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LA BIOLOGIA MOLECOLARE IN LABORATORIO:
PRESENTE E FUTURO
Trento 26 Novembre 2012
P. Lanzafame
U.O. Microbiologia e Virologia - Trento
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Come chi stando per terra raccoglie le mele da un albero alto e rigoglioso può raggiungere solo quelle pochissime situate vicino al tronco, mentre la quasi totalità rimangono lontane e irraggiungibili, così nella valutazione delle malattie umane fino ad ora si è potuto comprendere e quindi mettere in atto misure diagnostiche e terapeutiche solo di pochi e facilmente accessibili processi patologici
F. Collins 2001
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La biologia molecolare è una branca della
biologia che studia gli esseri viventi a livello dei
meccanismi molecolari alla base della loro
fisiologia, concentrandosi in particolare sulle
interazioni tra le macromolecole, ovvero proteine
e acidi nucleici (DNA e RNA).
Per biologia molecolare si definiscono, in
genere, una serie di tecniche che consentono la
rilevazione, l'analisi, la manipolazione,
l'amplificazione e la copia degli acidi nucleici
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• 1960: Lei ha un’ epatite da siero
• 1970: Lei ha un’ epatite da virus non A-non B
• 1990: Lei ha un’ epatite da HCV
• 2000: Lei ha un epatite da HCV genotipo 1
• 2010: Lei ha un epatite da HCV genotipo 1 con
un polimorfismo CC del gene IL28B sul
cromosoma 19, le probabilità di risposta al
trattamento sono buone
• 2011: Il genotyping SNPs rs8099919 nel gene
IL28B è associato con la progressione
dell’epatite C ad infezione cronica e con il
fallimento terapeutico
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• Alcuni esperimenti negli anni trenta e quaranta fornirono le basi su cui la disciplina sarebbe poi nata: nel 1935 si collegò per la prima volta l'ereditarietà ai cromosomi.
• Il termine biologia molecolare risale al 1938, coniato da Warren Weaver, direttore della fondazione Rockfeller,.
• Nel 1943 Avery correlò il trasferimento di tratti somatici tra ceppi batterici al DNA
• Nel 1953 Hershey e Chase dimostrarono che il materiale genetico è costituito dal DNA.
• La nascita della biologia molecolare si può però far risalire alla scoperta della struttura del DNA da parte di Watson e Crick.
• Meselson e Stahl nel 1958 dimostrarono il meccanismo di replicazione del DNA e poco dopo il codice genetico fu decodificato dal gruppo di Crick.
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Nel 1953, la scoperta della struttura a doppia elica del DNA (James Watson e
Francis Crick ) ha segnato il passaggio alle biotecnologie innovative e la nascita dell’
“ingegneria genetica”
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• Il dogma centrale della biologia molecolare è il principio secondo il quale il flusso dell'informazione genetica è monodirezionale e parte dagli acidi nucleici per arrivare alle proteine. In questo processo sono identificabili tre punti: l'informazione genetica èconservata nel DNA, che viene trasformato sotto forma di RNA, il quale viene successivamente tradotto in proteine, la forma "operativa" dell'informazione contenuta nel genoma.
• Questo costituisce il meccanismo di base dell'espressione dei geni e la direzione fondamentale del flusso di informazione genetica.
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LA TRAVERSATA DEL DESERTO
• 1965 – 1972: Da scienza teorica a scienza pratica
– 1973: primi sequenziamenti di Maxam-Gilbert
– 1975: sequenziamento metodo Sanger
– 1977: sequenziamento nuovo metodo di Maxam-Gilbert
• 1975 – 1980: La realizzazione delle tecniche di ingegneria genetica
• 1955: scoperta della DNA – polimerasi (A. Kornberg)
• 1983: la Polymerase chain reaction
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• Il sequenziamento del DNA è un processo che
serve a mettere in fila le basi che costituiscono il
frammento di DNA in analisi, in modo da poterlo
leggere propriamente ed analizzare.
• Conoscere l'esatta sequenza delle basi è di
fondamentale importanza per tutti i modelli di
ricerca in biologia molecolare poiché rende
possibile stabilire la presenza di mutazioni, la
struttura primaria dei geni, la localizzazione di
specifici elementi (promotori, terminatori,
sequenze satelliti)
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Sequencing methods: Sangersequencing
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Gli studi sul DNA ed in particolare sul DNA ricombinante e l’evoluzione delle tecniche di sintesi chimica hanno permesso di realizzare sonde genetiche che, mediante reazioni di ibridazione degli acidi nucleici, sono state ampiamente impiegate per la rilevazione ed identificazione genica
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Le basi teoriche della PCR furonodescritte da Gobind Khorana negli anni’70 (J Mol Biol 1971)
Suscitò particolare interesse solo nellametà degli anni ’80 quando Kary Mullis descrisse una tecnica che consentiva diottenere grosse quantità di DNA di geni a copia singola dal DNA genomico.
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Sometimes a
good idea comes to youwhen you are not lookingfor it
K.B. Mullis
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Prima della sua scoperta, per effettuare l'amplificazione del DNA con tecniche di laboratorio, era necessario aggiungere nuovo enzima dopo ciascun ciclo di riscaldamento, favorendo così la possibilità di inquinamento del campione e non permettendo la completa automazione del processo
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• La procedura iniziale prevedeva l’utilizzo del frammentodi Klenow dell’enzima DNA polimerasi di E.Coli cheveniva aggiunto fresco ad ogni ciclo di amplificazione: questo enzima essendo termolabile veniva infattiinattivato durante il passaggio di denaturazione del DNA.
• L’avvento della Taq DNA polimerasi da Thermophilusaquaticus ha notevolmente facilitato l’automazione ditale procedura e ha permesso di lavorare a temperature di annealing e di estensione (72°C) molto più elevate, aumentando così la stringenza dell’ibridazione fra primer e templato e quindi la specificità del prodotto amplificato.
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R. Williamson (Molecular genetics and the transformationof clinical chemistry, Atlanta 1989)
…la chimica clinica si trova in una crisi di identitàschiacciata fra le prime grandi esperienze di automazione e dal progredire della ricerca nell’ambito della diagnostica molecolare…..
….I grandi progressi analitici, la sempre migliore definizione delle patologie associate a difetti genetici e gli studi sulle basi molecolari della suscettibilità alle malattie complesse porteranno in un futuro non troppo lontano all’allargamento delle ricerche molecolari dai laboratori specialistici ai “laboratori tradizionali”.
Sta al chimico-clinico rispondere a questa sfida (o opportunità) riorganizzando e riqualificando la propria attività
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……. dalla PCR convenzionale al multiplexing
alla Real Time PCR in «urgenza» a ……………!!!!!!!???
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Hot start PCR Prevention of non-specific amplification
Nested PCR Designed mainly to increase sensitivity
RT-PCR Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) was developed to amplify RNA targets
Multiplex PCR Two or more sets of primers specific for different targets are introducedin the same tube, allowing multiple target sequences to be amplifiedsimultaneously
Broad-range PCR This application uses conserved sequences within phylogeneticallyinformative genetic targets to diagnose infection : e.g. universalprimers set to target herpesvirus infections
Arbitrarily primed PCR Involves the use of a single short (10-15 base) arbitrarily chosen primerto amplify genomic DNA under low-stringency conditions. Useful in determining whether 2 isolates of the same species are epidemiologically related
Quantitative PCR Normalization to internal or external standards. Value in determinig the clinical significance of a positive qualitative result for therapy, for clinical course and responsiveness to therapy
Variations and modifications of PCR
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Sample extraction process
Instrument automates: manual steps are limited to loading and unloading, with reagents in sealed, bar-coded, ready-to-use cassettes for fast and accurate reagent data entry
Increasing use of automation
Automated Sequencing
HIV, HCV, HBV (viral genotyping and
resistance testing)
Assay for detection
•Chlamydia trachomatis•Neisseria gonorrhea•Mycobacterium avium•Mycobacterium intracellulare
Assay for quantification
•HIV-1 viral load quantification•CMV viral load quantification,•Hepatitis B virus (HBV) viral load•Hepatitis C virus (HCV viral load
Automated PCR System
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Vortex and Dispense Sample into Port S
2
Insert Cartridge and Start Assay
3
Insert Swab into Elution Reagent Vial and
Break at Scope
1
Total Hands-On time <1 Minute
TOTAL AUTOMATION
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•I microarrays sono caratterizzati da una potenziale capacità di rilevazione ed identificazione di migliaia di
geni microbici
•Sebbene inizialmente applicati alla ricerca, ed in
particolare a studi di espressione genica, il loro utilizzo
nei laboratori di microbiologia clinica sta diventando una realtà destinata, nell’immediato futuro, a modificare la
diagnostica microbiologica
•La capacità di rilevare un gran numero di patogeni e/o
monitorare la variabilità delle popolazioni microbiche e l’approccio metagenomico potrebbero modificare la
nostra capacità di comprensione delle malattie infettive
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Evoluzione di Virochip™
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Metagenomics for microbial detection / discovery
GenomicsGenomics
Deep SequencingDeep Sequencing MicroarraysMicroarraysMassively ParallelMassively Parallel
PCR and massPCR and mass
spectrometry (PLEXspectrometry (PLEX--ID)ID)
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• La tradizionale ricerca genomica sui microrganismi determina le sequenze di DNA di singoli microbi, esaminando ceppi coltivati. La metagenomica è un approccio basato sull'utilizzo di tecniche genomiche moderne per lo studio di comunità microbiche direttamente nel loro ambiente naturale, evitando così il problema del prelevamento e coltivazione in laboratorio.
• Nella metagenomica, l’informazione sulle sequenze di DNA viene estratta da intere comunità microbiche in situ.
• Si basa sul sequenziamento del genoma di microrganismi di uno stesso luogo, la cui analisi effettuata nel proprio habitat naturale viene definita metagenoma. La maggior parte di questi organismi sono di difficile coltivazione a causa delle loro particolari esigenze.
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HTCV, a novel human cardiovirus in children with respiratory / gastrointestinal infection
(Chiu, et al, 2008, PNAS)
Microarray for Pathogen Discovery
ABV, the likely etiologic agent of PDD (Kistler, et al., 2008, Virol J)
XMRV, a gammaretrovirus associated a type of hereditary prostate cancer (Urisman, et al, 2006, PloS Pathogens)
A new monkey adenovirus(Chiu, Stewart, 2003 Vir.)
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A Metagenomics Investigation of the 2009 Influenza A H1N1 Pandemic (n=17)
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2009 H1N1 is More Similar to Swine than Human Influenza H1N1 by Virochip
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The PLEX-ID system combines the sensitivity of nucleic acid amplification with the accuracy of high-performanceelectrospray ionization mass spectrometry followed by base-composition analysis to identify a broad array ofmicroorganisms, including bacteria, viruses, fungi, and parasites. Certain PLEX-ID assays also provide information about drug resistance, virulence, and strain type. Anticipatedpublic health and biodefense applications include epidemiologicresearch and identification of emerging or previously unknownagents.
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Finora riservati quasi esclusivamente all’uso nella ricerca
–M. tuberculosis, Salmonella, Shigella
–Sepsi
–SNPs (B19v, HCV)
Applicazioni in ClinicaStudio dei profili di espressione genica
Determinazione dei polimorfismi genomici dell’ospite
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Proteomics meets microbiology
The ever increasing number of completed sequences for important
human pathogens will lead to a similar rise in demand for new methods to
facilitate identification and functional analysis of the gene products
Proteomics can be defined as the
study of the full set of proteins
expressed by an organism, tissue
or cell, and the change in their
expression patterns under different
conditions
PROTEOMA
«PROTEins within a genOME»
Carolyn I. Phillips et al. Proteomics meets microbiology: technical advances in the global mapping of protein expression and function Cellular Microbiology (2005)7(8),1061
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Il proteoma è l'insieme di tutti i possibili prodotti proteici espressi in una cellula, incluse tutte le isoforme e le modificazioni post-traduzionali. Il proteoma è dinamico nel tempo, varia in risposta a fattori esterni e differisce sostanzialmente tra i diversi tipi cellulari di uno stesso organismo
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Attualmente la proteomica si sviluppa su tre diversi livelli:
• Proteomica sistematica: identificazione e caratterizzazione del proteoma
• Proteomica differenziale: espressione differenziale delle proteine in cellule diverse di uno stesso organismo ed in momenti di vita diversi di una stessa cellula;
• Proteomica funzionale: comprende lo studio delle interazioni tra proteine (interattomica), lo studio delle interazioni tra una proteina ed i suoi substrati (metabolomica) e lo studio delle funzioni specifiche delle proteine (genomica enzimatica, genomica biochimica).
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Proteomic methods
• High resolution two-dimensional electropresis (D-GE)• High performance liquid chromatografy (HPLC)• Mass spectrometry (MS)• Protein microarray
Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight
mass spectrometry (MALDI-TOF MS)
Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
S. Emonet, et al. Application and use of various mass spectrometry methods
in clinical microbiology . Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1604–1613
The development of automated, high-
throughput proteomic technologies such
as MALDI-TOF MS has enabled large
numbers of samples to be analyzed
simultaneously in a short time
J. B. Fenn and K.TanakaNobel Prizes in Chemistry 2002 "for their
development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological
macromolecules"
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1-2 min
Measurement
- high accurate - reproducibile- low cost -analysis
Small amount ofbiological materialThe first description of the use of MS for bacterial identification
Anhalt JP, Fenselau C. Identification of bacteria using mass-spectrometry. Anal Chem 1975; 47: 219–225.
MALDI-TOF MS
- Automated and rapid molecularidentification of microorganisms
• Enterobacteriaceae• Non-fermenting bacteria• Staphylococci• Enterococci• β-haemolytic streptococci• Anaerobes• Yeast• Mycobacteria
-Virulence/resistance factors
Challenges
• Sample type , quality, specific storage• Hardware/software/database Maier, T. , Klepel, S. , Renner, U. , & Kostrzewa, M. . (2006).
Fast and reliable MALDI-TOF MS-based microorganism identification.
Nature Methods Application Notes, 25(2), 68-71
VanBogelen RA, Abshire KZ, Moldover B, Olson ER, Neidhardt FC.
Escherichia coli proteome analysis using the gene-proteindatabase. Electrophoresis. 1997 Aug;18(8):1243-51.
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Il laboratorio di diagnostica molecolare
Ottimizzazioneflusso di lavoro
AffidabilitàAmpio menu
applicativoFacilità d‘utilizzo
Gestione di varitipi di campione
Soluzioni basatesu costo-efficacia
Conformità alle normative(CE-IvD)
Sicurezza diprocesso
Risparmiodi tempo
Tracciabilitàdel campione
Flessibilità
Standardizzazione
Convenienza
Consolidamento
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La dotazione tecnologica di cui disponiamo
deve essere inserita in una organizzazione del
lavoro tale da garantire dei risultati di qualità
analitica di eccellenza in tempo utile per la cura
del paziente.
Solo così i nostri risultati diventano
clinicamente significativi.
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Principali criteri per individuare l’utilità e la valenza clinica di un nuovo test diagnostico
• C’è un razionale perché il test sia richiesto dal
clinico?
• Il test è utile per la salute del paziente?
• Un test più semplice può fornire informazioni
equivalenti?
• Il test aumenta il livello di conoscenza clinica?
• E’ possibile fare a meno del test?
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Principali criteri per la scelta di un test diagnostico
• Utilità clinica: capacità di un test di modificare la
decisione del medico in senso diagnostico,
prognostico e terapeutico
• Efficacia: capacità di fornire informazioni utili per
la gestione del paziente
• Efficienza: capacità di raggiungere l’obiettivo
con la migliore allocazione delle risorse
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Ma…….
Problemi interpretativi che da sempre sono alla base della valutazione clinica del referto microbiologico sono
frequentemente “amplificati”dalle tecniche molecolari: non sempre il dato strettamente biologico correla con la malattia …….
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Highly sensitiveHigh contamination risk
Not highly sensitiveLow contamination risk
Pros e Cons of moleculardiagnostic methods
Not highly specificWide identification range
Highly specificFalse negatives
Based on single or fewmarkers = incomplete viewLow cost and fast
Genome-wide or Metagenome-wide identificationHigh cost, time-consuming
DILEMMAS
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…..ciò richiede una capacità di interpretazione del referto molecolare che oltre alla garanzia che si èproceduto secondo uno standard qualitativo di eccellenza sia anche il frutto di una attenta valutazione clinica
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……..Il futuro dipende soprattutto da noi…….
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• Riduzione di operatori con formazione specialistica specifica
• Riduzione delle capacità critiche sperimentali e di valutazione tecnica
• Emergenza di nuove professioni
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…Stay hungry, stay ………
GRAZIE
PER
L’ATTENZIONE