Tre criteri fondamentali per la Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologheproduzione di proteine eterologhe

Espressione ad alto livello, affidabile e Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA)DNA/RNA)

La proteina prodotta deve mantenere la La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in propria attività biologica in E. coli E. coli (livello struttura/ conformazione della (livello struttura/ conformazione della proteina)proteina)

La proteina deve essere facilmente re-La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare isolata dal rimanente materiale cellulare

Step 2: dalla trascrizione alla proteinaStep 2: dalla trascrizione alla proteina

5’

3’

Gli enzimi sono attivi solo se ripiegati nella conformazione corretta (folding)

Nel processo di folding hanno Nel processo di folding hanno luogo modificazioni post-luogo modificazioni post-

traduzionali: traduzionali: es. Folding ossidativoes. Folding ossidativo

Soltanto il corretto appaiamento Soltanto il corretto appaiamento di residui di cisteina porta alla di residui di cisteina porta alla conformazione biologicamente conformazione biologicamente

attivaattiva

Nel processo di folding hanno luogo Nel processo di folding hanno luogo modificazioni post-traduzionali: modificazioni post-traduzionali:

es. Glicosilazionees. Glicosilazione

E. coli:E. coli: nel citoplasma nel citoplasma la formazione di ponti la formazione di ponti

disolfurodisolfuro è estremamente sfavorita è estremamente sfavorita

Il citoplasma ha un potenziale redox Il citoplasma ha un potenziale redox molto basso (ambiente riducente)molto basso (ambiente riducente)

Nel citoplasma non ci sono enzimi Nel citoplasma non ci sono enzimi che sono in grado di ossidare i tioli (-che sono in grado di ossidare i tioli (-SH) SH)

Foldasi e chaperonineFoldasi e chaperonine

Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. (es. ppiAppiA))

2) disolfuro isomerasi 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche)(eucariotiche)

+

Foldasi e chaperonineFoldasi e chaperonine

Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. ppiAppiA))

2) disolfuro isomerasi 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche)(eucariotiche)

ChaperonineChaperonine

Foldasi e chaperonineFoldasi e chaperonine

Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. ppiAppiA))

2) disolfuro isomerasi 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche)(eucariotiche)

ChaperonineChaperonine

Foldasi e chaperonineFoldasi e chaperonine

Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. (es. ppiAppiA))

2) disolfuro isomerasi 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche)(eucariotiche)

ChaperonineChaperonine

Gene name

Gene length

SWISS-PROT

Location (kb)

Description

dnaJ 1131 P08622 14.20Chaperone with DnaK; DNA chain elongation; stress-related DNA biosynthesis, responsive to heat shock

dnaK 1917 P04475 12.20HSP-70-type molecular chaperone, with DnaJ; stress-related heat-shock DNA biosynthesis, ATP-regulated binding and release of polypeptide substrates

ecpD 741 P33128 156.20 Possible pilin chaperone

fimC 726 P31697 4541.90 Biosynthesis of fimbriae; periplasmic chaperone for type 1 fimbriae

groL 1647 P06139 4368.60 Chaperone for assembly of enzyme complexes; phage morphogenesis; GroESL large subunit

groS 294 P05380 4368.30 Chaperone for assembly of enzyme complexes; phage morphogenesis; GroESL small subunit

htpG 1875 P10413 494.30 Heat shock protein C62.5; chaperone

ibpA 414 P29209 3865.00 Chaperone, heat-inducible protein of HSP20 family

ibpB 429 P29210 3864.50 Chaperone, heat-inducible protein of HSP20 family

narJ 711 P11351 1284.40 Nitrate reductase delta-subunit; chaperone

secB 468 P15040 3781.80 Protein export; chaperone SecB

tig 1299 P22257 454.40 Trigger factor; chaperone

„Mettersi in riga“ o venire eliminati: il ruolo delle chaperonine

Struttura del complesso GroEL/GroES (una della maggiori chaperonine citoplasmatiche)

A) Veduta laterale

B) Veduta apicale e basale

DnaK

Alto livello di espressione + errata conformazioneInclusion bodies

Vettori per l‘espressione di chaperonine

Il successo si consuma a freddo: i vettori per espressione a basse temperature

Inclusion bodies: se li Inclusion bodies: se li conosci li eviticonosci li eviti

La formazione di corpi di inclusione può La formazione di corpi di inclusione può essere ridotta:essere ridotta:

1) crescendo a bassa temperatura (ad es. 1) crescendo a bassa temperatura (ad es. 16°C)16°C)

2) riducendo la velocità di espressione del 2) riducendo la velocità di espressione del genegene

3) cercando di rendere meno riducente il 3) cercando di rendere meno riducente il citoplasmacitoplasma

4) aumentando l’espressione di 4) aumentando l’espressione di chaperonine o di enzimi che promuovono chaperonine o di enzimi che promuovono la formazione di ponti disolfurola formazione di ponti disolfuro

Inclusion bodies: se li Inclusion bodies: se li conosci li eviti ma non conosci li eviti ma non

necessariamentenecessariamente La formazione di corpi di inclusione può essere La formazione di corpi di inclusione può essere

ridotta:ridotta: 1) crescendo a bassa temperatura (ad es. 16°C)1) crescendo a bassa temperatura (ad es. 16°C) 2) riducendo la velocità di espressione del gene2) riducendo la velocità di espressione del gene 3) cercando di rendere un pò meno riducente il 3) cercando di rendere un pò meno riducente il

citoplasmacitoplasma 4) aumentando l’espressione di chaperonine o di 4) aumentando l’espressione di chaperonine o di

enzimi che promuovono la formazione di ponti enzimi che promuovono la formazione di ponti disolfurodisolfuro

Possono essere il punto di partenza, una volta Possono essere il punto di partenza, una volta purificati per la preparazione di un proteina purificati per la preparazione di un proteina d’interessed’interesse

L’involucro dei batteri Gram negativi

Gram+

L’aggiunta di peptidi segnale favoriscono il trasporto dal citoplasma allo spazio periplasmatico (es. MKTHRLNMTASLLIGISAFA )La proteina periplasmatica DsbA induce la formazione di ponti disolfuro tra cisteine

Lo spazio periplasmico è Lo spazio periplasmico è un ambiente ossidanteun ambiente ossidante

Espressione di proteine Espressione di proteine ricombinanti in ricombinanti in Echerichia Echerichia

colicoliVantaggiVantaggi

- Crescita rapida- Crescita rapida- Elevata densità - Elevata densità

cellulare su substrati cellulare su substrati poco costosipoco costosi

- Organismo molto Organismo molto ben caratterizzato e ben caratterizzato e ricca collezione di ricca collezione di mutantimutanti

- Numero elevato di Numero elevato di vettori di clonaggio vettori di clonaggio ed espressioneed espressione

SvantaggiSvantaggi Formazione di Formazione di

inclusion bodiesinclusion bodies Folding ossidativo Folding ossidativo

limitato allo spazio limitato allo spazio periplasmicoperiplasmico

Modificazioni post-Modificazioni post-traduzionali non traduzionali non adeguate (ad es. adeguate (ad es. glicosilazione)glicosilazione)

Schema generale di Schema generale di preparazione di una preparazione di una

proteina ricombinante in proteina ricombinante in E. E. colicoli1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti)

in un opportuno vettore d’espressionein un opportuno vettore d’espressione2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione

dell’espressione al fine di ottenere la massima dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione sceglie la strada dei corpi d’inclusione

3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di coltura di E. coliE. coli che esprime la proteina che esprime la proteina

4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante

tecniche cromatografiche a partire dagli estratti tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmicigrezzi citoplasmatici o periplasmici

6) Alternativamente, purificazione e denaturazione 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitroin vitro della della proteina d’interesseproteina d’interesse

Schema generale di Schema generale di preparazione di una preparazione di una

proteina ricombinante in proteina ricombinante in E. E. colicoli1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti)

in un opportuno vettore d’espressionein un opportuno vettore d’espressione2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione

dell’espressione al fine di ottenere la massima dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione sceglie la strada dei corpi d’inclusione

3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di coltura di E. coliE. coli che esprime la proteina che esprime la proteina

4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante

tecniche cromatografiche a partire dagli estratti tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmicigrezzi citoplasmatici o periplasmici

6) Alternativamente, purificazione e denaturazione 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitroin vitro della della proteina d’interesseproteina d’interesse

Schema generale di Schema generale di preparazione di una preparazione di una

proteina ricombinante in proteina ricombinante in E. E. colicoli1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in

un opportuno vettore d’espressioneun opportuno vettore d’espressione2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione

dell’espressione al fine di ottenere la massima dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione sceglie la strada dei corpi d’inclusione

3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coliE. coli che esprime la proteina che esprime la proteina

4) Raccolta e lisi delle cellule o solo dello spazio 4) Raccolta e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmicoperiplasmico

5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmicicitoplasmatici o periplasmici

6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitroin vitro della della proteina d’interesseproteina d’interesse

Schema generale di Schema generale di preparazione di una preparazione di una

proteina ricombinante in proteina ricombinante in E. E. colicoli1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in

un opportuno vettore d’espressioneun opportuno vettore d’espressione2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione

dell’espressione al fine di ottenere la massima dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione sceglie la strada dei corpi d’inclusione

3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coliE. coli che esprime la proteina che esprime la proteina

4) Raccolta e lisi delle cellule o solo dello spazio 4) Raccolta e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmicoperiplasmico

5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmicicitoplasmatici o periplasmici

6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitroin vitro della della proteina d’interesseproteina d’interesse

Rese di produzioneRese di produzionePer Per

cellulacellulaPer litro a Per litro a

101099 cells/mlcells/ml

Peso umidoPeso umido 9.5x109.5x10-13-13 gg

0.95 g0.95 g

Peso seccoPeso secco 2.8x102.8x10-13-13 gg

0.28 g0.28 g

Proteine Proteine totalitotali

1.55x101.55x10--

1313 g g0.15 g0.15 g

Rese massime teoriche di una proteina d’interesse per litro di coltura a 109 cells/ml

% delle % delle proteine proteine

totalitotali

Resa/litroResa/litro

0.10.1 150 150 gg

2.02.0 3 mg3 mg

50.050.0 75 mg75 mg

Schema generale di Schema generale di preparazione di una preparazione di una

proteina ricombinante in proteina ricombinante in E. E. colicoli1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in

un opportuno vettore d’espressioneun opportuno vettore d’espressione2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione

dell’espressione al fine di ottenere la massima dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione sceglie la strada dei corpi d’inclusione

3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coliE. coli che esprime la proteina che esprime la proteina

4) Raccolta delle cellule e lisi delle cellule o solo dello 4) Raccolta delle cellule e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmicospazio periplasmico

5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmicicitoplasmatici o periplasmici

6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitroin vitro della della proteina d’interesseproteina d’interesse

Raccolta: filtrazione e centrifugazionePer lisare le cellule: lisozima sonicazione French Press

French PressNel caso di espressione periplasmatica si lisa solo lo spazio periplasmico con shock osmotico

Schema generale di Schema generale di preparazione di una preparazione di una

proteina ricombinante in proteina ricombinante in E. E. colicoli1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti)

in un opportuno vettore d’espressionein un opportuno vettore d’espressione2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione

dell’espressione al fine di ottenere la massima dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione sceglie la strada dei corpi d’inclusione

3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di coltura di E. coliE. coli che esprime la proteina che esprime la proteina

4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante

tecniche cromatografiche a partire dagli estratti tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmicigrezzi citoplasmatici o periplasmici

6) Alternativamente, purificazione e denaturazione 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitroin vitro della della proteina d’interesseproteina d’interesse

Fusioni traduzionali possono Fusioni traduzionali possono aiutare il processo di purificazione aiutare il processo di purificazione della proteina d’interesse della proteina d’interesse attraverso cromatografia d’affinitàattraverso cromatografia d’affinità

Peptidi o proteine che possiedono affinità Peptidi o proteine che possiedono affinità per un particolare substrato possono essere per un particolare substrato possono essere “fusi”alla proteina di interesse per “fusi”alla proteina di interesse per facilitarne la purificazionefacilitarne la purificazione

Possono essere fusioni con intere proteine Possono essere fusioni con intere proteine (ad es. Maltose Binding Protein, Inteina, (ad es. Maltose Binding Protein, Inteina, GST)GST)

Oppure con piccoli epitopi (ad es. 6xHis, Oppure con piccoli epitopi (ad es. 6xHis, peptide FLAG)peptide FLAG)