tuyen chon nuoi chung aspergillus awamori sinh tông hop endo 14

8/7/2019 tuyen chon nuoi chung aspergillus awamori sinh tông hop endo 14

http://slidepdf.com/reader/full/tuyen-chon-nuoi-chung-aspergillus-awamori-sinh-tong-hop-endo-14 1/97

Số hóa bớ i Trung tâm H ọc liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

---------------------------------

NGUYỄN VĂN TUÂN

TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI

SINH TỔNG HỢ P ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ

TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

THÁI NGUYÊN- 2009




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

---------------------------------

NGUYỄN VĂN TUÂN

TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI

SINH TỔNG HỢ P ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ

TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60. 42. 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:TS. Quyền Đình Thi

Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

THÁI NGUYÊN - 2009




LỜ I CẢM Ơ N!

Trƣớ c hết tôi xin gửi lờ i cảm Sâu sắc tớ i TS. Quyền Đình Thi, Trƣở ng

phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Phó viện trƣở ng Viện Công nghệ Sinhhọc, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớ ng nghiên cứu,

hƣớ ng dẫn thí nghiệm, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hoá chất cũng

nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơ n tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học

Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình

làm luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơ n Khoa Sinh học, Khoa Sau đại học, trƣờ ng

Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên cùng các thầy cô giáo đã nhiệt tình

giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá học.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơ n Bộ môn Hoá- Sinh học, Ban chủ nhiệm

khoa Khoa học Cơ bản, Trƣờ ng đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên đã

tạo điều kiện cho tôi đi học.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơ n những ngƣờ i thân trong gia đình

và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thờ i gian học tập. Thái Nguyên tháng 9 năm 2009

Học viên

Nguyễn Văn Tuân




CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APS Ammonium persulphate

BSA Bovine serum albumin

CMC Carboxyl methyl cellulose

cs Cộng sự

DNA Deoxyribonucleic acid

DEAE Diethylaminoethyl

ĐC Đối chứngEDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

IU International unit

kb Kilo base

kDa Kilo Dalton

LB Luria and Bertani

M Marker

Nxb Nhà xuất bản

OD Optical density

PCR Polymerase chain reaction

rRNA Ribosome ribonucleic acid

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TBE Tris base-Boric acid-EDTA

TE Tris-EDTA

v/v Volume/volume

w/v Weight/volume




MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE ............ 3

1.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE.................. 4

1.2.1 Nguồn gốc ............................................................................................. 4

1.2.2 Phân loại ................................................................................................ 6

1.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE .......................................... 7

1.3.1 Cấu trúc bậc một .................................................................................... 7

1.3.2 Cấu trúc không gian ............................................................................... 9

1.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất ......................... 9

1.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ........................... 11

1.5 Ứ NG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ....................................... 12

1.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm ............................................................. 12

1.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc......................................... 13

1.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ ...................................... 15

1.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy ....................................... 15

1.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa .............................................. 16

1.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh .................... 16

1.6 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG

SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE....................................................... 17

1.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ...................... 20

1.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨ U CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM ...................... 22

CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................ 25 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT............................................................... 25

2.1.1 Chủng nấm .......................................................................................... 25

2.1.2 Thiết bị thí nghiệm .............................................................................. 25

2.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 26

2.1.4 Môi trƣờ ng .......................................................................................... 26




2.1.5 Dung dịch và đệm ................................................................................ 27

2.2 PHƢƠNG PHÁP ........................................................................................... 28

2.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật ............................................................................. 28

2.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase ........................................................ 28

2.2.3 Khảo sát ảnh hƣở ng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợ p

endoglucanase ................................................................................................ 30

2.2.4 Tinh sạch enzyme ................................................................................ 32

2.2.5 Điện di SDS-PAGE ............................................................................. 33

2.2.6 Xác định tính chất lý hóa của endoglucanase ....................................... 34

2.2.7 Xác định hàm lƣợ ng protein tổng số ..................................................... 35 2.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử ...................................................... 36

2.2.9 Xử lý số liệu ........................................................................................ 41

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............. ............. ............. ............. ... 42 3.1 TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI

SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE CAO ........................................................ 42

3.1.1 Tuyển chọn .......................................................................................... 42

3.1.2 Phân loại chủng nấm sợ i dựa vào phân đoạn gene 28S rRNA .............. 43

3.2 TỐI ƢU CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE .... 45

3.2.1 Khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase theo thờ i gian ......................... 45

3.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy ................................................................................ 47

3.2.3 Ảnh hƣở ng của nồng độ cơ chất cảm ứng ............................................ 48

3.2.4 Ảnh hƣở ng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon ...................... 50

3.2.5

Ảnh hƣở ng của nguồn nitrogen và nồng độ nguồn nitrogen ................. 52

3.2.6 pH môi trƣờ ng nuôi cấy ban đầu .......................................................... 54

3.3 TINH SẠCH ENDOGLUCANASE ............................................................ 55

3.3.1 Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 ................................ 55

3.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE ........................................ 56

3.4 NHỮ NG TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDOGLUCANASE ................. 57

3.4.1 Ảnh hƣở ng của nồng độ cơ chất .......................................................... 57




3.4.2 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu ..................................................................... 58

3.4.3 pH phản ứng tối ƣu .............................................................................. 60

3.4.4 Độ bền nhiệt độ ................................................................................... 61

3.4.5 Độ bền pH ........................................................................................... 63

3.4.6 Ảnh hƣở ng của dung môi hữu cơ ......................................................... 64

3.4.7 Ảnh hƣở ng của ion kim loại................................................................. 65

3.4.8 Ảnh hƣở ng của một số chất tẩy rửa ...................................................... 67

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 71 PHỤ LỤC ............................................................................................................. 79




DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợ c sử dụng trong thí nghiệm ................................. 25 Bảng 2.2. Danh sách hóa chất chính đƣợ c sử dụng trong thí nghiệm ..................... 26

Bảng 2.3. Danh sách dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm ......................... 27 Bảng 2.4. Thành phần gel điện di biến tính protein ............................................... 33 Bảng 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori ............................... 43

Bảng 3.2. Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA chủng

A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 79 Bảng 3.3. Khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase theo thờ i gian .......................... 79 Bảng 3.4. Ảnh hƣở ng của nhiệt độ nuôi cấy .......................................................... 80 Bảng 3.5. Ảnh hƣở ng nồng độ cơ chất cảm ứng .................................................... 80 Bảng 3.6. Ảnh hƣở ng của nguồn carbon ................................................................ 50

Bảng 3.7. Ảnh hƣở ng của nồng độ lõi ngô ............................................................ 80 Bảng 3.8. Ảnh hƣở ng của nguồn nitrogen ............................................................. 52 Bảng 3.9. Ảnh hƣở ng của nồng độ ammonium acetate .......................................... 81 Bảng 3.10. Ảnh hƣở ng của pH môi trƣờ ng nuôi cấy ban đầu ................................ 81 Bảng 3.11. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột Sephadex G-100 ....... 81

Bảng 3.12. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột sắc ký DEAE ............ 82

Bảng 3.13. Tóm tắt quá trình tinh sạch endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 57 Bảng 3.14. Ảnh hƣở ng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính endoglucanase ............. 82 Bảng 3.15. Ảnh hƣở ng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endoglucanase .......... 82 Bảng 3.16. Ảnh hƣở ng của pH hỗn hợ p phản ứng đến hoạt tính endoglucanase .... 83 Bảng 3.17. Độ bền nhiệt độ của endoglucanase ..................................................... 83 Bảng 3.18. Độ bền pH của endoglucanase ............................................................. 84 Bảng 3.19. Độ bền pH theo thờ i gian của endoglucanase ...................................... 85 Bảng 3.20. Ảnh hƣở ng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính endoglucanase............ 86

Bảng 3.21. Ảnh hƣở ng của ion kim loại ................................................................ 66 Bảng 3.22. Ảnh hƣở ng của một số chất tẩy rửa đến hoạt tính endoglucanase ........ 86




DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase ........................ 3

Hình 1.2. Trình tự amino acid tƣơng ứng vớ i cấu trúc bậc 2 của Cel12A từ một số

chủng vi sinh vật .................................................................................................... 8

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác (B)

của Cel12A từ H. grisea ......................................................................................... 9

Hình 1.4. Cấu trúc vùng CBD của Cel12A từ Humicola grisea............................. 10

Hình 1.5. Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của các

enzyme thuộc phức hệ cellulase ............................................................................. 11

Hình 2.1. Đƣờ ng chuẩn nồng độ glucose............................................................... 30 Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 . 33

Hình 2.3. Đƣờ ng chuẩn Bradford dùng BSA làm chuẩn ........................................ 36

Hình 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori nghiên cứu ............. 42

Hình 3.2. Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): vớ i khuôn DNA

tách chiết từ chủng A. awamori VTCC-F-099; Sản phẩm cắt vector tái tổ hợ p bằng

XbaI và XhoI (C). ................................................................................................. 44

Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. awamori VTCC-F-099 ..................................... 45

Hình 3.4. Khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase theo thờ i gian của chủng

A. awamori VTCC-F-099 ..................................................................................... 46

Hình 3.5. Ảnh hƣở ng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợ p

endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 ............................................. 48

Hình 3.6. Ảnh hƣở ng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase

của chủng A. awamori VTCC-F-099 .................................................................... 49

Hình 3.7. Ảnh hƣở ng của nồng độ lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợ p


Hình 3.8. Ảnh hƣở ng của nồng độ ammonium acetate đến khả năng sinh tổng hợ p

endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 .............................................. 53




Hình 3.9. Ảnh hƣở ng của pH môi trƣờ ng nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợ p


Hình 3.10. Điện di đồ trên gel polyacrylamide sản phẩm tinh sạch endoglucanase

từ chủng A. awamori VTCC-F-099 qua cột Sephadex G-100 ............................... 56

Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch endoglucanase trên gel

polyacrylamide....... ............................................................................................... 57

Hình 3.12. Ảnh hƣở ng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 58

Hình 3.13. Ảnh hƣở ng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 60 Hình 3.14. Ảnh hƣở ng của pH phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 61

Hình 3.15. Ảnh hƣở ng của nhiệt độ lên độ bền endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 62

Hình 3.16. Ảnh hƣở ng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 63


A. awamori VTCC-F-099 theo thờ i gian ................................................................ 64

Hình 3.18. Ảnh hƣở ng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099. ..................................................................................... 65

Hình 3.19. Ảnh hƣở ng của chất tẩy rửa lên hoạt tính endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099. ..................................................................................... 68




1

1 MỞ ĐẦU

Cellulose là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớ p thành tế bào

thực vật. Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân hủy

cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hƣởng đến

tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp.

Endo-β-1,4-glucanase (3.2.1.4) là một trong ba loại enzyme thuộc hệ

enzyme thủy phân cellulose (cellulase). Enzyme này tham gia phân cắt

ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucoside từ bên trong các phân tử cellulose và

một số loại polysaccharide tƣơng tự khác tạo thành các oligosaccharide.

Endo-β-1,4-glucanase có thể đƣợ c sản xuất bở i rất nhiều loại vi sinh vật

nhƣ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc. Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn có ở

thực vật, động vật nguyên sinh và một số loài động vật không xƣơng sống

khác. Các enzyme có nguồn gốc khác nhau sẽ có cấu trúc khác nhau. Điều

này dẫn tớ i sự khác nhau về hoạt tính xúc tác và điều kiện phản ứng tối ƣu

của các enzyme.

Hiện nay, việc sử dụng các enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase

trong một số ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp

chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, bột giặt, sản xuất dung môi hữu

cơ và xử lý môi trƣờ ng là rất quan trọng, mang lại nhiều giá trị to lớ n.

Tuy nhiên, những enzyme và chế phẩm có liên quan đƣợ c sử dụngtrong các ngành công nghiệp ở Việt Nam và một số nƣớ c hiện nay chủ yếu

đƣợ c nhập khẩu từ nƣớ c ngoài vớ i giá thành cao. Vì thế, việc nghiên cứu, sản

xuất ra các chế phẩm enzyme có nguồn gốc tự nhiên đang là một đòi hỏi cấp

thiết đối vớ i nhiều quốc gia trên thế giớ i trong đó có Việt Nam. Nƣớ c ta là

một nƣớ c sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất các

enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase là rất phong phú. Xuất phát từ những lý do




2

trên và tình hình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề

tài: “Tuyể n chọ n, nuôi cấ y chủ ng Aspergillus awamori sinh tổ ng hợ p

endo- β -1,4-glucanase và đánh giá tính chấ t lý hóa củ a endo- β -1,4- glucanase” vớ i các mục tiêu: (1) Tuyển chọn các chủng Aspergillus awamori

sinh tổng hợ p endo-β-1,4-glucanase cao và tìm môi trƣờ ng nuôi cấy thích hợ p

để tạo endo-β-1,4-glucanase ngoại bào, (2) Tinh sạch đƣợ c endo-β-1,4-

glucanase và đánh giá một số tính chất lý hóa của nó.




3

2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE

Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết

-1,4-O-glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tƣơng tự khác.

Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và đƣợ c xếp thành

3 nhóm cơ bản: endo-β-1,4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase)

(EC 3.2.1.4), exo-β-1,4-glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và

β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [30], [39].

Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và

nhờ có sự phối hợ p hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất đƣợ c

thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất.

Endo-β-1,4-glucanase là loại enzyme tham gia xúc tác phản ứng

thủy phân các liên kết β-1,4 glucoside ở bên trong các phân tử cellulose và

một số cơ chất tƣơng tự khác thành các sản phẩm đơn giản hơn (các

oligosaccharide).

Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase




4

2.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE

2.2.1 Nguồn gốc

Endo-β-1,4-glucanase có thể đƣợ c tổng hợ p từ rất nhiều nguồn khác

nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong

tự nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm

men có khả năng sinh tổng hợ p endo-β-1,4-glucanase.

Nấm mốc là một trong những đối tƣợ ng vi sinh vật có khả năng

sinh tổng hợ p endo-β-1,4-glucanase mạnh nhất. Nhiều chủng nấm mốc thuộc

các chi Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Phanerochaete đã đƣợ cnghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợ p endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ:

Aspergillus niger [25], [26], A. flavus, A. fumigatus [27] A. terreus [29]

Trichoderma reesei [53], Penicillium persicinum, P. brasilianum [33],

Penicillium sp. [10], Phanerochaete chrysosporium [34].

Bên cạnh nấm mốc, vi khuẩn cũng đƣợ c xem là một trong những đối

tƣợ ng có khả năng sinh tổng hợ p endo-β-1,4-glucanase khá phong phú. Nhiềuloài vi khuẩn hiếu khí đã đƣợ c nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợ p

endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ Acidothemus cellulobuticus [22], Bacillus

pumilis [32], Cellulomonas flavigena, C. udai [20], [21], Pseudomonas

fluoressens [42]. Không chỉ có các vi khuẩn hiếu khí mà một số vi khuẩn

kỵ khí cũng có khả năng sinh tổng hợ p endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ

Clostridium [57].Nhiều chủng xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces, Streptomyces cũng có

khả năng sinh tổng hợ p endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ: Actinomyces griseus

[13], Streptomyces reticuli [61].




5

Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn đƣợ c sinh tổng hợ p ở thực vật

Arabidopsis [23], ở động vật nguyên sinh và một số động vật không xƣơng

sống khác nhƣ mối [62], ở động vật thân mềm nhƣ Mytilus edulis [63].Trong số các nguồn sinh enzyme trên thì vi sinh vật đƣợ c xem là nguồn

cung cấp enzyme vớ i nhiều ƣu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vƣợ t xa

so vớ i enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật. Vì thế, chúng đƣợ c

sử dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme.

Trƣớ c hết, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme

vớ i số lƣợ ng lớn. Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con ngƣờ i chủ động tạora đƣợ c. Chu kỳ sinh trƣở ng của vi sinh vật ngắn (từ 16-100 giờ ). Vi sinh vật

sinh trƣở ng, phát triển vớ i tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lƣợ ng lại nhỏ,

kích thƣớc bé, nhƣng tỷ lệ enzyme trong tế bào tƣơng đối lớ n nên quy trình

sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao. Hơn nữa,

enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vƣợ t xa các sinh vật khác. Đối

vớ i một số trƣờ ng hợ p có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồnenzyme.

Vi sinh vật rất nhạy cảm đối với tác động của môi trƣờ ng, thành phần

dinh dƣỡng nuôi chúng cũng nhƣ một số tác nhân lý hóa, cơ học khác. Do đó

có thể thay đổi những điều kiện nuôi cấy để chọn những chủng cho

hàm lƣợng enzyme đáng kể vớ i hoạt tính xúc tác cao. Có thể nói rằng, vớ i

vi sinh vật, ngƣờ i ta có thể điều khiển sự tổng hợ p enzyme dễ dàng hơn trêncác đối tƣợ ng khác để tăng lƣợng enzyme đƣợ c tổng hợ p hoặc tổng hợ p

định hƣớ ng enzyme. Tuy vậy, trong quá trình chọn nguồn nguyên liệu từ

vi sinh vật, cần lƣu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố để có

biện pháp xử lý thích hợ p.




6

2.2.2 Phân loại

Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử

Quốc tế, cellulase thuộc lớ p 3 (hydrolase): các enzyme xúc tác phản ứngthủy phân, tổ 2 (glycosidase): thủy phân các liên kết glycoside, nhóm 1:

thủy phân liên kết O- và S-glycoside (International Union of Biochemistry

and Molecular Biology, 1992; http://afmb.cnrs-mrs.fr/ pedro/CAZY/db.html).

Cellulase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau. Tùy theo

quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ cellulase đƣợ c xếp

thành các nhóm khác nhau. Trƣớc đây, cellulase đƣợ c chia làm hai nhóm:nhóm enzyme C1 và nhóm enzyme Cx. Các enzyme C1 có khả năng thủy phân

sợ i cellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng. Các enzyme Cx đƣợ c

chia thành hai loại: exo -1,4-glucanase (3.2.1.21) xúc tác cho phản ứng cắt

đứt gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose; endo -1,4-glucanase

(3.2.1.4) hoạt động tùy tiện hơn, xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết

bên trong phân tử cellulose [7].Hiện nay, cellulase đƣợ c chia làm ba dạng: dạng 1 là endoglucanase

hoặc 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase hay carboxylmethylcellulase

(CMCase) (EC 3.2.1.4), dạng 2 là exoglucanase bao gồm 1,4--D-glucan

glucanohydrolase (còn gọi là cellodextrinase) (EC 3.2.1.74) và

1,4--D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91), dạng 3 là

-glucosidase hoặc -glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanasexúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết ở bên trong phân tử cellulose.

Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử

cellulose. -glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose

thành glucose [30], [39], [45].

http://afmb.cnrs-mrs.fr/%7C%5bsim%20%20%20%20%20%5d/%7Cpedro/CAZY/db.html

http://afmb.cnrs-mrs.fr/%7C%5bsim%20%20%20%20%20%5d/%7Cpedro/CAZY/db.html




7

Các cellulase có nguồn gốc khác nhau đƣợ c sắp xếp thành các họ.

Trƣớc đây, dựa vào cấu trúc bậc một của phân tử protein enzyme, cellulase

đƣợ c chia làm 6 họ: A, B, C, D, E và F [35]. Sau đó, cellulase đƣợ c chiathành 9 họ: A, B, C, D, E, F, G, H và I dựa vào cấu trúc của tâm xúc tác [31].

Hiện nay, các cellulase đƣợ c sắp xếp trong 12 họ: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 44, 45,

48, 61 và 74 [45].

2.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE

2.3.1 Cấu trúc bậc một

Endoglucanase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và

cấu trúc khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trƣớ c hết ở sự đa dạng về khối

lƣợ ng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi

polypeptide. Chủng A. oryzae KBN616 có khả năng sinh tổng hợ p hai loại

endoglucanase là Cel A và Cel B. Phân tử protein Cel A gồm 239 amino acid,

trọng lƣợ ng phân tử 31 kDa, đƣợ c xếp vào họ cellulase H. Trong khi đó,

Cel B đƣợ c xếp vào họ cellulase C vớ i chiều dài 416 amino acid vàkhối lƣợ ng phân tử 53 kDa [43]. Phân tử endoglucanase từ A. aculeatus

bao gồm 410 amino acid vớ i khối lƣợ ng phân tử khoảng 43,7 kDa [59]. Các

endoglucanase từ chủng A. niger Z10 có khối lƣợ ng phân tử 83 kDa và

50 kDa [25], từ A. terreus là 25 kDa [29], từ Trichoderma reesei là 48 kDa và

55 kDa [40], [47], từ Bacillus sp. D04 có khối lƣợ ng 35 kDa [56].

Sandgren và cs (2003) đã có những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc

Cel12A thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase từ nấm chịu nhiệt

Humicola grisea. Cel12A của H. grisea là một chuỗi polypeptide gồm 224

amino acid cấu tạo nên các chuỗi , và các vùng nối (Hình 1.2) [55].




8

Hình 1.2. Trình tự amino acid tƣơng ứng vớ i cấu trúc bậc 2 của

Cel12A từ một số chủng vi sinh vật [55].




9

2.3.2 Cấu trúc không gian

Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp

trong không gian các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùngliên kết cơ chất. Chính nhờ sự khác nhau về cấu trúc không gian của

các protein enzyme dẫn tớ i sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng.

Phân tử Cel12A của H. grisea cấu tạo bở i 1 chuỗi , 2 chuỗi (A và

B). Chuỗi -A đƣợ c cấu tạo bở i 6 dải xoắn (A1-A6), chuỗi -B đƣợ c cấu tạo

bở i 9 dải xoắn (B1-B9). Các dải xoắn đƣợ c nối vớ i nhau bở i các vùng nối,

có 4 vùng nối lớ n 29-32, 40-47, 92-96, và 165-169 nối tƣơng ứng các

dải xoắn : B2-A2, A2-A3, A5-B5 và A6-B7 (Hình 1.3A) [55].

2.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất

Trung tâm xúc tác của Cel12A từ H. grisea gồm 2 amino acid là

glutamic acid E-120 và E-205 (Hình 1.3B), còn ở Cel12A từ Trichoderma

reesei là E-116 và E-200 [55].

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác

(B) của Cel12A từ H. grisea [55]




10

Vai trò liên kết cơ chất khi tham gia xúc tác thủy phân cellulose của các

cellulase đƣợ c thực hiện nhờ các vùng liên kết đặc hiệu cellulose bind domain

(CBD). Các CBD có thể nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme hoặckhông. Tùy thuộc vào từng loại enzyme mà vùng liên kết này có cấu tạo

hóa học và cấu trúc không gian khác nhau. Cel12A của H. grisea có 3 vùng

liên kết vớ i sự tham gia của các amino acid, trong đó cystein (C175, C206,

C216) đóng vai trò trung tâm. CBD1 vớ i C175 làm trung tâm nằm trên

dải xoắn -A6 liên kết yếu vớ i các amino acid T85, I123, A144, F173, I177,

và F180 bằng tƣơng tác Van der Walls. Liên kết giữa các amino acid trong

CBD1 có kích thƣớc 3,5 đến 4,1 Å (Hình 1.4A). CBD2 vớ i C206 làm

trung tâm nằm trên dải xoắn -B4 liên kết vớ i các amino acid Q34, W52,

W54, S63, P65, Y91, A98 và T204. Liên kết giữa các amino acid trong CBD2

có kích thƣớ c 3,3 đến 4,9 Å và CBD2 chứa trung tâm hoạt động (Glu 205)

(Hình 1.4B). CBD3 vớ i C216 làm trung tâm nằm trên dải xoắn -A4 liên kết

vớ i các amino acid W48, V87, W89, F214 và F219. Liên kết giữa các

amino acid trong CBD3 có kích thƣớ c 3,3 đến 4,8 Å (Hình 1.4C) [55].

Hình 1.4. Cấu trúc vùng CBD của Cel12A từ Humicola grisea [55]




11

2.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE

Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase tham gia thủy phân phân tử

cơ chất theo một cơ chế riêng. Tuy nhiên, những enzyme này thƣờ ngphối hợ p hoạt động để thủy phân hoàn toàn phân tử cơ chất thành sản phẩm

đơn giản nhất là glucose.

Endo-β-1,4-glucanase tham gia thuỷ phân các liên kết β-1,4 glucoside ở

bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide tƣơng tự khác.

Sản phẩm phân cắt là các oligosaccharide. Exoglucanase thủy phân các

liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cơ chất, giải phóng cácoligosaccharide, cellobiose và glucose. -Glucosidase thủy phân các phân tử

cellodextrin và cellobiose tạo thành các phân tử glucose [45], [58] (Hình 1.5).

Hình 1.5. Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose

(B) của các enzyme thuộc phức hệ cellulase




12

2.5 Ứ NG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE

Các cellulase nói chung và endo-β-1,4-glucanase nói riêng đƣợ c

ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệpthực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp sản xuất

dung môi hữu cơ, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và bột giấy, đặc biệt

trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh.

2.5.1 Trong công nghiệp thự c phẩm

Sử dụng các chế phẩm enzyme có thể coi là một trong những phƣơng

hƣớ ng tiến bộ có triển vọng nhất của sản xuất nƣớ c quả và nƣớ c uống không

cồn. Dịch quả sau khi ép chiết thƣờ ng chứa các thành phần tế bào thịt quả và

các chất sơ có bản chất polysaccharide làm cho dịch có độ nhớ t cao và màu

đục. Glucanase thƣờng đƣợ c sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phân các

polysaccharide làm giảm độ nhớ t của dịch quả tạo thuận lợ i cho quá trình tách

chiết và làm trong. Glucanase kết hợ p vớ i các hemicellulase, pectinase trong

chế phẩm enzyme Viscozyme 120L đƣợ c ứng dụng chủ yếu để xử lý phá vỡ màng tế bào đậu tƣơng [14]. Trong quá trình sản xuất nƣớ c cà rốt thƣờ ng sử

dụng endoglucanase xử lý ở giai đoạn dịch hóa đã tạo ra nhiều pectin hơn.

Trong công nghệ sản xuất bia, dịch lên men ngoài các thành phần

đƣờ ng, protein còn có một lƣợ ng không nhỏ các phân tử khối lƣợ ng cao nhƣ

cellulose và -glucan, làm ảnh hƣở ng xấu đến quá trình lọc và chất lƣợ ng sản

phẩm. Ngƣời ta thƣờ ng sử dụng -glucanase để loại bỏ những thành phần

này. Các chế phẩm nhƣ Finizym 200L gồm các cellulase từ A. niger ,

-glucanase từ Bacillus subtillis, Disporotrichum dimorphosporum đã đƣợ c

sử dụng trong sản xuất bia.

Ngoài ra, endoglucanase còn đƣợ c sử dụng trong công nghệ sản xuất

bánh mì, bánh bisqui và thực phẩm chức năng. Glucanase từ Humicola




13

insolens đƣợ c ứng dụng trong sản xuất bánh mì, làm tăng độ mềm và xốp cho

bánh mỳ. Glucanase từ Trichoderma reesei, A. niger đƣợ c ứng dụng trong sản

xuất fructooligosaccharide. Đây là một trong số các oligosaccharide chứcnăng (prebiotic) đƣợ c sản xuất để bổ sung vào khẩu phần ăn. Prebiotic có

nhiều lợ i ích về mặt dƣợ c phẩm cũng nhƣ có ảnh hƣở ng tốt đến sức khỏe. Khi

đƣợ c bổ sung vào cơ thể ngƣời và động vật, prebiotic có nhiều tác động sinh

lý quan trọng nhƣ: ngăn cản quá trình xâm nhập của các vi sinh vật gây bệnh,

bảo vệ các chức năng của gan, làm giảm lƣợ ng cholesterol trong huyết thanh,

tăng khả năng miễn dịch của cơ thể, kháng lại bệnh ung thƣ, cản trở sự

phát triển của các vi sinh vật trong khoang miệng [38], [64]. Các phế phụ

phẩm nông nghiệp nhƣ lõi ngô, bã mía, bã sắn, vỏ trấu là cơ chất lý tƣở ng cho

việc sản xuất các oligosaccharide. Các enzyme tốt nhất sử dụng cho quá trình

này chủ yếu có nguồn gốc từ nấm mốc. Hiện nay, nhu cầu sử dụng các

oligosaccharide ở các nƣớ c trên thế giớ i là rất lớ n. Tại Nhật Bản, nhu cầu

hàng năm về các oligosaccharide vào khoảng 1000-2000 tấn/năm [48].

2.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc

Chăn nuôi là một nhánh quan trọng của ngành nông nghiệp Việt Nam.

Thu nhập từ chăn nuôi hàng năm đạt 20% tổng giá trị kinh tế của ngành

nông nghiệp. Chăn nuôi không những cung cấp các loại thực phẩm nhƣ trứng,

thịt, sữa cho thị trƣờ ng mà còn cung cấp nguồn phân bón rất hữu ích cho

ngành trồng trọt. Đây cũng là nguồn thu nhập đáng kể góp phần xóa đóigiảm nghèo, nâng cao đờ i sống cho ngƣờ i dân Việt Nam. Tuy nhiên, ngành

nông nghiệp nói chung và chăn nuôi nói riêng đang gặp phải nhiều khó khăn.

Một trong những vấn đề cần đƣợ c giải quyết hiện nay là làm thế nào để

nâng cao năng suất vật nuôi, tăng hiệu quả chăn nuôi mà vẫn đảm bảo an toàn

cho môi trƣờng xung quanh, đặc biệt là sức khỏe con ngƣờ i.




14

Trƣớ c tình hình đó, nhiều nhóm giải pháp đã đƣợc đƣa ra và một trong

những giải pháp đƣợ c nhiều nhà khoa học quan tâm là sử dụng các loại thức

ăn chăn nuôi có nguồn gốc sinh học hoặc bán sinh học nhƣ sản xuất và bổ sung các chế phẩm enzyme vào trong thức ăn chăn nuôi. Bổ sung chế phẩm

enzyme vào thức ăn chăn nuôi một mặt làm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và

hấp thụ chất dinh dƣỡ ng, từ đó làm tăng tốc độ sinh trƣở ng phát triển, nâng

cao chất lƣợ ng vật nuôi. Mặt khác, nhờ tác dụng của enzyme mà thức ăn đƣợ c

tiêu hóa triệt để, khai thác tối đa nguồn năng lƣợ ng vốn có, tiết kiệm chi phí

chăn nuôi, đồng thờ i làm giảm lƣợ ng phân thải ra ngoài, góp phần quan trọng

trong việc giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờ ng.

Thức ăn gia súc, gia cầm đƣợ c chế biến từ các loại ngũ cốc có chứa

nhiều cellulose và glucan. Những thành phần này thƣờ ng không đƣợ c tiêu hóa

triệt để, làm tăng độ nhớ t của dịch dạ dày. Do đó chúng đã hạn chế sự hấp thu

các chất dinh dƣỡ ng, làm giảm khả năng tiêu hóa của động vật. Bổ sung

-glucanase vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng phân giải các hợ p chất trên,

giải phóng glucose và các oligosaccharide, làm giảm độ nhớ t, tăng khả năng

hấp thu và chuyển hóa thức ăn [14]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung

glucanase độc lập hoặc kết hợ p vớ i các enzyme khác vào thức ăn chăn nuôi

làm tăng đáng kể tốc độ tăng trƣở ng và giảm thiểu bệnh tật cho vật nuôi.

Omogbenigun và cs (2004) cho thấy, khi bổ sung tổ hợ p chế phẩm glucanase

và một số enzyme khác (amylase, invertase, protease, phytase, xylanase)

xử lý thức ăn cho lợ n con 25 ngày tuổi có tác dụng nâng cao khả năng

tiêu hóa so với đối chứng là khẩu phần cơ sở không bổ sung enzyme nhƣ sau:

khả năng tiêu hóa tinh bột tăng 87-94%, các polysaccharide khác

tăng 10-18%, phytate tăng 59-70% [52].

Tiềm năng ứng dụng to lớ n của glucanase trong chăn nuôi đã thu hút sự

quan tâm của nhiều công ty chế biến thức ăn gia súc, gia cầm. Một số chế




15

phẩm là tổ hợ p các enzyme khác nhau có thể kể đến nhƣ: Rovazyme G2

(DSM Nutritional Products Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợ p của 3 loại enzyme

(cellulase, β-glucanase và xylanase); Roxazyme G (DSM Nutritional ProductsLtd, Thụy Sỹ) là tổ hợ p của 7 loại enzyme (cellulase, glucanase, protease,

amylase, pectinase, xylanase, hemicellulase); Natugrain (tập đoàn BASF,

Đức) là hỗn hợ p của endoxylanase và endoglucanase; Rhodizyme-CF

(Rampart-Power Bangladesh Ltd) là tổ hợ p của 5 loại enzyme (cellulase,

amylase, protease, lipase, pectinase). Chế phẩm SSF của Mỹ hiện đang bán tại

thị trƣờ ng Việt Nam là tổ hợ p của 6 loại enzyme: β-glucanase (200 BGU/g),

phytase (1000 PU/g), α-amylase (30 FAU/g), pectinase (4000 AJDU/g),

protease (700 HUT/g) và xylanase (100 XU/g) [3].

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong

chăn nuôi. Chu Thị Thanh Bình và cs (2002) đã nghiên cứu ứng dụng các

chủng nấm men trong chế biến bã thải từ hoa quả giàu chất sơ làm thức ăn

cho gia súc [2].

2.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ

Sử dụng glucanase xử lý nguyên liệu giàu cellulose, glucan trƣớ c khi

lên men đã làm tăng hiệu suất thu hồi dung môi lên trung bình là 1,5%. Nhiều

chế phẩm enzyme đã đƣợ c sử dụng trong ngành công nghiệp này nhƣ

neutrase 0,5L có chứa -glucanase sử dụng trong công nghiệp sản xuất

ethanol. Đồng thờ i, nhiều chủng vi sinh vật kỵ khí trong chi Clostridium

sinh tổng hợ p glucanase đƣợ c sử dụng trong công nghệ lên men sản xuất dung

môi hữu cơ , acetic acid [24], sản xuất acetone, butanol và isopropanol [28].

2.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, nguyên liệu ban đầu đƣợ c

nghiền cơ học và xử lý hóa học để các sợ i gỗ đƣợ c tách riêng khỏi nhau




16

chuyển thành bột giấy chứa các sợ i và bột mịn. Trong quy trình sản xuất giấy

cần loại bỏ lignin khỏi bột giấy, còn cellulose thì đƣợ c giữ lại. Phƣơng pháp

thông thƣờ ng là bổ sung dung dịch chlor hoặc chlor diocide. Đây là một phƣơng pháp tốn kém và thƣờ ng gây ô nhiễm môi trƣờ ng do thành phần chlor

tồn dƣ trong nƣớ c thải. Vì thế, trong những năm gần đây một giải pháp mớ i

đƣợc đƣa ra để thay thế phƣơng pháp truyền thống, đó là sử dụng các

chế phẩm enzyme trong đó có glucanase để xử lý bột giấy.

Glucanase thƣờng đƣợ c bổ sung vào công đoạn nghiền bột giấy để làm

thay đổi nhẹ cấu hình của sợ i cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệmkhoảng 20% năng lƣợ ng cho quá trình nghiền cơ học. Đồng thờ i xử lý

glucanase trƣớ c khi xử lý hóa chất nghiền bột hóa học sẽ làm phá vỡ lớ p vỏ

ngoài của gỗ, làm tăng khả năng khuếch tán của hóa chất vào phía trong gỗ,

tăng hiệu quả khử lignin [14], [15]. Đặc biệt trong công nghệ tái chế giấy,

glucanase đƣợ c sử dụng để tẩy mực in bám trên giấy. Kỹ thuật này đã mở ra

triển vọng đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

tái sinh [37].

2.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rử a

Cùng vớ i protease, lipase, amylase, cellulase và hemicellulase đƣợ c

ứng dụng để sản xuất chất tẩy rửa. Cellulase sẽ thủy phân các tơ sợ i của sợ i

vải là nơi bám của các phân tử bụi bẩn, loại bỏ chúng khỏi quần áo. Tí nh đến

năm 2002 đã có nhiều cellulase đƣợ c sản xuất dùng cho bột giặt nhƣ:endoglucanase và exoglucanase từ Thermomyces lanuginous [51].

2.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh

Việc sử dụng enzyme quan trọng nhất trong công tác bảo vệ môi trƣờ ng

là sử dụng enzyme trong xử lý chất thải, chuyển các chất thải thành sản phẩm

có ích, hoặc trong công nghệ tái sử dụng phế thải, chuyển các phế thải




17

thành sản phẩm có ích. Trong nhiều năm qua cả ở thế giớ i và Việt Nam, các

chủng vi sinh vật sinh tổng hợ p enzyme phân hủy cellulose đã đƣợ c ứng dụng

rất có hiệu quả để xử lý rác thải sinh hoạt. Năm 1999, Nguyễn Lan Hƣơng và cs đã phân lập và tuyển chọn đƣợ c

các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung vào bể

ủ rác thải đã rút ngắn đƣợ c chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5-7 ngày. Nhiều

chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm đã đƣợ c nghiên cứu và ứng dụng có hiệu

quả trong quá trình xử lý rác thải ở Việt Nam [1], [5], [8], [12].

Nhiều chế phẩm vi sinh trong đó có chứa hệ sinh vật sinh tổng hợ pcellulase đã đƣợ c nghiên cứu và sản xuất để xử lý rác thải. Trong đó,

chế phẩm Micromix 3 khi bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn

đƣợ c 15 ngày ủ, giảm một nửa thờ i gian lên men so với đối chứng. Đồng thờ i,

lƣợ ng mùn tạo thành khi xử lý rác bằng chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29%

và các chất dinh dƣỡng cao hơn 10% so với đối chứng. Sản phẩm của quá

trình xử lý rác thải đƣợ c phối trộn và bổ sung thêm một số vi sinh vật có íchcố định đạm tạo thành phân bón vi sinh, đƣợ c sử dụng rộng rãi trong nông

nghiệp đã góp phần nâng cao năng suất cây trồng, giảm thiểu đƣợ c nguồn và

nguy cơ gây ô nhiễm môi trƣờ ng [1].

Ngoài ra, đã có những nghiên cứu ảnh hƣở ng của cellulase đến nấm

gây bệnh cây trồng nhƣ cellulase của Trichoderma harzianum, từ đó ứng

dụng sản xuất thuốc bảo vệ thực vật sinh học [6].

2.6 ẢNH HƢỞ NG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ

NĂNG SINH TỔNG HỢ P ENDO-β-1,4-GLUCANASE

Trong tự nhiên, đa số các loài vi sinh vật sống hoại sinh, phân giải các

nguồn hợ p chất hữu cơ có sẵn trong môi trƣờ ng thành các chất dinh dƣỡ ng

cần thiết cho quá trình sinh trƣở ng và phát triển của mình. Khả năng




18

sinh trƣở ng, phát triển cũng nhƣ khả năng sinh tổng hợ p các enzyme chịu sự

tác động của nhiều yếu tố môi trƣờng nhƣ: nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trƣờ ng,

nguồn carbon, nguồn nitrogen.Nguồn carbon: các loài vi sinh vật sinh tổng hợ p endoglucanase có thể

sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau tùy thuộc đặc điểm của từng loài. Có

loài chỉ thích hợ p vớ i một hoặc một số ít nguồn carbon, có loài thì không đòi

hỏi nghiêm ngặt mà có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau.

Nguồn carbon có thể đơn giản nhƣ các loại đƣờng đơn, đƣờng đôi hoặc

phức tạp nhƣ glucan, tinh bột, cellulose.Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cs (1999) cho thấy, nguồn carbon

thích hợp cho sinh trƣở ng và sinh tổng hợ p cellulase của các chủng vi khuẩn

chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải là glucose và CMC. Nguồn carbon

thích hợ p cho sự sinh trƣở ng và sinh tổng hợ p cellulase của các chủng xạ

khuẩn CD6-9 là tinh bột, chủng CD9-9 là CMC và saccharose, chủng CD5-12

là lactose [5]; các chủng Actinomyces griseus là bã mía hoặc mùn cƣa. Nguồncarbon thích hợp đối vớ i các chủng xạ khuẩn ƣu ấm là vỏ lạc hoặc rơm [12].

Đối vớ i các chủng nấm mốc, nguồn carbon thích hợ p cho quá trình sinh

tổng hợ p cellulase và một số loại enzyme khác là các nguồn carbon tự nhiên,

đặc biệt là các phế phụ phẩm nông nghiệp. Theo Acharya và cs (2008), nguồn

carbon thích hợ p nhất cho các chủng A. niger sinh tổng hợ p endoglucanase là

mùn cƣa [18]. Còn theo kết quả nghiên cứu của Ojumu và cs (2003), chủng A.

flavus Linn isolate NSPR 101 có khả năng sinh tổng hợ p cellulase khi sử

dụng mùn cƣa, bã mía hay lõi ngô làm nguồn cơ chất, trong đó mùn cƣa đƣợ c

xem là nguồn cơ chất tối ƣu.

Các loài Penicillium pinophilum, P. persicinum, P. brasilianum

sinh tổng hợ p cellulase mạnh nhất đối vớ i nguồn cellulose tự nhiên, còn đối




19

vớ i nguồn carbon xylan hoặc birchwood xylan thì khả năng sinh tổng hợ p rất

kém [33]. Theo kết quả nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006), nguồn carbon

thích hợ p nhất cho chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 là rơm [10].Nguồn nitrogen: các loài vi sinh vật khác nhau có nhu cầu khác nhau

đối vớ i nguồn nitrogen. Nhìn chung, các loài đều có khả năng sử dụng cả

nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ nhƣng mức độ đồng hóa tùy thuộc từng loài.

Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợ p cellulase mạnh nhất

trong môi trƣờ ng chứa nguồn nitrogen là peptone và cao nấm men [5].

Nguồn nitrogen urea và đậu nành ảnh hƣở ng mạnh mẽ đến quá trìnhsinh tổng hợ p cellulase của chủng A. niger NRRL-363 vớ i hoạt tính cellulase

tổng số từ 46 đến 76 IU/g [11]. Nghiên cứu của Narasimha và cs (2006) cho

thấy, các chủng A. niger có thể sử dụng nhiều nguồn nitrogen khác nhau nhƣ:

urea, peptone, ammonium nitrate. Trong đó, urea là nguồn nitrogen tốt nhất

cho khả năng sinh tổng hợ p các cellulase của các chủng nấm này [49].

Nhiệt độ nuôi cấy: Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ sinh trƣở ng, cácloài vi sinh vật đƣợc chia làm 3 nhóm: các loài ƣa lạnh và chịu lạnh; các loài

ƣa ấm và các loài chịu nhiệt. Các loài ƣa lạnh có khả năng sinh trƣở ng trong

điều kiện dƣớ i 15C, các loài ƣa ấm thƣờng sinh trƣở ng phát triển tốt ở

khoảng nhiệt độ 20-37C; còn các loài chịu nhiệt có khả năng sinh trƣở ng và

phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50C.

Khi nghiên cứu các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập

từ bể ủ rác thải cho thấy, các chủng này sinh tổng hợ p cellulase mạnh nhất ở

điều kiện nhiệt độ 45-55C và có thể chịu đƣợ c nhiệt độ 65-80C [5].

Nghiên cứu của Nguyễn Lan Hƣơng và cs (2003) cũng cho thấy, các chủng

vi khuẩn và xạ khuẩn ƣa nhiệt sinh tổng hợ p cellulase cao nhất ở nhiệt độ

50C [9]. Chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus có khả năng sinh tổng hợ p




20

cellulase tối ƣu ở nhiệt độ 58C [13]. Trong khi đó, các chủng nấm mốc N1

và N2 có nhiệt độ sinh tổng hợ p cellulase tối ƣu là 31 và 34C [8]. Acharya

và cs (2008) cho rằng, các chủng A. niger tổng hợ p cellulase mạnh nhất khilên men trong điều kiện 28C, pH 4,0-4,5 [18].

pH môi trƣờ ng nuôi cấy ban đầu: pH môi trƣờng ban đầu ảnh hƣở ng

quan trọng đến khả năng sinh tổng hợ p cellulase của các chủng vi sinh vật.

Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trƣờng ban đầu thích hợ p là

acid, trung tính hay kiềm. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh

tổng hợ p cellulase thích hợ p với pH môi trƣờng ban đầu là 8,0 [5]; còn chủngxạ khuẩn Actinomyces griseus thích hợ p với pH môi trƣờng ban đầu là 6,7

[13]. Đối vớ i các chủng nấm mốc N1 và N2 sinh tổng hợ p cellulase tối ƣu ở

môi trƣờ ng có pH ban đầu là 4,5 và 5,5 [8]; các chủng A. niger sinh tổng hợ p

cellulase mạnh nhất trong khoảng pH môi trƣờng ban đầu từ 6,0-7,0 [19].

Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trƣở ng và khả năng sinh tổng hợ p

các loại enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố khác nhƣ: thờ i gian nuôi cấy, tốc độ lắc và sục khí, lƣợ ng giống đƣợ c tiếp vào

ban đầu.

2.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE

Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt

mạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định. Độ bền đối vớ i nhiệt độ và pH hay mức

độ và tính chất chịu ảnh hƣở ng của các chất tẩy rửa, dung môi hữu cơ hay

ion kim loại cũng có sự khác nhau.

Ảnh hƣở ng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác

chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giớ i hạn nhất định, chƣa ảnh hƣở ng

đến cấu trúc enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợ p,

khoảng nhiệt độ thích hợ p của nhiều enzyme vào khoảng 40-50C. Ở nhiệt độ




21

cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính; còn ở

nhiệt độ thấp dƣớ i 0C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhƣng lại có thể

phục hồi khi đƣa về nhiệt độ thích hợ p [4].Cellulase từ A. niger NRRL-363 hoạt động mạnh nhất ở 50C [11];

trong khi đó cellulase từ A. niger Z10 là 40C [25], còn hoạt tính xúc tác của

endoglucanase III từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở 55C [46]. Theo

kết quả nghiên cứu của Kiamoto và cs (1996), các endoglucanase từ chủng A.

oryzae KBN616 hoạt động tốt nhất trong dải nhiệt độ 45-55C [43].

Ảnh hƣở ng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộcvào pH môi trƣờ ng phản ứng. Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH

thích hợ p để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid. Theo

nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, pH tối ƣu cho hoạt động của cellulase từ

A. niger NRRL-363 là 5,5 [11]; của cellulase từ A. niger Z10 là 4,5 và 7,5

[25]; của endoglucanase III từ Trichoderma reesei là 4,0-5,0 [46]; của

endoglucanase từ A. oryzae KBN616 là 4,0 và 5,0 [43]. Khi nghiên cứu ảnhhƣở ng của pH lên hoạt tính endoglucanase từ chủng nấm ƣa acid A. terreus

M11, Gao và cs (2008) cho rằng enzyme này có khả năng hoạt động trong dải

pH 2-5, trong đó pH 2 là tốt nhất [29].

Ảnh hƣở ng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc

hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme. Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất

định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme. Sharma và

cs (1995) nhận thấy, ion Ca2+ làm tăng hoạt tính cellulase của Bacillus sp.

D04 lên 40% so với đối chứng; còn Mg2+ làm giảm nhẹ (hoạt tính còn lại

92%) và Zn2+ ức chế mạnh hoạt tính enzyme này (hoạt tính còn lại bằng 37%

so với đối chứng) [56]. Theo nghiên cứu của Gao và cs (2008), endoglucanase

từ A. terreus M11 bị giảm 77% hoạt tính khi ủ vớ i Hg2+ (2 mM), 59% khi ủ

vớ i Cu2+ (2 mM) [29].




22

Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hƣở ng mạnh

mẽ đến hoạt tính của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng

nhƣ bản chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hƣở ng tớ i hoạt độngcủa enzyme là khác nhau. Nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006) trên chủng

Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy, các dung môi hữu cơ methanol, ethanol,

isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là

n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63%. Các chất

tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và triton X-100 đều làm giảm hoạt tính

cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính

cellulase chỉ còn 18-34% [10].

2.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨ U CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM

Cho đến nay, ở Việt Nam đã có khá nhiều tác giả nghiên cứu về

cellulase nói chung và endo-β-1,4-glucanase nói riêng. Các nghiên cứu đƣợ c

tiến hành trên nhiều phƣơng diện khác nhau liên quan đến loại enzyme này.

Vấn đề môi sinh ngày càng trở nên trầm trọng trên phạm vi toàn cầu. Ở Việt Nam, lƣợ ng rác thải ra ngoài môi trƣờ ng ngày càng lớn, nguy cơ ô nhiễm

môi trƣờ ng ở nhiều nơi là rất cao. Việc sử dụng biện pháp vi sinh học

trong xử lý rác thải đã và đang mang lại nhiều giá trị to lớ n. Tuy nhiên,

việc sử dụng các vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên để xử lý rác thải, thờ i gian

thƣờ ng kéo dài gây nên tình trạng ô nhiễm môi trƣờ ng, tốn nhiều diện tích và

công sức. Để xử lý rác triệt để hơn, giảm giá thành và thờ i gian xử lý,ngoài việc tạo điều kiện thích hợ p cho vi sinh vật phát triển tốt thì việc tuyển

chọn các vi sinh vật có khả năng sinh trƣở ng nhanh, hoạt tính phân giải mạnh,

chịu đƣợ c nhiệt độ cao để bổ sung vào các bể rác là một trong những hƣớ ng

nghiên cứu đã và đang đƣợ c nhiều nhà khoa học quan tâm.

Năm 1999, Tăng Thị Chính và cs đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện

lên men và ảnh hƣở ng của các yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợ p




23

cellulase của một số chủng vi khuẩn ƣa nhiệt đƣợ c phân lập từ bể ủ rác thải,

nhằm tìm ra điều kiện tối ƣu nhất cho khả năng sinh tổng hợ p cellulase, ứng

dụng vào việc xử lý rác thải chứa nhiều cellulose. Kết quả cho thấy, cácchủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng chịu đƣợ c nhiệt độ 80C, nhiệt độ

lên men tối ƣu từ 45C đến 55C, pH môi trƣờng ban đầu thích hợ p nhất là 8.

Nguồn carbon tốt nhất cho sinh trƣở ng và sinh tổng hợ p cellulase của các

chủng vi khuẩn nghiên cứu là glucose và CMC; nguồn nitrogen là peptone và

cao nấm men. Các tác giả cũng đã nghiên cứu động thái của quá trình

sinh tổng hợ p cellulase và kết quả cho thấy, thời gian tích lũy cao nhất ở

48 giờ lên men [5].

Nguyễn Đức Lƣợ ng và cs (1999) đã tiến hành nghiên cứu khả năng

sinh tổng hợ p cellulase của Actinomyces griseus. Qua nghiên cứu tác giả thấy

rằng khả năng sinh tổng hợ p cellulase của A. griseus là cao và

khả năng này đạt tối ƣu ở 58C, pH ban đầu là 6,7, độ ẩm ban đầu là 55% vớ i

thờ i gian nuôi cấy là 72 giờ . Qua nghiên cứu tác giả cũng thấy rằng

nguồn lignocellulose thích hợ p là bã mía hoặc mùn cƣa [13]. Cũng trong năm

này, Phạm Thị Ngọc Lan và cs đã tiến hành nghiên cứu và tuyển chọn đƣợ c

một số chủng xạ khuẩn ƣa ấm phân lập từ mùn rác ở một số nơi có khả năng

phân giải cellulose mạnh. Trong số 195 chủng xạ khuẩn nghiên cứu thì

các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợ c từ các mẫu rơm mục và đất chân đống rơm

có khả năng phân giải cellulose và CMC mạnh nhất [12].

Trong số các loài vi sinh vật, nấm sợ i là một trong những đối tƣợ ng có

khả năng sinh tổng hợ p cellulase cao. Việc tìm ra các chủng nấm sợ i có khả

năng phân hủy cellulose cao và tối ƣu điều kiện sinh tổng hợ p cellulase của

chúng đang là vấn đề đƣợ c nhiều tác giả quan tâm. Năm 1999, Đặng Minh

Hằng đã nghiên cứu tuyển chọn đƣợ c hai chủng nấm sợ i có khả năng phân




24

giải cellulose cao. Tác giả cũng đã nghiên cứu và tìm ra đƣợ c một số điều

kiện tối ƣu cho khả năng sinh tổng hợ p cellulase của hai chủng nấm này [8].

Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh và cs đã nghiên cứu khả năng sinh tổnghợp và đặc điểm của cellulase từ chủng A. niger NRRL-363. Qua nghiên cứu,

tác giả đã tìm ra đƣợ c một số thông tin và điều kiện cơ bản cho sự tổng hợ p

cellulase của chủng này trên môi trƣờ ng trấu xay và một số chất thải

công nghiệp nhƣ mật rỉ đƣờ ng [11].

Bằng cách tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu nhiệt, phân giải

cellulose cao, Lý Kim Bảng và cs (1999) đã xây dựng đƣợ c quy trình

công nghệ sản xuất chế phẩm Micromix 3 bổ sung vào bể ủ rác thải. Nghiên

cứu cho thấy, khi chế phẩm này đƣợ c bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã

rút ngắn đƣợ c 15 ngày ủ, một nửa thờ i gian lên men so vớ i bể đối chứng

bổ sung chế phẩm VSV-xen. Lƣợ ng mùn tạo thành của bể ủ bổ sung

chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29%, và các chất dinh dƣỡng cao hơn 10% so

vớ i bể đối chứng [1].




25

3 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

3.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT

3.1.1 Chủng nấm

Hai mƣơi sáu chủng A. awamori do Viện Vi sinh vật và Công nghệ

Sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội cung cấp đƣợ c sử dụng để tuyển chọn,

nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợ p endoglucanase cao nhất. Từ đó thu

enzyme làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.1.2 Thiết bị thí nghiệm

Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợ c sử dụng trong thí nghiệm

Thiết bị Hãng sản xuất (quốc gia)

Bể ổn nhiệt Trung Quốc

Box cấy LB-1234 Việt Nam

Cân phân tích BL 150S Sartorius (Thụy Sỹ)

Hệ thống chụp ảnh gel Wealtec (Mỹ)

Hệ thống điện di ngang Mupid (Nhật bản)

Lò vi sóng SamSung (Hàn Quốc)

Máy ly tâm lạnh Mikro 22R Hettich (Đức)

Máy quang phổ UV-2500 LaboMed Inc (Mỹ)

Máy PCR Mastercycler personal Eppendorf (Đức)

Máy chuẩn pH 827 pH Lab Metrohm (Thụy Sỹ)

Máy lắc nuôi cấy Certomat HK (Đức)

Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật Bản)

Tủ lạnh 4ºC, -20ºC, -80ºC Toshiba, Sanyo (Nhật Bản)




26

3.1.3 Hóa chất

Bảng 2.2. Danh sách hóa chất chính đƣợ c sử dụng trong thí nghiệm

Hóa chất Hãng sản xuất (quốc gia)

3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) Fluka

Cao nấm men Difco (Mỹ)

DEAE Heldelberg (Đức)

Peptone Merck (Đức)

SDS Sigma (Mỹ)

Sephadex G100 Pharmacia (Mỹ)Sodium dodecylsulfate Sigma (Mỹ)

Triton X-100 Merck (Đức)

Tween-20 BioBasic Inc (Mỹ)

Tween-80 BioBasic Inc (Mỹ)

CMC Prolabo (Pháp)

3.1.4 Môi trƣờ ng

Môi trƣờ ng Czapek: 0,2% (w/v) NaNO3, 0,1% K2HPO4, 0,05%

MgSO4, 0,05% KCl, 2% Saccharose, pH 6,5. Môi trƣờng đặc bổ sung

2% agar.

Môi trƣờ ng MT1 theo Mandles (g/l): urea 0,3; (NH4)2SO

4 1,4;

KH2PO4 2; CaCl2 0,3; MgSO4.7H2O 0,3; peptone 1; cao nấm men 10;tween 80 1; CMC 10; các yếu tố vi lƣợ ng 0,1% (v/v) bao gồm các muối:

FeSO4

18 mM; MnSO4 6,6 mM; ZnSO

4 4,8 mM, CoCl2 15 mM. pH 7,0

[36], [60].

Môi trƣờ ng LB (Luria-Bertani): 1% (w/v) peptone; 0,5% (w/v) cao nấm

men; 1% (w/v) NaCl; pH 7,0, khử trùng, với môi trƣờng đặc bổ sung




27

2% (w/v) agar. Đối vớ i việc chọn chủng mang plasmid, môi trƣờng đƣợ c

bổ sung 100 g/ml ampicillin.

3.1.5 Dung dịch và đệm

Bảng 2.3. Danh sách dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm

Dung dịch Thành phần, nồng độ

Dung dịch Bradford gốc 100 ml 95% ethanol; 350 mg serva blue G; 200 ml88% phosphoric acid

Đệm Bradford thí nghiệm 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88%

phosphoric acid; 30 ml dung dịch bradford gốc

Đệm điện di protein (biếntính)

25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS,pH 8,4

Đệm KP (K2HPO4) 0,1 M K2HPO4, pH 6,5

Đệm tra mẫu protein (biếntính) 5x

10% SDS; 0,05% brommophenol blue; 50%glycerol; 10% 2 mecaptho ethanol pha trong đệm0,312 M Tris-HCl, pH 6,8

Dung dịch DNS (1000 ml) 205,4 g KNaC4H

4O

6.4H

2O; 4,15 g Na

2S

2O

5; 5,3 g

DNS; 9,9 g NaOH; 3,8 ml phenol

Dung dịch I Đệm Tris HCl 50 mM, pH 8,0; 50 mM NaCl

Dung dịch II Đệm Tris HCl 50 mM, pH 8,0; 1000 mM NaCl

Dung dịch III Đệm 80 mM phosphate, pH 7,5

Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8

Dung dịch APS 10% ammonium persulfate

Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8Dung dịch C 30% acrylamide; 0,8% bis-acrylamide

Dung dịch D 10% SDS; 25 mM EDTA

Dung dịch nhuộm gelpolyacrylamide

0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v)methanol; 10% (v/v) acetic acid

Dung dịch rửa PAGE 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acetic acid

Dung dịch protease K 20 g/ml protease K




28

Dung dịch RNase 10 g/ml RNase

Dung dịch ampicillin gốc 100 mg/ml ampicillin

Dung dịch nhuộm gelagarose 0,1 g/ml ethidium bromide

Đệm TE 100 mM Tris- HCl; 1 mM EDTA, pH 8,0

Đệm tra mẫu DNA 6x 0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v)xylene xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol

Đệm TBE 10x 108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTApH 8,0

Đệm cell lysis 10 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% (w/v) SDS, pH 8,0

3.2 PHƢƠNG PHÁP

3.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật

Nuôi cấ y hoạ t hóa nấ m sợ i

Các chủng A. awamori lấy từ các ống giống đƣợ c nuôi cấy trên

môi trƣờ ng Czapek lỏng ở điều kiện 30C, pH 6, 5, lắc 200 vòng/phút trong72 giờ .

Nuôi cấ y nấ m thu sinh khố i enzyme

Các chủng A. awamori sau khi hoạt hóa đƣợ c nuôi cấy chìm trong

môi trƣờ ng MT1 với 0,5% CMC làm cơ chất, ở 30°C, lắc 200 vòng/phút. Sau

96 giờ nuôi cấy, dịch canh trƣờng đƣợ c ly tâm loại sinh khối tế bào, thu dịch

enzyme thô.

3.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase

Đị nh tính hoạ t tính endoglucanase

Hoạt tính endoglucanase đƣợc xác định tƣơng đối theo phƣơng pháp

khuếch tán enzyme trên đĩa thạch. Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất CMC trong

đệm 100 mM potassium phosphate pH 6,5, dày khoảng 0,5 cm đƣợc đục lỗ




29

đƣờ ng kính 0,5 cm. 50 µl dịch enzyme vào lỗ rồi ủ 12 giờ ở 4C cho enzyme

khuếch tán đều xung quanh. Sau đó ủ tiếp 8 giờ ở 37C, lấy ra nhuộm bằng

dung dich 1% lugol và đo đƣờ ng kính vòng phân giải cơ chất.Hoạt tính tƣơng đối của enzyme tỷ lệ thuận vớ i kích thƣớc đƣờ ng kính vòng

phân giải cơ chất: Dhalo = D - d (vớ i D là đƣờ ng kính vòng ngoài và d là

đƣờ ng kính lỗ) [7].

Xác đị nh hoạt độ endoglucanase

Hoạt độ endoglucanase đƣợc xác định chính xác dựa vào lƣợ ng

đƣờ ng khử tạo thành sau phản ứng bằng phƣơng pháp đo quang phổ theo Miller (1959) [47].

Tiến hành

Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,1 ml dịch enzyme đƣợ c hút vào ống

nghiệm, thêm 0,4 ml dung dịch 0,5% CMC trong đệm 100 mM potassium

phosphate, pH 6,5. Hỗn hợp đƣợ c lắc đều và ủ ở 50°C trong 20 phút, sau đó

bổ sung ngay 1,25 ml dung dịch thuốc thử DNS và đun sôi cách thủy 5 phút.

Ống đố i chứ ng: 0,1 ml dịch enzyme đƣợ c hút vào ống nghiệm, thêm

1,25 ml dung dịch thuốc thử DNS ủ trong 5 phút, bổ sung tiếp 0,4 ml dung

dịch 0,5% CMC. Hỗn hợp đƣợ c lắc đều và ủ ở 50°C trong 20 phút, sau đó lấy

ra và đun sôi cách thủy 5 phút.

Hỗn hợ p sau phản ứng đƣợ c đo độ hấp thụ quang phổ ở bƣớ c sóng

540 nm. Kết quả đo độ hấp thụ quang phổ đƣợc đối chiếu với đồ thị chuẩn

nồng độ glucose để suy ra lƣợng đƣờ ng khử tƣơng đƣơng đƣợ c giải phóng ra.

Dự ng đƣờ ng chuẩn: Glucose đƣợc pha trong nƣớ c cất vớ i nồng độ

chuẩn khác nhau từ 0,04-0,18 mg/ml. 2 ml dung dịch glucose chuẩn đƣợ c đo

độ hấp phụ ở bƣớ c sóng 540 nm nhƣ trên. Sau đó, mối tƣơng quan giữa độ

hấp phụ và nồng độ glucose đƣợ c xây dựng bằng phần mềm Microsoft Excel.




30

Kết quả cho thấy, đƣờ ng nồng độ chuẩn glucose tuyến tính trong dải

nồng độ 0,04-0,18 mg/ml (Hình 2.1).

Đƣờ ng chuẩn có phƣơng trình: y = 2,6411x - 0,0799. Trong đó:

y - độ hấp phụ ở bƣớ c sóng 540 nm (OD540 nm); x - nồng độ glucose (mg/ml)

Đơn vị hoạt độ: một đơn vị hoạt độ quốc tế (IU) đƣợc định nghĩa là

lƣợ ng enzyme làm thủy phân cơ chất (CMC) thành đƣờ ng khử tƣơng đƣơng

1 mol glucose trong một phút ở điều kiện thí nghệm.

3.2.3 Khảo sát ảnh hƣở ng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợ p

endoglucanase

3.2.3.1 Thờ i gian nuôi cấ y

Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợ c nuôi cấy trong môi trƣờ ng MT1

cơ bản cho sinh tổng hợ p endoglucanase, dịch canh trƣờng đƣợ c thu

sau những khoảng thờ i gian nuôi cấy khác nhau: từ 24-240 giờ và xác định

hoạt tính endoglucanase.

R² = 0.997

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2

O D

5 4 0

n m

Glucose (mg/ml)

y = 2,6411x - 0,0799

Hình 2.1. Đƣờ ng chuẩn nồng độ glucose




31

3.2.3.2 Ảnh hưở ng củ a nhiệt độ môi trườ ng

Để xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu, chủng nấm nghiên cứu đƣợ c nuôi

trong môi trƣờng MT1 cơ bản cho sinh tổng hợ p endoglucanase, lắc200 vòng/phút ở 25C, 28C; 30C, 32C và 37C; pH 7,0. Dịch canh trƣờ ng

đƣợ c thu sau 96 giờ nuôi cấy và xác định hoạt tính endoglucanase.

3.2.3.3 Ảnh hưở ng củ a nồng độ cơ chấ t cả m ứ ng

Cơ chất vớ i một nồng độ nhất định thƣờng đóng vai trò là chất cảm ứng

cho quá trình sinh tổng hợ p loại enzyme tƣơng ứng. Để xác định khả năng

cảm ứng của cơ chất CMC đến khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase, chủng

A. awamori VTCC-F-099 đƣợ c nuôi cấy chìm trong môi trƣờ ng MT1 cơ bản

pH 7,0, lắc 200 vòng/phút ở 30C, CMC đƣợ c bổ sung vào môi trƣờ ng vớ i

các nồng độ khác nhau từ 0,2-4%. Sau 96 giờ nuôi cấy, thu dịch nổi và

xác định hoạt tính endoglucanase.

3.2.3.4 Ảnh hưở ng củ a nguồ n carbon và nồng độ nguồ n carbon

Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợ c nuôi cấy chìm trong môi trƣờ ng

MT1 cơ bản vớ i 2% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng, nuôi lắc

200 vòng/phút ở 30C, pH 7,0 và nguồn cao nấm men đƣợ c thay thế bằng các

nguồn carbon khác (vỏ cà phê, glucose, vỏ lạc, vỏ quýt, lõi ngô, bã mía,

saccharose, lactose, vỏ cám trấu, mùn cƣa, xơ dừa) vớ i cùng nồng độ. Dịch

nổi canh trƣờng đƣợ c thu sau 96 giờ để xác định hoạt tính endoglucanase

ngoại bào.

Sau khi chọn đƣợ c lõi ngô là nguồn carbon thích hợ p nhất cho

khả năng sinh tổng hợp endoglucanase, lõi ngô đƣợ c bổ sung vào môi trƣờ ng

vớ i các nồng độ khác nhau từ 0-5% (w/v) để xác định nồng độ tối ƣu.




32

3.2.3.5 Ảnh hưở ng củ a nguồ n nitrogen


MT1 cơ bản vớ i 2% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng, 3% lõi ngô làmnguồn carbon, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 30C, pH 7,0 và các nguồn nitrogen

(ammonium sulphate, urea, peptone) đƣợ c thay thế bằng các nguồn nitrogen

khác vớ i cùng nồng độ. Dịch nổi canh trƣờng đƣợ c thu sau 96 giờ nuôi cấy để

xác định hoạt tính endoglucanase ngoại bào.

3.2.3.6 Ảnh hưở ng của pH môi trườ ng


MT1 bổ sung 2% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng, 3% lõi ngô làm

nguồn carbon và 0,3% ammonium acetate làm nguồn nitrogen, nuôi lắc

200 vòng/phút ở 30C, pH ban đầu thay đổi từ 3,0-8,0. Dịch nổi môi trƣờ ng

đƣợ c thu ở 96 giờ để xác định hoạt tính endoglucanase ngoại bào.

3.2.4 Tinh sạch enzyme

Dịch enzyme sau khi đƣợ c ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, đƣợ c

đƣa lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100 vớ i tổng thể tích 10 ml. Cột có

kích thƣớc 2,6 x 60 cm đƣợ c cân bằng với đệm 50 mM potassium phosphate,

pH 7,5. Tốc độ dòng chảy là 25 ml/giờ . Thu 20 phân đoạn, thể tích

mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lƣợ ng protein và hoạt tính enzyme đƣợc xác định

trong mỗi phân đoạn.

Dịch enzyme sau khi qua cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100, chọn

những phân đoạn có hoạt tính endoglucanase cao đƣợ c đƣa tiếp lên cột sắc kí

trao đổi ion DEAE vớ i tổng thể tích 12 ml. Cột có kích thƣớ c 2,6 x 60 cm

đƣợ c cân bằng với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM NaCl, thôi mẫu

bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1000 mM NaCl. Tốc độ dòng chảy là




33

20 ml/giờ . Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lƣợ ng

protein và hoạt tính enzyme đƣợc xác định cho mỗi phân đoạn. Quá trình

tinh sạch endoglucanase có thể đƣợ c tóm tắt nhƣ sơ đồ hình 2.2.Dịch enzyme thô

↓ Ly tâm 10000 vòng/10 phút

↓ Dịch trong

↓ Cột Sephadex G100

↓

Cột DEAE↓

Enzyme tinh sạch

ình 2.2. Quy trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099

3.2.5 Điện di SDS-PAGE

Khối lƣợ ng phân tử tƣơng đối của enzyme tách chiết và độ tinh sạch

của các dịch enzyme đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp điện di trên gel

polyacrylamide theo Laemmli [44]. Thành phần gel điện di đƣợ c thể hiện nhƣ

bảng 2.4.

Bảng 2.4. Thành phần gel điện di biến tính protein

Thành phần Gel tách (l) Gel co (l)

H2O 1940 1180

Dung dịch A 1500 0

Dung dịch B 0 500

Dung dịch C 2500 300

Dung dịch D 60 20

APS 10% 24 10

TEMED 7 5

Tổng 6031 2015




34

Bản điện di đƣợ c chạy với cƣờng độ dòng điện 18-20 mA cho gel

co và 25-28 mA cho gel tách.

3.2.6 Xác định tính chất lý hóa của endoglucanase

3.2.6.1 Ảnh hưở ng củ a nồng độ cơ chấ t

Để tìm nồng độ cơ chất thích hợp dùng xác định hoạt tính

endoglucanase, phản ứng đƣợ c thực hiện vớ i các nồng độ cơ chất từ 0,2-2%

CMC pha trong đệm 100 mM potassium phosphate, pH 6,5. Hoạt tính enzyme

đƣợc xác định sau 20 phút phản ứng ở 50C.

3.2.6.2 Xác đị nh nhiệt độ tối ư u và độ bề n nhiệ t

Hỗn hợ p phản ứng của dịch enzyme (0,002 mg protein) với cơ chất

1,2% (w/v) CMC pha trong đệm potassium phosphate pH 6,5 đƣợ c ủ ở các

nhiệt độ khác nhau trong khoảng 30-70C, trong 20 phút để tìm nhiệt độ phản

ứng tối ƣu.

Để xác định độ bền nhiệt của endoglucanase từ chủng nấm nghiên cứu,dịch enzyme đã tinh sạch (0,002 mg protein) đƣợ c ủ ở các nhiệt độ khác nhau

từ 30C đến 70C, sau các khoảng thờ i gian: 6; 12; 24; 36; 48; 60 và 72 giờ .

Hoạt tính còn lại của enzyme đƣợc xác định theo phƣơng pháp nêu trên vớ i

thờ i gian phản ứng là 20 phút ở nhiệt độ phản ứng tối ƣu.

3.2.6.3 Xác đị nh pH phả n ứ ng tối ưu và độ bề n pH

Để xác định pH phản ứng tối ƣu cho phản ứng xúc tác của enzyme

nghiên cứu, dịch enzyme tinh sạch (0,002 mg protein) đƣợ c ủ vớ i cơ chất

CMC pha trong đệm 100 mM sodium acetate, pH từ 3,5-5,5 và 100 mM

potassium phosphate, pH từ 6,0-8,0, hỗn hợ p phản ứng đƣợ c ủ ở 50C trong

20 phút.




35

Để đánh giá độ bền pH của enzyme nghiên cứu, trƣớ c hết

endoglucanase (0,002 mg protein) đƣợ c ủ trong các đệm có pH thay đổi trong

khoảng 3,5-8,0, trong 2 giờ ủ ở 37C. Sau đó, chọn ra khoảng pH thích hợ pđể tiếp tục xác định độ bền pH theo thờ i gian: 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ .

3.2.6.4 Ảnh hưở ng củ a dung môi hữu cơ

Để đánh giá ảnh hƣở ng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính

endoglucanase, dịch enzyme đƣợ c ủ vớ i 10-30% các loại dung môi hữu cơ:

acetone, ethanol, isopropanol, methanol và n-butanol ở nhiệt độ 37C. Sau

2 giờ ủ, hoạt tính còn lại của enzyme đƣợc xác định.

3.2.6.5 Ảnh hưở ng củ a mộ t số chấ t tẩ y rử a

Dịch enzyme (0,002 mg protein) đƣợ c ủ vớ i 0,5-2% chất tẩy rửa tween

20, tween 80, SDS và triton X-100 ở nhiệt độ 37C. Sau 2 giờ , hoạt tính còn

lại đƣợc xác định để đánh giá ảnh hƣở ng của chúng lên hoạt tính

endoglucanase.

3.2.6.6 Ảnh hưở ng củ a ion kim loại

Để đánh giá tính chất và mức độ ảnh hƣở ng của ion kim loại lên

hoạt tính endoglucanase, dịch enzyme (0,002 mg protein) đƣợ c ủ cùng vớ i

muối của các ion kim loại: Ag+, Ca2+, Co2+, Cu2+, Fe3+, K+, Mg2+, Ni2+, Zn2+

và EDTA ở các nồng độ từ 5-15 mM ở 37C. Sau 2 giờ , hoạt tính còn lại của

enzyme đƣợc xác định.

3.2.7 Xác định hàm lƣợ ng protein tổng số

Hàm lƣợ ng protein đƣợc xác định theo phƣơng pháp Bradford.

Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng vớ i

Coomassie Brilliant Blue sẽ hình thành phức hợ p màu có khả năng hấp thụ

ánh sáng mạnh nhất ở bƣớc sóng 595 nm, cƣờng độ màu tỉ lệ thuận vớ i




36

nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lƣợ ng protein tổng số đƣợc xác định

dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò (Hình 2.3).

R² = 0.993

0.0

0.2

0.4

0.6

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

O D 5 9 5 n m

Hàm lượng protein (mg/ml)

y = 2,5x - 0,0169

Hình 2.3. Đƣờ ng chuẩn Bradford dùng BSA làm chuẩn

3.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử

3.2.8.1 Tách chiế t DNA tổ ng số củ a nấ m sợ i

Tế bào nấm sợi đƣợ c nuôi cấy trong môi trƣờ ng Czapek ở 30C, lắc

200 vòng/phút, sau 72 giờ dịch canh trƣờ ng đƣợ c ly tâm 10.000 vòng/phút

trong 10 phút. Tủa tế bào đƣợ c nghiền nhanh, nhẹ trong cối sứ chứa nitrogen

lỏng, sau đó đƣợ c bổ sung 600 l đệm cell lysis và lắc nhẹ. Bổ sung 65 llysozyme, ủ ở 37C trong 45 phút, cho 25 l protease K ủ ở 55C

trong 2-3 giờ . Bổ sung tiếp hỗn hợ p chloroform/isoamyl alcohol (24:1) vớ i

thể tích tƣơng đƣơng, trộn đều trong 5 phút, sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút

trong 15 phút. Hút 500 l dịch nổi chứa DNA sang ống eppendorf mớ i và

bổ sung 500 l isopropanol. Hỗn hợp đƣợc đảo nhẹ và tủa DNA ở -20C




37

trong 2-3 giờ . Tủa sau khi ly tâm đƣợ c làm khô bằng giấy thấm và bổ sung

500 l 70% ethanol để rửa DNA, loại muối và isopropanol. Sau khi ly tâm

12.000 vòng/phút trong 10 phút, tủa đƣợ c làm khô, hòa trong 40 l đệm TEvà bảo quản ở -20C [54].

3.2.8.2 Khuếch đại gene bằ ng PCR

Đoạn gene 28S rRNA của chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợ c

khuếch đại bằng kỹ thuật PCR, sử dụng cặp mồi NL1 (5-GCATATCAA

TAAGCGGAGGAAAAG-3 ); NL4 (5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3).

Hỗn hợ p phản ứng PCR bao gồm: 1 l DNA khuôn; 0,5 l mồi

mỗi loại; 1,2 l 25 mM MgCl2; 1 l Taq polymerase; 1,6 l 2,5 mM dNTP;

2 l đệm PCR, bổ sung nƣớ c cất lên tổng thể tích 20 l. Phản ứng thực hiện

theo chu trình nhiệt: 95C/5 phút; 35 chu kỳ: 95C/1 phút, 50C/1 phút,

72C/1 phút; 72C/10 phút. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel

0,8% agarose. 3.2.8.3 Gắ n dính DNA

Phản ứng gắn dính sản phẩm PCR vào vector tách dòng pJET 1.2/blunt

đƣợ c thực hiện theo protocol của hãng Fermentas. Hỗn hợ p bao gồm:

2 l H2O; 5 l đệm gắn dính 2x; 0,5 l DNA blunting enzyme; 1,5 l

sản phẩm PCR. Hỗn hợp đƣợ c trộn đều và ủ ở 70C trong 15 phút. Sau

đó, lấy ra bổ sung tiếp 0,5 l vector pJET 1.2/blunt và 0,5 l T4-DNA

ligase. Phản ứng gắn dính đƣợ c thực hiện ở 22C trong 2-3 giờ để tạo plasmid

tái tổ hợ p.




38

3.2.8.4 Biế n nạ p plasmid hóa họ c

Plasmid đƣợ c biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5 theo

phƣơng pháp sốc nhiệt và hóa học. Một khuẩn lạc E. coli DH5 đƣợ c cấychuyển vào 3 ml môi trƣờ ng LB, lắc 200 vòng/phút ở 37C qua đêm. 100 ml

môi trƣờ ng LB đƣợ c tiếp giống vớ i 1 ml dịch tế bào đã nuôi qua đêm,

nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37C. Khi OD600 nm đạt 0,4-0,6 (khoảng 2-3 giờ

nuôi cấy), dịch nuôi cấy đƣợ c thu lại và đặt vào trong đá lạnh 1 giờ , rồi ly tâm

6000 vòng/phút trong 10 phút ở 4C. Tủa tế bào đƣợc hòa đều trong 100 ml

dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh vô trùng, ủ đá 15 phút và ly tâm nhƣ trên.Tủa tế bào lại đƣợc hòa đều trong 40 ml dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh vô

trùng, ủ đá khoảng 1 giờ và ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút. Tủa

tế bào đƣợ c hòa vào 500 l dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh, vô trùng chứa

15% glycerol. Dịch hỗn hợ p tế bào và glycerol đƣợ c chia nhỏ 40 l vào các

ống eppendorf, dùng biến nạp ngay hoặc bảo quản ở -80C.

Năm l plasmid tái tổ hợp đƣợ c trộn vớ i 40 l dịch tế bào khả biến, ủ

20-30 phút ở 4C. Hỗn hợp đƣợ c gây sốc nhiệt 45 giây ở 42C. Sau đó

đặt ngay vào đá lạnh, để 5 phút rồi bổ sung 250 l môi trƣờng LB đã khử

trùng. Sau khi nuôi lắc hỗn hợ p 200 vòng/phút trong khoảng 45-60 phút ở

37C vớ i 50-200 l dịch tế bào đã biến nạp đƣợ c cấy chải trên môi trƣờ ng LB

đặc có chứa chất kháng sinh ampicillin, ủ qua đêm ở 37C.

3.2.8.5 Tách chiế t DNA plasmid

Mỗi khuẩn lạc biến nạp phát triển trên đĩa thạch đƣợ c cấy vào ống

nghiệm chứa 1,5 ml LB lỏng đã bổ sung 0,1% (v/v) ampicillin, nuôi lắc

qua đêm ở 37C, 200 vòng/phút. Tủa tế bào từ 1,5 ml dịch nuôi cấy (ly tâm

6000 vòng/phút trong 5 phút) đƣợ c lắc rung khoảng 30 giây trong 150 l




39

dung dịch I thành dịch đồng nhất, ủ 15-20 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó,

thêm 150 l dung dịch II vào hỗn hợp và đảo trộn nhẹ, tiếp tục bổ sung

150 l dung dịch III vào hỗn hợp và đảo trộn nhẹ. Hỗn hợp đƣợ c bổ sung450 l dung dịch chloroform/isoamyl alcohol (24:1), lắc rung và ly tâm

13.000 vòng/phút trong 10 phút. 450 l pha trên đƣợ c hút sang ống mớ i,

bổ sung 320 l isopropanol, lắc nhẹ và ủ 5 phút ở -80C để tủa DNA plasmid.

Tủa DNA plasmid (ly tâm 15 phút với 13.000 vòng/phút) đƣợ c rửa vớ i 500 l

70% ethanol ở 4C để loại muối và isopropanol và đƣợ c làm khô trong không

khí ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng tủa DNA plasmid đƣợc hòa trong đệm TE

pH 8,0 hoặc nƣớ c khử ion vô trùng, phân tích điện di, cắt bằng enzyme

cắt hạn chế để kiểm tra phân đoạn chèn hoặc bảo quản ở -20C [54].

Sau đó, plasmid tái tổ hợp mang đoạn gene cần tách dòng đƣợ c biến

nạp lại vào tế bào E. coli DH5, tách chiết và đƣợ c tinh sạch theo protocol:

bổ sung 0,25 l RNase vào dịch chứa plasmid, ủ ở 37ºC trong 1-2 giờ , lấy ra

bổ sung 450 l H2O khử ion và đảo đều hỗn hợ p. Tiếp đó, bổ sung 450 l

chloroform/isoamyl alcohol (24:1), đảo đều trong 5 phút. Sau khi ly tâm

13.000/phút trong 15-20 phút, dịch nổi đƣợ c hút sang ống eppendorf mớ i và

bổ sung 500 l isopropanol cùng vớ i 30 l dung dịch 3 M CH3COONa.

Hỗn hợp đƣợ c ủ ở -20ºC trong 15-20 phút, sau đó lấy ra ly tâm

13000 vòng/phút trong 20 phút để thu tủa. Tủa đƣợ c rửa lại 2 lần bằng

70% ethanol. Sau khi tủa đƣợ c rửa sạch và làm khô sẽ đƣợ c hòa trong 40 l

H2O. Mẫu plasmid tinh sạch đƣợ c sử dụng để giải trình tự nucleotide [54].

3.2.8.6 C ắ t DNA bằ ng enzyme cắ t hạ n chế

DNA plasmid tái tổ hợp đƣợ c cắt bằng cặp enzyme cắt hạn chế XbaI và

XhoI trong 2 giờ ở 37C để kiểm tra phân đoạn chèn. Hỗn hợ p phản ứng

gồm: 3 l DNA plasmid tái tổ hợ p; 0,25 l enzyme cắt hạn chế mỗi loại; 2 l




40

đệm Tango Y+; bổ sung nƣớ c khử ion đến tổng thể tích 10 l. Sau phản ứng,

sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel 0,8% agarose để kiểm tra.

3.2.8.7 Điên di gel agaroseNguyên lí của phƣơng pháp này là dựa vào đặc tính của DNA là

đại phân tử tích điện âm, dó đó trong môi trƣờng có điện trƣờ ng, các phân tử

DNA có kích thƣớ c khác nhau di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng vớ i

tốc độ khác nhau. Bản gel agarose thích hợ p cho việc làm giá đỡ phân tách

các phân tử DNA. Điện di DNA hoặc plasmid đƣợ c thực hiện trên gel

0,8% (w/v) agarose. Agarose đƣợc pha trong đệm 1x TBE, vi sóng choagarose tan hoàn toàn. Sau đó để nguội xuống khoảng 60C và đổ vào khay

điện di đã cài lƣợ c sẵn. Khi gel đã đông ổn định thì gỡ lƣợc ra, đặt vào buồng

điện di và tra mẫu. Sau khi chạy điện di xong, bản gel đƣợ c lấy ra khỏi khuôn

và nhuộm trong EtBr khoảng 3-5 phút, EtBr có thể cài xen vào trong DNA và

phát sáng dƣớ i ánh sáng tia cực tím, do đó có thể phát hiện ra sự hiện diện

của DNA.

3.2.8.8 Giải trình tự nucleotide

Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, phân đoạn chèn đƣợ c giải trình tự

nucleotide theo nguyên lý của phƣơng pháp Sanger cải tiến dựa trên các

dideoxynucleotide. DNA polymerase xúc tác gắn các deoxynucleotide vào

đầu 3‘-OH mạch đơn DNA đang tổng hợ p, khi gặp dideoxynucleotide

đánh dấu huỳnh quang không có nhóm 3’-OH phản ứng tổng hợ p sẽ bị dừng

lại. Kết quả là hỗn hợ p sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide

có kích thƣớc hơn kém nhau một nucleotide và đƣợ c phát hiện bằng mẫu dò

huỳnh quang trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM 3100

Avant Genetic Analyzer. Kết quả đọc trình tự đƣợ c phân tích, xử lý

bằng phần mềm DNAStar để so sánh trình tự nucleotide.




41

3.2.9 Phƣơng pháp xử lý số liệu

Phần mềm Microsoft Excel đƣợ c sử dụng để xử lý số liệu thu đƣợ c

trong quá trình thực nghiệm và tính giá trị của các tham số thống kê.Chƣơng trình DNAstar đƣợ c sử dụng để phân tích trình tự nucleotide,

so sánh trình tự nucleotide và xây dựng cây phân loại chủng nấm nghiên cứu.




42

4 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS

AWAMORI SINH TỔNG HỢ P ENDOGLUCANASE CAO

4.1.1 Tuyển chọn

Hai mƣơi sáu chủng A. awamori đƣợ c nuôi cấy chìm trong môi trƣờ ng

nuôi cấy cơ bản cho sinh tổng hợ p endoglucanase, ở 30ºC, lắc 200 vòng/phút,

sau 96 giờ thu dịch enzyme thô. Sử dụng phƣơng pháp khuếch tán enzyme

trên đĩa thạch để định tính hoạt tính endoglucanase và phƣơng pháp đo hoạt

độ endoglucanase đã chọn đƣợ c chủng A. awamori VTCC-F-099 có khả năng

sinh tổng hợ p endoglucanase cao nhất trong số 26 chủng A. awamori

nghiên cứu (Hình 3.1, Bảng 3.1). Nhƣ vậy, chủng A. awamori VTCC-F-099

đƣợ c chọn để tối ƣu các điều kiện nuôi cấy và tinh sạch, đánh giá tính chất

lý hóa của endoglucanase.

Hình 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori nghiên cứu




44

Hình 3.2. Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): vớ i khuônDNA tách chiết từ chủng A. awamori VTCC-F-099; Sản phẩm cắt vector tái

tổ hợ p bằng XbaI và XhoI (C). M: Marker.

Plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gene mong muốn đã đƣợ c tách vớ i số

lƣợ ng lớ n và làm sạch theo protocol của Sambrook và Russell (2001) để đọc

trình tự nucleotide. Đoạn gene 28S rRNA của các chủng nấm sợ i nghiên cứu

đƣợc xác định trình tự nucleotide trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM3100 Avant Genetic Analyzer. Đoạn gene 28S rRNA của chủng A. awamori

VTCC-F-099 có chiều dài 614 bp (Bảng 3.2).

So sánh trình tự đoạn gene 28S rRNA của chủng nấm nghiên cứu vớ i

một số trình tự gene 28S rRNA của nấm sợ i đã công bố trên GenBank cho

thấy, chủng A. awamori VTCC-F-099 có quan hệ họ hàng gần gũi vớ i một số

đại diện thuộc chi Aspergillus. Phân tích số liệu bằng phần mềm DNAStarcho thấy chủng A. awamori VTCC-F-099 có độ tƣơng đồng 99,5% vớ i chủng

A. awamori VTCC-F-296 (GQ903327), 96,9% vớ i chủng A. flavus IFM

54306 (AB363745), 96,6% vớ i chủng A. flavus UWFP 570 (AY216669),

96,1% vớ i chủng A. flavipes UWFP 1022 (AY216668). Trình tự đoạn gene

28S rRNA của chủng A. awamori VTCC-F-099 đã đƣợc đăng ký trong

Genbank vớ i mã số là GQ892590.

30002000

1500

1000750500

250

614 bp

bp

15001000750500

250

bp

15001000750500

250

A B C




45

Nucleotide Substitutions x100

0

1.8

Af 4

Af 6

Aa 2

Aa 9Af 6

Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. awamori VTCC-F-099

Af 45: Aspergillus flavus IFM 54306 (AB363745); Af 69: A. flavus UWFP

570 (AY216669); Aa 27: A. awamori VTCC-F-296 (GQ903327); Aa 90: A. awamori VTCC-F-099 (GQ892590); Af 68: A. flavipes UWFP 1022

(AY216668)

4.2 TỐI ƢU CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢ P ENDOGLUCANASE

4.2.1 Khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase theo thờ i gian

Để đánh giá khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase theo thờ i gian,

chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợ c nuôi cấy trong môi trƣờ ng MT1 ở

30C, lắc 200 vòng/phút. Dịch canh trƣờ ng nuôi cấy đƣợ c thu ở các thờ i gian

khác nhau để xác định hoạt tính endoglucanase. Kết quả cho thấy, khả năng

sinh tổng hợ p endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 tăng dần từ

24 giờ đến 96 giờ nuôi cấy. Tại thời điểm 96 giờ chủng này sinh tổng hợ p

endoglucanase mạnh nhất, hoạt tính đạt 0,55 IU/ml. Sau đó, hoạt tính

endoglucanase giảm dần trong các khoảng thờ i gian nuôi cấy tiếp theo. Sau

120 giờ nuôi cấy hoạt tính là 0,39 IU/ml, đạt 71% và đến 240 giờ hoạt tính là

0,33 IU/ml, đạt 60% so vớ i hoạt tính cực đại (Hình 3.4, Bảng 3.3).




46

0

40

80

120

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264

H o

ạ t t í n h e n d o g l u c a n a s e t ư ơ n g đ ố i ( % )

Thời gian nuôi cấy (giờ)

Hình 3.4. Khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase theo thờ i gian của

chủng A. awamori VTCC-F-099

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợ p vớ i một số kết quả

nghiên cứu trong nƣớc cũng nhƣ trên thế giớ i. Theo kết quả nghiên cứu của

một số tác giả trƣớc đây cho thấy, các chủng thuộc Trichoderma harzianam,

Trichoderma spp , Phanerochaete chrysosporium và A. niger sinh tổng hợ p

endoglucanase cao nhất sau 96 giờ nuôi cấy vớ i hoạt tính enzyme tƣơng ứng

là 1,88; 1,53; 2,40 và 0,096 IU/ml [18], [41]. Các chủng nấm sợ i phân lập từ

rác thải sinh tổng hợ p cellulase mạnh nhất sau 144 giờ nuôi cấy [8], còn ba

chủng nấm sợ i thuộc các loài Penicillium pinophinum, P. persicinum,

P. brasilianum có khả năng sinh tổng hợ p cellulase mạnh nhất sau 110-140

giờ nuôi cấy vớ i hoạt tính khoảng 0,4 IU/ml [33], chủng Penicillium sp.

DTQ-HK1 sinh tổng hợ p cellulase mạnh nhất sau 120 giờ nuôi cấy [10].

Tăng Thị Chính và cs (1999) khi nghiên cứu một số chủng vi khuẩn và

xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải cho thấy, các chủng vi khuẩn




47

sinh tổng hợ p cellulase mạnh nhất sau 48 giờ nuôi cấy, còn các chủng

xạ khuẩn sinh tổng hợ p cellulase mạnh nhất sau 48-72 giờ nuôi cấy [5].

Nhƣ vậy, các chủng nấm sợ i thƣờ ng sinh tổng hợ p endoglucanase chậm hơnso vớ i các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn.

4.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy

Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợ c nuôi cấy trong môi trƣờ ng MT1,

lắc 200 vòng/phút trong 96 giờ , ở các nhiệt độ khác nhau: 25, 28, 30, 32 và

37C để đánh giá ảnh hƣở ng của nhiệt độ môi trƣờ ng nuôi cấy lên khả năng

sinh tổng hợ p endoglucanase của chủng nấm này và tìm ra nhiệt độ nuôi cấytối ƣu. Kết quả trên hình 3.5 cho thấy, hoạt tính endoglucanase tăng dần trong

dải nhiệt độ 25C-30C, nhiệt độ tối ƣu cho khả năng sinh tổng hợ p

endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu là 30C, hoạt tính đạt 0,56 IU/ml.

Ở các nhiệt độ cao hơn, hoạt tính endoglucanase lại giảm dần, ở 37C chỉ còn

0,44 IU/ ml, đạt 78% so vớ i hoạt tính cực đại (Hình 3.5, Bảng 3.4).

Khi nghiên cứu trên các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt

phân lập từ bể ủ rác thải, Tăng Thị Chính và cs (1999) thấy rằng, các chủng

này sinh tổng hợ p cellulase mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ 45-55C và có thể

chịu đƣợ c nhiệt độ 65-80C [5]. Nghiên cứu của Nguyễn Lan Hƣơng và cs

(1999) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn ƣa nhiệt sinh tổng hợ p

cellulase cao nhất ở nhiệt độ 50C [9]. Chủng xạ khuẩn thuộc Actinomyces

griseus có khả năng sinh tổng hợ p cellulase tối ƣu ở nhiệt độ 58C [13].

Theo Acharya và cs (2008), các chủng A. niger sinh tổng hợ p cellulase mạnh

nhất khi lên men trong điều kiện 28C, pH 4,0-4,5 [18]. Kết quả nghiên cứu

của Trịnh Đình Khá (2006) trên chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy,

chủng này sinh tổng hợ p cellulase mạnh nhất khi nuôi cấy trong điều kiện

30C [10]. Nhƣ vậy, chủng A. awamori VTCC-F-099 là một chủng ƣa ấm và




48

trong các nhiệt độ khảo sát, nhiệt độ tối ƣu cho khả năng sinh tổng hợ p

endoglucanase là 30C.

0

40

80

120

20 25 30 35 40

H o ạ t t í n h e n d o g l u c a n a s e t ư ơ n g đ ố i ( % )

Nhiệt độ nuôi cấy (oC)

Hình 3.5. Ảnh hƣở ng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợ p

endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099

4.2.3 Ảnh hƣở ng của nồng độ cơ chất cảm ứ ng

Cơ chất vớ i một nồng độ nhất định thƣờng đóng vai trò là chất cảm ứng

cho quá trình sinh tổng hợ p một loại enzyme tƣơng ứng. Để xác định khả

năng cảm ứng của cơ chất CMC đến khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase,

chủng nấm nghiên cứu đƣợ c nuôi cấy trong môi trƣờng cơ bản cho sinh tổng

hợ p endoglucanase, CMC đƣợ c bổ sung vớ i các nồng độ khác nhau:

từ 0,2-4%, sau 96 giờ thu dịch canh trƣờng và xác định hoạt tính

endoglucanase. Kết quả cho thấy, khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase

của chủng A. awamori VTCC-F-099 thay đổi rõ rệt khi nồng độ CMC trong

môi trƣờng thay đổi. Hoạt tính endoglucanase tăng dần trong dải nồng độ




49

từ 0-2% CMC, đạt cực đại tại nồng độ 2% (0,81 IU/ml). Sau đó, khi nồng độ

CMC tiếp tục tăng vƣợ t quá 2% thì hoạt tính endoglucanase lại giảm dần. Ở

nồng độ 3% CMC thì hoạt tính endoglucanase còn khoảng 61% (0,49 IU/ml)và ở nồng độ 4% hoạt tính chỉ còn 0,42 IU/ ml, đạt khoảng 52% so vớ i

hoạt tính khi đạt cao nhất (Hình 3.6, Bảng 3.5). Nhƣ vậy, CMC vớ i nồng độ

2% có vai trò cảm ứng tốt nhất khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase ngoại

bào của chủng A. awamori VTCC-F-099.

0

40

80

120

0 1 2 3 4 5

H o ạ t t í n

h e n d o g l u c a n a s e t ư ơ n g đ ố i

( % )

Nồng độ CMC (%)

Hình 3.6. Ảnh hƣở ng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợ p


Khi nghiên cứu chủng Penicillium sp. DTQ-HK1, Trịnh Đình Khá

(2006) thấy rằng, chủng này sinh tổng hợ p cellulase mạnh nhất khi 0,5%

CMC đƣợ c bổ sung vào môi trƣờ ng nuôi cấy [10].




50

4.2.4 Ảnh hƣở ng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon

Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợ c nuôi cấy trong môi trƣờ ng MT1

chứa 2% CMC, cao nấm men đƣợ c thay thế bằng một số nguồn carbon khác,ở 30C, lắc 200 vòng/phút, sau 96 giờ . Kết quả cho thấy, khả năng

sinh tổng hợ p endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu khi sử dụng các

nguồn carbon khác nhau có sự sai khác đáng kể. Trong đó, hoạt tính enzyme

này cao nhất khi lõi ngô đƣợ c sử dụng làm nguồn carbon thay cho cao nấm

men (0,87 IU/ml), tiếp theo là bã mía (0,75 IU/ml) và glucose (0,70 IU/ml)

(Bảng 3.6). Nhƣ vậy, vớ i mục đích tìm nguồn nguyên liệu sắn có, nhất lànguồn phế phụ phẩm nông nghiệp thì lõi ngô đƣợ c xem là nguồn carbon

thay thế thích hợ p cho chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợ p

endoglucanase.

Bảng 3.6. Ảnh hƣở ng của nguồn carbon

Nguồn carbonHoạt tính endoglucanase

IU/ml %Bã mía 0,75 ± 0,146 86

Cao nấm men 0,65 ± 0,166 74

Glucose 0,70 ± 0,134 80

Lactose 0,28 ± 0,084 32

Lõi ngô 0,87 ± 0,158 100

Mùn cƣa 0,39 ± 0,101 45

Xơ dừa 0,54 ± 0,129 62Sucrose 0,60 ± 0,019 69

Vỏ cà phê 0,64 ± 0,127 74

Vỏ cám trấu 0,57 ± 0,052 65

Vỏ lạc 0,51 ± 0,026 59

Vỏ quýt 0,65 ± 0,166 74




51

Theo một số nghiên cứu trƣớ c đây, các chủng nấm mốc sinh tổng hợ p

các enzyme thuộc nhóm cellulase mạnh trong những môi trƣờ ng có

nguồn carbon tự nhiên nhƣ mùn cƣa, bã mía, lõi ngô [18], [50]. Ở một số

chủng Penicillium có khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase và -glucosidase

mạnh trong môi trƣờ ng có nguồn cơ chất cellulose tự nhiên còn đối vớ i

nguồn cơ chất là xylan yến mạch và birchwood xylan thì hoạt tính rất thấp

[33]. Chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 sinh tổng hợ p cellulase mạnh nhất khi

0,6% rơm đƣợ c sử dụng nhƣ một nguồn carbon [10].

Sau khi tìm đƣợ c nguồn carbon thay thế thích hợ p là lõi ngô, chúng tôi

tiến hành tối ƣu nồng độ nguồn carbon thay thế trên. Kết quả nghiên cứu cho

thấy, hoạt tính endoglucanase có sự thay đổi đáng kể khi thay đổi nồng độ

lõi ngô trong môi trƣờ ng nuôi cấy. Trong dải nồng độ khảo sát (0,5-5%) thì

nồng độ lõi ngô thích hợ p nhất cho khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase của

chủng nấm nghiên cứu là 3%, hoạt tính đạt 0,90 IU/ml (Hình 3.7, Bảng 3.7).

0

40

80

120

0 1 2 3 4 5

H o ạ t t í n h

e n d o g l u c a n a s e t ư ơ n g đ ố i ( %

)

Nồng độ lõi ngô (%)

Hình 3.7. Ảnh hƣở ng của nồng độ lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợ p





52

Theo nghiên cứu của một số tác giả thì lõi ngô không chỉ thích hợ p cho

khả năng sinh tổng hợ p các enzyme thuộc nhóm cellulase mà còn là nguồn cơ

chất cảm ứng cho một số loài vi sinh vật sinh tổng hợ p một số enzyme khácnhƣ xylanase [16], [17].

4.2.5 Ảnh hƣở ng của nguồn nitrogen và nồng độ nguồn nitrogen

Kết quả khảo sát ảnh hƣở ng của các nguồn nitrogen trong môi trƣờ ng

nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase của chủng

A. awamori VTCC-F-099 cho thấy, khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase

của chủng nấm nghiên cứu khi nuôi trong môi trƣờ ng có chứa các nguồnnitrogen khác nhau có sự khác nhau đáng kể. Trong số các nguồn nitrogen

đƣợ c khảo sát thì ammonium acetate đƣợ c xem là nguồn nitrogen thích hợ p

nhất cho chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợ p endoglucanase

(4,88 IU/ml) (Bảng 3.8). Đây là một nguyên liệu khá dễ kiếm nên đƣợ c chọn

là nguồn nitrogen để thay thế cho các nguồn nitrogen có trong môi trƣờ ng

cơ bản MT1.Bảng 3.8. Ảnh hƣở ng của nguồn nitrogen

Nguồn nitrogenHoạt tính endoglucanase

IU/ml %

Ammonium acetate 4,88 ± 0,129 100Ammonium nitrate 3,91 ± 0,104 80Ammonium sulphate 4,19 ± 0,124 86

Bột cá 4,10 ± 0,118 84Bột đậu tƣơng 3,51 ± 0,115 72Casein 3,44 ± 0,128 71Peptone 3,67 ± 0,105 75Urea 3,87 ± 0,077 79

Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cs (1999) cũng cho thấy, các nguồn

nitrogen hữu cơ (peptone, cao nấm men và bột đậu tƣơ ng) thích hợ p cho




53

quá trình sinh trƣở ng và sinh tổng hợ p cellulase của các chủng vi khuẩn

chịu nhiệt [5]. Bột đậu tƣơng cũng là nguồn nitrogen ảnh hƣở ng mạnh tớ i

khả năng sinh tổng hợ p cellulase của chủng A. niger RNNL-363 [11]. Nghiêncứu của Trịnh Đình Khá (2006) cho thấy, chủng Penicillium sp. DTQ-HK1

sinh tổng hợ p cellulase mạnh nhất khi 1,6% bột đậu tƣơng đƣợ c sử dụng nhƣ

nguồn nitrogen trong quá trình lên men [10].

Sau khi tìm đƣợ c nguồn nitrogen thay thế thích hợ p là ammonium

acetate, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣở ng của nồng độ nguồn

nitrogen này đến khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase của chủng nấmnghiên cứu.

0

40

80

120

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

H o ạ t t í n h e n d o g l u c a n a

s e t ư ơ n g đ ố i ( % )

Nồng độ ammonium acetate (%) Hình 3.8. Ảnh hƣở ng của nồng độ ammonium acetate đến khả năng sinh

tổng hợ p endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099

Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính endoglucanase của chủng nấm

nghiên cứu có sự thay đổi đáng kể khi thay đổi lƣợ ng amonium acetate trong

thành phần môi trƣờ ng. Hoạt tính enzyme tăng nhẹ trong dải nồng độ




54

0,1-0,25%, sau đó tiếp tục tăng mạnh và đạt cực đại tại 0,3% amonium acetate

(4,97 IU/ml). Tiếp theo, khi nồng độ amonium acetate tiếp tục tăng vƣợ t quá

0,3% thì hoạt tính endoglucanase lại giảm dần. Ở nồng độ 0,35% ammoniumacetate thì hoạt tính endoglucanase là 4,03 IU/ml, đạt 81% và ở nồng độ

0,5% ammonium acetate thì hoạt tính chỉ còn 3,51 IU/ml, đạt 71% so vớ i

hoạt tính enzyme khi đạt cực đại (Hình 3.8, Bảng 3.9).

4.2.6 pH môi trƣờ ng nuôi cấy ban đầu

pH môi trƣờ ng nuôi cấy ban đầu là một trong những yếu tố có ảnh

hƣở ng lớ n đến tốc độ sinh trƣở ng và khả năng sinh tổng hợ p các enzyme củacác loài vi sinh vật. Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợ c nuôi cấy trong môi

trƣờ ng MT1 chứa 2% CMC, 3% lõi ngô, 0,3% ammonium acetate đƣợc điều

chỉnh pH từ 3,0 đến 8,0 bằng các dung dịch HCl/NaOH, lắc 200 vòng/phút, ở

30C, trong 96 giờ . Kết quả đƣợ c thể hiện nhƣ hình 3.9 và bảng 3.10.

0

40

80

120

2 3 4 5 6 7 8 9

H o ạ t t í n h

e n d o g l u c a n a s e t ư ơ n g đ ố i ( %

)

pH

Hình 3.9. Ảnh hƣở ng của pH môi trƣờ ng nuôi cấy đến khả năng

sinh tổng hợ p endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099




55

Kết quả trên hình 3.9 và bảng 3.10 cho thấy, khả năng sinh tổng hợ p

endoglucanase tăng dần trong dải pH 3,0-6,5, đạt cực đại tại pH 6,5

(5,22 IU/ml). Sau đó, khi pH tiếp tục tăng vƣợ t qua pH 6,5 thì hoạt tínhenzyme bắt đầu giảm dần. Ở pH 7 hoạt tính là 4,84 IU/ml, đạt 93% và đến

pH 8 thì hoạt tính enzyme chỉ là 4,57 IU/ml, đạt 88% so vớ i hoạt tính cực đại.

Nhƣ vậy, pH 6,5 là tối ƣu cho chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợ p

endoglucanase.

Nghiên cứu của Đặng Minh Hằng (1999) trên một số chủng nấm sợ i

cho thấy, khả năng sinh tổng hợ p cellulase của chúng mạnh nhất trong khoảngpH 4,5-6,0 [8]. Các chủng A. niger sinh tổng hợ p endoglucanase mạnh nhất

trong khoảng pH môi trƣờng ban đầu từ 6,0-7,0 [19]. Trong khi đó, các chủng

vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợ p cellulase thích hợ p vớ i pH

môi trƣờng ban đầu là 8,0 [5].

4.3 TINH SẠCH ENDOGLUCANASE

4.3.1 Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100

Dịch enzyme sau khi đƣợc ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, đƣợ c

đƣa lên cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 vớ i tổng thể tích là 10 ml. Tốc độ

dòng chảy là 25 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml.

Kết quả kiểm tra hoạt tính endoglucanase của các phân đoạn (Bảng 3.11)

cho thấy, endoglucanase tập trung ở các phân đoạn từ 6 đến 16. Điện di đồ

hình 3.10 cho thấy, ở các phân đoạn vẫn còn khá nhiều băng protein,

tuy nhiên xuất hiện một băng protein đậm có khối lƣợng dƣớ i 35 kDa.




56

Hình 3.10. Điện di đồ trên gel polyacrylamide sản phẩm tinh sạch

endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 qua cột Sephadex G-100(1-5: các phân đoạn 7-11 qua cột sephadex G-100; 6: Marker; 7: dịch

enzyme thô)

4.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE

Những phân đoạn qua cột sephadex G-100 có hoạt tính endoglucanase

cao (phân đoạn 6-16) đƣợc đƣa tiếp lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE vớ i tổngthể tích 12 ml. Tốc độ dòng chảy là 20 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi

phân đoạn 2 ml. Kết quả kiểm tra hoạt tính endoglucanase của các phân đoạn

cho thấy, các phân đoạn từ 3 đến 7 có hoạt tính riêng cao hơn hẳn so vớ i các

phân đoạn khác (Bảng 3.12). Các phân đoạn có hoạt tính cao: từ phân đoạn 3

đến phân đoạn 7 đƣợ c điện di kiểm tra trên gel 12,5% polyacrylamide.

Điện di đồ hình 3.11 cho thấy, enzyme thu đƣợ c ở các phân đoạn trên làkhá sạch. Các phân đoạn trên đều có duy nhất một loại protein có khối lƣợ ng

phân tử khoảng 32 kDa. Enzyme thu đƣợ c có độ sạch 3,08 lần so vớ i

dịch enzyme thô ban đầu (Bảng 3.13).

kDa

166

66

45

35




57

Bảng 3.13. Tóm tắt quá trình tinh sạch endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099

Bƣớ c tinh sạch Protein tổng số (mg protein/ml) Hoạt tínhendoglucamase Độ tinhsạch (lần) Hiệu suấtthu hồi (%)

IU/ml IU/mg protein

Dịch thô 0,79 16,69 21,19 1 100

Sắc kí lọc gelSephadex G-100 0,28 6,30 22,44 1,06 76

Sắc ký trao đổiion DEAE 0,02 1,19 65,30 3,08 7

Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch endoglucanase trên gel

polyacrylamide (1: dịch enzyme thô; 2: marker; 3-7: các phân đoạn 3-7

qua cột DEAE).

4.4 NHỮ NG TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDOGLUCANASE

4.4.1 Ảnh hƣở ng của nồng độ cơ chất

Khi tăng nồng độ cơ chất thì vận tốc phản ứng tăng theo nghĩa là

hoạt tính của enzyme tăng. Tuy nhiên, vận tốc phản ứng đạt cực đại ở một

giớ i hạn nồng độ cơ chất nhất định, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất, có thể

vận tốc phản ứng lại giảm xuống [4].

kDa

66

45

35

25

1814

Endoglucanase(32 kDa)




59

nhiệt độ chƣa làm biến tính enzyme, hoạt tính enzyme tăng khi nhiệt độ tăng.

Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng quá giớ i hạn thì hoạt tính của enzyme lại giảm.

Để khảo sát nhiệt độ tối ƣu của endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099, phản ứng đƣợ c thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-70C vớ i

nồng độ cơ chất tối ƣu 1,2% CMC pha trong đệm 100 mM potassium

photphate, pH 6,5.

Khi tăng nhiệt độ từ 30 đến 50C, hoạt tính tƣơng đối của

endoglucanase cũng tăng dần từ 42% đến 100%. Sau đó, khi nhiệt độ tiếp

tục tăng vƣợ t quá 50C thì hoạt tính endoglucanase lại giảm dần. Ở nhiệt độ 70C hoạt tính chỉ còn 32% so vớ i hoạt tính cực đại (Hình 3.13, Bảng 3.15).

Nguyên nhân có thể do khi nhiệt độ tăng cao đã làm đứt gãy một số

liên kết yếu trong phân tử protein enzyme, làm thay đổi cấu trúc của

phân tử này, đặc biệt là cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme, từ đó

ảnh hƣở ng tớ i hoạt tính xúc tác của enzyme. Nhƣ vậy, nhiệt độ thích hợ p

cho phản ứng phân giải cơ chất CMC của endoglucanase từ A. awamori VTCC-F-099 là 50C, đây là một enzyme ƣa nhiệt. Chủng A. awamori

VTCC-F-099 và endoglucanase của nó có thể đƣợ c sử dụng vào một số quá

trình công nghiệp không đòi hỏi điều kiện nhiệt độ quá cao nhƣ công nghiệp

sản xuất thức ăn chăn nuôi, công nghiệp xử lý rác thải, công nghiệp giấy.

Những nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, Cellulase của A. niger NRRL-

363 hoạt động mạnh nhất ở 50C [11]; trong khi đó cellulase của A. niger Z10

là 40C [25], còn hoạt tính xúc tác của endoglucanase III từ Trichoderma

reesei đạt cao nhất ở 55C [46]. Theo kết quả nghiên cứu của Kitamoto

và cs (1996), các endoglucanase từ chủng A. oryzae KBN616 hoạt động

tốt nhất trong dải nhiệt độ 45-55C [43].




60

0

40

80

120

20 30 40 50 60 70 80

H o ạ t t í n h e n d o g l u c a n a s e t ư ơ n g

đ ố i ( % )

Nhiệt độ (oC)

Hình 3.13. Ảnh hƣở ng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính

endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099

4.4.3 pH phản ứ ng tối ƣu

Enzyme rất nhạy cảm vớ i pH của môi trƣờng, do đó pH có ảnh hƣở ng

rất lớ n vớ i tốc độ của phản ứng enzyme. Mỗi enzyme có một trị số pH

thích hợ p cho sự hoạt động của nó. Ảnh hƣở ng của pH đối vớ i phản ứng

enzyme có thể do nhiều tác dụng khác nhau: pH có thể ảnh hƣởng đến tốc độ

phản ứng enzyme do tác động vào trạng thái ion hóa của phân tử enzyme,

nhất là các nhóm hoạt động của enzyme. Để tìm ra khoảng pH tối ƣu cho

hoạt động của endoglucanase từ A. awamori VTCC-F-099, phản ứng giữa

enzyme và cơ chất đƣợ c thực hiện ở nhiệt độ tối ƣu 50C, vớ i nồng độ cơ chất

tối ƣu 1,2% CMC pha trong các đệm sodium acetate và potassium phosphate

có pH thay đổi trong khoảng 4,0-8,0.




61

0

40

80

120

3 4 5 6 7 8 9

H o ạ t t í n h e n d o g l u c a n a s e t ư ơ n g

đ ố i ( % )

pH

Hình 3.14. Ảnh hƣở ng của pH phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ

chủng A. awamori VTCC-F-099

Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính endoglucanase tăng mạnh

trong khoảng pH 4,0-5,0. Hoạt tính tƣơng đối đạt 17% ở pH 4,0 và đạt tối đa

ở pH 5,0 (4,08 IU/ml). Sau đó, hoạt tính tƣơng đối giảm dần xuống còn 82%

ở pH 5,5 và giảm mạnh xuống 37% ở pH 8,0 (Hình 3.14, Bảng 3.16).

pH thích hợp đối vớ i cellulase từ A. niger RNNL-363 là 5,5 [11]; của

cellulase từ A. niger Z10 là 4,5 và 7,5 [25]. Nhƣ vậy, endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099 hoạt động tốt trong dải pH 5,0-5,5 (100-82%),thuộc loại endoglucanase ƣa acid yếu.

4.4.4 Độ bền nhiệt độ

Hầu nhƣ tất cả các enzyme đều bị biến tính ít nhiều và ảnh hƣở ng tớ i

hoạt tính dƣới tác động của nhiệt độ. Nhiệt độ có thể làm cho một số liên kết

hydro trong mạng lƣớ i liên kết hydro tham gia vào việc giữ vững cấu trúc




62

của enzyme bị đứt gẫy. Mức độ ảnh hƣở ng tùy thuộc vào nhiệt độ cao

hay thấp và thờ i gian ủ. Để đánh giá độ bền nhiệt của endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099, dịch enzyme tinh sạch đƣợ c ủ ở các nhiệt độ khácnhau trong khoảng 30-70C, sau những khoảng thờ i gian nhất định hoạt tính

còn lại của enzyme đƣợc xác định.

0

40

80

120

0 20 40 60 80

H o ạ t t í n h e n d o g l u c a n a s e t ư

ơ n g đ ố i ( % )

Thời gian ủ (giờ)

Hình 3.15. Ảnh hƣở ng của nhiệt độ lên độ bền endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099. (): 30C; (): 40C; (): 50C; (): 60C;

(): 70C

Kết quả trên hình 3.15 và bảng 3.17 cho thấy, hoạt tính endoglucanase

từ chủng A. awamori VTCC-F-099 đều giảm tuyến tính theo thờ i gian và

nhiệt độ ủ càng cao thì hoạt tính giảm càng mạnh. Sau 24 giờ ủ ở 30C và

40C hoạt tính enzyme giảm nhẹ, hoạt tính tƣơng đối còn 94% và 85%.

Ở 50C hoạt tính tƣơng đối còn 79% sau 24 giờ ủ và giảm mạnh sau 36 giờ ủ,

còn ở 70C hoạt tính giảm mạnh chỉ sau 6 giờ ủ. Nhƣ vậy, enzyme

nghiên cứu tƣơng đối bền ở dải nhiệt độ 30-50C, có thể bảo quản ở nhiệt độ




63

phòng và ứng dụng trong một số quá trình công nghiệp không đòi hỏi nhiệt độ

quá cao nhƣ công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, công nghiệp sản xuất

thức ăn cho vật nuôi, công nghiệp xử lý rác thải.4.4.5 Độ bền pH

Do pH môi trƣờ ng có ảnh hƣởng đến độ bền của protein enzyme nên

việc lựa chọn đệm có pH thích hợp để bảo quản enzyme là rất quan trọng. Ở

đây, độ bền của endoglucanase đƣợ c khảo sát trong các đệm sodium acetate

vớ i dải pH 3,5-5,5 và đệm potassium phosphate vớ i dải pH 6,0-8,0. Sau 2 giờ

ủ với đệm ở 37C, hoạt tính enzyme đƣợc xác định.

0

40

80

120

160

ĐC 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8

H o ạ t t í n h e n d o g

l u c a n a s e t ư ơ n g đ ố i ( % )

pH


A. awamori VTCC-F-099

Kết quả nhƣ hình 3.16 và bảng 3.18 cho thấy, sau 2 giờ ủ,

endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 bền trong dải pH 4,0-6,0

(đệm acetate pH 4,0-5,5; đệm phosphate pH 6,0). Hoạt tính enzyme sau khi ủ

với các đệm có pH 4,0-6,0 giảm không đáng kể, thậm chí hoạt tính còn tăng

nhẹ sau khi ủ với đệm acetate pH 4,5-5,5.




64

Tiếp theo, đệm sodium acetate pH 4,0-5,5 và potassium phosphate

pH 6,0 trong số các pH thích hợ p cho endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099 đƣợ c chọn để tiếp tục khảo sát độ bền pH củaenzyme nghiên cứu theo thờ i gian. Kết quả cho thấy, hoạt tính endoglucanase

đƣợ c duy trì khá tốt trong đệm sodium acetate pH 4,5-5,5. Sau 24 giờ ủ,

hoạt tính tƣơng đối giảm không quá 20% so vớ i nhóm đối chứng (Hình 3.17,

Bảng 3.19). Nhƣ vậy, đệm sodium acetate pH 4,5-5,5 thích hợp để duy trì

hoạt tính endoglucanase trong quá trình bảo quản.

0

40

80

120

0 12 24 36 48 60 72 84

H o ạ t t í n h e n d

o g l u c a n a s e t ư ơ n g đ ố i ( % )

Thời gian ủ (giờ) Hình 3.17. Ảnh hƣở ng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099 theo thờ i gian (): pH 4; (): pH 4,5; ():pH 5,0; (): pH 5,5; (×): pH 6,0

4.4.6 Ảnh hƣở ng của dung môi hữu cơ

Dung môi hữu cơ ảnh hƣở ng lớn đến hoạt tính của enzyme. Khi thêm

dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm hằng số điện môi

của dung dịch, làm tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein [14].




65

Để khảo sát ảnh hƣở ng của các dung môi hữu cơ, dịch enzyme đƣợ c ủ

cùng các dung môi hữu cơ vớ i các nồng độ khác nhau ở 37C. Sau 2 giờ ,

hoạt tính còn lại đƣợc xác định. Kết quả cho thấy, cả 4 dung môi hữu cơ ở

tất cả các nồng độ khảo sát đều có ảnh hƣở ng ức chế hoạt động của

endoglucanase, trong đó ethanol làm hoạt tính endoglucanase giảm mạnh

nhất. Sau 2 giờ ủ vớ i 30% (v/v) ethanol ở 37C, hoạt tính tƣơng đối

của endoglucanase giảm chỉ còn 53% so với nhóm đối chứng (Hình 3.18,

Bảng 3.20). Nhƣ vậy, ethanol là dung môi hữu cơ làm ức chế mạnh nhất và

acetone là dung môi ức chế yếu nhất hoạt tính endoglucanase trong 4

dung môi hữu cơ khảo sát.

0

40

80

120

ĐC Act BtOH EtOH IsOH MtOH

H o ạ t t í n h e n d o g l u c a n a s e t ư ơ n g đ ố i ( % )

Dung môi hữu cơ

Hình 3.18. Ảnh hƣở ng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính endoglucanase

từ chủng A. awamori VTCC-F-099. (): 0%; (): 10%; (): 20%; (): 30%;

Act: Acetone; BtOH: n-Butanol; EtOH: Ethanol; IsoOH: Isopropanol; MtOH:Methamol.

4.4.7 Ảnh hƣở ng của ion kim loại

Để đánh giá ảnh hƣở ng của các ion kim loại đến hoạt tính

endoglucanase, dịch enzyme đƣợ c thêm vào các ion kim loại khác nhau

vớ i nồng độ 5, 10 và 15 mM. Sau 2 giờ ủ ở 37C hoạt tính endoglucanase còn




66

lại đƣợc xác định và so sánh vớ i mẫu đối chứng. Kết quả đƣợ c thể hiện

nhƣ bảng 3.21

Bảng 3.21. Ảnh hƣở ng của ion kim loại

Kim loại

Nồng độ (mM)

Hoạt tính endoglucanase sau 2 giờ ủ (%)

5 10 15

Ag+ 74 70 43

Ca 2+ 97 95 90

Co 2+ 99 96 79

Cu 2+ 126 137 148

EDTA 146 153 155

Fe 2+ 129 120 107

K+ 92 86 87

Mn 2+ 70 63 54

Ni 2+ 96 93 74

Zn 2+ 94 79 78

Kết quả trên bảng 3.21 cho thấy, tính chất và mức độ ảnh hƣở ng của

các ion kim loại đối vớ i hoạt tính của endoglucanase từ chủng A. awamori

VTCC-F-099 là khác nhau. Một số ion kim loại (Fe2+, Cu2+) và EDTA làm

tăng nhẹ hoạt tính enzyme. Khi nồng độ các ion trên thay đổi thì hoạt tính của

endoglucanase cũng thay đổi theo các chiều hƣớ ng khác nhau. Khi nồng độ

Cu2+ và EDTA tăng từ 5 mM lên 15 mM thì hoạt tính enzyme tƣơng đối cũng

tăng tƣơng ứng từ 126% lên 148% (đối vớ i Cu2+), từ 146% lên 155% (đối vớ i

EDTA). Trong khi đó, khi nồng độ của Fe2+ tăng từ 5 mM lên 15 mM thì

hoạt tính tƣơng đối của enzyme lại giảm từ 129% xuống còn 107%.

Ngƣợ c lại, các ion kim loại khác (Ag+, Ca2+, Co2+, K+, Mn2+, Ni2+,

Zn2+) lại làm giảm hoạt tính xúc tác của enzyme nghiên cứu vớ i các mức độ




67

khác nhau. Ở nồng độ thấp, các ion Ca2+, K+, Co2+, Ni2+, Zn2+ làm giảm nhẹ

hoạt tính xúc tác của endoglucanase. Khi nồng độ các ion này càng tăng,

hoạt tính enzyme giảm càng mạnh. Riêng ion Ag

+

và Mn

2+

làm ức chế rõ rệthoạt tính endoglucanase. Ở nồng độ 15 mM, hoạt tính tƣơng đối chỉ đạt 43%

(đối vớ i Ag+) và 54% (đối vớ i Mn2+) so vớ i mẫu đối chứng.

4.4.8 Ảnh hƣở ng của một số chất tẩy rử a

Một số loại chất tẩy rửa có đặc tính hoạt động bề mặt nên khi đƣợ c ủ

cùng enzyme sẽ làm ảnh hƣởng đến cấu trúc và hoạt động của enzyme.

Để đánh giá ảnh hƣở ng của chất tẩy rửa tớ i hoạt tính endoglucanase, dịchenzyme đƣợ c ủ cùng các dung dịch chất tẩy rửa (Tween 20, Tween 80, SDS,

Triton X-100) ở các nồng độ khác nhau từ 0,5; 1,0; 1,5; 2%. Sau 2 giờ ủ ở

37C hoạt tính còn lại đƣợc xác định.

Kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.19 và bảng 3.22 cho thấy, các

chất tẩy rửa trên đều có ảnh hƣở ng ức chế hoạt động xúc tác của enzyme

nghiên cứu. tween 20 ở nồng độ 0,5-1,0% ảnh hƣở ng yếu đến hoạt tính

endoglucanase. Hoạt tính tƣơng đối giảm còn 90-78% so với đối chứng sau

khi ủ enzyme cùng vớ i 0,5-1% (v/v) Tween 20. Ở nồng độ 1,5-2% Tween 20,

hoạt tính tƣơng đối chỉ còn 75-61%. Tween 80 làm giảm hoạt tính

endoglucanase từ 83 xuống 64% khi tăng nồng độ từ 0,5 lên 2%.

Triton X-100 làm giảm mạnh hoạt tính từ 82 xuống 59% so với đối chứng khi

tăng nồng độ từ 0,5-2%. Riêng đối vớ i SDS, thì hoạt tính endoglucanase bị ứcchế rõ rệt. Nồng độ SDS càng cao thì hoạt tính tƣơng đối càng giảm, ngay ở

nồng độ rất thấp 0,5% hoạt tính chỉ đạt 45% còn ở nồng độ cao 2%

thì hoạt tính chỉ còn 16% so với đối chứng.




68

0

40

80

120

ĐC Tween 20 Tween 80 SDS Triton X-100 H

o ạ t t í n h e n d o g l u c a n a s e t ư ơ n g đ ố i ( % )

Chất tẩy rửa

Hình 3.19. Ảnh hƣở ng của chất tẩy rửa lên hoạt tính endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099. (): 0%; (): 0,5%; (): 1%; (): 1,5%; (): 2%.

Thƣờ ng SDS ức chế rất mạnh hoạt động của enzyme nói chung do có

khả năng hình thành một lớp điện tích âm xung quanh phân tử protein enzymevà làm thay đổi cấu trúc của phân tử enzyme. Do đó, enzyme mất khả năng

liên kết và phân giải cơ chất. Khi nghiên cứu ảnh hƣở ng của các chất tẩy rửa

trên tớ i hoạt tính xúc tác của cellulase từ chủng Penicillium sp. DTQ-HK1,

Trịnh Đình Khá (2006) cũng thấy rằng cả 4 chất trên đều là chất ức chế

hoạt động của cellulase. Trong đó, SDS là chất ức chế mạnh nhất, hoạt tính

enzyme giảm xuống còn 18% sau khi ủ vớ i 2% SDS trong 2 giờ ở 37ºC [10].




69

5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Chủng Aspergillus awamori VTCC-F-099 có khả năng sinh tổng hợ p

endoglucanase cao nhất trong số 26 chủng A. awamori đƣợ c khảo sát.

Chủng này đƣợc định loại bằng chỉ thị gene 28S rRNA. Trình tự

nucleotide đoạn gene 28S rRNA của chủng này đã đƣợc đăng ký

trong GeneBank vớ i mã số GQ892590.

2. Chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợ p endoglucanase mạnh

nhất sau 96 giờ nuôi cấy trong môi trƣờ ng MT1 pH 6,5, lắc

200 vòng/phút ở 30C. Nồng độ cơ chất cảm ứng tối ƣu là 2% CMC,

nguồn carbon và nitrogen thích hợ p là lõi ngô (3%) và

ammonium acetate (0,3%).

3. Đã tinh sạch đƣợ c endoglucanase có khối lƣợ ng phân tử khoảng 32 kDa

từ chủng A. awamori VTCC-F-099 bằng phƣơng pháp sử dụng kết hợ pcột sắc ký lọc gel sephadex-G100 và cột sắc ký trao đổi ion DEAE.

Hiệu suất thu hồi endoglucanase khoảng 7%, độ sạch 3,1 lần.

4. Nhiệt độ và pH phản ứng tối ƣu của endoglucanase từ chủng

A. awamori VTCC-F-099 là 50C và 5,0. Enzyme này bền trong dải

nhiệt độ 30-50C và dải pH 4,5-5,5. Ở các nồng độ 5 mM, 10 mM,

15 mM hoạt tính endoglucanase đều tăng nhẹ dƣớ i ảnh hƣở ng của cácion kim loại: Fe2+, Cu2+ và EDTA. Ngƣợ c lại, các ion Ag+, Ca2+, Co2+,

K+, Mn2+, Ni2+, Zn2+ làm hoạt tính endoglucanase giảm. Đặc biệt là Ag+

làm hoạt tính endoglucanase giảm mạnh, chỉ còn 43% ở nồng độ

15 mM sau 2 giờ ủ ở 37C. Các dung môi: acetone, ethanol, methanol,

iso propanol và n- butanol đều làm giảm hoạt tính endoglucanase.




70

Đặc biệt, dung môi 30% methanol làm hoạt tính endoglucanase

giảm mạnh, còn 52% sau khi ủ 2 giờ ở 37C. Các chất tẩy rửa khảo sát

đều làm giảm hoạt tính xúc tác của endoglucanase. Đặc biệt là SDSlàm giảm mạnh hoạt tính enzyme, chỉ còn 20% sau khi ủ vớ i 2% SDS

trong 2 giờ ở 37C.

KIẾN NGHỊ

1. Thử nghiệm lên men lƣợ ng lớ n vớ i các nguồn cơ chất sẵn có, rẻ tiền

nhƣ: lõi ngô, bột giấy, bột đầu cá, bột đỗ tƣơng.

2. Tối ƣu quy trình tách chiết lƣợ ng lớ n endoglucanase từ môi trƣờ ng

nuôi cấy.

3. Nhân dòng, biểu hiện gene mã hóa endoglucanase, xây dựng quy trình

sản xuất enzyme tái tổ hợ p.

4. Tạo chế phẩm enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, nâng cao

chất lƣợ ng của vật nuôi.




71

6 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê

Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị Cúc

(1999), Sử dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose cao để nâng

cao chất lƣợ ng phân hủy rác thải sinh hoạt và nông nghiệp. Báo cáo

khoa học, H ội nghị Công nghệ Sinh học toàn quố c, Nxb Khoa học và

Kỹ thuật, Hà Nội: 546-551.

2. Chu Thị Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng, Lƣơng Thùy Dƣơng (2002),"Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các chủng nấm men có khả năng

phân giải cellulose nhằm ứng dụng trong xử lý bã thải hoa quả làm thức

ăn chăn nuôi." T ạ p chí Di truyề n học và Ứ ng d ụng, 2: 34-36.

3. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2006), Danh mục thức ăn

chăn nuôi, nguyên liệu thức ăn chăn nuôi đƣợ c nhập khẩu vào Việt

Nam. Số 01/2006/QĐ-BNN.4. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2006), Enzyme và ứ ng d ụng,

Nxb Giáo dục.

5. Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999), Nghiên cứu sản xuất

cellulase của một số chủng vi sinh vật ƣu nhiệt phân lập từ bể ủ rác

thải. Báo cáo khoa học, H ội nghị Công nghệ Sinh học toàn quố c, Nxb

Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 790-797.

6. Cao Cƣờ ng, Nguyễn Đức Lƣợ ng (2003), Khảo sát quá trình cảm ứng

enzyme chitinase và cellulase của Trichoderma harzianum ảnh hƣở ng

của hai enzyme này lên nấm bệnh Sclerotium rolfsii. Báo cáo khoa học,

H ội nghị Công nghệ Sinh học toàn quố c, Nxb Khoa học và Kỹ thuật,

Hà Nội: 321-324.




72

7. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn

Vĩnh Phƣớ c, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty

(1976), M ột số phương pháp nghiên cứ u vi sinh vật t ậ p 2 và 3, Nxb

Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

8. Đặng Minh Hằng (1999), Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến khả

năng sinh tổng hợ p cellulase của một số chủng vi sinh vật để xử lý rác.

Báo cáo khoa học, H ội nghị Công nghệ Sinh học toàn quố c, Nxb Khoa

học và Kỹ thuật, Hà Nội: 333-339.

9. Nguyễn Lan Hƣơng, Hoàng Đình Hòa (2003), Hệ vi khuẩn có hoạt tính

thủy phân tinh bột, protein, cellulose hoặc dầu ô lƣu trong quá trình

phân hủy chất thải hữu cơ. Báo cáo khoa học, H ội nghị Công nghệ Sinh

học toàn quố c, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 288-291.

10. Trịnh Đình Khá (2006), Tuyển chọn, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh

tổng hợp cellulase và đánh giá tính chất lý hóa của cellulase. Luận văn

Thạc s ỹ Khoa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học

Quốc Gia Hà Nội.11. Hoàng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy, Nguyễn Duy Long (2003),

Khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm cellulase của Aspergillus niger

RNNL-363. Báo cáo khoa học, H ội nghị Công nghệ Sinh học

toàn quố c, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 304-307.

12. Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hòa, Lý Kim Bảng (1999), Tuyển chọn

một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose từ mùn rác.

Báo cáo khoa học, H ội nghị Công nghệ Sinh học toàn quố c, Nxb

Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 177-182.

13. Nguyễn Đức Lƣợng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999), Khả năng sinh tổng

hợ p cellulase của Actinomyces griseus. Báo cáo khoa học, H ội nghị

Công nghệ Sinh học toàn quố c, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội:

804-809.




73

14. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn

Xuân Sâm (2004), Công nghệ enzyme, Nxb Khoa học và Kỹ thuật,

Hà Nội.

15. Hồ Sỹ Tráng (2006), Cơ sở hóa gỗ và cellolose t ậ p 2, Nxb Khoa học và

Kỹ thuật: 7-14.

16. Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2008), "Tối ƣu

một số điều kiện nuôi cấy chủng nấm Aspergillus oryzae DSM1863 và

Aspergillus niger DSM1957 sinh tổng hợ p xylanase", T ạ p chí

Công nghệ Sinh học, 6(3): 349-355.

Tài liệu tiếng Anh

17. Achary A, Prapulla S (2008), "Corncob-Induced endo-β-D-1,4 xylanase

of Aspergillus oryzae MTCC 5154: Production and characterization of

xylobiose from glucuronoxylan", J Agric Food Chem, 56(11):

3981-3988.

18. Acharya P, Acharya D, Modi H (2008), "Optimization for cellulase

production by Aspergillus niger using saw dust as substrate",

Afr J Biotechnol, 7(22): 4147-4152.

19. Akiba S, Kimura Y, Yamamoto K, Kumagai H (1995), "Purification

and characterizationof a protease-resistant cellulase from Aspergillus

niger ", J Ferment Bioeng, 79(2): 125-130.

20. Bagnara C, Gaudin C, Bélaïch JP (1987), "Physiological properties of

Cellulomonas fermentans, a mesophilic cellulolytic bacterium", Appl Microbiol Biotechnol, 26: 170-176.

21. Bagnara C, Toci R, Gaudin C, Bélaïch JP (1985), "Isolation and

characterization of a cellulolytic microorganism, Cellulomonas

fermentans, sp. nov", J Syst Bacteriol, 35: 502-507.




75

32. Gordon R, Haynes W, Pang C (1973), The genus Bacillus, Agriculture

handbook, Washington DC.

33.

Henning J, Morkeberg A, Krogh KBR, Olsson L (2005), "Production of cellulases and hemicellulases by three Penicillium species: effect of

substrate and evaluation of cellulase adsorption by capillary

electrophoresis", Enzyme Microb Technol, 36: 42-48.

34. Henriksson G, Nutt A, Henriksson H, Pettersson B, Stahlberg J,

Johansson G, Pettersson G (1999), "Endoglucanase 28 (Cel12A), a new

Phanerochaete chrysosporium cellulase", Eur J Biochem, 259: 88-95.

35. Henrissat B, Claeyssens M, Tomme P, Lemesle L, Mornon JP (1989),

"Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis", Gene,

81(1): 83-95.

36. Hong J, Tamaki H, Akiba S, Yamamoto K, Kumaga H (2001),

"Cloning of a gene encoding a highly stable endo-1,4-glucanase from

Aspergillus niger and its expression in yeast", J Biosci Bioeng, 92(5):

434-441.

37. Howard RL, Abotsi E, van Rensburg ELJ, Howard S (2003),

"Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme

production", Afr J Biotechnol, 2(12): 602-619.

38. Hsu CK, Liao JW, Chung YC, Hsieh CP, Chan YC (2004),

"Xylooligosaccharides and fructooligosaccharides\ affect the intestinal

micro biota and precancerous colonic lesion development in rats",

J Nutr , 134: 1523-1528.

39. Kang S, Ko E, Lee J, Kim S (1999), "Over production of β-glucosidase

by Aspergillus niger mutant from lignocellulsic biomass", Biotechnol

Lett , 21: 647-650.




76

40. Karisson J, Saloheimo M, Siika-aho M, Tenkanen M, Penttilä M,

Tjerneld F (2001), "Homologous expression and characterization of

Cel61A (EG IV) of Trichoderma reesei", Eur J Biochem, 268: 6498-6507.

41. Khan M, Ali S, Fakhru’l-Razi A, Alam M (2007), "Use of fungi for the

bioconversion of rice straw into cellulase enzyme", J Environ Sci

Health Part B, 42: 381-386.

42. Kim BH (1987), "Carbohydrate catabolism in cellulolytic strains of

Cellulomonas, Pseudomonas, and Nocardia", Korean J Microbiol, 25:

28-33.

43. Kitamoto N, Go M, Shibayama T, Kimura T, Kito Y, Ohmiya K,

Tsukagoshi N (1996), "Molecular cloning, purification and

characterization of two endo-β-1,4-glucanase from Aspergillus oryzae

KBN616", Appl Microbiol Biotechnol, 46: 538-544.

44. Laemmli U (1970), "Clevage of structure proteins during the assembly

of the head of bacteriophage T4", Nature, 227: 680-685.

45. Lee RL, Weimer PJ, Zyl WH, Pretorius IS (2002), "Microbial cellulose

utilization: fundamentals and biotechnology", Microbiol Mol Biol Rev,

66: 506 – 577.

46. Macarrón R, Acebal C, Castiilón MP, Domínguez JM, Manta IDL

(1993), "Mode of action of endoglucanase III from Trichoderma

reesei", Biochem J , 289: 867-873.

47. Miller G (1959), "Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination

of reducing sugars", Anal Chem, 31: 426-428.

48. Nakakuki T (2003), "Development of functional oligosaccharides in

Japan", Trends Glycosci Glycotechnol, 15(82): 57-64.




77

49. Narasimha G, sridevi A, Buddolla V, Subhosh C, Rajsekhar R (2006),

"Nutrient effect on production of cellulolytic enzymes by Aspergillus

niger ", Afr J Biotechnol, 5(5): 472-476.

50. Ojumu T, Solomon B, Betiku E, Layokun S, Amigun B (2003),

"Cellulase production by Aspergillus flavus Linn isolate NSPR 101

fermented in sawdust, bagasse and corncob", Afr J Biotechnol, 2(6):

150-152.

51. Ole K, Borchert TV, Fuglsang CC (2002), "Industrial enzyme

applications", Curr Opin Biotech, 13: 345-351.

52. Omogbenigun OF, Nyachoti CM, Slominski BA (2004), "Dietary

supplementation with multienzyme preparations improves nutrient

utilization and growth performance in weaned pigs", J Anim Sci, 82:

1053-1061.

53. Palonen H, Tenkanen M, Linder M (1999), "Dynamic interaction of

Trichoderma reesei cellobiohydrolases Cel6A and Cel7A and cellulose

at equilibrium and during hydrolysis", Appl Environ Microbiol, 65:5229-5233.

54. Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning: A Laboratory

Manual.

55. Sandgren M, Gualfetti PJ, Christian P, Sigrid P, Shaw A, Gross LS,

Saldajeno M, Berglund GI, Jones TA, Mitchinson C (2003), "The

Humicola grisea Cel12A enzyme structure at 1.2 Å resolution and the

impact of its free cysteine residues on thermal stability", Protein Sci,

12: 2782-2793.

56. Sang JH, Yong JY, Hyen SK (1995), "Characterization of

a bifunctional cellulase and its structural gene. The cel gene of

Bacillus sp. D04 has exo- and endoglucanase activity", J Biol Chem,

270: 26012-26019.




78

57. Sharma VK, Hagen JC (1995), "Isolation and characterization of

Clostridium hobsonii comb. nov", Biores Technol, 51: 61-74.

58. Siddiqui K, Shemsi A, Anwar M, Rashid M, Rajoka M (1998), "Partial

and coplete alteration of surface charges of carboxymethylcellulase by

chemical modification: thermostabilization in water-miscible organic

solvent", Enzyme Microbiol Technol, 24: 599-608.

59. Takada G, Kawasaki M, Kitawaki M, Kawaguchi T, Sumitani J-I,

Izumori k, Arai M (2002), "Cloning and trascription analysis of the

Aspergillus aculeatus No. F-50 endoglucanase 2 (cmc2) gene", Biosci

and Bioeng, 94(5): 482-485.

60. Takashima S, Nakamura A, Hidaka M (1998), "Isolation of the creA

gene from the cellulolytic fungus Humicola grisea and analysis of

CreA binding sites upstream from the cellulase genes", Biosci

Biotechnol Biochem, 62: 2364-2370.

61. Wachinger G, Bronnenmeier K, Staudenbauer WL, Schrempf H (1989),

"Identification of mycelium-associated cellulase from Streptomyces

reticuli", Appl Environ Microbiol, 55: 2653-2657.

62. Watanabe H, Tokuda G (2001), "Animal cellulases", Cell Mol Life Sci,

58: 1167-1178.

63. Xu B, Janson JC, Sellos D (2001), "Cloning and sequencing of

a molluscan endo--1,4-glucanase gene from the blue mussel, Mytilus

edulis", Eur J Biochem, 268: 3718-3727.

64. Yasuda K, Roneker KR, Miller DD, Welch RM, Lei XG (2006),

"Supplemental dietary Inulin affects the bioavailability of Iron in corn

and soybean meal to young pigs", J Nutr , 136: 3033-3038.




79

PHỤ LỤC

Bảng 3.2. Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA chủng A. awamori

VTCC-F-099

Trình tự nucleotide Vị trí

GCATATCAAT AAGCGGAGGA AAAGAAACCA ACCGGGATTG

CCTCAGTAAC GGCGAGTGAA GCGGCAAGAG CTCAAATTTG

AAAGCTGGCT CCTTCGGAGT CCGCATTGTA ATTTGCAGAG

GATGCTTTGG GTGCGGCCCC CGTCTAAGTG CCCTGGAACG

GGCCGTCAGA GAGGGTGAGA ATCCCGTCTT GGGCGGGGTG

TCCGTGCCCG TGTAAAGCTC CTTCGACGAG TCGAGTTGTT

TGGGAATGCA GCTCTAAATG GGTGGTAAAT TTCATCTAAA

GCTAAATACT GGCCGGAGAC CGATAGCGCA CAAGTAGAGT

GATCGAAAGA TGAAAAGCAC TTTGAAAGGA GAGTTAAACA

GCACGTGAAA TTGTTGAAAG GGAAGCGCTT GCGACCAGAC

TCGCCCGCGG GGTTCAGCCG GCATTCGTGC CGGTGTACTT

CCCCGTGGGC GGGCCAGCGT CGGTTTGGGC GGCCGGTCAA

AGGCCCCTGG AATGTAGTGC CCTCCGGGGC ACCTTATAGC

CAGGGGTGCA ATGCGGCCAG CCTGGACCGA GGAACGCGCT

TCGGCACGGA CGCTGGCATA ATGGTCGTAA ACGACCCGTC

TTGAAACACG GACC

4080

120160200240

280320360400440480520560600

614

Bảng 3.3. Khả năng sinh tổng hợ p endoglucanase theo thờ i gian

Thờ i gian (giờ ) OD1 OD2 OD3Hoạt tính endoglucanase

IU/ml %

24 0,30 0,31 0,31 0,41 ± 0,002 74

48 0,39 0,38 0,38 0,49 ± 0,006 89

72 0,39 0,39 0,39 0,49 ± 0,002 91

96 0,45 0,43 0,44 0,55 ± 0,012 100

120 0,28 0,30 0,29 0,39 ± 0,008 71

144 0,27 0,26 0,26 0,36 ± 0,002 66

168 0,21 0,30 0,25 0,35 ± 0,043 64

192 0,23 0,23 0,23 0,33 ± 0,001 60

216 0,22 0,29 0,25 0,35 ± 0,036 64

240 0,22 0,24 0,23 0,33 ± 0,011 60




Bảng 3.9. Ảnh hƣở ng của nồng độ ammonium acetate

Ammonium acetate (%) OD1 OD2 OD3Hoạt tính endoglucanase

IU/ml %0,10 0,28 0,21 0,25 3,44 ± 0,038 69

0,15 0,30 0,23 0,25 3,58 ± 0,039 72

0,20 0,30 0,27 0,28 3,86 ± 0,014 78

0,25 0,31 0,32 0,35 4,25 ± 0,023 85

0,30 0,39 0,34 0,44 4,97 ± 0,050 100

0,35 0,34 0,26 0,31 4,03 ± 0,040 81

0,40 0,29 0,28 0,30 3,90 ± 0,012 78

0,45 0,27 0,28 0,28 3,74 ± 0,001 75

0,50 0,24 0,26 0,27 3,51 ± 0,012 71

0,55 0,24 0,24 0,26 3,40 ± 0,011 68

Bảng 3.10. Ảnh hƣở ng của pH môi trƣờ ng nuôi cấy ban đầu

pH OD1 OD2 OD3Hoạt tính endoglucanase

IU/ml %3,0 0,26 0,33 0,23 3,67 ± 0,051 70

3,5 0,32 0,34 0,26 4,05 ± 0,042 78

4,0 0,34 0,35 0,31 4,34 ± 0,021 83

4,5 0,36 0,38 0,32 4,58 ± 0,030 88

5,0 0,37 0,40 0,33 4,71 ± 0,036 90

5,5 0,38 0,41 0,33 4,79 ± 0,040 92

6,0 0,39 0,42 0,36 4,93 ± 0,030 94

6,5 0,42 0,46 0,37 5,22 ± 0,047 100

7,0 0,38 0,42 0,34 4,84 ± 0,040 93

7,5 0,37 0,40 0,30 4,62 ± 0,051 88

8,0 0,36 0,40 0,31 4,57 ± 0,048 88

Bảng 3.11. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột Sephadex G-100

Phân đoạnHoạt tính endoglucanase


IU/ml IU/mg protein IU/ml IU/mg protein3 1,79 213,71 11 6,66 80,07

4 1,83 169,95 12 6,81 82,83

5 2,01 183,17 13 6,57 87,70

6 4,02 330,37 14 6,46 106,64

7 4,89 288,36 15 4,03 72,49

8 4,52 149,94 16 3,70 93,57

9 4,58 78,66 17 2,70 103,29

10 7,21 109,57 18 2,14 224,31




82

Bảng 3.12. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột sắc ký DEAE



IU/ml IU/mg protein IU/ml IU/mg protein3 0,76 79,74 11 2,01 48,75

4 0,73 56,86 12 1,91 43,89

5 0,82 55,75 13 1,91 40,60

6 1,53 71,65 14 1,62 34,68

7 1,30 62,10 15 1,01 23,12

8 1,13 57,80 16 0,98 30,99

9 1,07 56,16 17 0,60 24,09

10 1,78 57,59 18 0,49 24,49

Bảng 3.14. Ảnh hƣở ng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính endoglucanase

CMC (%)Hoạt tính endoglucanase

(IU/mg protein) %0,2 84,15 ± 0,005 22

0,4 119,71 ± 0,007 32

0,6 179,43 ± 0,008 48

0,8 260,87 ± 0,010 69

1,0 295,95 ± 0,013 781,2 377,49 ± 0,060 100

1,4 283,28 ± 0,021 75

1,6 232,33 ± 0,009 62

1,8 173,19 ± 0,006 46

2,0 163,45 ± 0,006 43

Bảng 3.15. Ảnh hƣở ng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endoglucanase

Nhiệt độ Hoạt tính endoglucanase(IU/mg protein) %30 45,37 ± 0,005 42

37 60,67 ± 0,025 56

40 93,11 ± 0,004 85

45 95,35 ± 0,001 87

50 109,09 ± 0,004 100

55 64,95 ± 0,006 60

60 50,85 ± 0,001 47

65 45,76 ± 0,003 42

70 34,65 ± 0,004 32




83

Bảng 3.16. Ảnh hƣở ng của pH hỗn hợ p phản ứng đến hoạt tính endoglucanase

Nhiệt độ Hoạt tính endoglucanase

(IU/mg protein) %4,0 37,87 ± 0,009 17

4,5 144,65 ± 0,002 64

5,0 226,68 ± 0,002 100

5,5 184,88 ± 0,007 82

6,0 118,54 ± 0,005 52

6,5 95,25 ± 0,004 42

7,0 90,58 ± 0,003 40

7,5 82,20 ± 0,072 36

8,0 84,54 ± 0,010 37

Bảng 3.17. Độ bền nhiệt độ của endoglucanase

Nhiệt độ Thờ i gian (giờ )Hoạt tính endoglucanase

(IU/mg protein) %

ĐC 0 410,23 ± 0,005 100

6 399,02 ± 0,001 97

12 388,99 ± 0,008 95

24 385,77 ± 0,004 94

30 36 382,75 ± 0,002 93

48 285,43 ± 0,004 70

60 258,34 ± 0,001 63

72 236,23 ± 0,006 58

6 368,43 ± 0,007 90

12 355,86 ± 0,001 87

24 346,61 ± 0,005 84

40 36 314,85 ± 0,006 77

48 277,92 ± 0,006 68

60 254,15 ± 0,007 62

72 228,53 ± 0,005 56

6 361,13 ± 0,001 88

12 324,98 ± 0,004 79

24 302,38 ± 0,025 74




84

50 36 210,12 ± 0,001 51

48 150,88 ± 0,024 37

60 130,33 ± 0,005 32

72 124,09 ± 0,006 30

6 255,61 ± 0,014 62

12 179,33 ± 0,009 44

24 131,79 ± 0,006 32

60 36 91,36 ± 0,001 22

48 65,83 ± 0,008 16

60 59,60 ± 0,001 15

72 38,94 ± 0,001 9

6 202,22 ± 0,002 49

12 143,77 ± 0,010 35

24 112,50 ± 0,007 27

70 36 54,92 ± 0,002 13

48 26,57 ± 0,003 6

60 23,94 ± 0,001 6

72 23,35 ± 0,000 6

Bảng 3.18. Độ bền pH của endoglucanase

Đệm pHHoạt tính endoglucanase

(IU/mg protein) %

Đối chứng 6,5 234,57 ± 0,008 100

3,5 56,48 ± 0,028 24

4,0 266,53 ± 0,008 114

Acetate 4,5 322,93 ± 0,020 138

5,0 347,29 ± 0,004 148

5,5 285,43 ± 0,004 122

6,0 241,78 ± 0,011 103

6,5 229,21 ± 0,008 98

Phosphate 7,0 245,38 ± 0,020 105

7,5 223,27 ± 0,004 95

8,0 210,21 ± 0,004 90




85

Bảng 3.19. Độ bền pH theo thờ i gian của endoglucanase

pH Thờ i gian (giờ )Hoạt tính endoglucanase

(IU/mg protein) %

4,0

0 259,02 ± 0,002 100

6 217,52 ± 0,031 84

12 166,28 ± 0,005 64

24 105,38 ± 0,001 41

36 73,33 ± 0,001 28

48 67,88 ± 0,004 26

60 54,24 ± 0,004 21

72 36,70 ± 0,002 14

4,5

0 322,35 ± 0,016 100

6 310,56 ± 0,014 96

12 269,06 ± 0,005 83

24 267,21 ± 0,006 83

36 264,19 ± 0,004 82

48 185,66 ± 0,000 58

60 122,34 ± 0,009 38

72 104,90 ± 0,004 33

5,0

0 310,76 ± 0,008 100

6 301,21 ± 0,002 97

12 281,14 ± 0,004 90

24 277,53 ± 0,001 8936 275,00 ± 0,004 88

48 202,42 ± 0,006 65

60 149,52 ± 0,008 48

72 116,68 ± 0,003 38

5,5

0 253,47 ± 0,004 100

6 244,02 ± 0,001 96

12 217,62 ± 0,008 86

24 210,02 ± 0,005 83

36 203,59 ± 0,004 80

48 174,26 ± 0,006 6960 175,82 ± 0,002 69

72 173,58 ± 0,007 68

6,0

0 209,43 ± 0,001 100

6 198,72 ± 0,001 95

12 192,58 ± 0,000 92

24 143,09 ± 0,008 68

36 137,73 ± 0,006 66

48 136,56 ± 0,005 65

60 125,45 ± 0,005 60

72 115,42 ± 0,010 55




86

Bảng 3.20. Ảnh hƣở ng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính endoglucanase

Dung Môi Nồng độ (%)Hoạt tính endoglucanase

(IU/mg protein) %

Đối chứng 0 372,91 ± 0,016 100

10 349,04 ± 0,031 94

Acetone 20 333,75 ± 0,004 89

30 325,95 ± 0,004 87

10 287,28 ± 0,003 77

n- Butanol 20 225,12 ± 0,025 60

30 213,53 ± 0,003 57

10 229,60 ± 0,001 62

Ethanol 20 198,52 ± 0,001 53

30 195,79 ± 0,002 53

10 365,02 ± 0,050 98

isopropanol 20 276,27 ± 0,044 74

30 258,24 ± 0,004 69

10 307,64 ± 0,001 82

Methanol 20 271,30 ± 0,011 73

30 266,82 ± 0,004 72

Bảng 3.22. Ảnh hƣở ng của một số chất tẩy rửa đến hoạt tính endoglucanase

Chất tẩy rử a Nồng độ (%)Hoạt tính endoglucanase

(IU/mg protein) %

Đối chứng 0,0 213,53 ± 0,004 100

Tween 20

0,5 191,22 ± 0,008 90

1,0 167,83 ± 0,004 79

1,5 160,43 ± 0,006 75

2,0 131,30 ± 0,008 61

Tween 80

0,5 177,48 ± 0,001 83

1,0 160,43 ± 0,004 751,5 144,55 ± 0,003 68

2,0 136,56 ± 0,001 64

SDS

0,5 97,01 ± 0,005 45

1,0 83,17 ± 0,001 39

1,5 51,70 ± 0,001 24

2,0 33,48 ± 0,004 16

Triton X-100

0,5 175,73 ± 0,004 82

1,0 147,67 ± 0,002 69

1,5 134,32 ± 0,003 63

2,0 125,56 ± 0,010 59

tuyen chon nuoi chung aspergillus awamori sinh tông hop endo 14

Documents