 416,6 421,5 0,85 1,30

Acesulfame-K 194,2 192,8 193,7 195,6 190,5 192 0,97 0,98

Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.16 cho thấy sự khác biệt giữa giá trị trung bình và

giá trị thực không đáng kể, độ đúng của phương pháp là rất tốt (yêu cầu của điện di là CV

<=3%). Hàm lượng thu hồi khá lớn từ 99,36 ÷ 107,5% nằm trong giới hạn cho phép. Vì

vậy có thể kết luận rằng phương pháp điện di mao quản có độ lặp đi lặp lại và độ chính

xác cao, nằm trong phạm vi tuyến tính.



3.2.8. Độ lặp lại và độ thu hồi của phƣơng pháp

Một phương pháp phân tích tốt phải có độ lặp lại và hệ số thu hồi cao. Để đánh giá

hai yếu tố trên, chúng tôi tiến hành khảo sát trên nền mẫu thực. Sử dụng mẫu trắng, thêm

chuẩn ở 3 mức nồng độ 10 ppm, 25 ppm, và 50 ppm. Mỗi mức tiến hành làm lặp lại 5

lần. Độ lặp lại và độ thu hồi được xác định như sau:

Độ lặp lại của phương pháp được xác định theo các đại lượng S2 và CV.

2

2( )

1

i tbS SS

n

, 100

(%)tb

SCV

S

, %100

u

xR

Trong đó:

Stb : Diện tích pic trung bình (mau.s)

n: Số lần đo

S: Độ lệch chuẩn

CV: Hệ số biến thiên (%)

R: Là hiệu suất



Bảng 3.17. Diện tích píc của As, Sac, Ac-k ở các nồng độ khác nhau

Nồng độ

(ppm)

Diện tích pic (mau.s)

Tên chất L1 L2 L3 L4 L5

10 3,9 4,1 4,0 4,1 3,9

Aspartame 25 9,8 9,9 10,1 10,2 9,7

50 20,3 20,9 21,2 21 20,7

10 29,2 30,1 29,6 28,8 29,5

Saccharin 25 74,3 72,8 72,5 73,6 74,7

50 143,2 141 145,2 142,6 142

10 13,2 12,9 12,7 13,3 13,5

Acesulfame-K 25 32,3 32,6 32,9 31,9 31,4

50 65,2 64,2 66,4 65,9 66,6

Bảng 3.18. Kết quả độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp

Tên chất Nồng độ

(ppm)

Stb Nồng độ tìm

thấy(ppm)

Độ lệch

SD

CV

(%)

R

(%)

Aspartame

10 4,0 8,4 0,09 2,30 83,7

25 9,9 24,3 0,20 1,82 97,4

50 20,8 50,3 0,34 1,64 100,6

Saccharin

10 29,2 10 0,48 1,63 101,8

25 73,6 25,2 0,94 1,28 100,7

50 142,8 48,8 1,50 0,83 97,6

Acesulfame-K

10 13,1 9,9 0,32 2,41 98,4

25 32, 24,2 0,63 1,82 96,6

50 65,1 48,9 0,98 1,49 97,8

Nhận xét: Độ thu hồi của phương pháp tại 3 mức nồng độ 10 ppm, 25ppm, và 50

ppm đều trên 80 % và nằm trong giới hạn cho phép. Độ lặp lại của Asp, Sac, Ace-K tại

nồng độ 10 ppm cao nhất trong 3 mức nồng độ. Tuy nhiên vẫn nằm trong giới hạn cho



phép của phương pháp sắc ký điện di mao quản (CV <= 3 %). Như vậy phương pháp có

độ thu hồi trên 80% và độ lặp lại cao, có thể áp dụng phương pháp để phân tích asp, sac,

ace-k trong đồ uống.

3.3. Phân tích mẫu thực tế

Trong luận văn này, mẫu nghiên cứu là các loại đồ uống và nước giải khát có ga và

không có ga hiện đang có mặt trên thị trường, cụ thể như sau:

- Mẫu 1: Sprite 330 mL- công ty Cocacola Việt Nam sản xuất ngày: 01/12/10 -

thời hạn sử dụng: 01/12/11.

- Mẫu 2: Coca-Cola 330 mL- Cocacola công ty Việt Nam - ngày sản xuất:

01/11/10 - thời hạn sử dụng: 01/11/11.

- Mẫu 3: Đồ uống Sting Dâu năng lượng 330 mL- công ty Việt Nam Pepsico sản

xuất ngày 13/11/10 –thời hạn sử dụng 13/11/11

- Mẫu 4: Lemon C2 trà xanh 360 mL- Hà Nội URC công ty Prodution ngày sản

xuất: 20/12/2010 - thời hạn sử dụng: 20/12/11.

- Mẫu 5: Trà xanh Oo Hà Nội URC do công ty Prodution sản xuất ngày: 20/02/11 -

thời hạn sử dụng: 20/02/12.

Đối với các mẫu được chúng tôi lựa chọn đều ở dạng dung dịch dung dịch do đó

quá trình xử lý mẫu đơn giản và nhanh, cụ thể: Các mẫu đồ uống được rung siêu âm trong

khoảng 30 phút, và loại bỏ hết khí cacbornate, lọc bằng màng lọc 0.2μm. Hút chính xác

0.50 ml mỗi mẫu cho vào bình định mức 5 ml và pha loãng bằng nước cất siêu tinh khiết.

Lượng thể tích dung dịch các chất chuẩn thêm vào lần lượt 0,1 ml; 0,2 ml; 0,4 ml với

nồng độ tương ứng: asp ( 10,8 ppm, 21,6 ppm, 43,2 ppm ), sac ( 10,76 ppm, 21,52 ppm,

43,04 ppm ), ace-k (12,12 ppm, 24,24 ppm, 48,48 ppm). Sau đó định mức bằng nước cất

siêu tinh khiết. Hàm lượng của asp, sac, ace-k được xác định bằng kỹ thuật thêm tiêu

chuẩn.



Bảng 3.19. Kết quả diện tích pic đối với mẫu thêm chuẩn và không thêm chuẩn

Mẫu

Nồng độ ppm Diện tích píc của mẫu(mau.s)

AS SAC AC-K AS SAC AC-K

Samurai

0 0 0 6,2 6,3 14,5

10,8 10,8 12,1 12,4 36,3 32,7

21,6 21,5 24,2 17,1 80,3 54,8

43,2 43, 48,5 30,2 141,2 89,2

Sprite

0 0 0 5,3 5,6 6,6

10,8 10,7 12,1 10,1 31,8 28,9

21,6 21,5 24,2 14,3 66,7 47,8

43,2 43 48,5 28,8 121,6 84,5

Lemon C2

0 0 0 4,8 7,6 5,1

10,8 10,8 12,1 10,5 41,4 25,6

21,6 21,5 24,2 14,9 80 49,3

43,2 43 48,5 27,8 131,3 89,8

Coca Cola

0 0 0 3,1 3,4 3,8

10,8 10,8 12,1 7,6 35,8 26,2

21,6 21,5 24,2 11,6 77,6 51

43,2 43 48,5 23,8 132,2 93,4

Trà Oo

0 0 0 0,9 2,7 1,6

10,8 10,8 12,1 5 36,1 24,2

21,6 21,5 24,2 9,7 77,4 46,8

43,2 43 48,5 18,2 138,2 93,9



0 10 20 30 40 50

5

10

15

20

25

30


------------------------------------------------------------

A 6.06 0.55503

B 0.55106 0.02243

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99835 0.71654 4 0.00165

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h (

ma

u.s

)

Nong do Asp (ppm)

0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 4.12 0.13532

B 3.42034 0.12717

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99862 4.04768 4 0.00138

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h (

ma

u.s

)

Nong do Sac (ppm)

(a) (b)

0 10 20 30 40 50

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 14.9 1.4758

B 1.55116 0.05314

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99883 1.90526 4 0.00117

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h (

ma

u.s

)

Nong do Ace-K (ppm)

(c)

Hình 3.19. Đường chuẩn thêm chuẩn của Aspartame (a), Saccharin (b),

Acesulfame-K (c) trong mẫu Samurai



0 10 20 30 40 50

5

10

15

20

25

30

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 4.32 0.23193

B 0.54524 0.04978

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99177 1.59042 4 0.00123

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h (

ma

u.s

)

Nong do Asp (ppm)

0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100

120

140

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 5.1 0.2237

B 2.7257 0.0902

------------------------------------------------------------

R SD N P

----------- -------------------------------------------------

0.99891 2.87079 4 0.00109

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h (

ma

u.s

)

Nong do Sac (ppm)

(a) (b)

0 10 20 30 40 500

20

40

60

80

100

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 8.18 0.37776

B 1.59217 0.04961

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99903 1.77868 4 9.69552E-4

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h(m

au

.s)

Nong do Ace-K (ppm)

(c)


Acesulfame-K (c) trong mẫu Sprite



0 10 20 30 40 50

5

10

15

20

25

30

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 4.5 0.654

B 0.5291 0.02643

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99751 0.84431 4 0.00249

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h (

ma

u.s

)

Nong do Asp (ppm)0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100

120

140

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 10.86 0.72707

B 2.87918 0.19173

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99559 6.10262 4 0.00441

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h (

ma

u.s

)

Nong do Sac (ppm)

(a) (b)

0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 4.82 0.97039

B 1.77298 0.03494

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99961 1.25277 4 3.88209E-4

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h (

ma

u.s

)

Nong do Ace-K (ppm)

(c)


Acesulfame-K (c) trong mẫu Lemon C2



0 10 20 30 40 500

5

10

15

20

25

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 2.46 0.22777

B 0.47963 0.03345

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99517 1.06864 4 0.00183

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h (

ma

u.s

)

Nong do Asp (ppm)

0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100

120

140

= A + B * X


------------------------------------------------------------

A 5.36 0.40931

B 3.01593 0.17885

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.9965 5.6924 4 0.0035

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h (

ma

u.s

)

Nong do Sac (ppm)

(a) (b)

0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100 Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 4.28 0.43299

B 1.85384 0.0408

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99952 1.46268 4 4.83976E-4

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h (

ma

u.s

)

Nong do Ace-K (ppm)

(c)


Acesulfame-K (c) trong mẫu Coca Cola



0 10 20 30 40 50

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 0.84 0.14162

B 0.40265 0.00572

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.9998 0.18283 4 2.01969E-4

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h (

ma

u.s

)

Nong do Asp (ppm)0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100

120

140

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 3.9 0.35615

B 3.17047 0.13613

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99816 2.33277 4 0.00184

------------------------------------------------------------

Die

n tic

h (

ma

u.s

)

Nong do Sac (ppm)

(a) (b)

0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 0.88 0.2164

B 1.94107 0.0294

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99977 1.05397 4 2.29306E-4

------------------------------------------------------------

Die

n ti

ch (

ma

u.s

)

Nong do Ace-K (ppm)

(c)


Acesulfame-K (c) trong mẫu Trà xanh Oo



Kết quả phân tích: Dựa vào các phương trình hồi qui của phương pháp thêm tiêu

chuẩn đối với các mẫu trên là : y = a + b x

Trong đó: a là diện tích của pic (mau.s)

x là nồng độ của chất ở trong mẫu (ppm)

→ Nồng độ của chất phân tích trong mẫu là b

aCx

Trong thực nghiệm do quá trình pha loãng nên

=> 10X

aC x

b (ppm) và

22 )()(.b

S

a

SCS ba

xx

Như vậy từ phương trình hồi qui cộng thêm yếu tố pha loãng ta tính được nồng độ

của các chất ngọt trong các mẫu thực tế thể hiện ở bảng 3.18.

Bảng 3.19. Kết quả phân tích Asp, Sac, Ace trong các mẫu

Mẫu Nồng độ của các chất (ppm)

AS SAC AC-K

Samurai 109,5 ± 10,5 12,1 ± 0,6 96,1 ± 10,2

Sprite 77,9 ± 7,8 18,9 ± 1,0 51,1 ± 5,6

Lemon C2 84,9 ± 12,6 37,8 ± 3,6 27,7 ± 6,0

Coca Cola 49,2 ± 5,7 17,8 ±1,7 22,5 ± 2,9

Trà Trà xanh Oo

21,0 ± 3,5 12,6 ± 2,8 4,5 ± 1,1

Nhận xét: Từ kết quả phân tích các mẫu ở bảng 3.18 đối với aspartame, saccharin,

acesulfame-K thì nồng độ cho phép trong đồ uống có ga và đồ uống có hương vị thường

là trong phạm vi 28-350 ppm, 21-90 ppm và 23-280 ppm, tương ứng. Vì vậy, nồng độ

phát hiện của Aspartame, Saccharin, Acesulfame-K trong các mẫu phân tích ở trên phù

hợp và nằm trong phạm vi hạn chế không ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng.

3.4. Bàn luận về qui trình rửa giải

Trong thời gian tiến hành điện di, khi bắt đầu và kết thúc, mao quản đều được rửa

để làm giảm sự hấp phụ của mẫu phân tích lên bề mặt mao quản , giúp phục hồi và bảo vệ

bề mặt mao quản. Qua quá trình khảo sát, chúng tôi đề xuất quy trình rửa giải mao quản

nhằm thu được kết quả phân tích tối ưu nhất như sau:



Hàng ngày:

+ Thời điểm bắt đầu: rửa bằng NaOH 1 N trong 5 phút, sau đó bằng NaOH 0.1N

trong 5 phút, rồi đến nước cất siêu tinh khiết đã lọc qua màng lọc 0,2 μm trong 5 phút,

cuối cùng là đệm 5 phút (rửa đệm 5 phút này cũng là quá trình đưa đệm làm việc lên mao

quản).

+ Thời điểm kết thúc: rửa bằng nước siêu tinh khiết 5 phút, sau đó ngâm 2 đầu mao

quản vào 2 ống chứa nước siêu tinh khiết.

Giữa các lần chạy mẫu:

+ Đối với các chất chuẩn và các mẫu dạng dung dịch có thành phần đơn giản: chỉ

cần rửa bằng NaOH 1N trong 3 phút, NaOH 0,1N trong 5 phút và đệm Borate 5 phút.

+ Đối với các mẫu có thành phần phức tạp, đặc biệt là mẫu thực phẩm, thì phải rửa

thêm bằng NaOH và acid H3PO4 nếu quan sát thấy thời gian lưu của các chất không lặp

lại.



KẾT LUẬN.

Đề tài nghiên cứu “ Ứng dụng kỹ thuật sắc ký điện di mao quản phân tích

Acesulfame-k, Saccharin, Aspartame trong đồ uống” qua thực nghiệm chúng tôi đã đạt

được mục tiêu và kết quả như sau:

- Đã xây dựng được phương pháp định lượng Acesulfame-k, Saccharin, Aspartame

trong đồ uống, nước giải khát với các điều kiện điện di: Bước sóng phát hiện các chất là

215,5 nm, sử dụng dung dịch đệm borat 20 mM pH = 9,5, điện thế đặt vào hai đầu mao

quản là 25kV, nhiệt độ 25oC, với áp suất bơm mẫu 50mbar trong thời gian 5s, dòng điện

100A.

- Đã xây dựng được đường chuẩn cho mỗi chất. Tìm được giới hạn phát hiện LOD

bằng thực nghiệm đối với Asp, Sac, Ace-K lần lượt là 1,6 ppm; 0,5 ppm; 1,0 ppm, theo

đường chuẩn giá trị này tìm được là 3,79 ppm; 6,46 ppm; 4,43 ppm. Giá trị LOQ tìm

được là 4,8 ppm; 1,5 ppm và 3,0 ppm, còn với lý thuyết giá trị này lần lượt là 12,6 ppm;

21,5 ppm; 14,8 ppm.

- Đánh giá được phương pháp phân tích dựa trên độ đúng và độ chụm với sai số

tương đối từ 0,75 – 1,85%, giá trị biến thiên CV < 3%. Độ lặp lại tương đối tốt với độ

lệch chuẩn (SD) từ 0,2 – 1,5% , hiệu suất thu hồi trên mẫu giả là 96,6 - 101,8%. Đồng thời

cũng đánh giá phương pháp trực tiếp trên mẫu thực với hiệu suất thu hồi là 95,2 – 107,0%

Từ lý thuyết và quá trình khảo sát, phương pháp điện di mao quản được lựa chọn

xác định 3 chất aspartame, saccharin, acesulfame-k trong các loại nước giải khát. Kết quả

thu được cho thấy hàm lượng Asp, Sac, và Ace-k đều nằm trong giới hạn cho phép trong

khoảng từ 28 – 350 ppm, 21 - 90 ppm, 23 – 280 ppm tương ứng. Vì vậy, nồng độ

aspartame, saccharin, acesulfame-k trong các mẫu phân tích ở trên phù hợp và nằn trong

phạm vi hạn chế không gây ảnh hưởng đến sưc khỏe người tiêu dùng. Bên cạnh đó

phương pháp điện di mao quản có lợi thế: tách tốt, hiệu quả về mặt kinh tế (dung môi, hệ

đệm, mẫu chi phí thấp). Nếu có thể, tôi mong tiếp tục nghiên cứu xác định đồng thời các

chất khác thuộc nhóm đường hóa học.



KIẾN NGHỊ

- Ứng dụng rộng rãi hơn nữa định lượng các loại đường trong các loại đồ uống,

nước giải khát…trong công tác kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm tại các cơ sở sản

xuất và các trung tâm kiểm nghiệm nhằm tiết kiệm thời gian, chi phí và góp phần bảo vệ

môi trường.

- Mở rộng nghiên cứu sử dụng điện di mao quản để tách thêm các loại đường hóa

học, chất bảo quản, phụ gia, phẩm màu…ở trên các mẫu nước giải khát và môt số mẫu

khác như dược phẩm, mỹ phẩm, bánh kẹo…để có thể đưa ra một phương pháp có nhiều

ưu điểm có khả năng ứng dụng cao trong các ngành.

- Đề nghị các nhóm nghiên cứu sau nghiên cứu thêm về qui trình rửa giải khi chạy

điện di đối với các mẫu có thành phần phức tạp. Đồng thời nghiên cứu để tìm ra các chất

nội chuẩn nhằm nâng cao độ chính xác và độ nhạy cung như khả năng thu hồi của phương

pháp.

- Do thời gian có hạn và điều kiện không cho phép nên việc khảo sát vẫn chưa

được tiến hành toàn diện đầy đủ. Vì vậy chúng tôi cũng đề nghị các nhóm nghiên cứu sau

nghiên cứu khảo sát thêm các điều kiện và các yếu tố ảnh hưởng để đưa ra qui trình phân

tích tối ưu nhất.



TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Nông Minh Dũng, Nguyễn Văn Ri, Phạm Luận (2002), “ Tách và xác định các

NTĐH bằng phương pháp điện di mao quản”, Tạp chí hoá học phân tích, (23), tr

10-12.

2. Lê Hoàng (2006), “ Xác định phụ gia thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao”, Luận văn thạc sĩ khoa học, Khoa Hóa học, Đại học Khoa học Tự

nhiên Hà Nội.

3. Đặng Thu Hiền (2009), “ Xác định hóa chất bảo vệ thực vật Carbamat trong một

số kim loại rau quả bàng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ”. Trường Đại học

Khoa học Tự Nhiên.

4. Trần Tứ Hiếu, Từ Vong Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hoá

học phân tích- phần 2- Các phương pháp phân tích công cụ, NXB Đại học quốc

gia Hà Nội

5. Trần Tứ Hiếu, (2003), “Phân tích trắc quang phổ hấp thụ UV-VIS”, Nhà Xuất Bản

Đại Học Quốc Gia Hà Nội.

6. Đỗ Lan Hương (2009), “Xây dựng phương pháp định lượng Cefixim trong chế

phẩm và trong huyết tương bằng điện di mao quản”, Trường đại học Dược Hà

Nội.

7. Phạm Luận (1999), “Cơ sở lý thuyết về sắc ký điện di mao quản trong hiệu suất

cao”, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.

8. Trịnh Thị Như Ngọc (2003), “Tách và xác định lượng nhỏ các NTĐH trong uran

bằng phương pháp chiết và điện di mao quản”, khoá luận tốt nghiệp, Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.

9. Tạ Thị Thảo (2005), “Bài giảng chuyên đề thống kê trong hóa phân tích”, Đại học

Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội.

10. Trần Minh Thuý (2003), “Tách và xác định lượng nhỏ các NTĐH trong uran bằng

phương pháp trao đổi ion và điện di mao quản”, Khoá luận tốt nghiệp, Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.

11. Thông tin trên internet:

http://vi.wikipedia.org/wiki/TCVN .(25/08/2011)

http://vi.wikipedia.org/wiki/TCVN



http://thuvienphapluat.vn/Thong-tu-45-2010-TT-BYT-Quy-chuan-ky-thuat-quoc-

gia-san-pham-do-uong-co-con-vb116458t23.aspx (25/08/2011)

TIẾNG ANH

12. Abdolraouf Samadi-Maybodi, S.K. Hassani Nejad Darzi, (2008) “Simultaneous

determination of vitamin B12 and its derivatives using some of multivariate

calibration 1 (MVC1) techniques”, Spectrochimica Acta Part, A701–1172, Pages

1167- 1172.

13. A. Herrmann, E. Damawandi and M. Wagmann J. (1983 ), “Determination of

cyclamate by high-performance liquid chromatography with indirect photometry”,

280(1), Pages 85-90

14. Ana Beatriz Bergamo, Jose Alberto Fracassi da Silva, Dosil Pereira de Jesus

(2010). “Simultaneous determination of aspartame, cyclamate, saccharin and

acesulfame-K in soft drinks and tabletop sweetener formulations by capillary

electrophoresis with capacitively coupled contactless conductivity detection”.

Institute of Chemistry, University of Campinas – UNICAMP, 55: pages 78-88.

15. Andrzej Wasik, Jonh Mc.Court, Manuela Buchgraber (2007). “Simultaneous

determination of nine intense sweeteners in foodstuffs by high performance liquid

chromatography and evaporative light scattering detection—Development and

single-laboratory validation”. European Commission, Retieseweg 111, 2440 Geel,

p 123 – 136

16. B.L.Karger, A.S. Cohen, A.Guttmen, (1989), “High Performance Electrophoresis

in Biological Science”, J. Chromatogr, 492,585-614.

17. Budavari, Susan, ed (1989). “ Aspartame". The Merck Index (11th ed.). Rahway,

NJ: Merck & Co.. p. 859.

18. Catherine O. Thompson, V. Craige Trenerry , Bridget Kemmery. “ Micellar

electrokinetic capillary chromatographic determination of artificial sweeteners in

low-Joule soft drinks and other foods”, Australian Government Analytical

Laboratories, 338-340 Tapleys Hill Road.

19. Conis, Elena, (2011) “Saccharin's mostly sweet following” Los Angeles Times.

December 27, 2010, accessed January 14, p 164 -184.

http://thuvienphapluat.vn/Thong-tu-45-2010-TT-BYT-Quy-chuan-ky-thuat-quoc-gia-san-pham-do-uong-co-con-vb116458t23.aspx

http://thuvienphapluat.vn/Thong-tu-45-2010-TT-BYT-Quy-chuan-ky-thuat-quoc-gia-san-pham-do-uong-co-con-vb116458t23.aspx



20. Da-jin Yang and Bo Chen. (2009). “ Simultaneous Determination of Nonnutritive

Sweeteners in Foods by HPLC/ESI-MS” , , Hunan Normal University, Changsha

410081, China, and National Institute for Nutrition and Food Safety, Chinese

Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100021, China J. Agric. Food

Chem., 2009, 57 (8), pp 3022–3027.

21. David J. Ager, David P. Pantaleone, Scott A. Henderson, Alan R. Katritzky, Indra

Prakash, D. Eric Walters, (1998), "Commercial, Synthetic Nonnutritive

Sweeteners". Angewandte Chemie International Edition 37 (13-24): 1802–17.

22. David N. Heiger, (1992), “ High Performance Capillary Electrophoresis”,

Hewlett Packard Company Pub.

23. Health Canada: "Aspartame - Artificial Sweeteners". http://www.hc-sc.gc.ca/fn-

an/securit/addit/sweeten-edulcor/aspartame-eng.php.

24. Ji C, Sun Y, Li X, Chu X, Chen Z. (2009) “Simultaneous determination of

artificial sweeteners in beverage by ultra performance liquid chromatography”.

Article in Chinese, Se Pu. Jan; 27(1):111-3.

25. Karstadt, Myra.L, "Testing Needed for Acesulfame Potassium, anArtificial-

Sweetener". Food Anal. Methods 5:105-109.

26. Lin, Yu H. Chou, Shin S.Sheu, Fuu Shyu, Yuan Authors, (2009), “Simultaneous

Determination of Sweeteners and Preservatives in Preserved Fruits by Micellar

Electrokinetic Capillary Chromatography”, Source: Journal of Chromatographic

Science, Volume 38, Number 8, August 2000, pp. 345-352(8)

27. L. F. Capitán-Vallveya, M. C. Valencia

a & E. Arana Nicolás (2007). “Flow-

through spectrophotometric sensor for the determination of saccharin in low-

calorie products”, Available online: 20 Feb 2007, Pages 32-41

28. Miguel A. Cantarelli, Roberto G. Pellerano, Eduardo J. Marchevsky, José

M. Camiña (2009). “Simultaneous determination of aspartame and acesulfame-K

by molecular absorption spectrophotometry using multivariate calibration and

validation by high performance liquid chromatography”. Universidad Nacional de

San Luis, Chacabuco y Pedernera, 5700 San Luis, Argentina, p 1664-1778.

29. M.C. Boyce, (1999) ”Simultaneous determination of antioxidants, preservatives

and sweeteners permitted as additives in foods by mixed micellar electrokinetic

chromatography”, J. Chromatogr, A, 847(1-2),369-375.

http://www.ingentaconnect.com/content/pres/jcs;jsessionid=8hbouobjgskeg.victoria



http://www.tandfonline.com/action/doSearch?action=runSearch&type=advanced&result=true&prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Capit%C3%A1n%5C-Vallvey%2C+L.+F.%29

http://www.tandfonline.com/action/doSearch?action=runSearch&type=advanced&result=true&prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Valencia%2C+M.+C.%29

http://www.tandfonline.com/action/doSearch?action=runSearch&type=advanced&result=true&prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Nicol%C3%A1s%2C+E.+Arana%29



30. Newton, David E, (2007), “Food Chemistry (New Chemistry)”. New York: Facts

on File. pp. 69.

31. Natalia E. Llamas & María S. Di Nezio & Miriam E. Palomeque & Beatriz S.

Fernández Band, (2008), “Direct Determination of Saccharin and Acesulfame-K

in Sweeteners and Fruit Juices Powders”, Food Anal. Methods 1:43–48

32. Rainer Schuster, Angelika Gratzfeld-Hüsgen “CZE analysis of artificial

sweeteners and preservatives in drinks”, Agilent Technologies.Waldbronn,

Germany.

33. Rowe, Raymond C. (2009). "Aspartame", Handbook of Pharmaceutical

Excipients. pp. 11–12. ISBN 1582120587

34. Orawan Kritsunankul , Jaroon Jakmunee, (2009), “Flow injection on-line dialysis

coupled to high performance liquid chromatography for the determination of some

organic acids in wine”, Talanta, vol.79, no.

35. W.G.Kuhr, (1990), “ Capillary Electrophoresis”, Anal. Chem, 64,398R-40R.

http://www.winebase.info/files.asp?file=10000369.pdf&force=false&meta=HPLC,%20Thailand,%20malolactic%20fermentation,%20tropical%20fruit%20wine,%20grape%20wine,%20quality%20control&title=Flow%20injection%20on-line%20dialysis%20coupled%20to%20high%20performance%20liquid%20chromatography%20for%20the%20determination%20of%20some%20organic%20acids%20in%20wine





PHỤ LỤC

1. Khảo sát loại đệm

(1a) (1b)

min1 2 3 4 5 6 7 8 9

Norm.

0

10

20

30

40

50

60

70


3.8

30

8.3

91

9.3

80

pH=6

min1 2 3 4 5 6 7 8 9

Norm.

0

20

40

60

80

100

120


4.5

71

6.8

50

7.4

60

pH=9

(1c) (1d)

min1 2 3 4 5 6 7 8 9

Norm.

-2.5

0

2.5

5

7.5

10

12.5

15


4.3

74

pH=7.5

(1e)

Điện di đồ hỗn hợp (asp, sac, ace-k) 40 ppm đối với các hệ đệm khác nhau trong điều

kiện ( L=65 cm, I=50mA, V=25 kV, áp suất 50 mbar, t=25oC), cụ thể:

- Đệm photphat 20 mM, pH 3,0 (1a và 1b) và pH 7,5 (1e)

- Đệm acetat 20 mM, pH 6,0 (1c)

- Đệm borat 20 mM, pH 9,0 (1d)



2. Khảo sát pH đệm

min1 2 3 4 5 6 7 8 9

Norm.

0

20

40

60

80

100

120


4.5

71

6.8

50

7.4

60

pH=9

(2a) (2b)

min1 2 3 4 5 6 7 8 9

Norm.

0

20

40

60

80

100


4.5

36

6.8

60

7.5

27

pH=9.5

(2c) (2d)

Điện di đồ hỗn hợp (asp, sac, ace-k) 40 ppm khi điện di với đệm borat 20 mM ở các

điểm pH khác nhau ( pH 8,5 –2a, pH 9,0 – 2b, pH 9,5 – 2c, pH 10,0– 2d) trong điều

kiện( L=65 cm, I=50mA, V=25 kV, áp suất 50 mbar, t=25oC),



3.Khảo sát nồng độ đệm

min1 2 3 4 5 6 7 8 9

Norm.

0

20

40

60

80

100

120

DAD1 E, Sig=215,5 Ref=off (MIXDUONG HH\MIX40000096.D)

4.4

71

6.4

96

7.0

13

Borate 15mM pH=9.5

min1 2 3 4 5 6 7 8

Norm.

0

20

40

60

80

100

120


4.5

89

6.8

12

7.4

13

Borate 20mM pH=9.5

(3a) (3b)

min1 2 3 4 5 6 7 8

Norm.

0

20

40

60

80

100


4.7

77

7.4

12

8.1

71

Borate 25mM pH=9.5

(3c) (3d)

Điện di đồ hỗn hợp (asp, sac, ace-k) 40 ppm khi điện di với đệm borat pH 9,5 ở các

nồng độ ( 15 mM – 3a, 20 mM –3b, 25 mM – 3c, 30 mM – 3d) trong điều kiện

(L=65cm)( L=65 cm, I=50 mA, V=25 kV, áp suất 50 mbar, t=25oC),



4. Khảo sát nhiệt độ

(4a) (4b)

Điện di đồ của hỗn hợp (asp, sac, ace-k) 40 ppm ở nhiệt độ ( t = 30oC –4a,

t = 20oC –4b) trong điều kiện ( L=65 cm, I=50mA, V=25 kV, đệm borat 20 mM,

pH 9,5 và áp suất 50 mbar, t=25oC)

5. Khảo sát điện thế

(5a) (5b)



(5c)

Điện di đồ của hỗn hợp (asp, sac, ace-k) 40 ppm ở điện thế

( V =20 kV – 5a, V = 25 kV –5b, V = 30 kV) trong điều kiện ( L=65 cm, I=50mA,

V=25 kV, đệm borat 20 mM, pH 9,5 và áp suất 50 mbar, t=25oC),

6. Khảo sát bƣớc sóng định lƣợng các chất

(6a) (6b)

(6c)



Điện di đồ của hỗn hợp (asp, sac, ace-k) 40 ppm ở các bước sóng khác nhau

( λ = 195,5 nm – 6a; λ = 210,5 nm –6b; λ = 230,5 nm –6c) trong điều kiện (L = 65 cm,

I = 50mA, V = 25 kV, đệm borat 20 mM, pH 9,5 và áp suất 50 mbar,t = 25oC).

7.Khảo sát các chất gây ảnh hƣởng

Ảnh hưởng của chất bảo quản lên thời gian của Ace-K, Sac, Asp.

CAx.Ben

(ppm)

tAsp

(phút)

Sai

số(%)

tSac

(phút)

Sai

số(%)

tAce-K

(phút)

Sai

số(%)

0 2,926 4,352 4,743

10,76 2,905 -0,7 4,318 -0,8 4,685 -1,2

21,52 2,906 -0,8 4,146 -4,7 4,705 -0,8

43,04 2,915 -3,8 4,137 -4,9 4,754 0,2

CAx.Sor

(ppm)

tSac

(phút)

Sai

số(%)

tSac

(phút)

Sai

số(%)

tAce-K

(phút)

Sai

số(%)

0 2,926 4,352 4,743

11,52 2,902 -0,8 4,315 -0,9 4,701 -0.9

23,04 2,887 -1,3 4,298 -1,2 4,697 -1,0

46,08 2,849 -2,6 4,257 -2,2 4,686 -1,2



Ảnh hưởng của đường Glucose, Fructose, Cyclamate và

Saccharose lên thời gian lưu của Ace-K, Sac, Asp.

CGlu

(ppm)

tAsp

(phút)

Sai

số(%)

tSac

(phút)

Sai

số(%)

tAce-K

(phút)

Sai

số(%)

0 2.926 4,352 4,743

23,12 2,894 -1,1 4,3 -1.20 4,687 -1,1

46,24 2,910 -0,6 4,332 -0.50 4,785 0,9

138,7 2,966 1,4 4,453 2.31 4,822 2,9

CFruc

(ppm)

tAsp

(phút)

Sai

số(%)

tSac

(phút)

Sai

số(%)

tAce-K

(phút)

Sai

số(%)

0 2,926 4,352 4,743

21,52 2,884 -1,4 4,365 0,29 4,778 0,7

43,04 2,921 -0,2 4,398 1,06 4,802 1,2

129,12 2,915 -0,4 4,366 0,32 4,955 4,5

CCyc

(ppm)

tAsp

(phút)

Sai

số(%)

tSac

(phút)

Sai

số(%)

tAce-K

(phút)

Sai

số(%)

0 2,926 4,352 4,743

20,00 2,924 0,1 4,423 1,62 4,803 1,21

50,00 2,935 0,3 4,455 2,30 4,859 2,40

100,00 2,956 1,0 4,501 3,42 4,988 5,12

CSacch

(ppm)

tAsp

(phút)

Sai

số(%)

tSac

(phút)

Sai

số(%)

tAce-K

(phút)

Sai

số(%)

0 2,926 4,352 4,743

20,90 3,021 3,2 4,406 1,2 4,738 0,1

41,80 3,053 4,3 4,413 1,4 4,756 0,3

125,40 3,132 7,0 4,568 5,0 4,792 1,0



Ảnh hưởng của các chất phẩm màu Tartara, Brilliant, Sunset và Qui

tới thời gian lưu của Ace, Sac, Ace-K

CTarta

(ppm)

tAsp

(phút)

Sai

số(%)

tSac

(phút)

Sai

số(%)

tAce-K

(phút)

Sai

số(%)

0 2,926 4,352 4,743

12,16 2,895 -1,0 4,342 -0,2 4,748 0,1

24,32 2,912 -0,5 4,306 -1,0 4,795 1,1

48,64 2,885 -1,4 4,298 -1,2 4,821 -1,6

CBrill

(ppm)

tAsp

(phút)

Sai

số(%)

tSac

(phút)

Sai

số(%)

tAce-K

(phút)

Sai

số(%)

0 2,926 4,352 4,743

9,28 2,932 0,2 4,361 0,2 4,749 0,1

18,56 2,937 0,4 4,377 0,6 4,757 0,3

111,40 2,940 0,5 4,435 1,9 4,823 1,7

CSun

(ppm)

tAsp

(phút)

Sai

số(%)

tSac

(phút)

Sai

số(%)

tAce-K

(phút)

Sai

số(%)

0 2,926 4,352 4,743

16,88 2,989 1,0 4,409 1,3 4,802 1,2

33,76 3,076 5,1 4,458 2,4 4,865 2,6

67,52 3,198 9,3 4,635 6,5 4,934 4,1

CQui

(ppm)

tAsp

(phút)

Sai

số(%)

tSac

(phút)

Sai

số(%)

tAce-K

(phút)

Sai

số(%)

0 2,926 4,352 4,743

14,28 2,995 2,3 4,389 0,9 4,756 0,3

28,56 3,123 6,7 4,441 2,0 4,822 1,7

57,12 3,189 8,9 4,535 4,2 4,881 2,9



min1 2 3 4 5 6

mAU

-5

0

5

10

15

20

25

30


Ace-K

Sac

Ben

Asp

Area: 9.07688

2.9

08

Area: 29.5062

4.1

47

Area: 60.1925

4.3

19

Area: 28.6303

4.7

07

min1 2 3 4 5 6

mAU

-5

0

5

10

15

20

25

30

35


Asp

Sac

Ace-K

Ben

Area: 8.49297

2.9

06

Area: 57.9875

4.1

53

Area: 61.3105

4.3

19

Area: 29.1757

4.7

05

(7a) (7b)

min1 2 3 4 5 6

mAU

-5

0

5

10

15

20

25

30

35


Area: 9.24844

2.9

03

Area: 32.7864

3.7

86

Area: 61.7908

4.3

16

Area: 31.7789

4.7

00

Ace-K

SacAsor

Asp

min1 2 3 4 5 6

mAU

0

5

10

15

20

25

30

35


Ace-K

SacBen

Asor

Asp

Area: 8.28048

2.8

88

Area: 32.6973

3.7

61

Area: 30.2541

4.1

16

Area: 61.9139

4.2

86

Area: 30.128

4.6

69

(7c) (7d)

min1 2 3 4 5 6 7

mAU

-5

0

5

10

15

20

25

30


Sac

Ace-K

Tatarin

QuiAsp

Area: 9.13356

2.8

84

Area: 61.516

4.2

83

Area: 30.5484

4.6

67

Area: 36.2287

5.2

35

Area: 35.1706

5.8

94

min1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

5

10

15

20

25

30


Tatarin

Ace-k

Sac

Asp

Area: 8.42863

2.8

96

Area: 59.7072

4.3

06

Area: 30.4066

4.6

95

Area: 26.9565

5.2

31

(7e) (7f)



min1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

5

10

15

20

25

30


Ace-K

Sac

Asp

Area: 9.0273

2.9

11

Area: 59.1757

4.3

33

Area: 30.0396

4.7

24

min1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

5

10

15

20

25

30


Tata

Qui

Ace-K

Sac

Cyc

Asp

2.9

39

3.4

70

4.3

92

4.7

95

5.3

76

6.2

06

(7g) (7h)

min1 2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

5

10

15

20

25

30


Brill

Qui

Tata

Ace-K

Sac

Cyc

Asp

2.0

17

Area: 8.5733

2.9

40

Area: 8.36935

3.4

73

Area: 61.9834

4.3

92

Area: 30.6439

4.7

95

Area: 60.5791

5.3

85

Area: 160.976

6.2

09

Area: 20.3756

9.5

70

min1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

10

20

30

40

50

60


Sac

Ace

Cyc

Asp

Ben

Asor

Tata

Qui

Sun

Area: 8.72509

2.9

39

Area: 6.40023

3.4

66

Area: 118.872

3.8

74 A

rea: 118.615

4.2

31

Area: 62.1616

4.3

88

Area: 30.0954

4.7

83

Area: 7.33305

4.9

00

Area: 147.872

5.5

51

Area: 137.589

6.1

81

(7i) (7k)

Điện di đồ của hỗn hợp các chất chuẩn khi thêm các chất gây ảnh hưởng

trong điều kiện điện di ( L = 56 cm, I = 50mA, V = 25 kV, đệm borat 20 mM,

pH 9,5 và áp suất 50 mbar, t = 25oC)

- Hình (7a), hình (7b): Sắc đồ hỗn mix chuẩn thêm axit Benzoic nồng độ 10,76 ppm

và 21,52ppm.

- Hình (7c): Sắc đồ hỗn mix chuẩn thêm axit Sorbic nồng độ 11,52 ppm

- Hình (7d): Sắc đồ hỗn mix chuẩn thêm axit Benzoic 10,76 ppm và axit Sorbic

11,52 ppm

- Hình (7e): Sắc đồ hỗn mix chuẩn thêm Tarta 12,16 ppm, Quil 14,28 ppm, Sun

16,88 ppm, Brill 12,16 ppm.



- Hình (7f): Sắc đồ hỗn mix chuẩn thêm Tarta 12,60 ppm nồng độ

- Hình (7g): Sắc đồ hỗn mix chuẩn thêm Glu 23,12 ppm, Fruc 21,52 ppm, Cyc 20

ppm, Sacch 20,9 ppm.

- Hình (7h): Sắc đồ hỗn mix chuẩn thêm Glu 46,24 ppm, Fruc 43,04 ppm, Cyc 50

ppm, Sacch 41,08 ppm, và Tarta 12,16 ppm, Quil 28,56 ppm, Sun 33,66 ppm, Brill 24,32

ppm.

- Hình (7i): Sắc đồ hỗn mix chuẩn thêm Glu 46,24 ppm, Fruc 43,04 ppm, Cyc 50


ppm.

- Hình (k): Sắc đồ hỗn mix chuẩn thêm Glu 46,24 ppm, Fruc 43,04 ppm, Cyc 50


ppm cùng với axit Ben 43,04 ppm, axit Sor 46,08 ppm.

8. Phân tích mẫu thực tế trong điều kiện điện di ( L= 56 cm, I=50mA, V=25 kV, đệm

borat 20 mM, pH 9,5 và áp suất 50 mbar, t = 25oC, thời gian tiêm mẫu 5s)

min1 2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

20

40

60

80

100


Area: 5.76154

2.8

12

Area: 5.81344

4.3

28

Area: 10.5497

4.6

98

min1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Area: 16.8135

2.8

14

Area: 81.9317

4.4

03

Area: 55.8331

4.7

58

Ace-K

Sac

Asp

(8a) (8b)

Điện di đồ mẫu Samurai (8a) và mẫu Sammurai thêm tiêu chuẩn(8b)

( Aspartame 21,6 ppm, Sac 21,52 ppm, Acesulfame-K 24,24 ppm)



min1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

5

10

15

20

25

30

35

40


Area: 10.8435

3.2

62

Area: 5.29255

4.9

75

Area: 6.41053

5.6

11

Asp

SacAce-K

min1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

10

20

30

40

50

60


Area: 33.3146

3.3

26

Area: 121.545

5.0

50

5.4

55

Area: 83.8221

5.5

65

Ace-K

Sac

Asp

(8c) (8d)

Hình 3.16. Điện di đồ mẫu Sprite (8c) và mẫu Sprite thêm tiêu chuẩn(8d)


min1 2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

20

40

60

80


Area: 7.91637

4.2

23

min1 2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

10

20

30

40

50


Area: 14.7764

3.0

81

Area: 80.0133

4.5

42

Area: 49.9617

4.9

54

Asp

Sac

Ace

(8e) (8f)

Điện di đồ mẫu Lemon C2 (8e) và mẫu Lemon C2 thêm tiêu chuẩn (8f)




min1 2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

2.5

5

7.5

10

12.5

15

17.5


Area: 5.10783

3.0

06

min1 2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

10

20

30

40

50


Area: 11.4138

3.0

43

Area: 77.5035

4.5

66

Area: 50.8722

4.9

80

(8g) (8h)

Hình 3.18. Điện di đồ mẫu Coca Cola (8g) và mẫu Coca Cola thêm tiêu chuẩn(8h)


min1 2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

10

20

30

40

50

60


min1 2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

10

20

30

40


Area: 9.63681

3.0

80

Area: 77.4212

4.5

89

Area: 46.492

5.0

05

(8i) (8k)

Hình 3.19. Điện di đồ mẫu Trà xanh Oo (8i) và mẫu Trà xanh O

o thêm tiêu chuẩn (8k)(

Aspartame 21,6 ppm, Sac 21,52 ppm, Acesulfame-K 24,24 ppm)

Ứng dụng kỹ thuật sắc ký điện di mao quản phân tích acesulfame-k, saccharin,...

Documents