ultrastructure du mucus (cellules caliciformes du côlon) et des granulations des mastocytes du...

Histochemie 30, 40--59 (1972) �9 by Springer-Verlag 1972

Uhrastructure du mucus (cellules caliciformes du c61on) et des granulations des mastocytes du c61on*

A n i s o t r o p i e - - M f i t a c h r o m a s i e - - M i c r o s c o p i e ~ l e c t r o n i q u e

J . P . Musy , 1 ). S p r u m o n t , L. Mod i s e t V. de B l a s i

Ins t i tu t d'Histologie et d 'Embryologie g6n6rale de l 'Universit6 de Fribourg/Suisse (directeur: Prof. G. Conti), Ins t i tu t d 'Anatomie de l 'Universit6 de Fribourg/Suisse

(direeteur: Prof. A. Failer) et Ins t i tu t d 'Anatomie de l 'Universit6 de Debrecen, Debrecen/Hongrie (directeur: Prof. St. Krompecher)

Regu le 29 janvier 1972

U l t r a s t r u c t u r e of M u c u s in G o b l e t Cells a n d of G r a n u l e s of M a s t o c y t e s in Co lon

Anisotropy, Metachromasia and Electron Microscopy

Summary. The authors have investigated the birefringence of the colic mucus in the guinea pig, the ra t and the rabbi t before and after of metachromatical staining with toluidine blue and with acridines. They demonstrate a positive birefringence of the extracellular mucus. The granulations of the mast cells in the same animals are anisotropic. The anisotropy can be seen in the mucus and in the granulations of the mast ceils after a combined fixation and staining with a mixture of glutaraldehyde and Alcian blue or Alcian green. The birefringence of the extracellular mucus also remains positive with these phtalocyanin dyes. Using the electron microscope, the authors demonstrate, by means of Alcian blue, a filamentous structure with a parallel orientat ion in the mucus while it flows out of the cells. The same method allows the vizualisation of a heterogenous aspect in the granulations of the mast ceils. They discuss the theoretical aspects of the metachromatical reaction in relation with the anisotropy of a structure.

Rdsum~. Les auteurs ont 6tudi6 la bir6fringence du mucus du c61on chez le rat , le cobaye et le lapin, au moyen des colorations m6tachromatiques au bleu de toluidine et aux acridines. Ils d6montrent une bir6fringence positive du mucus extracellulaire. Les granulations des mastocytes, dans le m~me ma~riel , sont anisotropes. L'anisotropie du mucus et des granulations des mastocytes est pr6sente apr6s fixation-coloration simultan~e au bleu Alcian et au vert Alcian. La bir6fringence du mucus extracellulaire reste 6galement positive avec les phtalocyanines. En microscopic 61ectronique, les auteurs d6montrent, s l 'aide du bleu Alcian, une structure filamenteuse parall~le du mucus s '6chappant de la cellule. Un aspect h6t6rog~ne des granulations des mastocytes est aussi mis en 6vidence par cette m6thode. Ils discutent l 'aspect de la r~action m6tachromatique en fonction de l 'anisotropie d 'une structure.

Introduction

Le m i c r o s c o p e p o l a r i s a n t p e r m e t d e p u i s l o n g t e m p s d6 js de r e c o n n a i t r e u n e

o r g a n i s a t i o n u l t r a s t r u c t u r a l e e n biologie . B e a u c o u p de d o n n 6 e s o b t e n u e s a in s i o n t

6t6 e n s u i t e c o n f i r m 6 e s p a r le m i c r o s c o p e 61ec t ron ique o u p a r la d i f f r a c t i o n des

* Nous remercions vivement le Prof. G. Romhs de l 'Universit6 de Pecs (Hongrie) d 'avoir bien voulu examiner nos pr6parations et de nous avoir conseill6 dans l'61aboration de ce travail.

Nous remercions sinc~rement le Dr. J. E. Scott du Canadian Red Cross Memorial Hospital, Taplow, Maidenhead, Berks (Angleterre) d 'avoir examin6 nos courbes spectrophotem6triques du bleu Alcian-h6parine et de nous avoir donn6 son avis.

Ce travail a 6t6 partiellement r6alis6 grace au er6dit no 3. 141.69 du Fonds National Suisse pour le D6veloppement de la Recherche Scientifique.

Ultrastructure, anisotropie et m6tachromasie du mucus 41

rayons X. Dans certains cas, le microscope polarisant permet m6me de d6terminer l 'orientation de particules submicroscopiques qui peuvent ne pas apparaitre au microscope 61ectronique (Finean, 1967). I1 existe 2 possibilit6s d'6tude de l 'ultrastructure au moyen du microscope polarisant : a) l 'cxamen de mat6riel non color6 permet de tirer des conclusions sur la bir6fringence proprc ou de forme; b) l'utilisation de m6thodes de coloration d6nomm6es dichroiques (Ambronn, 1888), des r6actions topochimiques (Schmidt, 1947) ou des r6actions topo-optiques (Rom- hhnyi, 1963). Dans ces cas, et au moyen d'une coloration sp6cifique, il est possible de faire une analyse structurale s61ective d'une mol6cule tissulairc d6finie. C'est le cas, par exemple, de l 'organisation des complexes macromol6culaires de la substance fondamentale en rapport avec le collag~ne. Ce dernier peut ~tre 6tudi6 par la r6action au ph6nol et les mucopolysaccharides par les r6actions m6tachromatiques anisotropes (Romh~nyi, 1963; Vidal, 1963, 1965, 1970; Modis et coll., 1970; Modis et coll., 1971). I1 s'agit, en g6n6ral, de colorants m6tachromatiques (Rom- h~nyi, 1963; Scheuner et coll., 1967; Scheuner, 1968) ou encore de colorants fluorescence m6tachromatique du groupe des acridines (Scheuner, 1968).

En investiguant les bases structurales de la r6action m6tachromatique, Rom- hhnyi (1963) pense quc la bir6fringence d'une structure m6tachromatique est due

la disposition des mol6cules de colorant sur les chromotropes tissuIaires orient6s. C'est aussi l 'avis de Missmahl (1964) et de Vidal (1963, 1965). Pour ces auteurs, une structure m6tachromatique n'est pas amorphe. Pour d 'autrcs (Scheuner et coll., 1970, 1971), la m6tachromasie et l 'anisotropie d'une structure ne sont pas des ph6nombnes en corr61ation, mais simplement coexistants. Pour ces auteurs donc, une structure m6tachromatique n 'est pas forc6ment anisotrope.

Nous avons toujours 6t6 frapp6s par la r6action m6tachromatique tr6s intense du mucus des cellules caliciformes du cSlon et des granulations des mastocytes. Si l 'on s'en tient aux observations de Romh~nyi (1963), ces 2 616ments cellulaires devraient 6tre anisotropes. A notre connaissance, il n'existe que peu d'6tudes concernant l 'anisotropie de ces structures. White et coll. (1954) d6montrent une bir6fringcnce positive dans les fibres de muco-prot6ines des s6cr6tions bronchiques. Romhhnyi (1963) note que los s6cr6tions 6pith61ialcs sont anisotropes apr6s coloration m6tachromatique. Quant aux granulations des mastocytes, elles nc seraient pas anisotropes d'apr6s Scheuner (1971). Selye (1965) cite une anisotropie du cytoplasme, mais pas des granules des mastocytcs apr6s coloration au bleu de toluidine et au rouge neutre.

Gyenge et coll. (1965) montrent, au moyen de r6actions topo-optiques, que l 'h6parine est orient6e dans les granulations des mastocytes. L'action de la trypsine lib6rant l 'h6parine de la prot6ine augmente l 'anisotropie des granules apr6s coloration.

En microscopic 61ectronique, Sandborn (1970) d6crit une structure fibrillaire dans le mucus s '6chappant des cellules caliciformes du c61on apr6s post-fixation

l 'osmium. Sprumont et coll. (1971), apr~s t ra i tement des blocs de c61on au zirconium, font la m6me constatation. Neutra et Leblond (1966), Wetzel et coll. (1966), Shearmann et coll. (1960) d6crivent des globules de mucus, mais sans y mettre en 6vidence des structures fibrillaires. Behnke et coll. (1970), apr6s incorporation de bleu Alcian h u n fixateur ald6hydique, identifient des granules de mucus ayant nn aspect h6t6rogbne. Les granulations des mastocytes ehez le rat

42 J.P. Musy, P. Sprumont, L. Modis et V. de Blast :

e t la souris sont d6crites comme des format ions soit f inement granulaires, soit

denses et homog6nes (Combs, 1966; Ginsburg, 1967; Selye, 1965). Pihl (1970)

montre, cependant , une t rame fibreuse dans les granules isol6s des mastocytes au

moyen de rouge de ruth6nium. Cette s t ruc ture ne serait pas mise en 6vidence

par les m6thodes conventionnel les de f ixat ion ct de contraste.

I1 nous a sembl6 int6ressant de ten te r de pr6ciser l ' u l t ras t ruc ture du mucus et

des granula t ions des mas tocytes en combinant les m6thodes opt iques de micro-

scopies ~ polarisat ion et 61ectronique. Wetze l et coll. (1966) se sont efforc6s de

met t re en 6vidence une s t ructure fine au n iveau des mucines, au moyen de fer

ionique.

I1 ne suffit pas, en effet, de d6montrer h i s toch imiquement la pr6sence d 'un

complexe tel que le mucus et d ' ident i f ier ses diff6rents const i tuants par autoradio-

graphie (Neutra et coll., 1966) ou par analyse biochimique (Kent et coll., 1963)

pour d6terminer les propri6t6s biophysiques de ses macromol6cules. C'est aussi

l 'opinion de Vidal (1965) ~ propos des mucopolysacchar ides du collag6ne.

Materiel et m~thodes

I. Anisotropie et mdtachromasie

Pour cette ~tude, on emploie des coupes ~ cong61ation de cSlon de rat, de cobaye et de lapin. Le rectosigmoide est pr~lev~ imm~diatement apr~s la mort par traumatisme cr~nien. Des fragments sont congel~s au moyen de C02 sur une platine appropride. Les coupes sont effectu~es au moyen du (~Kryostat Linde-Dittes ~) (Heidelberg) ~ une ~paisseur de 10 ~z.

On n'utilise pas de coupes de tissu inclus en paraffine: a) afin d'~viter une bir~fringence artificie|le due ~ des testes de paraffine (Vlachos, 1968); b) pour 4viter une solubitisation de la partie polysaccharide du mucus dans les alcools de d~shydratation et dans l'eau (Pearse, 1968; Montgomery, 1970) entrainant souvent une diminution de la m~tachromasie (Pearse, 1968).

1) Lames sans traitement: certaines lames sont examinees sans aucune fixation, ni coloration et mont~es en Uvinert (G. T. Gurr, Londres), afin d'~tudier la bir~fringence propre des structures dans un milieu sans bir~fringence propre.

2) Lames non/ixdes, mats eolordes: ces lames sont color~es au bleu Alcian 8 GS (Serva, Heidelberg) s 1% h pH 1,1, en HCI 0,1 N, pendant 2--5 minutes. Elles sont rinc~es rapidement ~ l'HC1 0,1 N, et mont~es en ((Uvinert)). Parall~lement, d'autres lames sont color~es au bleu de toluidine 0 (Merck, Darmstadt) s 0,1% en HC1 0,1 N, s pH 1,1, rinc~es rapidement

]'HCI 0,1 N e t mont~es en Uvinert. 3) Lames/ixdes et colordes: a) Fixation: (alcool-formol (9:1) (Pearse, 1968), bromure de cetyltrimethylammonium-

forrnol (Pearse, 1968), chlorure de cetylpiridinum-formol (Pearse, 1968), liquide de Carnoy (Ronmis, 1968), glutarald~.hyde 2% en tampon phosphate 0,1 M, pH 7,2.

Les temps de fixation varient de 2 minutes ~ 4 heures s 4~ Les coupes sont ensuite rapidement rinc~es ~ l'eau distillge et color~es. Pour le bleu Alcian et le vert Alcian, on proc~de ~ une fixation-coloration combin~e d'apr~s Behnke et coll. (1970). l,a technique est d~crite plus loin.

b) Coloration et montage. Bleu de toluidine 0 (Merck, Darmstadt) 0,1% aux pH de 1,2, 4,1, 5,2 et 6,9 dans les tampons appropri~s (Arnold, 1968). Pour le pH de 1,2, le bleu de toluidine est dissous dans l'HC1 0,1 N. Les temps de coloration varient de 2 s 10 minutes. Dans certains cas, on effectue la r~action de pr6cipitation selon Romhs (1963) (KI 2% dans H20, 6 parties - - KaFe(CN)e, 2 % dans H~O, 1 pattie). Les coupes sont ensuite s~ch~es entre 2 buvards et mont~es en gomme arabique. D'autres coupes sont simplement rinc~es dans la solution de mSme pH et mont~es en Uvinert (G. T. Gurr, Londres).

Bleu de dimdthylmdt)~yl~ne (Serva, Heidelberg) 0,1% dans H~O au pH de 5,8. La technique est identique h celle du bleu de toluidine, sans precipitation.

Ultrastructure, anisotropie et m~tachromasie du mucus 43

Bleu Alcian (G. T. Gurr, Londres) et bleu Alcian 8 GS (Serva, Heidelberg) le colorant est dissous dans le f ixateur selon les modalit~s suivantes: pH 1,1 bleu Alcian 1%, glutarald4- hyde 2% en HC1 0,1 N, pH 2,9 hleu Alcian 1%, glutarald~hyde 2% en H20, pH 4,6 et 5,2 bleu Alcian 1%, glutarald~hyde 2% en tampon ac6tate 0,1 M, pH 7,2 bleu Alcian 1%, glutaral- d~hyde 2% en tampon phosphate 0,1 M.

Les temps de fixation-coloration varient de 10 minutes ~ 2 heures ~ 4~ Les coupes sont rinc~es dans le t ampon au m6me pH et mont~es en gomme arabique. D'autres coupes sont d6shydrat~es dans des alcools de concentration croissante, pass~es au xylol et mont4es en Uvinert .

Vert Alcian 8 GX: le colorant est dissous s la concentration de 1% dans du glutarald~hyde 2% dans l 'ean distill~e. Le pH final du m~lange est de 2,8. Les lames sont ensuite trait~es comme avec le bleu Alcian.

Colorants fluorescents: ils sont dissous dans l 'eau distill~e, le pH final de la solution ~tant d~termin~ ensuite.

Les colorants sont: Acridine Orange (G. T. Gurr, Londres) 0,1%: pH 3,0, Acriflavine (Serva, Heidelberg) 0,1%: pH 2,6, Aurophosphine (E. Gurr, Londres) 0,17/o: pH 4,0, Cori- phosphine (E. Gurr, Londres) 0,1% : pH 4,5, Flavophospine (E. Gurr, Londres) 0,1% : pH 4,3, Rivanol (Hoechst) 4%: pH 8,2, N, N diaethylpseudoisocyanine (Serva, Heidelberg) 0,1%: pH 5,4.

Les temps de coloration varient de 1 s 5 minutes. Les coupes sont ensuite rinc~es rapidement s l 'eau distill~e, mont~es en Uvinert .

4) Rdactions histochimiques de contrdle. Les r~actions se font sur des coupes h cong61ation de c61on de ra t qui sont ensuite fix~es en alcool-formol. Hyaluronidase: testis hyaluronidase (Reanal, Hongrie) 1 mg/2 ml dans tampon phosphate 0,06 M, pH 6,2, 16 heures s 37~ - - Diastase: diastase 0,1% dans tampon phosphate 0,02M, pH6,0 , 60minutes s 37~ - - Neuraminidase: Neuraminidase (vibrio cholerae, B-grade, Calbiochem. Los Angeles)500 unit~s/ ml - - 1 ml de solution est m~lang~ ~ 4 ml de tampon acetate pH 5,2, 24 heures s 37~ - - M~thylation: a) HCI 0,1 N dans m6thanol, 12 heures h 37~ b) HC1 0,1 N dans m6thanol, 24 heures s 60~ - - Apr~s ces diff~rentes r~actions, les lames sont color~es au bleu de toluidine pH 4,1, au bleu de dim~thylm6thylbne pH 5,8, et au bleu Alcian aux pH 2,9 et 4,6.

I I . Examens aux di//drents microscopes photoniques

Les pr4parations sont examinees au moyen d 'un microscope polarisant Wild M21 (Heer- brugg, Suisse) sans analyseur et avec analyseur et polariseur. Ce microscope est ~quip~ d 'un dispositif photographique (~Microautomate~) (Wild) et d 'une lampe s vapeur de Hg HBO 200 (Wild). ] l e s t aussi muni d 'un compensateur de Ehringhaus et de Brace-KShler (difference de marche lambda/20, Carl Zeiss). Les preparations color6es pour la fluorescence sont en ontre examinees au microscope Ortholux Leitz HBO 200 muni d 'une lampe s vapeur Hg et d 'une combinaison de filtres BG et OG pour la lumi~re bleue.

1II . Prdparation pour la microscopie dlectronique

Pour cette ~tude, seuls des recto-sigmoides en provenance de rats blancs ont ~t~ utilis6s. L 'animal est sacrifi4 par t raumat isme crs L'organe est pr~lev~ imm6diatement; il est d4coup~ en blocs d 'environ l mm 3 dans le f ixateur s 4~ dont la composition est la snivante: glutarald~hyde 2% en tampon phosphate 0,1 M contenant 1% de bleu Alcian 8 GS (Serva, Heidelberg), le pH gtant ajust6 s 7,2 (Behnke et coll., 1970). Les blocs restent immerg~s 6 heures dans le f ixateur h 4~ Ils sont ensuite rinc~s s l 'eau distill~e. La moiti6 d 'entre eux est ensuite post-fixge au m~lange chrome-osmium de Dalton pendant 2 heures h 4~ Les blocs sont ensuite d~shydrat~s h l '~thanol et inclus en Araldit (Durcupan, Fluka, Buchs, Suisse) selon la technique habituelle. Ils sont coup~s s l 'ul tra-microtome Sorvall Porter- Blum MT 2, muni de couteaux de verre. Les coupes sont examin6es sur grille nue au moyen d 'un microscope ~lectronique AEI EM 6 B (tensions d'acc61~ration 60--80 kV). Certaines pr4parations ont pu ~tre examinees sans contraste de coupe, d 'autres ont dfi ~tre contrast~es

l 'ac~tate d 'uranyle, au permanganate de potassium ou citrate de plomb alcalin.

44 J.P. Musy, P. Sprumont, L. Modis et V. de Blasi :

I V. Examens spectrophotomdtriques

Au moyen du spectrophotom@tre enregistreur ((Pye Unicam Ultraviolet Spectrophoto- meter SP 1800)) (Cambridge), on a @tabli les courbes d'absorption du bleu Alcian (G.T. Gurr) et du bleu Alcian 8 GS (Serve) & une concentration 10 -6 molaire dens l'eau distill~e, en tenant compte d'un poids mol@culaire du bleu Alcian d'environ 1341 (Gurr, 1960). Le pH de la solution est de 5.

Dens lea m@mes conditions, on a @tabli la courbe du m~lange bleu Aleian-H@parine (((Heparin-Sodium, B. grade~, Calbiochem, Los Angeles) dont le poids mol@culaire est ~valu@

16 000. La concentration finale de l'h~parine dens le bleu Alcian est 10 -8 molaire et le pH de 5. La m@me technique avec lea m~mes concentrations a @t~ employee pour le m~lange vert

Alcian-H~parine.

R~sultats

Les r6sul ta ts sont superposables , quelle que soit l 'esp6ce animale envisag6e et la f ixa t ion utilis6e. I ls sont cxpos6s au Tab leau 1. Les lames sans f ixa t ion ni colora t ion mont ren t , eu microscope polar i sant , une birSfringence faible des cellules caliciformes. Cctte bir6fringence est difficile s pho tograph ie r du fair du peu de contras te . L ' ad jonc t i on du compensa teur de Ehr inghaus p e r m e t la raise en 6vidence, dens le mucus in t racel lu la i re , de zones compens6es en add i t i on ct en sous t rac t ion (fig. no 1). P a r endroi ts , des f i laments de mucus ex t r ace l l uh i r e sont visibles e t pr6sentcnt unc bir6fringence posi t ive d6termin6c au moyen de compensa teu r de Brace-KShlcr ( lambda/20) (Pol icard et coll., 1957). Les lames color6es sans avoi r 6t5 p r6a leb lement fixSes nc sont pas diff6rentes de celles fix6es et color6es, quan t & l 'anisot ropie . Les diff6rentes f ixa t ions n ' in f luencent pas les r6sul ta t s d 'une facon significative. Los lames color6cs au bleu de to lu id ine pr6sentent une m6tachromasic du mucus pe r s i s t an t & t o u s l e s p H testSs. L ' in ten- sit6 de la r6act ion m6tachromat ique augmente 16g6rement avee le pH. Ce dernier ph6nom6nc n ' e s t pas cons tan t et var ie assez souvent d ' u n groupe de cellules & l ' au t re . Au microscope polar i sant , la colora t ion fa i t ressor t i r de mani6re beaucoup plus ne t te la bir6fringence (fig. 3 a e t b). Le signe de la bir6fringence du mucus in t racel lu la i re ne peu t ~tre d6termin6. Pa r contre, le mucus ext racel lu la i re rencon- tr6 f r6quemment dens la lumi6re du c61on donne une bir6fringence posi t ive apr6s colorat ion au bleu de toluidine. Los m@mes r6sul ta ts sont obtenus avec le bleu de d im6thylm6thyl6ne .

Les mas tocy te s des m4mes lames sont 6tudi6s au p H de 1,2 du colorant . Sans colorat ion ou aux p H sup6ricurs, l ' ident i f ica t ion de ces ccllules se r6v61e incer ta ine dans les coupes ~ cong61ation. Au p H de 1,2, les mas tocy te s pr6sentent une forte m6tachromas ie de leurs granules cy toplasmiques . Examin6s au microscope polari- sent , cer ta ins de ces granules sont bir6fr ingents (fig. 5a et b), t andis que d ' au t r e s m o n t r e n t une forte absorp t ion de la lumi6re et appara i s sen t noirs.

Dens les lames color6es et fix6es s imul tan6ment au bleu Alcian, des s t ruc tures diff6rentes appara i s sen t avec l ' a u g m e n t a t i o n du p i t . Comme le bleu de toluidine, ce colorant sui t la loi g6n6ralc de la basophi l ie (Arnold, 1968). Au p H de 1,1, seules sont color6es les granula t ions des mas tocy te s et le m u c u s i n t r a - e t ex t ra- cellulaire (fig. 4 a et 7a). Au microscope polar i sant , le mucus in t racel lu la i re est fo r t emen t an iso t rope s tous los p H (fig. 7b et 8b). Le signe de la bir6fringence ne peu t gtre d6termin6. Dans notre s6rie de pr6para t ions , nous avons pu observer assez f r6quemment des f i laments de mucus t r a ve r s a n t la lumi6re in tes t ina le

Ultras t ruc ture , anisotropie et m6tachromasie du mucus 45

Tableau. 1 Metaehromasie et anisotropie du mucus des cellules et des granulat ions des mas tocytes

Colorant Metachromasie Fluorescence Anisotropie

mucus granu- mucus granu- mucus granu- cell. lations cell. lations cell. lations calici- masto- calci- masto- calei- masto- formes cytes formes cytes formes cytes

Sans fixation, -- - - -- - - -F ? sans coloration

Bleu de toluidine

p H 1,2 -~- d- -- - - + § T + p H 4,1 + ? -- d- -}- ? p H 5,2 + ? - - + + ? p H 5,5 + ? - - + + ? p H 6,9 d- ? -- ~-d- ?

Bleu de dimgthyl- mdthyl~ne

p H 5,8 d- ? -- - - d- -~- ?

Bleu Alcian p H 1,1 . . . . +-~- -~-+ pI-I 2,8 . . . . + + - ~ ? p H 4 , 6 . . . . + -~- -~- ? p H 5,2 . . . . + + + ? p H 7,2 . . . . + + + + ?

Vert Alcian p H 2 , 8 . . . . -~ ~-~- ?

Acridine.Orange

p H 3,0 -- -- -t- -~- d- -~- d- rouge- orange orange

Acriflavine p H 2,6 -- -- + + + +

rouge- orange orange

Aurophosphine p H 4,0 - - -- + + - - d-

orange orange

Coriphosphine

p H 4,5 - - -- + d- + § d- rouge- orange orange

Flavophosphine p H 4,3 -- -- -~- + + d- +

rouge rouge

R ivanol -- -- -~ ? ~- Jr d- ? p H 8,2 verte

IV,N Pseudoisocyanine p H 5,4 -- -- + ? + + + ?

orange

46 J.P. Musy, P. Sprumont, L. Modis et V. de Blasi:

Figs. 1--5

Ultrastrueture, anisotropie et m6tachromasie du mucus 47

(fig. 6a et b). Ces f i laments sont for tement anisotropes et leur bir6fringence est

positive. Les granula t ions des mastocytes sont 6galement anisotropes aprbs coloration

au bleu Alcian s pH de 1,1. Elles on t u n aspect superposable (fig. 4a et b) ~ celui ob tenu apr6s le bleu de toluidine. Aux autres pH, les mastocytes n ' o n t pu ~tre 6tudi6s, ear on ne peut les identifier avec certitude.

La f ixat ion-colorat ion simultan6e au ver t Alcian (pH 2,8) donne des r6sultats superposables s ceux du bleu Alcian au m6me pH. Dans la lumibre de certaines glandes, on peut observer des f i laments de mucus orient6s parall61ement s la lumi6re de la crypte. Ces f i laments pr6sentent une bir6fringence positive. La d6shydra ta t ion apr6s f ixat ion-colorat ion simultan6e au bleu et ver t Alcian ne modifie ni l ' in tensi t6 de la coloration, ni la bir6fringenee.

Les pr6parat ions trait6es par les colorants fluoresccnts faisant part ie du groupe chimique des acridines ont donn6 des r6sultats semblables, bien qu'i ls a ient 6t6 employ6s s des pH tr6s diff6rents. Examin6 en lumibre ul tra-violet te , lc mucus des cellules caliciformes pr6sente une forte fluorescence m6tachromat ique dans les teintes rouge ou rouge-orange sur fond jaune. On peut noter que les fibres collag6nes apparaissent vertes avee cette technique. Seul le Rivanol fait exception et montre une fluorescence verte du mucus. Les granulat ions des mastocytes ont le m~me aspect que le mucus, mais avec une intensi t6 de colora t ion plus marqu6e. Avee le Rivanol , les granula t ions des mastocytes n ' o n t pu 6tre 6tudi6es, car on ne peut identifier ces cellules. La N, N diaethylpseudoisocyanine montrc une fluorescence m6tachromat ique orange trbs intense du mucus.

Fig. 1. Muqueuse colique de rat. Coupe & cong61ation sans fixation ni coloration mont6e en (*Uvinert~), examin6e en lumi6re polaris~e avec adjonetion du compensateur de Ehringhaus. Au niveau de la fl6che la compensation est complbte sur les fibres r6ticul6es au voisinage de la membrane basale, par contre on remarque que le mucus ne peut 8tre compens~ compl~tement.

(20 • 10)

Fig. 2. Cryptes de la muqueuse eolique de rat, en coupe transversale. Coupe s eong61ation, fixation alcool absolu-formol, coloration s l'acridine orange 0,1%, non d6shydratde. On note

une forte bir6fringence du mucus en lumi6re polaris6e. (40 • 10)

Fig. 3. a Muqueuse et partie de la sous-muqueuse de cSlon de rat. Coupe s cong61ation, fixation aleool absolu-formol, coloration au bleu de toluidine 0,1%, pH 4,1, non d6shydrat6e, micro- photo sans analyseur, intense coloration du mucus des cryptes qui par ailleurs est m6ta- chromatique. (20 • 10.) b M~me endroit avec analyseur et polariseur crois6s, la bir6fringence du mucus est trbs intense. Plus faible bir6fringence du collag6ne au niveau de la sous-muqueuse.

(20 • 10)

Fig. 4. a Mastocytes dans la sous-muqueuse colique de rat. Coupe ,~ cong61ation, fixation et coloration simultan6es au m61ange glutarald6hyde-bleu Alcian s pH 1,1. Seules les granulations eytoplasmiques sont color6es. Sans analyseur. (100 • 10.) b M6me eellules photographi6e avec l'analyseur et le polariseur croisbs. La bir~fringence des granulations est bien visible.

(100 x 10)

Fig. 5. a Mastocytes dans la sous-muqueuse de rat. Coupe .~ cong61ation fix6e en alcool absolu- formol et color6e au bleu de toluidine h pH 1,2 photographi~e sans analyseur. Les granulations cytoplasmiques sont color6es et m6tachromatiques. (100 x 10.) b M~me cellule photographi~e avec l'analyseur et le polariseur crois6s. Les granulations sont fortement bir6fringentes

48 J .P . Musy, P. Sprumont, L. Modis et V. de Blasi:

Fig. 6. a Muqueuse colique de rat. Coupe s cong~lation fixation et coloration simultan~es au m~lange glutarald~hyde-bleu Alcian s pH de 2,8 d~shydratde. Des filaments de mucus sont tendus entre les surfaces de la muqueuse. Dans le coin sup~rieur droit on remarque des amas de mucus en surface de l'~pith~lium. Photographi~ sans analyseur. (10 • 10.) b M~me endroit photographi4 avec l'analyseur et le polariseur crois~s. Forte bir~fringence positive des filaments

de mucus et des amas. Bir~fringence plus faible du mucus intracellulaire. (10 • 10)


Les p r6para t ions t ra i t6es aux colorants f luorescents et examin6es au microscope po la r i san t p e r m e t t c n t d ' obse rve r une tr6s for te an iso t ropie du mucus in t ra- et extracel lula i re . Dans cer ta ines p r6para t ions color6es aux acridines, on observe de nombrcux f i laments de mucus dans la lumi~re intes t inale . A ce niveau, l ' an iso t ropie est for te et la bir6fringence posi t ive. Lc mucus in t racel lu la i re est fo r t emen t anisot rope , mais, comme avec les au t res m6thodes de colorat ion, le signe de la bir6fringence ne peu t ~tre d6termin6 (fig. 2). Les m~mes r6sul ta ts sont obtenus au moyen de N, N d iae thy lpseudoisocyanine .

Les digest ions enzymat iques ne modif ien t pas les diff6rentes colorat ions et ne changent pas l ' an i so t rop ie du mucus. Les 2 types de m6thy la t ion employ6s d iminuen t tr~s fo r t emen t le colora t ion du mucus ct font d i spara i t re l ' anisot ropie .

A u microscope 61ectronique, les g ranu la t ions s6cr6trices des cellules calicifor- rues sont bien pr6serv6es apr6s f ixa t ion-colora t ion au bleu Alc ian (fig. 9a). Le mucus se pr6sente sous forme de f i laments . Ceux-ci se d isposent de manibre plus ou moins parall61e dans les gou t t e le t t e s de mucus au m o m e n t oh elles sor ten t des cellules (fig. 9 c) ; s tr6s for t grossissement, ces f i laments de mucus appa ra i s sen t comme des a l ignements de grains opaques aux 61ectrons et don t le d iam6tre moyen est de l 'o rdre de 2,5 n m (fig. 9b). Ces a l ignements fo rmen t des br ins don t la longueur peu t a t t e ind re 500 nm. Les br ins pe uve n t se re jo indre et former des paires. Cet aspec t f i l amenteux typ ique est i nd6pendan t de l ' ac t ion de r o s m i n m pu isqu ' on le re t rouve dans les p r6para t ions t ra i t6es au bleu Alc ian sans post- f ixa t ion osmique.

Dans les mas tocy tes , le n o y a u est fo r t ement contras t6 au microscope 61ectroni- que, de m~me que les g ranula t ions typ iques , apr~s incorpora t ion de bleu Alcian au f ixa teur (fig. 10a). P a r contre, le cy top lasme est r c l a t ivemen t clair. A fort grossissement, l 'opaci t6 des g ranula t ions n ' e s t pas diffuse, mais p rov ien t de l ' aggr6gat ion de n o m b r e u x granules et f i laments (fig. 10b), sans qu ' i l soit possible d ' y reconna i t re avec cer t i tude une quelconque or ien ta t ion part icul i~re.

La courbe d ' ab so rp t i on du bleu Alcian (G. T. Gurr) mon t re un m a x i m u m situ6 622 nm et qui cor respond au m a x i m u m de la courbe ob tenue pa r Sco t t (1970).

La courbc cor respondante du complexe bleu Alcian-h6par ine pr6sente un effet hypsochrome avec un m a x i m u m situ6 s 610 nm.

La courbe d ' a b s o r p t i o n du bleu Alcian 8 GS (Serva, Heidelberg) d6mont re un m a x i m u m d ' a b s o r p t i o n situ6 ~ 630 nm, elle se r approche ~ 1 nm pr6s de la courbe connue pour le bleu Alcian 8 G X (Gurr, 1971). La courbe du complexe bleu

Fig. 7. a Muqueuse colique de rat. Coupe h cong61ation sans fixation, color6e au bleu Alcian pH 1,1, non d6shydrat6e. Coupe transversale au niveau des cryptes. Seul le mucus est

color6. Photographi6 sans analyseur. (40 x 10.) b M6me endroit photographi6 avec l'analyseur et le polariseur crois6s. Forte bir6fringence du mucus mais dont le signe ne peut ~tre d6termin6.

(40 • 10)

Fig. 8. a Surface de la muqueuse colique de rat, coupe ~ cong61ation sans fixation. Coloration au bleu Alcian ~ pH 2,8. Non d6shydratge. A noter la couche de mucus en surface de l'6pi- th61ium (fl6che), le mucus intracellulaire et la faible coloration des noyaux. Photographi6 sans analyseur. (100x 10.) b Mfime endroit avec l'analyseur et polariseur crois6s. La bir6- fringence du mucus extracellulaire est positive. Dans les cellules il s'agit d'une structure

pr6sentant diff~rentes directions d'orientation

4 Histochemie, Bd. 30

Fig. 9. Cellule caliciforme chez le rat dont le mucus s'~chappe dans la lumi~re de la glande. Ces trois microphotographies proviennent de trois expositions diff~rentes. La photo c est un agrandissement de la zSne marquee d'une fl~che sur a, la photo b repr~sentant la zSne marquee d'une fl~che sur c. Fixation-coloration au glutarald~hyde bleu Alcian s pH 7,2; post-osmication; contraste de coupe s l'ac~tate d'uranyle. Le mucus se compose de filaments orient,s perpendicuIairement ~ la surface 5pith~liale. Ceux-ci sont form,s de brins de particules opaques au i ~lectrons qui peuvent se rejoindre comme le font les deux brins marquis d'une fl~che courbe sur la photo 9c. Grossissements: 9a • 7000, 9b • 180000, 9c x 60000

J.P. Musy et al. : Ultrastructure, anisotropie et m6tachromasie du mucus 51

Fig. 10a et b. Mastocytes de rat dans la lamina propria de la muqueuse. Ces deux micro- graphies d'un mSme mastocyte proviennent de deux expositions diff~rentes. La photo b est un agrandissement de la zSne marquee d'une fl~che sur a. Fixation-coloration au glutaral- d6hyde bleu Alcian s pH 7,2; pas de post-osmication; contraste de coupe s l'ac~tate d'uranyle. Les granulations et le noyau (N) sont bien contrast, s, les ribosomes sont visibles entre les granulations. Ces derni~res renferment un amas dense de filaments et de granules et ne

semblent pas limit~es par une membrane. Grossissements: 10a • 7000, 10b • 60000

Alcian 8 GS-h6parine pr~sente un effet hypsochrome plus marqu5 et don t le

m a x i m u m se situe ~ 610 nm. La courbe d 'absorpt ion du vert Alcian 8 GX pr~sente 2 maxima dont le

principal est ~ 630 n m et le second ~ 681 nm. Apr~s adjonct ion d'hSparine, le m a x i m u m de la courbe montre un d~placement hypsochrome s 622 nm.

Discussion

Dans les cellules investigu6es, n i le type de fixation, ni l'esp~ce animale n ' o n t exerc6 d ' inf luence sur les propri6t~s m6tachromat iques ou anisotropiques. I1 n ' y a donc pas lieu de discuter ces 2 points.

A. Composition et structure du mucus c61ique et des granulations des mastocytes

Le mucus des cellules caliciformes du cSlon fair pat t ie du groupe des mucines ~pith~liales; il est compos~ de glycoprot~ines (Pearse, 1968; Ganter et Joll~s, 1970; Montgomery, 1970; Aspinall, 1970). Ces mucines intest inales ne sont encore que par t ie l lement connues (Montgomery, 1970), elles sont hydrosolubles et de

4*


poids mol6culaire 61ev6. Leur contenu polysaecharidique atteint un taux de 75 % (Neutra et Leblond, 1966). La fraction prot6ique des glycoprot6ines dans les glandes salivaires a fair l 'objet d'6tudes approfondies (Montgomery, 1970). Par ailleurs, la fraction polysaccharide des mucines 6pith61iales cSliques a 6t6 6tudi6e par Kent (1963), qui a identifi6 une (~mucosubstance~) dans une fraction cSlique pr6cipit6e par le Rivanol ou par le chlorure de cetylpyridinium. Cette ((mucosubstance ~) contient des esters sulfat6s et des r6sidus d'acide sialique. Alors que l'acide sialique est un constituant g6n6ral des mucines, il semble bien que le cSlon se caract6rise par une 616ration du taux des polysaccharides sulfat6s par rapport aux autres mucines 6pith61iales (Ganter et Joll~s, 1970). Une preuve indirecte de ce ph6nombne est donn6e par l'affinit6 particulibre des mucines 6pith61iales cSliques pour les sels de zirconium, formant des complexes parti- culibrement stables avec les groupes sulfat6s (Sprumont et coll., 1971). Par ailleurs, Neutra et Leblond (1966) ont d6montr6 l ' incorporation active de glucose H a, de galactose H a e t de S a5 dans les cellules caliciformes du cSlon de rat, grace

des m6thodes autoradiographiques. Pour ces auteurs, le mucus contiendrait de l'h6xosamine, du galactose, du fucose, de l'acide sialique et des r6sidus sulfat6s,

L'aspect filamenteux du mucus cSlique d6jh d6crit par Sandborn (1970) est retrouv6 au microscope 61ectronique aprbs t rai tement au bleu Alcian. Chaque filament est form6 de particules unitaires d 'un diambtre de 2,5 nm. Des particules similaires, mais d 'un diambtre de 3,5 nm ont 6t6 d6crites par Serafini-Fracassini et coll. (1969) au cours de l '6tude des complexes hdparine-prot6ine contrast6s par le nitrate de bismuth. Pour ces auteurs, les granules correspondent s des macro- mol6cules d'h6parine contrast6es, alors que la fraction prot6ique, non contrast6e, reste transparente aux 61ectrons. Une 6tude pr6c6dente (Serafini-Fracassini et coll., 1966) r6alis6e avec des techniques semblables sur des extraits de cartilage nasal de boeuf a r6v616 que le diambtre des particules unitaires variait, selon les m6thodes de pr6paration, de 2,3/L 4,7 nm. Les complexes polysaccharide-prot6ine 6talent en l'occurence ~ base de chondroitine sulfate A. Dans ces deux cas, les auteurs 6taient arriv6s s la conclusion que le bismuth se liait aux groupes sulfates des polysaccharides et que les dimensions variables des particules ob- serv6es correspondaient ~ des concentrations diff6rentes en sulfates des macro- mol6cules.

Dans le cas du mucus cSlique trait6 par le bleu Alcian, il est probable que le ph6nombne est comparable et que les particules observ6es correspondent h des macromol6cules polysaccharidiques sulfat6es, la fraction prot6ique restant invi- sible. Cette derni~re donn6e reste valable pour les 6chantillons qui ont subi une post-fixation osmique aprbs la fixation-coloration combin6e au bleu Alcian: Adams et coll. (1967) ont, en effet, d6montr6 que le t6troxyde d 'osmium ne pouvaiti6tre'y6duit ni par les prot6ines, ni par les polysaccharides. Quant aux particules opaques, leur diam~tre peut 6tre mis en relation avec la composition chimique des polysaccharides dans les mucines 6pith61iales cSliques, sans d'ailleurs que cette composition puisse 6tre d6termin6e de la sorte. Le bleu Alcian r6agirait avec ces macromol6cules de la m6me manibre que le nitrate de bismuth.

Quant aux granulations des mastocytes, elles contiennent de l'h6parine, une prot6ine basique et de l 'histamine (Combs, 1966; Selye, 1965; Pearse, 1968), ainsi que de l'acide hyaluronique, de la s6rotonine et des enzymes prot6olytiques


(Ganter et Joll6s, 1970). Le compos5 qui nous int6resse ici est l 'h6parine, polysaccharide acide fortement sulfat6 (Jeanloz, 1970; Aspinal, 1970), l ' incorporation active de S 35 dans les granulations des mastocytes 6tant connue par ailleurs (Combs, 1966).

Au microscope 61ectronique, le bleu Alcian permet de confirmer la nature filamenteuse et granulaire des granulations des mastoeytes. Les images obtenues correspondent s celles des mastocytes p6riton~aux du ra t trait6s par le nitrate de bismuth (Serafini-Fracassini et coll., 1969), ou par le rouge de ruthenium (Pilal, 1970). Dans ces deux cas, il a ~t6 sugg6r5 que les structures observ6es 6taient des complexes macromol6culaires h6parine-prot6ine. L'analogie avec nos images est ~vidente et permet de supposer que le bleu Alcian met en ~vidence des complexes semblables.

Les propri6tds tinctoriales du mucus des cellules calieiformes du c61on ont fair l 'objet de nombreuses 6tudes et sont bien connues (Lindner, 1965; Yamada, 1969, 1970, 1970; Pearse, 1968; Ravetto, 1969; Ravet to et coll., 1969; Modis et coll., 1971). Les r6actions histochimiques sont d6crites par Pearse (1968) et par Ganter et Joll~s (1970). Les granulations des mastocytes ont fait l 'objet de nombreuses 6tudes au point de vue de leurs propri6t6s tinetoriales et histochimiques (Selye, 1965; Horsfield, et coll., 1966; Mariano, 1970; Modis et coll., 1969; Dorsche et coll., 1970).

La m6tachromasie du mucus et des granulations des mastocytes est 6galement bien connue (Pearse, 1968; Ganter et Joll~s, 1970), que ce soit en lumi~re visible ou en fluorescence.

B. Bird/ringence du mucus et des granulations des mastocytes

La birSfringence du mucus in t ra -e t extracellulaire permet de conclure ~ une orientation micellaire au niveau des glyco-protSines. Ce phSnom~ne est peu connu dans les s6cr6tions 6pithdliales (White, 1954; Romh~nyi, 1963). Par contre, il a 6t5 6tudi6 dans les macromol6cules mucopolysaecharidiques associ6es au collag~ne (Romhhnyi, 1963; Vidal, 1963, 1965, 1970; Scheuner, 1967, 1968; Modis et coll., 1971). S'agit-il dans notre cas d'une bir6fringence propre ou d'une bir6fringence de forme (Policard et coll., 1957) ? Seule une eourbe d'imbibition avec des liquides d'indices de r6fraction diff6rents permett ra i t de trancher la question. Le mucus, et plus particuli~rement sa fraction polysaceharidique, est h la fois tr~s labile et tr~s hydrosoluble (Pearse, 1968). Cette solubilit6 persiste apr~s fixation, ce qui emp6che la rSalisation pratique d'une courbe d'imbibition. Qu'en est-il du signe de la birSfringence du mucus, c'est-~-dire de l 'orientation des micelles par rapport

la structure ? Dans le mucus intracellulaire, le signe de la bir6fringenee ne peut ~tre d6termin6, que ce soit avee ou sans coloration: quelle que soit l 'orientation de la structure par rapport au plan de polarisation de la lumi6re, on ne peut la compenser eompl~tement. On peut donc penser qu'il s 'agit d'une structure anisotrope dont les unit6s sont enchev~tr6es et orient~es dans des directions multiples. Cette hypoth~se semble confirm6e par le fait que le mucus s '6chappant d 'une cellule s'ordonne en filaments parall61es et pr6sente alors une bir4fringence net tement positive. Les couches 6paisses de mucus d6pos6es, par endroits, sur l'6pith61ium montrent 6galement une orientation parall61e des filaments et une bir6fringence positive (fig. 6a et b, 8a et b).


Le pH du colorant ne semble pas jouer de rSle important sur l'intcnsit6 de la bir6fringence du mucus. Tout au plus, a-t-on, sur des coupes en s6ries, l'impression d'une 16gbre augmentation de la bir6fringence lors d'une augmentation de pH. Des mesurcs quantitatives n 'ont pu ~tre faites pour des raisons techniques.

I1 est int6ressant de commenter les r6sultats obtenus aprbs bleu de toluidine au pH de 1,2, r6sultats d'aflleurs identiqucs ~ ceux du bleu Alcian au m~me pH. A ce pH, il est g6n6ralement admis (Pearse, 1968; Arnold, 1968; Ganter et Joll6s, 1970) que le colorant cationique ne se fixe que sur les groupes sulfates, ceux-ci 6~ant les seuls dissoci6s. Scheuner (1967, 1968) a aussi d6montr6 que les colorants du groupc des acridines permettcnt d'identifier des groupes acides orient6s au microscope polarisant. Dans notre cas, s cc pH du bleu de toluidine, le signe de la bir6fringence ne s'est pas modifi6 apr~s la coloration soit dans le mucus extracellulaire, soit dans les filaments s'6chappant de la cellule. La bir6fringence cst rest6e positive. White (1954) a d6montr6 un ph6nom6ne semblable ~ propos des glyco-prot6ines provenant de s6cr6tions bronchiques. On dolt donc admettre que les mol6cules du colorant se sont fix6es parall61ement au grand axe des structures micellaires contrairement ~ cc que l'on sait des mucopolysaccharides associ6s au collag6ne (Vidal, 1963; Modis, 1970).

Du fair du pH tr6s bas, on peut penser mettre ainsi indirectement en 6vidence l'oricntation p6riodique des groupes sulfates. Cctte orientation des groupes, par rapport aux mol6cules de glycoprot6incs, doit donc ~tre telle que le colorant puisse se fixer parall61ement aux chalnes lin6aires des polysaccharides. Ceci supposerait, pour ces mol6culcs et leurs groupes sulfates, une disposition spatiale diff6rente de celle qui est partiellement connue pour les mucopolysaccharides associ6s au collag~ne (Vidal, 1963; Scheuner, 1968). On peut, s ce sujet, rappeler que Rees (1969) a sugg6r6 ~ partir d'analyses math6matiques, que certains polysaccharides acides sulfat6s en provenance d'algues marines (Rhodophyceae) pourraient avoir la configuration d'une double h61ice semblable s celle form6e par les ((carrageenans ~). Pihl (1970), ~ l 'cxamen de certaines de ses images de complexe h6parine-prot6ine extrait de mastocytes et contrast6 au rouge de ruthenium, pcnsc que celles-ci pourraient correspondre s des structures h61icoidales. I1 a d'ailleurs 6t6 prouv6 que l'h6parinc en solution prend la configuration d'unc spirale gaussienne dont la longueur est de 26 nm et le rayon de gyration d'environ 3,45 nm (Stivala et coll., 1968).

L'anisotropie des granulations des mastocytes est d6crite par Gyenge et coll. (1965). S ehcuncr (1971 ) pcnse quc lcs mucopolysaccharides des m~mes granulations ne sont pas anisotropes. L'emploi de coupes ~ cong61ation avec des temps de fixation et de colorations tr~s courts explique vraisemblablement nos r6sultats en r6duisant s un minimum l'extraction des mucopolysaccharides. Le signe de la bir6fringence ne peut ~tre d6termin6: il semble donc s'agir d'une structure orientation complexe. Les r6sultats donn6s par le bleu de toluidine sont d'aillcurs confirm6s par le bleu Alcian au m~me pH et par les colorants fluorescents.

C. Cas particulier du bleu Alcian et du vert Alcian

A notre connaissance, ces deux colorants du groupe des phtalocyanines n 'ont jamais 6t6 utilis6s au microscope polarisant. L'anisotropie des structures 6tudi6es est fortemcnt augment6e par la m6thode de fixation-coloration simultan6e. Cette

Ultrastructure, anisotropie et m6tachromaSie du mucus 55

derni~re a ~t6 intoduite par Behnke (1970) pour la raise en 5vidence, en microscopie 61ectronique, des mueopolysaccharides. Comme pour le bleu de toluidine, le signe de la bir6fringence du mucus extracellulaire n 'est pas modifi~. Au pH de 1,1, on peut donc conclure que le bleu Alcian met 4lectivement en ~vidence des groupes sulfates orient,s parall~lement s la structure micellaire. Les propri~tSs tinctoriales du bleu et du vert Alcian sont bien connues (Scott, 1964, 1965, 1967; Modis, 1970). Quintarelli (1964, 1968) admet que le bleu Alcian r~alise, comme les sels d 'ammonium quartenaire, une pr6cipitation des mucopolysaccharides. Pour cet auteur, le colorant peut se lier avec le substrat par des liaisons ioniques, et par des liaisons de coordination avec le cuivre du colorant en formant des complexes (ch61ates). Les courbes spectrophotom~triques obtenues avec l'h~parine confir- ment l'id~e de la formation d 'un complexe (~colorant-mucopolysaccharide~>. I1 faut cependant noter que Lindner (1965) ne met pas en ~vidence d'effet hypsochrome dans les m41anges de bleu Alcian et d'h~parine. I1 se peut que la concen- trat ion tr~s 41ev6e de 2% de bleu Alcian employee par cot auteur modifie les caractSristiques d 'absorption du complexe.

Peut-on donc consid~rer le bleu Alcian et le vert Alcian comme des colorants mStachromatiques ~. Nos r~sultats sont en faveur de ce concept comme d'ailleurs ceux de Scott (1970). Pour cet auteur, l 'effet hypsochrome observ~ sur nos courbes est dfi ~ une interaction entre l'hSparine et le bleu Alcian similaire ~ celle observSe sur le bleu Alcian au contact d'une solution concentrSe de chlorure de magnesium (Scott, 1971). Au microscope polarisant, d 'autres ~tudes permettront , sur le collag~ne par exemple, de mieux connaire les propri~t~s anisotropes des phtalocyanines.

L'int~r~t de cette fixation-coloration est de permettre la d~shydratation des coupes ainsi traitSes. Elle permet une 5tude parall~le au microscope ~lectronique. La preservation de la fraction polysaccharidique est assurSe par sa liaison avec le colorant. Elle devrait permettre d'4tudier l 'aspect morphologique de certains polysaccharides extracellulaires dans le sens pr~conis5 par Bennet (1963).

D. Relation possible entre la mdtachromasie et l' anisotropie d' une structure

La r~action mStachromatique fair l 'objet de tr~s nombreux travaux. On peut analyser s~par~ment les rSsultats obtenus in vitro et ceux obtenus sur coupes histologiques.

I n vitro, la m~tachromasie du bleu de toluidine a ~t~ 5tudi~e entre autre par Walton et Ricketts (1954), Kelly (1956), Lison (1960), Lindner (1965), Kieser (1969) et Toepfer (1970). Les colorants s fluorescence m~tachromatique du groupe acridine ont 4t~ 5tudi~s par Stone et Bradley (1967), Modis et coll. (1970, 1971). La mStachromasie des phtalocyanines est dScrite par Scott (1970). L'~tude de ces t ravaux indique que la r~action m~tachromatique peut avoir lieu dans des conditions tr~s diff4rentes et, notamment , en prSsence de mucopolysaccharides acides sulfatSs comme le chondroitine sulfate ou l'hSparine. La prSsence de groupes sulfates semble jouer un rSle preponderant. Cependant, la r~action m~tachromatique peut 6tre provoqu~e in vitro simplement par modification de la concentration du colorant, de son p i t ou de son solvant, ou encore par addition de groupes hydroxylcs comme le montre Kieser (1969) s propos du bleu de toluidine. La cause en est probablement l 'apparit ion de modifications du syst~me 7l-~lectronique

56 J.P. Musy, P. Sprumont, L. Modis et V. de Blasi :

du groupc chromophore du colorant (Arnold, 1968; Kieser, 1969; Ganter et Joll~s, 1969). Pour les phtalocyanines, la r6action m6tachromatique in vitro serait 6galement due s une modification du syst~me ~-61ectronique du chromophore (Scott, 1970).

Sur coupes histologiques, la r~action m6tachromatique indiquerait, selon certains auteurs (Casselmann, 1962; Pearse, 1968; Arnold, 1968; Ganter et Joll~s, 1969), la pr6sence d'une certaine densit6 de charges nSgatives ~ la surface du ehromotrope. Pour Romhhnyi {1963) et Vidal (1963, 1970), la m6tachromasie exige en outre la pr6sence de groupes orient6s sur le chromotrope. Ces auteurs ont, en effet, constat6 une anisotropie des structures m6tachromatiques. Scheuner (1970, 1971) est d'avis que les deux ph6nom6nes peuvent coexister sans 6tre n6cessairement en relation. C'est aussi l'avis de Scott (1971). Ace sujet, Scheuner (1970) d6montre une r6action m6tachromatique, mais sans anisotropie, sur des sph6res de r6sine 6changeuse d'ions ((Sephadex~, color~es au bleu de toluidine et g l'acridine orange. D'apr~s nos r6sultats avec plusieurs colorants, deux structures tr~s fortement m6tachromatiques pr6sentent 6galement une forte anisotropie. La m6tachromasie et l'anisotropie d'une structure coexistent donc dans ce cas.

Si l'on admet que la r6action m6tachromatique est due ~ une modification du syst~me z-61ectronique du chromophore du colorant, on est amen6 s penser que, dans le tissu, le lieu de cette modification correspond s une densit6 61ev6e de charges 61ectron6gatives s la surface du chromotrope. Cette densit6 des charges ne serait possible, dans une structure histologique, que si les groupes charg6s des chromotropes tissulaires pr6sentent tous une orientation semblable. L'orien- ration des charges, qui d6termine l'orientation des mol6cules du colorant, r6aliserait des conditions appropri6es pour provoquer la modification du syst~me ~-61ectronique.

Une observation int6ressante de Romhs (1963) soutient cet argument. Cet auteur a pu montrer que la chromatine nucl6aire n'est m6tachromatique et anisotrope qu'apr~s traitement ~ la trypsine dans des coupes en paraffine. La trypsine au pH de 8,2 hydrolyse les prot6ines li6es ~ I 'ADN et fair apparaitre une densit~ de charges n6gatives suffisante pour r6aliser l'effet m6tachromatique et faire apparaltre l'anisotropie.

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Dr. J. P. Musy Insti tut d'Histologie et d'Embryologie g~n~rale de l'Universit~ de Fribourg CH-1700 Fribourg/Suisse

ultrastructure du mucus (cellules caliciformes du côlon) et des granulations des mastocytes du...

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