tumores melanocíticos em equinos – estudo clínico, histopatológico e imunohistoquímico

8/19/2019 Tumores melanocíticos em equinos – estudo clínico, histopatológico e imunohistoquímico

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Mestrado Integrado em Medicina VeterináriaCiências Veterinárias

Tumores Melanocíticos em Equinos – EstudoClínico, Histopatológico e Imunohistoquímico

Ana Margarida Sampaio e Melo Pereira

Orientador:Professor Doutor Mário Pedro Gonçalves Cotovio

Co-orientador:Dr. Miguel de Sá Cardoso Machado Bahia

UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOUROVILA REAL, 2011


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Mestrado Integrado em Medicina VeterináriaCiências Veterinárias

Tumores Melanocíticos em Equinos – EstudoClínico, Histopatológico e Imunohistoquímico

Ana Margarida Sampaio e Melo Pereira

Orientador:Professor Doutor Mário Pedro Gonçalves Cotovio

Co-orientador:Dr. Miguel de Sá Cardoso Machado Bahia

UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOUROVILA REAL, 2011


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“The greatness of a nation and its moral progress can be

judged by the way its animals are treated.” M. Gandhi


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Resumo

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RESUMO

A pele é o local mais comum de neoplasias em equinos. Supõe-se que a prevalência

destas condições esteja a aumentar e estima-se que cerca de 2/3 (66%) dos tumoresmelanocíticos em equinos possam progredir para malignidade. A classificação destas lesõesem equinos é complexa e dificulta o trabalho do patologista. A evolução ao nível das técnicasde imunohistoquímica tem sido importante no diagnóstico, prognóstico e terapêutica destadoença.

Foi realizada a excisão cirúrgica de nódulos cutâneos de 43 equinos acompanhada deinquérito. A avaliação clínica baseou-se na idade (valor mínimo de 2,5 anos e máximo de 26anos com média de 14,9 anos), género (51,2% ocorreram em machos e 48,8% em fêmeas),

raça (sobretudo Puro-Sangue Lusitano - 60,5% e Cruzado Lusitano - 27,9%), pelagem (ruçaem 90,7%, isabel em 4,7%, baia em 2,3% e castanha em 2,3%), quantidade (melanomadérmico em 11,6% e melanomatose dérmica em 88,4%), tamanho (90,7 % pequeno, 44,2%médio e 25,6% grande), localização (zona perineal em 93%, outras localizações em 27,9% epadrão difuso em 4,7%) e duração das lesões (entre 6 meses e 20 anos). As amostras foramprocessadas e submetidas a análise histopatológica e imunohistoquímica. As variáveishistopatológicas avaliadas foram: localização (65,1 % na derme e 34,9% na derme eepiderme), tipo celular (7,0% fusiforme, 53,5% redondo e misto em 39,5%), ulceração

(presente em 23,3%), quantidade de pigmento (escassa em 11,6%, moderada em 37,2% eabundante em 51,2%), quantidade de estroma (escassa em 44,2%, moderado em 37,2% eabundante em 18,6%), êmbolos vasculares/linfáticos (presentes em 9,3% das amostras).Obteve-se uma marcação positiva para o c-Kit em 62,8% das amostras.

A quantidade, tamanho e localização das lesões são factores importantes na decisãoterapêutica e no prognóstico das lesões. As variáveis histopatológicas podem ajudar a prever ocomportamento dos tumores pelo que se deverá prosseguir com os estudos no sentido deestabelecer critérios direccionados para a espécie.

A expressão desta proteína c-Kit não se encontrava avaliada em tumores melanocícitosde equinos. Obteve-se imunorreactividade em todos os tumores com características demalignidade evidente, dados que poderão ter implicações no diagnóstico e terapêutica dosmesmos.


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Abstract

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ABSTRACT

The skin is the most common site of neoplasia in the horse. It is assumed that theprevalence of this condition is increasing and it is estimated that about 2/3 (66%) of melanocytictumors in horses can progress to malignancy. The classification of this disease in horses iscomplex and hinders the work of the pathologist. The development of immunohistochemistrytechniques has been important in diagnosis, prognosis and therapy of this disease.

Was performed the surgical excision of cutaneous nodules of 43 horses accompanied byinquiry. The clinical evaluation based on age (minimum 2.5 years old and a maximum of 26years old with an average of 14.9 years old), gender (51.2% in males and 48.8% in females),breed (especially Lusitano - 60.5% and Lusitano Crossed Breed - 27.9%), coat color (gray in

90.7%, pearl in 4.7%, buckskin in 2.3% and bay in 2.3%), amount (dermal melanomas in 11.6%and dermal melanomatosis in 88.4%), size (90.7% small, 44.2% medium and 25.6% large),location (perineal area in 93%, other locations in 27.9% and diffuse in 4.7%) and duration oflesions (between 6 months and 20 years). The samples were processed and subjected tohistopathological and immunohistochemical analysis. The histopathological variables evaluatedwere: location (65.1% in dermis and 34.9% in dermis and epidermis), cell type (7.0% spindle,53.5% round and 39.5% mixed), ulceration (present in 23.3%), amount of pigment (poor in11.6%, moderated in 37.2% and abundant in 51.2%), amount of stroma (poor in 44.2%,

moderated in 37.2% and abundant in 18.6%) and vascular/lymphatic invasion (present in 9.3%of the samples). We obtained immunoreactivity for the c-Kit in 62.8% of the samples.

The amount, size and location of the lesions are important factors in therapeutic decisionand prognosis of the lesions. The histopathological variables can help predict the behavior oftumors, so we should continue with studies to establish criteria directed to the species. Theexpression of this protein c-Kit was evaluated for the first time, as far as we know, in equinemelanocytic tumors. The fact that immunoreactivity was present in all tumors with features ofevident malignancy may have implications on diagnosis and therapy of these tumors.


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Durante a realização desta Dissertação foram executados os seguintes trabalhos:

- Comunicação Oral intitulada “Caracterização de Tumores Melanocíticos em Cavalos deRaça Lusitana”, por Ana Margarida Pereira, Mário Cotovio, Justina Oliveira e Miguel Bahia. Foiapresentada nas II Jornadas do GTIE (Grupo de Trabalho em Investigação em Equídeos), emPonte de Lima no dia 25 de Junho de 2011, onde foi atribuído o prémio de melhorComunicação Oral.

- Comunicação Livre intitulada “Expressão Imunohistoquímica do c-Kit em Tumores

Melanocíticos de Equinos”, por Ana Margarida Pereira, Mário Cotovio, Justina Oliveira e MiguelBahia. Foi apresentada no II Encontro Formação OMV (Ordem dos Médicos Veterinários), emLisboa no dia 8 de Outubro de 2011.


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Índice geral

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ÍNDICE GERAL

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 1

1.1. Classificação e nomenclatura .............................................................................................. 31.2. Etiologia ............................................................................................................................... 41.3. Predisposição ...................................................................................................................... 61.4. Patogenia............................................................................................................................. 91.5. Diagnóstico clínico e histopatológico .................................................................................. 111.6. Tratamento e seguimento clínico ....................................................................................... 171.7. c-Kit (CD117 ou Kit) ........................................................................................................... 192. OBJECTIVOS ....................................................................................................................... 213. MATERIAL e MÉTODOS ...................................................................................................... 223.1. Material utilizado e a sua procedência ............................................................................... 223.2. Avaliação clínica ................................................................................................................ 223.3. Avaliação histopatológica ................................................................................................... 233.4. Avaliação imunohistoquímica ............................................................................................. 243.5. Análise estatística .............................................................................................................. 264. RESULTADOS ..................................................................................................................... 274.1. Avaliação dos dados clínicos ............................................................................................. 274.2. Avaliação dos dados histopatológicos ................................................................................ 31

4.3. Avaliação dos dados imunohistoquímicos .......................................................................... 385. DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 415.1. Estudo clínico .................................................................................................................... 415.2. Estudo histopatológico ....................................................................................................... 505.3. Estudo imunohistoquímico ................................................................................................. 526. CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 547. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 558. ANEXOS ............................................................................................................................... 61


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Lista de quadros, gráficos e figuras

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LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Predisposição racial para tumores melanocíticos em equinos. ................................. 7

Quadro 2 - Localizações mais comuns de ocorrência de tumores melanocíticos em equinos. .... 8Quadro 3 - Variáveis histológicas avaliadas. ............................................................................. 24Quadro 4 - Frequências e percentagens das raças dos animais incluídos no estudo. .............. 28Quadro 5 - Frequências e percentagens dos tamanhos das lesões encontradas nos animaisavaliados. ................................................................................................................................. 29Quadro 6 - Caracterização histopatológica das amostras analisadas. ...................................... 32Quadro 7 - Expressão de c-Kit nas amostras em estudo. ......................................................... 40

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 - Distribuição dos 43 animais incluídos no estudo segundo o género. ....................... 27Gráfico 2 - Frequências das diferentes pelagens observadas nos animais deste estudo. ......... 28Gráfico 3 - Distribuição da quantidade de lesões nos animais incluídos no estudo. .................. 29Gráfico 4 - Distribuição das localizações das lesões encontradas nos animais incluídos noestudo. ...................................................................................................................................... 31

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Equino de pelagem ruça, incluído no estudo, com vitiligo (pré-cirúrgico). ................... 5Figura 2 - Equino da figura 1 no pós-cirúrgico, onde se evidencia o grau de vitiligo. .................. 5Figura 3 - Melanocitoma único na cauda de um equino jovem. ................................................. 13Figura 4 - Ilustração esquemática do receptor c-Kit.. ................................................................ 20Figura 5 - Excisão cirúrgica de uma das amostras incluídas no estudo. ................................... 23Figura 6 - Localização típica de ocorrência das lesões em estudo. Imagem recolhida antes da

excisão cirúrgica. ...................................................................................................................... 30Figura 7 - Padrão difuso de lesões melanocíticas. Além destas o animal apresentava nódulosna área da traqueia, base da cauda e períneo. ......................................................................... 30Figura 8 - Localização dérmica da lesão. Coloração com HE, 4x.............................................. 33Figura 9 - Localização dérmica que se estende à epiderme. Coloração HE, 40x. ..................... 33Figura 10 - Morfologia celular fusiforme. Coloração HE, 40x. ................................................... 34Figura 11 - Morfologia celular redonda. Coloração HE, 40x. ..................................................... 34Figura 12 - Ulceração dos tecidos observada em amostra do estudo. Coloração HE, 40x. ...... 35Figura 13 - Quantidade de pigmento melânico escassa (grau 1). Coloração HE, 40x. .............. 35Figura 14 - Quantidade de pigmento melânico abundante (grau 3). Coloração HE, 40x. .......... 36Figura 15 - Quantidade de estroma moderada (grau 2). Coloração HE, 40x. ............................ 36Figura 16 - Quantidade de estroma abundante (grau 3). Coloração HE, 40x. ........................... 37


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Lista de quadros, gráficos e figuras

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Figura 17 - Êmbolo vascular. Observa-se pigmento melânico no seu interior. Coloração HE,40x. ........................................................................................................................................... 37Figura 18 - Imunorreactividade para o c-Kit com padrão citoplasmático granular, 40x. ............. 38Figura 19 - Imunorreactividade para o c-Kit com padrão citoplasmático difuso, 40x. ................ 39

Figura 20 - Imunorreactividade positiva para o c-Kit nos melanócitos e negativa paramelanófagos, 40x. .................................................................................................................... 39Figura 21 - Lesão melanocítica em equino com pelagem de cor castanha. .............................. 46


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Lista de siglas e abreviaturas

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ADN – Ácido Desoxirribonucleico

BCG – Bacillus Calmette-Guerin cm – centímetroCD117 – cluster de differenciação 117CDK – cyclin-dependent kinase Cdkn2a/p16 – inibidor 2a da quinase dependente da ciclinaCK – citoqueratinaCO2 – dióxido de carbono DAB – tetra-hidrocloreto de 3,3’-diaminobenzidina

EUA – Estados Unidos da AméricaHE – hematoxilina-eosinaHIS – hibridização in situHMB-45 – Human Melanoma Black-45 IHQ – imunohistoquímicaIL – interleucinaLEH – Liphook Equine HospitalMC1R – receptor 1 da melanocortina

ME – microscopia electrónicamin – minutoml – mililitromm – milímetroMSH – Melanocyte Stimulating Hormone n – número de amostrasNR4A3 – nuclear receptor, subfamília 4, grupo A, membro 3NSE – enolase específica dos neuróniosOMS – Organização Mundial de Saúdep53 – proteína 53PBS – phosphate buffered saline (tampão fosfato salino)PCNA – proliferating cell nuclear antigen(antigénio nuclear de células em proliferação)pH – potencial de hidrogénio iónicoPmel17/gp100 – proteína melanocítica 17/gp100PSI – Puro-Sangue InglêsPSL – Puro-Sangue LusitanoRb – retinoblastoma


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Lista de siglas e abreviaturas

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RTK – receptor da tirosina quinaseSCF – Stem Cell Factor STX17 – sintaxina 17

TYRP1/gp75 - proteína 1 relacionada à tirosinaseUAB – Universidade Autónoma de BarcelonaUTAD – Universidade de Trás-os-Montes e Alto DouroUV – UltravioletaUVA – Ultravioleta AUVB – Ultravioleta BW – watt% – percentagem

µm – micrómetroµl – microlitroχ2 – Qui-quadrado


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Agradecimentos

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AGRADECIMENTOS

Palavras soltas… que insurgem a mente, como agora. Tantas que parecem poucas!

Insuficientes para definir o que vai muito além do “Obrigada”:

Ao Professor Doutor Mário Cotovio pela brevidade no momento de aceitar orientar estaDissertação (pouco sabia do que o esperava!). Pela forma séria, meticulosa, cuidadosa,paciente, crítica e acima de tudo perfeccionista com que levou a cabo este trabalho. Pelo seusaber profundo, dedicação, incentivo (sempre). Pelas palavras adequadas aos momentoscertos que me fizeram continuar, que me permitiram e permitem seguir…

Ao Dr. Miguel Bahia pela excelência dos ensinamentos, pela particularidade dasexperiências, por toda a paciência em todas as horas (muitas) partilhadas. Pelo enormeesforço e profissionalismo na parte mais prática (e na restante também) deste trabalho. Por mefazer exigir de mim mais e melhor a cada minuto…

À Professora Doutora Justina Oliveira pela disponibilidade incansável, pela facilidade emtornar simples e real o que em tantos momentos parecia caótico. Pelo imenso tempo dedicado,pelo interesse sempre partilhado, pela participação activa, pela entrega verdadeira e pelodespertar de novos desafios.

Aos meus amigos e colegas desta viagem que também embarcaram nela. Ao Guinhas,ao Rapper, ao Zero, ao Paulo pela partilha de sentimentos, pelas horas e horas de conversas,

confidências, apoio, por me fazerem acreditar, sempre. À Di por tudo isto, pelo enorme bomsenso com que me ajuda sempre, por estar comigo. Ao Triguinho e ao Mário João pelas horasde ensaios de apresentações que não serão esquecidas, pelas críticas construtivas semprepresentes, por estarem ali.

Aos meus amigos e colegas das casas que serão sempre “as nossas casas”. À Koka, àVera, aos meus padrinhos Fernando e Lara, aos meus afilhados Rui e Daniela que memostraram uma passagem para a outra margem da amizade e que reservaram um lugar eternona minha memória.

À melhor colheita 2004/2005 em nome da Ariana, Bê, Beta, Bola, Carla, Diana, Fátima,Gustavo, Natália, Rafa por me mostrarem que valeu a pena, por me darem a certeza que esteera o caminho.

À Diana, à Joana e à Márcia, onde o sentido da amizade prevalece, onde as dificuldadesse tornam facilidades, onde tudo parece mais certo.

Aos meus Avós, Tios, Primas, Madrinha e Irene pela compreensão, paciência, incentivo,pela ajuda inigualável durante estes anos. À Natacha por tudo isto, por me saber aturar, porestar ao meu lado.


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Agradecimentos

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À Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), à Universidade Autónoma deBarcelona (UAB) e ao Liphook Equine Hospital (LEH) pela colaboração na realização desteestudo.

Ao 3º Esquadrão, do Regimento de Cavalaria, da Guarda Nacional Republicana, napessoa do Coronel Mariz dos Santos, ao Comando Territorial da Guarda Nacional Republicanade Évora, na pessoa do Coronel Jacob, ao Comando Territorial da Guarda NacionalRepublicana de Viseu, na pessoa do Coronel Calheiros, ao Centro Hípico de Viseu, ao CentroHípico da Quinta, ao Centro Equestre de Loureiro, a todos os proprietários e responsáveispelos cavalos do estudo e aos Médicos Veterinários referentes Dr. Henrique Cruz, Dr. RuiMendes, Dr.ª Rita Rocha Pires, Dr. Francisco Fernandes, Dr. João Borges, Dr. Jordi Figueres eà sua equipa pelo interesse demonstrado e ajuda prestada.

Aos Cavalos, responsáveis pela realização deste sonho, que nos ensinam um poucomais da vida e que são o maior e melhor mo tivo que nos faz ir mais longe…

Aos meus bichos que fazem parte de mim, que são a minha vida.Por último, mas não em último, aos meus Pais, a quem dedico este culminar de esforço,

dedicação e empenho. Por cada minuto, por todo o verdadeiro amor incondicional quecondiciona todos os meus dias, pelos ideais transmitidos que me fazem querer ser sempremais e melhor. Pelos sacrifícios e compreensão sem fim, por ser vossa … Por serem quem sãoe por me fazerem chegar aqui onde toda e qualquer palavra é nada para expressar o que vaipara além de mim…

Obrigada


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Introdução

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1. INTRODUÇÃO

A oncologia veterinária foi, no passado, considerada como uma “especialidade

emergente” (Cotchin, 1984) tornando-se, na actualidade, uma especialidade por si só comdetalhada informação publicada sobre a etiopatogenia e imunologia das neoplasias (Scott eMiller, 2003). No entanto, a oncologia cutânea parece ser amplamente ignorada na medicinaequina (Knottenbelt, 2009a).

As neoplasias são uma causa maior de morbilidade e mortalidade em equinos de todo omundo e a pele constitui, sem dúvida, o órgão mais afectado por este tipo de doença(Knottenbelt, 2009b citando Jackson, 1936; British Equine Veterinary Association, 1965; Kerr e Alden, 1974; Baker e Leyland, 1975; Cotchin, 1977). As neoplasias cutâneas constituem cerca

de 50% do total das neoplasias nesta espécie (Scott e Miller, 2003; Valentine, 2006b; Scott eMiller, 2011) ou inclusive 80% segundo Théon (2006).

A incidência de neoplasias em cavalos varia de acordo com o tipo de estudo: 1-3% emcavalos submetidos a cirurgia e 11% em cavalos examinados em matadouro, 26% em materialremetido para biópsia e 4,4% em estudos de necrópsia (Valentine, 2006a). A prevalência detumores cutâneos em cavalos é considerada relativamente elevada e a maioria dos tumoresapresentam características particulares pelo que se torna importante o diagnóstico precoce(Knottenbelt, 2009b). Além disso considera-se que a prevalência dos tumores em equinos temvindo a aumentar devido não só ao facto de os animais viverem cada vez mais anos mastambém pela evolução na prevenção e terapêutica (Théon, 2006).

Segundo Valentine (2006), o aumento da idade é claramente um factor que aumenta asusceptibilidade de ocorrência de neoplasias em todas as espécies. No entanto, outros autorescitados por Scott e Miller (2011) afirmam que, contrariamente a outras espécies, o risco paraneoplasia cutânea em equinos não aumenta com a idade corroborando Knottenbelt (2009b),que sugere haver pouca correlação entre a ocorrência de tumores de pele em equinos e oavanço da idade.

Os tumores melanocíticos em equinos são uma entidade reconhecida há centenas deanos (Foley et al., 1991; Valentine, 1995; Roels et al., 2000) e têm o seu primeiro relato, tantoquanto foi possível analisar, em 1813 por Gohier (Farcău et al., 2007), apesar de outrosestudos referirem os trabalhos nesta área apenas a partir do início do século XX(Seltenhammer et al., 2003; Pielberg et al., 2008). No entanto, a gestão das neoplasiascutâneas em equinos ainda está muito atrás da de outras espécies (Knottenbelt, 2008b) e

permanece uma condição pouco esclarecida (Sutton e Coleman, 1997).


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Introdução

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Em cavalos ruços é considerada uma condição quase inevitável (Smith et al., 2002) e ésugerido que ocorrerá em todos os cavalos com esta pelagem desde que vivam temposuficiente (Cotchin, 1965; Valentine, 1995; Sutton e Coleman, 1997; Bengtström, 2011)

diminuindo assim a sua longevidade (Pielberg et al., 2008). Estudos realizados até à datarevelam que os melanomas são o tipo de tumor mais frequente em equinos (Fleury et al.,2000b), constituindo 3,8% de todas as neoplasias diagnosticadas nesta espécie(Seltenhammer et al., 2003; Laus et al., 2010). Relativamente ao conjunto dos tumorescutâneos em equinos os estudos apresentam diversas percentagens para os tumoresmelanocíticos:

- 6-15% (Patterson-Kane e Ginn, 2003);- até 15% (Smith et al., 2002);

- até 18%, sendo considerado o segundo tipo de tumor cutâneo mais comum em equinos(Spugnini et al., 2011);

- entre 4-15% (Foley et al., 1991; MacGillivray et al., 2002; Scott e Miller, 2003; Scott eMiller, 2011), ressalvando que a incidência real nestes estudos pode ser mais elevada uma vezque estes tumores, sendo facilmente identificáveis, são infrequentemente submetidos a examehistológico.

Esta discrepância nos valores de incidência estará ligada à ausência de critériosdiagnósticos de malignidade estandardizados para os tumores melanocíticos (Gross et al.,2005).

Porém, estima-se que cerca de 2/3 (66%) dos tumores melanocíticos em equinos possameventualmente progredir para malignidade, ou seja, ter a capacidade de desenvolvermetástases (Patterson-Kane e Ginn, 2003; Scott e Miller, 2003; Seltenhammer et al., 2004; Chapman et al., 2009).

A importância deste tema prende-se com a sua elevada prevalência. Por um lado comocausa de rejeição de cavalos ruços em matadouros com implicações económicas importantes.Por outro como um potencial modelo para alterações celulares de pigmentação e malignidadeem outras espécies incluindo em humanos (Sutton e Coleman, 1997). Ou ainda fazendo-senotar com as repercussões na saúde dos equinos (em especial disfunções urogenitais egastrointestinais) e os seus efeitos negativos na performance do cavalo de desporto (Laus etal., 2010). Uma vez que se tem vindo a verificar, na população humana, um aumentosignificativo na incidência de melanomas ao longo das últimas décadas (Paek et al., 2008) persiste a necessidade de encontrar um modelo animal que se adeqúe e que facilite, dealguma forma, os estudos pré-clínicos (Heinzerling et al., 2001). O cavalo, particularmente depelagem ruça, parece ser um modelo animal apropriado uma vez que além de esta ser umaafecção com predisposição genética (Heinzerling et al., 2001) apresenta uma progressão


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Introdução

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espontânea com desenvolvimento de metástases em outros órgãos (Heinzerling et al., 2001; Chapman et al., 2009). Os tumores melanocíticos dos cavalos ruços também apresentamcaracterísticas histológicas e marcação IHQ que se assemelham ao melanoma humano

(Seltenhammer et al., 2004), tendo mesmo sido introduzido na terminologia humana um subtipode melanoma designado “melanoma tipo animal” (Ludgate et al., 2010). Assim, aprofundar oconhecimento acerca de neoplasias numa espécie ajudará a uma melhor compreensão dasmesmas em outras espécies como na humana (Bengtström, 2011).

1.1. Classificação e nomenclatura

Os tumores melanocíticos têm vindo a ser classificados com base nas diferenças clínicas,histológicas e de comportamento, isto é, benigno ou maligno (Buechner-Maxwell, 2009). Noentanto a literatura, quer humana quer veterinária, parece não ser consistente quanto àterminologia (Smith et al., 2002). No que diz respeito à espécie equina, a nomenclatura podetornar-se complexa e confusa com termos como melanoma (benigno ou maligno),melanossarcoma, melanocitoma, melanose, melanomatose, nevo melanocítico, nevonevocelular e nevo congénito a assumirem significados incertos em diferentes contextos (Scott

e Miller, 2011). Porém, o termo nevo não é usado na dermatopatologia veterinária(Goldschmidt, 1998). O termo melanoma tem sido aplicado de forma variável de acordo com ossistemas de classificação usados, alguns para designar neoplasias quer benignas quermalignas, outros limitam-no a proliferações neoplásicas malignas (Gross et al., 2005).

Quanto à classificação clínica, Desser et al. (1980) sugeriu um sistema de graus (0-5)assumindo o grau “0” para ausência de melanomas e o grau “5” para um crescimento exofíticode tumores com superfície ulcerada e metástases em diversos órgãos acompanhada desíndromes paraneoplásicas (Seltenhammer et al., 2003; Sölkner et al., 2004).

Em 1993, Wilcock descreveu 2 formas para esta doença em cavalos ruços: melanomadérmico idiopático (raro), análogo ao melanoma dérmico benigno em cães e melanocitosedérmica, equivalente à melanomatose dérmica (Valentine, 1995).

Em 1995, Valentine realizou um estudo retrospectivo o qual revelou 4 síndromes clínicas distintas: nevo melanocítico, melanoma dérmico, melanomatose dérmica e melanoma malignoanaplásico. Este sistema classificativo tem sido adoptado por alguns autores como Smith et al. (2002), Seltenhammer et al. (2004), Chapman et al. (2009), Laus et al. (2010) e a classificaçãoque parece ser actualmente aceite é recomendada pela Organização Mundial de Saúde(OMS), em 1998, em que os tumores melanocíticos cutâneos são divididos em 4 categorias:


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Introdução

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melanocitoma (melanoma dérmico, melanoma benigno), melanoacantoma, melanoma malignoe hiperplasia melanocítica (lentigo) (Goldschmidt, 1998).

Em 2000, Roels et al. classificou os tumores estudados em apenas 2 categorias:

melanoma maligno metastático e melanoma benigno baseando-se na sua localização eindicadores citológicos de malignidade. No mesmo ano, Fleury et al., com base nascaracterísticas histológicas dividiu-os em 2 tipos: anaplásicos e melanomatose.

Numa tentativa de comparar características histológicas entre o melanoma equino e ohumano, Seltenhammer et al. (2004) identificou 3 tipos: melanoma benigno dérmico de cavalosruços, melanoma maligno dérmico de cavalos ruços e melanoma maligno anaplásico decavalos de outras pelagens que não a ruça.

De uma forma mais simplificada, alguns autores distinguem os tumores melanocíticos em

melanocitomas para os tumores benignos e melanomas para os que tenham comportamentomaligno(Goldschmidt e Hendrick, 2002).

Contudo, embora existam sistemas de classificação perfeitamente esclarecidos paratumores melanocíticos em humanos e cães, os sistemas usados para equinos continuam a nãoresolver o dilema do patologista quando confrontado com os mesmos uma vez que aclassificação histológica deve idealmente prever o comportamento do tumor (Valentine, 1995).

1.2. Etiologia

Apesar dos estudos e das diversas teorias, a causa desta doença é assumida por muitosautores como desconhecida (Buechner-Maxwell, 2009) ou pouco esclarecida (Cotchin, 1965; Foy et al., 2002; Laus et al., 2010) estando ainda por determinar o seu verdadeiro mecanismo(Bengtström, 2011). Não obstante é de ter em conta que as causas de transformação celularsão multifactoriais desde víricas, traumáticas, inflamatórias, radiação ultravioleta (UV)(Foy et

al., 2002). Alguns autores assumem que ocasionalmente podem ter uma componente congénita

(Foley et al., 1991; Goldschmidt e Hendrick, 2002; Pamela et al., 2007; McMullen et al., 2008).Outros investigadores estudaram a componente hereditária comparando modelos genéticos enão genéticos (ambientais) e falam de um impacto genético importante nesta afecção apesarde não ter sido estabelecido um modelo de heritabilidade (Rieder et al., 2000).

Segundo Pielberg et al. (2008), desde que começaram os primeiros trabalhos emmelanomas que os investigadores perguntam como é que uma mutação que provoca a perdade pigmentação no pêlo pode também causar melanomas com excessiva produção de


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Introdução

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melanina. Estes autores sugerem uma possível explicação baseando-se no facto de osmelanócitos do folículo piloso e da derme terem diferentes ciclos de vida e demonstram que ofenótipo de pelagem ruça é causado por uma mutação em que há sobrexpressão dos genes

STX17 e NR4A3 estimulada por duplicações nos pares de bases do Ácido Desoxirribonucleico(ADN). Esta sobrexpressão génica parece também estimular a proliferação de melanócitos naderme aumentando então a propensão para o desenvolvimento de melanomas em cavalosruços. Em 2003, um estudo feito comparando a prevalência de melanomas em cavalos dediferentes coudelarias levou a concluir que a heritabilidade tem um efeito estatísticosignificativo no desenvolvimento dos tumores (Seltenhammer et al., 2003). Assim, adespigmentação do pêlo parece estar directamente correlacionada com a formação dostumores (Seltenhammer et al., 2003), sendo considerado um factor de risco relacionado com

uma mutação não detectada em humanos (Zhao et al., 2009). Em contrapartida, Sölkner et al.(2004), estabelecendo as relações genéticas entre despigmentação, melanoma e vitiligo(Figura 1 e 2), afirma a elevada heritabilidade para a característica de despigmentação mas aausência de correlação genética entre esta e os melanomas e uma elevada correlação entre adespigmentação e o vitiligo.

Figura 1 - Equino de pelagem ruça, incluídono estudo, com vitiligo (pré-cirúrgico). Figura 2 - Equino da figura 1 no pós-cirúrgico,onde se evidencia o grau de vitiligo.

Algumas teorias sugerem que em vez de uma verdadeira neoplasia é a manifestação deuma alteração no metabolismo da melanina, levando à formação de novos melanoblastos ou aum aumento da actividade dos já existentes (Foy et al., 2002), resultando numa acumulaçãodeste pigmento nos melanófagos durante o processo de despigmentação (Smith et al., 2002citando Levene, 1971). Dados clínicos, histológicos e imunohistoquímicos de um estudo

realizado em 1997, corroboram que se trata de uma alteração não neoplásica, provavelmentedevido a uma falha na degradação da melanina à medida que o animal envelhece e perde a


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pigmentação, apesar de poderem habitualmente invadir e metastizar para diversos órgãosinternos (Rodríguez et al., 1997).

Estas teorias parecem, no entanto ser refutadas por outros estudos nos quais ficou

demonstrada a natureza neoplásica desta condição pela ocorrência de metástases, decaracterísticas histológicas e marcações imunohistoquímicas que assim o indicam (Valentine,1995; Fleury et al., 2000a; Rieder et al., 2000; MacGillivray et al., 2002; Seltenhammer et al.,2004), ou mesmo uma possível origem multicêntrica dos tumores (Sutton e Coleman, 1997).

Revolucionando um pouco estes estudos demonstrando sempre uma ligação entre aorigem desta doença e os melanócitos, Fleury et al. (2000a) sugeriu que estas lesões teriamorigem em glândulas apócrinas e não em melanócitos (Fleury et al., 2000a).

Uma outra corrente de pensamento, de algum modo controversa, questiona o papel da

exposição a elevados níveis de radiação UV na patogenia desta doença (Patterson-Kane eGinn, 2003; Buechner-Maxwell, 2009). Contudo, devido à sua elevada ocorrência em zonasprotegidas da luz solar, como a área perianal, este parece não ser um factor de risco para aformação destes tumores em equinos ao contrário do que se verifica em humanos (Fleury etal., 2000b; Foy et al., 2002; Paek et al., 2008).

Em suma, parece haver evidências para suportar as diversas teorias mas pouco seevoluiu desde a descrição de McFadyean em 1933 (Sutton e Coleman, 1997).

1.3. Predisposição

Esta doença ocorre, resumidamente em animais de pelagem ruça e idade avançada(Valentine, 1995; Rieder et al., 2000).

Pelagem

A bibliografia é unânime em relatar a elevada percentagem destes tumores em cavalosde pelagem ruça embora possa ocorrer em qualquer pelagem (Knottenbelt e Pascoe, 1994; Bengtström, 2011). Apesar disso alguns autores afirmam que estes tumores são exclusivos decavalos ruços (Sutton e Coleman, 1997; Rees, 2004) .

Outros estudos parecem estabelecer uma relação entre a pelagem e a idade afirmandoque esta condição ocorre maioritariamente em cavalos ruços ou brancos, normalmente antesou aos 5 anos de idade, correspondendo à altura em que há mudanças na cor da pelagem(Lerner e Cage, 1973; Smith et al., 2002). Podem, no entanto, ocorrer noutras pelagens comona baia ou lazã (Smith et al., 2002).


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Idade Assumindo uma classificação em melanocitomas (benignos) e melanomas (malignos) há

autores que expõem o tema classificando os melanocitomas como uma condição mais

frequente em cavalos jovens (menos de 2 anos de idade) (Goldschmidt e Hendrick, 2002),enquanto os melanomas apresentam maior importância em cavalos de idade mais avançada, apartir dos 6 anos de idade (Valentine, 2006a; Scott e Miller, 2011).

Considerando os tumores melanocíticos como um todo, ocorrem maioritariamente emcavalos de idade avançada e raramente em cavalos com idade inferior a 6 anos (Foley et al.,1991).

Género

Os estudos não são consistentes neste tema (Smith et al., 2002), pelo que divergementre não haver qualquer predisposição sexual (Valentine, 1995; Sutton e Coleman, 1997; Fleury et al., 2000b; Valentine, 2006a; Buechner-Maxwell, 2009; Scott e Miller, 2011), asfêmeas serem mais predispostas (Foley et al., 1991) ou, pelo contrário, haver uma maiorpredisposição em machos (Valentine, 1995 citando Sundberg et al., 1977).

Raça As investigações realizadas até à data falam em predisposição de várias raças (Quadro

1) embora sejam, na maioria, raças com elevada percentagem de cavalos ruços (Smith et al.,2002; Valentine, 2006a; Buechner-Maxwell, 2009).

No que se refere à prática clínica parece haver uma frequência considerável destacondição em cavalos Puro-Sangue Lusitano (PSL), porém, do que foi possível apurar, nãoexistem estudos de prevalência nesta raça.

Quadro 1 - Predisposição racial para tumores melanocíticos em equinos.

Raça Estudo Árabe (Foley et al., 1991; Valentine, 1995; Goldschmidt e Hendrick, 2002; Smith et al.,2002; Rees, 2004; Valentine, 2006a; Buechner-Maxwell, 2009; Scott e Miller, 2011)

Percheron (Smith et al., 2002; Rees, 2004; Valentine, 2006a; Buechner-Maxwell, 2009; Scott eMiller, 2011) PSI (Valentine, 1995; Valentine, 2006a; Buechner-Maxwell, 2009)

Lipizzaner (Goldschmidt e Hendrick, 2002; Smith et al., 2002; Valentine, 2006a; Scott e Miller,2011) Andaluz (Valentine, 2006a)

Shire (Valentine, 2006a) Irish Draught (Valentine, 2006a) Pónei Galês (Valentine, 2006a)

PSI – Puro-Sangue Inglês


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LocalizaçãoEsta afecção pode ocorrer, virtualmente, em qualquer local (Buechner-Maxwell, 2009;

Scott e Miller, 2011). Os que se desenvolvem a nível cutâneo têm uma predisposição para a

superfície ventral da cauda, região perianal e perineal, área genital, área auricular, comissuraslabiais, zona periorbital e glândula parótida, como esquematizado no quadro 2.

Há também referências a outras localizações como: membros (Foy et al., 2002; Pamela et al., 2007; Scott e Miller, 2011), glândula mamária (Buechner-Maxwell, 2009), bordocoronário, casco (Smith et al., 2002), pescoço (Rodríguez et al., 1997; Foy et al., 2002), bolsasguturais (Foy et al., 2002; Valentine, 2006a), olho (Murphy e Young, 1979).

Um estudo faz menção à influência da idade na localização dos tumores, especificamenteno caso de melanocitomas, afirmando que os membros e tronco estarão mais predispostos em

cavalos jovens enquanto o períneo e cauda assumem maior importância em geriátricos(Goldschmidt e Hendrick, 2002).

Segundo Sutton e Coleman (1997), há autores que defendem não haver locaispredispostos para estes tumores e portanto há alguma variabilidade quanto a este tema entreinvestigadores. A título de exemplo, os músculos esqueléticos normalmente não sãomencionados, porém é um local comum encontrado por Médicos Veterinários quedesempenham funções em matadouros. No estudo realizado por estes autores, o local maiscomum para ocorrência destes tumores foi a superfície ventral da cauda seguindo-se osmúsculos esqueléticos e glândula parótida.

Quadro 2 - Localizações mais comuns de ocorrência de tumores melanocíticos em equinos.

Localização Estudo

Superfície ventral cauda(Foley et al., 1991; Rodríguez et al., 1997; Sutton e Coleman, 1997; Fleury et al., 2000b; Foy et al., 2002; MacGillivray et al., 2002; Smith et al., 2002; Seltenhammer et al., 2004; Valentine, 2006a; Farcău etal., 2007; Buechner-Maxwell, 2009; Scott e Miller, 2011)

Perianal (Foley et al., 1991; Fleury et al., 2000b; Seltenhammer et al., 2004; Buechner-Maxwell, 2009; Scott e Miller, 2011)

Perineal(Valentine, 1995; Fleury et al., 2000b; Goldschmidt e Hendrick, 2002; MacGillivray et al., 2002; Smith et al., 2002; Seltenhammer et al.,2004; Valentine, 2006a; Farcău et al., 2007; Pamela et al., 2007; Buechner-Maxwell, 2009)

Genital / Vulva / Prepúcio(Foley et al., 1991; Valentine, 1995; Rodríguez et al., 1997; Fleury etal., 2000b; Smith et al., 2002; Pamela et al., 2007; Buechner-Maxwell, 2009)

Orelha (Foy et al., 2002; Buechner-Maxwell, 2009; Scott e Miller, 2011)

Comissura labial (Fleury et al., 2000b; Seltenhammer et al., 2004; Valentine, 2006a; Buechner-Maxwell, 2009) Glândula parótida (Rodríguez et al., 1997; Sutton e Coleman, 1997; Valentine, 2006a; Buechner-Maxwell, 2009)

Periorbital (Fleury et al., 2000b; Seltenhammer et al., 2004; Buechner-Maxwell,2009) Pescoço (Rodríguez et al., 1997)


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1.4. Patogenia

Apesar de ser uma condição bem reconhecida e muito comum o seu processosubjacente continua a ser enigmático e discordante (Sutton e Coleman, 1997).

Os melanoblastos têm origem neuroectodérmica e durante o desenvolvimento fetalmigram para a derme, epiderme e folículos pilosos. As células diferenciadas produtoras depigmento são referidas como melanócitos. Estas células dendríticas encontram-se interpostasentre os queratinócitos basais da epiderme e o folículo piloso. São encontradas moléculas decaderina epitelial (caderina-E) na superfície dos melanócitos e queratinócitos. Normalmente,estes dois tipos de células não formam ligações entre si a não ser através destas moléculas

que constituem o mecanismo de adesão entre os 2 tipos celulares. A melanina, produzidapelos melanócitos, é armazenada nos melanossomas e transferida para os queratinócitos numprocesso designado por citocrinia. Os melanossomas acumulam-se no interior do citoplasmados queratinócitos onde protegem a pele dos efeitos nocivos da radiação UV. Osmelanoblastos que não atingem a epiderme desenvolver-se-ão em melanócitos intradérmicos.Na derme, pode-se encontrar uma segunda população de células que contêm melanina, osmelanófagos, que fagocitam a melanina que atinge a derme proveniente da migração edestruição dos melanócitos da epiderme ou folículos (Goldschmidt e Hendrick, 2002; Smith et

al., 2002). A conversão de melanócitos normais, não pigmentados e isolados de outros melanócitos,

para pigmentados e neoplásicos, em ninhos, é um processo com várias etapas desde ainiciação seguida de promoção, transformação e metastização. Virtualmente, nada se sabeacerca da iniciação da maioria dos melanomas em animais. Porém pensa-se que esteprocesso, em cerca de 65% dos melanomas cutâneos em humanos, ocorrerá emconsequência de mutações geradas por radiação solar UVA e UVB. Esta conclusão baseia-sena ligação epidemiológica do melanoma com a exposição solar. Supõe-se que a

susceptibilidade genética, possivelmente aumentando a frequência espontânea de célulasmutadas, pode ser crítica para iniciação de muitos tumores. Contudo, com excepção do cavaloruço, a transformação maligna de lesões benignas é muito pouco comum em animais eacredita-se que a maioria dos melanomas surgem de melanócitos na epiderme, derme, epitélioocular e epitélio oral. Quanto aos promotores podem incluir trauma, exposição química,queimaduras, hormonas, infecções, drogas e outras causas de hiperplasia reactiva. Talvez osmelanomas cutâneos surjam de lesão crónica resultando em hiperplasia reactiva do epitélio,ruptura da interacção normal entre queratinócitos e melanócitos e amplificação das célulasiniciadas espontaneamente ou por factores ambientais não identificados. A transformação écoadjuvada por instabilidade ao nível do ADN. Os supressores de proliferação celular e


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activadores da apoptose, como por exemplo a proteína retinoblastoma (Rb) e proteína 53 (p53)são, eventualmente, substituídos por factores de crescimento e/ou receptores de factores decrescimento e inibidores da apoptose (Smith et al., 2002). Apesar destes dados foi detectada

sobrexpressão da p53 normal em melanomas metastáticos em 2 cavalos o que sugeriu queesta proteína não estará envolvida na tumorigénese do melanoma equino (Roels et al., 2000).

A mutação de proto-oncogenes em oncogenes ( c-myc , c-erb-B-2 , c-yes, c-Kit , ras)também favorece a proliferação e desenvolvimento tumoral assim como o crescimentoautónomo, através de factores de crescimento, é requerido para a progressão neoplásica. Estatransformação neoplásica, resultado de mutações, ocorre antes da metastização que é, em si,um processo com várias etapas iniciando-se com a separação da massa primária,deslocamento para e através do endotélio, migração via sanguínea e/ou linfática e, por fim,

ligação e proliferação numa localização secundária. Durante todo este processo as célulastumorais devem conseguir escapar ao sistema imunitário, sobreviver e deslocar-se no sistemacirculatório e/ou linfático e proliferar numa localização distinta da sua origem. Outras alteraçõesnecessárias para que um melanócito se torne maligno são ainda alvo de investigação (Smith etal., 2002) e o conhecimento destas informações torna-se assim importante tendo em conta asimplicações que pode ter no tratamento desta condição (Sutton e Coleman, 1997).

De notar ainda o facto de o processo de diluição da cor da pelagem e o desenvolvimentotumoral poderem estar relacionados. A pigmentação visível da pele e pêlo é o culminar dosprocessos que foram sendo referidos anteriormente. Embora na última década se tenham feitoenormes avanços no que respeita à compreensão da fisiologia e genética da pigmentação,usando tecnologia de ADN e linhagens mutantes de ratos, o mecanismo em cavalos recebeupouca atenção. Uma análise das alterações morfológicas nos melanócitos foliculares decavalos ruços seria um passo importante para definir os genes nos quais se devem focar osestudos. Em 1984, foi observado por Altmeyer e colaboradores que os níveis da hormonaestimulante dos melanócitos α (α-MSH) diminuem à medida que o cavalo se torna ruço. Estahormona induz a proliferação dos melanócitos e estimula a produção de pigmento pelosmesmos. Dois dos genes mais importantes na cor da pelagem, extension e agouti , codificamreceptores da α -MSH e uma proteína antagonista da mesma hormona respectivamente.Interacções entre ambas têm uma influência importante no nível e tipo de melanina produzida(eumelanina e feomelanina). Assim, alargar investigações neste tema pode ser importante,começando por estabelecer os níveis de α -MSH, identificar e caracterizar os genes quecodificam o seu receptor (receptor 1 da melanocortina - MC1R) bem como a proteínasinalizadora de agouti em cavalos ruços e de outras pelagens (Sutton e Coleman, 1997).


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1.5. Diagnóstico clínico e histopatológico

O diagnóstico desta condição é, por norma, baseado na sua aparência macroscópica

(Foy et al., 2002). Os sinais clínicos e sintomas variam desde interferência com o freio/ bridãoou selar o cavalo até sérias lesões obstrutivas no tracto urogenital ou gastrointestinalprogredindo para metástases viscerais que ameaçam a vida do animal (Foy et al., 2002; Smith et al., 2002; Laus et al., 2010).

Como já abordado, a maioria dos estudos faz uma distinção importante no que toca àpelagem. Estes tumores apesar de serem mais comuns em pelagens ruças, como referidoanteriormente, ocorrem também em animais de outras pelagens como baia, lazã, castanha,tendo nestes um desenvolvimento mais precoce e uma maior tendência para a malignidade

(Smith et al., 2002; Seltenhammer et al., 2003). Ao que parece, cerca de 90% (ou 95% segundo Foy et al. (2002)) destes tumores são

benignos aquando da sua apresentação inicial. No entanto, pensa-se que cerca de 2/3progridem para malignidade e têm capacidade de metastização generalizada (Smith et al.,2002), apesar de esta informação contrariar um estudo em que não foram detectadascaracterísticas histológicas de malignidade (Rodríguez et al., 1997).

Como já foi referido anteriormente, apesar de existirem classificações bem estabelecidaspara tumores melanocíticos em humanos e cães, as apresentadas para cavalos parecem nãoresolver o dilema do patologista quando confrontado com este tipo de tumores, sendo porvezes extrapoladas de outras espécies. Idealmente, a classificação histológica deve culminarnuma previsão precisa do comportamento do tumor em causa (Valentine, 1995; Stokking,2004; Knottenbelt, 2008a; Paek et al., 2008). Por esta razão, Chapman et al. (2009) optou pornão classificar as lesões como benignas ou malignas por falta de critérios fiáveis para umadiferenciação numa base histológica.

Segundo Rees (2004), o diagnóstico é usualmente baseado nos sinais clínicos e abiópsia não é necessária para confirmar o diagnóstico a não ser em casos de lesões comaparências bizarras. No entanto, o diagnóstico pode complicar-se pelo facto destas lesõespoderem variar consideravelmente na sua aparência assim como no grau de pigmentação,característica que parece não estar associada ao prognóstico e que não é específica porqueexistem outras lesões neoplásicas e não neoplásicas que podem ser fenotipicamentesemelhantes (Smith et al., 2002).

Contudo, a chave para o maneio adequado e prognóstico preciso das neoplasiascutâneas é um diagnóstico específico, conseguido apenas através de biópsia e avaliaçãohistológica. A citologia aspirativa embora forneça informação importante não substitui a biópsiae exame histopatológico. Apesar da história clínica facultar dados importantes que podem


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inclusive ajudar no diagnóstico diferencial, a imensa variedade de neoplasias cutâneas faz comque estes dados se tornem menos fiáveis. Em suma, um nódulo não passa de um nódulo atéque seja avaliado histologicamente (Scott e Miller, 2011) e a sua detecção pode ser obtida por

inspecção e palpação (Seltenhammer et al., 2003).O exame histológico pode basear-se em várias características como: localização do

tumor, presença de actividade juncional, tipo de células presentes, grau de pigmentação, graude pleomorfismo, actividade mitótica, presença de inflamação e/ou necrose, padrão decrescimento e lesões em tecidos adjacentes (Foley et al., 1991; Smith et al., 2002; Chapman etal., 2009).

No que se refere à descrição da localização das neoplasias melanocíticas da peledevemos ter em consideração 3 termos:

- juncional: proliferação de melanócitos neoplásicos na junção dermo-epidérmica. Podeenvolver a epiderme ou folículo piloso;

- composto: o tumor apresenta tanto uma componente epidérmica como dérmica;- dérmico: em que o tumor é apenas intradérmico sem envolvimento da epiderme

(Goldschmidt, 1998; Goldschmidt e Hendrick, 2002). A morfologia celular e actividade mitótica são elementos importantes na distinção de

tumores melanocíticos benignos e malignos pelo que está sugerido o branqueamento dosmesmos em casos de cortes histológicos densamente pigmentados (Goldschmidt, 1998). Apesar disso, esta diferenciação é bastante complicada. A presença de melanócitos isoladosou em ninhos na camada superior da epiderme é, por norma, indicativo de malignidade assimcomo uma componente infiltrativa dérmica ou subcutânea do tumor (Goldschmidt, 1998). Alguns autores referem também a presença de uma componente inflamatória constituídaprincipalmente de linfócitos(Roels et al., 2000).

Melanocitoma (melanoma benigno)O melanocitoma não pode ser diferenciado do melanoma na avaliação macroscópica

(Goldschmidt e Hendrick, 2002). Estas lesões variam consideravelmente na sua aparência oque poderá estar relacionado com o intervalo de tempo que estão presentes na pele(Goldschmidt e Hendrick, 2002). As lesões são, normalmente, firmes e bem circunscritas. Apele subjacente pode apresentar-se normal, alopécica, hiperpigmentada, hiperqueratótica ouulcerada (Scott e Miller, 2011). Na maioria, segundo alguns investigadores, aparecem comonódulos cutâneos únicos que podem ser pretos, castanhos ou cinzentos (Pamela et al., 2007) (Figura 3).

A citologia revela variabilidade na forma dos melanócitos. Histologicamente osmelanocitomas caracterizam-se por vários padrões celulares desde feixes, cordões ou ninhos


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de melanócitos. A morfologia celular pode ir de epitelióide a fusiforme ou um misto destas duas(Foley et al., 1991; Scott e Miller, 2011). Além destas há autores que referem ainda célulaspoligonais e redondas (Goldschmidt, 1998). Está presente pleomorfismo celular e células

binucleadas, com núcleos redondos ou ovais. A actividade mitótica é, habitualmente, reduzida. A intensidade de pigmento varia entre reduzida a abundante e os melanófagos encontram-seentre as células tumorais ou em tecidos adjacentes contendo elevadas quantidades demelanina no seu citoplasma. Há marcado envolvimento da epiderme e do epitélio do folículopiloso com ninhos de melanócitos (Foley et al., 1991; Valentine, 1995; Scott e Miller, 2011).

Em cavalos novos parece existir uma característica particular quanto à sua localização,aparentemente ocorrem em vários locais mas não na típica região perianal. A ulceraçãotambém parece ser uma característica bem mais frequente do que habitualmente nos animais

de idade avançada (Foley et al., 1991).

Figura 3 - Melanocitoma único na cauda de um equino jovem. Adaptado de Scott e Miller(2011).

Melanoma

As lesões são muito variáveis no que diz respeito à sua aparência, independentementeda sua localização. Podem assomar qualquer cor, desde cinzento ou castanho, vermelho oumesmo azul (Smith et al., 2002). Habitualmente são lesões firmes, nodulares ou com aparênciade placas. Podem ou não ser alopécicas, hiperpigmentadas ou ulceradas (Rodríguez et al.,1997; Rees, 2004; Scott e Miller, 2011). Em alguns casos podem libertar uma substânciaespessa e negra. Ao coalescer os nódulos podem apresentar uma aparência irregular erugosa. Alguns tumores podem, contudo, ser pedunculados ou ter aspecto verrucoso. Emborade forma menos frequente podem aparecer como lesões isoladas (Foy et al., 2002; Smith et al.,

2002; Scott e Miller, 2011).


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Em função da avaliação clínica e características histológicas, Fleury et al. (2000a)categoriza 2 tipos de lesões, semelhantes a placas com proliferação atípica de melanócitos enodular com disposição concêntrica de células tumorais e melanófagos.

O comportamento destas lesões em equinos é difícil de prever baseado nascaracterísticas histológicas. Definem-se 3 padrões distintos de crescimento:

- crescimento lento durante anos, sem metástases;- crescimento lento durante anos com súbito crescimento rápido e metástases;- crescimento rápido com malignidade desde o início (Rees, 2004; Pamela et al., 2007;

Scott e Miller, 2011).De referir que Valentine (1995) sugere 4 síndromes, como referido anteriormente, sendo

que 3 deles têm potencial metastático e cada um deles é diferenciado por características

clínicas, histológicas e comportamentais apesar do melanoma dérmico só poder ser distinguidoda melanomatose dérmica com base nas características clínicas. O melanoma dérmico énormalmente uma lesão única ocorrendo em animais com um amplo intervalo de idades, namelanomatose surgem lesões múltiplas que coalescem com frequência e com uma maiorprobabilidade para metastizar internamente.

Embora a maioria dos animais, mesmo com metástases, não apresente sintomatologiaclínica há outros que desenvolvem sinais clínicos (em especial claudicação) referente ao tumorprimário ou às metástases (nomeadamente neurológicos) (Scott e Miller, 2011).

O exame citológico revela melanócitos pleomórficos e atípicos. Histopatologicamenteestes tumores caracterizam-se por melanócitos atípicos difusos, em ninhos ou cordões. Amorfologia pode ser predominantemente epitelióide, fusiforme ou uma combinação de ambasembora conste não ter significado prognóstico neste tipo de tumor (Goldschmidt, 1998).

Smith et al. (2002) define 4 variantes histopatológicas mais comuns para este tumor emanimais domésticos:

- epitelióide, células redondas com bordos celulares discretos, citoplasma com aspectovítreo, núcleos grandes e nucléolos proeminentes;

- fusiforme, células em feixes simples ou feixes entrelaçados;- misto, incluindo ambas as morfologias anteriores;- turbilhonar ou dendrítico, que ocorre apenas nas lesões cutâneas e usualmente é

benigno em oposição aos restantes.Já Seltenhammer et al. (2004) identificou também 4 tipos histológicos sendo os 3

primeiros equiparáveis aos anteriores e definindo um quarto tipo como células balonizantes. Ao contrário do que acontece nos humanos, cães e gatos há uma tendência para estas

lesões se iniciarem em associação aos folículos pilosos ou glândulas apócrinas e para não


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envolverem a epiderme e junção dermoepidérmica (Seltenhammer et al., 2004; Scott e Miller,2011).

Talvez um pouco à parte temos um outro tipo de melanomas, os amelânicos, que são

frequentemente mais invasivos que os restantes, exibindo desenvolvimento precoce demetástases quando comparados com os outros tipos (Seltenhammer et al., 2004).

MetástasesEmbora a controvérsia relativamente ao tema, por definição, metástases provam

malignidade (Roels et al., 2000 citando Majno e Joris, 1996). Independentemente da sualocalização, estas lesões podem metastizar através dos vasos sanguíneos ou linfáticos, sendoos gânglios linfáticos regionais o alvo primário(Fleury et al., 2000a; MacGillivray et al., 2002;

Smith et al., 2002). Apesar de poderem apresentar um crescimento lento estes tumores são localmente

invasivos e se o factor tempo proporcionar irão metastizar para fáscia muscular, glândulamamária, osso, canal vertebral, cérebro e órgãos internos como pulmão, fígado, baço, rim,coração. Os sinais clínicos mais comuns associados são: depressão, perda de peso, cólica eedema periférico. A palpação rectal e ultrasonografia são exames úteis na detecção detumores internos. A constatação de células com pigmento melânico, que podem sermelanócitos neoplásicos ou melanófagos associados, em biópsia ou citologias de massasinternas ou ainda em preparações citológicas de fluido abdominal ou torácico, confirma odiagnóstico de melanoma metastático (Fleury et al., 2000a; Patterson-Kane et al., 2001; Foy etal., 2002; MacGillivray et al., 2002; Valentine, 2006a; Garvican et al., 2007).

Foi sugerido que estas massas internas possam ser acumulações ectópicas demelanócitos hiperplásicos ou pigmento melânico em aglomerados dentro de melanófagos enão verdadeiras metástases e podem assim experimentar transformação maligna in situ (Patterson-Kane et al., 2001 citando Wilock, 1993).

Critérios de malignidadeMuitas vezes estes critérios referem-se aos animais em geral e não especificamente a

equinos o que torna a avaliação nesta espécie pouco ajustada. O melanoma será uma daspoucas neoplasias em animais em que a localização é um importante factor prognóstico masnão existe uma relação evidente entre as características histológicas, incluindo o índicemitótico e pigmentação, e a taxa de sobrevivência (Smith et al., 2002).

Para tumores cutâneos em animais a característica mais fiável para distinguir benigno demaligno é o índice mitótico(Smith et al., 2002) e segundo Goldschmidt (1998) 3 ou mais figurasmitóticas por 10 campos de grande ampliação indicam malignidade.


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A morfologia celular é também uma característica discriminatória útil e no caso demalignidade as células apresentam um núcleo grande com variações de tamanho e forma,hipercromasia, condensação da cromatina incomum, um ou mais nucléolos e figuras mitóticas

atípicas. O critério mais importante é, sem dúvida, a invasão linfática ou sanguínea(Goldschmidt, 1998; Smith et al., 2002).

O tamanho da lesão, o grau de pigmentação, a intensidade da coloração do antigénionuclear de proliferação celular (PCNA), a presença de necrose, ulceração ou inflamação eexpressão da p53 são de valor prognóstico limitado em animais (Smith et al., 2002).

Outras técnicas diagnósticasNo caso de melanomas amelânicos ou pouco diferenciados o diagnóstico definitivo pode

estar comprometido uma vez que existem algumas neoplasias que simulam melanomasmicroscopicamente. As técnicas tradicionais de histoquímica passam assim para segundoplano para a imunohistoquímica (IHQ) incorporando anticorpos monoclonais e policlonais, amicroscopia electrónica (ME) e mais recentemente a hibridização in situ (HIS) (Smith et al.,2002).

A detecção IHQ de marcadores melanocíticos tem auxiliado em muito o diagnósticodestes tumores (Pamela et al., 2007). A vimentina, citoqueratina (CK), proteína S100, enolaseespecífica dos neurónios (NSE), Melanocyte Antigen-A (Melan-A) ou Melanoma AntigenRecognized by T-cells 1 (MART-1), PCNA, Ki-67 eHuman Melanoma Black-45 (HMB-45) sãoalguns dos exemplos de marcadores mais reportados na bibliografia (Rodríguez et al., 1997; Sutton e Coleman, 1997; Roels et al., 2000; Heinzerling et al., 2001; Smith et al., 2002; Patterson-Kane e Ginn, 2003; Seltenhammer et al., 2004; Stokking, 2004; Pamela et al., 2007; Chapman et al., 2009; Scott e Miller, 2011).

A proteína vimentina é um filamento intermediário expresso por células mesenquimatosase neuroectodérmicas de tecidos normais assim como a CK mas expressa por células epiteliais(Koenig et al., 2001). A maioria dos melanomas, em humanos, cães e gatos, senão todosparecem ser positivos à vimentina e negativos à CK (Gown et al., 1986; Smith et al., 2002). Umoutro marcador que se tem mostrado útil é a S100, uma proteína ligante do cálcio, intranucleare por norma encontrada em células do tecido nervoso central e periférico. Esta proteínatambém foi encontrada em células fora do tecido nervoso como nos melanócitos sendo que amaioria dos melanomas são S100-positivos (Sandusky Jr et al., 1985; Gown et al., 1986; Smith et al., 2002). A NSE, uma enzima glicolítica, é um marcador frequentemente utilizado paraidentificar tumores melanocíticos contudo, não é específica destes uma vez que pode serencontrada numa variedade de outros tecidos como o músculo liso ou tecidos neuroendócrinos(Koenig et al., 2001; Smith et al., 2002). Melan-A/MART-1 é uma proteína de funções pouco


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conhecidas que elícita uma resposta citotóxica das células T, é fortemente positiva nocitoplasma dos melanócitos mas não é expressa noutros tipos celulares e talvez seja omarcador mais específico até ao momento (Koenig et al., 2001; Smith et al., 2002; Stokking,

2004; Chapman et al., 2009). O PCNA e o Ki-67 são marcadores de proliferação e, segundoalguns autores, são importantes na distinção de tumores benignos e malignos (Seltenhammer et al., 2004), embora outros estudos não partilhem desta opinião (Roels et al., 2000; Pamela etal., 2007; Scott e Miller, 2011). O HMB-45 é um anticorpo monoclonal apresentado pelaprimeira vez em 1986, quando se admitia ser absolutamente específico e sensível para lesõesmelanocíticas (Gown et al., 1986; Orchard, 2000). Estudos mais actuais revelam, porém umadiminuição da especificidade e sensibilidade deste marcador sendo considerado menosprofícuo em tecidos animais (Berrington et al., 1994; Orchard, 2000; Smith et al., 2002).

Adicionalmente ressalva-se a possível importância diagnóstica que terá avaliar determinadosoncogenes relacionados com tecidos melanocíticos (Sahar El-Sheikh et al., 2009). Comoreferido previamente, estes oncogenes são resultado de mutações de proto-oncogenes como éo caso do c-Kit (Smith et al., 2002), tema que será aprofundado posteriormente neste trabalho.

1.6. Tratamento e seguimento clínico

Para determinar as opções de tratamento deverá ter-se em conta a localização, otamanho, o número e o tipo de tumor assim como os custos associados e possíveis efeitossecundários (Knottenbelt, 2008b; Buechner-Maxwell, 2009; Laus et al., 2010). O tamanho éconsiderado por numerosos investigadores, quer em humanos quer em equinos, um importantefactor prognóstico podendo influenciar a escolha do tratamento (Valentine, 1995; MacGillivray et al., 2002; Knottenbelt, 2008b; Knottenbelt, 2008a; Paek et al., 2008; Buechner-Maxwell,2009).

As modalidades de tratamento disponíveis, mesmo sem custos demasiado elevados epassíveis de serem realizadas em ambiente não hospitalar, são vastas: excisão convencional,crioterapia, imunoterapia e quimioterapia intralesional (cisplatina, 5-fluorouracilo). A excisão alaser com dióxido de carbono (CO2) e a radioterapia são também modalidades a considerar, noentanto o equipamento é dispendioso e estes casos são habitualmente referidos para ambientehospitalar (Palmer, 2002; Knottenbelt, 2008a; Buechner-Maxwell, 2009; Scott e Miller, 2011). Além destes métodos há estudos que referem também a ablação por radiofrequência, abraquiterapia ou a amputação parcial da cauda (Knottenbelt, 2008a; Chapman et al., 2009; Spugnini et al., 2011). Apesar das imensas escolhas a resposta ao tratamento é difícil de


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determinar devido à baixa taxa de crescimento da maioria dos tumores e ao facto de, porvezes, se combinarem várias modalidades terapêuticas (MacGillivray et al., 2002).

De acordo com alguns autores, a excisão cirúrgica, quando possível, é o tratamento de

eleição (Goldschmidt e Hendrick, 2002; Valentine, 2006a). A cimetidina é um antagonista do receptor da histamina (H2) com efeitos

imunomoduladores. É usada em humanos, cães e embora seja benéfica nestes a mesmaevidência não está bem esclarecida em cavalos (Buechner-Maxwell, 2009; Laus et al., 2010). Éum assunto que tem gerado alguma controvérsia uma vez que há registos de ser efectivalevando a remissão completa ou mais comummente parando a progressão da doença atravésda diminuição no tamanho e número de tumores. Também existem estudos a contrapor estesresultados ou ainda investigadores que defendem ser mais indicado em tumores que crescem

activamente não havendo assim consenso acerca da eficácia deste fármaco (Rodríguez et al.,1997; Goldschmidt e Hendrick, 2002; MacGillivray et al., 2002; Palmer, 2002; Rees, 2004; Laus et al., 2010; Scott e Miller, 2011). A falta de homogeneidade relativamente aos métodos,apresentação clínica e tratamentos entre os investigadores pode ser a razão para não seconseguir estabelecer uma comparação lógica e viável entre os diversos estudos (Laus et al.,2010).

No caso dos melanocitomas a excisão cirúrgica completa é curativa (Foley et al., 1991; Roels et al., 2000). No que se refere aos melanomas a excisão cirúrgica extensa pode sercurativa no caso de lesões isoladas mas é impossível ou impraticável nas lesões múltiplas. Acrioterapia é uma alternativa mas alguns autores verificaram rápida recorrência quer com estemétodo ou com excisão cirúrgica (Scott e Miller, 2011). A remoção incompleta, quer porexcisão cirúrgica quer por criocirúrgia, pode aumentar o risco de recidiva de uma formaagressiva (Foley et al., 1991; Farcău et al., 2007; Scott e Miller, 2011 citando Johnson, 1998)ou mesmo aumentar o risco de metástases por estimulação mecânica (Chapman et al., 2009).

De acordo com alguns autores, a radioterapia, a quimioterapia tradicional e aimunoterapia com BCG (Bacillus Calmette-Guerin) não têm sido vantajosas (Scott e Miller,2011). Actualmente investigam-se hipóteses focadas na imunoprofilaxia quer em humanos querem animais. Uma eventual vacina, preparada a partir de um tumor excisionado, como umpotencial tratamento nos casos não passíveis de excisão cirúrgica ou administraçãointratumoral de ADNs de interleucina-18 (IL-18) e interleucina-12 (IL-12) demostraram algunsefeitos inibitórios no crescimento dos tumores em cavalos ruços (Heinzerling et al., 2001; Valentine, 2006a; Knottenbelt, 2008a; Chapman et al., 2009).

Recentemente (2011) foi publicado o primeiro caso de sucesso no tratamento demúltiplos melanomas num equino usando a técnica clínica da electroquimioterapia, umaestratégia que liga a administração de um agente quimioterápico, no caso a cisplatina, e a


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descarga de pulsos eléctricos aumentando a absorção e eficácia do fármaco usado. É umaabordagem segura e eficaz para os tumores cutâneos em equinos e está disponívelequipamento portátil permitindo a sua realização em ambulatório (Spugnini et al., 2011).

Uma taxa significativa de tratamentos fracassa devido à falta de seguimento clínico eaqui, tanto o Médico Veterinário responsável como o proprietário, assumem um papelfundamental no que diz respeito à monitorização do animal (Hewes e Sullins, 2009).

Alguns autores assumem, porém, ser dispensável qualquer tipo de tratamento a não serque interfira com funções orgânicas do animal (Foley et al., 1991; Rees, 2004) .

É, sem qualquer dúvida, fundamental continuar a investigação neste tema (Valentine,2006a; Chapman et al., 2009) pois parece haver escassos progressos em tratamentos demelanomas malignos quer em humanos quer em animais (Goldschmidt e Hendrick, 2002). É

necessário que sejam estabelecidos modelos pré-clínicos que permitam a determinação daeficácia de novas abordagens terapêuticas bem como um marcador fiável para o melanomaequino, que continua por estabelecer (Seltenhammer et al., 2004; Chapman et al., 2009).

1.7. c-Kit (CD117 ou Kit)

O c-Kit (Figura 4) é um proto-oncogene com importantes funções na normal proliferação,desenvolvimento e diferenciação dos melanoblastos embrionários. A sua expressão éconstitutivamente mantida em células-tronco hematopoiéticas, mastócitos, linfócitosintraepiteliais, células germinativas, melanócitos e células intersticiais de Cajal onde actuacomo receptor do factor de crescimento. Codifica um receptor transmembranar da tirosinaquinase (RTK) – c-Kit e localiza-se no cromossoma 4q em humanos. A transformação malignados melanócitos está associada a alterações na expressão do receptor c-Kit. A proteínacodificada pelo proto-oncogene é activada pelo seu ligante, designado Stem Cell Factor (SCF)

ou factor de crescimento dos mastócitos, durante a melanógenese (Morini et al., 2004; Alexeeve Kyonggeun, 2006; Rivera et al., 2008; Sahar El-Sheikh et al., 2009).


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Introdução

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Figura 4 - Ilustração esquemática do receptor c-Kit. Adaptado de Lennartsson et al. (2005).

Em Medicina Humana a sua expressão foi cuidadosamente avaliada em tecidos normaise em tecidos neoplásicos (Matsuda et al., 1993; Morini et al., 2004). Em 1993, Matsuda et al. levou a cabo um estudo em que avaliou a expressão do c-Kit em diversos tipos de tumores ecomparou-os com os correspondentes tecidos normais, fetais e adultos, concluindo que esteproto-oncogene estará envolvido na patogenia de determinados tipos específicos de tumoresbem como na iniciação e progressão dos mesmos (Matsuda et al., 1993). Os investigadorescontinuam a direccionar esforços para o estudo desta proteína nos melanomas humanos,avaliando melanomas orais e melanomas cutâneos malignos quanto à expressão IHQ do c-Kit.Diversos estudos demostraram que a progressão e o comportamento metastático domelanoma humano estão associados a perda de expressão do proto-oncogene c-Kit , noentanto, a causa subjacente ainda não se encontra totalmente esclarecida (Bar-Eli, 1997; Potti et al., 2003; Gross et al., 2005; Alexeev e Kyonggeun, 2006; Sahar El-Sheikh et al., 2009).

Embora existam trabalhos realizados em tecidos humanos, caninos, felinos e de roedores(Komuro, 1999; Morini et al., 2004; Rivera et al., 2008; Sahar El-Sheikh et al., 2009), tantoquanto foi possível averiguar, não há registos da expressão desde marcador em tumoresmelanocíticos em equinos.


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Objectivos

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2. OBJECTIVOS

A realização desta dissertação teve como objectivos principais:

- avaliar as características clínicas e histológicas dos tumores melanocíticos de equinos eestabelecer comparações com as investigações já publicadas;- avaliar a expressão IHQ do marcador c-Kit nos tumores melanocíticos de equinos criando umparalelismo com os resultados obtidos para outras espécies;- estudar possíveis relações entre as características clínicas e histopatológicas e a marcaçãoIHQ obtida;- ponderar possíveis implicações desta marcação de c-Kit no diagnóstico de tumoresmelanocíticos na espécie equina.


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Material e métodos

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3. MATERIAL e MÉTODOS

3.1. Material utilizado e a sua procedência

Neste estudo foram incluídos nódulos cutâneos de equinos, com suspeita de seremtumores melanocíticos pelo Médico Veterinário responsável e cujos proprietários autorizaram asua remoção (total ou parcial). As amostras foram recolhidas em território nacional, emInglaterra e em Barcelona durante um período de 8 meses, entre Novembro de 2010 e Julho de2011. As amostras foram processadas na Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro(UTAD), no Liphook Equine Hospital (LEH) e na Universidade Autónoma de Barcelona (UAB)para posterior avaliação.

3.2. Avaliação clínica

A cada animal foi efectuado um exame físico geral o qual incluiu detalhada observação epalpação das zonas passíveis de se encontrar nódulos cutâneos.

A par do material recolhido foi efectuado um questionário ao proprietário (Anexo 1),responsável pelo animal ou Médico Veterinário referente no qual constava dados referentes aoanimal como nome, idade, género, raça, pelagem e aptidão. Relativamente à(s) lesão(ões)foram recolhidos dados sobre o tamanho, a quantidade, a localização e a duração bem comocada caso documentado por suporte fotográfico (Sony Cyber-shot DSC-W120, 7.2 Megapixels).

Estes dados recolhidos com as respectivas categorias associadas constituíram as nossasvariáveis clínicas.

Em relação ao tamanho dos nódulos considerou-se pequenas as lesões até 1 centímetro(cm) de diâmetro, médias as lesões que apresentavam entre 1 e 4 cm e grandes as lesõessuperiores a 4 cm de diâmetro.

Relativamente à quantidade considerou-se melanoma dérmico quando se identificou 1 ou2 nódulos e melanomatose dérmica quando visíveis nódulos em número superior a 2.


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3.3. Avaliação histopatológica

O material foi recolhido por excisão cirúrgica (Figura 5), fixado em formol a 10%, incluído

em parafina sintética Histoplast®-Shandon®, seguindo a metodologia habitual.

Figura 5 - Excisão cirúrgica de uma das amostras incluídas no estudo.

Após inclusão, foram realizados cortes de cada um dos tumores, com 3 micrómetros (µm)de espessura, num micrótomo automático Leica® RM 2255. Em seguida, os cortes foramcolocados em lâminas e efectuou-se secagem na estufa, à temperatura de 37ºC. Apóssecagem, foram desparafinados em xilol, hidratados por passagem consecutiva em álcoois deconcentrações decrescentes, procedendo-se à coloração convencional com hematoxilina-eosina (HE) para posterior diagnóstico histopatológico.

O diagnóstico histopatológico foi realizado em conformidade com os critérios daOrganização Mundial de Saúde (OMS) (Goldschmidt, 1998), num microscópio Nikon®Optiphot-2.

Todas as amostras foram observadas com a coloração de HE e avaliadas ascaracterísticas histológicas descritas no quadro 3 que se segue. Foi avaliada a localização daslesões entre derme ou derme e epiderme, o tipo de células presentes em fusiforme, redondo ouum misto destes, foi observada a presença de ulceração, quantificou-se o pigmento e estromaem 3 graus, escasso (1), moderado (2) e abundante (3) e observou-se ainda a presença deêmbolos vasculares/linfáticos.


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Quadro 3 - Variáveis histológicas avaliadas.

Variáveis histológicas Categorias

Localização Derme e/ou

Epiderme

Tipo de célulasFusiformeRedondoMisto

Ulceração Presente Ausente

Quantidade de pigmentoEscasso 1Moderado 2 Abundante 3

Quantidade de estroma Escasso 1Moderado 2 Abundante 3

Êmbolos Presente Ausente

3.4. Avaliação imunohistoquímica

Para a análise IHQ foram utilizadas amostras preservadas em formol a 10%, incluídas emparafina. No micrótomo foram realizados cortes seriados de cada um dos tumores com 3 µm deespessura, que foram colocados em lâminas revestidas com solução de Silane (3- Aminopropyltriethoxysilane, Sigma®), de acordo com a metodologia convencional. Antes deestarem preparados para a realização da técnica de IHQ, os cortes permaneceram por 48horas na estufa a 37ºC, para secagem e melhor aderência às lâminas.

A presença de melanina por vezes dificulta a avaliação da imunorreactividade, uma vezque se torna difícil de diferenciar da reacção castanha adquirida pelo cromogéneo tetra-hidrocloreto de 3,3’-diaminobenzina (DAB) pelo que, num estudo prévio, tentou-se umapuramento da técnica de branqueamento da melanina com diferentes tempos de actuação dasolução de ácido oxálico (H2C2O4) a 0,1%.

De forma a optimizar os resultados foram também realizados estudos preliminares paraadequar concentrações do anticorpo primário, método de recuperação antigénica e diferentestempos de incubação. Todas as incubações foram realizadas em câmara húmida horizontal,Bio Optica®.


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Material e métodos

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3.4.1 Procedimento

A expressão IHQ da proteína em estudo foi obtida pelo método indirecto com uso de um

complexo estreptavidina-biotina peroxidase, utilizando o kitUltravision Detection System,Labvision Corporation®, Fremont, CA, USA (as suas componentes figuram a negrito noseguimento do texto).

O procedimento escolhido foi adaptado do método exposto por Sulaimon (2002)conforme abaixo descrito:

1. Desparafinação dos cortes em xilol durante 30 minutos e hidratação com uma sériede álcoois de concentração decrescente (100%, 95%, 80% e 70%) até à águadestilada;

2. Realização de um pré-tratamento de recuperação antigénica em microondas (imersãodas lâminas em tampão citrato com pH=6,2) durante 15 minutos, divididos em 3 ciclosde 5 minutos com intervalos de 30 segundos entre cada um, a 750W;

3. Arrefecimento das lâminas durante cerca de 30 minutos à temperatura ambiente;4. Imersão das lâminas durante 30-40 minutos numa solução de permanganato de

potássio (KMnO4) a 0,25%;5. Lavagem das lâminas por água destilada;6. Colocação das lâminas numa solução de ácido oxálico (H 2C2O4) a 0,1% durante

aproximadamente 10 minutos (processo monitorizado ao minuto, adaptando-se ostempos à quantidade de pigmento da amostra);

7. Inibição das peroxidases endógenas com peróxido de hidrogénio (H 2O2) a 3%,durante 30 minutos e remoção do excesso do mesmo com duas lavagens sucessivascom tampão fosfato salino (PBS);

8. Incubação dos cortes à temperatura ambiente durante 5 minutos com Ultra VBlock® ;

9. Incubação dos cortes com o anticorpo primário c-Kit (CD117) (clone Ab-6, Dako®),com uma concentração de 1:500 (diluição em tampão PBS com pH=7,4), durante anoite, no frigorífico a 4ºC, permanecendo em câmara húmida horizontal, Bio Optica®;

10. Após o período de incubação, remoção do anticorpo primário com 4 lavagens comtampão PBS e incubação dos cortes durante 10 minutos com Biotinylated GoatPolivalent® (anticorpo secundário) à temperatura ambiente;

11. Realização de 2 lavagens com tampão PBS e incubação durante 10 minutos comStreptavidin Peroxidase® à temperatura ambiente e de seguida uma lavagem comtampão PBS;


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12. Revelação das lâminas com uma incubação de aproximadamente 10 minutos emsolução aquosa de tetra- hidrocloreto de 3,3’-diaminobenzidina (DAB) SIGMA®, à qualse adicionou previamente 1,2 µl de peróxido de hidrogénio (H2O2) a 30% por cada

mililitro (ml) de solução seguida de lavagem com água destilada; 13. Realização de contraste nuclear ou contra-coloração com imersão das lâminas numa

solução de Hematoxilina de Gill, durante 1 minuto, seguindo-se uma lavagem emágua corrente até as lâminas contrastarem de azul (cerca de 10 minutos);

14. Desidratação das lâminas em concentração crescente de álcoois (95%, 100%),diafinização em xilol durante aproximadamente 20 minutos e montagem utilizando aresina sintética Entellan (Merck®).

3.4.2 Métodos de quantificação da imunorreactividade

Foi considerada reacção positiva a marcação no citoplasma dos melanócitos. Os tumoresforam considerados positivos quando apresentavam mais de 5% das células tumoraispositivas, de acordo com o descrito (Morini et al., 2004).

A imunorreactividade foi avaliada quando a marcação ocorria no citoplasma dosmelanócitos e classificada em presente ou ausente.

3.5. Análise estatística

A análise estatística foi realizada com o programa estatístico SPSS® (Statistical Packagefor the Social Sciences, Chicago, IL, EUA), versão 19.0 para Windows.

Como análise descritiva das variáveis contínuas, usou-se a média, a mediana, o desviopadrão e o erro padrão da média, mínimo e máximo. Os resultados foram expressos da formamédia ± desvio padrão. Usou-se a análise descritiva das variáveis categóricas, com a obtençãode frequências e percentagens das categorias.

Foi usado o teste de Qui-Quadrado ( χ2) para analisar as correlações entre cada categoriadas variáveis dentro de cada estudo (clínico, histopatológico e imunohistoquímico) assim comopara analisar as associações das categorias das variáveis entre estudos (clínico,histopatológico e imunohistoquímico). Os valores obtidos foram considerados significativospara valores de p


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Resultados

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4. RESULTADOS

Neste estudo foram incluídos tumores cutâneos de 43 equinos e foram avaliados os

dados clínicos, histológicos e imunohistoquímicos. De alguns animais foram retirados váriosnódulos, no entanto, só foi analisado histologicamente um nódulo por animal.

A classificação das amostras avaliadas neste estudo vai de encontro à classificaçãoadoptada por Valentine, no estudo publicado em 1995. Os tumores foram classificados em 4síndromes clínicas: nevo melanocítico, melanoma dér

tumores melanocíticos em equinos – estudo clínico, histopatológico e imunohistoquímico

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